WO2020161364A1 - Dispositivo óptico para la detección de emisión de fluorescencia - Google Patents
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- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
Definitions
- Detecting minute amounts of particular particles in a sample is important in a variety of technical fields.
- the accurate detection of microorganisms with respect to, for example, hygienic demands is a matter of increasing interest for instruments and environments in hospitals, for example.
- controlling the early appearance of bacterial film formation is of utmost importance in many clinical, environmental, or food quality control applications.
- an objective of the present invention is to provide a portable optical device that mitigates the aforementioned problems at low cost.
- the present invention addresses the aforementioned problems by providing an optical device for detecting fluorescence emission from a particle sample, comprising a light source (for example, a light emitting diode device, LED, or a matrix device of LEDs) configured to emit a beam of light towards the particle sample and a color filter and an interference filter (single band or multiple bands) both configured to filter the light coming from the particle sample.
- the optical device further comprises a complementary metal oxide semiconductor CMOS image sensor configured to detect light passing through a color filter and an interference filter.
- the CMOS image sensor can be replaced by Single-Photon Avalanche Diode (SPAD) arrays, and any array of photodetectors that has been proven to be a very reliable operational means of detection.
- the optical device may further comprise a programmable data processing means for processing data provided by the CMOS image sensor.
- Figure 1 schematically illustrates an optical device comprising an LED light source and a CMOS image sensor according to an embodiment of the present invention.
- Figure 2 is a flow chart illustrating a method for detecting fluorescence emission from a sample of particles in accordance with an embodiment of the present invention.
- the excitation beam resulting from collimation by the collimation lens 20 and filtering by the excitation filter 30 of the light beam emitted by the light source 10 strikes a sample of particles 40.
- the sample may be a biofilm that extend horizontally and comprise microorganisms such as, for example, bacteria.
- the excitation excites the fluorescence emission of the sample 40 particles.
- the emission filter 60 may be an interference filter with a central wavelength of 526 nm and a bandwidth of 53 nm. Other appropriate wavelengths that could be selected according to the corresponding light source, for example, an LED device with emission wavelength of 490 nm, 625 nm, or 810 nm.
- the color filter 50 and the emission filter 60 are arranged to block light from the excitation beam striking the filter surfaces at all angles.
- the optical characteristics of the emission filter 60 must be carefully matched to those of the excitation filter 30 in order to achieve the level of excitation wavelength rejection necessary to allow the relatively weak fluorescence emission signal to be recorded. In fact, it is the combination of both the color filter 50 and the emission filter 60 that achieves the appropriate suppression of the excitation wavelength of the excitation beam.
- an imaging lens 70 Downstream along the vertical optical axis of the optical device 10, an imaging lens 70 is disposed.
- the imaging lens 70 collimates the light passing through the color filter 50 and the emission filter 70 onto a surface detection plane of a CMOS image sensor 80.
- the imaging lens 70 can be equipped with a manual focus and an iris and can have an effective focal length of 6mm.
- the imaging lens 70 can be configured and arranged to ensure a field of view of greater than 250 mm 2 and, in particular, at least 300 mm 2 and a spatial resolution of the CMOS image sensor 80 of 280 pm (determined using a USAF 1951 test object positive), for example.
- the CMOS image sensor 80 may comprise single photon avalanche diode (SPAD) photodetector arrays. However, according to a particular embodiment, the lens that is normally arranged on the detection elements of the CMOS image sensor 80 is eliminated.
- the CMOS 80 image sensor can use a Bayer filter setting to structure its pixels. Every 2 x 2 contiguous pixels contains one red, one blue, and two green pixels. A single capture consists of four two-dimensional arrays with a size of 1640 x 1232 pixels with 10 bits for each pixel, for example.
- the exposure time and gain of the CMOS 80 image sensor can be adjusted using software, for example.
- the CMOS 80 image sensor is a 4.6 mm diagonal sensor with a 3280 x 2464 pixel matrix known as version 2 of the Raspberry Pi camera module.
- Optical device 100 also comprises data processing and control electronics (not shown in Figure 1).
- the data processing and control electronics can be based on a Raspberry Pi 3 Model B, which processes the electronic signal acquired after detection by the CMOS 80 image sensor in order to provide a fluorescence count proportional to the emission level. of the sample.
