WO2020180037A1 - 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물, 혐기 배양 체계를 이용한 인간 장내 미생물 군집의 모사 배양 방법, 이에 의해 제조된 미생물 제제 및 이의 용도 - Google Patents

인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물, 혐기 배양 체계를 이용한 인간 장내 미생물 군집의 모사 배양 방법, 이에 의해 제조된 미생물 제제 및 이의 용도 Download PDF

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신재호
김은수
최승대
이유정
박창언
손현우
조영재
조형우
김민철
정연균
박민규
박영준
강기웅
김민지
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경북대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present inventors were searching for methods having the same microbial composition as the original feces by simulating and culturing the intestinal microbial community in vitro, while intestinal microbial communities including bacterioidetes, permicutes, proteobacteria, fusobacteria and actinobacteria, etc.
  • the present invention was completed based on this, because it was found a method of culturing similarly to that of Wondyeon, and it was confirmed that the intestinal microbial community obtained therefrom has a therapeutic effect on intestinal diseases.
  • Another object of the present invention is to prepare a microbial community suspension from the feces of a subject; Inoculating the suspension into the composition; And it is to provide a human intestinal microbial community simulation culture method comprising the step of culturing the composition.
  • Another aspect of the present invention provides a microbial preparation comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of a culture of a microbial community simulated by the above method, a concentrate of the culture, and a dried product of the culture.
  • FIG. 16 shows (a) Bifidobacteriaceae and (b) Akermensi Asia (Bifidobacteriaceae) found in the intestine of mice after administration of a population of intestinal microorganisms simulated by a method according to an embodiment of the present invention.
  • Akkermensiaceae) is a graph showing the family (family) microorganisms.
  • the composition may further include one or more components selected from the group consisting of water-soluble starch, sodium pyruvate, and L-arginine.
  • the composition may further include one or more components selected from the group consisting of Pancreatic digest of casein and Papain digest of soybean.
  • the medium of the present invention is a fastidious anaerobe comprising a brain-heart infusion media (BHI) containing a bovine brain extract, a bovine heart extract and proteose peptone as an active ingredient, starch, sodium pyruvate and L-arginine as an active ingredient.
  • BHI brain-heart infusion media
  • FAB tryptic soy broth
  • pancreatic digests of casein and papain digests of soybeans as active ingredients is more useful for simulated culture in which the ratio of human intestinal microbial communities is maintained.
  • the first step of the present invention is to prepare a microbial community suspension from feces.
  • the step of culturing may be performed for 24 to 120 hours.
  • the microbial community of the present invention may be, for example, a human-derived intestinal microbial community that is normally selected by verification of alpha diversity, beta diversity and/or relative abundance based on criteria commonly applied in the art.
  • At least 120 ⁇ 27g or more of stool samples were obtained per sample from the donor selected in Example 1-1, and some of the obtained stool samples were stored frozen at -80°C, and the extra sample contained 20% glycerin. It was suspended 10 times by weight in 0.85% physiological saline. As a result of measuring the number of viable cells in each stool sample using a hemocytometer, it was confirmed that each stool sample contained about 10 9 to 10 11 intestinal microorganisms per gram. Fecal samples suspended in a buffer solution were stored frozen at -80°C until use in the experiment. The fecal sample pretreatment process was performed in the anaerobic chamber under conditions of 0 ppm to 40 ppm of oxygen and 10000 ppm to 50000 ppm of hydrogen.
  • Example 3 Simulated culture and formulation of fecal samples
  • At least one buffer solution was selected from a buffer group consisting of 0.85% physiological saline and 50% glycerin containing, and mixed 1 to 1 with the BHI medium culture of the simulated microbial community, and formulated in a liquid form (Fig. 7). .
  • DNA was extracted using QIAmp Power Fecal DNA Pro Kit (QIAGEN, Germany) according to a conventional method in the art.
  • the original stool sample suspension and the simulated cultured human intestinal microbial community culture solution of Example 1 were thawed and then 1.8 ml was taken, which was concentrated 6 times by centrifugation, and then extracted according to the manufacturer's instructions.
  • the V4-V5 region of the 16S rRNA gene was specifically amplified by the polymerase chain reaction method using the primers in Table 7.
  • Example 7 Confirmation of the therapeutic effect of inflammatory bowel disease of the simulated cultured intestinal microbial community culture formulation

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Abstract

본 발명은 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물, 혐기 배양 체계를 이용한 인간 장내 미생물 군집의 모사 배양 방법, 이에 의해 제조된 미생물 제제 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따라 수득된 미생물 군집은 정상 집단의 대변에 포함된 장내 미생물과 유사한 효능을 나타내므로, 장내 미생물 개선, 기능성 식품 및 화장품의 제조 등 다양한 분야에 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물, 혐기 배양 체계를 이용한 인간 장내 미생물 군집의 모사 배양 방법, 이에 의해 제조된 미생물 제제 및 이의 용도
본 발명은 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물, 혐기 배양 체계를 이용한 인간 장내 미생물 군집의 모사 배양 방법, 이에 의해 제조된 미생물 제제 및 이의 용도에 관한 것이다.
포유동물의 장점막 표면에 정착하고 있는 장내 미생물 군집(gut microbiome)은 장관 내부 생태계(ecosystem)를 구성하면서 숙주의 물질 대사에 관여하는 것으로 알려져 있다. 정상의 경우, 그람 음성균인 프로테오박테리아 문 과 박테로이데테스 문, 그리고 그람 양성 세균인 퍼미큐테스 문이 적절한 비율(symbiosis)로 존재하고 있으며, 이들이 장내에 상재 하면서 다른 세균들과 함께 영양분을 획득하기 위해 복잡하고 정교한 생태학적 네트워크 및 생화학적 에너지 흐름을 만들어낸다. 특히 장내 미생물에 의해 생산되는 단사슬 지방산(short chain fatty acids, SCFAs)은 장 상피 세포와 숙주의 면역에 직접적인 영향을 미치는 것으로 알려졌으며 최근의 연구는 장과 뇌 사이에서 생체 신호를 주고받는 장-뇌 연결 축(gut-brain axis)의 존재 가능성과 장내 미생물 불균형에 따른 비만, 당뇨, 염증성 장 질환 등을 보고하며 장내 미생물 군집이 숙주인 사람 및 동물과 직접적인 상호작용을 하고 있음을 시사하고 있다.
한편, 비만과 장내 미생물 군집 변화의 상관관계에 대해서는 렙틴(leptin)이 결핍된 생쥐의 장내 미생물 군집에서 퍼미큐테스 문이 증가하고, 박테로이데테스 문이 감소한다는 것이 처음 보고되었다. 또한 비만을 가진 사람의 장내 미생물 군집에서도 퍼미큐테스 문/박테로이데테스 문의 비율 증가가 확인되어 비만과 장내 미생물 군집 간의 연관성이 사람에서도 유효하다는 것이 알려졌고, 비만 생쥐의 장내 미생물 군집을 이식받은 무균 생쥐가 마른 생쥐의 장내 미생물 군집을 이식받은 생쥐보다 체중이 더 증가한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 사실들을 바탕으로 장내 미생물 군집이 마른 사람과 비만인 사람에게서 다른 양상을 보이며, 더 나아가 장내 미생물 군집의 교체나 외부로부터의 도입이 체내 대사의 변화를 유도할 수 있음을 보여주고 있다.
또한, 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)은 장에 염증 또는 궤양이 발생하여 일련의 복부 경련 및 설사 혈변 등의 증상을 보이고 재발이 반복되는 난치병으로, 염증성 장 질환의 발병 원인은 아직 명확하게 밝혀지지 않았으나, 최근의 연구 결과들에 따르면 유전적, 환경적인 인자, 자가면역증상 등이 원인으로 꼽히고 있으며, 장내 미생물 군집 또한 염증성 장 질환과 높은 상관관계를 갖는 것으로 밝혀졌다. 정상인에서는 박테로이데테스와 퍼미큐테스 및 프로테오박테리아의 비율이 적절히 유지되지만 염증성 장 질환 환자군에서는 유전적 요인과 함께 스트레스, 식이 및 항생제와 같은 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 프로테오박테리아의 폭발적인 증가 등 장내 미생물 군집 조성의 비정상적인 변화를 유도(dysbiosis)하고, 장내 점막 세포에 일련의 면역 반응을 유도하게 되어 결국에는 만성 염증 및 과민성 염증을 유발한다.
또한, 클로스트리디움 디피실 감염증은 클로스트리디움 디피실( Clostridioides difficile)의 감염으로 인하여 증상을 보이는 감염증으로 클로스트리디움 디피실 관련 질병(CDAD, C. difficile associated diarrhea)으로도 알려져 있으며, 클로스트리디움 디피실 균이 A 독소(장 독소, enterotoxin), B 독소(세포 독소, cytotoxin)를 생성하여 장점막에 손상을 주는 것으로 알려져 있다. 항생제 치료, 소화기계 수술, 고령, 입원 및 양성자 펌프 억제제 복용 등을 위험인자로 볼 수 있으며, 발병과 연관성이 높은 항생제로는 clindamycin, cephalosporin, fluoroquinolone 등이 알려져 있다.
이와 같은 항생제 처방은 항생제 내성 획득 균주의 출현을 유도하기 때문에 상기의 염증성 장 질환과 동일하게 건강인의 대변을 이식하는 방법을 시도하고 있다. 분변 이식, 혹은 대변 이식(Fecal Microbiota Transplantation, FMT)은 상기의 장내 미생물 군집과 인간 질병과의 상관관계를 바탕으로 등장한 개념이다. 현재까지 발표된 600건 이상의 증례 보고와 2개의 무작위 비교연구에 따르면, 건강인의 대변을 정제하여 환자의 장내에 도입했을 때, 클로스트리디움 디피실 감염증으로 인한 염증 증상의 개선과 함께 재발이 없는 완치가 90%에 이르렀다는 2012년의 선행 연구를 포함하여 현재까지 클로스트리디움 디피실 감염증 치료를 대변 이식으로 성공했다는 사례가 계속해서 보고되고 있다. 또한, 기존 항생제 치료 군과 비교했을 때에도 재발률 및 부작용 발생이 적고 안정성 역시 기존의 약물치료에 비해 높다는 사례가 보고되고 있다. 최신의 연구들은 장 질환뿐만 아니라 대사 질환, 신경계 질환 및 심혈관계 질환에까지 적응증을 확대하며 최신의 임상으로 주목 받고 있다.
