WO2019088379A1 - 신규 유산균 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2019088379A1
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bifidobacterium longum
lactobacillus
lactic acid
inflammatory disease
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김동현
한명주
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경희대학교 산학협력단
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    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a novel lactic acid bacterium, Lactobacillus plantarum and Bifidobacterium longum, and more particularly to a composition containing a novel lactic acid bacterium useful for the prevention and treatment of an inflammatory disease.
  • Inflammation is one of a kind of defense reaction that appears in living tissue or organ for any external stimulus. Normally, the inflammatory reaction removes infected material from the outside and regenerates damaged tissue to regain its function. However, when the inflammatory reaction is continuously caused by the secretion of the inflammatory cytokine, a variety of inflammatory diseases are generated depending on the site of the inflammatory reaction.
  • vaginitis a type of female inflammatory disease
  • vaginal infectious disease caused by the proliferation of various anaerobic bacteria instead of bacteria normally present in the vagina.
  • Most of the vaginitis is caused by bacterial vaginitis and fungal vaginitis.
  • Typical cases of bacterial vaginosis are caused by the anaerobic strain Gardnerella vaginalis or Atopobium vaginae, It is mainly caused by Candida albicans (Sexually Transmitted Diseases, November 2006, vol 33, No. 11, 663-665).
  • antibiotics are used for bacterial vaginitis and fungal vaginitis can be improved by using azole antifungals.
  • a therapeutic agent has another problem that it is difficult to expect a fundamental therapeutic effect by causing another bacterial shift. Therefore, it is necessary to develop a therapeutic agent capable of inhibiting the inflammatory reaction so that normal lactic acid bacteria can be restored to their original state while eliminating vaginitis causing vaginosis.
  • sufficient studies have not been made.
  • the inventors of the present invention have found that a novel lactic acid bacterium isolated from kimchi and human feces inhibits the inflammatory reaction, inhibits the growth of vaginitis causing bacteria, At the same time, the present invention has been completed upon confirming that it is effective for the prevention and treatment of inflammatory diseases, specifically vaginitis, by showing the therapeutic effect of vaginitis.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for the prevention or treatment of an inflammatory disease comprising a novel lactic acid bacterium.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or ameliorating an inflammatory disease comprising a novel lactic acid bacterium.
  • the present invention provides Lactobacillus plantarum NK3 (Depository Institution: Korean Microorganism Conservation Center, Date of Deposit: 2017.08.04, Accession Number: KCCM12089P).
  • Lactobacillus plantarum NK3 of the present invention is a novel lactic acid bacteria of Lactobacillus plantarum isolated and identified from kimchi which is a traditional fermented food.
  • the 16S rDNA nucleotide sequence for identification and classification of Lactobacillus plantarum NK3 of the present invention is shown in SEQ ID NO: 1 attached hereto.
  • the Lactobacillus plantarum NK3 of the present invention may comprise the 16S rDNA of SEQ ID NO: 1.
  • Lactobacillus plantarum NK3 of the present invention is gram-positive, and the cell type is bacillus.
  • the physiological characteristics of the more specific Lactobacillus plantarum NK3 can be analyzed according to conventional methods in the art, and the results are shown in Table 2 below.
  • Lactobacillus plantarum NK3 is a carbon source, which is selected from the group consisting of L-arabinose, D-ribose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, D- mannose, mannitol, sorbitol, Mannoside, N-acetyl-glucosamine, amigalline, arbutin, escululin, salicin, cellobiose, maltose, lactose, melibiose, sucrose, trehalose, melizitose, gentiobiose, D-turanose and glucose You can use Nate.
  • the present invention provides Bifidobacterium longum NK49 (Depository Institution: Korean Microorganism Conservation Center, Deposit date: 2017.08.04, Accession number: KCCM12088P) .
  • Bifidobacterium longum NK49 of the present invention is a novel lactic acid bacterium of Bifidobacterium longum that has been isolated and identified from human feces.
  • the 16S rDNA nucleotide sequence for identification and classification of Bifidobacterium longum NK49 of the present invention is shown in SEQ ID NO: 2 attached hereto.
  • the Bifidobacterium longum NK49 of the present invention may comprise the 16S rDNA of SEQ ID NO: 2.
  • Bifidobacterium longum NK49 As a result of analysis of the 16S rDNA sequence of SEQ ID NO: 2, 99% homology with the known Bifidobacterium longum isolates showed the highest molecular phylogenetic relationship with Bifidobacterium longum. Therefore, the lactic acid bacteria were identified as Bifidobacterium longum, named Bifidobacterium longum NK49, and deposited on August 4, 2017 (Accession No. KCCM12088P) at the Korean Microorganism Conservation Center.
  • the Bifidobacterium longum NK49 of the present invention is a gram-positive bacterium, and the cell type is bacillus.
  • the physiological characteristics of the more specific Bifidobacterium longum NK49 can be analyzed according to conventional methods in the art, and the results are shown in Table 3 below.
  • Bifidobacterium longum sword NK49 is a carbon source which is a mixture of L-arabinose, D-ribose, D-xylose, D-galactose, D-glucose, D-fructose, mannitol, sorbitol, D-glucoside, esculine, salicin, maltose, lactose, melibiose, sucrose, raffinose and D-turanose can be used.
  • the present invention provides a method for treating inflammatory diseases including Lactobacillus plantarum NK3 KCCM 12089P, Bifidobacterium longum NK49 KCCM 12088P or a mixture thereof Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the " Lactobacillus plantarum NK3 " of the present invention is the same as that described above.
  • Lactobacillus plantarum NK3 contained in the pharmaceutical composition of the present invention may be a biomass of the present invention, a bacterium thereof, a culture thereof, a disruption thereof or an extract thereof, Lactobacillus plantarum NK3 can be used without limitation.
  • the "Bifidobacterium longum NK49" of the present invention is the same as described above.
  • Bifidobacterium longum NK49 contained in the pharmaceutical composition of the present invention may be a live cell, a bacterium thereof, a culture thereof, a lysate thereof, or an extract thereof, Lactobacillus plantarum NK3 can be used without limitation.
  • " culture product " in the present invention means an object obtained by culturing a lactic acid bacterium in a known liquid medium or a solid medium, and the present invention includes a novel lactic acid bacterium.
  • the inflammatory diseases of the present invention can be used for the treatment and prophylaxis of arthritis, gout, hepatitis, asthma, obesity, keratitis, gastritis, enteritis, nephritis, colitis, diabetes, tuberculosis, bronchitis, pleurisy, peritonitis, spondylitis, pancreatitis, Inflammation, scleroderma, sepsis, burns, dermatitis, periodontitis and gingivitis.
  • the inflammatory reaction was significantly inhibited in the treatment of Lactobacillus plantarum NK3 or Bifidobacterium longum NK49 with lipopolysaccharide, which is an inflammatory reaction inducer, in macrophages isolated from mice 1 and 2).
  • the pharmaceutical composition comprising Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, or a mixture thereof can be effectively used for the prevention and treatment of inflammatory diseases.
  • the inflammatory disease may be vaginitis.
  • Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 or a mixture thereof exhibits a growth inhibitory effect in the vaginitis-causing bacterium, Gardnerella vaginalis and Atofibium pants, It was confirmed that the effect of suppressing the infection of Nerella vaginalis was excellent (Figs. 3 to 5).
  • the pharmaceutical composition comprising Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, or a mixture thereof can be effectively used for the prevention and treatment of vaginitis, a specific inflammatory disease.
  • the inflammatory disease may be colitis.
  • administering Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, or a mixture thereof results in restoration of the length of the large intestine and reduction of the activity of myeloperoxidase , And the expression level and activity of cytokines, which are inflammatory indicators, were inhibited (Table 6). Accordingly, it has been confirmed that the pharmaceutical composition comprising Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, or a mixture thereof can be effectively used for the prevention and treatment of colitis, which is a specific inflammatory disease.
  • compositions according to the present invention may be formulated into pharmaceutical formulations using methods well known in the art so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the mammal.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention may additionally comprise a pharmaceutically acceptable carrier to the extent that the activity of the novel lactic acid bacteria is not inhibited.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers may be those conventionally used such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, But are not limited to, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, and other pharmaceutically acceptable additives.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention should be a pharmaceutically effective amount.
  • a " pharmaceutically effective amount " means an amount sufficient to prevent or treat an inflammatory disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment.
  • Effective dose levels may be varied by those skilled in the art depending on factors such as the formulation method, the condition and weight of the patient, the sex, age, disease severity, form of the drug, route and duration of administration, excretion rate, have. Effective amounts may vary depending on the route of treatment, the use of excipients, and the likelihood of use with other agents, as will be appreciated by those skilled in the art.
  • the composition of the present invention is generally administered to an adult at a dose of 0.0001 to 100 mg / kg per day, preferably 0.001 to 100 mg / kg per 1 kg of body weight per day .
  • the dosage form is administered as described above, Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, or a mixture thereof of the present invention can be administered at 1 ⁇ 10 2 CFU / kg to 1 ⁇ 10 11 CFU / kg per day.
  • the administration may be carried out once a day or divided into several times. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as mice, livestock, humans, and the like through various routes.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, coated or intravenously, subcutaneously, intraperitoneally injected), but oral administration is preferred.
  • oral administration For prevention and treatment of vaginitis, it can be administered into the vagina.
  • Solid formulations for oral administration may include powders, granules, tablets, capsules, soft capsules, pills, and the like.
  • liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups and aerosols.