- the Raspberry Pi includes General Purpose Input / Outputs (GPIOs) to connect various other electronic components as desired.
- GPIOs General Purpose Input / Outputs
- a printed circuit board (PCB) can be designed to control the light source 10.
- a nominal current of 1A and a forward voltage drop of 3.5 V can be used to drive the incoherent light source 10.
- a power supply of 5V to 5A can power all 100 optical device.
- Optical device 100 has the ability to monitor the early onset of bacterial film build-up in clinical, environmental, or food quality control applications.
- optical device 100 provides direct measurement without the need for complex post-image processing.
- Optical device 100 allows a growth curve for microorganisms such as bacteria to be quickly constructed. Simple sample preparation and fast measurement time ( ⁇ 1 minute) allow real-time monitoring of biofilms to control their formation on various surfaces including hospital instruments, food, and pipes in water treatment plants.
- Figure 1 presents the device operating in transmission mode.
- a reflection mode configuration may be provided for surfaces that are not transparent (eg, metal surfaces or thin sheets).
- the excitation light path and the detection path be located on the same side and above the sampled surface.
- the final setup for detecting fluorescence from reflective surfaces can involve any or a combination of the elements mentioned above.
- a procedure for detecting fluorescence emission from a particle sample is illustrated in Figure 2.
- a sample is prepared.
- a concrete example for sample preparation is given in the following description.
- a sample can be formed surface area on a substrate (carrier).
- the substrate can be a low cost glass substrate.
- a biofilm can form on the substrate.
- Fluorphores can be added to the surface of the sample where the particles are located.
- the fluorophores can be DNA intercalating dyes, such as, for example, SYBR Green.
- the sample is irradiated by a beam of excitation light 220.
- the beam of excitation can be formed from a beam of light emitted by an LED device, for example, the light source 10 shown in Figure 1, and a lens of collimation and an excitation filter, for example, the collimation lens 20 and the excitation filter 30 shown in Figure 1.
- the excitation beam causes an emission of fluorescence light from the sample particles, for example, the sample 40 shown in figure 1.
- the light coming from the sample is filtered 230 by a color filter, for example, the color filter 50 of the optical device 100 shown in Figure 1.
- the light filtered by the color filter is filtered 240 by an emission filter. , for example, the emission filter 60 shown in FIG. 1.
- the color filter and the emission filter effectively block light from the excitation light beam passing through the sample.
- Light passing through the color filter and the emission filter is collimated 250 by an imaging lens on a surface detection plane of a CMOS image sensor configured to detect 260 the light coming from the forming lens of pictures.
- the emission filter 70 and the CMOS image sensor 80 of the optical device 100 shown in FIG. 1 can be used.
- E. coli cells were marked with a fluorescent nucleic acid dye, specifically SYBR 1 Green (SG), from a stock solution 10,000X concentrate (Invitrogen S7563) in dimethyl sulfoxide (DMSO).
- SG has an absorption maximum at 490 nm and an emission maximum at 520 nm.
- SG is embedded within double-stranded DNA helices without specificity. If it is linked to DNA, the fluorescence increases several orders of magnitude. 10 ⁇ l of SG stock solution was dissolved in 100 ⁇ l of phosphate buffered saline (PBS, Sigma-Aldrich P4417).
- PBS phosphate buffered saline
- samples were incubated for 20 minutes at room temperature.
- samples are labeled and measured at different optical density values, and surface cytometric results are compared with results obtained with the spectrophotometer and a fluorescence microscope (Nikon Ti inverted microscope with Andor iXon camera).
- the sample surfaces were prepared by combining borosilicate coverslips with a thickness of 100 pm (Knittel glass) with silicon insulators (Grace Bio-labs GBL665301) to confine the sample to an area larger than the visual field of the instrument. Since attention was turned to the added effect of cells on the surface, signal processing was limited to obtain a fluorescence count from the sample. It was correlated to a concentration of bacteria in cells / mm 2 or used to construct a complete growth curve in a similar way to comparative measurements with the spectrophotometer. For characterization and comparison purposes, the samples were also visualized with a fluorescent microscope.
