TW202417626A - 具有共表現的ｔｇｆｂｒ ｓｈｒｎａ之免疫細胞 - Google Patents

具有共表現的ｔｇｆｂｒ ｓｈｒｎａ之免疫細胞 Download PDF

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TW202417626A
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約翰 加格儂
亞當 里特曼
艾米 喬 加斯邦
布雷諾 辛
傑森 哈爾
娜塔莉 貝茲曼
艾倫 庫柏
拉普 里維 葛雷
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美商亞森諾生物科學公司
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Abstract

本文提供減少TGFBR1及/或TGFBR2之表現之重組核酸及包含該等重組核酸之細胞。亦提供製造及使用該等細胞之方法。

Description

具有共表現的TGFBR　SHRNA之免疫細胞
癌症係特徵在於不可控細胞生長之疾病。已嘗試許多治療癌症之方法，包括藥物及輻射療法。最新的癌症治療尋求使用身體之自身免疫細胞來攻擊癌細胞。一種有希望的方法使用取自患者且經遺傳改造以產生嵌合抗原受體或CAR之T細胞，該等嵌合抗原受體或CAR係給予T細胞靶向特定蛋白質之新能力之受體蛋白。受體係嵌合的，此乃因其將抗原結合功能及T細胞活化功能組合至單一受體中。
使用CAR-T細胞之免疫療法係有希望的，此乃因經修飾之T細胞具有識別癌細胞以更有效地靶向並破壞該等癌細胞之潛能。在用CAR改造T細胞後，將所得CAR-T細胞引入患者中來攻擊腫瘤細胞。一旦將CAR-T細胞輸注至患者中，其便立即與其在細胞上之靶向抗原接觸。CAR-T細胞結合至抗原且變得活化。在抗原接合後，CAR T細胞可以指數方式增殖，起始抗腫瘤細胞介素產生，且靶向腫瘤細胞殺傷。
然而，基於CAR T細胞之免疫療法仍存在一些限制。具體而言，CAR-T細胞可能缺乏外周存活，可能具有降低的擴增及效應功能，易受阻抑及耗竭，且可能不會產生記憶T細胞持久性。因此，需要靶向T細胞固有路徑之額外療法來解決CAR-T療法之該等障礙。
在一個態樣中，本文提供一或多種重組核酸，其包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類TGF-β受體2 (TGFBR2)之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供一或多種重組核酸，其包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類TGF-β受體1 (TGFBR1)之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供一或多種重組核酸，其包含：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，該第一核酸序列與編碼人類TGF-β受體2 (TGFBR2)之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；及長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，該第二核酸序列與編碼人類TGF-β受體2 (TGFBR2)之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供一或多種重組核酸，其包含：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，該第一核酸序列與編碼人類TGF-β受體2 (TGFBR2)之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；及長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，該第二核酸序列與編碼人類TGF-β受體1 (TGFBR1)之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一些實施例中，核酸序列之長度係至少16個、17個、18個、19個、20個、21個或22個核苷酸。
在一些實施例中，核酸係短髮夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)或反義寡核苷酸。
在一些實施例中，核酸係shRNA。
在一些實施例中，核酸或第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第一及第二核酸各自包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸或第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列。
在一些實施例中，核酸或第一核酸包含SEQ ID NO: 51或53中所述之序列。
在一些實施例中，核酸、第一核酸或第二核酸包含SEQ ID NO: 81及51或53中所述之序列。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 128、129、130、139、140或141中所述之序列。
在一些實施例中，與不包含各別核酸之對照細胞相比，核酸、第一核酸或第二核酸使細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，核酸或第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-35中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸或第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之序列。
在一些實施例中，與不包含各別核酸之對照細胞相比，核酸或第二核酸使細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列，且第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之序列。
在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列，且第二核酸包含SEQ ID NO: 51中所述之序列。
在一些實施例中，與不包含各別核酸之對照細胞相比，第一及第二核酸使細胞中TGFBR1及TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列，且第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列，且第二核酸包含SEQ ID NO: 28、16、51或53中所述之序列。
在一些實施例中，各自與不包含各別核酸之對照細胞相比，核酸、第一核酸及/或第二核酸使細胞中TFGBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，且第二核酸使細胞中TGFBR1及/或TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，一或多種核酸進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三核酸序列，其中至少第三核酸序列包含與編碼人類Fas細胞表面死亡受體(FAS)之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之序列。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 130、139、129或141中所述之序列。
在一些實施例中，一或多種核酸進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三核酸序列，其中第三核酸序列包含以下中之一或多者：(1)與編碼人類Fas細胞表面死亡受體(FAS)之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列，(2)與編碼人類2型蛋白酪胺酸磷酸酶非受體(PTPN2)之mRNA之核苷酸518至559互補之核酸序列，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之序列；或(3)與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補之核酸序列，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之序列。
在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列，第二核酸包含SEQ ID NO: 51中所述之序列，且第三核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之序列。
在一些實施例中，一或多種重組核酸包含SEQ ID NO: 129、130、139或141中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含與編碼人類2型蛋白酪胺酸磷酸酶非受體(PTPN2)之mRNA之核苷酸518至559互補之核酸序列，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 100-112中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 110中所述之序列。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 129中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補之核酸序列，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 113-126中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三及第四核酸序列，其中第三核酸序列包含與編碼人類Fas細胞表面死亡受體(FAS)之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列，且第四核酸序列包含與編碼人類2型蛋白酪胺酸磷酸酶非受體(PTPN2)之mRNA之核苷酸518至559互補之核酸序列，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 100-112中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 110中所述之序列。
在一些實施例中，與不包含核酸之對照細胞相比，第三核酸使細胞中FAS之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，及/或使細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，重組核酸進一步包含以下中之至少一者：編碼引發受體之核苷酸序列，該引發受體包含特異性結合至第一抗原之第一細胞外抗原結合結構域；及編碼嵌合抗原受體(CAR)之核苷酸序列，該嵌合抗原受體包含特異性結合至第二抗原之第二細胞外抗原結合結構域，其中第一抗原及第二抗原係不同的。
在一些實施例中，重組核酸在5’至3’方向上包含：CAR；本文所揭示之一或多種重組核酸；及引發受體。
在一些實施例中，核酸在5’至3’方向上包含：引發受體；本文所揭示之一或多種重組核酸；及CAR。
在一些實施例中，重組核酸進一步包含與宿主細胞染色體中之***位點互補之5’同源定向修復臂及/或3’同源定向修復臂。
在一些實施例中，重組核酸包含5’同源定向修復臂及3’同源定向修復臂。
在一些實施例中，一或多種核酸中之每一者係在複數種不同核酸分子上編碼。
在一些實施例中，一或多種核酸中之每一者係在相同核酸分子上編碼。
在一些實施例中，將一或多種重組核酸納入一或多個表現盒或表現載體中。
在一些實施例中，表現盒或表現載體進一步包含一或多種重組核酸上游之組成型啟動子。
在一些實施例中，表現盒包含SEQ ID NO: 133-137中之任一者中所述之序列。
在一些實施例中，表現載體係非病毒載體。
在一個態樣中，本文提供表現載體，其包含本文所揭示之重組核酸。
在一些實施例中，表現載體係非病毒載體。
在一些實施例中，重組核酸之5’端及3’端包含一或多條核苷酸序列，其與側接細胞基因體中之***位點之基因體序列同源。
在一些實施例中，***位點位於T細胞受體α恆定(TRAC)基因座或基因體安全港(GSH)基因座處。
在一些實施例中，GSH基因座係GS94基因座。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含長度為至少15個核苷酸之一或多種重組核酸，該一或多種重組核酸與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含長度為至少15個核苷酸之一或多種重組核酸，該一或多種重組核酸與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含含有以下之一或多種重組核酸：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，其與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；及長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，其中第二核酸序列與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；或與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一些實施例中，第二核酸序列與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
在一些實施例中，第二核酸序列與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含含有以下之一或多種重組核酸：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，其與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；及長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，其與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含含有以下之一或多種重組核酸：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列及第二核酸序列，其與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
在一些實施例中，該細胞進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三核酸序列，其中第三核酸序列(1)與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列；(2)與編碼人類PTPN2之mRNA之核苷酸518至559互補，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之序列；或(3)與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之序列。
在一些實施例中，該細胞進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第四核酸序列，其中第四核酸序列(1)與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列；(2)與編碼人類PTPN2之mRNA之核苷酸518至559互補，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之序列；或(3)與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之序列。
在一些實施例中，第一、第二、第三及第四核酸係shRNA、siRNA、dsRNA或反義寡核苷酸。
在一些實施例中，第一、第二、第三及第四核酸係shRNA。
在一些實施例中，第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列。
在一些實施例中，第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-35中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之序列。
在一些實施例中，第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列；且第二核酸序列包含選自由SEQ ID NO: 6-35中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列；且第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之序列。
在一些實施例中，第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第二核酸包含SEQ ID NO: 51或53中所述之序列。
在一些實施例中，第一核酸及第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列；且第二核酸包含SEQ ID NO: 51或53中所述之序列。
在一些實施例中，一或多種重組核酸包含SEQ ID NO: 128、129、130、139、140或141中所述之序列。
在一些實施例中，與不包含第一核酸之對照細胞相比，第一核酸使細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含第一核酸之對照細胞相比，細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含第二核酸之對照細胞相比，第二核酸使細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含第二核酸之對照細胞相比，細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，各自與不包含各別核酸之對照細胞相比，第一核酸使細胞中TFGBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，且第二核酸使細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含第二核酸之對照細胞相比，第二核酸使細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含第二核酸之對照細胞相比，細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，各自與不包含各別核酸之對照細胞相比，第一核酸使細胞中TFGBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，且第二核酸使細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，第三核酸序列與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之序列。
在一些實施例中，與不包含第三核酸之對照細胞相比，第三核酸使免疫細胞中FAS之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，第四核酸序列與編碼人類PTPN2之mRNA之核苷酸518至559互補，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之序列。
在一些實施例中，第四核酸包含選自由SEQ ID NO: 100-112中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第四核酸包含SEQ ID NO: 110中所述之序列。
在一些實施例中，一或多種重組核酸包含SEQ ID NO: 129中所述之序列。
在一些實施例中，與不包含第一核酸之對照細胞相比，第四核酸使免疫細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，第四核酸序列與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之序列。
在一些實施例中，第四核酸包含選自由SEQ ID NO: 113-126中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，TGFBR1、TGFBR2、FAS及/或PTPN2及/或TOX之表現係藉由核酸分析或蛋白質分析確定。
在一些實施例中，核酸分析包含以下中之至少一者：聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR (qPCR)、RT-qPCR、微陣列、基因陣列或RNAseq。
在一些實施例中，蛋白質分析包含以下中之至少一者：免疫印漬術、螢光活化細胞分選、流式細胞術、磁活化細胞分選或基於親和力之細胞分離。
在一些實施例中，該細胞進一步包含引發受體，其包含特異性結合至第一抗原之第一細胞外抗原結合結構域；及嵌合抗原受體(CAR)，其包含特異性結合至第二抗原之第二細胞外抗原結合結構域。
在一些實施例中，免疫細胞係原代人類免疫細胞。
在一些實施例中，原代免疫細胞係自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、T細胞、γδ T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、原代T細胞、T細胞祖細胞或誘導性富潛能幹細胞(iPSC)。
在一些實施例中，原代免疫細胞係原代T細胞。
在一些實施例中，原代免疫細胞係原代人類T細胞。
在一些實施例中，免疫細胞係無病毒的。
在一些實施例中，免疫細胞係自體免疫細胞。
在一些實施例中，免疫細胞係同種異體免疫細胞。
在一個態樣中，本文提供原代免疫細胞，其包含***原代免疫細胞基因體之靶區域中之至少一種重組核酸，該至少一種重組核酸包含含有選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列的第一核酸；及含有選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之序列組成之群之序列的第二核酸，且其中原代免疫細胞不包含將重組核酸引入原代免疫細胞中之病毒載體。
在一個態樣中，本文提供原代免疫細胞，其包含***原代免疫細胞基因體之靶區域中之至少一種重組核酸，該至少一種重組核酸包含含有選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列的第一核酸；及含有選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之序列組成之群之序列的第二核酸，且其中原代免疫細胞不包含將重組核酸引入原代免疫細胞中之病毒載體。
在一個態樣中，本文提供活的無病毒原代細胞，其包含核糖核蛋白複合物(RNP)-重組核酸複合物，其中RNP包含核酸酶結構域及指導RNA，其中重組核酸包含含有選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列的第一核酸；及含有選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之序列組成之群之序列的第二核酸，且其中重組核酸之5’端及3’端包含與側接原代細胞基因體中之***位點之基因體序列同源的核苷酸序列。
在一個態樣中，本文提供活的無病毒原代細胞，其包含核糖核蛋白複合物(RNP)-重組核酸複合物，其中RNP包含核酸酶結構域及指導RNA，其中重組核酸包含含有選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列的第一核酸；及含有選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之序列組成之群之序列的第二核酸，且其中重組核酸之5’端及3’端包含與側接原代細胞基因體中之***位點之基因體序列同源的核苷酸序列。
在一些實施例中，該細胞進一步包含引發受體，其包含特異性結合至第一抗原之第一細胞外抗原結合結構域；及嵌合抗原受體(CAR)，其包含特異性結合至第二抗原之第二細胞外抗原結合結構域，其中第一抗原及第二抗原係不同的。
在一個態樣中，本文提供細胞群體，其包含複數個本文所揭示之免疫細胞。
在一個態樣中，本文提供醫藥組合物，其包含本文所揭示之免疫細胞或本文所揭示之細胞群體及醫藥學上可接受之賦形劑。
在一個態樣中，本文提供醫藥組合物，其包含本文所揭示之一或多種重組核酸或本文所揭示之載體及醫藥學上可接受之賦形劑。
在一個態樣中，本文提供編輯免疫細胞之方法，其包括：提供核糖核蛋白(RNP)-重組核酸複合物，其中RNP包含核酸酶結構域及指導RNA，其中重組核酸包含本文所揭示之重組核酸，且其中重組核酸之5’端及3’端包含與側接免疫細胞基因體中之***位點之基因體序列同源的核苷酸序列；將RNP-重組核酸複合物以非病毒方式引入免疫細胞中，其中指導RNA與原代免疫細胞基因體之靶區域特異性雜交，且其中核酸酶結構域使靶區域裂解以在免疫細胞之基因體中產生***位點；及經由將本文所揭示之重組核酸***免疫細胞基因體中之***位點中來編輯免疫細胞。
在一些實施例中，以非病毒方式引入包括電穿孔。
在一些實施例中，核酸酶結構域包含CRISPR相關之核酸內切酶(Cas)，視情況地Cas9核酸酶。
在一些實施例中，細胞基因體之靶區域係T細胞受體α恆定(TRAC)基因座或基因體安全港(GSH)基因座。
在一些實施例中，重組核酸係雙股重組核酸或單股重組核酸。
在一些實施例中，重組核酸係線性重組核酸或環狀重組核酸，視情況地其中環狀重組核酸係質體。
在一些實施例中，免疫細胞係原代人類免疫細胞。
在一些實施例中，免疫細胞係自體免疫細胞。
在一些實施例中，免疫細胞係同種異體免疫細胞。
在一些實施例中，免疫細胞係自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、T細胞、γδ T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、原代T細胞、T細胞祖細胞或誘導性富潛能幹細胞(iPSC)。
在一些實施例中，免疫細胞係原代T細胞。
在一些實施例中，免疫細胞係原代人類T細胞。
在一些實施例中，免疫細胞係無病毒的或不包含病毒載體。
在一些實施例中，進一步包括自患者獲得免疫細胞及活體外引入重組核酸。
在一個態樣中，本文提供治療個體疾病之方法，其包括向個體投與本文所揭示之免疫細胞或本文所揭示之醫藥組合物。
在一些實施例中，疾病係癌症。
在一些實施例中，癌症係實體癌症或液體癌症。
在一些實施例中，癌症係卵巢癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、子宮癌、間皮瘤、子宮頸癌、胰臟癌、腎癌、肺癌、***癌、膀胱癌、乳癌、腦癌、白血病或淋巴瘤。
在一些實施例中，投與細胞會增強免疫反應。
在一些實施例中，增強的免疫反應係適應性免疫反應。
在一些實施例中，增強的免疫反應係先天性免疫反應。
在一個態樣中，本文提供增強個體之免疫反應之方法，其包括向個體投與本文所揭示之免疫細胞或本文所揭示之醫藥組合物。
在一些實施例中，增強的免疫反應係適應性免疫反應。
在一些實施例中，增強的免疫反應係先天性免疫反應。
在一些實施例中，與不包含各別核酸之對照細胞相比，免疫細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含各別核酸之對照細胞相比，免疫細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含各別核酸之對照細胞相比，免疫細胞中FAS之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含各別核酸之對照細胞相比，免疫細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含各別核酸之對照細胞相比，免疫細胞中TOX之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，免疫細胞中TGFBR1、TGFBR2、FAS、PTPN2及/或TOX之表現係藉由核酸分析或蛋白質分析確定。
在一些實施例中，核酸分析包含以下中之至少一者：聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR (qPCR)、RT-qPCR、微陣列、基因陣列或RNAseq。
在一些實施例中，蛋白質分析包含以下中之至少一者：免疫印漬術、螢光活化細胞分選、流式細胞術、磁活化細胞分選或基於親和力之細胞分離。
在一些實施例中，進一步包括與免疫細胞同時或在免疫細胞之後向個體投與免疫療法。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2022年9月13日提出申請之美國臨時申請案第63/375,519號、於2023年3月13日提出申請之美國臨時申請案第63/489,840號、於2023年4月13日提出申請之美國臨時申請案第63/495,867號及於2023年7月28日提出申請之美國臨時申請案第63/516,484號的優先權益，該等臨時申請案中每一者之揭示內容之全文出於所有目的皆以引用方式併入本文中。 序列表
本申請案含有序列表，其已以電子方式提交且全文皆以引用方式併入本文中。該XML拷貝創建於20XX年XX月，命名為ANB-215_ sequencelisting.xml，且大小係X,XXX,XXX個位元組。 定義
除非另有說明，否則申請專利范圍及說明書中所用之術語係如下文所述來定義。
如本文所用之術語「基因座」係指基因或遺傳標記物在染色體上定位之特定、固定物理位置。
術語「安全港基因座」係指可納入基因或遺傳元件、但不破壞相鄰基因之表現或調節之基因座。該等安全港基因座亦稱為安全港位點(SHS)或基因體安全港(GSH) 位點。如本文所用之安全港基因座係指可***如本文所定義編碼轉基因之序列之「整合位點」或「敲入位點」。在一些實施例中，***係藉由替代位於整合位點之序列來進行。在一些實施例中，***係在不替代整合位點之序列下進行。預期整合位點之實例提供於 表 D中。
如本文所用之術語「***物」係指整合(***)靶基因座或安全港位點之核苷酸序列。***物可用於指使用例如同源定向修復(HDR) CRISPR/Cas9基因體編輯或熟習此項技術者已知之將核苷酸序列***基因體區域中之其他方法納入靶基因座或安全港位點之基因或遺傳元件。
術語「***」係指操縱核苷酸序列以引入非天然序列。此係例如經由使用限制酶及連接酶來進行，藉此可藉由用適當限制酶消化兩個分子以產生相容性重疊、且然後使用連接酶將分子連結在一起將通常編碼所關注基因之所關注DNA序列納入另一核酸分子中。熟習此項技術者非常熟悉該等操縱且實例可參見Sambrook等人(Sambrook、Fritsch及Maniatis, 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)，該文獻之全文(包括任何圖式、圖及表)皆以引用方式併入本文中。
「CRISPR/Cas」系統係指用於防禦外源核酸之一大類細菌系統。CRISPR/Cas系統發現於寬范圍之真細菌及古菌生物體中。CRISPR/Cas系統包括I型、II型及III型亞型。野生型II型CRISPR/Cas系統利用RNA介導之核酸酶Cas9與指導物及活化RNA之複合物來識別並裂解外源核酸。此項技術中亦已知具有指導RNA及活化RNA二者活性之指導RNA。在一些情形下，該等雙重活性指導RNA稱為小指導RNA (sgRNA)。
在眾多種真細菌中發現Cas9同源物，包括(但不限於)以下分類群之細菌： 放線菌門 (Actinobacteria)、 產水菌門 (Aquificae)、 擬桿菌門 - 綠菌門 (Bacteroidetes-Chlorobi)、 衣原體門 - 疣微菌門 (Chlamydiae-Verrucomicrobia)、 綠彎菌門 (Chlroflexi)、 藍菌門 (Cyanobacteria)、 厚壁菌門 (Firmicutes)、 變形菌門 (Proteobacteria)、 螺旋體門 (Spirochaetes)及 熱袍菌門 (Thermotogae)。例示性Cas9蛋白係 釀膿鏈球菌 (Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白。其他Cas9蛋白及其同源物闡述於例如以下文獻中：Chylinksi等人，RNA Biol. 2013年5月1日; 10(5): 726-737；Nat. Rev. Microbiol. 2011年6月; 9(6): 467-477；Hou等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 2013年9月24日;110(39):15644-9；Sampson等人，Nature. 2013年5月9日;497(7448):254-7；及Jinek等人，Science. 2012年8月17日; 337(6096):816-21。Cas9核酸酶結構域可經最佳化以在宿主細胞中具有有效活性或增強的穩定性。
如本文所用之術語「Cas9」係指RNA介導之核酸酶(例如細菌或古菌來源或衍生自其之核酸酶)。例示性RNA介導之核酸酶包括前述Cas9蛋白及其同源物，且包括(但不限於) CPF1 (參見，例如Zetsche等人，Cell，第163卷，第3期，第759-771頁，2015年10月22日)。類似地，如本文所用之術語「Cas9核糖核蛋白」複合物及諸如此類係指Cas9蛋白與crRNA (例如指導RNA或小指導RNA)之間的複合物、Cas9蛋白與反式活化crRNA (tracrRNA)之間的複合物、Cas9蛋白與小指導RNA之間的複合物或其組合(例如，含有Cas9蛋白、tracrRNA及crRNA指導RNA之複合物)。
如本文所用之片語「免疫細胞」包括可產生免疫細胞之所有細胞類型，包括造血細胞，例如造血幹細胞、富潛能幹細胞及誘導性富潛能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，免疫細胞係B細胞、巨噬細胞、自然殺手(NK)細胞、誘導性富潛能幹細胞(iPSC)、人類富潛能幹細胞(HSPC)、T細胞或T細胞祖細胞或樹突細胞。在一些實施例中，細胞係先天性免疫細胞。
如本文所用，原代細胞或原代幹細胞上下文中之術語「原代」係指尚未經轉型或永生化之細胞。該等原代細胞可培養、亞培養或傳代有限次數(例如培養0次、1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次)。在一些情形下，原代細胞適於活體外培養條件。在一些情形下，原代細胞係自生物體、系統、器官或組織分離，視情況地進行分選及利用，例如在無培養或亞培養下直接進行。在一些情形下，原代細胞經刺激、活化或分化。舉例而言，原代T細胞可藉由與CD3、CD28促效劑、IL-2、IFN-γ或其組合接觸(例如，在其存在下培養)來活化。
如本文所用之術語「T淋巴球」及「T細胞」可互換使用且係指已在胸腺中完成成熟且鑑別身體中之某些外源抗原之細胞。該等術語亦指在免疫系統中具有多種作用(包括其他免疫細胞之活化及去活化)之主要白血球類型。T細胞可為任一T細胞，例如經培養T細胞，例如原代T細胞，或衍生自經培養T細胞株(例如Jurkat、SupT1等)之T細胞，或自哺乳動物獲得之T細胞。T細胞包括(但不限於)幼稚T細胞、經刺激T細胞、原代T細胞(例如未經培養)、經培養T細胞、永生化T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調節T細胞、自然殺手T細胞、其組合或其亞群。T細胞可為CD3 +細胞。T細胞可為CD4 +、CD8 +、或CD4 +及CD8 +。T細胞可為任一類型之T細胞、CD4 + / CD8 +雙陽性T細胞、CD4 +輔助T細胞(例如Th1及Th2細胞)、CD8 + T細胞(例如細胞毒性T細胞)、外周細胞(包括但不限於血液單核細胞(PBMC)、外周血白血球(PBL)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、記憶T細胞、幼稚T細胞、調節T細胞、γδ T細胞等)。其可為處於任一發育階段之任一T細胞。其他類型之輔助T細胞包括Th3 (Treg)細胞、Th17細胞、Th9細胞或Tfh細胞。其他類型之記憶T細胞包括諸如以下之細胞：中樞記憶T細胞(Tcm細胞)、效應記憶T細胞(Tem細胞及TEMRA細胞)。T細胞亦可指經遺傳修飾之T細胞，例如已經修飾以表現T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)之T細胞。T細胞亦可自幹細胞或祖細胞分化而來。
「CD4 + T細胞」係指在其表面上表現CD4且與細胞免疫反應相關之T細胞亞組。CD4 + T細胞之特徵在於刺激後分泌概況，其可包括諸如以下之細胞介素之分泌：IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4及IL-10。「CD4」係55 kD糖蛋白，其最初定義為T淋巴球上之分化抗原，但亦發現於其他細胞(包括單核球/巨噬細胞)上。CD4抗原係免疫球蛋白超家族之成員且已暗示為II類MHC (主要組織相容性複合物)限制性免疫反應中之聯想識別元件。在T淋巴球上，CD4抗原定義輔助物/誘導物亞組。
「CD8 + T細胞」係指在其表面上表現CD8、受I類MHC 限制且用作細胞毒性T細胞之T細胞亞組。「CD8」分子係存在於胸腺細胞上以及存在於細胞毒性及阻抑T淋巴球上之分化抗原。CD8抗原係免疫球蛋白超家族之成員且係I類主要組織相容性複合物限制性相互作用中之聯想識別元件。
如本文所用之片語「造血幹細胞」係指可產生血球之一種類型之幹細胞。造血幹細胞可產生骨髓或淋巴譜系細胞或其組合。造血幹細胞主要發現於骨髓中，但其可自外周血或其部分分離而來。可使用各種細胞表面標記物來鑑別、分選或純化造血幹細胞。在一些情形下，造血幹細胞鑑別為c-kit +及lin -。在一些情形下，人類造血幹細胞鑑別為CD34 +、CD59 +、Thy1/CD90 +、CD38 lo/-、C-kit/CD117 +、lin -。在一些情形下，人類造血幹細胞鑑別為CD34 -、CD59 +、Thy1/CD90 +、CD38 lo/-、C-kit/CD117 +、lin -。在一些情形下，人類造血幹細胞鑑別為CD133 +、CD59 +、Thy1/CD90 +、CD38 lo/-、C-kit/CD117 +、lin -。在一些情形下，小鼠造血幹細胞鑑別為CD34 lo/-、SCA-1 +、Thy1 +/lo、CD38 +、C-kit +、lin -。在一些情形下，造血幹細胞係CD150 +CD48 -CD244 -。