  • formulations may be formulated in the form of sterilized aqueous solutions, liquid preparations, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, eye drops, ointments, syrups, suppositories, And preferably pharmaceutical compositions of creams, gels, patches, sprays, ointments, alerts, lotions, liniments, ointments, eye drops, pastes or cataplasms can be prepared and used , But is not limited thereto.
  • the formulations for topical administration may be anhydrous or water-based, depending on the clinical formulation.
  • the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like.
  • the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.
  • the present invention includes a step of administering to a subject a Lactobacillus plantarum NK3, a Bifidobacterium longum NK49, or a mixture thereof.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an inflammatory disease.
  • &quot Lactobacillus plantarum NK3 ", " Bifidobacterium longum NK49 ", " administration ", and " inflammatory disease " and the like are the same as described above in the present invention.
  • the subject refers to an animal, and typically can be a mammal that may exhibit beneficial effects in treatment with the novel lactic acid bacteria of the present invention.
  • a preferred example of such a subject may include primates such as humans.
  • Such subjects may also include all subjects with or at risk of having symptoms of inflammatory disease.
  • the present invention provides a method for preventing or ameliorating an inflammatory disease comprising Lactobacillus plantarum NK3 KCCM12089P, Bifidobacterium longum NK49, KCCM12088P, or a mixture thereof, Provide food.
  • &quot Lactobacillus plantarum NK3 ", " Bifidobacterium longum NK49 ", " administration ", and " inflammatory disease ", etc. of the present invention are the same as those described above.
  • the health functional food is a food emphasizing the biological control function of food, and is added with added value so as to function and manifest to a specific purpose using physical, biochemical and biotechnological methods.
  • These health functional food ingredients are designed and manufactured so that the body control functions related to regulation of body defense and body rhythm, prevention and recovery of disease are sufficiently exhibited to the living body, and food additives, And may contain raw materials.
  • Lactobacillus plantarum NK3 or Bifidobacterium longum NK49 of the present invention When Lactobacillus plantarum NK3 or Bifidobacterium longum NK49 of the present invention is used as a health functional food (or a health functional beverage addition product), the novel lactic acid bacterium may be added as it is, or may be used in combination with other food or food ingredients, And the like.
  • the mixing amount of Lactobacillus plantarum NK3 or Bifidobacterium longum NK49 can be suitably determined according to its use purpose (prevention, health or improvement, therapeutic treatment).
  • the health functional food may contain flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, organic acids, A pH adjuster, a stabilizer, a preservative, a glycerin, an alcohol, a carbonating agent used in a carbonated drink, and the like.
  • the health functional food of the present invention may contain pulp for the production of fruit and vegetable drinks. These components may be used singly or in combination, and the proportion of such additives is generally selected in the range of 0.001 to 50 parts by weight based on the total weight of the composition.
  • Foods to which the Lactobacillus plantarum NK3 or Bifidobacterium longum NK49 can be added include dairy products including sausages, meats, breads, chocolates, snacks, candies, confectionery, ramen, pizza, other noodles, gums, Products, soups, drinks, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes.
  • the liquid ingredient to be added in addition to the novel lactic acid bacteria may include various flavors or natural carbohydrates such as ordinary beverages as an additional ingredient.
  • natural carbohydrates may be used in combination with monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose and polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins and xylitol and sorbitol , Erythritol, and the like.
  • monosaccharides such as glucose and fructose
  • disaccharides such as maltose and sucrose
  • polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins and xylitol and sorbitol , Erythritol, and the like.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory diseases, comprising Lactobacillus plantarum NK3 KCCM12089P, Bifidobacterium longum NK49 KCCM12088P or a mixture thereof It provides usages.
  • the present invention provides a composition comprising Lactobacillus plantarum NK3 KCCM12089P, Bifidobacterium longum NK49, KCCM12088P or mixtures thereof for use in the treatment of inflammatory diseases .
  • the invention provides the use of Lactobacillus plantarum NK3 KCCM 12089P, Bifidobacterium longum NK49 KCCM 12088P or mixtures thereof for the treatment of inflammatory diseases.
  • novel lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 or a mixture thereof according to the present invention have an effect of inhibiting the inflammatory reaction. Accordingly, the novel lactic acid bacterium according to the present invention can be used as a composition for preventing or treating inflammatory diseases, and is particularly effective for the treatment and prevention of colitis and vaginitis.
  • NF-kB p-p65 / p65
  • NK3 Lactobacillus plantarum NK3
  • Bifidobacterium longum NK49 novel lactic acid bacteria
  • FIG. 2 is a graph showing the inhibitory effect of TNF- ⁇ on the macrophages of Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49, which are novel lactic acid bacteria.
  • FIG. 3 is a graph showing the antimicrobial effect of Lactobacillus plantarum NK3, which is a novel lactic acid bacterium, and Gardnerella vaginalis, Bifidobacterium longum NK49.
  • FIG. 4 is a graph showing the antimicrobial effect of Atobobium vaginae on Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49, which are new lactic acid bacteria.
  • FIG. 5 is a graph showing the inhibitory effect on the infection of Gardnerella vaginalis of Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49, which are new lactic acid bacteria.
  • G Only the guardian Nella trousers treated; GL5, GL6, GL7: treated with Gardnerella vaginalis and treated with 1 ⁇ 10 6 CFU / mL, 1 ⁇ 10 7 CFU / mL, and 1 ⁇ 10 8 CFU / mL of Lactobacillus plantarum, respectively; GB5, GB6, and GB7: treated with Gardnerella vaginalis and treated with 1 ⁇ 10 6 CFU / mL, 1 ⁇ 10 7 CFU / mL, and 1 ⁇ 10 8 CFU / mL of Bifidobacterium longum, respectively.
  • FIG. 6 is a graph showing the inhibitory effect of the novel lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 and mixtures thereof on the quality of the uterus and inflammation of the uterus.
  • N normal group
  • GC infected only with Gardnerella vaginalis
  • oGL, oGB, oGM Experimental animals infected with Gardnerella vaginalis were infected with Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium longagi Or a mixture thereof
  • vGL, vGB, vGM Experimental animals infected with Gardnerella vaginalis were infected with Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium longagi Or a mixture thereof is injected into the vagina. The same shall apply hereinafter.
  • Figure 7 is a graph showing the inhibitory activity against the infected Gardnerella vaginalis of Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 and mixtures thereof, which is a novel lactic acid bacterium .
  • FIG. 8 is a graph showing the inhibitory activity of myeloperoxidase activity of Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 and mixtures thereof, which is a novel lactic acid bacterium.
  • FIG. 9 is a graph showing the inhibitory effect of TNF- ⁇ on Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, and a mixture thereof, which is a novel lactic acid bacterium.
  • FIG. 10 is a graph showing the ability of the novel lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 and mixtures thereof to express IL-10.
  • FIG. 11 is a graph showing the effect of Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, and the mixture thereof in the vaginal lactobacilli recovery effect of the novel lactic acid bacteria.
  • Example 1 Isolation and identification of lactic acid bacteria
  • Table 1 shows the strain names of the lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria isolated from kimchi contained 5 kinds of Lactobacillus plantarum (Control Nos. 1 to 5 of Table 1), 5 kinds of Lactobacillus brevis (Control Nos. 6 to 10 of Table 1) , 5 kinds of Lactobacillus sakei (Control Nos. 11 to 15 of Table 1) and 5 kinds of Lactocacillus curvatus (Control Nos. 16 to 20 of Table 1).
  • Lactobacillus isolated from human feces is classified into five types (Lactobacillus rhamnosus (control numbers 21 to 25 in Table 1), 5 kinds of Lactobacillus plantarum (control numbers 26 to 30 in Table 1) , 5 Lactobacillus reuteri (Control No. 31-35 in Table 1), 4 Lactobacillus johnsonii (Control No. 36-39 in Table 1), Lactobacillus mucosae
  • Three types of Bifidobacterium adolescentis Control No. 43 to 45 in Table 1), five species of Bifidobacterium longum (Table 3) (Table 1, Control Number 40 to 42), Bifidobacterium adolescentis 1, Control No. 46-50).
  • Control Number Strain name Control Number Strain name One Lactobacillus plantarum NK1 26 Lactobacillus plantarum NK26 2 Lactobacillus plantarum NK2 27 Lactobacillus plantarum NK27 3 Lactobacillus plantarum NK3 28 Lactobacillus plantarum NK28 4 Lactobacillus plantarum NK4 29 Lactobacillus plantarum NK29 5 Lactobacillus plantarum NK5 30 Lactobacillus plantarum NK30 6 Lactobacillus brevis NK6 31 Lactobacillus reuteri NK31 7 Lactobacillus brevis NK7 32 Lactobacillus reuteri NK32 8 Lactobacillus brevis NK8 33 Lactobacillus reuteri NK33 9 Lactobacillus brevis NK9 34 Lactobacillus reuteri NK34 10 Lactobacillus brevis NK10 35 Lactobacillus reuteri NK
  • Lactobacillus plantarum NK3 (Accession No. KCCM12089P) was confirmed to be a gram-positive bacterium.
  • the 16S rDNA of Lactobacillus plantarum NK3 was found to have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the 16S rDNA sequence of Lactobacillus plantarum NK3 was compared with a BLAST search. As a result, a strain of Lactobacillus plantarum having the same 16S rDNA sequence was not found, and the known lactobacillus plantarum And it was confirmed that it was 99% homologous with 16S rDNA sequence of Lactobacillus plantarum strain.
  • Bifidobacterium longum NK49 (Accession No. KCCM12088P) was confirmed to be a gram-positive bacterium.