- the data are given in terms of changes in optical density, which takes into account various phenomena including scattering and absorption that modify the intensity of light transmitted by a medium relative to the incident light flux.
- the error bars obtained originate from experiments performed on different days with cells in different dormant states before seeding the LB culture medium.
- C is the signal intensity averaged over the entire CMOS image sensor in the incubation period t and Co is the signal averaged from the CMOS sensor before any sample is introduced and is analogous to the power of incident light used for measurements of
- Optical density / (t) is a direct measurement and does not require complex post-image processing.
- Figure 3B shows the typical growth curve obtained by the inventive optical device and the fit to a logistic population growth model. Data points below the known detection threshold were ignored in the fit and omitted from Figure 3B. For comparison purposes, the first reliable data points for the growth curve obtained by the cytometer were shifted to overlap the optical density curve.
- the error bars represent ⁇ 2s where s is the standard deviation.
- the delay phase is slightly shorter than for the optical density measurement and is probably due to the lack of sensitivity for weak signals when only a few bacteria are present.
- the appearance of the exponential growth phase and its duration before reaching the stationary phase are consistent with those obtained by absorbance measurements.
- the stationary plateau phase is slightly steeper than for the absorbance curve, which it could come from signal saturation at the CMOS sensor.
- the experiment clearly demonstrates the full accuracy of the measurements and the determination of a growth curve of a bacterial culture by the inventive optical device. All of the above-cited embodiments are not intended to be limitations, but to serve as examples illustrating features and advantages of the invention. It should be understood that some or all of the features described above can also be combined in different ways.
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Abstract
La presente invención se refiere a un dispositivo óptico para la detección de emisión de fluorescencia de una muestra de partículas, que comprende una fuente de luz configurada para emitir un haz de luz hacia la muestra de partículas, un filtro de color y un filtro de interferencia, estando ambos configurados para filtrar luz que proviene de la muestra de partículas y un sensor de imagen de semiconductor complementario de óxido metálico, CMOS, configurado para detectar luz que pasa a través del filtro de color y el filtro de interferencia. El dispositivo está adaptado,en particular,para mediciones de superficie.
Description
Dispositivo Óptico para la Detección de Emisión de Fluorescencia
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un dispositivo óptico para la detección de emisión de fluorescencia, por ejemplo, en una disposición de superficie. En particular, se propone un citómetro configurado para detectar emisión de fluorescencia desde una muestra de microorganismos.
Antecedentes de la invención
La detección de cantidades diminutas de partículas concretas en una muestra es importante en una variedad de campos técnicos. En particular, la detección precisa de microorganismos respecto, por ejemplo, a demandas higiénicas, es una cuestión de creciente interés para instrumentos y entornos en hospitales, por ejemplo. De hecho, el control de la aparición temprana de formación de películas de bacterias es de suma importancia en muchas aplicaciones clínicas, ambientales, o de control de calidad de alimentos.
Además de biosensores magneto-elásticos y sensores electroquímicos, son conocidas en la técnica tecnologías ópticas configuradas para determinar cantidades diminutas de partículas tales como microorganismos. Las técnicas ópticas comprenden medidas espectroscópicas basadas en dispersión Raman, dispersión Raman aumentada por superficie, y microscopía de fluorescencia, tal como en forma de citómetros de flujo. Sin embargo, las técnicas ópticas conocidas, en particular las basadas en microscopía de fluorescencia requieren componentes relativamente voluminosos y costosos y/o sufren de una insuficiente resolución, campo visual, umbral de detección, profundidad de campo, y/o precisión de medición dependiendo de la configuración real. Incluso si se consigue una precisión satisfactoria, las soluciones de la técnica anterior padecen de una incómoda preparación de la muestra y no son apropiadas para la medición directa en el campo.
En vista de lo anterior, un objetivo de la presente invención es proporcionar un dispositivo óptico portátil que mitigue los problemas mencionados a bajo coste.