如本文所用之片語「造血細胞」係指衍生自造血幹細胞之細胞。造血細胞可藉由自生物體、系統、器官或組織(例如血液或其部分)分離來獲得或提供。替代地，可分離造血幹細胞且藉由使幹細胞分化來獲得或提供造血細胞。造血細胞包括具有有限的分化成其他細胞類型之潛能之細胞。該等造血細胞包括(但不限於)多潛能祖細胞、譜系限制性祖細胞、普通骨髓祖細胞、顆粒球-巨噬細胞祖細胞或巨核細胞-紅血球祖細胞。造血細胞包括淋巴及骨髓譜系之細胞，例如淋巴球、紅血球、顆粒球、單核球及血小板。
如本文所用之術語「構築物」係指分子(包括大分子或多核苷酸)之複合物。
如本文所用之術語「整合」係指將構築物之一或多個核苷酸穩定***細胞基因體中、即共價連接至細胞染色體DNA中之核酸序列的過程。其亦可指整合位點之核苷酸缺失。當***位點存在缺失時，「整合」可進一步包括用一或多個***的核苷酸取代缺失的內源序列或核苷酸。
如本文所用之術語「外源」係指已引入宿主細胞中且並非該細胞天然之分子或活性。可例如藉由將編碼核酸引入宿主遺傳材料中來引入該分子，例如藉由整合至宿主染色體中或作為非染色體遺傳材料(例如質體)。因此，該術語在與編碼核酸之表現結合使用時係指將編碼核酸以可表現形式引入細胞中。術語「內源」係指在天然、未經編輯之條件下存在於宿主細胞中之分子或活性。類似地，該術語在與編碼核酸之表現結合使用時係指含於細胞內且並非外源引入之編碼核酸之表現。
術語「異源」係指並非側接序列天然之核酸或多肽序列或結構域，例如，其中在自然界中未發現與核酸或多肽序列之一端或兩端偶合之異源序列。
術語「同源」係指側接序列天然之核酸或多肽序列或結構域，例如，其中在自然界中發現與核酸或多肽序列之一端或兩端偶合之同源序列。
如本文所用之「多核苷酸供體構築物」係指以遺傳方式***多核苷酸中且係該多核苷酸外源之核苷酸序列(例如DNA序列)。多核苷酸供體構築物轉錄成RNA且視情況地轉譯成多肽。多核苷酸供體構築物可包括原核序列、來自真核mRNA之cDNA、來自真核(例如哺乳動物) DNA之基因體DNA序列及合成DNA序列。舉例而言，多核苷酸供體構築物可為miRNA、shRNA、天然多肽(即天然存在之多肽)或其片段、或變異體多肽(例如，與天然多肽具有小於100%序列一致性之天然多肽)或其片段。
如本文所用之術語「互補」或「互補性」係指核苷酸或核酸之間的特異性鹼基配對。互補核苷酸通常係A及T (或A及U)以及G及C。本文所述之指導RNA可包含與細胞中之基因體序列完全互補或實質上互補(例如，具有1-4個錯配)之序列，例如DNA靶向序列。
如本文所用之術語「轉基因」係指已天然地或藉由多種遺傳改造技術中之任一者自一種生物體轉移至另一生物體之多核苷酸。其視情況地轉譯成多肽。其視情況地轉譯成重組蛋白。「重組蛋白」係由基因(即重組DNA)編碼之蛋白質，該基因已在支持基因表現及信使RNA轉譯之系統(參見表現系統)中經選殖。重組蛋白可為治療劑，例如治療本文所揭示之疾病或病症之蛋白質。如所用，轉基因可指編碼多肽之多核苷酸。
術語「蛋白質」、「多肽」及「肽」在本文中可互換使用。
如本文所用之術語「可操作地連接(operably linked)」或「可操作地連接(operatively linked)」係指核酸序列與單一核酸片段結合，使得一種功能受另一功能的影響。舉例而言，若啟動子能夠影響編碼序列或功能RNA之表現(即，編碼序列或功能RNA處於啟動子之轉錄控制下)，則啟動子與其可操作地連接。編碼序列可在有義及反義取向上可操作地連接至控制序列。
如本文所用之術語「發育細胞狀態」係指例如細胞無活性、活性表現、分化、衰老等時之狀態，發育細胞狀態亦可指處於前體狀態(例如T細胞前體)之細胞。
如所用，術語「編碼」係指編碼所關注蛋白質或多肽之核酸序列。核酸序列可為DNA或RNA分子。在較佳實施例中，分子係DNA分子。在其他較佳實施例中，分子係RNA分子。當作為RNA分子存在時，其將包含引導宿主細胞之核糖體開始轉譯(例如起始密碼子ATG)及引導核糖體結束轉譯(例如終止密碼子)之序列。開放閱讀框(ORF)介於起始密碼子與終止密碼子之間。該等術語為熟習此項技術者已知。
如本文所用之術語「個體」係指哺乳動物個體。例示性個體包括人類、猴、狗、貓、小鼠、大鼠、牛、馬、駱駝、山羊、兔、豬及綿羊。在某些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體患有可用本文所提供之經改造細胞或其群體治療之疾病或疾患。在一些態樣中，疾病或疾患係癌症。
如本文所用之術語「啟動子」係指能夠控制編碼序列或功能RNA之表現之核苷酸序列(例如DNA序列)。啟動子序列係由近端及更遠端上游元件組成，後者元件通常稱為增強子。啟動子可完全衍生自天然基因，可由來自在自然界中發現之不同啟動子之不同元件構成，及/或可包含合成DNA區段。如本文所預期之啟動子可為所關注細胞之內源或所關注細胞之外源。熟習此項技術者應瞭解，不同啟動子可誘導不同組織或細胞類型中、或處於不同發育狀態、或因應不同環境條件之基因表現。如此項技術中已知，啟動子可根據啟動子之強度及/或啟動子有活性之條件來選擇，例如組成型啟動子、強啟動子、弱啟動子、誘導型/可抑制型啟動子、組織特異性或發育調節啟動子、細胞週期依賴性啟動子及諸如此類。
啟動子可為誘導型啟動子(例如熱休克啟動子、四環素調節啟動子、類固醇調節啟動子、金屬調節啟動子、***受體調節啟動子等)。啟動子可為組成型啟動子(例如CMV啟動子、UBC啟動子)。在一些實施例中，啟動子可為空間限制性及/或時間限制性啟動子(例如組織特異性啟動子、細胞類型特異性啟動子等)。參見例如美國公開案20180127786，其揭示內容之全文皆以引用方式併入本文中。
如本文所預期之基因編輯可涉及基因(或核苷酸序列)敲入或基因剔除。如本文所用之術語「敲入」係指將DNA序列或其片段添加至基因體中。該等欲敲入之DNA序列可包括一或多個完整基因，可包括與基因相關之調節序列或前述之任一部分或片段。舉例而言，可將編碼重組蛋白之多核苷酸供體構築物***攜帶突變基因之細胞基因體中。在一些實施例中，敲入策略涉及用所提供序列取代現有序列，例如用野生型拷貝取代突變對偶基因。另一方面，術語「基因剔除」係指消除基因或基因表現。舉例而言，基因可藉由缺失或添加核苷酸序列、導致閱讀框破壞來進行基因剔除。作為另一實例，基因可藉由用不相關(例如非編碼)序列替代基因之一部分來進行基因剔除。
如本文所用之術語「非同源末端連結」或NHEJ係指其中將DNA股之切割或切口末端直接連接而無需同源模板核酸之細胞過程。NHEJ可在修復位點產生一或多個核苷酸之添加、缺失、取代或其組合。
如本文所用之術語「同源定向修復」或HDR係指其中藉由根據同源模板核酸聚合來修復DNA股之切割或切口末端之細胞過程。因此，原始序列經模板序列替代。同源模板核酸可由基因體(姊妹染色分體、同源染色體或相同或不同染色體上之重複區域)別處之同源序列提供。替代地，可引入外源模板核酸以在靶位點獲得特異性HDR誘導之序列變化。以此方式，可在切割位點引入特定突變。
如本文所用之單股DNA模板或雙股DNA模板係指可由細胞用作HDR模板之DNA寡核苷酸。通常，單股DNA模板或雙股DNA模板具有與靶位點同源之至少一個區域。在一些情形下，單股DNA模板或雙股DNA模板具有兩個同源區域，其側接含有欲***靶切割位點之異源序列之區域。
術語「載體」及「質體」可互換使用，且如本文所用係指可用於將遺傳材料引入細胞中之多核苷酸媒劑。載體可為線性或環狀。載體可整合至宿主細胞之靶基因體中或在宿主細胞中獨立地複製。載體可包含例如複製起點、多選殖位點及/或可選擇標記物。表現載體通常包含表現盒。載體及質體包括(但不限於)整合載體、原核質體、真核質體、植物合成染色體、遊離基因體、黏粒及人工染色體。
如本文所用，引入核酸或包含核酸之複合物(例如RNP-DNA模板複合物)之上下文中之片語「引入」係指核酸序列或RNP-DNA模板複合物自細胞外轉座至細胞內。在一些情形下，引入係指核酸或複合物自細胞外轉座至細胞核內。預期該轉座之各種方法，包括(但不限於)電穿孔、與奈米線或奈米管接觸、受體介導之內化、經由細胞穿透肽轉座、脂質體介導之轉座及諸如此類。
如本文所用之術語「表現盒」係重組或合成產生之多核苷酸構築物，其包含可操作地連接至所選多核苷酸以幫助所選多核苷酸在宿主細胞中表現之調節序列。舉例而言，調節序列可幫助所選多核苷酸在宿主細胞中轉錄，或幫助所選多核苷酸在宿主細胞中轉錄及轉譯。表現盒可例如整合於宿主細胞之基因體中或存在於表現載體中。
如本文所用之片語「有需要之個體」係指展現及/或經診斷具有如本文所述之疾病或病症之一或多個症狀或徵象的個體。
「化學治療劑」係指可用於治療癌症之化學化合物。化學治療劑包括用於調節、降低、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素效應之「抗激素劑」或「內分泌治療劑」。
術語「組合物」係指含有例如本文所預期之經改造細胞或核酸之混合物。在一些實施例中，組合物可含有額外組分，例如助劑、穩定劑、賦形劑及諸如此類。術語「組合物」或「醫藥組合物」係指呈諸如允許其中所含活性成分之生物活性有效地治療個體之形式、且不含在醫藥組合物中所提供之量下對個體具有不可接受毒性之額外組分的製劑。
術語「原位」係指發生在與活生物體分開生長(例如生長於組織培養物中)之活細胞中之過程。
術語「活體內」係指發生在活生物體中之過程。
如本文所用之術語「離體」通常包括在活組織中或其上、較佳地在生物體外之人工環境中、較佳地在與天然條件具有最小差異下進行之實驗或量測。
如本文所用之術語「哺乳動物」包括人類及非人類二者且包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、犬、貓、鼠類、牛、馬及豬。
兩條或更多條核酸或多肽序列之上下文中之術語「一致性」%係指在比較及比對最大對應性時，兩條或更多條序列或子序列具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基，如使用下文所述序列比較算法中之一者(例如熟習此項技術者可獲得之BLASTP及BLASTN或其他算法)或藉由目視檢查所量測。端視應用，「一致性」%可存在於所比較之序列區域內(例如功能結構域內)，或替代地存在於欲比較之兩條序列之全長內。
就序列比較而言，一條序列通常用作與測試序列進行比較之參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列座標，並指定序列算法程式參數。然後，序列比較算法基於所指定之程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性%。
可藉由例如以下方法實施序列之最佳比對以供比較：Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)之局部同源性算法；Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)之同源性比對算法；Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)之相似性方法之探索；該等算法之電腦化實施方案(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)或目視檢查(通常參見Ausubel等人，見上文)。
適於測定序列一致性及序列相似性%之算法之一個實例係BLAST算法，其闡述於Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中。用於實施BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。
術語「足夠量」意指足以產生期望效應之量，例如足以調節細胞中之蛋白質聚集之量。
術語「治療有效量」係有效地改善疾病症狀之量。
術語「改善」係指在疾病狀態(例如癌症疾病狀態)之治療中減輕其嚴重程度或進展、緩解或治癒之任何治療有益之結果。
如本文所用之術語「有效量」係指足以實現有益或期望結果之化合物(例如本文所述之組合物、本文所述之細胞)之量。有效量可在一或多次投與、施加或劑量中投與，且不欲限於特定調配物或投與途徑。
如本文所用之術語「治療」包括可改良疾患、疾病、病症及諸如此類或改善其症狀之任何效應，例如減輕、降低、調節、改善或消除。
術語「調節(modulate)」及「調節(modulation)」係指降低或抑制、或替代地活化或增加所列舉之變量。
術語「增加」及「活化」係指所列舉之變量增加10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更大。
術語「降低」及「抑制」係指所列舉之變量減小10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更大。
必須注意，除非上下文另外明確指明，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。 重組核酸組合物
轉型生長因子β受體1 (TGFBR1；HGNC：11772，NCBI Entrez基因：7046，UniProtKB/Swiss-Prot：P36897)係跨膜絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶且在結合至TGF-β時與II型TGF-β受體(TGFRB2)形成異質複合物，從而將TGF-β信號自細胞表面轉導至細胞質。
轉型生長因子β受體2 (TGFBR2；HGNC：11773，NCBI Entrez基因：7048，UniProtKB/Swiss-Prot：P37173)係跨膜絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶且在結合至TGF-β時與1型TGF-β受體(TGFBR1)形成異二聚體複合物，從而將TGF-β信號自細胞表面轉導至細胞質。
如本文所用之「靶基因」係指細胞中之核酸序列，其中該序列之表現可特異性地且有效地使用本文所述之重組核酸分子及方法來調節。在某些實施例中，靶基因可參與個體免疫細胞之生長(增殖)、維持(存活)及/或免疫行為。
在一些實施例中，靶基因係轉型生長因子β受體1 (TGFBR1)。在一些實施例中，靶基因係轉型生長因子β受體2 (TGFBR2)。在一些實施例中，兩個或更多個重組核酸分子靶向TFGBR2基因。
在一些實施例中，使用本文所述之重組核酸分子及方法調節一個以上之靶基因。在一些實施例中，使用本文所述之重組核酸分子及方法調節至少兩個靶基因。在一些實施例中，重組核酸分子係shRNA。在一些實施例中，至少兩個靶基因係至少TGFBR1及TGFBR2。在一些實施例中，至少兩個靶基因係至少TGFBR1、TGFBR2、FAS及PTPN2。在一些實施例中，至少兩個靶基因係至少TGFBR1、TGFBR2、FAS及TOX。在一些實施例中，至少兩個靶基因係至少TGFBR2、FAS及PTPN2。在一些實施例中，至少兩個靶基因係至少TGFBR2、FAS及TOX。
在一個態樣中，本文提供重組核酸，其包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類轉型生長因子β受體1 (TGFBR1)之mRNA互補。在一個態樣中，本文提供重組核酸，其包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類轉型生長因子β受體2 (TGFBR2)之mRNA互補。
在一些實施例中，重組核酸包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類轉型生長因子β受體1 (TGFBR1)之mRNA之核苷酸1589-1610或1965-1986互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一些實施例中，重組核酸包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類轉型生長因子β受體2 (TGFBR2)之mRNA之核苷酸2215-2236、4430-4451或3761-3782互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
在一些實施例中，核酸或第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之序列組成之群之序列。在一些實施例中，第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列，且第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，第一及第二核酸各自包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列。在一些實施例中，核酸或第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列。在一些實施例中，核酸或第一核酸包含SEQ ID NO: 51或53中所述之序列。在一些實施例中，核酸、第一核酸或第二核酸包含SEQ ID NO: 81及51或53中所述之序列。
在一些實施例中，核酸或第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-35中所述之序列組成之群之序列。在一些實施例中，核酸或第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之序列。第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列，且第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之序列。
在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列，且第二核酸包含SEQ ID NO: 28、16、51或53中所述之序列。在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列，且第二核酸包含SEQ ID NO: 51中所述之序列。在一些實施例中，第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之序列，第二核酸包含SEQ ID NO: 51中所述之序列，且第三核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之序列。
在一些實施例中，一或多種核酸進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三核酸序列，其中至少第三核酸序列包含與編碼人類Fas細胞表面死亡受體(FAS)之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列。在一些實施例中，第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之序列組成之群之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 130中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含選自由SEQ ID NO: 128-131、140或141中所述之序列組成之群之序列。
FAS係誘導細胞凋亡之TNF受體超家族成員。PTPN2係調節干擾素及許多其他傳訊路徑之磷酸酶。TOX係調節耗竭的T細胞分化之轉錄因子。
在一個態樣中，本文提供重組核酸，其包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類FAS、2型蛋白酪胺酸磷酸酶非受體(PTPN2)或胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA互補。
在一些實施例中，重組核酸包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列。
在一些實施例中，重組核酸包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類2型蛋白酪胺酸磷酸酶非受體(PTPN2)之mRNA之核苷酸518至559互補，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之序列。
在一些實施例中，重組核酸包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之序列。
在一些實施例中，核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之序列組成之群之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之序列。在一些實施例中，與不包含核酸之對照細胞相比，核酸使免疫細胞中FAS之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，核酸包含選自由SEQ ID NO: 100-112中所述之序列組成之群之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 110中所述之序列。在一些實施例中，與不包含核酸之對照細胞相比，核酸使細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，核酸包含選自由SEQ ID NO: 113-126中所述之序列組成之群之序列。在一些實施例中，與不包含核酸之對照細胞相比，核酸使細胞中TOX之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，核酸包含選自由SEQ ID NO: 127-130中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸包含選自由SEQ ID NO: 127-131或133-141中所述之序列組成之群之序列。在一些實施例中，核酸包含選自由SEQ ID NO: 127-131及139-141中所述之序列組成之群之序列。在一些實施例中，核酸包含選自由SEQ ID NO: 133-137中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三核酸序列，其中至少第三核酸序列包含與編碼人類Fas細胞表面死亡受體(FAS)之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列。
在一些實施例中，第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之序列組成之群之序列。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之序列。
在一些實施例中，核酸包含shRNA模組。在一些實施例中，shRNA模組包含一或多個shRNA之第一股及第二股。在一些實施例中，shRNA模組包含兩個shRNA。在一些實施例中，shRNA模組包含三條shRNA序列。在一些實施例中，shRNA模組包含四條shRNA序列。在一些實施例中，shRNA模組進一步包含一或多個miR之一或多個骨架。在一些實施例中，一或多個骨架包含5’骨架、環及3’骨架。在一些實施例中，shRNA模組在一或多個miR之骨架內包含一或多個shRNA之第一股及第二股。在一些實施例中，shRNA之第一股位於miR之5’骨架與環之間，且shRNA之第二股位於miR之環與3’骨架之間。
在一些實施例中，shRNA模組係雙重shRNA模組。在一些實施例中，shRNA模組自5’至3’包含(1)第一miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(2)第一shRNA之第一股，(3)第一miR之環(例如miR-3G環)，(4)第一shRNA之第二股，(5)第一miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(6)第一間隔體，(7)第二miR之5’骨架(例如miR-E 5’骨架)，(8)第二shRNA之第一股，(9)第二miR之環(例如miR-E環)，(10)第二shRNA之第二股，(11)第二miR之3’骨架(例如miR-E 3’骨架)，(12)第二間隔體，及(13) PPT序列。在一些實施例中，第一及第二miR係相同的。在一些實施例中，第一miR係miR-3G且第二miR係miR-E (「3G-E格式」)。在一些實施例中，第一及第二miR係不同的。
在一些實施例中，shRNA模組係三重shRNA模組。在一些實施例中，shRNA模組自5’至3’包含(1)第一miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(2)第一shRNA之第一股，(3)第一miR之環(例如miR-3G環)，(4)第一shRNA之第二股，(5)第一miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(6)第一間隔體，(7)第二miR之5’骨架(例如miR-E 5’骨架)，(8)第二shRNA之第一股，(9)第二miR之環(例如miR-E環)，(10)第二shRNA之第二股，(11)第二miR之3’骨架(例如miR-E 3’骨架)，(12)第二間隔體，(13)第三miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(14)第三shRNA之第一股，(15)第三miR之環(例如miR-3G環)，(16)第三shRNA之第二股，(17)第三miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，及(18) PPT序列。在一些實施例中，第一、第二及第三miR係相同的。在一些實施例中，第一、第二及第三miR皆係不同的。在一些實施例中，第一及第二miR係相同的且第三miR係不同的。在一些實施例中，第一及第三miR係相同的且第二miR係不同的。在一些實施例中，第二及第三miR係相同的且第一miR係不同的。在一些實施例中，第一及第三miR係miR-3G且第二miR係miR-E (「3G-E-3G格式」)。在一些實施例中，第一、第二及第三miR皆係miR-3G (「3G-3G-3G格式」)。
在一些實施例中，shRNA模組係四重shRNA模組。在一些實施例中，shRNA模組自5’至3’包含，(1)第一miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(2)第一shRNA之第一股，(3)第一miR之環(例如miR-3G環)，(4)第一shRNA之第二股，(5)第一miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(6)第一間隔體，(7)第二miR之5’骨架(例如miR-E 5’骨架)，(8)第二shRNA之第一股，(9)第二miR之環(例如miR-E環)，(10)第二shRNA之第二股，(11)第二miR之3’骨架(例如miR-E 3’骨架)，(12)第二間隔體，(13)第三miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(14)第三shRNA之第一股，(15)第三miR之環(例如miR-3G環)，(16)第三shRNA之第二股，(17)第三miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(18)第三間隔體，(19)第四miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(20)第四shRNA之第一股，(21)第四miR之環(例如miR-3G環)，(22)第四shRNA之第二股，(23)第四miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(24) PPT序列。在一些實施例中，第一、第二、第三及第四miR係相同的。在一些實施例中，第一、第二、第三及第四miR皆係不同的。在一些實施例中，第一組之兩個miR係相同的且第二組之兩個miR係相同的，但不同於第一組。在一些實施例中，第一組之兩個miR係相同的，且剩餘兩個miR各自不同於第一組且彼此不同。在一些實施例中，三個miR係相同的且最後一個miR係不同的。在一些實施例中，第一、第三及第四miR係miR-3G且第二miR係miR-E (「3G-E-3G-3G格式」)。
在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 130中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 128中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 140中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 129中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 131中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 139中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 141中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 133中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 134中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 135中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 136中所述之序列。在一些實施例中，核酸包含SEQ ID NO: 137中所述之序列。
在一些實施例中，核酸序列之長度係至少16個、17個、18個、19個、20個、21個或22個核苷酸。
在一些實施例中，核酸係RNA干擾(RNAi)分子。例示性RNAi分子包括短髮夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)或反義寡核苷酸。在一些實施例中，核酸係短髮夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)或反義寡核苷酸。在一些實施例中，核酸係shRNA。
單股髮夾核糖核酸(shRNA)係其中有義股及反義股藉由髮夾環連接之短雙鏈體。其係由可在細胞中自質體構築物上之RNA聚合酶II或RNA聚合酶III啟動子轉錄之莖-環結構組成。一旦表現，shRNA便立即被處理成RNAi種類。已知自質體表現shRNA係相對穩定的，藉此提供優於例如使用合成siRNA之強大優點。可將shRNA表現單元納入多種質體、脂質體、病毒載體及其他媒劑中以遞送並整合至靶細胞中。自質體表現shRNA可穩定整合用於組成型表現。shRNA係在細胞核中合成，經進一步處理並運輸至細胞質，且然後納入RNA誘導之沈默複合物(RISC)中發揮活性。shRNA轉化成活性siRNA分子(其能夠結合、鉗合由靶基因編碼之mRNA轉錄本及/或防止其轉譯)。
Argonaute蛋白家族係RISC之主要組分。在Argonaute蛋白家族內，僅Ago2含有能夠自shRNA分子之莖部***解並釋放隨從股之核酸內切酶活性。Argonaute家族之其餘三個成員Ago1、Ago3及Ago4不具可鑑別出的核酸內切酶活性，其亦組裝成RISC且認為經由裂解非依賴性方式起作用。因此，RISC可表徵為具有裂解依賴性及裂解非依賴性路徑。
RNAi (例如反義RNA、siRNA、microRNA、shRNA等)闡述於國際公開案第WO2018232356A1號、國際公開案第WO2019084552A1號、國際公開案第WO2019226998A1號、國際公開案第WO2020014235A1號、國際公開案第WO2020123871A1號及國際公開案第WO2020186219A1號中，該等公開案中之每一者出於所有目的皆以引用方式併入本文中。
反義寡核苷酸結構及化學修飾闡述於國際PCT公開案第WO20/132521號中，該公開案以引用方式併入本文中。
dsRNA及shRNA分子以及使用及產生方法闡述於美國專利第8,829,264號；美國專利第9,556,431號；及美國專利第8,252,526號中，該等專利中之每一者皆以引用方式併入本文中。
siRNA分子以及使用及產生方法闡述於美國專利第7,361,752號及美國專利公開案第US20050048647號中，該二者皆以引用方式併入本文中。
用於RNA干擾(例如shRNA、siRNA、dsRNA及反義寡核苷酸)之其他方法及組合物通常為此項技術中已知，且進一步闡述於美國專利第7,361,752號；美國專利第8,829,264號；美國專利第9,556,431號；美國專利第8,252,526號、國際PCT公開案第WO00/44895號；國際PCT公開案第WO01/36646號；國際PCT公開案第WO99/32619號；國際PCT公開案第WO00/01846號；國際PCT公開案第WO01/29058號；及國際PCT公開案第WO00/44914號；國際PCT公開案第WO04/030634號中；該等專利中之每一者皆以引用方式併入本文中。
可用於編碼RNAi分子(例如本文所述之shRNA)之核酸序列(或構築物)可包含啟動子，其直接或間接地可操作地連接(或聯結)至編碼RNAi分子之序列。該等啟動子可基於宿主細胞及所尋求之效應來選擇。適宜啟動子之非限制性實例包括組成型及誘導型啟動子，例如基於RNA聚合酶II (pol II)之誘導型啟動子。適宜啟動子之非限制性實例進一步包括四環素誘導型或可抑制型啟動子、EF1a、基於RNA聚合酶I或III之啟動子、pol II依賴性病毒啟動子(例如CMV-IE啟動子)以及pol III U6及H1啟動子。亦可使用噬細菌體T7啟動子(在該情形下應瞭解，亦必須存在T7聚合酶)。核酸序列無需限於使用任何單一啟動子，尤其是因為核酸序列可包含兩個或更多個shRNA (即，效應物之組合)，包括(但不限於)所納入之shRNA分子。每一所納入之啟動子可控制shRNA分子組分中之一者或其任一組合。
在某些實施例中，啟動子可優先在靶向細胞中有活性，例如，可能期望使用免疫細胞特異性啟動子在免疫細胞中優先表現至少一種重組核酸。將該等構築物引入宿主細胞中可在以下條件下實現：重組核酸前體轉錄本內所含之兩種或更多種重組核酸最初駐留在單一初級轉錄本內，使得單獨RNA分子(例如，各自包含其自身莖-環結構之shRNA)隨後藉由內源核糖核酸酶自該前體轉錄本切除。所得成熟重組核酸(例如shRNA)隨後可誘導在細胞中產生之靶基因mRNA轉錄本之降解及/或轉譯抑制。替代地，每一前體莖-環結構可作為單獨轉錄本之一部分產生，在該情形下每一重組核酸序列將較佳地包括其自身啟動子及轉錄終止子序列。另外，多個重組核酸前體轉錄本可駐留在單一初級轉錄本內。
本文所述shRNA重組核酸之莖-環結構可長約40至100個核苷酸，或較佳地長約50至75個核苷酸。莖區之長度可為約15-45個核苷酸(或更長)或長度為約20-30個核苷酸。在一些實施例中，莖區之長度係22個核苷酸。在一些實施例中，莖區之長度係15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個或45個核苷酸。
莖可包含完全互補之雙鏈體(任何3′尾除外)，然而，莖之任一臂上可存在凸起或內環。該等凸起及不對稱內環之數量較佳地係極少的(例如1、2或3)且大小係約3個核苷酸或更小。末端環部分可包含約4個或更多個核苷酸，但較佳地不超過約25個核苷酸。環部分之大小將較佳地係6-15個核苷酸。
如本文所述，shRNA之莖區包含隨從股及指導股，其中指導股含有與由靶基因編碼之靶mRNA轉錄本互補之序列。較佳地，小心地設計指導股及隨從股之G-C含量及匹配，以在具和不具核酸內切酶裂解的情況下具有熱力學上有利的股解開活性。另外，較佳地經由BLAST搜索(www.ncbi.nim.nih.qov/ BLAST)來確認指導股之特異性。
本發明提供，可使用本文所述之方法及重組核酸來調節多個靶基因之表現水準。舉例而言，本發明提供，第一組重組核酸可經設計以包括序列(指導股)，該序列經設計以降低第一靶基因之表現水準，而第二組重組核酸可經設計以包括序列(指導股)，該序列經設計以降低第二靶基因之表現水準。不同組之重組核酸可表現且駐留在相同或單獨之初步轉錄本內。在某些實施例中，該多重方法(即，使用本文所述之重組核酸來調節兩個或更多個靶基因之表現水準)可對患者具有增強的治療效應。舉例而言，若向患者提供表現本文所述之重組核酸分子之細胞來治療、預防或改善癌症之效應，則可期望向患者提供兩種或更多種類型之重組核酸分子，其經設計以降低參與免疫細胞活化或抑制之多個基因之表現水準。
與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，一或多種本文所述之重組核酸分子可能能夠使細胞中之靶基因表現減少至少約50%以上。舉例而言，與不包含各別重組核酸分子之對照細胞相比，重組核酸分子(例如shRNA)可能能夠使細胞中選自由TGFBR1、TGFBR2、FAS、PTPN2及/或TOX組成之群之靶基因的表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或更大。與不包含各別重組核酸分子之對照細胞相比，一或多種重組核酸分子可能能夠使細胞中選自由TGFBR1、TGFBR2、FAS、PTPN2及/或TOX組成之群之靶基因的表現減少至少約10%-50%、10%-20%、10%-30%、10%-40%、20%-50%、30%-50%、40%-50%、10%-100%、50%-100%、50%-99%、50%-95%、50%-90%、50%-85%、50%-80%、50%-75%、50%-70%、50%-65%、50%-60%、50%-55%或更大。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，一或多種重組核酸分子使細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，一或多種重組核酸分子使細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，一或多種重組核酸分子使細胞中FAS之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，一或多種重組核酸分子使細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，一或多種重組核酸分子使細胞中TOX之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
重組核酸分子可經化學合成或活體外轉錄，且可進一步包括對磷酸-糖骨架或核苷殘基之一或多個修飾。
可使用將核酸引入細胞之此項技術中已知之其他方法，例如脂質介導之載劑運輸、化學品介導之運輸(例如磷酸鈣)及諸如此類。因此，重組核酸分子構築物可與發揮以下活性中之一或多者之組分一起引入：增強細胞對RNA之攝取、促進shRNA雙鏈體股之退火、穩定退火的shRNA股或以其他方式增加靶基因之抑制。
在一些實施例中，一或多種重組核酸進一步包含與宿主細胞染色體中之***位點互補之5’同源定向修復臂及/或3’同源定向修復臂。在一些實施例中，一或多種重組核酸包含5’同源定向修復臂及3’同源定向修復臂。在一些實施例中，將一或多種重組核酸納入表現盒或表現載體中。在一些實施例中，表現盒或表現載體進一步包含一或多種重組核酸上游之組成型啟動子。