  • the 16S rDNA of Bifidobacterium longum NK49 was found to have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a comparison of the 16S rDNA nucleotide sequence of Bifidobacterium longum NK49 with a BLAST search showed that the Bifidobacterium longum strain having the same 16S rDNA base sequence was not detected and that the known Bifidobacterium longum And 99% homology with the 16S rDNA sequence of the Bifidobacterium longum strain.
  • Example 2 Comparison of activity of isolated lactic acid bacteria
  • DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl
  • a DPPH solution A suspension of lactic acid bacteria (1 ⁇ 10 6 CFU / ml) or a vitamin C solution (1 g / ml) was added to 0.1 ml of the DPPH solution and cultured at 37 ° C. for 20 minutes. The culture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to obtain a supernatant. Then, the antioxidant activity of the isolated lactic acid bacteria was calculated by measuring the absorbance of the supernatant at 517 nm. The antioxidant activity of each lactic acid bacterium is shown in Table 4 below.
  • mice 2 ml of 4% thioglycolate sterilized in C57BL / 6 mice (male, 20-23 g at 6 weeks of age) was administered intraperitoneally. After 96 hours, the mice were anesthetized and 8 ml of RPMI 1640 medium was administered to the abdominal cavity of the mice. After 5 to 10 minutes, RPMI medium (macrophages) in the abdominal cavity of the mice was drawn, centrifuged at 1000 g for 10 minutes, and then washed twice with RPMI 1640 medium.
  • the macrophages were spread on a 24-well plate at a rate of 0.5 ⁇ 10 6 per well and cultured in the same manner as in Example 1 except that the separated lactic acid bacterium (final treatment concentration: 1 ⁇ 10 4 cfu / ml, the same applies hereinafter) and lipopolysaccharide LPS) was treated for 2 or 24 hours before supernatants and cells were obtained.
  • the obtained cells were homogenized in RIPA buffer (Gibco). (NF-kB), p-p65 (phosphor-NF-kB), and beta (beta) from the cells obtained by treating the amount of cytokine expression of TNF-a and IL- -actin was measured by an immunoblotting method.
  • the level of expression of the inflammation index for each lactic acid bacterium is shown in Table 4 below.
  • Caco2 cells, colon cancer cells, were distributed from a Korean cell line bank and cultured in RPMI 1640 medium for 48 hours. Then, Caco2 cells were dispensed in a 12-well plate at a dose of 2 x 10 6 per well. Each well was treated with 1 ⁇ g of LPS alone or with 1 ⁇ g of LPS and 1 ⁇ 10 4 CFU of lactic acid bacteria and cultured for 24 hours. Then, the cells cultured from each well were collected and the expression amount of ZO-1, a tight junction protein, was measured by immunoblotting. The expression levels of ZO-1 for each lactic acid bacterium are shown in Table 5 below.
  • Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49 which are novel lactic acid bacteria among the isolated lactic acid bacteria, were evaluated for the expression of ZO-1, a close-coupled protein, (Table 4 and Table 5). The results are shown in Table 4 and Table 5, respectively. ≪ tb > < TABLE >
  • Example 3 Measurement of inhibition of inflammatory response to macrophages
  • mice 2 ml of 4% thioglycolate sterilized in C57BL / 6 mice (male, 20-23 g) was administered intraperitoneally. After 96 hours, the mice were anesthetized and 8 ml of RPMI 1640 medium was administered to the abdominal cavity of the mice. After 5 to 10 minutes, the RPMI medium (macrophages) in the abdominal cavity of the mice was drawn, centrifuged at 1000 g for 10 minutes, and washed twice with RPMI 1640 medium. The cells were cultured in a 24-well plate for 5 hours, and adhered cells were used as macrophages.
  • the macrophages were spread in a number of 0.5 x 10 < 6 > per well, and cultured at 10 3 , 10 4, and 10 5 CFU / mL Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49, which are novel lactic acid bacteria, and lipopolysaccharide (LPS), an inflammatory reaction inducer, were treated for 90 minutes or 24 hours Post supernatant and cells.
  • the obtained cells were homogenized in RIPA buffer (Gibco).
  • the amount of expression of p65 (NF-kB), p-p65 (phosphor-NF-kB) and ⁇ -actin was measured by immunoblotting from the cells obtained by treatment for 90 minutes.
  • the amount of TNF- ⁇ cytokine expressed in the culture supernatant after 24 hours of treatment was measured by ELISA kit (Ebioscience, San Diego, CA, USA).
  • Example 4 Antimicrobial activity against vaginitis causing bacteria
  • Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49 (1 ⁇ 10 6 , 1 ⁇ 10 7 , 1 ⁇ 10 8 CFU / mL) were added to the GAM medium to separate the new lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49 (Gardnerella vaginalis) or Atopobium vaginae (1 x 10 6 CFU / mL) were transplanted.
  • Yeast extract (1%), maltose (0.1%), glucose (0.1%) and horse serum (10%) were added to the BHI broth at 37 °C under anaerobic conditions And then cultured in the BHIS medium for 24 hours.
  • the human cervical cancer cell line HeLa cells were cultured in RPMI 1640 medium (containing 10% heat-inactivated fetal calf serum) at 37 ° C, 5% CO 2 and 95% (1 ⁇ 10 5 , 1 ⁇ 10 6 , 1 ⁇ 10 7 CFU / mL) alone or in combination with Lactobacillus plantarum NK3 and Bifidobacterium longum NK49 (1 ⁇ 10 4 , 1 ⁇ 10 6 CFU / Gardnerella vaginalis (1 ⁇ 10 5 CFU / mL) was transplanted and the number of bacteria attached to HeLa cells after 24 hours was measured by qPCR.
  • RPMI 1640 medium containing 10% heat-inactivated fetal calf serum
  • mice were injected subcutaneously with 0.125 mg of ⁇ -estradiol 17-benzoate (Sigma, MO, USA) dissolved in olive oil.
  • Gardnerella vaginalis (1 x 10 8 CFU / mouse) was transplanted into the vagina of the mice.
  • the experiment was carried out after 7 days of lactic acid bacteria administration (14 days after transplantation) and 24 hours after sacrifice of animal model.
  • Gardnerella vaginalis was transplanted into the vagina and inflammation accompanied by vaginal and uterine edema occurred.
  • oral or vaginal administration of the novel lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, or a mixture thereof significantly reduced the appearance and inflammation of the uterus (Fig. 6).
  • vagina was washed with sterilized physiological saline (0.5 ml) at 24 hours and 48 hours.
  • the washed vaginal washes were separated by Qaigen DNA purification kit, and lactobacillus and Gardnerella vaginalis strains were quantitated by PCR.
  • MPO myeloperoxidase
  • Lysis buffer (20 mM HEPES, 1.5 mM MgCl 2, 0.4 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride, 20 ⁇ g / mL trypsin inhibitor, 1 % nonidet p-40, 20% glycerol) was added and homogenized. Proteins were quantitated by the Bradford assay and samples were prepared to contain 50 ⁇ g / ⁇ L of protein.
  • an electrophoresis sample buffer (Laemmli sample buffer 950 ⁇ L + ⁇ Me 50 ⁇ L) was added to the sample, followed by denaturation at 100 ° C. for 3 minutes and electrophoresis (150 V, 30 mA) was performed. The electrophoresed gel was transferred to the membrane at 30V for 2 hours. 15 ml of the membrane was added to 5% skim milk / PBS-T (0.05% tween 20 / PBS) and shaken for 1 hour.
  • an electrophoresis sample buffer (Laemmli sample buffer 950 ⁇ L + ⁇ Me 50 ⁇ L) was added to the sample, followed by denaturation at 100 ° C. for 3 minutes and electrophoresis (150 V, 30 mA) was performed. The electrophoresed gel was transferred to the membrane at 30V for 2 hours. 15 ml of the membrane was added to 5% skim milk / PBS-T (0.05% tween 20 / PBS) and shaken
  • the group infected with Gardnerella vaginalis showed an increase in TNF- ⁇ expression and a decrease in IL-10 expression in vaginal tissue.
  • TNF- ⁇ expression is suppressed and the expression of IL-10 is suppressed in the group administered with oral or vaginal administration of Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49 or a mixture thereof (Figs. 9 and 10).
  • mice were washed twice in vagina with 0.5 ml of sterile physiological saline. The washed vaginal washes were collected and centrifuged (10,000 g, 10 min). The precipitate was extracted with a bacterial genomic DNA extraction kit (QIAGEN DNeasy Feces kit; Qiagen, Hilden, Germany). 10 ng of the extracted DNA was subjected to DNA polymerase activation (95 ° C., 30 sec), denaturation (95 ° C., 5 sec) and amplification (63 ° C., 30 sec) in the SYBER premix with the following primers in a Qiagen thermal cycler PCR was repeatedly performed.
  • DNA polymerase activation 95 ° C., 30 sec
  • denaturation 95 ° C., 5 sec
  • amplification 63 ° C., 30 sec
  • Lactobacilli forward (5'-3 ') CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC (SEQ ID NO: 3);
  • Lactobacilli reverse (5'-3 ') CTT GTA CAC ACC GCC CGT (SEQ ID NO: 4);
  • Control 16S rDNA reverse (5'-3 ') AAG GAG GTG WTC CAR CC (SEQ ID NO: 6).
  • Lactobacillus plantarum NK3, Bifidobacterium longum NK49, or a mixture thereof was significantly reduced when the plant was infected with Gardnerella vaginalis.
  • lactobacilli increased (FIG. 11). This means that vaginitis induced by Gardnerella vaginalis and reduced lactobacilli have been restored by the administration of the lactic acid bacteria to restore the acidic conditions.
  • Example 5 Effect of lactic acid bacteria on colitis in an animal model
  • mice Male, 21-23g, 6 weeks old were used for 6 weeks in each group, and the mice were adapted to the laboratory for 1 week.