Descripción de la Invención
La presente invención aborda los problemas mencionados anteriormente proporcionando un dispositivo óptico para la detección de emisión de fluorescencia de una muestra de partículas, que comprende una fuente de luz (por ejemplo, un dispositivo diodo emisor de luz, LED, o un dispositivo de matrices de LEDs) configurado para emitir un haz de luz hacia la muestra de partículas y un filtro de color y un filtro de interferencia (de banda única o múltiples bandas) ambos configurados para filtrar la luz que viene de la muestra de partículas. El dispositivo óptico comprende, además, un sensor de imagen de semiconductor complementario de óxido metálico, CMOS, configurado para detectar luz que pasa a través de un filtro de color y un filtro de interferencia. El sensor de imagen CMOS puede sustituirse por matrices de diodos de avalancha de fotón individual (Single-Photon Avalanche Diode, SPAD), y cualquier matriz de fotodetectores que se haya demostrado que es un medio de detección operativo de manera muy fiable. El dispositivo óptico puede comprender, además, un medio de procesamiento de datos programable para procesar datos proporcionados por el sensor de imagen CMOS.
El dispositivo óptico puede ser, por ejemplo, un citómetro y la muestra puede ser un espécimen de células vivas, en particular, microorganismos y, más particularmente, bacterias. La muestra puede ser o comprender una micropelícula o una biopelícula. Por medio de la configuración que se describe aquí, puede disponerse un dispositivo de bajo coste, pequeño, y portátil que permita una determinación rápida y confiable de la emisión de la fluorescencia emitida por una muestra de partículas y, de este modo, la cuantificación de las partículas. En particular, el dispositivo óptico descrito es apropiado para mediciones in situ en el campo.
De acuerdo con una realización, el sensor de imagen CMOS, al contrario de la técnica anterior, no incluye un conjunto de la lente de gran aumento costoso sobre unos elementos de detección del sensor de imagen CMOS para aumentar drásticamente la profundidad del campo y el campo de visión y superar las principales limitaciones de los microscopios existentes. Por medio de la configuración que se da aquí puede obtenerse un campo visual, una resolución, y un umbral de detección deseables sin una lente compleja montada sobre los elementos de detección del sensor de imagen CMOS y formando parte del mismo.
Además, el dispositivo óptico puede comprender una lente de formación de imágenes configurada y dispuesta para colimar luz sobre la superficie del sensor de imagen CMOS que previamente ha pasado a través del filtro de color y el filtro de interferencia. En particular, la
lente de formación de imágenes puede estar configurada y dispuesta para producir un campo visual del sensor de imagen CMOS de por lo menos 250 mm2 y por lo menos 300 mm2. De este modo, pueden superarse las limitaciones conocidas de espectrofotometría y microscopía de fluorescencia de la técnica y puede proporcionarse una medición directa sin necesidad de un complejo procesamiento de imagen posterior. Además, la configuración así especificada tiene en cuenta rápidamente la construcción de una curva de crecimiento para microorganismos en el caso en que tales microorganismos representan las partículas.
De acuerdo con otra realización, el dispositivo óptico comprende, además, una lente de formación de imágenes (colimación) configurada y dispuesta para colimar el haz de luz emitido por la fuente de luz y un filtro de excitación configurado y dispuesto para filtrar el haz de luz colimado por la lente de colimación. El haz de luz es colimado eficazmente a la muestra de partículas por medio de la lente colimación. No se requiere ningún elemento óptico adicional (en particular, ningún medio de filtro de polarización) entre la muestra y el sensor de imagen CMOS.
Todas las realizaciones descritas anteriormente del dispositivo óptico inventivo pueden comprender, además, un medio de procesamiento simple y rápido (por ejemplo, un procesador de uso general que ejecute un producto de programa de software apropiado) que esté configurado para derivar una tasa de crecimiento de células vivas (que representan las partículas) a partir de datos suministrados por el sensor de imagen CMOS. Para derivar la tasa de crecimiento de la población de las células vivas, por ejemplo, tiene que determinarse la concentración de microorganismos tales como bacterias, en base a los datos proporcionados por el sensor de imagen CMOS en instantes predeterminados diferentes.