在一些實施例中，一或多種重組核酸包含至少第一核酸及至少第二核酸。在一些實施例中，一或多種重組核酸進一步包含至少第三核酸及至少第四核酸。第一、第二、第三及/或第四核酸可為RNAi分子，例如shRNA。在一些實施例中，將第一核酸及第二核酸納入單一表現盒或單一表現載體中。在一些實施例中，將第三核酸及第四核酸納入單一表現盒或單一表現載體中。在一些實施例中，將第一、第二、第三及第四核酸納入單一表現盒或單一表現載體中。在一些實施例中，表現盒或表現載體進一步包含第一核酸上游及/或第二核酸上游之組成型啟動子。在一些實施例中，表現盒或表現載體進一步包含第三核酸上游及/或第四核酸上游之組成型啟動子。在一些實施例中，表現盒或表現載體進一步包含第一核酸上游、第二核酸上游、第三核酸上游及/或第四核酸上游之組成型啟動子。在一些實施例中，表現載體係非病毒載體。
在一些實施例中，表現盒係雙重shRNA表現盒。在一些實施例中，雙重表現盒自5’至3’包含(1)啟動子(例如EF1a啟動子，例如SEQ ID NO: 132)，(2)第一miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(3)第一shRNA之第一股，(4)第一miR之環(例如miR-3G環)，(5)第一shRNA之第二股，(6)第一miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(7)第一間隔體，(8)第二miR之5’骨架(例如miR-E 5’骨架)，(9)第二shRNA之第一股，(10)第二miR之環(例如miR-E環)，(11)第二shRNA之第二股，(12)第二miR之3’骨架(例如miR-E 3’骨架)，(13)第二間隔體，(14) PPT序列，(15) 5’非轉譯區(UTR)，(16)視情況存在之轉基因(例如編碼嵌合抗原受體)，及(17)多腺苷酸化(聚A)序列(例如人類生長激素(GH1)聚A序列，例如SEQ ID NO: 138)。在一些實施例中，第一及第二miR係相同的。在一些實施例中，第一miR係miR-3G且第二miR係miR-E (「3G-E格式」)。在一些實施例中，第一及第二miR係不同的。在一些實施例中，雙重表現盒包含SEQ ID NO: 133中所述之核酸序列，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%序列一致性之核酸。例示性雙重shRNA表現盒顯示於 圖 26中。
在一些實施例中，表現盒係三重shRNA表現盒。在一些實施例中，三重表現盒自5’至3’包含(1)啟動子(例如EF1a啟動子，例如SEQ ID NO: 132)，(2)第一miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(3)第一shRNA之第一股，(4)第一miR之環(例如miR-3G環)，(5)第一shRNA之第二股，(6)第一miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(7)第一間隔體，(8)第二miR之5’骨架(例如miR-E 5’骨架)，(9)第二shRNA之第一股，(10)第二miR之環(例如miR-E環)，(11)第二shRNA之第二股，(12)第二miR之3’骨架(例如miR-E 3’骨架)，(13)第二間隔體，(14)第三miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(15)第三shRNA之第一股，(16)第三miR之環(例如miR-3G環)，(17)第三shRNA之第二股，(18)第三miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(19) PPT序列，(20) 5’非轉譯區(UTR)，(21)視情況存在之轉基因(例如編碼嵌合抗原受體)，及(22)多腺苷酸化(聚A)序列(例如人類生長激素(GH1)聚A序列，例如SEQ ID NO: 138)。在一些實施例中，第一、第二及第三miR係相同的。在一些實施例中，第一、第二及第三miR皆係不同的。在一些實施例中，第一及第二miR係相同的且第三miR係不同的。在一些實施例中，第一及第三miR係相同的且第二miR係不同的。在一些實施例中，第二及第三miR係相同的且第一miR係不同的。在一些實施例中，第一及第三miR係miR-3G且第二miR係miR-E (「3G-E-3G格式」)。在一些實施例中，第一、第二及第三miR皆係miR-3G (「3G-3G-3G格式」)。在一些實施例中，三重表現盒包含SEQ ID NO: 134-136中之任一者中所述之核酸序列，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%序列一致性之核酸。在一些實施例中，三重表現盒包含SEQ ID NO: 134中所述之核酸序列，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%序列一致性之核酸。在一些實施例中，三重表現盒包含SEQ ID NO: 135中所述之核酸序列，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%序列一致性之核酸。在一些實施例中，三重表現盒包含SEQ ID NO: 136中所述之核酸序列，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%序列一致性之核酸。例示性三重shRNA表現盒顯示於 圖 27-29中。
在一些實施例中，表現盒係四重shRNA表現盒。在一些實施例中，四重表現盒自5’至3’包含(1)啟動子(例如EF1a啟動子，例如SEQ ID NO: 132)，(2)第一miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(3)第一shRNA之第一股，(4)第一miR之環(例如miR-3G環)，(5)第一shRNA之第二股，(6)第一miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(7)第一間隔體，(8)第二miR之5’骨架(例如miR-E 5’骨架)，(9)第二shRNA之第一股，(10)第二miR之環(例如miR-E環)，(11)第二shRNA之第二股，(12)第二miR之3’骨架(例如miR-E 3’骨架)，(13)第二間隔體，(14)第三miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(15)第三shRNA之第一股，(16)第三miR之環(例如miR-3G環)，(17)第三shRNA之第二股，(18)第三miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(19)第三間隔體，(20)第四miR之5’骨架(例如miR-3G 5’骨架)，(21)第四shRNA之第一股，(22)第四miR之環(例如miR-3G環)，(23)第四shRNA之第二股，(24)第四miR之3’骨架(例如miR-3G 3’骨架)，(25) PPT序列，(26) 5’非轉譯區(UTR)，(27)視情況存在之轉基因(例如嵌合抗原受體)，及(28)多腺苷酸化(聚A)序列(例如人類生長激素(GH1)聚A序列，例如SEQ ID NO: 138)。在一些實施例中，第一、第二、第三及第四miR係相同的。在一些實施例中，第一、第二、第三及第四miR皆係不同的。在一些實施例中，第一組之兩個miR係相同的且第二組之兩個miR係相同的，但不同於第一組。在一些實施例中，第一組之兩個miR係相同的，且剩餘兩個miR各自不同於第一組且彼此不同。在一些實施例中，三個miR係相同的且最後一個miR係不同的。在一些實施例中，第一、第三及第四miR係miR-3G且第二miR係miR-E (「3G-E-3G-3G格式」)。在一些實施例中，四重表現盒包含SEQ ID NO: 137中所述之核酸序列，或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.9%序列一致性之核酸。例示性四重shRNA表現盒顯示於 圖 30中。 重組細胞
本文亦提供重組細胞，例如原代細胞或免疫細胞，其包含以非病毒方式***細胞基因體之靶區域中之至少一種重組核酸。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含長度為至少15個核苷酸之一或多種重組核酸，該一或多種重組核酸與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含長度為至少15個核苷酸之一或多種重組核酸，該一或多種重組核酸與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含含有以下之一或多種重組核酸：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，其與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；及長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，其中第二核酸序列與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；或與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含含有以下之一或多種重組核酸：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，其與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；及長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，其與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
在一個態樣中，本文提供免疫細胞，其包含含有以下之一或多種重組核酸：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列及第二核酸序列，其與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
在一些實施例中，細胞係原代免疫細胞。在一些實施例中，細胞係活的無病毒原代細胞。
在一些實施例中，重組核酸分子所靶向之基因(例如TGFBR1、TGFBR2、FAS、PTPN2及/或TOX)之表現在靶細胞中減少或降低。靶基因表現可減少至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更大。與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，靶基因表現可減少約10%-50%、10%-20%、10%-30%、10%-40%、20%-50%、30%-50%、40%-50%、10%-100%、50%-100%、50%-99%、50%-95%、50%-90%、50%-85%、50%-80%、50%-75%、50%-70%、50%-65%、50%-60%、50%-55%或更大。
如本揭示案中所述包含***靶基因座或安全港位點之重組核酸分子之細胞可稱為經改造細胞。在一些實施例中，經改造細胞係免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞係可產生富潛能免疫細胞之任何細胞。在一些實施例中，免疫細胞可為誘導性富潛能幹細胞(iPSC)或人類富潛能幹細胞(HSPC)。在一些實施例中，免疫細胞包含原代造血細胞或原代造血幹細胞。在一些實施例中，該經改造細胞係幹細胞、人類細胞、原代細胞、造血細胞、適應性免疫細胞、先天性免疫細胞、自然殺手(NK)細胞、T細胞、CD8+細胞、CD4+細胞或T細胞祖細胞。在一些實施例中，免疫細胞係T細胞。在一些實施例中，T細胞係調節T細胞、效應T細胞或幼稚T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD8 +T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD4 +T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD4 +CD8 +T細胞。
在一些實施例中，經改造細胞係幹細胞、人類細胞、原代細胞、造血細胞、適應性免疫細胞、先天性免疫細胞、T細胞或T細胞祖細胞。本揭示案中預期之免疫細胞之非限制性實例包括T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、NKT/iNKT細胞、巨噬細胞、骨髓細胞及樹突細胞。本揭示案中預期之幹細胞之非限制性實例包括富潛能幹細胞(PSC)、胚胎幹細胞(ESC)、誘導性富潛能幹細胞(iPSC)、藉由細胞核轉移獲得之胚胎源性胚胎幹細胞(ntES；細胞核轉移ES)、雄性生殖系幹細胞(GS細胞)、胚胎生殖細胞(EG細胞)、造血幹細胞/祖細胞幹細胞(HSPC)、體細胞幹細胞(成人幹細胞)、血管母細胞、神經幹細胞、間質幹細胞及其他細胞(包括骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、心肌細胞、神經元、肌腱細胞、脂肪細胞、胰臟細胞、肝細胞、腎細胞及濾泡細胞等)之幹細胞。在一些實施例中，經改造細胞係T細胞、NK細胞、iPSC及HSPC。在一些實施例中，本揭示案中所用之經改造細胞係活體外生長之人類細胞株(例如有意永生化之細胞株、癌細胞株等)。
在一些實施例中，免疫細胞係自體免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞係同種異體免疫細胞。
本文亦提供細胞群體，其包含複數個經改造細胞。在一些實施例中，至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多之細胞之基因體包含至少一種重組核酸分子。在一些實施例中，至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多之細胞之基因體包含至少兩種shRNA分子。在一些實施例中，至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多之細胞之基因體包含至少三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種重組核酸分子。
本文亦提供細胞群體，其包含重組核酸。
細胞可進一步包含嵌合蛋白，例如嵌合抗原受體(CAR)或引發受體。在一些實施例中，細胞包含至少一種嵌合抗原受體。在一些實施例中，細胞包含至少一種引發受體。在一些實施例中，細胞包含至少一種嵌合抗原受體及至少一種引發受體。編碼至少一種RNAi分子之至少一種重組核酸分子可在與至少一種RNAi分子相同之DNA模板或核酸片段上編碼，或在與RNAi分子不同之DNA模板或核酸片段上編碼。在CAR、引發受體及RNAi重組核酸分子係在相同DNA模板或核酸片段上編碼之情形下，各個組分可以任一順序置於DNA模板上。舉例而言，DNA模板在5’至3’方向上可包含：CAR、至少一種RNAi重組核酸及引發受體。替代地，DNA模板在5’至3’方向上可包含：i)引發受體、至少一種RNAi重組核酸及CAR；ii)至少一種RNAi重組核酸、引發受體及CAR；iii)至少一種RNAi重組核酸、CAR及引發受體；iv)引發受體、CAR及至少一種RNAi重組核酸；v) CAR、引發受體及至少一種RNAi重組核酸；vi)至少一種RNAi重組核酸、引發受體、CAR；vii)至少一種RNAi重組核酸、CAR及引發受體。在一些實施例中，至少一種RNAi重組核酸包含兩種重組核酸。在一些實施例中，重組核酸包含與TGFBR1互補之核酸。在一些實施例中，重組核酸包含與TGFBR2互補之核酸。在一些實施例中，重組核酸包含與FAS互補之核酸。在一些實施例中，重組核酸包含與PTPN2互補之核酸。在一些實施例中，重組核酸包含與TOX互補之核酸。
在一些實施例中，引發受體包含特異性結合至第一抗原之第一細胞外抗原結合結構域，且嵌合抗原受體(CAR)包含特異性結合至第二抗原之第二細胞外抗原結合結構域。 減少基因表現之方法
本發明之另一態樣提供減弱哺乳動物細胞中之靶基因表現之方法，其包括將與靶基因mRNA互補之重組核酸(例如單股髮夾核糖核酸(shRNA)、siRNA、dsRNA或反義寡核苷酸)引入哺乳動物細胞中。在一些實施例中，與靶基因mRNA互補之重組核酸係shRNA。在一些實施例中，shRNA包含形成雙鏈體區域之19至100個核苷酸之自互補序列，該等自互補序列在細胞內條件下與靶基因mRNA轉錄本雜交。在一些實施例中，shRNA包含22 nt之自互補序列。在一些實施例中，shRNA：(i)係RNaseIII酶裂解之受質，產生雙股RNA產物，(ii)不會產生哺乳動物細胞之一般序列非依賴性殺傷，及(iii)以依賴於該等互補區序列之方式減少該靶基因之表現。
在一些實施例中，靶基因係TGFBR1。在一些實施例中，靶基因係TGFBR2。在一些實施例中，靶基因係人類TGFBR1。在一些實施例中，靶基因係人類TGFBR2。在一些實施例中，靶基因係FAS。在一些實施例中，靶基因係人類FAS。在一些實施例中，靶基因係PTPN2。在一些實施例中，靶基因係人類PTPN2。在一些實施例中，靶基因係TOX。在一些實施例中，靶基因係人類TOX。
包含重組核酸之細胞可具有減少或降低的選自TGFBR1及/或TGFBR2之靶基因表現。在一些實施例中，與不包含各別重組核酸分子之對照細胞相比，細胞具有減少約50%-100%、50%-99%、50%-95%、50%-90%、50%-85%、50%-80%、50%-75%、50%-70%、50%-65%、50%-60%、50%-55%的TGFBR1及/或TGFBR2表現。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，細胞具有減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的細胞中之TGFBR1表現。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，細胞具有減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的細胞中之TGFBR2表現。在一些實施例中，各自與不包含各別重組核酸分子之對照細胞相比，細胞具有減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的免疫細胞中之TGFBR1及TGFBR2表現。
在一些實施例中，與不包含第一核酸之對照細胞相比，細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，與不包含第二核酸之對照細胞相比，第二核酸使細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，與不包含第一或第二核酸之對照細胞相比，細胞中TGFBR2及TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
包含重組核酸之細胞亦可具有減少或降低的選自由FAS、PTPN2及TOX組成之群之靶基因之表現。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，細胞具有減少約50%-100%、50%-99%、50%-95%、50%-90%、50%-85%、50%-80%、50%-75%、50%-70%、50%-65%、50%-60%、50%-55%的FAS、PTPN2及/或TOX表現。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，細胞具有減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的細胞中之FAS表現。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，細胞具有減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的細胞中之PTPN2表現。在一些實施例中，與不包含重組核酸分子之對照細胞相比，細胞具有減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的免疫細胞中之TOX表現。
在一些實施例中，與不包含第一核酸之對照細胞相比，免疫細胞中FAS之表現減少至少50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，與不包含第二核酸之對照細胞相比，第二核酸使免疫細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，與不包含第二核酸之對照細胞相比，細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，與不包含第二核酸之對照細胞相比，第二核酸使免疫細胞中TOX之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一些實施例中，與不包含第二核酸之對照細胞相比，細胞中TOX之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
在一些實施例中，TGFBR1、TGFBR2、FAS、PTPN2及/或TOX之表現係藉由核酸分析或蛋白質分析確定。在一些實施例中，核酸分析包含以下中之至少一者：聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR (qPCR)、RT-qPCR、微陣列、基因陣列或RNAseq。 治療癌症之方法
在另一態樣中，本發明提供治療個體之免疫相關疾患或疾病(例如癌症)之方法，其包括向個體投與有效量之組合物。該組合物包含含有至少一種重組核酸之細胞，該至少一種重組核酸包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與選自由TGFBR1及/或TGFBR2組成之群之靶互補。
在一些實施例中，重組核酸係shRNA分子。在一些實施例中，shRNA係TGFBR1 shRNA分子或TGFBR2 shRNA。在一些實施例中，細胞包含至少TGFBR2 shRNA分子。在一些實施例中，細胞包含至少TGFBR2 shRNA分子。在一些實施例中，細胞包含至少兩個TGFBR2 shRNA分子。在一些實施例中，細胞包含至少TGFBR2 shRNA分子及TGFBR2 shRNA分子。
在另一態樣中，本發明提供增強個體免疫反應之方法，其包括向個體投與有效量之組合物，該組合物包含含有至少一種shRNA分子之細胞，其中shRNA分子選自由TGFBR2 shRNA分子或TGFBR1 shRNA分子組成之群。
在一些實施例中，治療個體之方法或增強個體免疫反應之方法包括向個體進一步投與有效量之組合物，該組合物包含含有至少一種重組核酸之細胞，該至少一種重組核酸包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與選自由TGFBR1及/或TGFRB2組成之群之靶互補。
在一些實施例中，重組核酸係shRNA分子。
在一些實施例中，shRNA選自由FAS shRNA分子、PTPN2 shRNA分子及TOX shRNA分子組成之群。在一些實施例中，細胞包含至少FAS shRNA分子。在一些實施例中，細胞包含至少PTPN2 shRNA分子。在一些實施例中，細胞包含至少TOX shRNA分子。在一些實施例中，細胞包含至少FAS shRNA分子及PTPN2 shRNA分子。在一些實施例中，細胞包含至少FAS shRNA分子及TOX shRNA分子。在一些實施例中，細胞包含至少PTPN2 shRNA分子及TOX shRNA分子。在另一態樣中，本發明提供增強個體免疫反應之方法，其包括向個體投與有效量之組合物，該組合物包含含有至少一種shRNA分子之細胞，其中shRNA分子選自由FAS shRNA分子、PTPN2 shRNA分子及TOX shRNA分子組成之群。在一些實施例中，細胞包含至少TGFBR2 shRNA分子、TGFBR2 shRNA分子、FAS shRNA分子、PTPN2 shRNA分子及/或TOX shRNA分子。
在一些實施例中，本文所提供之方法可用於治療個體之免疫相關疾患。在一個實施例中，個體係人類。
在一些實施例中，本文所提供之方法(例如增強免疫反應之方法)可用於治療癌症，且因此接受本文所述系統之個體患有癌症。在一些實施例中，癌症係實體癌症。在一些實施例中，癌症係液體癌症。在一些實施例中，癌症係免疫迴避的。在一些實施例中，癌症係卵巢癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、子宮癌、間皮瘤、子宮頸癌、胰臟癌、腎癌、肺癌、***癌、膀胱癌、乳癌、腦癌、白血病或淋巴瘤。在一些實施例中，癌症係卵巢癌、腎癌、肺癌、乳癌或***癌。
在一些實施例中，治療可減小癌症體積或大小。在一些實施例中，與投與重組核酸或重組細胞前之癌症體積相比，治療有效地減小癌症體積。在一些實施例中，治療可減小癌症生長速率。在一些實施例中，與投與重組核酸或重組細胞前之癌症生長速率相比，治療有效地減小癌症生長速率。在一些實施例中，治療有效地消除癌症。 免疫調節之方法
投與包含重組核酸之細胞之方法可調節免疫反應，該重組核酸包含與TGFBR1及/或TGFBR2互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。調節可為增加或減少免疫反應。在一些實施例中，調節係增加免疫反應。
投與包含重組核酸之細胞之方法可調節免疫反應，該重組核酸包含與FAS、PTPN2及/或TOX互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。調節可為增加或減少免疫反應。在一些實施例中，調節係增加免疫反應。
在一個態樣中，投與包含系統之細胞可誘導促發炎分子，例如細胞介素或趨化介素，該系統包含重組核酸，該重組核酸包含與如本文所述之FAS、PTPN2及/或TOX互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。在一些實施例中，細胞介素係IFNg。通常，誘導性促發炎分子係以大於使用同型對照達成之水準之水準存在。該等促發炎分子進而可活化抗腫瘤免疫性，包括(但不限於) T細胞活化、T細胞增殖、T細胞分化、M1樣巨噬細胞活化及NK細胞活化。因此，投與包含重組核酸之系統可誘導導致腫瘤破壞之多種抗腫瘤免疫機制，該重組核酸包含與FAS、PTPN2及/或TOX互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。
在另一態樣中，本文提供增加個體免疫反應之方法，其包括向個體投與有效量之包含重組核酸之細胞，該重組核酸包含與TGFBR1及/或TGFBR2互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。在一些實施例中，增加個體免疫反應之方法包括向個體投與包含重組核酸之細胞，該重組核酸包含與TGFBR1及/或TGFBR2互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。
在另一態樣中，本文提供增加個體免疫反應之方法，其包括向個體投與有效量之包含重組核酸之細胞，該重組核酸包含與FAS、PTPN2及/或TOX互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。在一些實施例中，增加個體免疫反應之方法包括向個體投與包含重組核酸之細胞，該重組核酸包含與FAS、PTPN2及/或TOX互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。
在一些實施例中，細胞存在於進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組合物中。
在如本文所述增加免疫反應之任何及所有態樣中，特徵或功能態樣之任何增加或減少或變化係與不包含重組核酸之細胞進行比較，該重組核酸包含與TGFBR1及/或TGFBR2互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。
增加免疫反應可為增強免疫反應或誘導免疫反應二者。例如，增加免疫反應涵蓋免疫反應之開始或起始，或增強或擴大正在進行或現有的免疫反應。在一些實施例中，治療誘導免疫反應。在一些實施例中，誘導性免疫反應係適應性免疫反應。在一些實施例中，誘導性免疫反應係先天性免疫反應。在一些實施例中，治療增強免疫反應。在一些實施例中，增強的免疫反應係適應性免疫反應。在一些實施例中，增強的免疫反應係先天性免疫反應。在一些實施例中，治療增加免疫反應。在一些實施例中，增加的免疫反應係適應性免疫反應。在一些實施例中，增加的免疫反應係先天性免疫反應。在一些實施例中，免疫反應係藉由投與包含重組核酸之細胞來開始或起始，該重組核酸包含與TGFBR1及/或TGFBR2互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。在一些實施例中，免疫反應係藉由投與包含重組核酸之細胞來增強，該重組核酸包含與TGFBR1及/或TGFBR2互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。
在另一態樣中，本申請案提供用重組核酸對細胞進行遺傳編輯之方法，該重組核酸包含與TGFBR1及/或TGFBR2互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該等方法可調節細胞之免疫功能。調節可為增加免疫反應。在一些實施例中，調節係增加免疫功能。在一些實施例中，功能之調節導致包含重組核酸之細胞活化，該重組核酸包含與TGFBR1及/或TGFBR2互補之長度為至少15個核苷酸之核酸序列。
在一些實施例中，細胞係自然殺手(NK)細胞、T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、原代T細胞或T細胞祖細胞。
在一些實施例中，包含如本文所述之重組核酸之細胞之功能的調節導致細胞刺激天然及活化T細胞之能力增加，例如藉由增加表現重組核酸之細胞之細胞介素或趨化介素分泌。在一些實施例中，功能之調節增強或增加細胞產生細胞介素、趨化介素、CAR或共刺激或活化受體之能力。在一些實施例中，調節增加表現重組核酸之細胞之T細胞刺激功能，包括例如細胞觸發T細胞受體(TCR)傳訊、T細胞增殖或T細胞細胞介素產生之能力。
在一些實施例中，增加的免疫反應係分泌細胞介素及趨化介素。在一些實施例中，與同型對照細胞相比，重組核酸誘導細胞中增加的至少一種細胞介素或趨化介素之表現。
在一些實施例中，增強的免疫反應係抗腫瘤免疫細胞募集及活化。
在一些實施例中，與同型對照細胞相比，表現重組核酸之細胞誘導記憶免疫反應。一般而言，記憶免疫反應係在後續暴露於病原體或抗原時免疫系統先前遇到之保護性免疫反應。例示性記憶免疫反應包括感染或接種抗原後之免疫反應。一般而言，記憶免疫反應由淋巴球(例如T細胞或B細胞)來調介。在一些實施例中，記憶免疫反應係對癌症(包括癌細胞生長、增殖或轉移)之保護性免疫反應。在一些實施例中，記憶免疫反應抑制、防止或減少癌細胞生長、增殖或轉移。 編輯細胞之方法
如本文所用之術語「基因編輯」或「基因體編輯」係指一種類型之遺傳操縱，其中使用人工操縱之核酸酶或「分子剪刀」自基因體***、替代或去除DNA。其係可用於闡明序列特異性基因或蛋白質之功能及效應或改變細胞行為(例如用於治療目的)之工具。
目前可用之基因體編輯工具包括鋅指核酸酶(ZFN)及轉錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)以將基因納入安全港基因座(例如腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)安全港基因座)。利用phiC31整合酶及Bxb1整合酶之DICE (雙重整合酶盒交換)系統係用於靶整合之工具。另外，成簇的規則間隔之短迴文重複/Cas9 (CRISPR/Cas9)技術可用於靶向基因***。
位點特異性基因編輯方法可包括同源依賴機制或同源非依賴機制。
在本文所述之方法中預期此項技術中已知之靶向***基因序列之所有方法以將構築物***基因靶或安全港基因座。
本文提供在病毒載體不存在下***一或多種重組RNAi核酸之方法。在一些實施例中，在病毒載體不存在下，一或多種重組核酸可***原代免疫細胞之基因體中。
本文闡述用於達成將編碼一或多種重組核酸之核苷酸序列整合至細胞基因體中之方法及組合物。在一些方法中，整合效率增加，脫靶效應減少，及/或細胞活力之損失減少。
使用核酸酶(例如CRISPR相關之系統(Cas))將編碼一或多種重組核酸之質體引入免疫細胞中。核酸酶可以核糖核蛋白格式與靶向免疫細胞基因體上之特異性位點之指導RNA (gRNA)一起引入。核酸酶在此特異性位點切割基因體DNA。特異性位點可為編碼內源免疫細胞受體之基因體之一部分。因此，在此位點切割基因體將導致免疫細胞不再表現內源免疫細胞受體。
質體可包括與免疫細胞基因體上特異性位點之序列互補之5’及3’同源定向修復臂。互補序列處於由核酸酶切割之位點之任一側，此允許質體納入免疫細胞基因體上之指定***位點。一旦納入質體，細胞便將表現shRNA。
最初，將免疫細胞(例如T細胞)活化。免疫細胞可自患者獲得。因此，本揭示案提供自患者收穫免疫細胞(例如T細胞)之方法。然後，將編碼一或多種重組核酸之質體引入T細胞中。有利地，本揭示案之質體可使用電穿孔引入。在經由電穿孔引入質體時，亦可引入核酸酶。藉由使用電穿孔，本揭示案之方法避免使用病毒載體來引入轉基因，此係免疫細胞改造中已知之瓶頸。然後將免疫細胞擴增並共培養以產生足夠量之經改造免疫細胞以用作治療性治療。
編輯細胞基因體之方法可包括a)提供Cas9核糖核蛋白複合物(RNP)-DNA模板複合物，其包含：(i) RNP，其中RNP包含Cas9核酸酶結構域及指導RNA，其中指導RNA與細胞基因體之靶區域特異性雜交，且其中Cas9核酸酶結構域使靶區域裂解以在細胞基因體中產生***位點；及(ii)雙股或單股DNA模板，其中DNA模板之5’端及3’端包含與側接***位點之基因體序列同源之核苷酸序列，且其中複合物中RNP對DNA模板之莫耳比係約3:1至約100:1；及b)將RNP-DNA模板複合物引入細胞中。
在一些實施例中，本文所述之方法提供至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%、99%或更高之RNP-DNA模板複合物之遞送效率。在一些情形下，效率係針對將RNP-DNA模板引入細胞中後之活細胞來確定。在一些情形下，效率係針對將RNP-DNA模板引入細胞中之細胞總數(活細胞或非活細胞)來確定。
作為另一實例，遞送效率可藉由量化細胞群體中基因體編輯之細胞數(與在引入步驟後獲得之總細胞或總活細胞相比)來確定。可利用各種量化基因體編輯之方法。該等方法包括(但不限於)使用錯配特異性核酸酶，例如T7核酸內切酶I；一或多個靶基因座之測序(例如，藉由經選殖靶基因座擴增片段之桑格測序(sanger sequencing))；及高通量深度測序。
在一些實施例中，細胞活力損失與將裸DNA引入細胞中或使用病毒載體將DNA引入細胞中後之細胞活力損失相比有所減少。減少可為減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或該等百分比之間的任一百分比。在一些實施例中，整合之脫靶效應與將裸DNA引入細胞中或使用病毒載體將DNA引入細胞中後之脫靶整合相比有所減少。減少可為減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或該等百分比之間的任一百分比。
在一些情形下，本文所述之方法提供已引入RNP-DNA模板之細胞之高細胞活力。在一些情形下，已引入RNP-DNA模板之細胞之活力係至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%、99%或更高。在一些情形下，已引入RNP-DNA模板之細胞之活力係約20%至約99%、約30%至約90%、約35%至約85%或90%或更高、約40%至約85%或90%或更高、約50%至約85%或90%或更高、約50%至約85%或90%或更高、約60%至約85%或90%或更高、或約70%至約85%或90%或更高。
在本文所提供之方法中，RNP對DNA模板之莫耳比可為約3:1至約100:1。舉例而言，莫耳比可為約5:1至10:1、約5:1至約15:1、5:1至約20:1；5:1至約25:1；約8:1至約12:1；約8:1至約15:1、約8:1至約20:1、或約8:1至約25:1。
在一些實施例中，DNA模板之濃度係約2.5 pM至約25 pM。舉例而言，DNA模板之濃度可為約2.5 pM、3 pM、3.5 pM、4 pM、4.5 pM、5 pM、5.5 pM、6 pM、6.5 pM、7 pM、7.5 pM、8 pM、8.5 pM、9 pM、9.5 pM、10 pM、10.5 pM、11 pM、11.5 pM、12 pM、12.5 pM、13 pM、13.5 pM、14 pM、14.5 pM、15 pM、15.5 pM、16 pM、16.5 pM、17 pM、17.5 pM、18 pM、18.5 pM、19 pM、19.5 pM、20 pM、20.5 pM、21 pM、21.5 pM、22 pM、22.5 pM、23 pM、23.5 pM、24 pM、24.5 pM、25 pM或該等濃度之間的任一濃度。
在一些實施例中，DNA模板之量係約1 µg至約10 µg。舉例而言，DNA模板之量可為約1 µg至約2 µg、約1 µg至約3 µg、約1 µg至約4 µg、約1 µg至約5 µg、約1 µg至約6 µg、約1 µg至約7 µg、約1 µg至約8 µg、約1 µg至約9 µg、約1 µg至約10 µg。在一些實施例中，DNA模板之量係約2 µg至約3 µg、約2 µg至約4 µg、約2 µg至約5 µg、約2 µg至約6 µg、約2 µg至約7 µg、約2 µg至約8 µg、約2 µg至約9 µg、或2 µg至約10 µg。在一些實施例中，DNA模板之量係約3 µg至約4 µg、約3 µg至約5 µg、約3 µg至約6 µg、約3 µg至約7 µg、約3 µg至約8 µg、約3 µg至約9 µg、或約3 µg至約10 µg。在一些實施例中，DNA模板之量係約4 µg至約5 µg、約4 µg至約6 µg、約4 µg至約7 µg、約4 µg至約8 µg、約4 µg至約9 µg、或約4 µg至約10 µg。在一些實施例中，DNA模板之量係約5 µg至約6 µg、約5 µg至約7 µg、約5 µg至約8 µg、約5 µg至約9 µg、或約5 µg至約10 µg。在一些實施例中，DNA模板之量係約6 µg至約7 µg、約6 µg至約8 µg、約6 µg至約9 µg、或約6 µg至約10 µg。在一些實施例中，DNA模板之量係約7 µg至約8 µg、約7 µg至約9 µg、或約7 µg至約10 µg。在一些實施例中，DNA模板之量係約8 µg至約9 µg、或約8 µg至約10 µg。在一些實施例中，DNA模板之量係約9 µg至約10 µg。
在一些實施例中，DNA模板編碼shRNA分子或其片段。在一些實施例中，DNA模板編碼至少一種shRNA分子。在一些實施例中，DNA模板編碼至少兩種shRNA分子。在一些實施例中，DNA模板編碼一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種shRNA分子。