  • One group was used as a normal group, and the other group mice were induced with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) as colitis.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • animals were anesthetized with ether and mixed with 50% ethanol.
  • the TNBS solution was injected into the large intestine through the anus using a 1 ml round syringe and kept in the vertical for 30 seconds to induce inflammation Respectively.
  • 0.1 ml of physiological saline was orally administered to the normal group.
  • a 1% dextrose solution of a lactic acid bacterium suspension was orally administered to the experimental animals in the normal group instead of the novel lactic acid bacteria.
  • the experimental animals of the positive control group were orally administered sulfasalazine, a colitis treating drug, in an amount of 50 mg / kg instead of the novel lactic acid bacteria.
  • Western blotting was used to measure inflammatory response indicators such as p-p65, p65, COX-2 and ⁇ -actin. Specifically, 50 ⁇ g of the supernatant obtained in the same manner as in the measurement of the activity of Myeloperoxidase (MPO) was subjected to immunoblotting. The expression level of cytokines (IL-17, TNF- ⁇ ) was measured using an ELISA kit.
  • MPO Myeloperoxidase
  • the inventors of the present invention deposited Lactobacillus plantarum NK3 on KCCM12089P on August 4, 2017, at the Korea Microorganism Conservation Center (address: 45 Yurim Building, 2 Gagil in Haejeon, Seoul, Korea) I got a security number.
  • KCCM12088P has been given the accession number.

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Abstract

본 발명은 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼 NK3 및 비피도박테리움 롱검 NK49에 관한 것으로, 구체적으로 염증 질환의 예방 및 치료에 유용한 신규한 유산균을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 유산균 및 이의 용도
본 발명은 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼 및 비피도박테리움 롱검에 관한 것으로, 구체적으로 염증 질환의 예방 및 치료에 유용한 신규한 유산균을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
염증은 임의의 외부 자극에 대해 생체 조직 또는 기관에서 나타나는 일종의 방어반응의 하나이다. 정상적인 경우, 염증 반응은 외부로부터 감염된 물질을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 기능을 회복하게 된다. 그러나, 염증유발 사이토카인의 분비에 따른 염증 반응이 지속적으로 일어나면 염증 반응이 일어난 부위에 따라 다양한 염증 질환이 발생하게 된다.
한편, 여성 염증 질환의 하나인 질염은 질 내에 정상적으로 존재하는 세균 대신 다양한 혐기성 세균이 증식하면서 발생하는 질 내 감염증으로, 최근 여성들의 여성용품 사용 증가 및 스트레스의 증가로 인해 발생이 증가하고 있다. 질염은 세균성 질염과 진균성 질염이 대부분인데, 세균성 질염의 경우 대표적으로 혐기성 균주인 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 또는 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae)에 의해 발생하고, 진균성 질염은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 주로 발생한다(Sexually Transmitted Diseases, November 2006, vol 33, No. 11, 663-665).
한편, 세균성 질염의 경우 항생제를 사용하고 진균성 질염의 경우 아졸계 항진균제로 증상을 개선시킬 수 있으나, 이러한 치료제의 경우 또 다른 균의 교대 현상을 일으켜 근본적인 치료 효과를 기대하기 어려운 문제가 있다. 따라서, 질 내의 질염 원인균을 제거함과 동시에 정상 유산균이 원상회복될 수 있도록 염증 반응을 억제할 수 있는 치료제의 개발이 필요한 실정이나, 충분한 연구가 이루어지지 않고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 염증 질환, 구체적으로 질염의 예방 및 치료제를 연구하던 중, 김치 및 인간의 분변에서 분리된 신규한 유산균이 염증 반응을 억제할 뿐만 아니라, 질염 원인균의 성장을 억제함과 동시에 질염의 치료 효과를 나타내어 염증 질환, 구체적으로 질염의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 락토바실러스 플란타럼 및 비피도박테리움 롱검 유산균을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 유산균을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 유산균을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 수행하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3)(기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁일: 2017.08.04, 수탁번호: KCCM12089P)을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 NK3은 전통 발효식품인 김치로부터 분리 및 동정된 락토바실러스 플란타럼의 신규한 유산균임을 특징으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 NK3의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열은 본 명세서에 첨부된 서열번호 1과 같다. 따라서, 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3)은 서열번호 1의 16S rDNA을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열의 분석 결과, 공지된 락토바실러스 플란타럼 균주들과 99%의 상동성을 나타내어 락토바실러스 플란타럼과 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보였다. 따라서, 상기 유산균을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)으로 동정하고, 락토바실러스 플란타럼 NK3으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2017년 8월 4일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCCM12089P).
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 NK3은 그람양성균이고, 세포의 형태는 간균이다. 보다 구체적인 락토바실러스 플란타럼 NK3의 생리학적 특성은 당해 기술분야의 통상의 방법에 따라 분석할 수 있고, 그 결과는 하기 표 2와 같은 것으로 나타났다. 구체적으로, 락토바실러스 플란타럼 NK3은 탄소원으로 L-아라비노오스, D-리보오스, D-갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, D-만노오스, 만니톨, 솔비톨, α-메틸-D-만노사이드, N-아세틸-글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스큘린, 살리신, 셀로비오스, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 수크로오스, 트레할로오스, 멜리지토오스, 겐티오비오스, D-투라노오스 및 글루코네이트를 이용할 수 있다.
상기 목적을 수행하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49)(기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁일: 2017.08.04, 수탁번호: KCCM12088P)을 제공한다.
본 발명의 비피도박테리움 롱검 NK49은 인간의 분변으로부터 분리 및 동정된 비피도박테리움 롱검의 신규한 유산균임을 특징으로 한다.
본 발명의 비피도박테리움 롱검 NK49의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열은 본 명세서에 첨부된 서열번호 2와 같다. 따라서, 본 발명의 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49)는 서열번호 2의 16S rDNA을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 2의 16S rDNA 염기서열의 분석 결과, 공지된 비피도박테리움 롱검 균주들과 99%의 상동성을 나타내어 비피도박테리움 롱검과 가장 높은 분자계통학적 유연관계를 보였다. 따라서, 상기 유산균을 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum)으로 동정하고, 비피도박테리움 롱검 NK49로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2017년 8월 4일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCCM12088P).
본 발명의 비피도박테리움 롱검 NK49는 그람양성균이고, 세포의 형태는 간균이다. 보다 구체적인 비피도박테리움 롱검 NK49의 생리학적 특성은 당해 기술분야의 통상의 방법에 따라 분석할 수 있고, 그 결과는 하기 표 3와 같은 것으로 나타났다. 구체적으로, 비피도박테리움 롱검 NK49은 탄소원으로 L-아라비노오스, D-리보오스, D-자일로오스, D-갈락토오스, D-글루코오스, D-프럭토오스, 만니톨, 솔비톨, α-메틸-D-글루코사이드, 에스큘린, 살리신, 말토오스, 락토오스, 멜리비오스, 수크로오스, 라피노오스 및 D-투라노오스를 이용할 수 있다.
상기 목적을 수행하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타럼 NK3(Lactobacillus plantarum NK3)”은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 락토바실러스 플란타럼 NK3은 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물일 수 있으나, 염증 질환의 예방 또는 치료 효과를 달성할 수 있는 락토바실러스 플란타럼 NK3의 형태라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 “비피도박테리움 롱검 NK49(Bifidobacterium longum NK49)”은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 비피도박테리움 롱검 NK49는 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물일 수 있으나, 염증 질환의 예방 또는 치료 효과를 달성할 수 있는 락토바실러스 플란타럼 NK3의 형태라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, “배양물”은 유산균을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 사물을 의미하며, 본 발명에서는 신규한 유산균을 포함하는 개념이다.
본 발명의 염증 질환은 관절염, 통풍, 간염, 천식, 비만, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 대장염, 당뇨, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증 통증, 요도염, 방광염, 질염, 동맥경화증, 패혈증, 화상, 피부염, 치주염 및 치은염을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 생쥐로부터 분리된 대식세포에 염증 반응 유도물질인 리포폴리사카라이드와 함께 락토바실러스 플란타럼 NK3 또는 비피도박테리움 롱검 NK49의 처리시 염증반응이 현저히 억제됨을 확인하였다(도 1 및 2). 이를 통해, 상기 락토바실러스 플란타럼 NK3, 비피도박테리움 롱검 NK49 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약학 조성물이 염증 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 상기 염증 질환은 질염일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 락토바실러스 플란타럼 NK3, 비피도박테리움 롱검 NK49 또는 이들의 혼합물이 질염 유발 세균인 가드네렐라 바지날리스 및 아토포비움 바지내에 대하여 성장 억제 효과를 나타내고, 상기 가드네렐라 바지날리스의 감염을 억제하는 효과가 우수함을 확인하였다(도 3 내지 5). 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 질염이 유도된 동물모델에 락토바실러스 플란타럼 NK3, 비피도박테리움 롱검 NK49 또는 이들의 혼합물을 투여한 결과, 질염 세균에 의해 발생한 부종을 동반한 염증 및 질염 세균의 수가 감소하고, 질의 대표적인 염증 지표인 미엘로페록시다아제의 활성이 감소하고, 질 점막에서 TNF-α의 발현이 증가하며, IL-10의 발현이 증가함을 확인하였다(도 6 내지 10). 이를 통해, 상기 락토바실러스 플란타럼 NK3, 비피도박테리움 롱검 NK49 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약학 조성물이 구체적인 염증 질환인 질염의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 상기 염증 질환은 대장염일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 대장염이 유도된 동물모델에 락토바실러스 플란타럼 NK3, 비피도박테리움 롱검 NK49 또는 이들의 혼합물을 투여한 결과, 대장의 길이가 회복하고, 미엘로퍼옥시다아제의 활성이 감소하며, 염증 지표인 사이토카인들의 발현량 및 활성이 억제됨을 확인하였다(표 6). 이를 통해, 상기 락토바실러스 플란타럼 NK3, 비피도박테리움 롱검 NK49 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약학 조성물이 구체적인 염증 질환인 대장염의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 신규한 유산균의 활성을 저해하지 않는 범위 내에서 추가적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 약제학적으로 유효한 양이어야 한다. “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 염증 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 ㎏당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여할 수 있다. 상기와 같이 투여제를 투여할 경우, 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 NK3, 비피도박테리움 롱검 NK49 또는 이들의 혼합물을 1일 1x102 CFU/kg 내지 1x1011 CFU/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여(예를 들어, 도포 또는 정맥 내, 피하, 복강 내 주사)할 수 있으나 경구 투여가 바람직하다. 질염의 예방 및 치료를 위해서는 질 내로 투여할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제 등이 포함될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 점안제, 안연고제, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 안연고제, 점안제, 파스타제 또는 카타플 라스마제의 약제학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 국소 투여를 위한 제제는 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 목적을 수행하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 NK3(Lactobacillus plantarum NK3), 비피도박테리움 롱검 NK49(Bifidobacterium longum NK49) 또는 이들의 혼합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 “락토바실러스 플란타럼 NK3(Lactobacillus plantarum NK3)”,“비피도박테리움 롱검 NK49(Bifidobacterium longum NK49)”, “투여” 및 “염증 질환” 등의 용어는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 신규한 유산균을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 대상체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다. 또한 이와 같은 대상체들에는 염증 질환의 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품을 제공한다.