Además, se dispone un procedimiento para detectar emisión de fluorescencia de una muestra de partículas y comprende: irradiar un haz de excitación sobre la muestra de partículas con el fin de producir la emisión de fluorescencia de la muestra de partículas, filtrar la luz que proviene de la muestra de partículas por medio de un filtro de color y un filtro de interferencia (en particular, con el fin de bloquear el luz del haz de excitación que pasa por la muestra), y detectar luz que proviene de la muestra de partículas y es filtrada por el filtro de color y el filtro de interferencia (es decir, básicamente la luz de fluorescencia) mediante un sensor de imagen semiconductor complementario de óxido metálico, CMOS. Las partículas pueden ser células vivas, en particular, microorganismos y, más en particular, bacterias y la muestra pueden
proporcionarse en forma de micropelícula o biopelícula. Las realizaciones del dispositivo óptico inventivo descritas anteriormente pueden utilizarse para llevar a cabo este procedimiento y las etapas de procedimiento que se mencionan a continuación. El procedimiento puede comprender, además, generar el haz de excitación irradiando un haz de luz desde un dispositivo de diodos emisores de luz, LED, en particular, que comprende una matriz de LEDs, y filtrar el haz de luz irradiado por el dispositivo LED a través de un filtro de excitación (que puede proporcionarse en forma de filtro de interferencia). De acuerdo con una realización, el procedimiento comprende, además, colimar la luz filtrada por el filtro de color y el filtro de interferencia mediante una lente de formación de imágenes y disponer la lente de formación de imágenes de manera que se obtenga un campo visual del sensor de imagen CMOS de por lo menos 250 mm2 y, en particular, 300 mm2. Cuando las partículas son bacterias u otros microorganismos y la muestra, en particular, es una biopelícula de bacterias, el procedimiento puede comprender monitorizar el crecimiento de bacterias de superficie (u otro microorganismo) en tiempo real en base a datos proporcionados por el sensor de imagen CMOS, en el que la monitorización del crecimiento de bacterias de superficie (u otro microorganismo), en particular, comprende generar una curva de crecimiento para el cultivo bacteriano (u otro microorganismo).
Además, se dispone un producto de programa de ordenador que comprende uno o más medios legibles por ordenador que tienen instrucciones ejecutables por ordenador para realizar las etapas del procedimiento de acuerdo con una de las realizaciones descritas anteriormente cuando se ejecutan en un medio de procesamiento.
El procedimiento de acuerdo con una de las realizaciones descritas anteriormente puede comprender, además, preparar la muestra de partículas formando una biopelícula sobre sustrato transparente o traslúcido, incluyendo sustratos de cristal o polímero.
Se describirán características y ventajas adicionales de la presente invención con referencia a los dibujos. En la descripción, se hace referencia a las figuras que se acompañan, las cuales pretenden ilustrar realizaciones preferidas de la invención. Se entiende que dichas realizaciones no representan todo el alcance de la invención.
La figura 1 ilustra esquemáticamente un dispositivo óptico que comprende una fuente de luz LED y un sensor de imagen CMOS de acuerdo con una realización de la presente invención. La figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un procedimiento para detectar emisión de fluorescencia de una muestra de partículas de acuerdo con una realización de la presente invención.
Las figuras 3A y 3B muestran una comparación de curvas de crecimiento obtenidas a través de mediciones de absorbencia convencionales (figura 3A) y a través de una realización del dispositivo óptico inventivo (figura 3B).
La presente invención presenta un dispositivo óptico portátil relativamente pequeño (en particular, un citómetro de superficie) que tiene una detección de emisión de fluorescencia de una muestra de partículas relativamente precisa a unos costes relativamente bajos. La figura 1 ilustra una realización de dicho dispositivo óptico 100. El dispositivo óptico 100 comprende una fuente de luz 10. La fuente de luz 10 puede ser una fuente de luz incoherente formada por un dispositivo LED que puede comprender una matriz de LEDs. Puede utilizarse un LED de alta potencia de espacio libre para la fuente de luz 10. Se seleccionan apropiadamente potencias de salida de algunos mW. En general, se prevén longitudes de onda del rango del espectro de luz entre ultravioleta e infrarrojo y potencias de salida que van hasta algún vatio.
La luz emitida por la fuente de luz 10 es colimada por una lente colimación 20. La lente colimación 20 puede ser una lente acromática. La lente acromática puede tener una longitud focal de 50 nm, por ejemplo. Además, el dispositivo óptico 100 comprende un filtro de excitación 30. El filtro de excitación 30 puede ser un filtro de interferencia (de capa fina). El filtro de excitación 30 puede tener una o varias regiones de paso de banda, en principio. Por ejemplo, el filtro de excitación 30 puede proporcionar un haz de luz con una longitud de onda central de 466 nm con una ancho de banda de 40 nm.