在一些實施例中，DNA模板包括調節序列，例如啟動子序列及/或增強子序列，以調節異源蛋白或其片段在***細胞基因體中後之表現。
在一些情形下，DNA模板係線性DNA模板。在一些情形下，DNA模板係單股DNA模板。在一些情形下，單股DNA模板係純單股DNA模板。如本文所用之「純單股DNA」意指實質上缺少DNA之另一股或相對股之單股DNA。「實質上缺少」意指，純單股DNA之一股比DNA之另一股缺少至少100倍。
在一些情形下，RNP-DNA模板複合物係藉由將RNP與DNA模板在約20℃至約25℃之溫度下一起培育不到約1分鐘至約30分鐘來形成。舉例而言，在約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃之溫度下，RNP可與DNA模板一起培育約5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、11分鐘、12分鐘、13分鐘、14分鐘、15分鐘、16分鐘、17分鐘、18分鐘、19分鐘、20分鐘、21分鐘、22分鐘、23分鐘、24分鐘、25分鐘、26分鐘、27分鐘、28分鐘、29分鐘或30分鐘或該等時間之間的任一時間量。在另一實例中，在約20℃至約25℃之溫度下，RNP可與DNA模板一起培育不到約1分鐘至約1分鐘、不到約1分鐘至約5分鐘、不到約1分鐘至約10分鐘、約5分鐘至10分鐘、約5分鐘至15分鐘、約10分鐘至約15分鐘、約10分鐘至約20分鐘、或約10分鐘至約30分鐘。在一些實施例中，在將RNP-DNA模板複合物引入細胞中之前，將RNP-DNA模板複合物及細胞混合。
在一些實施例中，引入RNP-DNA模板複合物包括電穿孔。用於對細胞電穿孔以引入RNP-DNA模板複合物之方法、組合物及裝置可包括本文實例中所述之彼等方法、組合物及裝置。用於對細胞電穿孔以引入RNP-DNA模板複合物之其他或替代方法、組合物及裝置可包括WO/2006/001614或Kim, J.A.等人，Biosens. Bioelectron. 23, 1353-1360 (2008)中所述之彼等方法、組合物及裝置。用於對細胞電穿孔以引入RNP-DNA模板複合物之其他或替代方法、組合物及裝置可包括美國專利申請公開案第2006/0094095號；美國專利申請公開案第2005/0064596號；或美國專利申請公開案第2006/0087522號中所述之彼等方法、組合物及裝置。用於對細胞電穿孔以引入RNP-DNA模板複合物之其他或替代方法、組合物及裝置可包括Li, L.H.等人，Cancer Res. Treat. 1, 341-350 (2002)；美國專利第6,773,669號；美國專利第7,186,559號；美國專利第7,771,984號；美國專利第7,991,559號；美國專利第6485961號；美國專利第7029916號；及美國專利申請公開案第2014/0017213號；及美國專利申請公開案第2012/0088842號中所述之彼等方法、組合物及裝置，該等文獻皆以引用方式併入本文中。用於對細胞電穿孔以引入RNP-DNA模板複合物之其他或替代方法、組合物及裝置可包括Geng, T.等人，J. Control Release 144, 91-100 (2010)；及Wang, J.等人，Lab. Chip 10, 2057-2061 (2010)中所述之彼等方法、組合物及裝置，該等文獻皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，Cas9蛋白可呈活性核酸內切酶形式，使得當結合至靶核酸作為與指導RNA之複合物之一部分或與DNA模板之複合物之一部分時，將雙股斷裂引入靶核酸中。雙股斷裂可藉由NHEJ修復以引入隨機突變，或藉由HDR修復以引入特定突變。各種Cas9核酸酶可用於本文所述之方法中。舉例而言，可利用需要緊鄰指導RNA靶向區之3’之NGG原間隔體相鄰模體(PAM)之Cas9核酸酶。該等Cas9核酸酶可靶向基因體之含有NGG序列之任一區域。作為另一實例，具有正交PAM模體要求之Cas9蛋白可用於靶向不具相鄰NGG PAM序列之序列。具有正交PAM序列特異性之例示性Cas9蛋白包括(但不限於) CFP1、Nature Methods 10, 1116-1121 (2013)中所述之彼等Cas9蛋白及Zetsche等人，Cell，第163卷，第3期，第759-771頁，2015年10月22日中所述之彼等Cas9蛋白，該等文獻皆以引用方式併入本文中。
在一些情形下，Cas9蛋白係切口酶，使得當結合至靶核酸作為與指導RNA之複合物之一部分時，將單股斷裂或切口引入靶核酸中。各自結合至結構不同之指導RNA之一對Cas9切口酶可靶向靶基因體區域之兩個近端位點，且因此將一對近端單股斷裂引入靶基因體區域中。切口酶對可提供增強的特異性，此乃因脫靶效應可能產生單一切口，該等切口通常藉由鹼基切除修復機制修復而無損傷。例示性Cas9切口酶包括具有D10A或H840A突變之Cas9核酸酶。
在一些實施例中，RNP包含Cas9核酸酶。在一些實施例中，RNP包含Cas9切口酶。在一些實施例中，RNP-DNA模板複合物包含至少兩種結構不同之RNP複合物。在一些實施例中，至少兩種結構不同之RNP複合物含有結構不同之Cas9核酸酶結構域。在一些實施例中，至少兩種結構不同之RNP複合物含有結構不同之指導RNA。在一些實施例中，其中至少兩種結構不同之RNP複合物含有結構不同之指導RNA，每一結構不同之RNP複合物包含Cas9切口酶，且結構不同之指導RNA與靶區域之相對股雜交。
在一些情形下，將包含結構不同之核糖核蛋白複合物之複數個RNP-DNA模板引入細胞中。舉例而言，Cas9蛋白可與複數個(例如2個、3個、4個、5個或更多個，例如2-10個、5-100個、20-100個)結構不同之指導RNA複合以將DNA模板靶向***複數個結構不同之靶基因體區域。
在本文所提供之方法及組合物中，細胞包括(但不限於)真核細胞、原核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞及諸如此類。視情況地，細胞係哺乳動物細胞，例如人類細胞。細胞可為活體外、離體或活體內。細胞亦可為原代細胞、生殖細胞、幹細胞或前體細胞。前體細胞可為例如富潛能幹細胞或造血幹細胞。在一些實施例中，細胞係原代造血細胞或原代造血幹細胞。在一些實施例中，原代造血細胞係免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞係T細胞。在一些實施例中，T細胞係調節T細胞、效應T細胞或幼稚T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD4 +T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD8 +T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD4 +CD8 +T細胞。在一些實施例中，T細胞係CD4 -CD8 -T細胞。亦提供藉由本文所述之任一方法修飾之任一細胞群體。在一些實施例中，該等方法進一步包括擴增經修飾細胞之群體。
在一些情形下，將細胞自個體去除，使用本文所述之任一方法修飾且投與患者。在其他情形下，將本文所述之任一構築物活體內遞送至患者。參見例如美國專利第9737604號及Zhang等人，「Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery of CRISPR/Cas9 for tumor therapy」， NPG Asia Materials，第9卷，第e441頁(2017)，該等文獻皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，將RNP-DNA模板複合物引入約1 × 10 5至約2 × 10 6個細胞中。舉例而言，可將RNP-DNA模板複合物引入約1 × 10 5至約5 × 10 5個細胞、約1 × 10 5至約1 × 10 6個、1 × 10 5至約1.5 × 10 6個、1 × 10 5至約2 × 10 6個、約1 × 10 6至約1.5 × 10 6個細胞、或約1 × 10 6至約2 × 10 6個細胞中。
在一些情形下，本文所述之方法及組合物可用於產生、修飾、使用或控制重組免疫細胞，例如嵌合抗原受體T細胞(CAR T細胞)。該等CAR T細胞可用於治療或預防個體之癌症、傳染病或自體免疫疾病。舉例而言，在一些實施例中，將一或多種基因產物***或敲入T細胞中以表現異源蛋白(例如嵌合抗原受體(CAR)或引發受體)。 ***位點
用於編輯免疫細胞基因體之方法包括編輯人類T細胞基因體之方法，其包括將核酸序列或構築物***人類免疫細胞中之TCR-α次單元(TRAC)基因之外顯子1中之靶區域中。在一些實施例中，靶區域處於TRAC基因之恆定結構域之外顯子1中。在其他實施例中，靶區域處於編碼TCR-α跨膜結構域之序列開始之前的外顯子1、外顯子2或外顯子3中。
用於編輯免疫細胞基因體之方法亦包括編輯人類免疫T細胞基因體之方法，其包括將核酸序列或構築物***人類T細胞中之TCR-β次單元(TRBC)基因之外顯子1中之靶區域中。在一些實施例中，靶區域處於TRBC1或TRBC2基因之外顯子1中。
特定而言，用於編輯免疫細胞基因體之方法包括編輯人類免疫細胞基因體之方法，其包括將核酸序列或構築物***基因體安全港(GSH)之靶區域中。
用於編輯T細胞基因體之方法亦包括編輯人類T細胞基因體之方法，其包括將核酸序列或構築物***GS94靶區域(基因座chr11: 128340000- 128350000)中。
在一些實施例中，靶區域係GS94基因座。
基因編輯療法包括例如載體整合及位點特異性整合。位點特異性整合係病毒載體之隨機整合之有希望的替代，此乃因其降低***誘變或***腫瘤形成之風險(Kolb等人，Trends Biotechnol. 2005 23:399-406；Porteus等人，Nat Biotechnol. 2005 23:967-973；Paques等人，Curr Gen Ther. 2007 7:49-66)。然而，位點特異性整合繼續面臨諸如以下之挑戰：較差的敲入效率、***腫瘤形成之風險、相鄰基因或轉基因之不穩定及/或異常表現、低可及性(例如在相鄰基因之20 kB內)等 。該等挑戰可部分地經由鑑別及使用安全港基因座或安全港位點(SHS)來解決，該等位點係其中可納入基因或遺傳元件而不會破壞相鄰基因之表現或調節之位點。
最廣泛使用之推定的人類安全港位點係染色體19q上之AAVS1位點，其最初鑑別為復發性腺相關病毒***之位點。已基於同源性鑑別出其他潛在SHS，其中位點首先在其他物種(例如允許性鼠類Rosa26基因座之人類同源物)中或在越來越多之在一些情況下似乎非必需之人類基因中鑑別出。此類型之其他推定的SHS係CCR5趨化介素受體基因，其在被破壞時賦予對人類免疫缺陷病毒感染之抗性。已基於病毒整合位點映射或基因誘捕分析在人類及其他細胞類型中鑑別出其他潛在基因體SHS，如原始鼠類Rosa26基因座。前三種SHS、即AAVS1、CCR5及Rosa26與許多蛋白質編碼基因及調節元件非常接近。(參見Sadelain, M.等人(2012). Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature reviews Cancer, 12(1), 51-58，該文獻之相關揭示內容之全文皆以引用方式併入本文中)。
人類染色體19上之AAVS1 (亦稱為PPP1R12C基因座)係具有預期功能之托管轉基因(例如DNA轉基因)之已知SHS。其處於位置19q13.42。其具有開放染色質結構且勝任轉錄。AAVS1之典型SHS基因座係chr19: 55,625,241-55,629,351。參見Pellenz等人，「New Human Chromosomal Sites with 「Safe Harbor」 Potential for Targeted Transgene Insertion」. Human gene therapy第30,7卷(2019): 814-828，該文獻之相關揭示內容以引用方式併入本文中。例示性AAVS1靶gRNA及靶序列提供於下文中： ●    AAVS1-gRNA序列：ggggccactagggacaggatGTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT ●    AAVS1靶序列：ggggccactagggacaggat
位於染色體3上之位置3p21.31之CCR5編碼HIV-1之主要輔受體。破壞CCR5基因中之此位點有益於HIV/AIDS療法且促進靶向其第三外顯子之鋅指核酸酶之開發。CCR5之典型SHS基因座係chr3: 46,414,443-46,414,942。參見Pellenz等人，「New Human Chromosomal Sites with 「Safe Harbor」 Potential for Targeted Transgene Insertion」. Human gene therapy第30,7卷(2019): 814-828，該文獻之相關揭示內容以引用方式併入本文中。
小鼠Rosa26基因座尤其可用於遺傳修飾，此乃因其可經高效靶向且在測試之大多數細胞類型中表現。Irion等人，2007 (「Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells」. Nature biotechnology 25.12 (2007): 1477-1482，該文獻之相關揭示內容以引用方式併入本文中)在染色體3 (位置3p25.3)中鑑別出人類同源物，即人類ROSA26。人類Rosa26 (hRosa26)之典型SHS基因座係chr3: 9,415,082-9,414,043。參見Pellenz等人，「New Human Chromosomal Sites with 「Safe Harbor」 Potential for Targeted Transgene Insertion」. Human gene therapy第30,7卷(2019): 814-828，該文獻之相關揭示內容以引用方式併入本文中。
安全港位點之其他實例提供於Pellenz等人，「New Human Chromosomal Sites with 「Safe Harbor」 Potential for Targeted Transgene Insertion」. Human gene therapy第30,7卷(2019): 814-828中，該文獻之相關揭示內容以引用方式併入本文中。其他整合位點之實例提供於 表 1中。
在一些實施例中，安全港位點允許高轉基因表現(足以允許轉基因功能或所關注疾病之治療)及轉基因在幾天、幾週或幾個月內之穩定表現。在一些實施例中，安全港基因座之基因之基因剔除賦予細胞之功能益處，或安全港基因座之基因在細胞內不具已知功能。在一些實施例中，安全港基因座產生具或不具CD3/CD28刺激之穩定活體外轉基因表現、如藉由iGuide-Seq或CRISPR-Seq偵測到之可忽略的脫靶裂解、如藉由iGuide-Seq或CRISPR-Seq偵測到之相對於其他基因座較少之脫靶裂解、可忽略的轉基因非依賴性細胞毒性、可忽略的轉基因非依賴性細胞介素表現、可忽略的轉基因非依賴性嵌合抗原受體表現、可忽略的鄰近基因去調節或沈默、及定位於癌症相關基因外。
如所用，「鄰近基因」可指距離安全港基因座(整合位點)約100 kB、約125 kB、約150 kB、約175 kB、約200 kB、約225 kB、約250 kB、約275 kB、約300 kB、約325 kB、約350 kB、約375 kB、約400 kB、約425 kB、約450 kB、約475 kB、約500 kB、約525 kB、約550 kB內之基因。
在一些實施例中，本揭示案預期核酸***物，其包含一或多種重組RNAi核酸，例如至少一種shRNA分子。一或多種重組RNAi核酸之整合可產生例如增強的治療特性。如本文所用之該等增強的治療特性係指與相同正常細胞類型之典型免疫細胞相比，細胞之治療特性增強。舉例而言，與典型、未經修飾及/或天然存在之NK細胞相比，具有「增強的治療特性」之NK細胞具有增強的、改良的及/或增加的治療結果。免疫細胞之治療特性可包括(但不限於)細胞移植、運輸、歸巢、活力、自我更新、持久性、免疫反應控制及調節、存活及細胞毒性。免疫細胞之治療特性亦表現為：抗原靶向受體表現；HLA呈遞或其缺乏；對腫瘤內微環境之耐受性；旁觀免疫細胞之誘導及免疫調節；利用減少改良之靶特異性；對諸如化學療法之治療之抗性。
如本文所用之術語「***物大小」係指整合(***)在靶基因座或安全港位點之核苷酸序列之長度。
本揭示案之***物係指***靶基因座或安全港位點之核酸分子或多核苷酸。在一些實施例中，核苷酸序列係DNA分子，例如基因體DNA，或包含去氧核糖核苷酸。在一些實施例中，***物包含較小的DNA片段，例如色素體DNA、粒線體DNA或以質體、F型黏接質體、黏粒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)及/或任何其他亞基因體DNA區段之形式分離之DNA。***物中之核苷酸預期為天然存在之核苷酸、非天然存在核苷酸及經修飾之核苷酸。核苷酸可經化學或生物化學修飾，或可含有非天然或衍生化核苷酸鹼基，如熟習此項技術者將容易地瞭解。該等修飾包括例如標記、甲基化、用類似物取代一或多個天然存在之核苷酸、核苷酸間修飾。多核苷酸可呈任一拓撲構形，包括單股、雙股、部分雙鏈、三鏈、髮夾狀、環狀構形及此項技術中預期之其他三維構形。
***物可具有編碼區及/或非編碼區。***物可包含非編碼序列(例如控制元件，例如啟動子序列)。在一些實施例中，***物編碼一或多種重組RNAi核酸。
在一些實施例中，核酸序列經由非病毒遞送***免疫細胞之基因體中。在非病毒遞送方法中，核酸可為裸DNA或處於非病毒質體或載體中。非病毒遞送技術可為如本文所述或熟習此項技術者已知之位點特異性整合技術。用於整合至安全港基因座中之位點特異性技術之實例包括(但不限於)使用核酸酶之同源依賴性改造及使用Cas9或其他CRISPR核酸內切酶之同源非依賴性靶向***。
在一些實施例中，藉由將以下引入經改造細胞中使***物整合在安全港位點：(a)裂解安全港位點中之靶區域以產生***位點之靶向核酸酶；及(b)核酸序列(***物)，其中***物藉由例如HDR納入***位點。可用於本揭示案方法中之非病毒遞送技術之實例提供於美國申請案第16/568,116號及美國申請案第16/622,843號中，該等申請案之相關揭示內容之全文皆以引用方式併入本文中。
預期整合位點之實例提供於 表 D中。 表 D ： sgRNA 序列
sgRNA ID sgRNA 序列 sgRNA 起始坐標 GRCH38 sgRNA 靶基因座 整合位點 中值 ( 經修飾 %) ，自 2 名供體、 2 個引子集匯總
sgRNA_1 GCACCTGAATACCACGCCTG chr16:88811818 APRT APRT 79.28
sgRNA_2 CGCCTGCGATGTAGTCGATG chr16:88811551 APRT APRT 78.60
sgRNA_3 CAGGACGGGCGAGATGTCCC chr16:88811640 APRT APRT 85.25
sgRNA_4 CTGAATCTTTGGAGTACCTG chr15:44715425 B2M B2M 78.51
sgRNA_5 GGCCACGGAGCGAGACATCT chr15:44711550 B2M B2M 94.75
sgRNA_6 AAGTCAACTTCAATGTCGGA chr15:44715515 B2M B2M 70.97
sgRNA_7 GCTTGGAGGCCTGATCAGCG chr19:36141111 CAPNS1 CAPNS1 89.34
sgRNA_8 CTTATCTCTTCGCAGCGAGG chr19:36142301 CAPNS1 CAPNS1 91.09
sgRNA_9 CACACATTACTCCAACATTG chr19:36142676 CAPNS1 CAPNS1 71.98
sgRNA_10 TTCCGCAAAATAGAGCCCCA chr3:105746019 CBLB CBLB 91.55
sgRNA_11 TGCACAGAACTATCGTACCA chr3:105751622 CBLB CBLB 91.43
sgRNA_12 GCAATAAGACTCTTTAAAGA chr3:105853470 CBLB CBLB 76.18
sgRNA_13 CAAAGAGATTACGAATGCCT chr1:116754658 CD2 CD2 89.80
sgRNA_14 CAAGGCACCCCAGGTTTCCA chr1:116754663 CD2 CD2 92.70
sgRNA_15 TTACGAATGCCTTGGAAACC chr1:116754666 CD2 CD2 92.82
sgRNA_16 CAGAGACGCATCTGACCCTC chr11:118315540 CD3E CD3E 90.96
sgRNA_17 CATGCAGTTCTCACACACTG chr11:118313715 CD3E CD3E 87.47
sgRNA_18 GTGTGAGAACTGCATGGAGA chr11:118313715 CD3E CD3E 86.65
sgRNA_19 TCTCATTTCAGGAAACCACT chr11:118349748 CD3G CD3G 87.24
sgRNA_20 AGTCATACACCTTAACCAAG chr11:118349754 CD3G CD3G 87.99
sgRNA_21 TTCAAGGAAACCAGTTGAGG chr11:118352458 CD3G CD3G 86.55
sgRNA_22 GAGCCTTGCCTGGAAATCTG chr11:61118177 CD5 CD5 84.03
sgRNA_23 AAGCGTCAAAAGTCTGCCAG chr11:61118324 CD5 CD5 89.19
sgRNA_24 CGTTCCAACTCGAAGTGCCA chr11:61118121 CD5 CD5 83.11
sgRNA_25 GAGCGACTGGGACACGGTGA chr9:136866246 EDF1 EDF1 88.84
sgRNA_26 GCTGCGCAAGAAGGGCCCTA chr9:136866211 EDF1 EDF1 91.04
sgRNA_27 TTGTTCTGGCCAGCAGCCCC chr9:136863433 EDF1 EDF1 85.98
sgRNA_28 CTTCCAGAGCCACATCATCG chr19:48965791 FTL FTL 93.10
sgRNA_29 GGGACTCACCAGAGAGAGGT chr19:48965601 FTL FTL 88.86
sgRNA_30 CGGTCGAAATAGAAGCCCTA chr19:48965770 FTL FTL 93.14
sgRNA_31 AAAAGGATATTGTGCAACTG chr10:87933015 PTEN PTEN 92.37
sgRNA_32 TGTGCATATTTATTACATCG chr10:87933183 PTEN PTEN 90.64
sgRNA_33 TTTGTGAAGATCTTGACCAA chr10:87933087 PTEN PTEN 85.36
sgRNA_34 TGTCATGCTGAACCGCATTG chr18:12830972 PTPN2 PTPN2 87.94
sgRNA_35 CCACTCTATGAGGATAGTCA chr18:12859219 PTPN2 PTPN2 92.45
sgRNA_36 TTGACATAGAAGAGGCACAA chr18:12836828 PTPN2 PTPN2 93.96
sgRNA_37 GAGTACTACACTCAGCAGCA chr12:6952098 PTPN6 PTPN6 89.61
sgRNA_38 TCACGCACAAGAAACGTCCA chr12:6954872 PTPN6 PTPN6 82.74
sgRNA_39 AGGTCTCGGTGAAACCACCT chr12:6951610 PTPN6 PTPN6 91.27
sgRNA_40 AGCATTATCCAAAGAGTCCG chr1:198696873 PTPRC PTPRC 88.88
sgRNA_41 ATATTAATTCTTACCAGTGG chr1:198692370 PTPRC PTPRC 88.95
sgRNA_42 AGCTTTAAATCAAGGTTCAT chr1:198756176 PTPRC PTPRC 96.89
sgRNA_43 ATCCCGAGCCCTAAGGTGCA chr11:67436325 PTPRCAP PTPRCAP 84.08
sgRNA_44 GGCAGCGCGGAGGACAGCGT chr11:67436285 PTPRCAP PTPRCAP 97.74
sgRNA_45 CTCAGGGGGCTACTACCACC chr11:67436170 PTPRCAP PTPRCAP 91.50
sgRNA_46 GTCACCGACGAGACCAGAAG chr5:82277810 RPS23 RPS23 79.40
sgRNA_47 GTCGTGGACTTCGTACTGCT chr5:82277843 RPS23 RPS23 83.07
sgRNA_48 TAATTTTTAGGCAAGTGTCG chr5:82277860 RPS23 RPS23 61.94
sgRNA_49 TTAGCTGTTAGACTTGAATA chr14:51993810 RTRAF RTRAF 85.50
sgRNA_50 CGAGAGCCGTCAACTTGCGT chr14:51989652 RTRAF RTRAF 85.64
sgRNA_51 CGGCTTCAACTGCAAAGGTG chr14:51989700 RTRAF RTRAF 88.77
sgRNA_52 TATGAAAAAGCAGAGCGACT chr15:43793025 SERF2 SERF2 89.61
sgRNA_53 TCTGGCGGGCGAGCTCACGC chr15:43792989 SERF2 SERF2 86.73
sgRNA_54 CTCACGCTGGTTACCGCCTA chr15:43792977 SERF2 SERF2 80.57
sgRNA_55 AAAGATTACGAACTTCCCTG chr12:46207559 SLC38A1 SLC38A1 92.24
sgRNA_56 GTTAAAAACAGACATGCCTA chr12:46229232 SLC38A1 SLC38A1 91.51
sgRNA_57 ATGCCTAAGGAGGTTGTACC chr12:46229246 SLC38A1 SLC38A1 79.48
sgRNA_58 CTCCAGGTATCCCATCGAAA chr18:47869418 SMAD2 SMAD2 79.53
sgRNA_59 CACCAAATACGATAGATCAG chr18:47870532 SMAD2 SMAD2 86.61
sgRNA_60 TGGCGGCGTGAATGGCAAGA chr18:47896729 SMAD2 SMAD2 82.91
sgRNA_61 TAGGATGGTAGCACACAACC chr16:11255478 SOCS1 SOCS1 92.25
sgRNA_62 CAGCAGCAGAGCCCCGACGG chr16:11255432 SOCS1 SOCS1 83.79
sgRNA_63 CGGCGTGCGAACGGAATGTG chr16:11255296 SOCS1 SOCS1 84.24
sgRNA_64 TATAGACGCTGCCCGACGTC chr15:40038895 SRP14 SRP14 95.12
sgRNA_65 TCCAAAGAAGGGTACTGTGG chr15:40038368 SRP14 SRP14 92.14
sgRNA_66 ACAGTACCCTTCTTTGGAAT chr15:40038358 SRP14 SRP14 65.82
sgRNA_67 GCGACGGGCGCATCTACGTG chr12:120469572 SRSF9 SRSF9 83.68
sgRNA_68 CCCGACCTCCATAAGTCCTG chr12:120465700 SRSF9 SRSF9 92.56
sgRNA_69 GGGGTCCTCGAAGCGCACGA chr12:120469426 SRSF9 SRSF9 89.94
sgRNA_70 TGCTCTGTTTAGAAGATGAC chr5:32591641 SUB1 SUB1 79.36
sgRNA_71 ATATTCTTTTCTAGTTAAAG chr5:32591566 SUB1 SUB1 70.93
sgRNA_72 CCTGTAAAGAAACAAAAGAC chr5:32591614 SUB1 SUB1 93.66
sgRNA_73 TGGAGAAAGACGTAACTTCG chr4:105234315 TET2 TET2 83.53
sgRNA_74 TCTGCCCTGAGGTATGCGAT chr4:105234747 TET2 TET2 90.97
sgRNA_75 ATTCCGCTTGGTGAAAACGA chr4:105235656 TET2 TET2 89.62
sgRNA_76 CAGGCACAATAGAAACAACG chr3:114295571 TIGIT TIGIT 92.65
sgRNA_77 CCATTTGTAATGCTGACTTG chr3:114295700 TIGIT TIGIT 60.75
sgRNA_78 CTGGGTCACTTGTGCCGTGG chr3:114295634 TIGIT TIGIT 87.99
sgRNA_79 GTCAGGGTTCTGGATATCTG chr14:22547508 TRAC TRAC 98.20
sgRNA_80 TGGATTTAGAGTCTCTCAGC chr14:22547541 TRAC TRAC 88.15
sgRNA_81 CTGCGGCTGTGGTCCAGCTG chr14:22550661 TRAC TRAC 94.77
sgRNA_82 ACAAAACTGTGCTAGACATG chr14:22547658 TRAC TRAC 87.86
sgRNA_83 TTCTTCCCCAGCCCAGGTAA chr14:22547778 TRAC TRAC 89.85
sgRNA_84 CGTCATGAGCAGATTAAACC chr14:22550625 TRAC TRAC 95.81
sgRNA_85 GAGAGCGCCTGCGACCCGAG chr19:58544980 TRIM28 TRIM28 89.44
sgRNA_86 CCAGCGGGTGAAGTACACCA chr19:58544869 TRIM28 TRIM28 94.79
sgRNA_87 GGAGCGCTTTTCGCCGCCAG chr19:58544839 TRIM28 TRIM28 91.81
sgRNA_88 TGAGGCCTGGACCTTATGCA chr10:33134193 chr10:33130000-33140000 desert_1 (GS88) 69.44
sgRNA_89 CCTGGTGGAGTGAACCATGA chr10:33132917 chr10:33130000-33140000 desert_1 (GS89) 95.25
sgRNA_90 CAAGCACTTAGGTTCCCCTG chr10:33134633 chr10:33130000-33140000 desert_1 (GS90) 91.13
sgRNA_91 GGTCTCCCTACAATTCAGCG chr10:72294568 chr10:72290000-72300000 desert_2 (GS91) 92.02
sgRNA_92 CACAGCGCGTGACTGCAATG chr10:72298268 chr10:72290000-72300000 desert_2 (GS92) 90.22
sgRNA_93 TCTGGGGCACCAATTCTAGG chr10:72292786 chr10:72290000-72300000 desert_2 (GS93) 86.35
sgRNA_94 GAGCCATGCTTGGCTTACGA chr11:128342576 chr11:128340000-128350000 desert_3 (GS94) 91.24
sgRNA_95 GTACAAGTACTTATCTCATG chr11:128343592 chr11:128340000-128350000 desert_3 (GS95) 89.02
sgRNA_96 GAGATAACAACATAACAACA chr11:128347170 chr11:128340000-128350000 desert_3 (GS96) 96.47
sgRNA_97 CATATTCCATAGTCTTTGGG chr11:65425000 chr11:65425000-65427000 (NEAT1) desert_4 (GS97) 88.54
sgRNA_98 CTGCCCCTTAGCAACTTAGG chr11:65425507 chr11:65425000-65427000 (NEAT1) desert_4 (GS98) 92.76
sgRNA_99 TGTTTAAAAATATGTTGACA chr11:65426264 chr11:65425000-65427000 (NEAT1) desert_4 (GS99) 90.76
sgRNA_100 CCAGGAATGGAAACTCACGC chr15:92830315 chr15:92830000-92840000 desert_5 (GS100) 87.84
sgRNA_101 GAGGCCGCTGAATTAACCCG chr15:92831850 chr15:92830000-92840000 desert_5 (GS101) 85.32
sgRNA_102 ATACACGCACACTTGCAGAA chr15:92831131 chr15:92830000-92840000 desert_5 (GS102) 99.92
sgRNA_103 GAGCAGACAGAAACCCAGGG chr16:11225670 chr16:11220000-11230000 desert_6 (GS103) 87.92
sgRNA_104 TGAGTCTCCAAACAGAACAG chr16:11226284 chr16:11220000-11230000 desert_6 (GS104) 88.53
sgRNA_105 TAATATCACTGACTTCACGG chr16:11225029 chr16:11220000-11230000 desert_6 (GS105) 87.65
sgRNA_106 TACACACAATGTAAGCAGCA chr2:87467461 chr2:87460000-87470000 desert_7 (GS106) 71.79
sgRNA_107 GGGAGCTCAATTCGAAACCA chr2:87468809 chr2:87460000-87470000 desert_7 (GS107) 65.89
sgRNA_108 TTGGACAGGTGAGACAGTCG chr2:87467001 chr2:87460000-87470000 desert_7 (GS108) 72.64
sgRNA_109 AAGCTCACTCAGATAGTGTG chr3:186511316 chr3:186510000-186520000 desert_8 (GS109) 76.89
sgRNA_110 CAGGAGAACCACCTTACACG chr3:186515260 chr3:186510000-186520000 desert_8 (GS110) 86.31
sgRNA_111 GGACAGACCCTGATTCACAA chr3:186519655 chr3:186510000-186520000 desert_8 (GS111) 85.47
sgRNA_112 ACATGGCAGTCTATGAACAG chr3:59451154 chr3:59450000-59460000 desert_9 (GS112) 87.77
sgRNA_113 CCTATAGAGAGTACTACTTG chr3:59456416 chr3:59450000-59460000 desert_9 (GS113) 79.33
sgRNA_114 CCAACCGGGTCTTCATTACG chr3:59457029 chr3:59450000-59460000 desert_9 (GS114) 92.21
sgRNA_115 TCAAGCGTAGAGTTCCGAGT chr8:127993006 chr8:127980000-128000000 desert_10 (GS115) 93.07
sgRNA_116 TCATGCAATTATGGACCCAG chr8:127994663 chr8:127980000-128000000 desert_10 (GS116) 89.40
sgRNA_117 CGGGAAAGTGACTGGCCATG chr8:127996766 chr8:127980000-128000000 desert_10 (GS117) 87.45
sgRNA_118 TGAGATTGAAATCAAATCGG chr9:7974159 chr9:7970000-7980000 desert_11 (GS118) 84.84
sgRNA_119 TATGCAATATTCATCACGCG chr9:7977914 chr9:7970000-7980000 desert_11 (GS119) 85.44
sgRNA_120 AATGTGTTAAATCAAATGCA chr9:7976895 chr9:7970000-7980000 desert_11 (GS120) 83.48
CRISPR-Cas 編輯
基因編輯之一個有效實例係CRISPR-Cas方法(例如CRISPR-Cas9)。此方法納入指導多核苷酸(例如指導核糖核酸或gRNA)及Cas核酸內切酶(例如Cas9核酸內切酶)之使用。
如本文所用之多肽(稱為「Cas核酸內切酶」或具有「Cas核酸內切酶活性」)係指由Cas基因編碼之CRISPR相關之(Cas)多肽，其中Cas多肽係可在可操作地連接至一或多個指導多核苷酸時裂解之靶DNA序列(參見例如美國專利第8,697,359號)。此定義亦包括保留指導多核苷酸依賴性核酸內切酶活性之Cas核酸內切酶之變異體。本文所詳述之供體DNA***方法中所用之Cas核酸內切酶係在靶位點(例如在靶基因座內或在安全港位點)將雙股斷裂引入DNA中之核酸內切酶。
如本文所用之術語「指導多核苷酸」係指能夠與Cas核酸內切酶複合且允許Cas核酸內切酶識別並裂解DNA靶位點之多核苷酸序列。指導多核苷酸可為單一分子或雙分子。指導多核苷酸序列可為RNA序列、DNA序列或其組合(RNA-DNA組合序列)。僅包含核糖核酸之指導多核苷酸亦稱為「指導RNA」。在一些實施例中，使用指導RNA (gRNA)與Cas核酸內切酶(例如Cas9核酸內切酶)之組合將多核苷酸供體構築物***安全港基因座。
指導多核苷酸包括與靶DNA中之核苷酸序列互補之第一核苷酸序列結構域(亦稱為可變靶向結構域或VT結構域)，及與Cas核酸內切酶多肽相互作用之第二核苷酸。其可為包含序列結構域(稱為Cas核酸內切酶識別結構域或CER結構域)之雙分子(亦稱為雙股指導多核苷酸)。此雙分子指導多核苷酸之CER結構域包含沿互補區雜交之兩個單獨分子。兩個單獨分子可為RNA序列、DNA序列及/或RNA-DNA組合序列。