본 발명의 “락토바실러스 플란타럼 NK3(Lactobacillus plantarum NK3)”,“비피도박테리움 롱검 NK49(Bifidobacterium longum NK49)”, “투여” 및 “염증 질환” 등의 용어는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
상기 건강기능 식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 플란타럼 NK3 또는 비피도박테리움 롱검 NK49를 건강기능 식품(또는 건강기능 음료 첨가물)으로 사용할 경우, 상기 신규한 유산균을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 락토바실러스 플란타럼 NK3 또는 비피도박테리움 롱검 NK49의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능 식품은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 0.001 내지 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 건강기능 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 락토바실러스 플란타럼 NK3 또는 비피도박테리움 롱검 NK49를 첨가할 수 있는 식품은 소세지, 육류, 빵, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 음료수로 제형화할 경우에 신규한 유산균 이외에 첨가되는 액체 성분으로는 이에 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 염증 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물의 용도를 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 염증 질환의 치료에 사용하기 위한 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 염증 질환의 치료를 위한 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물의 용도를 제공한다.
이상 본 명세서에 기재된 수치값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼 NK3, 비피도박테리움 롱검 NK49 또는 이들의 혼합물은 염증 반응을 억제하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 신규한 유산균은 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용될 수 있으며, 특히, 대장염 및 질염의 치료 및 예방에 효과적이다.
도 1은 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49의 대식세포에 대한 NF-kB의 활성(p-p65/p65) 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49의 대식세포에 대한 TNF-α의 발현량 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49의 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)에 대한 항균 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49의 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae)에 대한 항균 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49의 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)에 대한 감염 억제능을 나타낸 그래프이다.
G: 가드네렐라 바지날리스만을 처리한 군; GL5, GL6, GL7: 가드네렐라 바지날리스를 처리하고, 락토바실러스 플란타럼을 각각 1x106 CFU/mL, 1x107 CFU/mL, 1x108 CFU/mL 처리한 군; GB5, GB6, GB7: 가드네렐라 바지날리스를 처리하고, 비피도박테리움 롱검을 각각 1x106 CFU/mL, 1x107 CFU/mL, 1x108 CFU/mL 처리한 군.
도 6은 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 및 이들의 혼합물의 질과 자궁의 염증 억제 효과를 확인한 도이다.
N: 정상군; GC: 가드네렐라 바지날리스만을 감염시킨 군; oGL, oGB, oGM: 가드네렐라 바지날리스를 감염시킨 실험동물에 각각 락토바실러스 플란타럼, 비피도박테리움 롱검 또는 이들의 혼합물을 경구로 투여한 군; vGL, vGB, vGM: 가드네렐라 바지날리스를 감염시킨 실험동물에 각각 락토바실러스 플란타럼, 비피도박테리움 롱검 또는 이들의 혼합물을 질 내로 투여한 군. 이하 동일.
도 7은 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 및 이들의 혼합물의 감염된 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)에 대한 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 8은 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 및 이들의 혼합물의 미엘로페록시다아제 활성 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 9는 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 및 이들의 혼합물의 TNF-α 발현 억제능을 나타낸 그래프이다.
도 10은 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 및 이들의 혼합물의 IL-10 발현 증가능을 나타낸 그래프이다.
도 11은 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 및 이들의 혼합물의 질 내 락토바실리(Lactobacilli) 회복 효과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유산균의 분리 및 동정
(1) 사람의 분변으로부터 유산균의 분리
사람의 분변을 GAM 액체 배지(GAM broth; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 넣고 현탁하였다. 이후, 상등액을 취해 BL 한천 배지(BL agar medium; Nissui Pharmaceutical, Japan)에 이식하고 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후, 콜로니(colony)를 형성한 균주들을 분리하였다.
(2) 김치로부터 유산균의 분리
배추 김치, 무 김치 또는 파김치를 각각 파쇄하고, 파쇄 상등액을 취해 MRS 한천 배지(MRS agar medium; Difco, USA)에 이식하고 37℃에서 약 48시간 동안 혐기적으로 배양하여 콜로니(colony)를 형성한 균주들을 분리하였다.
(3) 분리된 유산균의 동정
사람의 분변 또는 김치로부터 분리된 균주들의 생리학적 특성 및 16S rDNA 서열을 분석하여 균주의 종을 확정하고, 균주명을 부여하였다. 부여된 유산균의 균주명은 하기 표 1과 같다. 구체적으로, 김치로부터 분리된 유산균은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 5종(표 1의 관리번호 1 내지 5), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 5종(표 1의 관리번호 6 내지 10), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 5종(표 1의 관리번호 11 내지 15) 및 락토바실러스 커바터스(Lactocacillus curvatus) 5종(표 1의 관리번호 16 내지 20)이었다. 사람의 분변으로부터 분리된 유산균은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 5종(표 1의 관리번호 21 내지 25), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 5종(표 1의 관리번호 26 내지 30), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 5종(표 1의 관리번호 31 내지 35), 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) 4종(표 1의 관리번호 36 내지 39), 락토바실러스 뮤코세(Lactobacillus mucosae) 3종(표 1의 관리번호 40 내지 42), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 3종(표 1의 관리번호 43 내지 45), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 5종(표 1의 관리번호 46 내지 50) 이었다.
관리번호 균주명 관리번호 균주명
1 Lactobacillus plantarum NK1 26 Lactobacillus plantarum NK26
2 Lactobacillus plantarum NK2 27 Lactobacillus plantarum NK27
3 Lactobacillus plantarum NK3 28 Lactobacillus plantarum NK28
4 Lactobacillus plantarum NK4 29 Lactobacillus plantarum NK29
5 Lactobacillus plantarum NK5 30 Lactobacillus plantarum NK30
6 Lactobacillus brevis NK6 31 Lactobacillus reuteri NK31
7 Lactobacillus brevis NK7 32 Lactobacillus reuteri NK32
8 Lactobacillus brevis NK8 33 Lactobacillus reuteri NK33
9 Lactobacillus brevis NK9 34 Lactobacillus reuteri NK34
10 Lactobacillus brevis NK10 35 Lactobacillus reuteri NK35
11 Lactobacillus sakei NK11 36 Lactobacillus johnsonii NK36
12 Lactobacillus sakei NK12 37 Lactobacillus johnsonii NK37
13 Lactobacillus sakei NK13 38 Lactobacillus johnsonii NK38
14 Lactobacillus sakei NK14 39 Lactobacillus johnsonii NK39
15 Lactobacillus sakei NK15 40 Lactobacillus mucosae NK40
16 Lactobacillus curvatus NK16 41 Lactobacillus mucosae NK41
17 Lactobacillus curvatus NK17 42 Lactobacillus mucosae NK42
18 Lactobacillus curvatus NK18 43 Bifidobacterium adolescentis NK43
19 Lactobacillus curvatus NK19 44 Bifidobacterium adolescentis NK44
20 Lactobacillus curvatus NK20 45 Bifidobacterium adolescentis NK45
21 Lactobacillus rhamnosus NK21 46 Bifidobacterium longum NK46
22 Lactobacillus rhamnosus NK22 47 Bifidobacterium longum NK47
23 Lactobacillus rhamnosus NK23 48 Bifidobacterium longum NK48
24 Lactobacillus rhamnosus NK24 49 Bifidobacterium longum NK49
25 Lactobacillus rhamnosus NK25 50 Bifidobacterium longum NK50
(4) 신규 유산균 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum ) NK3의 생리학적 특성
상기 표 1에 기재된 균주들 중 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3(수탁번호 KCCM12089P) 은 그람양성 간균인 것으로 확인되었다. 또한, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3의 16S rDNA는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3의 16S rDNA 염기서열을 BLAST 검색으로 비교한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주는 검색되지 않았고, 공지된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주의 16S rDNA 서열과 99% 상동성을 보임을 확인하였다.