이러한 대변 이식술은 공여자로부터 공여받은 대변을 생리 식염수에 현탁하고 이를 균질화한 뒤 여과하여 2시간 이내에 근위 공장까지 비위관을 삽입한 환자에게 투여하는 등의 방법을 사용하고 있다. 그러나 일반적으로 각종 장 질환 환자의 증상 개선, 체형 변화 유도 등을 위해서는 수 회에 걸쳐 대변 이식술을 시행해야 하는데, 매회 공여자로부터 대변을 공여받아야 하고 원 대변 시료의 보관이 까다로우며 한 번 사용 후 재사용이 어렵다. 또한 공여자의 식이와 같은 환경적 요인들로 인해 공여받은 대변의 미생물 군집이 항상 일정하지 않아 재현성이 보장되지 않는다는 점, 공여자 대변의 오염 여부를 일일이 점검해야 하는 문제점들이 존재한다.
따라서, 상기의 한계점들을 극복하기 위해 현재 대변 이식술 방법을 개선하고자 소량의 원 대변 시료를 캡슐화, 코팅하는 연구들이 시도되고 있으나 현재까지 약의 형태로 개발된 방법은 존재하지 않다. 한편, 위의 문제점들과 함께 사람과 장내 미생물간 상호작용 메커니즘의 본질을 이해하고자 하는 욕구는 장내 환경과 미생물 군집을 모방하려는 시도로 이어졌다.
장내 미생물 군집을 모방하는 것은 접근 방법에 따라서 bottom-up 방식과 top-down 방식으로 나눌 수 있다. Bottom-up 방식은 종래의 유산균 제제들과 마찬가지로 건강한 인간의 장에 존재하는 개별 균주를 분리, 대량 배양한 뒤 이들을 혼합하여 장내 미생물 컨소시엄으로 만드는 방식이다. 그러나 이 방식은 시간, 인력 및 비용적 측면에서 비효율적이라는 것이 여러 선행연구에서 밝혀지고 있으며, 특히 배양 가능한 미생물 분류군 역시 극히 제한적이므로 근본적인 기술적 한계에 부딪히고 있다. 이러한 이유로 Bottom-up 방식으로 실험쥐에 처리된 개별 분리 균주의 최대 수는 33종이다(Martz 등 2015).
Top-down 방식은 대변 자체를 배양하여 장내 미생물 군집을 최대로 유지하는 방법이다. 이 방식은 단독 배양이 불가능한 다양한 계통발생학적 분류군들의 배양이 가능하지만, 2016년의 Takagi 등과 2019년의 Yousi 등의 선행연구에서 보고되었듯이 배양하는 과정에서 군집의 조성이 붕괴되는 한계점을 보여주었다.
한편, 장내 환경 자체를 모방하려는 시도는 2004년 Parlesak 등의 Transwell, 2014년 Mazorati 등에 의한 Host-Microbiota Interaction (HMI TM), 2017년 Hoek의 Human oxygen Bacteria anaerobic (HoxBan) 공배양 체계 및 2012년 김 등의 gut-on-a-chip 등 지난 10년이 넘는 기간 동안 다양한 시도들이 있어왔다. 그러나, 이들 시도는 미생물 생태학적 재현 보다는 장내의 물리화학적 환경 구축에 중점을 두었으며, 특히 배양체계의 복잡성, 재현성 등 아직까지 극복해야 될 난관들이 존재한다.
산업화를 위해서는 구성 성분 혹은 개별적 장내 미생물의 구성이 정확히 알려진, 표준화된 장내 미생물 군집을 대량으로 생산할 수 있어야 하지만 장내 미생물 군집의 복잡성과 구성의 다양한 특징으로 인해 숙주와 장내 미생물 군집 간의 복잡한 상호작용에 대한 기작을 밝히기가 쉽지 않고, 장내 미생물 군집으로부터 개개의 종을 분리하는 것 또한 아직까지 기술적 한계로 어려운 상황이다. 대변이식의 적응증이 장질환 뿐만 아니라 유형2 당뇨병, 비만 등을 포함한 대사질환, 면역질환, 심혈관 질환 및 파킨슨병, 우울증, 알츠하이머 등의 신경계질환까지 그 범위를 확대함에 따라, 장내 미생물 군집 모사 배양의 중요도는 증가하는 실정이다.
본 발명자들은 장내 미생물 군집을 체외에서 모사 배양하여 원 대변과 동일한 미생물 조성을 갖는 방법들을 탐색하던 중 박테로이데테스, 퍼미큐테스, 프로테오박테리아, 푸소박테리아 및 액티노박테리아 등을 포함하는 장내 미생물 군집을 원대변의 것과 유사하게 배양하는 방법을 발견하였고, 이로부터 수득된 장내 미생물 군집이 장질환에 치료적 효과를 가짐을 확인하였기에 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 하나의 목적은 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 혐기성인 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피험체의 대변으로부터 미생물 군집 현탁액을 준비하는 단계; 상기 현탁액을 상기조성물에 접종하는 단계; 및 상기 조성물을 배양하는 단계를 포함하는 인간 장내 미생물 군집 모사 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 모사 배양된 미생물 군집의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물 제제를 포함하는 염증성 장질환 또는 클로스트리디움 디피실 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD) 또는 클로스트리디움 디피실 감염증( Clostridioides difficile infection, CDI)의 치료 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 양상은 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 혐기성인 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 소 뇌 추출물(Calf Brains, infusion), 소 심장 추출물(Beef Heart, infusion) 및 프로테오스 펩톤(Proteose peptone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 수용성 녹말(Soluble starch), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate) 및 L-아르기닌(L-Arginine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 카제인의 췌장 소화물(Pancreatic digest of casein) 및 콩의 파파인 소화물(Papaic digest of soybean)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물의 pH는 7.2 내지 7.4일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 피험체의 대변으로부터 미생물 군집 현탁액을 준비하는 단계; 상기 현탁액을 상기 조성물에 접종하는 단계; 및 상기 조성물을 배양하는 단계를 포함하는 인간 장내 미생물 군집 모사 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양하는 단계는 혐기성 조건에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 시료를 준비하는 단계는 0ppm 내지 40ppm의 산소 조건에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양하는 단계는 24시간 내지 120시간 동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양하는 단계는 0.1 내지 3.0 기압에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 박테로이데테스 문(Bacteroides phylum), 퍼미큐테스 문(Firmicutes phylum), 프로테오박테리아 문(Proteobacteria phylum) 및 액티노박테리아 문(Actinobacteria phylum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물 문일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 방법으로 모사 배양된 미생물 군집의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 미생물 제제를 포함하는 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD) 또는 클로스트리디움 디피실 감염증( Clostridioides difficile infection, CDI) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(Ulcerative Colitis, UC) 또는 크론병(Crohn's Disease, CD)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 클로스트리디움 디피실 감염증은 재발성 클로스트리디움 디피실 감염증(recurrent Clostridioides difficile infection) 또는 난치성 클로스트리디움 디피실 감염증(refractory Clostridioides difficile infection)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD) 또는 클로스트리디움 디피실 감염증( Clostridioides difficile infection, CDI)의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(Ulcerative Colitis, UC) 또는 크론병(Crohn's Disease, CD)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 클로스트리디움 디피실 감염증은 재발성 클로스트리디움 디피실 감염증(recurrent Clostridioides difficile infection) 또는 난치성 클로스트리디움
인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물, 혐기 배양 체계를 이용한 인간 장내 미생물 군집의 모사 배양 방법, 이에 의해 제조된 미생물 제제 및 이의 용도에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 수득된 미생물 군집은 정상 집단의 대변에 포함된 장내 미생물과 유사한 효능을 나타내므로, 장내 미생물 개선, 기능성 식품 및 화장품의 제조 등 다양한 분야에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 인간 장내 미생물 군집의 혐기적 모사 배양 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 모사 배양을 위해 모집된 98명의 공여자군의 평균(Mean of healthy) 및 최종적으로 선택된 공여자의 원 대변(original stool)에 포함된 미생물 문(phylum)의 상대적 분포도(relative abundance)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 유래 장내 미생물 군집을 본 발명의 일 구체예에 따른 BHI(brain heart infusion), FAB(fastidious anaerobe broth), RCM(reinforces Clostridial media), SAM(Schaedler anaerobe media) 또는 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 72시간 동안 배양한 후의 미생물 문(phylum)에서의 상대적 풍부도(relative abundance)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 BHI 배지에서 인간 유래 장내 미생물 군집의 모사 배양 (a) 전 및 (b) 후 배지의 외관을 나타낸 사진이다.
도 5는 BHI 배지에서 인간 유래 장내 미생물 군집의 모사 배양 (a) 전 및 (b) 후 배지의 현미경 사진이다.
도 6은 5개의 혐기배양 배지(BHI, FAB, RCM, SAM, TSB)에서 각각 모사 배양된 인간 유래 장내 미생물 군집의 (a) 시간에 따른 생장 곡선(growth curve) 및 (b) 배양 72시간 후의 각 배지 별 미생물의 양을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 수득된 모사 배양된 건강인 유래의 장내 미생물 군집을 함유하는 미생물 제제로 제형화한 사진이다.
도 8은 (a) BHI, (b) FAB, (c) RCM, (d) SAM 및 (e) TSB 배지에서, 인간 유래 장내 미생물 군집의 배양 시간에 따른 군집의 상대적 풍부도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 5개의 혐기 배지(BHI, FAB, RCM, SAM, TSB)에서 72시간 동안 모사 배양된 인간 유래 장내 미생물 군집에 대한 (a) 샤넌 지수(Shannon's index) 및 (b) 관측된 종(observed species)을 나타낸 그래프이다(ns: non-significant, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005, 및 **** p < 0.0001).