使用CRISPR-Cas方法之基因體編輯依賴於由RNA指導之Cas核酸內切酶(例如Cas 9核酸內切酶)誘導之位點特異性DNA雙股斷裂(DSB)之修復。該等DSB之同源定向修復(HDR)使得能夠藉由引入所定義基因體變化(包括鹼基取代、序列***及缺失)精確地編輯基因體。基於HDR之習用CRISPR/Cas9基因體編輯涉及用Cas9、gRNA及含有與所關注基因體基因座匹配之同源臂之供體DNA轉染細胞。
HITI (同源非依賴性靶向***)使用基於非同源末端連結(NHEJ)之同源非依賴性策略且該方法可能比HDR更有效。指導RNA (gRNA)靶向***位點。對於HITI，供體質體缺少同源臂且DSB修復並不經由HDR路徑來進行。供體多核苷酸構築物可經改造以包括側接欲***基因或序列之Cas9裂解位點。此導致Cas9在供體質體及基因體靶序列二者上裂解。靶及供體二者具有鈍端且NHEJ路徑使用線性化供體DNA質體，從而整合至基因體DSB位點中。(參見例如Suzuki, K.等人(2016). In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature, 540(7631), 144-149，該文獻之相關揭示內容之全文皆併入本文中)。
使用CRISPR-Cas方法實施基因編輯之方法為熟習此項技術者已知。(參見例如美國申請案第US16/312,676號、美國申請案第US15/303,722號及美國申請案第US15/628,533號，該等申請案之揭示內容之全文皆以引用方式併入本文中)。另外，使用核酸內切酶將轉基因***安全港基因座中闡述於例如美國申請案第13/036,343號中，該申請案之揭示內容之全文皆以引用方式併入本文中。
編碼核酸內切酶之指導RNA及/或mRNA (或DNA)可化學連接至增強寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取之一或多個部分或結合物。該等部分之非限制性實例包括脂質部分，例如膽固醇部分、膽酸、硫醚、硫膽固醇、脂族鏈(例如十二烷二醇或十一基殘基)、磷脂(例如二-十六基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六基-外消旋-甘油-3-H-膦酸三乙胺)、聚胺或聚乙二醇鏈、金剛烷乙酸、棕櫚基部分及十八胺或己基胺基-羰基-t氧基膽固醇部分。參見例如美國專利公開案第20180127786號，其揭示內容之全文皆以引用方式併入本文中。 治療應用
對於治療應用，將有效量之經改造細胞、其群體或其組合物投與個體，通常係哺乳動物，通常係人類。
經改造細胞可藉由輸注(例如在一段時間內連續輸注)或熟習此項技術者已知之其他投與模式投與個體。
本文所提供之經改造細胞不僅可用於基因療法，且亦可用於非醫藥用途，例如產生動物模型及產生表現所關注重組核酸之重組細胞株。
本揭示案之經改造細胞可為已藉由將轉基因整合在本文所述之安全港基因座修飾之任何細胞，通常係哺乳動物細胞，通常係人類細胞。例示性細胞提供於重組細胞部分中。
本揭示案之經改造細胞、組合物及方法可用於諸如免疫或T細胞療法之治療應用。在一些實施例中，相對於無***之情況，將編碼shRNA分子之序列***安全港基因座內會維持TCR表現，且在維持TCR功能的同時實現轉基因表現。
在一些實施例中，本揭示案提供藉由向需要治療之個體投與包含本文所述之任一經改造細胞之組合物來治療該個體之方法。在一些實施例中，投與經改造之細胞組合物產生期望藥理學及/或生理學效應。該效應可為疾病及/或由疾病引起之不良效應之部分或完全治癒。在一些實施例中，治療涵蓋個體(例如哺乳動物，例如人類)疾病之任何治療。另外，治療可穩定或減輕個體(例如患者)之不期望之臨床症狀。本文所提供之細胞、其群體或其組合物可在疾病發生期間或之後投與。
在某些實施例中，個體患有可藉由細胞療法治療及/或改善之疾病、疾患及/或損傷。在一些實施例中，需要細胞療法之個體係患有損傷、疾病或疾患之個體，由此產生細胞療法(例如，其中將細胞材料投與個體之療法)。然而，預期可能治療、改善及/或減輕與損傷、疾病或疾患相關之至少一種症狀之嚴重程度。 投與方法
可投與有效量之包含系統之免疫細胞來治療癌症。包含系統之免疫細胞之適當劑量可基於以下來確定：欲治療癌症之類型、包含系統之免疫細胞之類型、癌症之嚴重程度及進程、個體之臨床疾患、個體之臨床病史及對治療之反應以及主治醫師之考慮。 醫藥組合物
本文所提供之經改造重組細胞或重組核酸可作為醫藥組合物之一部分來投與。除一或多個重組細胞外，該等組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟習此項技術者所熟知之其他材料。該等材料應為無毒的且不應干擾活性成分之功效。載劑或其他材料之精確性質可取決於投與途徑，例如口服、靜脈內、皮膚或皮下、鼻、肌內、腹膜內途徑。醫藥組合物可包含一或多種醫藥賦形劑。可使用任一適宜醫藥賦形劑，且熟習此項技術者能夠選擇適宜醫藥賦形劑。因此，下文所提供之醫藥賦形劑意欲具有說明性而非限制性。其他醫藥賦形劑包括例如 Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe等人(編輯)，第6版(2009)，其全文皆以引用方式併入。
本文預期投與其他治療劑之各種模式。在一些實施例中，其他治療劑係藉由任一適宜投與模式來投與。
組合物可單獨或與其他治療組合投與，根據欲治療之疾患同時或依序投與。 套組及製品
本申請案提供套組，其包括本文所述之重組核酸或細胞組合物中之任一或多者以及使用說明書。使用說明書可作為包裝插頁存在於套組中，存在於套組容器或其組分之標記中，或可呈數位形式(例如經由網際網路上之鏈接存在於CD-ROM上)。套組可包括以下中之一或多者：基因體靶向核酸、編碼基因體靶向核酸之多核苷酸、位點定向多肽及/或編碼位點定向多肽之多核苷酸。亦預期套組內之其他組分，例如緩衝劑(例如復原緩衝劑、穩定緩衝劑、稀釋緩衝劑)及/或一或多種對照載體。
在一些實施例中，套組進一步含有選自以下中之任一者之組分：二級抗體、用於免疫組織化學分析之試劑、醫藥學上可接受之賦形劑及說明手冊及其任一組合。在一個特定實施例中，套組包括醫藥組合物，該醫藥組合物包含本文所述之重組核酸或細胞組合物中之任一或多者及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
本申請案亦提供製品，其包含本文所述之重組核酸或細胞組合物或套組中之任一者。製品之實例包括小瓶(包括密封小瓶)。 實例
下文係用於實施本發明之特定實施例之實例。實例僅係出於說明目的而提供，且並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。已努力確保所用數值(例如量、溫度等)之準確性，但當然，應允許一定實驗誤差及偏差。
除非另有指示，否則本發明之實踐將採用此項技術範圍內之蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。此類技術在文獻中充分解釋。參見例如T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties(W.H. Freeman and Company, 1993)；A.L. Lehninger, Biochemistry(Worth Publishers, Inc.，當前新增)；Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版，1989)； Methods In Enzymology(S. Colowick及N. Kaplan編輯，Academic Press, Inc.)； Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；Carey及Sundberg， Advanced Organic Chemistry，第3版(Plenum Press)，A卷及B卷(1992)。 實例 1 ： TGFRB1 及 TGFRB2 shRNA 之活體外表徵 材料 T 細胞產生：
使用CITE非病毒基因遞送產生經改造之T細胞。簡言之，使用Miltenyi StraightFrom® Leukopak® CD4/CD8微珠套組自健康人類供體分離泛T細胞。用抗CD3/抗CD28珠粒刺激經分離之T細胞。在刺激後兩天，將細胞重懸浮於含有與GS94指導RNA及編碼所關注轉基因之供體DNA模板之複合的釀膿鏈球菌(S. pyogenes) Cas9之溶液中。隨後使用Lonza 4-D Nucleofector對細胞進行電穿孔且在補充有IL-7及IL-15之新鮮培養基中進行恢復。在電穿孔後每2-3天對細胞計數且添加新鮮培養基。測試之所有構築物皆編碼表現ALPG PrimeR受體及靶向MSLN之CAR之邏輯閘。例示性構築物格式顯示於 圖 1A中。shRNA盒中所編碼之盒在構築物之間係可變的。表現ALPG/MSLN邏輯閘及shRNA盒之T細胞稱為積體電路T細胞(ICT)。盒中所用之shRNA靶向TGFBR1、TGFBR2、FAS及/或PTPN2。篩選靶向TGFBR2之37種單一候選shRNA減少TGFBR2表面表現之能力。雙重shRNA盒含有靶向TGFBR1之shRNA及靶向TGFBR2之shRNA或靶向TGFBR2之兩個shRNA。藉由組合TGFBR1/TGFBR2 shRNA或TGFBR2/TGFBR2 shRNA與靶向FAS及PTPN2之shRNA之組合來製造「四重」 shRNA盒。藉由組合TGFBR2 shRNA與靶向FAS及PTPN2之shRNA之組合來製造「三重」 shRNA盒。 使用 K562 腫瘤細胞及流式細胞術之重複刺激分析：
在電穿孔後第5天時，經由Myc+細胞之基於珠粒之陽性選擇(Myc標籤表現於引發受體上)來富集經編輯細胞。將T細胞與經改造以表現ALPG及MSLN之K562腫瘤細胞以2:1效應物:靶比率在普通培養基或含有10 ng/mL TGFβ1之培養基中共培養6天。在第一次刺激後3天，經由流式細胞術量化T細胞及腫瘤，將T細胞正規化至所定義濃度，且以2:1 E:T比率在添加或不添加TGFβ1下再刺激。在第6天時，收穫細胞且實施流式細胞術以評價FAS、CD103之表現及活腫瘤細胞數( 圖 1C 、圖 2A 、圖 2B)。 使用 K562 腫瘤細胞及流式細胞術之縱向重複刺激分析
在電穿孔後第4天時，經由Myc+細胞之基於珠粒之陽性選擇來富集經編輯細胞。將T細胞與經改造以表現ALPG及MSLN之K562腫瘤細胞以2:1效應物:靶比率在普通培養基或含有10 ng/mL TGFβ1之培養基中共培養。每2-3天經由流式細胞術量化T細胞及腫瘤。在每一時間點，將T細胞正規化至所定義濃度且以2:1 E:T比率在添加或不添加TGFβ1下再刺激。在14天時段內實施總共6次刺激。藉由流式細胞術縱向量化CD103+ T細胞( 圖 5A)及PD-1+ T細胞( 圖 5B)在+TGFβ1條件下之頻率。 與 RPMI-8226 腫瘤細胞共培養及流式細胞術：
將如上文分離之細胞與RPMI-8226腫瘤細胞以1:2.5 E:T在10 ng/mL外源TGFb1存在或不存在下共培養6天。在第6天時，收穫細胞且實施流式細胞術以評價CD103之表現。
將經編輯之邏輯閘T細胞與K562靶細胞在TGF-β1不存在或存在下共培養14天。藉由流式細胞術量測CD103及PD1之表面表現。計算在第2次-第6次刺激時CD103及PD1之AUC/ΔAUC (10 ng/mL TGF-ꞵ1對0)。 藉由 MULTI-Seq 驗證 shRNA 靶敲低：
在TGFβ存在或不存在下實施之14天重複刺激分析(RSA)結束時，收穫且處理細胞用於MULTISEQ。
在Attune上對所培養細胞計數且正規化至約85,000個細胞/孔之最低T細胞計數。將培養基中之100μL正規化細胞轉移至96孔圓底板。
將96孔板中之細胞洗滌兩次，且在180 µL之1× PBS中重懸浮於細胞懸浮液中。對於錨標記，將22 µL之2 µM錨-條形碼混合物(錨LMO及樣品條形碼寡核苷酸於1× PBS中之當量)與每一細胞樣品混合，且在冰上培育5分鐘。將22 µL之共錨溶液(1× PBS中之2 µM共錨LMO)添加至錨條形碼化樣品中並在冰上再培育5分鐘。共錨標記後，使細胞在4℃中以400 × g旋轉沈降10 min。去除上清液，然後在含有1% BSA之冷1× PBS緩衝液中連續洗滌兩次。然後將細胞重懸浮於含有1% BSA之冷1× PBS中，匯集至單一管中，過濾且分選活的T細胞。在血球計上對經分選細胞計數且加載至10×微流體晶片K上，目標40,000個細胞/泳道。如鉻Next GEM單細胞5'試劑套組v2方案中所述實施文庫製備，其中將MULTI-Seq引子(約25 nM最終濃度)添加至cDNA擴增反應中
根據10× cDNA擴增淨化方案，將0.6× SPRIselect試劑添加至樣品中。將樣品混合，培育且置於10×磁鐵上直至溶液澄清。將80 µL上清液轉移至新的1.5 mL管中。此含有MULTI-seq條形碼序列流份。將260 µL SPRIselect及180 µL 100%異丙醇添加至MULTI-seq條形碼流份中。將樣品充分混合，培育且置於10×磁鐵上。丟棄上清液且用80%乙醇將珠粒洗滌兩次。將珠粒風乾且重懸浮於Qiagen溶析緩衝液中。使用Qubit螢光計量化樣品。
將樣品正規化至18.75 µL總樣品體積中之3.5 ng用於指數PCR。將通用i5引子與獨特的i7指數配對，用於多重化樣品以供測序。在指數PCR後，使樣品經歷1.6× SPRIselect淨化。然後藉由Qubit及Tapestation量化最終樣品。根據Tapestation計算之莫耳濃度係100 bp至1000 bp。將MULTI-seq條形碼樣品匯集至目標2,000個讀數/細胞。在Illumina Novaseq平台上如鉻Next GEM單細胞5’試劑套組v2方案中所指示對樣品測序。
對相關靶基因(FAS、PTPN2、TGFBR1、TGFBR2)進行Log2(CPKM+1)繪圖。 藉由流式細胞術評價磷酸 -smad2/3：
將2×10 5個myc富集細胞/供體重懸浮於無血清無細胞介素培養基中且靜置過夜。第二天，用10 ng/ml TGF-ꞵ1將細胞處理2小時且針對表面Myc表現及活/死染色進行染色。根據製造商方案使用BE Perm緩衝液III將細胞固定且透化。使用純系072-670 (BD)針對pSMAD2/3對細胞染色。將樣品洗滌且在Attune Nxt血球計數器上獲取。相對於缺少TGFBR shRNA之對照細胞量化pSMAD2/3 MFI。 結果
為確保shRNA miR四聯體(fas-ptpn2-tgfbr2-tfgrb2 shRNA或fas-ptpn2 -tgfbr2-tgfrb1 shRNA)在所有靶上起作用，在用四重shRNA構築物轉染細胞後評價TGFBR2及FAS敲低。四重shRNA賦予增強的TGFBR2敲低且維持T細胞固有靶FAS之敲低( 圖 1B及 圖 1C)。納入多種TGFBR2 shRNA會增強TGFBR2敲低。另外，FAS敲低在「四重」 shRNA-miR模組中得以保留且在所有TGFBR shRNA構築物之間係相當的。用2種shRNA靶向TGFBR2可在蛋白質層級上改良KD。
在短重複刺激分析中，TGFBR2敲低亦部分地抑制TGF-ꞵ介導之靶細胞殺傷阻抑( 圖 1D)。
四種前導TGFBR2 shRNA候選物在T細胞中達成大於50%之TGFBR2表面表現敲低( 圖 1E)。亦在使用可溶性TGF-b之重複刺激分析中評價單一TGFBR2敲低之T細胞。 圖 1F顯示在單獨培養基中或在TGF-b存在下刺激之T細胞中之累積T細胞擴增、腫瘤細胞擴增及IFNg產生。在TGF-b存在下，經由單一shRNA敲低TGFBR2並未改良ICT功能。然而，TGFBR2基因剔除之ICT (TGFBR2 sgRNA)之所有指標皆展示功能恢復(T細胞擴增增加、靶細胞擴增減少、IFNg產生增加)。因此，與經由單一TGFBR2 shRNA敲低相比，雙重TGFBR2 shRNA構築物顯示改良之T細胞功能。
與單獨FAS-PTPN2 shRNA相比，「三聯體」 shRNA盒亦減少TGFBR2表現及pSMAD磷酸化( 圖 1G)。
為評價TGFRB靶向shRNA四聯體對TGF-ꞵ傳訊之下游效應之抗性，將經編輯之邏輯閘T細胞與Prime-細胞溶解+ K562s在TGF-ꞵ不存在或存在下共培養。如 圖 2A中所顯示，在短期RSA中在腫瘤加TGF-ꞵ1暴露後，四重shRNA賦予對TGF-ꞵ介導之CD103誘導之部分抗性。因此，TGFBR1及TGFBR2基因剔除保護邏輯閘T細胞免於TGF-β介導之CD103誘導。TGFBR敲低導致TGF-β對CD103之誘導部分地減少。
使用RPMI-8226靶細胞重複該分析。如 圖 2B中所顯示，在RPMI-8226靶細胞中在腫瘤加TGF-ꞵ1暴露後，四重shRNA賦予對TGF-ꞵ介導之CD103誘導之部分抗性。
TGFBR2敲低拯救邏輯閘T細胞對腫瘤細胞殺傷之TGF-ꞵ介導之阻抑( 圖 3)。因此，在TGF-ꞵ1存在下，TGFBR shRNA拯救邏輯閘T細胞之抗腫瘤活性。
亦使用PD1表面表現來評價TGFBR shRNA四聯體活性。PD1對CD103之二元繪圖表現顯示TGFB傳訊之消除，此導致PD-1表現減弱(數據未顯示)。亦觀察到在用四重shRNA模組敲低後，PD1與CD103誘導之間的關聯( 圖 2A 、圖 2B及 圖 4)。亦觀察到在短RSA (2次刺激)及CSA後積體電路T細胞 (ICT)上CD103誘導之強關聯( 圖 4)。因此，對CD103及PD1誘導之抗性係相關的。不希望受限於理論，PD1誘導可為可用於對TGFBR shRNA模組分級之指標。
選擇所選四重shRNA模組進行進一步表徵。如 圖 5A中所顯示，在RSA期間，所選TGFBR四聯體部分地損害CD103誘導。TGFBR2基因剔除縱向保護邏輯閘T細胞免於TGF-β介導之CD103誘導。TGFBR敲低導致TGF-β1對CD103之誘導部分地減少。在RSA期間，所選四重TGFBR shRNA模組強烈地損害PD1之維持( 圖 5B)。
MULTIseq揭露四重miR shRNA模組之靶控阻抑( 圖 6)。FAS及PTPN2之KD保留在四重構築物中。TGFBR2之KD在四聯體中亦係一致的。
基於pSMAD2/3磷酸化，TGFBR2-TGFBR2四聯體對TGF-ꞵ傳訊展現較強的時間抑制。如 圖 7中所顯示，TGFBR2-TGFBR2四重shRNA模組(左圖)展現因應TGF-ꞵ1之pSMAD2/3誘導減少。因此，R2-R2 shRNA四聯體(左圖)展現大於R2-R1四聯體(右圖)之對TGF-ꞵ1誘導之傳訊之抑制。此證實，納入靶向TGFBR之多種shRNA會增強靶敲低且提供優異的對阻抑性TGFB之抗性。
所選四重shRNA對TGFBR2之敲低抑制邏輯閘T細胞對靶細胞殺傷之TGF-ꞵ介導之阻抑( 圖 8)。TGFBR敲低可明顯拯救邏輯閘T細胞對靶細胞殺傷之TGF-β介導之阻抑。 實例 2 ： TGFRB1 及 TGFRB2 基因剔除之活體內表徵 材料 H1975 小鼠模型
H1975細胞經改造以共表現ALPG及MSLN，用於邏輯閘CAR T細胞之靶向。簡言之，藉由用aCD3/aCD28刺激泛T細胞且用含有GS94指導RNA、供體DNA模板及靶向TGFBR2之sgRNA (若適用)之Cas9 RNP電穿孔來產生具有TGFBR2基因剔除(KO)之ICT細胞。使細胞在IL-7及IL-15中擴增7天且在使用前冷凍保存。向小鼠皮下接種H1975 ALPG/MSLN細胞。在隨機化後，當異種移植物達到160 mm3時，向具有TGFBR2基因剔除且表現ALPG/MSLN邏輯閘(ALPG引發受體及MSLN CAR)之T細胞注射5×10 5個、2×10 6個或4×10 6個T細胞。使用不具TGFBR2基因剔除或ALPG/MSLN邏輯閘之WT T細胞作為對照。N = 7隻小鼠/組，1名供體。 786-O 小鼠模型
在NSG MHC I/II雙基因剔除小鼠中開發人類腎細胞癌(RCC)之TGF-B分泌模型。將經改造以表現ALPG及MSLN蛋白之2e6個768-O細胞注射至側腹中，且在腫瘤達到300 mm 3時對小鼠分期。藉由尾靜脈注射以3e5個細胞/小鼠之「應力劑量」水準投與經由CRISPR進行TGFBR2基因剔除且表現例示性ALPG/MSLN邏輯閘(ALPG引發受體及MSLN CAR)之ICT細胞。所用之對照T細胞係僅RNP細胞及表現邏輯閘及非編碼對照(NTC) sgRNA之經編輯T細胞。在第14天抽取外周血用於經編輯T細胞之PK分析。在ICT注射後40天、總腫瘤細胞注射後68天量測腫瘤體積。N = 7隻小鼠/組。 結果 H1975 小鼠模型
邏輯閘T細胞中之TGFBR2基因剔除在H1975異種移植物模型中產生抗腫瘤活性( 圖 9A)。TGFBR2基因剔除(KO)之邏輯閘T細胞誘導腫瘤生長抑制(TGI)。在相同細胞劑量下，5×10 5個經改造細胞之劑量在TGFBR2 KO與WT邏輯閘細胞之間產生TGI分離，此表明TGFBR2之KO增加T細胞對靶細胞之功效。
TGFBR2 KO在H1975模型中增強邏輯閘T細胞(ICT)之功效，其與FAS-PTPN2之shRNA敲低相當( 圖 9B)。 786-O 小鼠模型
未經編輯之細胞(僅RNP)未展示抗腫瘤效應，而僅邏輯閘T細胞展現一定的腫瘤控制。相比之下，具有邏輯閘及TFGBR2基因剔除(TGFBR2 sgRNA)之T細胞展現顯著增強之腫瘤控制( 圖 9C)。藉由流式細胞術對在ICT注射後第14天分離之頰出血樣品量測外周血中經編輯之ICT細胞且在實驗組之間進行比較。具有TGFBR2基因剔除之ICT細胞展示血液中顯著更高水準之ICT擴增( 圖 9D)。司徒頓氏t測試(Student’s t-test)；p＜0.05。因此，在分泌TGF-B之RCC模型中，TGFBR2基因剔除改良ICT功效。 實例 3 ： TGFRB1 及 TGFRB2 shRNA 與 FAS 及 PTPN2 shRNA 之組合之活體內表徵 材料及方法 786-O 小鼠模型
簡言之，藉由用aCD3/aCD28刺激泛T細胞且用含有GS94指導RNA及編碼ALPG/MSLN邏輯閘之供體DNA模板及所指示shRNA盒的Cas9 RNP電穿孔來產生ICT細胞。亦用靶向TGFBR2之sgRNA處理TGFBR2 KO樣品。使細胞在IL-7及IL-15中擴增7天且在使用前冷凍保存。
向小鼠皮下接種786-O ALPG/MSLN。在隨機化後，當異種移植物達到300 mm 3時，注射ICT。N = 7隻小鼠/組，1名供體。經由卡尺縱向量測腫瘤負荷。 H1975 小鼠模型
如上文所述產生ICT細胞。
向小鼠皮下接種H1975 ALPG/MSLN。在隨機化後，當異種移植物達到145 mm 3時，注射經改造之T細胞。T細胞經改造以表現ALPG/MSLN邏輯閘單獨與對照shRNA、或與FAS-PTPN2 shRNA或FAS-PTPN2-TGFBR2_23- TGBR1_10 shRNA、FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR1_13 shRNA、FAS-PTPN2- TGFBR2_23-TGBR2_16 shRNA或FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR2_37 shRNA之組合。使用TGFBR2基因剔除T細胞作為陽性對照。N = 7隻小鼠/組，1名供體，2個劑量。 結果
在786-O模型中，與WT T細胞及僅表現FAS-PTPN2 shRNA之T細胞相比，表現FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR1_10 shRNA、FAS-PTPN2- TGFBR2_23-TGBR1_13 shRNA、FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR2_16 shRNA或FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR2_37 shRNA之TGFBR2基因剔除T細胞展現增強的TGI ( 圖 10)。
在H1975活體內模型中，與WT T細胞及僅表現FAS-PTPN2 shRNA之T細胞相比，表現FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR1_10 shRNA、FAS-PTPN2- TGFBR2_23-TGBR1_13 shRNA、FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR2_16 shRNA或FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR2_37 shRNA之TGFBR2基因剔除T細胞展現增強的TGI。 圖 11A顯示用經改造T細胞治療後之平均腫瘤體積。 圖 11B顯示用邏輯閘及對照shRNA對照組治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11C顯示用FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR2_16 shRNA邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11D顯示用FAS-PTPN2邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11E顯示用FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR2_37 shRNA邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11F顯示用FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR1_13 shRNA邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11G顯示用FAS-PTPN2 -TGFBR2_23-TGBR1_10 shRNA邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11H顯示用TGFBR2基因剔除T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 實例 4 ：第二邏輯閘與 FAS 及 TGFBR2 shRNA 之組合之活體外表徵 材料及方法T細胞中之primeR/CAR ICT構築物表現
經由位點定向CRISPR介導之敲入(KI)產生靶向第二例示性primeR抗原(引發受體)及第二例示性CAR抗原之積體電路T (ICT)細胞。使用CD3-CD28珠粒將T細胞活化兩天。在第2天時，去除珠粒，然後將ICT轉基因遞送至T細胞基因體中之GS94位點。使用基於CRISPR之過程及電穿孔步驟實施轉基因整合，該步驟組合活化的T細胞、靶向GS94非編碼自體整合位點之CRISPR/Cas9 RNP及構成修復模板之質體DNA，以經由細胞DNA修復機構實現轉基因盒之***。
藉由複合單一指導RNA (sgRNA)與重組釀膿鏈球菌Cas9 (SpCas9)產生所用之GS94 CRISPR/Cas9 RNP。sgRNA含有將CRISPR/Cas9 RNP引導至GS94-轉基因整合位點之原間隔體序列。質體DNA修復模板含有ICT轉基因盒，側接有與側接整合位點之區域同源之450個鹼基對(bp)之序列，以實現修復介導之***。
所產生之各個ICT轉基因盒之圖提供於 圖 12中。ICT構築物1、2、3及4包含組成性表現之引發受體、誘導型CAR (形成邏輯閘或「LG」)、靶向FAS (1種shRNA)及TGFBR2 (2種shRNA)之組成性表現之shRNA以及合成路徑活化劑(SPA)。除FAS及TGFBR2以及替代SPA之LNGFR外，一種ICT亦包括靶向PTPN2之shRNA (LG 5 IC)。FAS及雙重TGFBR2 shRNA盒(三重shRNA)之序列提供於SEQ ID NO: 130中，而FAS/PTPN2/雙重TGFBR2 shRNA盒(四重shNRA)之序列提供於SEQ ID NO: 131中。包含邏輯閘以及shRNA及視情況存在之SPA之完整轉基因盒稱為邏輯閘1積體電路(「IC」或LG 1 IC)、邏輯閘2 IC (LG 2 IC)、邏輯閘3 IC (LG 3 IC)、邏輯閘4 IC (LG 4 IC)或邏輯閘5 IC (LG 5 IC)。
電穿孔後，使細胞在T細胞培養基中恢復並擴增7天。在指示時，陰性對照T細胞係使用在供體質體不存在下用核糖核蛋白(RNP)編輯T細胞之模擬物電穿孔製程產生，且稱為「RNP對照」。
使用基於流動之染色評價ICT細胞之轉基因KI以及PrimeR及CAR之表現。構築物在信號肽後分別在PrimeR及CAR之遠端細胞外部分上含有標籤myc及flag。用myc、flag及CD3抗體將活化後第7天時之ICT細胞在4c下染色30 min。活化後，將細胞在FACs緩衝液中洗滌且藉由流式細胞術運行。在針對活CD3+細胞對每一樣品進行閘控後，分析ICT之PrimeR及CAR表現。 CAR之ICT誘導
如上文所述自2名供體之T細胞產生ICT。在活化後第11天時，藉由Flag及Myc染色量測ICT之CAR及PrimeR表現。藉由將樣品中為PrimeR+或CAR+之T細胞%相加來量化KI%。在共培養設置之前，使用供體匹配之僅RNP細胞之添加將ICT正規化至相同的KI%。將1×10 7個ICT與1×10 7個靶細胞或培養基共培養72小時且使用flag染色進行染色以計算CAR+細胞%。在分析設置期間量測基底CAR表現。 shRNA敲低
ICT細胞含有靶向FAS及TGFBR2敲低之組成型shRNA模組，而不具轉基因KI之細胞(PrimeR陰性細胞)具有正常的FAS及TGFBR2表現且可用作內部對照。對ICT細胞之四種產物實施多色流式細胞術以表徵轉基因表現且評價FAS及TGFBR2之shRNA-miR敲低。在流式細胞術中使用針對CD4、CD8、CD95 (FAS)及TGFBR2之抗體。該組亦包括用於PrimeR偵測之rh-primeR抗原及用於CAR偵測之rhCAR抗原以及用於活細胞對死細胞染色之Zombi NIR。
使用流式細胞術確定ICT細胞中FAS及TGFBR2之表面蛋白敲低。用抗FAS及抗TGFBR2抗體對細胞進行染色，且量測PrimeR陽性及PrimeR陰性ICT細胞亞組之幾何平均螢光強度(gMFI)。數據代表4名供體。該式用於計算KD% (敲低%) = 100% (1- (MFI PrimeR+)/(MFI PrimeR-))。 合成路徑活化劑
合成路徑活化劑(SPA)組成性驅動STAT傳訊而無需外部細胞介素輸入。SPA可經設計以經由合理設計接合不同水準之多種STAT家族轉錄因子之活性。例示性I類SPA主要增加pSTAT3活性且例示性II類SPA主要增加pSTAT5活性。
為證實SPA模組驅動組成型STAT3磷酸化之能力，將在非刺激條件下表現SPA模組之ICT固定、透化且針對pSTAT3及myc抗原決定基標籤染色，以區分經編輯細胞與未經編輯之細胞(數據未顯示)。 細胞毒性、經改造之K562細胞
將表現包含邏輯閘1 IC、邏輯閘2 IC、邏輯閘3 IC、邏輯閘4 IC或邏輯閘5 IC的積體電路與shRNA及視情況地SPA之ICT細胞與K562_EFG、K562_EFG_CAR抗原、K562_EFG_primeR抗原或K562_EFG_CAR抗原_primeR抗原以不同的E:T比率在37℃下共培養72小時。培育後，使用螢光素酶報導基因分析量測細胞毒性。數據呈現為4名供體之平均值±標準偏差。 細胞介素分泌
為進一步評價表現邏輯閘1-5 IC之ICT細胞之特異性及功能，自K562靶細胞毒性共培養物(效應物:靶比率為1:1，72小時共培養物)收集上清液。培育後，在終點時收集上清液且使用Luminex分析量測細胞介素釋放水準。顯示4名供體之數據。 內源/經改造細胞中之細胞毒性
將表現LG 1-5 IC之ICT細胞與CAR抗原_primeR抗原細胞(細胞內源表現CAR抗原且經改造以表現primeR抗原)以不同的E:T比率在37℃下共培養72小時。培育後，使用螢光素酶報導基因分析量測細胞毒性。數據呈現為4名供體之平均值±標準偏差。在上文所述之螢光素酶讀出之前，在終點時收集上清液且使用Luminex分析量測細胞介素(B) IFN-g、(C) TNFa、(D) GM-CSF及(E) IL-2。顯示4名供體之數據。 混合共培養物細胞毒性
將表現邏輯閘1-5之ICT細胞與primeR抗原+/CAR抗原- HUVEC細胞及表現螢光素酶之primeR抗原-/ CAR抗原+細胞(K562-EFG- CAR抗原)以不同的E:T比率在37℃下共培養72小時。培育後，使用螢光素酶報導基因分析量測細胞毒性。數據來自一名正常供體。相對於RNP電穿孔之陰性對照使用螢光素酶報導基因分析評估ICT介導之CAR抗原+靶細胞殺傷。 結果
所有ICT細胞組成性表現PrimeR構築物，如藉由myc表現所顯示( 圖 13)。誘導型CAR不在ICT細胞中之基礎狀態下表現，如藉由缺乏FLAG表現所指示( 圖 13)，此表明引發受體尚未誘導CAR表現。
如 圖 14中所顯示，當與primeR抗原表現細胞株共培養時，ICT細胞誘導CAR表現。 圖 14中所顯示之數值係(CAR%) /(正規化至分析起始時之KI%)*100。因此，邏輯閘電路藉由在primeR不與其同源抗原結合下不表現CAR ( 圖 13)以及在primeR與其靶細胞上之同源配位體結合時誘導CAR表現來正確地發揮功能( 圖 14)。
將shRNA模組納入ICT細胞中顯示正規化至未經編輯之細胞(PrimeR-)之表現引發受體-CAR邏輯閘之ICT細胞(PrimeR+)中FAS及TGFBR2之較低MFI，此表明ICT PrimeR+細胞中FAS及TGFBR2之敲低( 圖 15)。
表現LG 1-5 IC之ICT展示與未經編輯之對照細胞(RNP)相比，對僅雙重CAR抗原及primeR抗原表現細胞之細胞毒性。 圖 16A顯示對既不表現CAR抗原亦不表現primeR抗原之母體K562細胞之細胞毒性， 圖 16B顯示對僅表現CAR抗原之K562細胞之細胞毒性， 圖 16C顯示對僅表現primeR抗原之K562細胞之細胞毒性，且 圖 16D顯示對表現primeR抗原及CAR抗原二者之K562細胞之細胞毒性。如 圖 16D中所顯示，與未經編輯之細胞(RNP)相比，ICT僅對表現primeR抗原及CAR抗原二者之細胞展現細胞毒性。
僅在取自靶細胞表現primeR抗原及CAR抗原二者之共培養物之上清液中觀察到表現LG 1-5 IC之ICT之IFN-γ產生( 圖 17)。細胞介素分析之結果與細胞毒性數據一致。總之，該等數據進一步證實，ICT活性由primeR抗原及CAR抗原之共表現來驅動。
表現LG 1-5 IC之ICT展示對表現內源CAR抗原之primeR抗原-med細胞株之活體外細胞毒性( 圖 18A)。在共培養後，ICT亦分泌細胞介素。 圖 18B顯示在與primeR抗原+/CAR抗原+細胞共培養後，ICT細胞之IFNγ、TNFα、GM-CSF及IL-2分泌。因此，表現LG 1-5 IC之ICT分泌細胞介素，且在primeR抗原存在下殺傷表現內源CAR抗原之ccRCC細胞株。
與HUVEC-primeR抗原之共培養物誘導ICT細胞上CAR蛋白之表現且確認CAR抗原+細胞之特異性殺傷( 圖 19)。因此，表現LG 1-5 IC之ICT能夠經由與primeR抗原+內皮細胞相互作用且隨後特異性接合並殺傷CAR抗原+腫瘤細胞來誘導CAR表現。因此，不希望受限於理論，可藉由與表現primeR抗原之內皮細胞結合來引發ICT以表現CAR，且然後殺傷CAR抗原+靶腫瘤細胞。
因此，開發利用兩種抗原之存在來觸發腫瘤細胞殺傷以改良CAR T細胞之治療指數的邏輯閘控ICT細胞，由此增強腫瘤特異性。針對在ccRCC之腫瘤新血管系統上發現之primeR抗原之表現對CAR之誘導進行閘控。在此實例中，未知PrimeR抗原及CAR抗原在正常組織中共表現。當引發受體(PrimeR)結合其同源抗原時，PrimeR接合觸發誘導CAR表現之轉錄因子之蛋白水解釋放。使用transwell分析確認血管引發之可行性，其中ICT由表現內皮細胞株之primeR抗原引發且然後遷移穿過transwell膜以殺傷表現CAR抗原之RCC細胞。
為進一步增加ICT細胞之效能及持久性，將靶向FAS及TGFBR2 (用於T細胞中之TGFB傳訊之受體)二者之shRNA盒***ICT中。在外源TGFb存在下實施之活體外慢性刺激分析期間，添加FAS/TGFBR2 shRNA增強表現primeR抗原× CAR抗原邏輯閘之T細胞之抗腫瘤活性(數據未顯示)。另外，含有FAS/TGFBR shRNA之ICT在多個異種移植物RCC模型中展示增強的抗腫瘤活性( 實例 5 、圖 22)。總而言之，該等結果證實，primeR抗原-CAR抗原ICT細胞可(i)選擇性靶向通常可能不會由習用CAR安全靶向之抗原；及(ii)克服腫瘤微環境中之多種阻抑機制。 實例 5 ：表現 FAS 及 TGFBR2 shRNA 之 primeR 及 CAR 邏輯閘 T 細胞之活體內功效 材料及方法A498 RCC功效模型
人類ccRCC細胞表現內源水準之CAR抗原且經改造以表現生理水準之primeR抗原。將2 ×10 6個primeR抗原+/CAR抗原+細胞接種至5-6月齡雌性NSG MHC I/II DKO小鼠之右背側腹中。在腫瘤接種後第35天，達到150 mm 3之平均腫瘤體積且將帶有腫瘤之動物隨機化至多個治療組中，使得每組之平均腫瘤體積在總平均值之10%內。向7隻小鼠/組靜脈內注射單一劑量之表現 實例 4中所述之五種LG ICT (LG 1 IC、LG 2 IC、LG 3 IC、LG 4 IC或LG 5 IC)中之一者之0.15 ×10 6個PrimeR+ ICT細胞、RNP或PBS。用自兩名不同之正常供體產生之ICT重複研究。每兩週記錄腫瘤體積及體重。根據式½* L*W 2計算腫瘤體積，其中L係腫瘤長度且W係腫瘤寬度。
血液藥物動力學展示ICT在第14天之擴增，然後截至T細胞注射後第42天完全收縮。使用流式細胞術及count bright珠粒進行T細胞量化/體積來量化小鼠血液中之PrimeR+ ICT以追蹤ICT之擴增。對平均值及SEM繪圖。 雙側腹模型
人類ccRCC 786-O細胞經改造以表現CAR及primeR抗原或僅CAR。將2 ×10 6個786-O-CAR+及786-O-CAR+- primeR抗原+細胞分別接種至5-6月齡雌性NSG MHC I/II DKO小鼠之左及右背側腹中。在腫瘤接種後第35天，在每一側腹上達到150-200 mm 3之平均腫瘤體積且將帶有腫瘤之動物隨機化至多個治療組中，使得右側腹上每組之平均腫瘤體積在總平均值之10%內。向7隻小鼠/組靜脈內注射單一劑量之0.25 ×10 6個或1 ×10 6個PrimeR+ ICT細胞、組成型CAR T細胞、RNP或PBS對照。每兩週記錄腫瘤體積及體重。根據式½* L*W 2計算腫瘤體積，其中L係腫瘤長度且W係腫瘤寬度。(B)僅786-℃AR抗原側腹上之腫瘤體積(左圖)，及(C) 786-O-CAR+/primeR抗原+側腹上之腫瘤體積(右圖)。數據代表使用7隻小鼠/組之單一供體研究，對平均值及SEM繪圖。 結果A498 RCC功效模型
表現LG 1-5 IC之ICT在ccRCC模型中顯示腫瘤消除。 圖 20A及 圖 20D顯示用自供體1 ( 圖 20A-C)或供體2 ( 圖 20D-F)之T細胞產生之表現邏輯閘1-5之ICT、RNP或PBS治療之小鼠中腫瘤植入後之腫瘤體積。 圖 20B及 圖 20E顯示在接種後第12天之總T細胞及ICT擴增，然後截至第21天收縮。 圖 20C及 圖 20F顯示在第12天及第21天時表現引發受體之總T細胞。在兩個重複中，ICT細胞展示小鼠中顯著的腫瘤生長抑制(P ＜0.05)。 雙側腹模型