락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3의 생리학적 특성 중 탄소원 이용성을 API 50 CHL 키트를 사용하여 당 발효 시험으로 분석하였다. 그 결과는 하기 표 2와 같다. 하기 표 2에서 “+”는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타내고, “-”는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 나타낸다.
탄소원 NK3 탄소원 NK3
CONTROL - 에스큘린 +
글리세롤 - 살리신 +
에리쓰리톨 - 셀로비오스 +
D-아라비노오스 - 말토오스 +
L-아라비노오스 + 락토오스 +
D-리보오스 + 멜리비오스 +
D-자일로오스 - 수크로오스 +
L-자일로오스 - 트레할로오스 +
D-아도니톨 - 이뉼린 -
메틸-BD-자일로피라노사이드Methyl-BD-Xylopyranoside - 멜리지토오스 +
D-갈락토오스 + 라피노오스 -
D-글루코오스 + 전분(Starch) -
D-프럭토오스 + 글리코겐 -
D-만노오스 + 자일리톨 -
L-소르보오스 - 겐티오비오스 +
람노서스 - D-투라노오스 +
둘시톨 - D-릭소오스 -
이노시톨 - D-타가토오스 -
만니톨 + D-푸코오스 -
솔비톨 + L-푸코오스 -
α-메틸-D-만노사이드 ± D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 - L-아라비톨 -
N-아세틸-글루코사민 + 글루코네이트 ±
아미그달린 + 2-케토-글루코네이트 -
알부틴 + 5-케토-글루코네이트 -
(5) 신규 유산균 비피도박테리움 롱검 ( Bifidobacterium longum ) NK49의 생리학적 특성
상기 표 1에 기재된 균주들 중 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 (수탁번호 KCCM12088P)는 그람양성 간균인 것으로 확인되었다. 또한, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49의 16S rDNA는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것으로 나타났다. 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49의 16S rDNA 염기서열을 BLAST 검색으로 비교한 결과, 동일한 16S rDNA 염기서열을 갖는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주는 검색되지 않았고, 공지된 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주의 16S rDNA 서열과 99% 상동성을 보임을 확인하였다.
비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49의 생리학적 특성 중 탄소원 이용성을 API 50 CHL 키트를 사용하여 당 발효 시험으로 분석하였다. 그 결과는 하기 표 3과 같다. 하기 표 3에서 “+”는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타내고, “-”는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 나타낸다.
탄소원 NK49 탄소원 NK49
CONTROL - 에스큘린 +
글리세롤 - 살리신 +
에리쓰리톨 - 셀로비오스 -
D-아라비노오스 - 말토오스 +
L-아라비노오스 + 락토오스 +
D-리보오스 + 멜리비오스 +
D-자일로오스 ± 수크로오스 +
L-자일로오스 - 트레할로오스 -
D-아도니톨 - 이뉼린 -
메틸-BD-자일로피라노사이드Methyl-BD-Xylopyranoside - 멜리지토오스 -
D-갈락토오스 + 라피노오스 +
D-글루코오스 + 전분(Starch) -
D-프럭토오스 + 글리코겐 -
D-만노오스 - 자일리톨 -
L-소르보오스 - 겐티오비오스 -
람노서스 - D-투라노오스 ±
둘시톨 - D-릭소오스 -
이노시톨 - D-타가토오스 -
만니톨 + D-푸코오스 -
솔비톨 + L-푸코오스 -
α-메틸-D-만노사이드 - D-아라비톨 -
α-메틸-D-글루코사이드 ± L-아라비톨 -
N-아세틸-글루코사민 - 글루코네이트 -
아미그달린 - 2-케토-글루코네이트 -
알부틴 - 5-케토-글루코네이트 -
실시예 2: 분리된 유산균들의 활성 비교
(1) 항산화 활성(in vitro)
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 0.2 mM 농도가 되도록 에탄올에 녹여 DPPH 용액을 제조하였다. 상기 DPPH 용액 0.1 ㎖에 유산균의 현탁액(1×106 CFU/㎖) 또는 비타민 C 용액(1 g/㎖)을 넣고 20분간 37℃에서 배양하였다. 배양액을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 이후, 517 ㎚에서 상등액의 흡광도를 측정하여 분리된 유산균들의 항산화 활성을 계산하였다. 각 유산균 별 항산화 활성은 하기 표 4와 같다.
(2) 대식세포에서의 염증 지표 측정
C57BL/6 생쥐(male, 6주령 20-23 g)의 복강에 멸균된 4% 티오글라이콜레이트(thioglycolate) 2 ㎖를 투여하였다. 96시간이 지난 뒤에 생쥐를 마취시키고, 생쥐의 복강에 RPMI 1640 배지 8 ㎖를 투여하였다. 5~10분 후에 생쥐의 복강 내의 RPMI 배지(대식세포)를 뽑아, 1000 g에서 10분간 원심분리하고 다시 RPMI 1640 배지로 2회 세척하였다. 상기 대식세포를 각 웰 당 0.5×106의 수로 24-웰 플레이트에 깔고, 분리된 유산균(최종 처리 농도: 1x104 cfu/ml, 이하 동일)과 염증 반응 유도 물질인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)를 2시간 또는 24시간 동안 처리한 후 상등액 및 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 RIPA 버퍼(Gibco사)에 넣고 균질화하였다. 24시간 처리한 배양 상등액에서 TNF-α, IL-10 등의 사이토카인 발현량을, 2시간 동안 처리하여 수득한 세포로부터 p65(NF-kB), p-p65(phosphor-NF-kB) 및 β-actin의 발현량을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였다. 각 유산균 별 염증 지표의 발현 수준은 하기 표 4와 같다.
(표 4의 활성 측정시 기준: +++, >90%, 매우 강함; ++, >60-90%, 강함; +, >20-60%, 약함; -, <20%, 효과 미비, 표 5 동일)
관리번호 균주명 항산화 활성 TNF-α억제능 IL-10발현증가 NF-kB억제능
1 Lactobacillus plantarum NK1 + + + +
2 Lactobacillus plantarum NK2 + ++ + +
3 Lactobacillus plantarum NK3 +++ +++ +++ +++
4 Lactobacillus plantarum NK4 + + + ++
5 Lactobacillus plantarum NK5 ++ ++ ++ ++
6 Lactobacillus brevis NK6 + + + +
7 Lactobacillus brevis NK7 + + + +
8 Lactobacillus brevis NK8 + + + +
9 Lactobacillus brevis NK9 + + + +
10 Lactobacillus brevis NK10 - + + +
11 Lactobacillus sakei NK11 + + + +
12 Lactobacillus sakei NK12 - ++ + +
13 Lactobacillus sakei NK13 - ++ ++ +
14 Lactobacillus sakei NK14 - + + +
15 Lactobacillus sakei NK15 + + + +
16 Lactobacillus curvatus NK16 + + + +
17 Lactobacillus curvatus NK17 + + + +
18 Lactobacillus curvatus NK18 + + + +
19 Lactobacillus curvatus NK19 + + + +
20 Lactobacillus curvatus NK20 + + + +
21 Lactobacillus rhamnosus NK21 + + + +
22 Lactobacillus rhamnosus NK22 + + + +
23 Lactobacillus rhamnosus NK23 + + + +
24 Lactobacillus rhamnosus NK24 ++ + + +
25 Lactobacillus rhamnosus NK25 ++ ++ ++ ++
26 Lactobacillus plantarum NK26 + + + +
27 Lactobacillus plantarum NK27 + + + +
28 Lactobacillus plantarum NK28 + + + +
29 Lactobacillus plantarum NK29 + + + +
30 Lactobacillus plantarum NK30 + + + +
31 Lactobacillus reuteri NK31 + + + +
32 Lactobacillus reuteri NK32 ++ ++ ++ ++
33 Lactobacillus reuteri NK33 +++ ++ ++ ++
34 Lactobacillus reuteri NK34 + + + +
35 Lactobacillus reuteri NK35 + + + +
36 Lactobacillus johnsonii NK36 ++ ++ ++ +
37 Lactobacillus johnsonii NK37 ++ ++ ++ ++
38 Lactobacillus johnsonii NK38 + + + +
39 Lactobacillus johnsonii NK39 + + + +
40 Lactobacillus mucosae NK40 ++ ++ ++ ++
41 Lactobacillus mucosae NK41 ++ ++ +++ +++
42 Lactobacillus mucosae NK42 + + + +
43 Bifidobacterium adolescentis NK43 + + + +
44 Bifidobacterium adolescentis NK44 ++ ++ ++ ++
45 Bifidobacterium adolescentis NK45 + + + +
46 Bifidobacterium longum NK46 +++ ++ +++ +++
47 Bifidobacterium longum NK47 ++ ++ ++ ++
48 Bifidobacterium longum NK48 + + + +
49 Bifidobacterium longum NK49 +++ +++ +++ +++
50 Bifidobacterium longum NK50 + + + +
(3) Caco2 세포의 ZO -1 단백질 발현 효과
대장암 세포인 Caco2 세포를 한국 세포주 은행에서 분양하여 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 배양한 후, Caco2 세포를 웰 당 2×106 의 양이 되도록 12-웰 플레이트에 분주하였다. 각 웰에 LPS 1 ㎍을 단독으로 처리하거나 LPS 1 ㎍과 유산균 1×104 CFU를 같이 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이 후, 각 웰로부터 배양된 세포들을 모으고, 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 밀착연접단백질(tight junction protein)인 ZO-1의 발현량을 측정하였다. 각 유산균 별 ZO-1의 발현량은 하기 표 5와 같다.