도 10은 (a) 5개의 혐기 배지에서 배양된 시료들의 전체적인 분포 및 (b) 각 배지에서 배양된 시료들의 전체적인 분포를 궤양성 대장염(UC) 환자 및 재발성 CDI 환자의 12개 샘들과 함께 주성분 분석(principal coordinates analysis, PCoA) 2차원 좌표상에 나타낸 그래프 및 (c) 원 대변의 weighted UniFrac 생태학적 거리를 배지별로 나타낸 그래프이다.
도 11은 BHI 배지에서 72시간 배양된 인간 유래 장내 미생물 군집을 동일한 조성의 새로운 배지에 재접종하여 연속 계대 배양한 미생물 군집의 전체적인 분포를 주성분 분석 2차원 좌표상에 나타낸 그래프이다.
도 12는 실험쥐의 (a) 결장(colon) 사진, (b) 결장의 길이 및 (c) 장내 투과도(permeability)를 나타낸 그래프, (d) 비장(spleen) 사진, 및 (e) 비장의 무게를 나타낸 그래프이다.
도 13은 무처리군 실험쥐(Untreated) 및 염증성 장질환이 유도된 실험쥐(DSS)의 (a) TNFα, (b) IL-1β, (c) IFNγ, (d) IL-4, (e) IL-6, (f) IL-10, (g) IL-12 및 (h) IL-17 사이토카인 발현량을 나타낸 그래프이다(ns: non-significant, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005, 및 **** p < 0.0001).
도 14는 (a) 15일간의 무처리군(Untreated), DSS처리군(DSS), 일반 실험쥐의 대변을 투여 받은 군(nFMT), 본 발명의 일 구체예에 따른 건강인 대변을 투여 받은 군(hFMT), 본 발명의 일 구체에에 따른 방법으로 모사 배양된 건강인 유래의 장내 미생물 군집을 투여 받은 군(cFMT)의 15일 동안의 체중 변화(body weight)를 나타낸 그래프, (b) 실험 종료 시점(15일차)에서 각 실험군 별 실험쥐들의 체중을 비교한 그래프(ns: non-significant, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005, 및 **** p < 0.0001), 및 (c) 실험쥐들의 결장 조직을 헤마톡실린과 에오신 염색(hematoxylin and eosin staining, H&E staining)하여 조직병리학적 소견(검은색 화살표: 정상 및 회복 중인 조직, 붉은색 화살표: 염증 및 손상된 조직)을 관찰한 현미경 사진이다.
도 15는 염증성 장질환이 유도된 실험쥐에 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 모사 배양된 건강인 유래의 장내 미생물 군집을 투여한 후, (a) TNFα, (b) IL-1β, (c) IFNγ, (d) IL-4, (e) IL-6, (f) IL-10, (g) IL-12, 및 (h) IL-17 사이토카인 발현량을 나타낸 그래프이다(ns: non-significant, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005, 및 **** p < 0.0001).
도 16은 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 모사 배양된 장내 미생물 군집을 투여한 후, 실험쥐의 장내에서 발견된 (a) 비피도박테리아시아(Bifidobacteriaceae) 및 (b) 아커멘시아시아(Akkermensiaceae) 과(family) 미생물을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 일 양상은 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 혐기성인 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "미생물 군집(microbiota)"은 특정 환경, 특히 신체에 존재하고 있는 미생물들의 무리를 말한다. 신체의 부위에 따라 존재하는 미생물 군집의 구성이 다양하게 나타날 수 있다. 미생물 군집은 비교적 균형을 이루며 안정적으로 유지되나, 음식물 섭취, 생활방식, 위생상태, 약물복용 등 외부적 요인에 따라 군집을 이루는 미생물의 비율이 달라질 수 있으며, 이와 같은 외부적 요인에 의한 인체 미생물 군집 균형의 파괴에 의하여 질병이 유발될 수 있다.
본 발명의 미생물 군집은 예를 들어, 당업계에서 통상적으로 적용되는 기준을 근거로, 알파 다양성, 베타 다양성 및/또는 상대적 풍부도의 검증에 의하여 정상으로 선별되는 인간 유래 장내 미생물 군집일 수 있다.
본 발명의 배지는 예를 들어, 소 뇌 추출물(Beef brain infusion), 소의 심장 추출물(beef heart infusion), 프로테오스 펩톤(proteose peptone), 포도당(dextrose), 염화 나트륨(sodium chloride), 인산수소이나트륨(disodium phosphate), 카제인의 췌장소화물(pancreatic digest of casein), 우육추출물(beef extract), 효모추출물 (yeast extract), 펩톤(peptone), 수용성 녹말 (soluble starch), 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 피루브산 나트륨(sodium pyruvate), L-아르기닌( L-arginine), L-시스테인 염산염( L-cysteine hydrochloride), 피로인산 나트륨(sodium pyrophosphate), 숙신산염(sodium succinate), 헤민 (Hemin), 비타민K (vitamin K), 트리스 하이드록시 메틸아미노메탄 (tris hyroxymethyl aminomethane), 녹말(starch), 아세트산 나트륨(sodium acetate), 황화나트륨(sodium sulfide) 및/또는 레사주린(resazurin)를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 소 뇌 추출물(Calf Brains, infusion), 소 심장 추출물(Beef Heart, infusion) 및 프로테오스 펩톤(Proteose peptone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 수용성 녹말(Soluble starch), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate) 및 L-아르기닌(L-Arginine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 카제인의 췌장 소화물(Pancreatic digest of casein) 및 콩의 파파인 소화물(Papaic digest of soybean)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.
특히, 본 발명의 배지는 소 뇌 추출물, 소 심장 추출물 및 프로테오스 펩톤을 유효성분으로 포함하는 brain-heart infusion media(BHI), 녹말, 피루브산 나트륨 및 L-아르기닌을 유효성분으로 포함하는 fastidious anaerobe broth(FAB), 및 카제인의 췌장 소화물 및 콩의 파파인 소화물을 유효성분으로 포함하는 tryptic soy broth(TSB)인 것이 인간 장내 미생물 군집의 비율을 유지하여 배양하는 모사 배양에 더욱 유용하다.
본 발명의 배지는 혐기성 배지로써, 배양 배지 내의 산소 농도는 30 ppm 미만인 것이 인간 장내 미생물 군집의 모사 배양에 특히 유용하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 배지의 혐기성은 질소(N 2), 수소(H 2), 및 이산화탄소(CO 2)가 100 : 0 : 0 내지 100 : 10 : 10의 부피비로 혼합된 혼합가스에 의한 배지 내 산소의 치환에 의하여 조성될 수 있다. 혼합가스에 의한 배지내 산소의 치환은 배지 부피 1mL를 기준으로 30초 이상이 이루어지는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 2분일 수 있다. 배지에서 산소를 치환하기 위하여 사용하는 혼합가스는 glass copper column로 가열되어, 180℃ 이상인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 350℃일 수 있다. 이와 같은 배지 내 산소의 치환에 의하여, 배지내 산소의 농도는 30 ppm 미만인 혐기성으로 조성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 배지 내의 기압은 1.5 내지 3.0 기압일 수 있으며, 가장 바람직하게는 2.0 기압일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 조성물의 pH는 7.2 내지 7.4일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 피험체의 대변으로부터 미생물 군집 현탁액을 준비하는 단계; 상기 현탁액을 상기 조성물에 접종하는 단계; 및 상기 조성물을 배양하는 단계를 포함하는 인간 장내 미생물 군집 모사 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 첫 번째 단계는 대변으로부터 미생물 군집 현탁액을 준비하는 단계이다.
본 발명의 모사 배양에 의하여 배양된 장내 미생물 군집 미생물의 개체수는 배양된 전체 미생물 개체수 100을 기준으로 1 내지 30일 수 있고, 배양된 장내 미생물 군집을 이루는 미생물은 표 1과 같은 미생물 과의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 유리고세균(Euryarchaeota) 및/또는 프로테오박테리아(Proteobacteria) 과 균주의 개체수는 본 발명의 모사 배양에 의하여 배양된 장내 미생물 군집 미생물 전체 미생물 개체수 100을 기준으로 0 내지 5인 것이 바람직하다.
조합 장내 미생물 군집을 이루는 미생물 과(family)
1 Bacteria, Actinobacteria, Coriobacteria, Coriobacteriales, Coriobacteriaceae
2 Bacteria, Actinobacteria, Coriobacteria, Coriobacteriales, Eggerthellaceae
3 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Bacteroidaceae
4 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Barnesiellaceae
5 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Marinifilaceae
6 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Prevotellaceae
7 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Rikenellaceae
8 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Tannerellaceae
9 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Bacillales, Bacillaceae
10 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Bacillales, Staphylococcaceae
11 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobcillales, Carnobacteriaceae
12 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobcillales, Enterococcaceae
13 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobcillales, Lactobacilliaceae
14 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobcillales, Streptococcaceae
15 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridales, Christensenellaceae
16 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridales, Eubacteriaceae
17 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridales, Bacillales Family XI
18 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridales, Lachnospiraceae
19 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridales, Peptostreptococcaceae
20 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridales, Ruminococcaceae
21 Bacteria, Firmicutes, Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae
22 Bacteria, Firmicutes, Negativicutes, Selenomonadales, Acidaminococcaceae
23 Bacteria, Firmicutes, Negativicutes, Selenomonadales, Veillonellaceae
24 Bacteria, Fusobacteria, Fusobacteriia, Fusobacteriales, Fusobacteriaceae, Fusobacterium
25 Bacteria, Proteobacteria, Deltaproteobacteria, Desulfovibrionales
26 Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Betaproteobacteriales, Burkholderiaceae
27 Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Enterobacteriales, Enterobacteriaceae
28 Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Pasteurellales, Pasteurellaceae
본 단계에서 사용하는 대변은 분쇄기에 의한 균질화 및 거즈에 의한 고형물의 여과로 전처리된 것일 수 있다.