表現LG 1-5 IC之ICT在雙側腹模型中顯示特異性( 圖 21A-B)。在雙陽性primeR抗原+/CAR抗原+側腹( 圖 21B)中觀察到大於僅單陽性CAR側腹( 圖 21A)之腫瘤生長抑制(TGI)。因此，雙側腹異種移植物模型顯示，邏輯閘控電路(ICT)更具選擇性地殺傷表現CAR抗原及primeR抗原二者之腫瘤，但不殺傷僅表現CAR抗原之腫瘤。 實例 6 ：具有 TGFBR 敲低或合成路徑活化劑之 primeR 及 CAR 邏輯閘 T 細胞之合成及表徵
構築且表徵表現primeR及CAR邏輯閘之T細胞(亦稱為積體電路T細胞(ICT))以及合成路徑活化劑及FAS及TGFBR shRNA或FAS、TGFBR2及PTPN2 shRNA。結果提供於 圖 22 及圖 23中。 圖 22顯示，TGFBR敲低保護ICT細胞免於TGFβ介導之活體外抑制。 圖 23顯示，ICT細胞係活體內腎細胞癌模型中之強效及特異性細胞療法。在如 實例 5中所述之雙側腹模型中，表現CAR及primeR邏輯閘之ICT細胞展示對表現CAR抗原及primeR抗原二者之腫瘤細胞的顯著及特異性腫瘤減少。ICT細胞亦比用作基準之習用CAR T細胞更強效。 實例 7 ： RCC 模型中表現 FAS 及 TGFBR2 shRNA 之 primeR 及 CAR 邏輯閘 T 細胞之活體內功效 材料及方法786-O ccRCC模型
將經改造以表現ALPG及MSLN蛋白之2e6個768-O細胞注射至小鼠側腹中，且當腫瘤達到300 mm 3時對小鼠分期。在腫瘤接種後28天，藉由尾靜脈注射以3e5個細胞/小鼠之應力劑量投與表現例示性相應primeR+CAR邏輯閘及四種所選四重shRNA (FAS/PTPN2/TGFBR2/TGFBR2 shRNA，參見 實例 3及 圖 10)中之一者之ICT。在腫瘤接種後第42天時收集血液用於PK分析(數據未顯示)。在第28天時T細胞注射後之62天內量測腫瘤體積，持續總共90天。所用對照T細胞係未經編輯的(RNP)或表現邏輯閘及螢光素酶(雙重luc)、FAS/PTPN2 shRNA模組之ICT，或經由CRISPR對FAS/PTPN2/TFGBR2進行基因剔除。N=7。 A498 ccRCC模型
開發出另一活體內RCC模型來評價含有TGFBR2 shRNA之ICT之功效。A498 ccRCC細胞表現內源水準之第二例示性CAR抗原且經改造以表現生理水準之第二例示性primeR抗原。將經改造之A498細胞注射至小鼠側腹中且當腫瘤達到150 mm 3時對小鼠分期。在腫瘤接種後25天，藉由尾靜脈注射以3e5個細胞/小鼠之應力劑量投與表現primeR+CAR邏輯閘及四重shRNA (FAS/PTPN2/TGFBR2/TGFBR2 shRNA，SEQ ID NO: 131)以及 實例 4中所述之例示性SPA之ICT。在腫瘤接種後第39天時收集血液用於PK分析(數據未顯示)。在T細胞注射後28天內量測腫瘤體積，持續總共54天。所用對照T細胞係未經編輯之T細胞(RNP)或表現邏輯閘及FAS/PTPN2 shRNA模組及SPA之ICT。N=7。 結果786-O ccRCC模型
在786-O ccRCC模型中，與對照T細胞相比，含有任一四重shRNA盒之ICT展示顯著改良之腫瘤清除率( 圖 24)。與對照細胞及表現四重shRNA之ICT相比，僅表現FAS/PTPN2 shRNA之ICT展示中間水準之腫瘤清除率。因此，與僅包含FAS/PTPN2 shRNA之ICT相比，將TGFBR2 shRNA納入ICT中可增加腫瘤清除率。僅表現邏輯閘之ICT在786-O RCC模型中在研究中所用之3e5應力劑量下未展示抗腫瘤效應。未經編輯之T細胞在786-O RCC模型中未展示抗腫瘤效應。 A498 ccRCC模型
在A498 ccRCC模型中，與對照T細胞相比，含有任一四重shRNA盒之ICT展示顯著改良之腫瘤清除率及強效抗腫瘤反應( 圖 25)。與對照細胞相比，僅表現FAS/PTPN2 shRNA之ICT展示改良之腫瘤清除率，但腫瘤減少不如表現四重shRNA之細胞顯著。因此，與僅包含FAS/PTPN2 shRNA之ICT相比，將TGFBR2 shRNA納入ICT中可增加腫瘤清除率。未經編輯之T細胞在786-O RCC模型中未展示抗腫瘤效應。
因此，本數據顯示在分泌TGF-B之兩種不同RCC異種移植物模型中，TFGBR2之shRNA敲低增強抗腫瘤功效。
儘管已參考較佳實施例及各個替代實施例具體顯示並闡述本發明，但熟習相關技術者應理解，可在不背離本發明之精神及範圍的情況下對其中之形式及細節作出各種變化。
本說明書主體內所引用之所有參考文獻、授權專利及專利申請案之全文出於所有目的皆以引用方式併入本文中。 非正式序列表
SEQ ID NO 名稱 序列
1 TGF-β受體1 (TGFBR1) cDNA ggcggctagggaggtggggcgaggcgaggtttgctggggtgaggcagcggcgcggccgggccgggccgggccacaggcggtggcggcgggaccatggaggcggcggTCGCTGCTCCGCGTCCCCGGCTGCTCCTCCTCGTGCTggcggcggcggcggcggcggcggcggcgctgctcccgggggcgacggCGTTACAGTGTTTCTGCCACCTCTGTACAAAAGACAATTTTACTTGTGTGACAGATGGGCTCTGCTTTGTCTCTGTCACAGAGACCACAGACAAAGTTATACACAACAGCATGTGTATAGCTGAAATTGACTTAATTCCTCGAGATAGGCCGTTTGTATGTGCACCCTCTTCAAAAACTGGGTCTGTGACTACAACATATTGCTGCAATCAGGACCATTGCAATAAAATAGAACTTCCAACTACTGTAAAGTCATCACCTGGCCTTGGTCCTGTGGAACTGGCAGCTGTCATTGCTGGACCAGTGTGCTTCGTCTGCATCTCACTCATGTTGATGGTCTATATCTGCCACAACCGCACTGTCATTCACCATCGAGTGCCAAATGAAGAGGACCCTTCATTAGATCGCCCTTTTATTTCAGAGGGTACTACGTTGAAAGACTTAATTTATGATATGACAACGTCAGGTTCTGGCTCAGGTTTACCATTGCTTGTTCAGAGAACAATTGCGAGAACTATTGTGTTACAAGAAAGCATTGGCAAAGGTCGATTTGGAGAAGTTTGGAGAGGAAAGTGGCGGGGAGAAGAAGTTGCTGTTAAGATATTCTCCTCTAGAGAAGAACGTTCGTGGTTCCGTGAGGCAGAGATTTATCAAACTGTAATGTTACGTCATGAAAACATCCTGGGATTTATAGCAGCAGACAATAAAGACAATGGTACTTGGACTCAGCTCTGGTTGGTGTCAGATTATCATGAGCATGGATCCCTTTTTGATTACTTAAACAGATACACAGTTACTGTGGAAGGAATGATAAAACTTGCTCTGTCCACGGCGAGCGGTCTTGCCCATCTTCACATGGAGATTGTTGGTACCCAAGGAAAGCCAGCCATTGCTCATAGAGATTTGAAATCAAAGAATATCTTGGTAAAGAAGAATGGAACTTGCTGTATTGCAGACTTAGGACTGGCAGTAAGACATGATTCAGCCACAGATACCATTGATATTGCTCCAAACCACAGAGTGGGAACAAAAAGGTACATGGCCCCTGAAGTTCTCGATGATTCCATAAATATGAAACATTTTGAATCCTTCAAACGTGCTGACATCTATGCAATGGGCTTAGTATTCTGGGAAATTGCTCGACGATGTTCCATTGGTGGAATTCATGAAGATTACCAACTGCCTTATTATGATCTTGTACCTTCTGACCCATCAGTTGAAGAAATGAGAAAAGTTGTTTGTGAACAGAAGTTAAGGCCAAATATCCCAAACAGATGGCAGAGCTGTGAAGCCTTGAGAGTAATGGCTAAAATTATGAGAGAATGTTGGTATGCCAATGGAGCAGCTAGGCTTACAGCATTGCGGATTAAGAAAACATTATCGCAACTCAGTCAACAGGAAGGCATCAAAATGTAATTCTACAGCTTTGCCTGAACTCTCCTTTTTTCTTCAGATCTGCTCCTGGGTTTTAATTTGGGAGGTCAATTGTTCTACCTCACTGAGAGGGAACAGAAGGATATTGCTTCCTTTTGCAGCAGTGTAATAAAGTCAATTAAAAACTTCCCAGGATTTCTTTGGACCCAGGAAACAGCCATGTGGGTCCTTTCTGTGCACTATGAACGCTTCTTTCCCAGGACAGAAAATGTGTAGTCTACCTTTATTTTTTATTAACAAAACTTGTTTTTTAAAAAGATGATTGCTGGTCTTAACTTTAGGTAACTCTGCTGTGCTGGAGATCATCTTTAAGGGCAAAGGAGTTGGATTGCTGAATTACAATGAAACATGTCTTATTACTAAAGAAAGTGATTTACTCCTGGTTAGTACATTCTCAGAGGATTCTGAACCACTAGAGTTTCCTTGATTCAGACTTTGAATGTACTGTTCTATAGTTTTTCAGGATCTTAAAACTAACACTTATAAAACTCTTATCTTGAGTCTAAAAATGACCTCATATAGTAGTGAGGAACATAATTCATGCAATTGTATTTTGTATACTATTATTGTTCTTTCACTTATTCAGAACATTACATGCCTTCAAAATGGGATTGTACTATACCAGTAAGTGCCACTTCTGTGTCTTTCTAATGGAAATGAGTAGAATTGCTGAAAGTCTCTATGTTAAAACCTATAGTGTTTGAATTCAAAAAGCTTATTTATCTGGGTAACCCAAACTTTTTCTGTTTTGTTTTTGGAAGGGTTTTTGTGGTATGTCATTTGGTATTCTATTCTGAAAATGCCTTTCTCCTACCAAAATGTGCTTAAGCCACTAAAGAAATGAAGTGGCATTAATTAGTAAATTATTAGCATGGTCATGTTTGAATATTCTCACATCAAGCTTTTGCATTTTAATTGTGTTGTCTAAGTATACTTTTAAAAAATCAAGTGGCACTCTAGATGCTTATAGTACTTTAATATTTGTAGCATACAGACTAATTTTTCTAAAAGGGAAAGTCTGTCTAGCTGCTTGTGAAAAGTTATGTGGTATTCTGTAAGCCATTTTTTTCTTTATCTGTTCAAAGACTTATTTTTTAAGACATGAATTACATTTAAAATTAGAATATGGTTAATATTAAATAATAGGCCTTTTTCTAGGAAGGCGAAGGTAGTTAATAATTTGAATAGATAACAGATGTGCAAGAAAGTCACATTTGTTATGTATGTAGGAGTAAACGTTCGGTGGATCCTCTGTCTTTGTAACTGAGGTTAGAGCTAGTGTGGTTTTGAGGTCTCACTACACTTTGAGGAAGGCAGCTTTTAATTCAGTGTTTCCTTATGTGTGCGTACATTGCAACTGCTTACATGTAATTTATGTAATGCATTCAGTGCACCCTTGTTACTTGGGAGAGGTGGTAGCTAAAGAACATTCTGAGTATAGGTTTTTCTCCATTTACAGATGTCTTTGGTCAAATATTGAAAGCAAACTTGTCATGGTCTTCTTACATTAAGTTGAAACTAGCTTATAATAACTGGTTTTTACTTCCAATGCTATGAAGTCTCTGCAGGGCTTTTACAGTTTTCGAAGTCCTTTTATCACTGTGATCTTATTCTGAGGGGAGAAAAAACTATCATAGCTCTGAGGCAAGACTTCGACTTTATAGTGCTATCAGTTCCCCGATACAGGGTCAGAGTAACCCATACAGTATTTTGGTCAGGAAGAGAAAGTGGCCATTTACACTGAATGAGTTGCATTCTGATAATGTCTTATCTCTTATACGTAGAATAAATTTGAAAGACTATTTGATCTTAAAACCAAAGTAATTTTAGAATGAGTGACATATTACATAGGAATTTAGTGTCAATTTCATGTGTTTAAAAACATCATGGGAAAAATGCTTAGAGGTTACTATTTTGACTACAAAGTTGAGTTTTTTTCTGTAGTTACCATAATTTCATTGAAGCAAATGAATGAGTTTGAGAGGTTTGTTTTTATAGTTGTGTTGTATTACTTGTTTAATAATAATCTCTAATTCTGTGATCAGGTACtttttttgtgggggttttttttttgtttttttttttttgttgttgtttttGGGCCATTTCTAAGCCTACCAGATCTGCTTTATGAAATCCAGGGGACCAATGCATTTTATCACTAAAACTATTTTTATATAATTTTAAGAATATACCAAAAGTTGTCTGATTTAAAGTTGTAATACATGATTTCTCACTTTCATGTAAGGTTATCCACTTTTGCTGAAGATATTTTTTATTGAATCAAAGATTGAGTTACAATTATACTTTTCTTACCTAAGTGGATAAAATGTACTTTTGATGAATCAGGGAATTTTTTTAAAGTTGGAGTTTAGTTCTAAATTGACTTTACGTATTACTGCAGTTAATTCCTTTTTTGGCTAGGGATGGTTTGATAAACCACAATTGGCTGATATTGAAAATGAAAGAAACTTAAAAGGTGGGATGGATCATGATTACTGTCGATAACTGCAGATAAATTTGATTAGAGTAATAATTTTGTCATTTAAAAACACAGTTGTTTATACTGCCCATCCTAGGATGCTCACCTTCCAAGATTCAACGTGGCTAAAACATCTTCTGGTAAATTGTGCGTCCATATTCATTTTGTCAGTAGCCAGGAGAAATGGGGATGGGGGAAATACGACTTAGTGAGGCATAGACATCCCTGGTCCATCCTTTCTGTCTCCAGCTGTTTCTTGGAACCTGCTCTCCTGCTTGCTGGTCCCTGACGCAGAGACCGTTGCCTCCCCCACAGCCGTTTGACTGAAGGCTGCTCTGGAGACCTAGAGTAAAACGGCTGATGGAAGTTGTGGGACCCACTTCCATTTCCTTCAGTCATTAGAGGTGGAAGGGAGGGGTCTCCAAGTTTGGAGATTGAGCAGATGAGGCTTGGGATGCCCCTGCTTTGACTTCAGCCATGGATGAGGAGTGGGATGGCAGCAAGGTGGCTCCTGTGGCAGTGGAGTTGTGCCAGAAACAGTGGCCAGTTGTATCGCCTATAAGACAGGGTAAGGTCTGAAGAGCTGAGCCTGTAATTCTGCTGTAATAATGATAGTGCTCAAGAAGTGCCTTGAGTTGGTGTACAGTGCCATGGCCATCAAGAATCCCAGATTTCAGGTTTTATTACAAAATGTAAGTGGTCACTTGGCGATTTTGTAGTACATGCATGAGTTACCTTTTTTCTCTATGTCTGAGAACTGTCAGATTAAAACAAGATGGCAAAGAGATCGTTAGAGTGCACAACAAAATCACTATCCCATTAGACACATCATCAAAAGCTTATTTTTATTCTTGCACTGGAAGAATCGTAAGTCAACTGTTTCTTGACCATGGCA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2 TGF-β受體2 (TGFBR2) cDNA ACTCGCGCGCACGGAGCGACGACACCCCCGCGCGTGCACCCGCTCGGGACAGGAGCCGGACTCCTGTGCAGCTTCCCTCGGCCGCCGGGGGCCTCCCCGCGCCTCGCCGGCCTCCAGGCCCCCTCCTGGCTGGCGAGCGGGCGCCACATCTGGCCCGCACATCTGCGCTGCCGGCCCGGCGCGGGGTCCGGAGAGGGCGCGGCGCGGAGGCGCAGCCAGGGGTCCGGGAAGGCGCCGTCCGCTGCGCTGGGGGCTCGGTCTATGACGAGCAGCGGGGTCTGCCATGGGTCGGGGGCTGCTCAGGGGCCTGTGGCCGCTGCACATCGTCCTGTGGACGCGTATCGCCAGCACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGGTTAATAACGACATGATAGTCACTGACAACAACGGTGCAGTCAAGTTTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCCACCTGTGACAACCAGAAATCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCACAGGAAGTCTGTGTGGCTGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACACTAGAGACAGTTTGCCATGACCCCAAGCTCCCCTACCATGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCTCCAAAGTGCATTATGAAGGaaaaaaaaaaGCCTGGTGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGTAGCTCTGATGAGTGCAATGACAACATCATCTTCTCAGAAGAATATAACACCAGCAATCCTGACTTGTTGCTAGTCATATTTCAAGTGACAGGCATCAGCCTCCTGCCACCACTGGGAGTTGCCATATCTGTCATCATCATCTTCTACTGCTACCGCGTTAACCGGCAGCAGAAGCTGAGTTCAACCTGGGAAACCGGCAAGACGCGGAAGCTCATGGAGTTCAGCGAGCACTGTGCCATCATCCTGGAAGATGACCGCTCTGACATCAGCTCCACGTGTGCCAACAACATCAACCACAACACAGAGCTGCTGCCCATTGAGCTGGACACCCTGGTGGGGAAAGGTCGCTTTGCTGAGGTCTATAAGGCCAAGCTGAAGCAGAACACTTCAGAGCAGTTTGAGACAGTGGCAGTCAAGATCTTTCCCTATGAGGAGTATGCCTCTTGGAAGACAGAGAAGGACATCTTCTCAGACATCAATCTGAAGCATGAGAACATACTCCAGTTCCTGACGGCTGAGGAGCGGAAGACGGAGTTGGGGAAACAATACTGGCTGATCACCGCCTTCCACGCCAAGGGCAACCTACAGGAGTACCTGACGCGGCATGTCATCAGCTGGGAGGACCTGCGCAAGCTGGGCAGCTCCCTCGCCCGGGGGATTGCTCACCTCCACAGTGATCACACTCCATGTGGGAGGCCCAAGATGCCCATCGTGCACAGGGACCTCAAGAGCTCCAATATCCTCGTGAAGAACGACCTAACCTGCTGCCTGTGTGACTTTGGGCTTTCCCTGCGTCTGGACCCTACTCTGTCTGTGGATGACCTGGCTAACAGTGGGCAGGTGGGAACTGCAAGATACATGGCTCCAGAAGTCCTAGAATCCAGGATGAATTTGGAGAATGTTGAGTCCTTCAAGCAGACCGATGTCTACTCCATGGCTCTGGTGCTCTGGGAAATGACATCTCGCTGTAATGCAGTGGGAGAAGTAAAAGATTATGAGCCTCCATTTGGTTCCAAGGTGCGGGAGCACCCCTGTGTCGAAAGCATGAAGGACAACGTGTTGAGAGATCGAGGGCGACCAGAAATTCCCAGCTTCTGGCTCAACCACCAGGGCATCCAGATGGTGTGTGAGACGTTGACTGAGTGCTGGGACCACGACCCAGAGGCCCGTCTCACAGCCCAGTGTGTGGCAGAACGCTTCAGTGAGCTGGAGCATCTGGACAGGCTCTCGGGGAGGAGCTGCTCGGAGGAGAAGATTCCTGAAGACGGCTCCCTAAACACTACCAAATAGCTCTTCTGGGGCAGGCTGGGCCATGTCCAAAGAGGCTGCCCCTCTCACCAAAGAACAGAGGCAGCAGGAAGCTGCCCCTGAACTGATGCTTCCTGGAAAACCAAGGGGGTCACTCCCCTCCCTGTAAGCTGTGGGGATAAGCAGAAACAACAGCAGCAGGGAGTGGGTGACATAGAGCATTCTATGCCTTTGACATTGTCATAGGATAAGCTGTGTTAGCACTTCCTCAGGAAATGAGATTGATTTTTACAATAGCCAATAACATTTGCACTTTATTAATGCCTGtatataaatatgaatagctatgttttatatatatatatatatatctatatatgtctatagctctatatatataGCCATACCTTGAAAAGAGACAAGGAAAAACATCAAATATTCCCAGGAAATTGGTTTTATTGGAGAACTCCAGAACCAAGCAGAGAAGGAAGGGACCCATGACAGCATTAGCATTTGACAATCACACATGCAGTGGTTCTCTGACTGTAAAACAGTGAACTTTGCATGAGGAAAGAGGCTCCATGTCTCACAGCCAGCTATGACCACATTGCACTTGCTTTTGCAAAATAATCATTCCCTGCCTAGCACTTCTCTTCTGGCCATGGAACTAAGTACAGTGGCACTGTTTGAGGACCAGTGTTCCCGGGGTTCCTGTGTGCCCTTATTTCTCCTGGACTTTTCATTTAAGCTCCAAGCCCCAAATCTGGGGGGCTAGTTTAGAAACTCTCCCTCAACCTAGTTTAGAAACTCTACCCCATCTTTAATACCTTGAATGTTTTGAACCCCACTTTTTACCTTCATGGGTTGCAGAAAAATCAGAACAGATGTCCCCATCCATGCGATTGCCCCACCATCTACTAATGAAAAATTGTTCTTTTTTTCATCTTTCCCCTGCACTTATGTTACTATTCTCTGCTCCCAGCCTTCATCCTTTTCTAAAAAGGAGCAAATTCTCACTCTAGGCTTTATCGTGTTTACTTTTTCATTACACTTGACTTGATTTTCTAGTTTTCTATACAAACACCAATGGGTTCCATCTTTCTGGGCTCCTGATTGCTCAAGCACAGTTTGGCCTGATGAAGAGGATTTCAACTACACAATACTATCATTGTCAGGACTATGACCTCAGGCACTCTAAACATAtgttttgtttggtcagcacagcgtttcaaaaagtgaagccactttataaatatttggagattttgcaggaaaatctggatccccagGTAAGGATAGCAGATGGTTTTCAGTTATCTCCAGTCCACGTTCACAAAATGTGAAGGTGTGGAGACACTTACAAAGCTGCCTCACTTCTCACTGTAAACATTAGCTCTTTCCACTGCCTACCTGGACCCCAGTCTAGGAATTAAATCTGCACCTAACCAAGGTCCCTTGTAAGAAATGTCCATTCAAGCAGTCATTCTCTGGGTATATAATATGATTTTGACTACCTTATCTGGTGTTAAGATTTGAAGTTGGCCTTTTATTGGACTAAAGGGGAACTCCTTTAAGGGTCTCAGTTAGCCCAAGTTTCTTTTGCTTATATGTTAATAGTTTTACCCTCTGCATTGGAGAGAGGAGTGCTTTACTCCAAGAAGCTTTCCTCATGGTTACCGTTCTCTCCATCATGCCAGCCTTCTCAACCTTTGCAGAAATTACTAGAGAGGATTTGAATGTGGGACACAAAGGTCCCATTTGCAGTTAGAAAATTTGTGTCCACAAGGACAAGAACAAAGTATGAGCTTTAAAACTCCATAGGAAACTTGTTAATCAACAAAGAAGTGTTAATGCTGCAAGTAATCTCTTTTTTAAAACTTTTTGAAGCTACTTATTTTCAGCCAAATAGGAATATTAGAGAGGGACTGGTAGTGAGAATATCAGCTCTGTTTGGATGGTGGAAGGTCTCATTTTATTGAGATTTTTAAGATACATGCAAAGGTTTGGAAATAGAACCTCTAGGCACCCTCCTCAGTGTGGGTGGGCTGAGAGTTAAAGACAGTGTGGCTGCAGTAGCATAGAGGCGCCTAGAAATTCCACTTGCACCGTAGGGCATGCTGATACCATCCCAATAGCTGTTGCCCATTGACCTCTAGTGGTGAGTTTCTAGAATACTGGTCCATTCATGAGATATTCAAGATTCAAGAGTATTCTCACTTCTGGGTTATCAGCATAAACTGGAATGTAGTGTCAGAGGATACTGTGGCTTGTTTTGTTTATGtttttttttCTTATTCAAGAAAAAAGACCAAGGAATAACATTCTGTAGTTCCTAAAAATACTGACTTTTTTCACTACTATACATAAAGGGAAAGTTTTATTCTTTTATGGAACACTTCAGCTGTACTCATGTATTAAAATAGGAATGTGAATGCTATATACTCTTTTTATATCAAAAGTCTCAAGCACTTATTTTTATTCTATGCATTGTTTGTCTTTTACATAAATAAAATGTTTATTAGATTGAATAAAGCAAAATACTCAGGTGAGCATCCTGCCTCCTGTTCCCATTCCTAGTAGCTAAA
3 FAS mRNA NCBI NM_000043.6 CTCTTCTCCCGCGGGTTGGTGGACCCGCTCAGTACGGAGTTGGGGAAGCTCTTTCACTTCGGAGGATTGCTCAACAACCATGCTGGGCATCTGGACCCTCCTACCTCTGGTTCTTACGTCTGTTGCTAGATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGCCCAAGTGACTGACATCAACTCCAAGGGATTGGAATTGAGGAAGACTGTTACTACAGTTGAGACTCAGAACTTGGAAGGCCTGCATCATGATGGCCAATTCTGCCATAAGCCCTGTCCTCCAGGTGAAAGGAAAGCTAGGGACTGCACAGTCAATGGGGATGAACCAGACTGCGTGCCCTGCCAAGAAGGGAAGGAGTACACAGACAAAGCCCATTTTTCTTCCAAATGCAGAAGATGTAGATTGTGTGATGAAGGACATGGCTTAGAAGTGGAAATAAACTGCACCCGGACCCAGAATACCAAGTGCAGATGTAAACCAAACTTTTTTTGTAACTCTACTGTATGTGAACACTGTGACCCTTGCACCAAATGTGAACATGGAATCATCAAGGAATGCACACTCACCAGCAACACCAAGTGCAAAGAGGAAGGATCCAGATCTAACTTGGGGTGGCTTTGTCTTCTTCTTTTGCCAATTCCACTAATTGTTTGGGTGAAGAGAAAGGAAGTACAGAAAACATGCAGAAAGCACAGAAAGGAAAACCAAGGTTCTCATGAATCTCCAACTTTAAATCCTGAAACAGTGGCAATAAATTTATCTGATGTTGACTTGAGTAAATATATCACCACTATTGCTGGAGTCATGACACTAAGTCAAGTTAAAGGCTTTGTTCGAAAGAATGGTGTCAATGAAGCCAAAATAGATGAGATCAAGAATGACAATGTCCAAGACACAGCAGAACAGAAAGTTCAACTGCTTCGTAATTGGCATCAACTTCATGGAAAGAAAGAAGCGTATGACACATTGATTAAAGATCTCAAAAAAGCCAATCTTTGTACTCTTGCAGAGAAAATTCAGACTATCATCCTCAAGGACATTACTAGTGACTCAGAAAATTCAAACTTCAGAAATGAAATCCAAAGCTTGGTCTAGAGTGAAAAACAACAAATTCAGTTCTGAGTATATGCAATTAGTGTTTGAAAAGATTCTTAATAGCTGGCTGTAAATACTGCTTGGTTTTTTACTGGGTACATTTTATCATTTATTAGCGCTGAAGAGCCAACATATTTGTAGATTTTTAATATCTCATGATTCTGCCTCCAAGGATGTTTAAAATCTAGTTGGGAAAACAAACTTCATCAAGAGTAAATGCAGTGGCATGCTAAGTACCCAAATAGGAGTGTATGCAGAGGATGAAAGATTAAGATTATGCTCTGGCATCTAACATATGATTCTGTAGTATGAATGTAATCAGTGTATGTTAGTACAAATGTCTATCCACAGGCTAACCCCACTCTATGAATCAATAGAAGAAGCTATGACCTTTTGCTGAAATATCAGTTACTGAACAGGCAGGCCACTTTGCCTCTAAATTACCTCTGATAATTCTAGAGATTTTACCATATTTCTAAACTTTGTTTATAACTCTGAGAAGATCATATTTATGTAAAGTATATGTATTTGAGTGCAGAATTTAAATAAGGCTCTACCTCAAAGACCTTTGCACAGTTTATTGGTGTCATATTATACAATATTTCAATTGTGAATTCACATAGAAAACATTAAATTATAATGTTTGACTATTATATATGTGTATGCATTTTACTGGCTCAAAACTACCTACTTCTTTCTCAGGCATCAAAAGCATTTTGAGCAGGAGAGTATTACTAGAGCTTTGCCACCTCTCCATTTTTGCCTTGGTGCTCATCTTAATGGCCTAATGCACCCCCAAACATGGAAATATCACCAAAAAATACTTAATAGTCCACCAAAAGGCAAGACTGCCCTTAGAAATTCTAGCCTGGTTTGGAGATACTAACTGCTCTCAGAGAAAGTAGCTTTGTGACATGTCATGAACCCATGTTTGCAATCAAAGATGATAAAATAGATTCTTATTTTTCCCCCACCCCCGAAAATGTTCAATAATGTCCCATGTAAAACCTGCTACAAATGGCAGCTTATACATAGCAATGGTAAAATCATCATCTGGATTTAGGAATTGCTCTTGTCATACCCCCAAGTTTCTAAGATTTAAGATTCTCCTTACTACTATCCTACGTTTAAATATCTTTGAAAGTTTGTATTAAATGTGAATTTTAAGAAATAATATTTATATTTCTGTAAATGTAAACTGTGAAGATAGTTATAAACTGAAGCAGATACCTGGAACCACCTAAAGAACTTCCATTTATGGAGGATTTTTTTGCCCCTTGTGTTTGGAATTATAAAATATAGGTAAAAGTACGTAATTAAATAATGTTTTTGGTATTTCTGGTTTTCTCTTTTTTGGTAGGGGCTTGCTTTTTGGTTTTGTCTTCCTTTTCTCTAACTGATGCTAAATATAACTTGTCTTTAATGCTTCTTGGATCCCTTAGAAGGTACTTCCTTTTTAACCTTAACCCTTTTAGTAGTTAAATAATTATTTCCATAGGTTGCTATTGCCAAGAAGACCTCTTCCAAACAGCACATGATTATTCGTCAAACAGTTTCGTATTCCAGATACTGGAATGTGGATAAGAAAGTATACATTTCAAGGGGTAGGTTTTATTATTAAGAAAGCCAAATGAGGATTTTGAAATATTCTTTCCTGCATATTATCCATTCTAGCTACATGCTGGCCAGTGGGCCACCTTTCTTTTCTGCAATTTAATGCTAGTAATATATTCTATTTAACCCATGAGTCCCAAAGTATTAGCATTTCAACATGTAAGCATGTCGGTAAGATAGTTGTGCTTTGCTTAGGGTTCCCTCCTGTGTTATGGTCTGGAAAGTGTCTTTAGGCAGAAAGTCTGAGTGATCACAGGGTTCACTCATTAATTTCTCTTTTCTGAGCCATCATAGTCTGTGCTGTCTGCTCTCCAGTTTTCTATTTCTAGACAGAAGTAGGGCAAGTTAGGTACTAGTTATTCTTCATGGCCAGAAGTGCAAGTTCTACTTTGCAAGACAAGATTAAGTTAGAGAACACCCTATTCCACTTTGGTGAACTCAGAGCAAGAACTTTGAGTTCCTTTGGGAGGAAGACAGTGGAGAAGTCTTTGTACTTGGTGATGTGGTTTTTTTCCTCATGGCTTCACCTAGTGGCCCCAAGCATGACTTCTCCCATGTCAATGAGCACAGCCACATTCCCGAGTTGAGGTGACCCCACGGTCCAGAATCATCCTCATTCTGGTGAACCTGGTTCTCTTTGTGGTGGGCATACTGGGTAGGAGAATCACCCAAAGGTCACCCATGAGCTGCAGAAAAAAAGGCTATTTGCAGAAGGAGCTCACAGATCACATTGAAAGCATTGCATATTCAAACATCTTGGTCTTCTTTATTGGCATGCCCACAGGGTCTTCTGACCTCTGATTAGATCAGACACTTTTTAGATATTGAATCATCAGTTTCTGTACAACTATCTGAATAAGGTATATAATCAATGAAATTTAGAATTTTTTTCTATGCTTACTCCTGATTGGTAATTTGTTTGGGTTTAGAATTCTATACAAGGCCATTTGTAATTTTCCTCAGCACTTTAAAAATATTAAACCATGTTTTCTTAA