관리번호 균주명 ZO-1발현증가
1 Lactobacillus plantarum NK1 +
2 Lactobacillus plantarum NK2 +
3 Lactobacillus plantarum NK3 ++
4 Lactobacillus plantarum NK4 +
5 Lactobacillus plantarum NK5 ++
6 Lactobacillus brevis NK6 +
7 Lactobacillus brevis NK7 +
8 Lactobacillus brevis NK8 +
9 Lactobacillus brevis NK9 +
10 Lactobacillus brevis NK10 -
11 Lactobacillus sakei NK11 +
12 Lactobacillus sakei NK12 -
13 Lactobacillus sakei NK13 +
14 Lactobacillus sakei NK14 +
15 Lactobacillus sakei NK15 +
16 Lactobacillus curvatus NK16 +
17 Lactobacillus curvatus NK17 +
18 Lactobacillus curvatus NK18 +
19 Lactobacillus curvatus NK19 +
20 Lactobacillus curvatus NK20 +
21 Lactobacillus rhamnosus NK21 +
22 Lactobacillus rhamnosus NK22 +
23 Lactobacillus rhamnosus NK23 +
24 Lactobacillus rhamnosus NK24 ++
25 Lactobacillus rhamnosus NK25 +
26 Lactobacillus plantarum NK26 +
27 Lactobacillus plantarum NK27 +
28 Lactobacillus plantarum NK28 +
29 Lactobacillus plantarum NK29 +
30 Lactobacillus plantarum NK30 +
31 Lactobacillus reuteri NK31 +
32 Lactobacillus reuteri NK32 ++
33 Lactobacillus reuteri NK33 ++
34 Lactobacillus reuteri NK34 +
35 Lactobacillus reuteri NK35 +
36 Lactobacillus johnsonii NK36 +
37 Lactobacillus johnsonii NK37 ++
38 Lactobacillus johnsonii NK38 +
39 Lactobacillus johnsonii NK39 +
40 Lactobacillus mucosae NK40 ++
41 Lactobacillus mucosae NK41 ++
42 Lactobacillus mucosae NK42 +
43 Bifidobacterium adolescentis NK43 +
44 Bifidobacterium adolescentis NK44 ++
45 Bifidobacterium adolescentis NK45 +
46 Bifidobacterium longum NK46 ++
47 Bifidobacterium longum NK47 +
48 Bifidobacterium longum NK48 +
49 Bifidobacterium longum NK49 +
50 Bifidobacterium longum NK50 +
(5) 실험 결과
분리된 유산균들의 활성을 평가한 결과, 분리된 유산균들 중에서 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49가 밀착연접단백질인 ZO-1의 발현량을 증가시키면서 항산화 활성 및 염증반응 억제 효과를 우수하게 나타냄을 확인하였다(표 4 및 표 5).
실시예 3: 대식세포에 대한 염증반응 억제능 측정
상기 실시예 2에서 항산화 활성 및 염증반응의 억제 효과가 우수한 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49에 대하여 투여 농도에 따른 염증반응 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, C57BL/6 생쥐(수컷, 20-23 g)의 복강에 멸균된 4% 티오글라이콜레이트(thioglycolate) 2 ㎖를 투여하였다. 96시간이 지난 뒤에 생쥐를 마취시키고, 생쥐의 복강에 RPMI 1640 배지 8 ㎖를 투여하였다. 5~10분이 지난 뒤에 생쥐 복강 내의 RPMI 배지(대식세포)를 뽑아, 1000 g에서 10분간 원심분리하고 다시 RPMI 1640 배지로 2회 세척하였다. 24-웰 플레이트에서 5시간 배양하여 부착된 세포를 대식세포로 사용하였다. 상기 대식세포를 각 웰당 0.5×106의 수로 깔고, 103, 104 및 105 CFU/mL 의 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49와 염증 반응 유도 물질인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)를 90 분 또는 24 시간 동안 처리한 후 상등액 및 세포를 수득하였다. 수득한 세포를 RIPA 버퍼(Gibco사)에 넣고 균질화하였다. 90분 동안 처리하여 수득한 세포로부터 p65(NF-kB), p-p65(phosphor-NF-kB) 및 β-actin의 발현량을 면역블롯팅(immunoblotting) 방법으로 측정하였다. 24시간 처리한 후 수득한 배양 상등액에서는 TNF-α의 사이토카인의 발현량을 ELISA kit(Ebioscience, San Diego, CA, USA)로 측정하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49를 처리한 모든 군에서 NF-kB의 활성이 억제되고, TNF-α의 발현량이 억제됨을 확인하였다(도 1 및 도 2).
실시예 4: 질염 원인균에 대한 항균력
(1) 유산균의 항균시험
GAM 배지에 분리된 신규 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 (1x106, 1x107, 1x108 CFU/mL)와 함께 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 또는 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae) (1x106 CFU/mL)를 이식하였다. 37 ℃, 혐기적 조건으로 BHI broth에 효모 추출물(yeast extract) (1%), 말토오스(maltose) (0.1%), 글루코스(glucose) (0.1%) 및 말 혈청(horse serum) (10%)을 첨가한 BHIS 배지에서 24시간 배양하여 항균력을 측정하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 모두 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 및 아토포비움 바지내(Atopobium vaginae)에 대해 95% 이상의 성장 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(도 3 및 도 4).
(2) 유산균의 감염 억제능
인간 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포를 37 ℃, 5% CO2 및 95% 공기 조건에서 RPMI 1640 배지(10% 열 비활성화 신생우아혈청(heat-inactivated fetal calf serum) 함유)에서 배양하면서 분리된 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 및 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 (1x104, 1x106 CFU/mL)만 또는 상기 유산균 (1x105, 1x106, 1x107 CFU/mL)과 함께 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) (1x105 CFU/mL)를 이식하여 24시간 후에 HeLa 세포에 부착된 세균수를 qPCR로 측정하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3 또는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49을 함께 이식한 HeLa 세포에는 부착된 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 수가 현저히 감소됨을 확인하였다(도 5).
위 실험 결과들을 통해, 신규한 유산균들은 질염 유발 세균의 성장 억제 효과를 나타낼 뿐만 아니라 세균의 감염을 억제시키는 효과도 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 5: 동물모델에서 유산균의 질염 치료 효과
(1) 질염 동물모델의 제조 및 유산균 투여
C57BL/6 생쥐(암컷, 19-22 g, 6주령)를 한군 당 6마리씩 사용하여 실험을 진행하였다. 상기 생쥐에 β-estradiol 17-benzoate(Sigma 사, MO, 미국) 0.125 mg 을 올리브 오일에 녹여 피하 주사하였다. 3일 후, 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) (1x 108 CFU/mouse)를 생쥐의 질 내로 이식하였다. 이식 후 8일째부터 14일간 매일 1회씩 1x109 CFU/mouse의 분리된 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 또는 이들의 1:1 혼합물을 경구 또는 질 내로 직접 투여하였다. 유산균 투여 7일(이식 후 14일째)째 마지막으로 투여하고, 24시간 후에 동물모델을 희생시켜 실험을 수행하였다.
(2) 질 내 염증 발생 여부 확인
상기와 같이 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)를 생쥐의 질에 이식한 결과 질과 자궁에 부종을 동반한 염증이 발생하였다. 그러나, 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 또는 이들의 혼합물을 경구 또는 질 내로 투여한 결과 질과 자궁의 외관상 염증이 유의적으로 감소됨을 확인하였다(도 6).
(3) 유산균 및 가드네렐라 바지날리스 균주의 정량
신규한 유산균을 상기와 같이 투여한 후 24 시간 및 48 시간에 멸균된 생리식염수 0.5 ml로 질 내를 씻어 내었다. 씻어낸 질 세척액을 Qaigen DNA purification kit로 분리한 뒤, PCR로 유산균 및 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 균주를 정량하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 또는 이들의 혼합물을 경구 또는 질 내로 투여한 군에서 감염된 가드네렐라 바지날리스의 균수가 99% 이상 감소됨을 확인하였다(도 7).
(4) 미엘로페록시다아제 활성 측정
50 mM 인산 완충액(phosphate buffer, pH 6.0) 1 mL에 상기와 같이 씻어낸 질 세척액을 가하여 초음파 처리하였다. 녹이고 얼리는 과정을 3회 실시한 후 원심 분리하였다. 상층액 100 μL에 o-디아니시딘(o-dianisidine, 0.129 mg/mL) 398 μL를 가하였다. H2O2의 최종 농도를 0.0005% 로 맞춘 뒤, 25℃ 및 492 nm 조건에서 경시적(time course)으로 미엘로페록시다아제(myeloperoxidase, MPO)의 활성을 측정하였다.
그 결과, 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)로 감염시킨 군의 경우 질의 대표적인 염증 지표인 미엘로페록시다아제의 활성이 유의하게 증가하였다. 그러나, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 또는 이들의 혼합물을 경구 또는 질 내로 투여한 군에서는 미엘로페록시다아제의 활성이 현저히 감소됨을 확인하였다(도 8).