본 단계에서 준비되는 현탁액은 대변의 중량을 기준으로 10배의 완충용액에 재현탁된 것일 수 있다. 이와 같이 준비된 미생물 군집 현탁액은 10 9 cells/g 내지 10 11 cells/g의 미생물을 함유할 수 있고, 바람직하게는 10 10 cells/mL의 미생물을 함유할 수 있다.
현탁액을 준비하는데 사용될 수 있는 완충용액은 예를 들어, 식염수, 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS), 글리세린(glycerol), 또는 이들을 혼합하여 제조한 용액일 수 있고, 바람직하게는 20%(v/v) 글리세린을 0.85(w/v)% 농도로 함유하는 식염수일 수 있다.
본 발명의 두 번째 단계는 상기 현탁액을 상기 조성물에 접종하는 단계이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양하는 단계는 혐기성 조건에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 시료를 준비하는 단계는 0ppm 내지 40ppm의 산소 조건에서 이루어질 수 있다.
첫 번째 및 두 번째 단계가 수행되는 공간의 수소(hydrogen)는 10000ppm 내지 50000ppm 농도인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 18000ppm 농도일 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 단계가 수행되는 공간의 산소(oxygen) 농도는 0ppm 내지 100ppm인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 0ppm 내지 30ppm일 수 있다. 현탁액은 외부 대기로부터 완전히 격리되는 것이 바람직하며, 예를 들어, 알루미늄 캡(cap) 및 오픈 캡(open cap)과 브로모부틸고무(bromo-butyl rubber)의 사용에 의하여 외부 대기 유입이 완전히 차단될 수 있다.
현탁액의 접종 부피는 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물의 부피 100을 기준으로 0.1 내지 30인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1일 수 있다.
본 발명의 마지막 단계는 상기 조성물을 배양하는 단계이다.
미생물 군집 현탁액이 접종된 조성물의 배양은 30℃ 내지 37℃에서 이루어질 수 있고, 바람직하게는 36.5℃에서 이루어질 수 있다. 배양시, 미생물 군집 현탁액이 접종된 조성물을 교반할 수 있다. 예를 들어, 배양기의 분당회전속도(rpm)는 80rpm 내지 250rpm일 수 있고, 보다 바람직하게는 180rpm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양하는 단계는 24시간 내지 120시간 동안 이루어질 수 있다.
미생물 군집 현탁액이 접종된 조성물의 배양은 24시간 내지 120시간 동안 이루어질 수 있고, 바람직하게는 72시간 동안 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 박테로이데테스 문(Bacteroides phylum), 퍼미큐테스 문(Firmicutes phylum), 프로테오박테리아 문(Proteobacteria phylum) 및 액티노박테리아 문(Actinobacteria phylum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물 문일 수 있다.
본 발명의 배양 방법에 의하여 인간 장내 미생물 군집 중, 특히 박테로이데테스 문, 퍼미큐테스 문, 프로테오박테리아 문 및 액티노박테리아 문의 비율을 유지하며 배양할 수 있으므로, 유용한 인간 장내 미생물 군집을 대량으로 배양하는데 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 방법으로 모사 배양된 미생물 군집의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 미생물 군집은 예를 들어, 당업계에서 통상적으로 적용되는 기준을 근거로, 알파 다양성, 베타 다양성 및/또는 상대적 풍부도의 검증에 의하여 정상으로 선별되는 인간 유래 장내 미생물 군집일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 미생물 군집 현탁액은 박테로이데테스 문, 퍼미큐테스 문, 프로테오박테리아 문 및 액티노박테리아 문에 해당하는 각 미생물 문에 대항하는 미생물을 포함할 수 있다. 각 문에 대한 하위 미생물 과(family) 및 각 과에 해당하는 미생물의 현탁액 내 함유 비율은 하기 표 2와 같다.
미생물 문(Phylum) 미생물 과(Family) 전체 미생물 개체수대비 비율(%)
문 과
Actinobacteria Actinomycetaceae 2.5 내지 10 0 내지 0.03
Bifidobacteriaceae 2 내지 5
Coriobacteriaceae 0.1 내지 1.5
Coriobacteriales Incertae Sedis 0 내지 0.055
Eggerthellaceae 0.1 내지 1
Bacteroidetes Bacteroidaceae 15 내지 25 12 내지 20
Barnesiellaceae 0 내지 0.37
Marinifilaceae 0 내지 0.07
Prevotellaceae 0 내지 1.5
Rikenellaceae 0 내지 1.5
Tannerellaceae 0.05 내지 7.5
Firmicutes Bacillaceae 65 내지 75 0 내지 0.01
Bacillales Family XI 0 내지 0.01
Carnobacteriaceae 0 내지 0.03
Enterococcaceae 1 내지 4
Lactobacillaceae 0 내지 5
Leuconostocaceae 0 내지 0.2
Lactobacillales P5D1-392 0 내지 0.03
Christensenellaceae 0 내지 0.5
Clostridiaceae 1 0.5 내지 15
Eubacteriaceae 0.1 내지 1.5
Clostridiales Family XI 0 내지 2
Clostridiales Family XIII 0 내지 0.3
Lachnospiraceae 18 내지 23
Peptostreptococcaceae 0.3 내지 0.8
Ruminococcaceae 4 내지 8.5
Erysipelotrichaceae 0.5 내지 1
Acidaminococcaceae 0 내지 0.9
Veillonellaceae 5 내지 12
Fusobacteria Fusobacteriaceae 0 내지 0.1 0 내지 0.1
Proteobacteria Rhodospirillales uncultured 0 내지 1.5 0 내지 0.4
Desulfovibrionaceae 0 내지 0.35
Burkholderiaceae 0 내지 0.35
Enterobacteriaceae 0 내지 1
　Verrucomicrobia Akkermansiaceae 0 내지 0.1 0 내지 0.1
본 발명의 일 구체예에 따른 미생물 군집 현탁액에 포함된 각 미생물 군집은 예를 들어, 전체 미생물 개체수 100을 기준으로, 표 3과 같은 비율 및 조합의 미생물 문의 미생물을 포함할 수 있다.
조합 장내 미생물 군집을 이루는 미생물 문(Phylum) 비율(전체 미생물 개체수 100 기준)
1 Bacteria, Actinobacteria 2.5 - 10
2 Bacteria, Bacteroidetes 15 - 25
3 Bacteria, Firmicutes 65 - 75
4 Bacteria, Fusobacteria 0 - 0.1
5 Bacteria, Proteobacteria 0 - 1.5
6 Bacteria, Verrucomicrobia 0 - 0.1
본 발명의 일 구체예에 따른 미생물 군집 현탁액에 포함된 각 미생물 군집은 예를 들어, 전체 미생물 개체수 100을 기준으로, 표 4와 같은 비율 및 조합의 미생물 과의 미생물을 포함할 수 있다.
조합 장내 미생물 군집을 이루는 미생물 과(Family) 비율(전체 미생물 개체수 100 기준)
1 Bacteria, Actinobacteria, Actinomycetales, Actinomycetaceae 0 - 0.03
2 Bacteria, Actinobacteria, Bifidobacteriales, Bifidobacteriaceae 2 - 5
3 Bacteria, Actinobacteria, Coriobacteriia, Coriobacteriales, Coriobacteriaceae 0.1 - 1.5
4 Bacteria, Actinobacteria, Coriobacteriia, Coriobacteriales, Coriobacteriales Incertae Sedis 0 - 0.055
5 Bacteria, Actinobacteria, Coriobacteriia, Coriobacteriales, Eggerthellaceae 0.1 - 1
6 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Bacteroidaceae 12 - 20
7 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Barnesiellaceae 0 - 0.37
8 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Marinifilaceae 0 - 0.07
9 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Prevotellaceae 0 - 1.5
10 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Rikenellaceae 0 - 1.5
11 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Tannerellaceae 0.05 - 7.5
12 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Bacillales, Bacillaceae 0 - 0.01
13 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Bacillales Family XI 0 - 0.01
14 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales, Carnobacteriaceae 0 - 0.03
15 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales, Enterococcaceae 1 - 4
16 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales, Lactobacillaceae 0 - 5
17 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales, Leuconostocaceae 0 - 0.2
18 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales P5D1-392 0 - 0.03
19 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Christensenellaceae 0 - 0.5
20 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Clostridiaceae 1 0.5 - 15
21 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Eubacteriaceae 0.1 - 1.5
22 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales Family XI 0 - 2.0
23 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales Family XIII 0 - 0.3
24 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae 18 - 23
25 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Peptostreptococcaceae 0 - 0.8
26 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae 4 - 8.5
27 Bacteria, Firmicutes, Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae 0.5 - 1
28 Bacteria, Firmicutes, Negativicutes, Selenomonadales, Acidaminococcaceae 0 - 0.9
29 Bacteria, Firmicutes, Negativicutes, Selenomonadales, Veillonellaceae 5 - 12
30 Bacteria, Fusobacteria, Fusobacteriales, Fusobacteriaceae 0 - 0.1
31 Bacteria, Proteobacteria, Alphaproteobacteria, Rhodospirillales uncultured 0 - 0.4
32 Bacteria, Proteobacteria, Deltaproteobacteria, Desulfovibrionales, Desulfovibrionaceae 0 - 0.35
33 Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Betaproteobacteriales, Burkholderiaceae 0 - 0.35
34 Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Enterobacteriales, Enterobacteriaceae 0 - 1
35 Bacteria, Verrucomicrobia, Verrucomicrobiae, Verrucomicrobiales, Akkermansiaceae 0 - 0.1
본 발명의 일 구체예에 따른 미생물 군집 현탁액에 포함된 각 미생물 군집은 예를 들어, 전체 미생물 개체수 100을 기준으로, 표 5와 같은 비율 및 조합의 미생물 속의 미생물을 포함할 수 있다.