4 PTPN2 mRNA NCBI NM_002828.4 GCATGCGCCGCAGCGCCAGCGCTCTCCCCGGATCGTGCGGGGCCTGAGCCTCTCCGCCGGCGCAGGCTCTGCTCGCGCCAGCTCGCTCCCGCAGCCATGCCCACCACCATCGAGCGGGAGTTCGAAGAGTTGGATACTCAGCGTCGCTGGCAGCCGCTGTACTTGGAAATTCGAAATGAGTCCCATGACTATCCTCATAGAGTGGCCAAGTTTCCAGAAAACAGAAATCGAAACAGATACAGAGATGTAAGCCCATATGATCACAGTCGTGTTAAACTGCAAAATGCTGAGAATGATTATATTAATGCCAGTTTAGTTGACATAGAAGAGGCACAAAGGAGTTACATCTTAACACAGGGTCCACTTCCTAACACATGCTGCCATTTCTGGCTTATGGTTTGGCAGCAGAAGACCAAAGCAGTTGTCATGCTGAACCGCATTGTGGAGAAAGAATCGGTTAAATGTGCACAGTACTGGCCAACAGATGACCAAGAGATGCTGTTTAAAGAAACAGGATTCAGTGTGAAGCTCTTGTCAGAAGATGTGAAGTCGTATTATACAGTACATCTACTACAATTAGAAAATATCAATAGTGGTGAAACCAGAACAATATCTCACTTTCATTATACTACCTGGCCAGATTTTGGAGTCCCTGAATCACCAGCTTCATTTCTCAATTTCTTGTTTAAAGTGAGAGAATCTGGCTCCTTGAACCCTGACCATGGGCCTGCGGTGATCCACTGTAGTGCAGGCATTGGGCGCTCTGGCACCTTCTCTCTGGTAGACACTTGTCTTGTTTTGATGGAAAAAGGAGATGATATTAACATAAAACAAGTGTTACTGAACATGAGAAAATACCGAATGGGTCTTATTCAGACCCCAGATCAACTGAGATTCTCATACATGGCTATAATAGAAGGAGCAAAATGTATAAAGGGAGATTCTAGTATACAGAAACGATGGAAAGAACTTTCTAAGGAAGACTTATCTCCTGCCTTTGATCATTCACCAAACAAAATAATGACTGAAAAATACAATGGGAACAGAATAGGTCTAGAAGAAGAAAAACTGACAGGTGACCGATGTACAGGACTTTCCTCTAAAATGCAAGATACAATGGAGGAGAACAGTGAGAGTGCTCTACGGAAACGTATTCGAGAGGACAGAAAGGCCACCACAGCTCAGAAGGTGCAGCAGATGAAACAGAGGCTAAATGAGAATGAACGAAAAAGAAAAAGGTGGTTATATTGGCAACCTATTCTCACTAAGATGGGGTTTATGTCAGTCATTTTGGTTGGCGCTTTTGTTGGCTGGACACTGTTTTTTCAGCAAAATGCCCTATAAACAATTAATTTTGCCCAGCAAGCTTCTGCACTAGTAACTGACAGTGCTACATTAATCATAGGGGTTTGTCTGCAGCAAACGCCTCATATCCCAAAAACGGTGCAGTAGAATAGACATCAACCAGATAAGTGATATTTACAGTCACAAGCCCAACATCTCAGGACTCTTGACTGCAGGTTCCTCTGAACCCCAAACTGTAAATGGCTGTCTAAAATAAAGACATTCATGTTTGTTAAAAACTGGTAAATTTTGCAACTGTATTCATACATGTCAAACACAGTATTTCACCTGACCAACATTGAGATATCCTTTATCACAGGATTTGTTTTTGGAGGCTATCTGGATTTTAACCTGCACTTGATATAAGCAATAAATATTGTGGTTTTATCTACGTTATTGGAAAGAAAATGACATTTAAATAATGTGTGTAATGTATAATGTACTATTGACATGGGCATCAACACTTTTATTCTTAAGCATTTCAGGGTAAATATATTTTATAAGTATCTATTTAATCTTTTGTAGTTAACTGTACTTTTTAAGAGCTCAATTTGAAAAATCTGTTACTAAAAAAATAAATTGTATGTCGATTGAATTGTACTGGATACATTTTCCATTTTTCTAAAGAGAAGTTTGATATGAGCAGTTAGAAGTTGGAATAAGCAATTTCTACTATATATTGCATTTCTTTTATGTTTTACAGTTTTCCCCATTTTAAAAAGAAAAGCAAACAAAGAAACAAAAGTTTTTCCTAAAAATATCTTTGAAGGAAAATTCTCCTTACTGGGATAGTCAGGTAAACAGTTGGTCAAGACTTTGTAAAGAAATTGGTTTCTGTAAATCCCATTATTGATATGTTTATTTTTCATGAAAATTTCAATGTAGTTGGGGTAGATTATGATTTAGGAAGCAAAAGTAAGAAGCAGCATTTTATGATTCATAATTTCAGTTTACTAGACTGAAGTTTTGAAGTAAACACTTTTCAGTTTCTTTCTACTTCAATAAATAGTATGATTATATGCAAACCTTACATTGTCATTTTAACTTAATGAATATTTTTTAAAGCAAACTGTTTAATGAATTTAACTGCTCATTTGAATGCTAGCTTTCCTCAGATTTCAACATTCCATTCAGTGTTTAATTTGTCTTACTTAAACTTGAAATTGTTGTTACAAATTTAATTGCTAGGAGGCATGGATAGCATACATTATTATGGATAGCATACCTTATTTCAGTGGTTTTCAAACTATGCTCATTGGATGTCCAGGTGGGTCAAGAGGTTACTTTCAACCACAGCATCTCTGCCTTGTCTCTTTATATGCCACATAAGATTTCTGCATAAGGCTTAAGTATTTTAAAGGGGGCAGTTATCATTTAAAAACAGTTTGGTCGGGCGCGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAAGTGGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAACGTGGTGAAACACCATCTCTACTAAAAATGCAAAAATTAGCTGGGCATGGTGGAGGGCACCTGTAATCTCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGTAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGATGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCACGTCACTGCACTCCAGCCAGGGCGACAGAGCGAGACTCCATCTCAAAAGAAACAAACAAAAAAAACAGTTTGGGCCGGGTGTGGTGGCTCACGCTTGTAATCCCAGCACTTCGGAAGGCCAAGGCGGGCGGATCACGAGGTCAAGAGATGGAGACTGTCCTGGCCAACATGGTGAAATCCCTTCTTTACTAAAAATACAAAAATTATCTGGGCGTGGTGGTGCATGCCTGTAGTCCCAGCTCCTTGGGAGGCTAAGGCAGGAGAATCACTTGAACCCGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATTGCACCACTGCACTCCAGCCTGGCAACAGAGCAAGACTTCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTTTGAAAACCATTGGTATAGATAGATATTTTGAATTGATTTGCATAGTCTCCTTGAATGTGTTAAATTATGTTGAAAGTATGAAAGCAGGATGTAGGTGGTACTACATATTAAATAAGATTTATATAACA
5 TOX mRNA NCBI NM_014729.3 CTCTTCTTCTTAAACAAACCACAAACGGATGTGAGGGAAGGAAGGTGTTTCTTTTACTCCTGAGCCCAGACACCTCACTCTGTTCCGTCTAAGCTTGTTTTGCTGAACACTTTTTTTTAAAAAAGGAAAAAGAAAAGGAGTTGCTTGATGTGAGAGTGAAATGGACGTAAGATTTTATCCACCTCCAGCCCAGCCCGCCGCTGCGCCCGACGCTCCCTGTCTGGGACCTTCTCCCTGCCTGGACCCCTACTATTGCAACAAGTTTGACGGTGAGAACATGTATATGAGCATGACAGAGCCGAGCCAGGACTATGTGCCAGCCAGCCAGTCCTACCCTGGTCCAAGCCTGGAAAGTGAAGACTTCAACATTCCACCAATTACTCCTCCTTCCCTCCCAGACCACTCGCTGGTGCACCTGAATGAAGTTGAGTCTGGTTACCATTCTCTGTGTCACCCCATGAACCATAATGGCCTGCTACCATTTCATCCACAAAACATGGACCTCCCTGAAATCACAGTCTCCAATATGCTGGGCCAGGATGGAACACTGCTTTCTAATTCCATTTCTGTGATGCCAGATATACGAAACCCAGAAGGAACTCAGTACAGTTCCCATCCTCAGATGGCAGCCATGAGACCAAGGGGCCAGCCTGCAGACATCAGGCAGCAGCCAGGAATGATGCCACATGGCCAGCTGACTACCATTAACCAGTCACAGCTAAGTGCTCAACTTGGTTTGAATATGGGAGGAAGCAATGTTCCCCACAACTCACCATCTCCACCTGGAAGCAAGTCTGCAACTCCTTCACCATCCAGTTCAGTGCATGAAGATGAAGGCGATGATACCTCTAAGATCAATGGTGGAGAGAAGCGGCCTGCCTCTGATATGGGGAAAAAACCAAAAACTCCCAAAAAGAAGAAGAAGAAGGATCCCAATGAGCCCCAGAAGCCTGTGTCTGCCTATGCGTTATTCTTTCGTGATACTCAGGCCGCCATCAAGGGCCAAAATCCAAACGCTACCTTTGGCGAAGTCTCTAAAATTGTGGCTTCAATGTGGGACGGTTTAGGAGAAGAGCAAAAACAGGTCTATAAAAAGAAAACCGAGGCTGCGAAGAAGGAGTACCTGAAGCAACTCGCAGCATACAGAGCCAGCCTTGTATCCAAGAGCTACAGTGAACCTGTTGACGTGAAGACATCTCAACCTCCTCAGCTGATCAATTCGAAGCCGTCGGTGTTCCATGGGCCCAGCCAGGCCCACTCGGCCCTGTACCTAAGTTCCCACTATCACCAACAACCGGGAATGAATCCTCACCTAACTGCCATGCATCCTAGTCTCCCCAGGAACATAGCCCCCAAGCCGAATAACCAAATGCCAGTGACTGTCTCTATAGCAAACATGGCTGTGTCCCCTCCTCCTCCCCTCCAGATCAGCCCGCCTCTTCACCAGCATCTCAACATGCAGCAGCACCAGCCGCTCACCATGCAGCAGCCCCTTGGGAACCAGCTCCCCATGCAGGTCCAGTCTGCCTTACACTCACCCACCATGCAGCAAGGATTTACTCTTCAACCCGACTATCAGACTATTATCAATCCTACATCTACAGCTGCACAAGTTGTCACCCAGGCAATGGAGTATGTGCGTTCGGGGTGCAGAAATCCTCCCCCACAACCGGTGGACTGGAATAACGACTACTGCAGTAGTGGGGGCATGCAGAGGGACAAAGCACTGTACCTTACTTGAGAATCTGAACACCTCTTCTTTCCACTGAGGAATTCAGGGAAGTGTTTTCACCATGGATTGCTTTGTACAGTCAAGGCAGTTCTCCATTTTATTAGAAAATACAAGTTGCTAAGCACTTAGGACCATTTGAGCTTGTGGGTCACCCACTCTGGAAGAAATAGTCATGCTTCTTTATTATTTTTTTAATCCTTTATGGACATTGTTTTTCTTCTTCCCTGAAGGAAATTTGGACCATTCAGATTTTATGTTGGTTTTTTGCTGTGAAGTGCTGCGCTCTAGTAACTGCCTTAGCAACTGTAGATGTCTCGGATAAAAGTCCTGGATTTTCCATTGGTTTTCATAATGGGTGTTTATATGAAACTACTAAAGACTTTTTAAATGGCTTGATGTAGCAGTCATAGCAAGTTTGTAAATAGCATCTATGTTACACTCTCCTAGAGTATAAAATGTGAATGTTTTTGTAGCTAAATTGTAATTGAAACTGGCTCATTCCAGTTTATTGATTTCACAATAGGGGTTAAATTGGCAAACATTCATATTTTTACTTCATTTTTAAAACAACTGACTGATAGTTCTATATTTTCAAAATATTTGAAAATAAAAAGTATTCCCAAGTGATTTTAATTTAAAAACAAATTGGCTTTGTCTCATTGATCAGACAAAAAGAAACTAGTATTAAGGGAAGCGCAAACACATTTATTTTGTACTGCAGAAAAATTGCTTTTTTGTATCACTTTTTGTGTAATGGTTAGTAAATGTCATTTAAGTCCTTTTATGTATAAAACTGCCAAATGCTTACCTGGTATTTTATTAGATGCAGAAACAGATTGGAAACAGCTAAATTACAACTTTTACATATGGCTCTGTCTTATTGTTTCTTCATACTGTGTCTGTATTTAATCTTTTTTTATGGAACCTGTTGCGCCTATTTATGAAATAATAAATATAGGTGTTTGTAAGTAAATTTGTTAGTATTTGAAAGAGGTTTCTTTGATGTTTTAACTTTTGCTGGCAAAAAAAAATTCACGCTTGGTGTGAATACTTTATTATTTAGTTTTTACAGTAACATGAATAAAGCCAAACCTGCTTTTCATTTAGCAGCAAATTAAAGTAACCAGTCCTTATTTCTGCATTTCTTTGGTTGATGCAAACAAAAAACTATTATATTTAAGAACTTTATTTCTTCATACGACATAACAGAATTGCCCTCCAAGTCACACAAGCTCCAAGACTAAACAAACAGACAGGTCCTCTGTCTTAAAAAGGTTACTTCTTGGTTCTCAGCTGGTTCTAGTCAATTCTGAACCACCACCCCCCGCCCCCCGCAAAAAAGTAAAAGTCAAACCAAACTTCCTCAAGCTGCATGCTTTTCACAAAATCCAGAAAGCATTTAAGAATTGAACTAGGGGCTGGAAGAAGTGAAAGGGAAGCATCTAAAAATGAAAGGTGAGTAACCAGATAGCAAAAGAAAAGGGAAAGCCATCCAAATTTGAAAGCTGTTGATAGAAATTGAGATTCTTGCTGTCTTTTGTGCCTCTACAAGCTACTACTCATTCCAGAATTCCTGGGTCTTCCAAGAGGATTCTTAAGGTACCAGAGATTTGCTAGGGAACCAAAAGTGCTTGAGAATCTGCCTGAGGGCTTGCATAGCTTTCACATTAAAAAAAGAAAAAGCTAGCAGATTTACTCCTTTTTAGGGGATCATATCAAGAAAGTTAGTCTGGTTGGAAACCAAGAGAATGGCTGATGTCTCTTTCTTGGAATATGTGAAATAAATTTAGCAGTTTAACTAAATACAAATATATGCATTGTGTAATCCACTCAGAATTAAACAGACAAAAGGTATGCTTGCTTTGGAATGATTTTAGGCATTGTACAACCTTGAATCACTTGAGCATGTAATAACTAATAAATAATGCAGATCCATGTGATTATTAAAATGACTGTAGCTGAGAGCTCTAATTTTCCTGTCTTGAAACTGTATAAGAACTCATGTGATTAAGTTCACAGTTTATTGTTTGTCTGTTTAGTATTTTAGAAATATACCAGCACTACTAATTAACTAATGTCTTTTATTTATTATATTATGATAAAGTAAAAATTTCACTTGCATTAAGTCTAAACTGAGAAGGTAATTACTGGGAGGAGAATGAGCAGCTTTGACTTTGACAGGCGGTTTGTGCAGGAAAGCACAGTGCCGTGTTGTTTACAGCTTTTCTAGAGCAGCTGTGCGACCAGGGTAGAGAGTGTTGAAATTCAATACCAAATACAGTAAAAACAAATGTAAATAAAAGAAAACACATCATCAATAAAACTGTTATTATGCGTGACCGTA
6 TGFBR1_8 TTAAATGTAATTCATGTCTTAA
7 TGFBR1_9 TTCAATGAAATTATGGTAACTA
8 TGFBR1_5 TATAATTGTAACTCAATCTTTG
9 TGFBR1_3 TTTGATTTCAAATCTCTATGAG
10 TGFBR1_2 TTTAAATGTAATTCATGTCTTA
11 TGFBR1_6 TTAAGTTGTAATAAACAGGTTG
12 TGFBR1_7 TTTAATTGACTTTATTACACTG
13 TGFBR1_4 TTAGTATCTCAAAATATCTGAG
14 TGFBR1_1 TTAATTGACTTTATTACACTGC
15 TGFBR1_15 TTAAATGACAAAATTATTACTC
16 TGFBR1_13 TTAGTAATAAGACATGTTTCAT
17 TGFBR1_27 TATTCAAATTATTAACTACCTT
18 TGFBR1_12 TAAGTAATCAAAAAGGGATCCA
19 TGFBR1_14 TTGTGTATAACTTTGTCTGTGG
20 TGFBR1_22 TTTTAAATGTAATTCATGTCTT
21 TGFBR1_29 TTAACATAAGCATCACTCTTCT
22 TGFBR1_18 TTAAAGTACTATAAGCATCTAG
23 TGFBR1_11 TATCTATTCAAATTATTAACTA
24 TGFBR1_17 TCTTGTAACACAATAGTTCTCG
25 TGFBR1_20 TTAAACAAGTAATACAACACAA
26 TGFBR1_30 TAATAAAACCTGAAATCTGGGA
27 TGFBR1_23 TACATTTTGTAATAAAACCTGA
28 TGFBR1_10 TAGAATTACATTTTGATGCCTT
29 TGFBR1_28 TTTAAGATCAAATAGTCTTTCA
30 TGFBR1_21 TACAATTTAAAAAAACTTATGG
31 TGFBR1_16 TAAAATTGTCTTTTGTACAGAG
32 TGFBR1_25 TAAGTTGTAATAAACAGGTTGA
33 TGFBR1_19 TAATGTACTGACAATCATCTTA
34 TGFBR1_24 TTTCATTTTCAATATCAGCCAA
35 TGFBR1_26 TTTTAAGATCAAATAGTCTTTC
36 TGFBR2_5 TTTCTTACAAGGGACCTTGGTT
37 TGFBR2_9 TATAAGCAAAAGAAACTTGGGC
38 TGFBR2_8 TTTCTGGTTGTCACAGGTGGAA
39 TGFBR2_3 TTGTTGATTAACAAGTTTCCTA
40 TGFBR2_1 TAGAGTGAGAATTTGCTCCTTT
41 TGFBR2_4 TTCAGGAATCTTCTCCTCCGAG
42 TGFBR2_2 TTTAATACATGAGTACAGCTGA
43 TGFBR2_7 TTTCTAAACTAGGTTGAGGGAG
44 TGFBR2_6 TTGTCAGTGACTATCATGTCGT
45 TGFBR2_32 TATTTTAATACATGAGTACAGC
46 TGFBR2_25 TAAGCAAAAGAAACTTGGGCTA
47 TGFBR2_14 TTTTAATACATGAGTACAGCTG
48 TGFBR2_11 TTAAAAAAGAGATTACTTGCAG
49 TGFBR2_34 TATTCATATTTATATACAGGCA
50 TGFBR2_49 TTTTAAAAAAGAGATTACTTGC
51 TGFBR2_37 TTATGTAAAAGACAAACAATGC
52 TGFBR2_30 TTAAATGAAAAGTCCAGGAGAA
53 TGFBR2_16 TTGATTAACAAGTTTCCTATGG
54 TGFBR2_48 TTTAATTCCTAGACTGGGGTCC
55 TGFBR2_22 TCAAAATCATATTATATACCCA
56 TGFBR2_45 TATATATAGAGCTATAGACATA
57 TGFBR2_40 TGTAATGAAAAAGTAAACACGA
58 TGFBR2_46 TTCTAAACTAGGTTGAGGGAGA
59 TGFBR2_13 TATTCTAGAAACTCACCACTAG
60 TGFBR2_38 TTGAAATCCTCTTCATCAGGCC
61 TGFBR2_17 TGAGAATACTCTTGAATCTTGA
62 TGFBR2_36 TTGAATATCTCATGAATGGACC
63 TGFBR2_27 TTTAAAAAAGAGATTACTTGCA
64 TGFBR2_24 TTCACTTTTTGAAACGCTGTGC
65 TGFBR2_39 TAATCTTTTACTTCTCCCACTG
66 TGFBR2_20 TATATATAAAACATAGCTATTC
67 TGFBR2_21 TATATATATAAAACATAGCTAT
68 TGFBR2_10 TTGTGGTTGATGTTGTTGGCAC
69 TGFBR2_26 TAGAATAAAAATAAGTGCTTGA
70 TGFBR2_44 TAATGTTTACAGTGAGAAGTGA
71 TGFBR2_33 TAGGGAAAGATCTTGACTGCCA
72 TGFBR2_31 TAGAGTTTCTAAACTAGGTTGA
73 TGFBR2_42 TTTTAGAAAAGGATGAAGGCTG
74 TGFBR2_47 TTTAGAAAAGGATGAAGGCTGG
75 TGFBR2_35 ATAGAATAAAAATAAGTGCTTG
76 TGFBR2_19 TCTTGAATCTTGAATATCTCAT
77 TGFBR2_12 TTTCATTAGTAGATGGTGGGGC
78 TGFBR2_43 TTAGAAAAGGATGAAGGCTGGG
79 TGFBR2_41 ATATATATATAAAACATAGCTA
80 TGFBR2_29 TTATATTCTTCTGAGAAGATGA
81 TGFBR2_23 TAAAAATCAATCTCATTTCCTG
82 TGFBR2_18 TAATAAACATTTTATTTATGTA
83 TGFBR2_15 TGATTAACAAGTTTCCTATGGA
84 TGFBR2_28 TTAAAAATCTCAATAAAATGAG
85 FAS_1指導物 TAGATTTTAAACATCCTTGGAG
86 FAS_1指導物 TAGATTTTAAACATCCTTGGAG
87 FAS_6指導物 TTACTCTTGATGAAGTTTGTTT
88 FAS_7指導物 TTGAACTTTCTGTTCTGCTGTG
89 FAS_8指導物 TTGTCTGTGTACTCCTTCCCTT
90 FAS_9指導物 TCTTTGATTGCAAACATGGGTT
91 FAS_10指導物 TTGATCTCATCTATTTTGGCTT
92 FAS_11指導物 TTAAGAATCTTTTCAAACACTA
93 FAS_12指導物 TTCTATTGATTCATAGAGTGGG
94 FAS_13指導物 TAATCTTAATCTTTCATCCTCT
95 FAS_14指導物 TTAACTTGACTTAGTGTCATGA
96 FAS_15指導物 TTACATAAATATGATCTTCTCA
97 FAS_16指導物 TACATAAATATGATCTTCTCAG
98 FAS_18指導物 TAAAAATCTACAAATATGTTGG
99 FAS_19指導物 TTTGGTTTACATCTGCACTTGG
100 PTPN2_1指導物 TATAATACGACTTCACATCTTC
101 PTPN2_2指導物 TAGAAAGTTCTTTCCATCGTTT
102 PTPN2_4指導物 TTCTATGTCAACTAAACTGGCA
103 PTPN2_5指導物 TTAAACAGCATCTCTTGGTCAT
104 PTPN2_7指導物 TCGAATTTCCAAGTACAGCGGC
105 PTPN2_8指導物 TTAGAAAGTTCTTTCCATCGTT
106 PTPN2_9指導物 TAGATGTACTGTATAATACGAC
107 PTPN2_10指導物 TCTGTATACTAGAATCTCCCTT
108 PTPN2_11指導物 TTTTATGTTAATATCATCTCCT
109 PTPN2_13指導物 TGAGAATCTCAGTTGATCTGGG
110 PTPN2_14指導物 TCTGACAAGAGCTTCACACTGA
111 PTPN2_15指導物 TTCTATTATAGCCATGTATGAG
112 PTPN2_16指導物 TGATATTTTCTAATTGTAGTAG
113 TOX_2指導物 TAAAGTATTCACACCAAGCGTG
114 TOX_4指導物 TATGACTGCTACATCAAGCCAT
115 TOX_5指導物 TTAAATGACATTTACTAACCAT
116 TOX_6指導物 TTAAATTAAAATCACTTGGGAA
117 TOX_7指導物 TTTGCTCTTCTCCTAAACCGTC
118 TOX_8指導物 TTAGTTAATTAGTAGTGCTGGT
119 TOX_9指導物 TAGGTGAGGATTCATTCCCGGT
120 TOX_10指導物 TTAGTCTTGGAGCTTGTGTGAC
121 TOX_11指導物 TTTAAATTAAAATCACTTGGGA
122 TOX_12指導物 TTTTAAATTAAAATCACTTGGG
123 TOX_13指導物 TTCAATTACAATTTAGCTACAA
124 TOX_15指導物 TTTATTATTTCATAAATAGGCG
125 TOX_16指導物 TTACAAACTTGCTATGACTGCT
126 TOX_17指導物 TATTATTTCATAAATAGGCGCA
127 FAS_11 miR3G - PTPN2_14 miRE模組 GTAAGTCGACTCGTTGGATCCCCACTACCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCGACTTCTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCCAGTGTGAAGCTCTTGTCAGATAGTGAAGCCACAGATGTATCTGACAAGAGCTTCACACTGATGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTAGAATTCGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTTTCATCTGACCAGTAGTGGACTAGTGTGACGCTGCTGACCCCTTTCTTTCCCTTCTACAG
128 TGFBR2_23-TGBR2_37 miR3G模組 CCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTAAAAATCAATCTCATTTCCTGGTAGTGAAATATATATTAAACCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGAC
129 FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR2_37 miR3G模組 CCACTACCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCGACTTCTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCCAGTGTGAAGCTCTTGTCAGATAGTGAAGCCACAGATGTATCTGACAAGAGCTTCACACTGATGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTAGAATTCGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTGACGGTGACTTAGGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTAAAAATCAATCTCATTTCCTGGTAGTGAAATATATATTAAACCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGAC
130 FAS/TGFBR2/TGFBR2 shRNA盒 gtaagtcgactcgttggatccccactacccggatcaacgccctaggtttatgtttggatgaactgacatacgcgtatccgtcttaagaatcttttcaaacactagtagtgaaatatatattaaactagtgtttgaaaagattcttattacggtaacgcggaattcgcaactattttatcaattttttgcgtcgacgacggtgacttaggagtatgccggatcaacgccctaggtttatgtttggatgaactgacatacgcgtatccgtctaaaaatcaatctcatttcctggtagtgaaatatatattaaaccaggaaatgagattgatttttttacggtaacgcggaattcgcaactattttatcaattttttgcgtcgacgactgtgacagcagagtatgccggatcaacgccctaggtttatgtttggatgaactgacatacgcgtatccgtcttatgtaaaagacaaacaatgcgtagtgaaatatatattaaacgcattgtttgtcttttacatattacggtaacgcggaattcgcaactattttatcaattttttgcgtcgaccggaactatcttgaagagtagtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctacaga
131 FAS/TGFBR2/TGFBR2/PTPN2 shRNA盒 gtaaGTcgactcgttggatccCCACTACCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCGACTTCTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCCAGTGTGAAGCTCTTGTCAGATAGTGAAGCCACAGATGTATCTGACAAGAGCTTCACACTGATGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTAGAATTCGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTGACGGTGACTTAGGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTAAAAATCAATCTCATTTCCTGGTAGTGAAATATATATTAAACCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACCGGAACTATCTTGAAGAGTAGTAGTGGactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctACAG
132 EF1A啟動子 GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAG
133 FAS-PTPN2雙重shRNA盒 GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTCGACTCGTTGGATCCCCACTACCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCGACTTCTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCCAGTGTGAAGCTCTTGTCAGATAGTGAAGCCACAGATGTATCTGACAAGAGCTTCACACTGATGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTAGAATTCGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTTTCATCTGACCAGTAGTGGACTAGTGTGACGCTGCTGACCCCTTTCTTTCCCTTCTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACACCTGCAGCCCAAGCTTACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAAAGGACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAAACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTC (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN可不存在或可編碼任一長度之轉基因)
134 FAS-TGFBR2-TGFBR2架構1 (3G-3G-3G)三重shRNA盒 GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTCGACTCGTTGGATCCCCACTACCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACGACGGTGACTTAGGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTAAAAATCAATCTCATTTCCTGGTAGTGAAATATATATTAAACCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACCGGAACTATCTTGAAGAGTAGTAGTGGACTAGTGTGACGCTGCTGACCCCTTTCTTTCCCTTCTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACACCTGCAGCCCAAGCTTACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAAAGGACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAAACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTC (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN可不存在或可編碼任一長度之轉基因)
135 TGFBR2-TGFBR2-FAS架構2三重shRNA盒 GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTCGACTCGTTGGATCCCCACTACCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTAAAAATCAATCTCATTTCCTGGTAGTGAAATATATATTAAACCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCGACGGTGACTTAGGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACCGGAACTATCTTGAAGAGTAGTAGTGGACTAGTGTGACGCTGCTGACCCCTTTCTTTCCCTTCTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACACCTGCAGCCCAAGCTTACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAAAGGACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAAACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTC (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN可不存在或可編碼任一長度之轉基因)
136 FAS-TGFBR2-TGFBR2架構3 (3G-E-3G)三重shRNA盒 GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTCGACTCGTTGGATCCCCACTACCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCGACGGTGACTTAGGAGTATGTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCGACTTCTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTAGTGAAGCCACAGATGTATAAAAATCAATCTCATTTCCTGTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTAGAATTCGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACCGGAACTATCTTGAAGAGTAGTAGTGGACTAGTGTGACGCTGCTGACCCCTTTCTTTCCCTTCTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACACCTGCAGCCCAAGCTTACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAAAGGACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAAACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTC (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN可不存在或可編碼任一長度之轉基因)
137 FAS-PTPN2-TGFBR2-TGFBR2四重shRNA盒 GGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTCGACTCGTTGGATCCCCACTACCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCGACTTCTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCCAGTGTGAAGCTCTTGTCAGATAGTGAAGCCACAGATGTATCTGACAAGAGCTTCACACTGATGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTAGAATTCGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTGACGGTGACTTAGGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTAAAAATCAATCTCATTTCCTGGTAGTGAAATATATATTAAACCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACCGGAACTATCTTGAAGAGTAGTAGTGGACTAGTGTGACGCTGCTGACCCCTTTCTTTCCCTTCTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACACCTGCAGCCCAAGCTTACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAAAGGACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAAACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTC (NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN可不存在或可編碼任一長度之轉基因)
138 人類生長激素(GH1)多腺苷酸化信號 CGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAAACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTC
139 FAS-TGFBR2-TGFBR2 (3G-E-3G)三重shRNA模組 CGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCGACGGTGACTTAGGAGTATGTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCGACTTCTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTAGTGAAGCCACAGATGTATAAAAATCAATCTCATTTCCTGTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTAGAATTCGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGAC
140 TGFBR2_23-TGBR2_37 miR3G及miR3E模組 TGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCGACTTCTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTAGTGAAGCCACAGATGTATAAAAATCAATCTCATTTCCTGTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTAGAATTCGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGAC
141 TGFBR2-TGFBR2-FAS miR3G三重shRNA模組 CCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTAAAAATCAATCTCATTTCCTGGTAGTGAAATATATATTAAACCAGGAAATGAGATTGATTTTTTTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACACTTCAAGGGGCTTGCGGCCGCAACCATCTCCATGGCGACGGTGACTTAGGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTATGTAAAAGACAAACAATGCGTAGTGAAATATATATTAAACGCATTGTTTGTCTTTTACATATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGACGACTGTGACAGCAGAGTATGCCGGATCAACGCCCTAGGTTTATGTTTGGATGAACTGACATACGCGTATCCGTCTTAAGAATCTTTTCAAACACTAGTAGTGAAATATATATTAAACTAGTGTTTGAAAAGATTCTTATTACGGTAACGCGGAATTCGCAACTATTTTATCAATTTTTTGCGTCGAC
參考以下描述及附圖，本發明之該等及其他特徵、態樣及優點將變得更好理解，在該等附圖中： 圖 1A顯示編碼邏輯閘(引發受體(primeR)及CAR)及shRNA模組之例示性***盒。 圖 1B顯示與所指示shRNA模組一起培育之T細胞中TGFBR2及FAS之敲低。 圖 1C顯示與所指示shRNA模組及0 ng/ml或10 ng/ml TGF-β1一起培育之T細胞中TGFBR2及FAS之敲低。 圖 1D顯示在短RSA (第2次刺激)後，與所指示shRNA模組及0 ng/ml或10 ng/ml TGF-β1一起培育之T細胞中TGFBR2及FAS之敲低。 圖 1E顯示用所指示shRNA敲低後之相對TFGBR2表現。 圖 1F顯示在單獨培養基中或在TGF-b存在下，用單一TGFBR2 shRNA刺激之T細胞中之累積T細胞擴增、腫瘤細胞擴增及IFNg產生。 圖 1G顯示在用所指示shRNA敲低或進行FAS-PTPN2-TGFBR2基因剔除後，T細胞中之TFGBR2表現及pSMAD磷酸化。 圖 2A顯示，在短期RSA中在腫瘤加TGF-ꞵ1暴露後，所指示shRNA賦予對TGF-ꞵ介導之CD103誘導之部分抗性。 圖 2B顯示，在RPMI-8226靶細胞中在腫瘤加TGF-ꞵ1暴露後，所指示shRNA賦予對TGF-ꞵ介導之CD103誘導之部分抗性。 圖 3顯示，所指示四重shRNA模組對TGFBR2之敲低拯救邏輯閘T細胞對腫瘤細胞殺傷之TGF-ꞵ介導之阻抑。 圖 4顯示在用所指示shRNA處理細胞後，在短RSA (2次刺激)後，在ICT上誘導CD103之關聯。 圖 5A顯示在RSA期間，所選TGFBR四聯體部分地損害CD103誘導。 圖 5B顯示在RSA期間，所選TGFBR shRNA模組強烈地損害PD1之維持。 圖 6顯示，MULTIseq分析顯示miR shRNA模組之靶控阻抑。 圖 7顯示，TGFBR2-TGFBR2四重shRNA模組展現pSMAD2/3誘導因應TGF-ꞵ1之減少。 圖 8顯示，所選四重shRNA對TGFBR2之敲低抑制邏輯閘T細胞對靶細胞殺傷之TGF-ꞵ介導之阻抑 。 圖 9A顯示，邏輯閘T細胞中之TGFBR2基因剔除增強H1975異種移植物模型中之抗腫瘤活性。 圖 9B顯示，FAS-PTPN2 shRNA增強H1975活體內模型中邏輯閘T細胞之功效。 圖 9C顯示，邏輯閘T細胞中之TGFBR2基因剔除增強786-O異種移植物模型中之抗腫瘤活性。 圖 9D顯示在786-O異種移植物模型中在第14天時，具有TGFBR2 KO之T細胞之擴增。 圖 10顯示，與WT T細胞及僅表現FAS-PTPN2 shRNA之T細胞相比，表現所指示shRNA之TGFBR2基因剔除T細胞在786-O模型中展現增強的TGI。 圖 11A顯示用經改造T細胞治療後之平均腫瘤體積。 圖 11B顯示用邏輯閘及對照shRNA對照組治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11C顯示用FAS-PTPN2 -TGFBR2_23-TGBR2_16 shRNA邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11D顯示用FAS-PTPN2邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11E顯示用FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR2_37 shRNA邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11F顯示用FAS-PTPN2-TGFBR2_23-TGBR1_13 shRNA邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11G顯示用FAS-PTPN2-TGFBR2_23 -TGBR1_10 shRNA邏輯閘T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 11H顯示用TGFBR2基因剔除T細胞治療後之個別小鼠腫瘤大小。 圖 12提供表現邏輯閘1-5 IC、shRNA及視情況存在之SPA之各種ICT轉基因盒之圖。 圖 13顯示，所有ICT細胞組成性表現PrimeR構築物。 圖 14顯示，當與primeR抗原表現細胞株共培養時，ICT細胞誘導CAR表現。 圖 15顯示，在ICT細胞中納入shRNA模組導致表現引發受體-CAR邏輯閘之ICT細胞(PrimeR+)中FAS及TGFBR2的MFI較低，正規化至未經編輯之細胞(PrimeR-)。 圖 16A顯示對既不表現CAR抗原亦不表現primeR抗原之母體K562細胞之細胞毒性， 圖 16B顯示對僅表現CAR抗原之K562細胞之細胞毒性， 圖 16C對僅表現primeR抗原之K562細胞之細胞毒性。 圖 16D顯示對表現primeR抗原及CAR抗原二者之K562細胞之細胞毒性。 圖 17顯示在取自靶細胞表現primeR抗原及CAR抗原二者之共培養物之上清液中，僅表現邏輯閘1-5之ICT之IFN-γ產生。 圖 18A顯示，表現邏輯閘1-5之ICT展示對表現內源CAR抗原之primeR抗原+細胞株之活體外細胞毒性， 圖 18B顯示在與primeR抗原+/CAR抗原+細胞共培養後，ICT細胞之IFNγ、TNFα、GM-CSF及IL-2分泌。 圖 19顯示，與HUVEC-primeR抗原+細胞共培養誘導ICT細胞上CAR蛋白之表現及CAR抗原+細胞之特異性殺傷。 圖 20A顯示用自供體1產生之表現邏輯閘1-5之ICT、RNP或PBS治療之小鼠中腫瘤植入後之腫瘤體積。 圖 20B顯示接種後第12天時之總T細胞及ICT之擴增，然後截至第21天收縮。 圖 20C顯示第12天及第21天時表現引發受體之總T細胞。 圖 20D顯示用自供體2產生之表現邏輯閘1-5之ICT、RNP或PBS治療之小鼠中腫瘤植入後之腫瘤體積。 圖 20E顯示接種後第12天時之總T細胞及ICT之擴增，然後截至第21天收縮。 圖 20F顯示第12天及第21天時表現引發受體之總T細胞。 圖 21A顯示僅單陽性CAR抗原側腹中之腫瘤生長抑制(TGI)。 圖 21B顯示雙陽性primeR抗原/CAR抗原側腹中之腫瘤生長抑制(TGI)。 圖 22顯示，TGFBR敲低保護ICT細胞免於TGFβ-介導之抑制。 圖 23顯示，ICT+shRNA比習用CAR-T基準更強效。 圖 24顯示在注射表現四重shRNA之所指示ICT後，786-O異種移植物模型中之活體內腫瘤體積。 圖 25顯示與FAS-PTPN2 shRNA相比，在表現四重shRNA之ICT後，A498異種移植物模型中之活體內腫瘤體積。 圖 26顯示用於以3G-E格式表現針對 FAS及 TGFBR2之shRNA之例示性雙重shRNA表現盒的示意圖。 圖 27顯示用於以3G-E-3G格式表現針對 FAS及 TGFBR2之shRNA之例示性三重shRNA表現盒的示意圖。 圖 28顯示用於以3G-3G-3G格式表現針對 TGFBR2及 FAS之shRNA之例示性三重shRNA表現盒的示意圖。 圖 29顯示用於以3G-3G-3G格式表現針對 FAS及 TGFBR2之shRNA之例示性三重shRNA表現盒的示意圖。 圖 30顯示用於以3G-E-3G-3G格式表現針對 FAS、 PTPN2及 TGFBR2之shRNA之例示性四重shRNA表現盒的示意圖。
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Claims (118)

  1. 一或多種重組核酸，其包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類TGF-β受體2 (TGFBR2)之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
  2. 一或多種重組核酸，其包含長度為至少15個核苷酸之核酸序列，該核酸序列與編碼人類TGF-β受體1 (TGFBR1)之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
  3. 一或多種重組核酸，其包含：  a.        長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，該第一核酸序列與編碼人類TGF-β受體2 (TGFBR2)之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列，及 b.      長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，該第二核酸序列與編碼人類TGF-β受體2 (TGFBR2)之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之該序列。
  4. 一或多種重組核酸，其包含：  a.   長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，該第一核酸序列與編碼人類TGF-β受體2 (TGFBR2)之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列，及 b.  長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，該第二核酸序列與編碼人類TGF-β受體1 (TGFBR1)之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸序列之長度係至少16個、17個、18個、19個、20個、21個或22個核苷酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸係短髮夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)、雙股RNA (dsRNA)或反義寡核苷酸。
  7. 如請求項6之一或多種重組核酸，其中該核酸係shRNA。
  8. 如請求項1或3至7中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸或該第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之序列組成之群之序列。
  9. 如請求項3至8中任一項之一或多種重組核酸，其中該第一核酸及該第二核酸各自包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列。
  10. 如請求項8或9之一或多種重組核酸，其中該核酸或該第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之該序列。
  11. 如請求項8、9或10之一或多種重組核酸，其中該核酸或該第一核酸包含SEQ ID NO: 51或53中所述之該序列。
  12. 如請求項8至11中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸、該第一核酸或該第二核酸包含SEQ ID NO: 81及51或53中所述之該序列。
  13. 如請求項8至11中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 128、129、130、139、140或141中所述之序列。
  14. 如請求項1或3至13中任一項之一或多種重組核酸，其中與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該核酸、該第一核酸或該第二核酸使細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  15. 如請求項2或4至8中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸或該第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-35中所述之該等序列組成之群之序列。
  16. 如請求項15之一或多種重組核酸，其中該核酸或該第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之該序列。
  17. 如請求項2、4至8、15或16中任一項之一或多種重組核酸，其中與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該核酸或該第二核酸使細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  18. 如請求項4至14或16至17中任一項之一或多種重組核酸，其中該第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之該序列，且該第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之該序列。
  19. 如請求項3、5至8或15至18中任一項之一或多種重組核酸，其中與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該第一核酸及該第二核酸使細胞中TGFBR1及TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  20. 如請求項4至7中任一項之一或多種重組核酸，其中該第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之該等序列組成之群之序列，且該第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-84中所述之該等序列組成之群之序列。
  21. 如請求項20之一或多種重組核酸，其中該第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之該序列，且該第二核酸包含SEQ ID NO: 28、16、51、或53中所述之該序列。
  22. 如請求項1至21中任一項之一或多種重組核酸，其中各自與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該核酸、該第一核酸及/或該第二核酸使細胞中TFGBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，且該第二核酸使細胞中TGFBR1及/或TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  23. 如請求項1至22中任一項之一或多種重組核酸，其進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三核酸序列，其中該至少第三核酸序列包含與編碼人類Fas細胞表面死亡受體(FAS)之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列。
  24. 如請求項23之一或多種重組核酸，其中該第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之序列組成之群之序列。
  25. 如請求項23或24之一或多種重組核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之該序列。
  26. 如請求項23至25中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 130、139、129、或141中所述之該序列。
  27. 如請求項1至22中任一項之一或多種重組核酸，其進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三核酸序列，其中該第三核酸序列包含以下中之一或多者：(1)與編碼人類Fas細胞表面死亡受體(FAS)之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之該序列，(2)與編碼人類2型蛋白酪胺酸磷酸酶非受體(PTPN2)之mRNA之核苷酸518至559互補之核酸序列，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之序列；或(3)與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補之核酸序列，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之序列。
  28. 如請求項27之一或多種重組核酸，其中該第三核酸包含與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之該序列。
  29. 如請求項27或28之一或多種重組核酸，其中該第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之該等序列組成之群之序列。
  30. 如請求項27至29中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之該序列。
  31. 如請求項27之一或多種重組核酸，其中該第三核酸包含與編碼人類2型蛋白酪胺酸磷酸酶非受體(PTPN2)之mRNA之核苷酸518至559互補之核酸序列，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之該序列。
  32. 如請求項27或31之一或多種重組核酸，其中該第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 100-112中所述之序列組成之群之序列。
  33. 如請求項27、31或32中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 110中所述之該序列。
  34. 如請求項27至33中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 129中所述之序列。
  35. 如請求項27之一或多種重組核酸，其中該第三核酸包含與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補之核酸序列，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之該序列。
  36. 如請求項27或35之一或多種重組核酸，其中該第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 113-126中所述之序列組成之群之序列。
  37. 如請求項1至27中任一項之一或多種重組核酸，其進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三及第四核酸序列，其中該第三核酸序列包含與編碼人類Fas細胞表面死亡受體(FAS)之mRNA之核苷酸1126至1364互補之核酸序列，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之該序列，且該第四核酸序列包含與編碼人類2型蛋白酪胺酸磷酸酶非受體(PTPN2)之mRNA之核苷酸518至559互補之核酸序列，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之該序列。
  38. 如請求項27或28之一或多種重組核酸，其中該第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之該等序列組成之群之序列。
  39. 如請求項27至29中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之該序列。
  40. 如請求項27或31之一或多種重組核酸，其中該第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 100-112中所述之該等序列組成之群之序列。
  41. 如請求項27、31或32中任一項之一或多種重組核酸，其中該核酸包含SEQ ID NO: 110中所述之該序列。
  42. 如請求項27至41中任一項之一或多種重組核酸，其中與不包含該核酸之對照細胞相比，該第三核酸使細胞中FAS之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，及/或使細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  43. 如請求項1至42中任一項之一或多種重組核酸，其中該一或多種核酸中之每一者係在複數種不同核酸分子上編碼。
  44. 如請求項1至42中任一項之一或多種重組核酸，其中該一或多種核酸中之每一者係在相同核酸分子上編碼。
  45. 如請求項1至44中任一項之一或多種重組核酸，其中將該一或多種重組核酸納入一或多個表現盒或表現載體中。
  46. 如請求項45之一或多種重組核酸，其中該表現盒或該表現載體進一步包含該一或多種重組核酸上游之組成型啟動子。
  47. 如請求項45或46之一或多種重組核酸，其中該表現盒包含SEQ ID NO: 133-137中之任一者中所述之序列。
  48. 一種表現載體，其包含如請求項1至47中任一項之重組核酸。
  49. 一種免疫細胞，其包含長度為至少15個核苷酸之一或多種重組核酸，該一或多種重組核酸與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
  50. 一種免疫細胞，其包含長度為至少15個核苷酸之一或多種重組核酸，該一或多種重組核酸與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
  51. 一種免疫細胞，其包含含有以下之一或多種重組核酸：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，其與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；及長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，其中該第二核酸序列  a.       與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之該序列；或 b.      與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
  52. 如請求項51之免疫細胞，其中該第二核酸序列與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之該序列。
  53. 如請求項51之免疫細胞，其中該第二核酸序列與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之該序列。
  54. 一種免疫細胞，其包含含有以下之一或多種重組核酸：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列，其與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列；及長度為至少15個核苷酸之第二核酸序列，其與編碼人類TGFBR1之mRNA互補，該人類TGFBR1包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。
  55. 一種免疫細胞，其包含含有以下之一或多種重組核酸：長度為至少15個核苷酸之第一核酸序列及第二核酸序列，其與編碼人類TGFBR2之mRNA互補，該人類TGFBR2包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。
  56. 如請求項49至55中任一項之免疫細胞，其中該細胞進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三核酸序列，其中該第三核酸序列與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之序列。
  57. 如請求項49至55中任一項之免疫細胞，其中該細胞進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第三核酸序列，其中該第三核酸序列(1)與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之該序列；(2)與編碼人類PTPN2之mRNA之核苷酸518至559互補，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之序列；或(3)與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之序列。
  58. 如請求項49至57中任一項之免疫細胞，其中該細胞進一步包含長度為至少15個核苷酸之至少第四核酸序列，其中該第四核酸序列(1)與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之該序列；(2)與編碼人類PTPN2之mRNA之核苷酸518至559互補，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之該序列；或(3)與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之該序列。
  59. 如請求項49至58中任一項之免疫細胞，其中該第一核酸、該第二核酸、該第三核酸及該第四核酸係shRNA、siRNA、dsRNA或反義寡核苷酸。
  60. 如請求項59之免疫細胞，其中該第一核酸、該第二核酸、該第三核酸及該第四核酸係shRNA。
  61. 如請求項51至60中任一項之免疫細胞，其中該第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之序列組成之群之序列。
  62. 如請求項61之免疫細胞，其中該第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之該序列。
  63. 如請求項51至62中任一項之免疫細胞，其中該第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 6-35中所述之序列組成之群之序列。
  64. 如請求項63之免疫細胞，其中該第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之該序列。
  65. 如請求項51至64中任一項之免疫細胞，其中該第一核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之該等序列組成之群之序列；且該第二核酸序列包含選自由SEQ ID NO: 6-35中所述之該等序列組成之群之序列。
  66. 如請求項51至65中任一項之免疫細胞，其中該第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之該序列；且該第二核酸包含SEQ ID NO: 16或28中所述之該序列。
  67. 如請求項51至62中任一項之免疫細胞，其中該第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之該等序列組成之群之序列。
  68. 如請求項67之免疫細胞，其中該第二核酸包含SEQ ID NO: 51或53中所述之該序列。
  69. 如請求項51至62或67至68中任一項之免疫細胞，其中該第一核酸及該第二核酸包含選自由SEQ ID NO: 36-84中所述之該等序列組成之群之序列。
  70. 如請求項51至62或67至69中任一項之免疫細胞，其中該第一核酸包含SEQ ID NO: 81中所述之該序列；且該第二核酸包含SEQ ID NO: 51或53中所述之該序列。
  71. 如請求項51至62或67至70中任一項之免疫細胞，其中該一或多種重組核酸包含SEQ ID NO: 128、129、130、139、140或141中所述之序列。
  72. 如請求項51至71中任一項之免疫細胞，其中與不包含該第一核酸之對照細胞相比，該第一核酸使細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  73. 如請求項72之免疫細胞，其中與不包含該第一核酸之對照細胞相比，細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  74. 如請求項51至66中任一項之免疫細胞，其中與不包含該第二核酸之對照細胞相比，該第二核酸使細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  75. 如請求項74之免疫細胞，其中與不包含該第二核酸之對照細胞相比，細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  76. 如請求項51至75中任一項之免疫細胞，其中各自與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該第一核酸使細胞中TFGBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%，且該第二核酸使細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  77. 如請求項56至76中任一項之免疫細胞，其中該第三核酸序列與編碼人類FAS之mRNA之核苷酸1126至1364互補，該人類FAS包含SEQ ID NO: 3中所述之該序列。
  78. 如請求項77之免疫細胞，其中該第三核酸包含選自由SEQ ID NO: 85-99中所述之序列組成之群之序列。
  79. 如請求項78之免疫細胞，其中該第三核酸包含SEQ ID NO: 92中所述之該序列。
  80. 如請求項56至79中任一項之免疫細胞，其中該一或多種重組核酸包含SEQ ID NO: 129、130、139或141中所述之該序列。
  81. 如請求項56至80中任一項之免疫細胞，其中與不包含該第三核酸之對照細胞相比，該第三核酸使該免疫細胞中FAS之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  82. 如請求項58至78中任一項之免疫細胞，其中該第四核酸序列與編碼人類PTPN2之mRNA之核苷酸518至559互補，該人類PTPN2包含SEQ ID NO: 4中所述之該序列。
  83. 如請求項77之免疫細胞，其中該第四核酸包含選自由SEQ ID NO: 100-112中所述之序列組成之群之序列。
  84. 如請求項83之免疫細胞，其中該第四核酸包含SEQ ID NO: 110中所述之該序列。
  85. 如請求項58至84中任一項之免疫細胞，其中該一或多種重組核酸包含SEQ ID NO: 129中所述之該序列。
  86. 如請求項57至85中任一項之免疫細胞，其中與不包含該第一核酸之對照細胞相比，該第四核酸使該免疫細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  87. 如請求項58至78中任一項之免疫細胞，其中該第四核酸序列與編碼人類胸腺細胞選擇相關之高遷移率族盒(TOX)之mRNA之核苷酸1294至2141互補，該人類TOX包含SEQ ID NO: 5中所述之該序列。
  88. 如請求項87之免疫細胞，其中該第四核酸包含選自由SEQ ID NO: 113-126中所述之序列組成之群之序列。
  89. 如請求項49至88中任一項之免疫細胞，其中TGFBR1、TGFBR2、FAS及/或PTPN2及/或TOX之表現係藉由核酸分析或蛋白質分析確定。
  90. 如請求項89之免疫細胞，其中該核酸分析包含以下中之至少一者：聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR (qPCR)、RT-qPCR、微陣列、基因陣列或RNAseq。
  91. 如請求項89之免疫細胞，其中該蛋白質分析包含以下中之至少一者：免疫印漬術、螢光活化細胞分選、流式細胞術、磁活化細胞分選或基於親和力之細胞分離。
  92. 如請求項49至91中任一項之免疫細胞，其中該免疫細胞係原代人類免疫細胞。
  93. 如請求項49至92中任一項之免疫細胞，其中該原代免疫細胞係自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、T細胞、γδ T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、原代T細胞、T細胞祖細胞或誘導性富潛能幹細胞(iPSC)。
  94. 如請求項49至93中任一項之免疫細胞，其中該原代免疫細胞係原代T細胞。
  95. 如請求項49至94中任一項之免疫細胞，其中該原代免疫細胞係原代人類T細胞。
  96. 如請求項49至95中任一項之免疫細胞，其中該免疫細胞係自體免疫細胞。
  97. 如請求項49至95中任一項之免疫細胞，其中該免疫細胞係同種異體免疫細胞。
  98. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項49至97中任一項之免疫細胞。
  99. 一種醫藥組合物，其包含如請求項49至97中任一項之免疫細胞或如請求項98之細胞群體及醫藥學上可接受之賦形劑。
  100. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至47中任一項之一或多種重組核酸或如請求項48之載體及醫藥學上可接受之賦形劑。
  101. 一種治療個體疾病之方法，其包括向該個體投與如請求項51至98中任一項之免疫細胞或如請求項99或100之醫藥組合物。
  102. 如請求項101之方法，其中該疾病係癌症。
  103. 如請求項102之方法，其中該癌症係實體癌症或液體癌症。
  104. 如請求項102或103之方法，其中該癌症係卵巢癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、子宮癌、間皮瘤、子宮頸癌、胰臟癌、腎癌、肺癌、***癌、膀胱癌、乳癌、腦癌、白血病或淋巴瘤。
  105. 如請求項101至104中任一項之方法，其中投與該(等)細胞會增強免疫反應。
  106. 如請求項105之方法，其中該增強的免疫反應係適應性免疫反應。
  107. 如請求項105之方法，其中該增強的免疫反應係先天性免疫反應。
  108. 一種增強個體之免疫反應之方法，其包括向該個體投與如請求項51至98中任一項之免疫細胞或如請求項99或100之醫藥組合物。
  109. 如請求項108之方法，其中該增強的免疫反應係適應性免疫反應。
  110. 如請求項109之方法，其中該增強的免疫反應係先天性免疫反應。
  111. 如請求項101至112中任一項之方法，其中與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該免疫細胞中TGFBR2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  112. 如請求項101至110中任一項之方法，其中與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該免疫細胞中TGFBR1之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  113. 如請求項101至112中任一項之方法，其中與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該免疫細胞中FAS之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  114. 如請求項101至112中任一項之方法，其中與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該免疫細胞中PTPN2之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  115. 如請求項101至112中任一項之方法，其中與不包含該各別核酸之對照細胞相比，該免疫細胞中TOX之表現減少至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。
  116. 如請求項112至115中任一項之方法，其中該免疫細胞中TGFBR1、TGFBR2、FAS、PTPN2及/或TOX之表現係藉由核酸分析或蛋白質分析確定。
  117. 如請求項116之方法，其中該核酸分析包含以下中之至少一者：聚合酶鏈反應(PCR)、定量PCR (qPCR)、RT-qPCR、微陣列、基因陣列或RNAseq。
  118. 如請求項116之方法，其中該蛋白質分析包含以下中之至少一者：免疫印漬術、螢光活化細胞分選、流式細胞術、磁活化細胞分選或基於親和力之細胞分離。
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