(5) 질 점막에서 전사인자 및 사이토카인의 분석
상기 희생시킨 동물모델의 대장 또는 질점막 조직에 lysis buffer (20 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 0.4 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM dithiotheitol, 0.5 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride, 20 μg/mL 트립신 억제제, 1% nonidet p-40, 20% 글리세롤)를 넣어 균질화(homogenize)하였다. Bradford assay로 단백질을 정량하여 단백질이 50 μg/μL이 포함되도록 검체를 제조하였다. 상기 검체에 전기영동 샘플 버퍼 (Laemmli sample buffer 950 μL+ βMe 50 μL) 10 μg/μL를 가한 뒤 100 ℃에서 3분간 변성(denaturation)시켜, 전기영동 (150V, 30mA)을 수행하였다. 전기영동한 젤을 30V에서 2시간 동안 멤브레인에 트랜스퍼(transfer)하였다. 상기 멤브레인을 5% skim milk/PBS-T (0.05% tween 20/PBS)에 15ml 넣고 1시간 동안 흔들었다. 1차 항체 10 μg/μL에 1% skim milk/PBS-T 10 mL을 넣고 12시간 반응시킨 후 PBS-T 용액으로 5분간 3회 세척하였다. 그리고 각 사이토카인 및 전사인자에 대한 2차 항체 10 μg/μL에 1% skim milk/PBS-T 20 mL을 넣고 1시간 동안 흔들어 반응시켰다. PBS-T 용액으로 5분간 3회 세척한 뒤, 마지막으로 ECL용액으로 발광시켰다.
그 결과, 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)로 감염시킨 군의 경우 질 조직에서의 TNF-α 발현이 증가하고, IL-10의 발현이 감소하였다. 그러나, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 또는 이들의 혼합물을 경구 또는 질 내로 투여한 군에서는 TNF-α 발현이 억제되고, IL-10의 발현이 증가함을 확인하였다(도 9 및 도 10).
(6) 질 내 유산균의 증가
생쥐의 질을 멸균된 생리식염수 0.5 ml로 질 내를 2회 씻어 내었다. 씻어낸 질 세척액을 모아 원심분리 (10,000 g, 10 분)하였고, 침전물을 bacterial genomic DNA extraction kit (QIAGEN DNeasy Feces kit; Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 10 ng을 Qiagen thermal cycler에서 하기의 프라이머를 넣고 SYBER premix를 넣어 DNA polymerase activation (95 ℃, 30초), denaturation (95 ℃, 5초) 및 amplification (63 ℃, 30 초)을 38회 반복하여 PCR을 수행하였다.
Lactobacilli forward (5'-3') CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC (서열번호 3);
Lactobacilli reverse (5'-3') CTT GTA CAC ACC GCC CGT (서열번호 4);
Control 16S rDNA forward (5'-3') AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG (서열번호 5); 및
Control 16S rDNA reverse (5'-3') AAG GAG GTG WTC CAR CC (서열번호 6).
그 결과, 가드네렐라 바지날리스에 의해 감염된 경우 락토바실리(Lactobacilli)가 현저히 감소하는 반면, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 또는 이들의 혼합물을 경구 또는 질 내로 투여시, 상기 락토바실리가 증가함을 확인하였다 (도 11). 이는 가드네렐라 바지날리스에 의해 질염이 유도되어 감소된 락토바실리가 상기 유산균의 투여에 의해 회복되어 질 내 산성 조건을 회복하였음을 의미한다.
상기 실험 결과들을 통해, 신규한 유산균은 질염의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5: 동물모델에서 유산균의 대장염 치료 효과
(1) 대장염 동물 모델의 제조 및 유산균 투여
C57BL/6 생쥐(수컷, 21-23g, 6주령)를 한 군당 6마리씩 사용하여 1주간 실험실에 적응시킨 뒤 실험을 진행하였다. 한 군을 정상군으로 하였고, 나머지 군의 생쥐는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 대장염을 유발하였다. 구체적으로 실험동물을 에테르로 마취한 후 50% 에탄올에 혼합한 TNBS 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖ 씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 한편, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구투여하였다. 투여 후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 또는 이들의 1:1 혼합물을 생리식염수에 현탁하여 1x109 CFU의 양으로 경구투여하였다. 유산균 투여가 종료된 다음날 실험동물을 희생시킨 다음 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하여 길이를 측정하였다. 그 후, 이로부터 하기의 각종 지표를 확인하였다. 한편, 정상군의 실험동물에는 신규한 유산균 대신 유산균 현탁액인 1% 덱스트로스 용액을 경구투여하였다. 또한, 양성 대조군의 실험동물에는 신규한 유산균 대신 대장염 치료 약물인 설파살라진(sulfasalazine)을 50 ㎎/㎏의 양으로 경구투여하였다.
(2) 미엘로퍼옥시다아제 활성 측정
대장조직 100㎎에 0.5% 헥사데실 트리메틸 암모늄 브롬화물(hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 함유 10 mM 인산칼슘 완충액(potassium phosphate buffer, pH 7.0) 200㎕를 넣고 균질화(homogenization)하였다. 4℃ 및 10,000 g의 조건에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액 50 ㎕를 0.95 ㎖ 의 반응액(1.6mM 테트라메틸 벤지딘(tetramethyl benzidine)과 0.1mM H2O2 함유)에 넣고 37℃에서 반응시키면서 650 ㎚에서 경시적으로 흡광도를 측정하였다. 상기 미엘로퍼옥시다아제 활성은 반응물로서 생긴 H2O2 1μmol/ml을 1 유닛으로 계산하였다.
(3) 염증 지표의 측정
웨스턴블롯팅 방법을 이용하여 p-p65, p65, COX-2 및 β-actin 과 같은 염증 반응 지표 물질을 측정하였다. 구체적으로, 상기 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정 실험과 동일한 방법으로 얻은 상등액 50㎍을 취해 면역블롯팅을 수행하였다. 또한, 사이토카인(IL-17, TNF-α)의 발현량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.
(4) 실험 결과
상기에서 수행한 실험 결과는 하기 표 6과 같다.
실험군 체중변화g 대장길이 cm MPO 활성μU/㎎ TNF-αpg/mg IL-17pg/mg NF-kB활성p-p65/p65 COX-2활성
정상군 0.9 6.5 0.21 35 17 0.12 0.23
유도군 -1.9 4.4 1.86 265 89 0.32 0.52
LP NK3 -0.9 5.2 1.12 89 45 0.23 0.35
BL NK49 -0.7 5.4 0.87 95 38 0.22 0.36
혼합물 -0.7 5.5 0.82 88 35 0.19 0.29
양성대조군 -1.0 5.1 1.26 105 47 0.25 0.42
구체적으로, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49 또는 이들의 혼합물을 투여한 군에서의 체중 변화가 크지 않아 독성이 없음을 확인하였다. 또한, 대장염의 유도시 대장이 길이가 짧아졌으나, 유산균을 투여한 군에서는 대장 길이의 회복 효과를 나타냄을 확인하였다. 나아가, 유산균을 투여한 군에서는 대장염의 유도에 따라 증가된 미엘로퍼옥시다아제 활성이 감소되고, TNF-α 및 IL-17의 사이토카인의 발현량이 억제되며 NF-kB의 활성 및 COX-2 의 활성이 억제됨을 확인하였다.
이를 통해, 신규한 유산균은 독성을 나타내지 않으면서 대장염의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
<유산균의 수탁 정보>
본 발명의 발명자들은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) NK3을 2017년 8월 4일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(주소: 대한민국 서울 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩)에 특허기탁하여 KCCM12089P의 수탁번호를 부여받았다.
또한, 본 발명의 발명자들은 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) NK49를 2017년 8월 4일에 공인기탁기관인 한국미생물보존센터(주소: 대한민국 서울 서대문구 홍제내 2가길 45 유림빌딩)에 특허기탁하여 KCCM12088P의 수탁번호를 부여받았다.
Figure PCTKR2018004590-appb-I000001
Figure PCTKR2018004590-appb-I000002

Claims (20)

  1. 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P.
  2. 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P.
  3. 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P는 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열을 포함하는, 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P.
  4. 제2항에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P은 서열번호 2의 16S rDNA 염기서열을 포함하는, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P.
  5. 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P은 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물인, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P은 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물인, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 염증 질환은 관절염, 통풍, 간염, 천식, 비만, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 대장염, 당뇨, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증 통증, 요도염, 방광염, 질염, 동맥경화증, 패혈증, 화상, 피부염, 치주염 및 치은염을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 염증 질환은 대장염 또는 질염인, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물을 포함하는 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  11. 제5항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P은 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물인, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  12. 제10항에 있어서, 상기 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P은 이의 생균체, 이의 사균체, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물인, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  13. 제10항에 있어서, 상기 염증 질환은 관절염, 통풍, 간염, 천식, 비만, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 대장염, 당뇨, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증 통증, 요도염, 방광염, 질염, 동맥경화증, 패혈증, 화상, 피부염, 치주염 및 치은염을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  14. 제10항에 있어서, 상기 염증 질환은 대장염 또는 질염인, 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능 식품.
  15. 락토바실러스 플란타럼 NK3(Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49(Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 염증 질환은 관절염, 통풍, 간염, 천식, 비만, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 대장염, 당뇨, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증 통증, 요도염, 방광염, 질염, 동맥경화증, 패혈증, 화상, 피부염, 치주염 및 치은염을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 염증 질환의 예방 또는 치료방법.
  17. 염증 질환의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물의 용도.
  18. 제17항에 있어서, 상기 염증 질환은 관절염, 통풍, 간염, 천식, 비만, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 대장염, 당뇨, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증 통증, 요도염, 방광염, 질염, 동맥경화증, 패혈증, 화상, 피부염, 치주염 및 치은염을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 용도.
  19. 염증 질환의 치료에 사용하기 위한 락토바실러스 플란타럼 NK3 (Lactobacillus plantarum NK3) KCCM12089P, 비피도박테리움 롱검 NK49 (Bifidobacterium longum NK49) KCCM12088P 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 염증 질환은 관절염, 통풍, 간염, 천식, 비만, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 대장염, 당뇨, 결핵, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증 통증, 요도염, 방광염, 질염, 동맥경화증, 패혈증, 화상, 피부염, 치주염 및 치은염을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 조성물.
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