조합 장내 미생물 군집을 이루는 미생물 속(genus) 비율(전체 미생물 개체수 100 기준)
1 Bacteria, Actinobacteria, Bifidobacteriales, Bfidobacteriaceae, Bifidobacterium 2 - 5
2 Bacteria, Actinobacteria, Coriobacteriia, Coriobacteriales, Coriobacteriaceae, Collinsella 0.2 - 1.5
3 Bacteria, Actinobacteria, Coriobacteriia, Coriobacteriales, Coriobacteriales Incertae Sedis, Raoultibacter 0 - 0.045
4 Bacteria, Actinobacteria, Coriobacteriia, Coriobacteriales, Eggerthellaceae, Eggerthella 0.1 - 1
5 Bacteria, Actinobacteria, Coriobacteriia, Coriobacteriales, Eggerthellaceae, Enterorhabdus 0 - 0.02
6 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Bacteroidaceae, Bacteroides 12 - 20
7 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Barnesiellaceae, Barnesiella 0 - 0.04
8 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Barnesiellaceae, Coprobacter 0 - 0.02
9 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Marinifilaceae, Odoribacter 0 - 0.05
10 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Prevotellaceae, Paraprevotella 0 - 0.01
11 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Rikenellaceae, Alistipes 0 - 0.2
12 Bacteria, Bacteroidetes, Bacteroidia, Bacteroidales, Tannerellaceae, Parabacteroides 6 - 7.5
13 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Bacillales, Bacillaceae, Bacillus 0 - 0.01
14 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales, Carnobacteriaceae, Granulicatella 0 - 0.03
15 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales, Enterococcaceae, Enterococcus 1 - 4
16 Bacteria, Firmicutes, Bacilli, Lactobacillales P5D1-392, Streptococcus sp. oral clone ASCB12 0 - 0.03
17 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Christensenellaceae, Catabacter 0 - 0.055
18 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Christensenellaceae, Christensenellaceae R-7 group 0 - 0.01
19 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Clostridiaceae 1, Clostridium sensu stricto 1 0.5 - 15
20 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Clostridiaceae 1, Clostridium sensu stricto 3 0 - 0.1
21 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Clostridiaceae 1, Clostridium sensu stricto 13 0 - 0.03
22 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Clostridiaceae 1, Sarcina 0 - 0.03
23 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Eubacteriaceae, Anaerofustis 0 - 0.055
24 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Eubacteriaceae, Eubacterium 0.3 - 1.5
25 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales Family XI, Peptoniphilus 0.01 - 0.2
26 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Eubacterium fissicatena group 0 - 0.02
27 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Eubacterium hallii group 0 - 2
28 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Eubacterium ventriosum group 0 - 0.6
29 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Ruminococcus gnavus group 0 - 0.08
30 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Ruminococcus torques group 0 - 1
31 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Agathobacter 0 - 0.06
32 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Anaerostipes 0 - 0.5
33 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Blautia 0 - 0.6
34 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Coprococcus 1 0 - 0.4
35 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Coprococcus 2 0 - 0.02
36 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Coprococcus 3 0 - 0.6
37 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Dorea 3 - 6
38 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Fusicatenibacter 0 - 0.02
39 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Hungatella 0 - 0.3
40 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Lachnoclostridium 5 - 10
41 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Lachnoclostridium 5 0 - 0.25
42 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae FCS020 group 0 - 0.03
43 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceaee NK4A136 group 0 - 0.04
44 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae UCG-004 0 - 5
45 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae UCG-006 0 - 0.3
46 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae UCG-008 0 - 0.4
47 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Roseburia 0 - 0.7
48 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Sellimonas 0 - 0.35
49 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Shuttleworthia 0 - 0.05
50 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae, Tyzzerella 0 - 0.7
51 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Lachnospiraceae uncultured 0 - 2
52 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Peptostreptococcaceae, Asaccharospora 0 - 0.5
53 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Peptostreptococcaceae, Intestinibacter 0 - 0.4
54 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Peptostreptococcaceae, Paraclostridium 0 - 0.1
55 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Peptostreptococcaceae, Peptoclostridium 0 - 0.04
56 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Peptostreptococcaceae, Romboutsia 0 - 0.05
57 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Peptostreptococcaceae uncultured 0 - 0.5
58 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Eubacterium coprostanoligenes group 0 - 0.01
59 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Acetanaerobacterium 0 - 0.15
60 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Butyricicoccus 0 - 0.2
61 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Candidatus Soleaferrea 0 - 0.5
62 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Faecalibacterium 0 - 0.8
63 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Flavonifractor 1 - 2
64 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Intestinimonas 0.1 - 0.3
65 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Oscillibacter 0 - 1.5
66 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Oscillospira 0 - 0.05
67 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Phocea 0 - 0.01
68 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminiclostridium 5 0 - 0.03
69 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae UCG-002 0 - 0.15
70 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae UCG-003 0 - 0.4
71 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae UCG-004 0 - 0.7
72 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae UCG-013 0 - 0.35
73 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae, Subdoligranulum 0.01 - 0.04
74 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae UBA1819 0.01 - 0.1
75 Bacteria, Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Ruminococcaceae uncultured 2 - 4
76 Bacteria, Firmicutes, Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae, Clostridium innocuum group 0 - 0.15
77 Bacteria, Firmicutes, Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae, Dielma 0 - 0.07
78 Bacteria, Firmicutes, Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae, Erysipelatoclostridium 0 - 1.5
79 Bacteria, Firmicutes, Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae UCG-003 0 - 0.5
80 Bacteria, Firmicutes, Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae, Holdemania 0 - 0.01
81 Bacteria, Firmicutes, Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae, Turicibacter 0 - 0.01
82 Bacteria, Firmicutes, Negativicutes, Selenomonadales, Acidaminococcaceae, Phascolarctobacterium 0.3 - 1
83 Bacteria, Firmicutes, Negativicutes, Selenomonadales, Veillonellaceae, Allisonella 1.5 - 3
84 Bacteria, Firmicutes, Negativicutes, Selenomonadales, Veillonellaceae, Megamonas 0 - 10
85 Bacteria, Firmicutes, Negativicutes, Selenomonadales, Veillonellaceae, Veillonella 0 - 0.01
86 Bacteria, Fusobacteria, Fusobacteriia, Fusobacteriales, Fusobacteriaceae, Fusobacterium 0 - 0.1
87 Bacteria, Proteobacteria, Deltaproteobacteria, Desulfovibrionales, Desulfovibrionaceae, Bilophila 0 - 0.4
88 Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Betaproteobacteriales, Burkholderiaceae, Parasutterella 0 - 0.03
89 Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Betaproteobacteriales, Burkholderiaceae, Sutterella 0 - 0.3
90 Bacteria, Verrucomicrobia, Verrucomicrobiae, Verrucomicrobiales, Akkermansiaceae, Akkermansia 0 - 0.1
본 발명의 미생물 제제의 제형은 예를 들어, 액상 형태일 수 있고, 증량제가 첨가된 분말 형태일 수 있으며, 제형화하여 과립화 또는 캡슐화된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미생물 제제는, 모사 배양된 미생물 군집의 배양물, 상기 배양물의 농축물 또는 상기 배양물의 건조물에 첨가제, 증량제, 영양제 등의 부가제가 더 첨가되어 제조된 것일 수 있다. 이때, 첨가제로 사용될 수 있는 물질로는 예를 들어, 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 증량제 및 영양제로는 skim milk(배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트(bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 인간 유래 장내 미생물 군집을 모사 배양한 배양물은 혐기적 및 호기적으로 동결건조하여 보관될 수 있고, 식염수, 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline; PBS), 글리세린(glycerol) 또는 이들을 혼합에 의하여 제조된 용액의 사용에 의하여 보관될 수 있다. 예를 들어, 20%(v/v) 글리세린을 0.85(w/v)% 농도로 함유하는 식염수 및 인간 유래 장내 미생물 군집을 모사 배양한 배양물을 1 대 1로 혼합하고, -80℃에서 냉동하여 보관될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 미생물 제제는 대변 이식술, 각종 장 질환의 개선, 미생물 감염 개선, 체형 개선, 반려동물과 가축의 장내 미생물 군집 개선용으로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 미생물 제제를 포함하는 기능성 식품 및 화장품의 제조, 농업용 퇴비 발효용, 축산용 사료 발효용 및 축산용 기능성 미생물 제제로 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 미생물 제제를 포함하는 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD) 또는 클로스트리디움 디피실 감염증( Clostridioides difficile infection, CDI) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington: the science and practice of pharmacy 22nd edition (2013)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 염증성 장질환에 대한 예방 또는 치료 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 염증성 장질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물치료 및/또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 1000㎎/㎏일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(Ulcerative Colitis, UC) 또는 크론병(Crohn's Disease, CD)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 클로스트리디움 디피실 감염증은 재발성 클로스트리디움 디피실 감염증(recurrent Clostridioides difficile infection) 또는 난치성 클로스트리디움 디피실 감염증(refractory Clostridioides difficile infection)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD) 또는 클로스트리디움 디피실 감염증( Clostridioides difficile infection, CDI)의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 정상 집단의 대변에 포함된 장내 미생물과 유사한 효능을 나타내므로, 상기 조성물이 염증성 장질환 및/또는 클로스트리디움 디피실 감염증 환자에 투여됨으로써, 상기 질환의 치료가 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(Ulcerative Colitis, UC) 또는 크론병(Crohn's Disease, CD)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 클로스트리디움 디피실 감염증은 재발성 클로스트리디움 디피실 감염증(recurrent Clostridioides difficile infection) 또는 난치성 클로스트리디움 디피실 감염증(refractory Clostridioides difficile infection)일 수 있다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 대변 시료 준비
1-1. 대변 시료 공여자 선발
인간 유래 장내 미생물 군집의 모사배양을 위한 전체적인 모식도는 도 1과 같다.
모사 배양에 필요한 인간의 장내 미생물 군집의 획득을 위하여, 공여자의 건강상태 및 생활습관을 확인하기 위한 설문을 실시하여 1차 후보군을 선발하고, 선별된 1차 후보군으로부터 총 98개의 대변 시료를 분변 검사용 키트의 사용에 의해 공여 받았다. 공여 받은 대변 시료에 대하여 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)을 수행하여, 대변 시료의 알파 다양성(α-diversity), 베타 다양성(β-diversity) 및 상대적 풍부도(relative abundance)를 기준으로 1차 건강인 후보군을 선정하였다. 1차 후보군의 장내 미생물 군집 분석을 바탕으로, 2명의 우수한 공여자를 선발하였으며, 혈액검사로 병원성 미생물 및 바이러스의 감염 여부를 확인한 뒤, 최종 1명의 공여자를 선발하였다.
98개의 대변 시료에 대한 염기서열을 분석한 결과, 각 시료로부터 평균적으로 28,198±20,657개의 서열 조각(sequence reads)을 얻었으며 희박화 곡선(rarefaction curve)이 모든 시료에서 수렴함을 확인하여, 각 시료에 대한 생물학적 환경이 충분히 반영됨을 확인하였다. 또한, 상기 시료들의 상대적 풍부도는 10% 내지 45% 비율의 박테로이데테스 문, 20% 내지 85% 비율의 퍼미큐테스 문, 및 0% 내지 5% 비율의 프로테오박테리아 문인 것으로 확인되었다. 알파 다양성 지수에서, 샤넌 지수 기준 3.0 이상, 심슨 지수 기준 0.65 이상, 관측된 종(observed species) 기준 250 이상, Chao1 지수 기준 320 이상, 마가레프(Margalef) 지수 25 이상임을 확인하여 공여자들의 장내 미생물 군집이 건강인의 범주에 포함됨을 검증하였으며, 혈액 검사와 병행하여 1차 후보군의 대변 시료 중 가장 평균에 가까운 공여자 1명을 선발하였다(도 2).
1-2. 대변 시료 처리
실시예 1-1에서 선발한 공여자로부터 1개의 시료당 각 최소 120±27g 이상의 대변 시료를 확보하였으며, 확보한 대변 시료 중의 일부는 -80℃에서 냉동보관 하였고, 여분의 시료는 20% 글리세린을 함유한 0.85% 생리식염수로 중량 대비 10배 현탁하였다. 각 대변 시료에서 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 생균수를 측정한 결과, 각 대변 시료에 그람(gram)당 약 10 9 내지 10 11개의 장내 미생물이 함유되어 있는 것으로 확인되었다. 완충용액에 현탁된 대변 시료는 실험에 사용하기 전까지 -80℃에서 냉동 보관되었다. 대변 시료 전처리 과정은 혐기성 챔버에서 산소(oxygen) 농도 0ppm 내지 40ppm 및 수소(hydrogen) 농도 10000ppm 내지 50000ppm 조건에서 수행되었다.
한편, 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC) 및 재발성 클로스트리디움 디피실 감염증(recurrent Clostridioides difficile infection, rCDI) 환자로부터 12개의 대변 시료를 공여받아, 본 발명의 모사 배양 방법에 의해 배양된 인간 유래 장내 미생물 군집 및 건강인 집단의 대변 시료와 비교하였다.
실시예 2. 대변 시료의 모사 배양을 위한 배지 제작
대변 시료의 모사 배양을 수행하기 위하여, 표 6의 조성을 갖는 5종의 배지를 제작하였다.
구체적으로, 질소 공급원 및 에너지 공급원으로써, 소 뇌 추출물(Beef brain infusion), 소의 심장 추출물(beef heart infusion), 프로테오스 펩톤(proteose peptone), 탄소 공급원으로써 포도당(dextrose), 염 농도 조절 목적의 염화 나트륨(sodium chloride), 수소 이온 농도 조절 목적의 인산수소이나트륨(disodium phosphate), 배지 내 산소 제거 목적의 황화나트륨(sodium sulfide), 및/또는 배양액 내의 산소 존재 여부를 확인하기 위한 목적의 레사주린(resazurin) 등이 포함되도록 배지를 제작하였다. 제작한 배지에서 산소를 제거하여 혐기적 조건을 갖도록 하기 위하여, 300 내지 350℃로 가열된 질소(N 2) 가스를 제작된 5종 배지에 1mL 당 30초 이상 처리하여 배지에 포함된 산소를 제거하고, 121℃ 및 15분 조건에서 멸균하여 사용하였다.
성분 %(w/v)
BHI FAB RCM SAM TSB
소 뇌 추출물(Calf Brains, infusion) 0.77 - - - -
소 심장 추출물(Beef Heart, infusion) 0.98 - - - -
카제인의 췌장 소화물(Pancreatic digest of casein) - - - 0.56 1.7
콩의 파파인 소화물(Papaic digest of soybean) - - - 0.1 0.3
프로테오스 펩톤(Proteose peptone) 1 - - - -
포도당(Dextrose) 0.2 0.1 0.5 0.582 0.25
염화 나트륨(Sodium chloride) 0.5 0.5 0.5 0.17 0.5
인산 이칼륨(Dipotassium phosphate) 0.25 - - - 0.25
인산 칼륨(Potassium phosphate) - - - 0.082 -
우육 추출물(Beef extract) - - 1 0.5 -
효모 추출물(Yeast extract) - - 0.3 0.5 -
펩톤(Peptone) - 2.3 1 - -
수용성 녹말(Soluble starch) - 0.1 - - -
탄산 수소 나트륨(Sodium bicarbonate) - 0.04 - - -
피루브산 나트륨(Sodium pyruvate) - 0.1 - - -
L-아르기닌( L-Arginine) - 0.1 - - -
L-시스테인 염산염(L-Cysteine hydrochloride) - 0.05 0.05 0.04 -
피로 인산 나트륨(Sodium pyrophosphate) - 0.025 - - -
숙신산 나트륨(Sodium succinate) - 0.05 - - -
헤민(Hemin) - 0.001 - 0.001 -
비타민 K (Vitamin K) - 0.0001 - - -
트리스 하이드록시 메틸아미노메탄(Tris hydroxymethyl aminomethane) - - - 0.3 -
녹말(Starch) - - 0.1 - -
아세트산 나트륨(Sodium acetate) - - 0.3 - -
황화 나트륨(Sodium sulfide) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
레사주린(Resazurin) 0.002 0.002 0.002 0.002 0.002
수소이온농도(pH) 7.4 7.2 6.8 7.6 7.3
실시예 3. 대변 시료의 모사 배양 및 제형화
3-1. 대변 시료의 배양
인간 유래 장내 미생물 군집의 모사 배양을 위하여, 실시예 1-2에서 준비한 대변 시료 현탁액을 사용하였으며, 모든 실험군에서 실시예 2에서 제작한 각 배지별로 3반복 수행하였다. 시료 현탁액은 0.1 내지 10%(v/v)가 되도록 접종되었으며, 배지의 배양은 30℃ 내지 37℃ 및 80rpm 내지 250rpm 조건의 배양기에서 이루어졌다.
그 결과, 98명의 공여자군의 평균(Mean of healthy) 및 최종적으로 선택된 공여자의 원 대변(original stool)에 포함된 미생물 문(phylum)의 상대적 분포도(relative abundance)는 도 3과 같이 확인되었다. 인간 유래 장내 미생물 군집의 모사 배양을 확인하기 위하여 육안으로 관찰한 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 증식 전 투명하던 배지가 모사 배양 후 불투명하게 된 것으로 나타나, 미생물 군집이 증식된 것으로 확인되었다. 또한, 현미경 관찰 결과, 도 5a 및 5b에 나타난 바와 같이 증식 후 단위 넓이당 미생물이 현저하게 증가한 것으로 확인되었다.
3-2. 배양에 따른 미생물의 생장 곡선 확인
인간 유래 장내 미생물 군집의 모사 배양에 따른 생장 곡선의 확인을 위하여, 실시예 1-2에서 준비한 대변 시료 현탁액을 실시예 2에서 제작한 각 배지에 0.1 내지 30%(v/v)가 되도록 접종하였으며, 이때 혈구 계수기에 의해 확인된 생균수는 약 10 7 cells/mL였다. 접종 직후부터 대수 증식기가 끝나는 24시간까지 매 3시간 간격으로 생균수를 측정하였으며, 24시간 이후부터는 24시간 간격으로 생균수를 72시간까지 측정하여 생장 곡선(growth curve)을 작성하였다.
그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, 초기 균체량은 약 10 7cells/mL로, 배양 24시간 후 약 10 9cells/mL까지 생장하였으며, 배양 종결 시점(72시간)에서 관측된 생균수는 약 10 9cells/mL로 확인되었다. 또한, 배양 종결 시점에서 각 배지 별 장내 미생물의 개수를 관측한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, BHI(brain-heart infusion media) 배지, FAB(fastidious anaerobe broth) 배지 및 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 다른 2개의 배지 대비 유의미하게( p < 0.05) 높은 생장이 이루어진 것으로 확인되었다.
원 대변(original stool)의 미생물 군집 구성과 가장 유사한 배양 시간을 탐색하기 위하여, 상기 생장 곡선 작성 결과를 바탕으로, 배양된 장내 미생물 군집 접종 후 0시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간에 배양액 시료를 시간대별로 회수한 다음, 차세대 염기서열 분석에 사용하기 전까지 회수한 배양액 시료를 -80℃에서 냉동 보관하였다.
3-3. 모사 배양된 건강인 유래 장내 미생물 군집의 제형화
모사 배양된 건강인 유래 장내 미생물 군집을 현행 대변이식술과 동일한 방법으로 개체에 투여하기 위하여, 0.85% 생리식염수, 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS), 20% 글리세린(glycerol), 20% 글리세린을 함유한 0.85% 생리식염수 및 50% 글리세린 등으로 이루어진 완충액군으로부터 하나 이상의 완충액을 선택하여 모사 배양된 미생물 군집의 BHI 배지 배양물과 1 대 1로 혼합하여 액상 형태로 제형화하였다(도 7).
실시예 4. 대변 시료의 최적 모사 배양 배지 확인
4-1. 대변 시료 배양에 따른 상대적 풍부도 평가
실시예 1에서 공여 받은 97개의 시료, 배양 접종액으로 선택된 1개의 원 대변 시료(original stool) 및 실시예 3에서 회수한 배양액 시료에 대하여, DNA를 추출하였다.
구체적으로, 당업계의 통상적인 방법에 따라 QIAmp Power Fecal DNA Pro Kit(QIAGEN, 독일)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 실시예 1의 원 대변 시료 현탁액 및 모사 배양된 인간 유래 장내 미생물 군집 배양액을 해동한 뒤 1.8㎖를 취하였으며, 이를 원심분리로 6배 농축한 다음, 제조사의 지시에 따라 추출하였다. 추출한 DNA로부터 중합효소연쇄반응법으로 16S rRNA 유전자의 V4-V5영역을 표 7의 프라이머를 사용하여 특이적으로 증폭하였다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
515F GTGNCAGCMGCCGCGGTRA 서열번호 1
907R CCGYCWATTYHTTTRAGTTT 서열번호 2
국제 순수 응용 화학 연합(International Union of Pure and Applied Chemistry; IUPAC)의 ambiguity code 표기법에 따라, 상기 표 7의 프라이머 염기서열 중 일반적인 염기 A(adenine), T(thiamine), G(guanine) 및 C(cytosine)을 제외한 염기 서열의 의미는 다음과 같다:
N: A, T, G 또는 C
M: A 또는 C
R: A 또는 G
Y: C 또는 T
W: A 또는 T
H: A, C 또는 T.
수득된 PCR 산물로부터 AMPure XP(BECKMAN COULTER, 미국)을 이용해 약 550bp 길이의 DNA 절편을 특이적으로 선택하였다. Illumina 사의 MiSeq TM을 이용하여, 2 X 301bp 페어드-엔드(paired-end) 방식으로 염기서열을 획득하였으며, MiSeq TM Control Software(MCS)으로 후처리를 수행하였다.
수득된 원시 서열 데이터(raw sequence data)는 Quantitative insights into microbial ecology 1(Qiime1, version 1.9.1)을 이용하여 데이터 처리하였다.
구체적으로, 염기서열의 정확도를 FastQC로 확인한 다음, Phred quality score 기준으로 최소 Q30(99.9%의 정확도) 이상 및 250bp 이상의 길이를 갖는 서열조각만을 추출하였다. VSEARCH를 이용하여 키메라 서열(chimeric sequence)를 제거하였으며, SILVA 16S rRNA gene 데이터 베이스(release 132)를 이용하여 운영분류단위(operational taxonomic units, OTU)를 분류하였다. 이로부터 획득한 OTU 표(OTU table)는 상대적 분포도와 알파 및 베타 다양성 분석에 사용되었다.
각 시간대별 배양액들의 상대적 풍부도를 차세대 염기서열 분석을 통하여 확인한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 원 대변 시료는 다른 97개의 정상 대변 시료와 유사한 장내 미생물 군집의 평균적인 구성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 접종 후 약 72시간 경과시 BHI, FAB 및 TSB 배지의 상대적 분포도(relative abundance)가 원래의 군집 구성과 유사하게 회복되는 것으로 확인되었다.
4-2. 대변 시료 배양에 따른 알파 다양성 평가
모사 배양된 인간 유래 장내 미생물 군집과 98개의 정상 대변 시료의 생태적 통계학적인 유사도를 평가하기 위하여, 원 대변, 이들의 배양액 및 97개의 정상 대변 시료에 대해 알파 다양성을 조사하였다.
구체적으로, 배양된 미생물 군집의 풍부도를 평가하기 위하여 샤넌 지수(Shannon's index)를 사용하였고(도 9a), 생장한 종의 수를 평가하기 위하여 관측된 종(observed species)을 사용하였다(도 9b).
그 결과, 원 대변의 경우, 다른 97개의 정상 대변 대비 미생물 군집의 풍부도 및 관측된 종의 수가 유사하거나 높은 것으로 확인되었다. 한편, 72시간 동안 원 대변이 배양된 5개의 혐기 배지 중, BHI 배지에서 풍부도 및 관측된 종의 수 모두 원 대변과 유사한 값을 나타내고, FAB 배지 및 TSB 배지 대비 높은 풍부도 및 관측된 종의 수가 확인되어(도 9), 실시예 4-1의 상대적 분포도(relative abundance) 결과와 일치하는 것으로 확인되었다.
4-3. 대변 시료 배양에 따른 베타 다양성 평가
대변 시료 간의 거리가 생태학 및 통계적으로 얼마나 유사한지를 평가하기 위하여, 베타 다양성을 조사하였다.
구체적으로, 통계 분석을 위하여, 당업계의 통상적인 방법에 따라 주성분 분석(principal coordinates analysis, PCoA)하고, weighted UniFrac을 사용하여 각 시료 간의 거리 산출하였으며, 계통 분류학상 종(species) 수준에서 확인하였다.
그 결과, 도 10a와 도 10c에 나타난 바와 같이, 원 대변이 건강인 집단의 범주에 포함됨과 동시에, BHI 배지에서 모사 배양된 장내 미생물 군집이 FAB 배지 및 TSB 배지 대비 원 대변과 가장 유사한 것으로 확인되어, 실시예 4-1의 상대적 분포도 결과 및 실시예 4-2의 알파 다양성 결과와 일치하는 것으로 확인되었다. 또한, 환자 집단의 시료는 도 10b에 나타난 바와 같이, 건강인, 원 대변 시료, 및 발명의 모사 배양 방법으로 배양된 인간 유래 장내 미생물 군집과 구별되는 것으로 확인되었다.
이와 같은 결과를 통하여, 원 대변으로부터 BHI, FAB 및 TSB 배지에서 모사 배양된 인간 유래 장내 미생물 군집은 배양 48시간 이후부터 정상 집단의 범주에 포함되어 모사 배양 후에도 정상 집단의 대변과 생태적 및 통계적으로 유사한 것으로 확인되었고, 특히, 모사 배양을 수행하는데 있어서, BHI 배지가 최적 배지인 것으로 확인되었다.
실시예 5. 공여 받은 대변으로부터 모사 배양된 시료의 재현성 검증
실시예 3에서 모사 배양된 인간 유래의 장내 미생물 군집의 미생물 조성 재현성을 확인하기 위하여, 실시예 3의 방법과 동일한 방법으로 BHI 배지의 72시간 배양액을 사용하여 수 회 연속적인 배양을 수행하였다. 배양 후, 배양액으로부터 미생물 군집의 핵산을 추출하고, 차세대 염기서열 분석을 수행하였다.
구체적으로, 확보된 염기서열의 정보들은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하였으며, 통계 분석을 위하여, 당업계의 통상적인 방법에 따라 주성분 분석하고, weighted UniFrac을 사용하여 각 시료 간의 거리 산출하였으며, 계통 분류학상 종(species) 수준에서 확인하였다.
그 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이 수 차례 연속적으로 모사 배양된 인간 장내 미생물 군집이 정상 집단의 범주에 포함된 것으로 확인되어, 원 대변의 미생물 군집을 모사하여 대변 시료의 연속적 모사 배양이 가능한 것으로 확인되었다.
실시예 6. 실험쥐의 염증성 장질환 유도
6-1. 염증성 장질환 모델 제작
실험쥐의 대면, 사람의 대변 및 실시예 3-3의 모사 배양된 건강인 유래 장내 미생물 군집 제형의 염증성 장질환 치료 효과를 확인하기 위하여, 실험쥐에 염증성 장질환을 유도하였다.
실험쥐로는 총 43마리의 C57BL/6J strain을 사용하였으며, 23±3℃ 및 습도 60±5%의 일반적인 조건에서 총 15일간 사육하였다. 염증성 장질환은 2%(w/v) 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, DSS) 수용액을 대장에 투여하여 유도하였다. 실험군은 다음과 같이 설정하였다: 무처리군(Untreated) 11마리, 음성 대조군으로써 2% DSS만을 처리한 군(DSS) 11마리, 양성 대조군으로써 2% DSS 처리 후 무처리군의 실험쥐 대변을 이식받은 군(normal mouse fecal microbiota transplantation, nFMT) 7마리, 실시예 1의 건강인 유래 원 대변(original stool)을 이식받은 군(human fecal microbiota transplantation, hFMT) 7마리 및 실험군으로써 실시예 3-3에서 모사 배양된 건강인 유래 장내 미생물 군집을 투여 받은 군(cultured human fecal microbiota transplantation, cFMT) 7마리로, 총 5개의 실험군으로 나누어 실험하였다.
실험쥐는 약 열흘 간의 안정화 기간을 거친 뒤, 무처리군을 제외한 나머지 4개의 군(DSS, nFMT, hFMT 및 cFMT)에 7일간 2%의 DSS를 투여하였고, 실험 9일차부터 11일차까지 대조물질 및 실험물질로써, 실험쥐의 대면, 사람의 대변 또는 실시예 3-3의 모사 배양된 건강인 유래 장내 미생물 군집 제형을 실시예 4-2의 방법으로 실험쥐에 투여하였다.
6-2. 모사 배양된 건강인 유래 장내 미생물 군집 배양체의 투여
염증성 장질환이 유도된 실험쥐의 대변이식은 실험 9일차부터 11일차까지 실험쥐 당 10㎕/g/day 용량으로 1일 1회 투여하였다.
구체적으로, DSS 군에는 위약효과 및 제형화에 사용된 완충액의 효과를 판단하기 위한 모의처리(mock treatment)로써, 실시예 3-3에서 모사 배양된 미생물 군집의 배양물을 액상 형태로 제형화할 때 사용한 것과 동일한 조성의 완충액을 투여하였다. nFMT 군에는 일반 쥐 유래의 대변을 균질화하여 완충액에 10%(w/v) 농도로 현탁한 현탁액을 투여하였다. hFMT 군에는 실시예 1의 건강인 유래의 원 대변 현탁액을 투여하였다. cFMT 군에는 상기 실시예 3-3에서 제조한 모사 배양된 미생물 군집 배양물의 액상 제형을 투여하였다.
6-3. 염증성 장질환 모델 검증
실시예 6-1에서 덱스트란 설페이트 소듐 처리된 실험쥐의 염증성 장질환 유도 여부를 확인하였다.
구체적으로, 실험 7일차에 무처리군(Untreated) 및 2% DSS를 처리한 군(DSS)으로부터 각 4마리의 실험쥐를 무작위로 선택하여 희생(sacrifice)을 하였다. 실험 7일차에, 각 실험쥐에 케타민(ketamine) 및 자일라진(xylazine) 칵테일을 10㎕/㎏의 투여량으로 복강내 주사(intraperitoneal injection)하여 마취한 다음, 혈액을 회수하고, 경추탈골하여 안락사하였다. 그 후, 실험쥐로부터 결장(colon)과 비장(spleen)을 획득하여 결장의 길이 비교, 비장의 크기 및 무게, 장내 투과도(intestinal permeability) 및 RT-qPCR 분석에 따른 사이토카인의 발현양을 분석하였다. RT-qPCR은 Power SYBR TM PCR Master Mix(ThermoFisher, 미국)를 사용하여 제조사에서 권장하는 조성에 따라 수행되었으며, 표 8에 기재된 프라이머를 사용하여 각 사이토카인 유전자들의 발현양을 정량하였다. 사이토카인들의 상대적 발현량을 정하기 위한 표준 유전자(reference gene)로써 eukaryote elongation factor 2(EEF2)를 사용하였다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
Tnfa(TNFα) forward AGCCGATGGGTTGTACCTTG 서열번호 3
reverse ATAGCAAATCGGCTGACGGT 서열번호 4
Ifng(IFNγ) forward CAGCAACAGCAAGGCGAAAA 서열번호 5
reverse TGGACCTGTGGGTTGTTGAC 서열번호 6
Il1b(IL-1β) forward GAGCACCTTCTTTTCCTTCATCTT 서열번호 7
reverse TCACACACCAGCAGGTTATCATC 서열번호 8
Il4(IL-4) forward TAGGGCTTCCAAGGTGCTTC 서열번호 9
reverse GGCATCGAAAAGCCCGAAAG 서열번호 10
Il6(IL-6) forward CTTGGGACTGATGCTGGTGA 서열번호 11
reverse GGTCTGTTGGGAGTGGTATCC 서열번호 12
Il10(IL-10) forward CTGCTATGCTGCCTGCTCTT 서열번호 13
reverse GCAGTTATTGTCTTCCCGGC 서열번호 14
Il12b(IL-12) forward TTGCCATCGTTTTGCTGGTG 서열번호 15
reverse CACTGTTTCTCCAGGGGCAT 서열번호 16
Il17a(IL-17) forward TCCTGGTCCTGAAGAGGGAG 서열번호 17
reverse CACACCCACCAGCATCTTCT 서열번호 18
Eef2(EEF2) forward TGTCAGTCATCGCCCATGTG 서열번호 19
reverse CATCCTTGCGAGTGTCAGTGA 서열번호 20
그 결과, 2% 덱스트란 설페이트 소듐 처리군(DSS)군에서 결장 길이 감소(도 12a 및 도 12b), 장내 투과도 증가(도 12c), 비장의 크기 및 무게 증가(도 12d 및 도 12e)가 관찰되었다. 또한, 무처리군(Untreated) 대비 2% 덱스트란 설페이트 소듐 처리군(DSS)군에서 전체적인 사이토카인의 발현량 상승이 나타나(도 13a 내지 도 13h), 실험쥐에 염증성 장질환이 유도된 것으로 확인되었다.
실시예 7. 모사 배양된 장내 미생물 군집 배양물 제제의 염증성 장질환 치료 효과 확인
7-1. 체중, 조직학적 평가 및 사이토카인 발현량 분석에 따른 염증성 장질환 치료 효과 확인
실시예 6의 동물 실험 후, 실시예 3-3의 모사 배양된 건강인 유래 장내 미생물 군집 배양물 제제가 염증성 장질환에서 치료 효과를 나타내는지 확인하였다.
구체적으로, 실험쥐는 대변이식 과정 종결 직후, 대변이식의 즉각적인 효과를 관찰하기 위하여, 실험 12일차에 실시예 4-3과 동일한 방법으로 실험쥐를 희생하였다. 대변이식 사후 경과를 추적하기 위하여, 실험 12일차부터 15일차까지 자연적인 회복(spontaneous recovery)을 유도한 뒤, 15일 차에 추가로 희생하여 사이토카인의 발현양을 분석하였다. 또한, 15일의 실험기간 동안 실험쥐의 체중변화를 추적하였다.
한편, 염증의 정도를 조직병리학적으로 평가하기 위하여, 당업계에서 최적 표준(gold standard)으로 사용되는 헤마톡실린 및 에오신 염색(hematoxylin and eosin staining, H&E staining)을 수행하였다. 회수된 결장(colon)은 0.5cm 길이의 절편으로 횡단면을 절개한 뒤, 점막면이 바깥을 향하게 하여 스위스 롤(swiss-rolling) 방식으로 시료를 준비하고 10%(v/v) 포르말린(formalin) 용액에 침지하여 4℃에서 16시간동안 고정(fixation)하였다. 이후 Wirtz 등 2017의 방법에 따라, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 실험쥐의 체중이 실험 5일차부터 감소한 뒤, 대변 이식이 종결된 12일차부터 다시 증가한 것으로 나타났고, cFMT 군의 15일차 체중은 무처리군 대비 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 14a 및 도 14b). 또한, 대변 이식을 받은 nFMT 군, hFMT 군 및 cFMT 군 모두에서, DSS 군 대비 결장 조직의 손상 정도가 완화된 것으로 확인되었다(도 14c).
한편, 사이토카인의 발현량을 분석한 결과, 대변 이식을 받은 nFMT 군, hFMT 군 및 cFMT 군에서 항염증성 사이토카인으로 알려진 IL-4와 IL-10의 발현량이 DSS 군 대비 증가한 반면, (전)염증성 사이토카인의 양은 DSS 군 대비 감소한 것으로 확인되었다(도 15a 내지 도 15h). 또한, nFMT 군, hFMT 군 및 cFMT 군 간의 사이토카인 발현양은 대부분 통계적으로 유의미하지 않은 것으로 나타나, 일반 쥐의 대변, 건강인 유래의 대변 및 실시예 3-3에서 모사 배양된 장내 미생물 군집 배양물 제제의 치료적 효과가 유사한 것으로 확인되었다.
7-2. 장내 미생물 군집 분석에 따른 염증성 장질환 치료 효과 확인
실시예 6 실험군의 장내 미생물 군집을 미생물 생태학적으로 분석하기 위하여, 차세대 염기서열 분석장치(next generation sequencing, NGS)를 사용하여 실험쥐 대변의 미생물 변화를 추적하였다.
구체적으로, 대변이식이 종결된 직후인 12일차와 실험 종료 시점인 15일차에 실험쥐의 대변을 회수하고, 실시예 4-1과 동일한 방법으로 핵산을 추출한 다음, 중합효소연쇄반응법으로 16S rRNA 유전자 영역의 염기서열 중 일부를 특이적으로 증폭하였고, PCR 산물을 정제하여 차세대 염기서열 분석에 사용하였다. 또한, 실시예 4-1과 동일한 방법으로 분석된 서열 정보를 처리하였다.
상기 차세대 염기서열 분석결과로부터 각 실험군 별 12 일차 및 15 일차의 실험쥐 장내 미생물의 개별 계통분류학적 분류군을 과(family) 수준에서 추적한 결과, nFMT 군 및 cFMT 군에서 대표적인 장내 유익균으로 알려진 Bifidobacteriaceae 및 Akkermensiaceae의 증가가 나타나(16a 및 도 16b), 모사 배양된 건강인 유래 장내 미생물 군집 배양물 제제의 치료 효과를 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (18)

  1. 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물에 있어서,
    상기 조성물은 혐기성인 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 소 뇌 추출물(Calf Brains, infusion), 소 심장 추출물(Beef Heart, infusion) 및 프로테오스 펩톤(Proteose peptone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 수용성 녹말(Soluble starch), 피루브산 나트륨(Sodium pyruvate) 및 L-아르기닌(L-Arginine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 카제인의 췌장 소화물(Pancreatic digest of casein) 및 콩의 파파인 소화물(Papaic digest of soybean)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물의 pH는 7.2 내지 7.4인 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양용 조성물.
  6. 피험체의 대변으로부터 미생물 군집 현탁액을 준비하는 단계;
    상기 현탁액을 제 1 항의 조성물에 접종하는 단계; 및
    상기 조성물을 배양하는 단계
    를 포함하는 인간 장내 미생물 군집 모사 배양 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 혐기성 조건에서 이루어지는 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 시료를 준비하는 단계는 0ppm 내지 40ppm의 산소 조건에서 이루어지는 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 24시간 내지 120시간 동안 이루어지는 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양 방법.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 0.1 내지 3.0 기압에서 이루어지는 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양 방법.
  11. 제 6 항에 있어서, 상기 미생물은 박테로이데테스 문(Bacteroides phylum), 퍼미큐테스 문(Firmicutes phylum), 프로테오박테리아 문(Proteobacteria phylum) 및 액티노박테리아 문(Actinobacteria phylum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물 문인 것인 인간 장내 미생물 군집 모사 배양 방법.
  12. 제 6 항의 방법으로 모사 배양된 미생물 군집의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제.
  13. 제 12 항의 미생물 제제를 포함하는 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD) 또는 클로스트리디움 디피실 감염증( Clostridioides difficile infection, CDI) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(Ulcerative Colitis, UC) 또는 크론병(Crohn's Disease, CD)인 것인 약학적 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서, 클로스트리디움 디피실 감염증은 재발성 클로스트리디움 디피실 감염증(recurrent Clostridioides difficile infection) 또는 난치성 클로스트리디움 디피실 감염증(refractory Clostridioides difficile infection)인 것인 약학적 조성물.
  16. 제 13 항의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD) 또는 클로스트리디움 디피실 감염증( Clostridioides difficile infection, CDI)의 치료 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(Ulcerative Colitis, UC) 또는 크론병(Crohn's Disease, CD)인 것인 치료 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 클로스트리디움 디피실 감염증은 재발성 클로스트리디움 디피실 감염증(recurrent Clostridioides difficile infection) 또는 난치성 클로스트리디움 디피실 감염증(refractory Clostridioides difficile infection)인 것인 치료 방법.
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