El haz de excitación que resulta de la colimación por la lente colimación 20 y el filtrado por el filtro de excitación 30 del haz de luz emitido por la fuente de luz 10 incide en una muestra de partículas 40. La muestra puede ser una biopelícula que se extienda horizontalmente y
comprenda microorganismos tales como, por ejemplo, bacterias. Al incidir en la muestra 40, la excitación excita la emisión de fluorescencia de las partículas de la muestra 40.
Curso abajo a lo largo del eje óptico vertical del dispositivo óptico 10, se dispone un filtro de color 50 y un filtro de emisión 60 integrados en forma de filtro de interferencia, por ejemplo, en el orden mencionado. El filtro de emisión puede realizarse depositando capas delgadas de materiales especializados sobre un sustrato de filtro plano. El sustrato de filtro puede ser un sustrato de cristal o sílice/cuarzo fundido. En el sustrato de filtro pueden formarse capas alternas de materiales de índice de refracción alto y bajo, cada uno típicamente un múltiplo entero de un cuarto de longitud de onda de grosor. Mediante una cuidadosa selección de valores de grosor y de índice de refracción para las distintas capas, puede utilizarse una interferencia controlada de ondas de luz reflejadas en cada interfaz de capa para permitir que el filtro refleje unas longitudes de onda específicas a la vez que transmita otras. El filtro de color 50 puede ser un filtro de color verde. Ni que decir tiene que el color del filtro de color 50 debe seleccionarse de acuerdo con el espectro de fluorescencia de la muestra de partículas 40. Colores comunes del filtro son azul o amarillo pálido en el bloque U, verde o amarillo intenso en el bloque B, y naranja o rojo en el bloque G.
El filtro de emisión 60 puede ser un filtro de interferencia con una longitud de onda central de 526 nm y un ancho de banda de 53 nm. Otras longitudes de onda apropiadas que podrían seleccionarse de acuerdo con la fuente de luz correspondiente, por ejemplo, un dispositivo LED con longitud de onda de emisión de 490 nm, 625 nm, o 810 nm. El filtro de color 50 y el filtro de emisión 60 se disponen con el fin de bloquear luz del haz de excitación que incide en las superficies de los filtros en todos los ángulos. Las características ópticas del filtro de emisión 60 deben adaptarse cuidadosamente a las del filtro de excitación 30 con el fin de conseguir el nivel de rechazo de longitud de onda de excitación necesario para permitir registrar la señal de emisión de fluorescencia relativamente débil. De hecho, es la combinación de tanto del filtro de color 50 como el filtro de emisión 60 que consigue la supresión apropiada de la longitud de onda de excitación del haz de excitación. Incluso con una potencia elevada, un haz mal colimado o incluso no colimado, esta combinación de filtros permite eliminar la luz de excitación que incide en la superficie de los filtros en todos los ángulos, mejorando de este modo la relación señal/ruido a pesar de un coeficiente de transmisión máximo aproximadamente de un 70% para el filtro de color 50, por ejemplo.
Curso abajo a lo largo del eje óptico vertical del dispositivo óptico 10, se dispone una lente de formación de imágenes 70. La lente de formación de imágenes 70 colima la luz que pasa por el filtro de color 50 y el filtro de emisión 70 sobre un plano de detección de superficie de un sensor de imagen CMOS 80. La lente de formación de imágenes 70 puede ir equipada con un foco manual y un iris y puede tener una longitud focal eficaz de 6 mm. La lente de formación de imágenes 70 puede configurarse y disponerse para garantizar un campo visual de más de 250 mm2 y, en particular, por lo menos 300 mm2 y una resolución espacial del sensor de imagen CMOS 80 de 280 pm (determinada utilizando un objeto de prueba USAF 1951 positivo), por ejemplo.
El sensor de imagen CMOS 80 puede comprender matrices de fotodetectores de diodos de avalancha de fotón individual (SPAD). Sin embargo, de acuerdo con una realización particular, la lente que normalmente va dispuesta sobre los elementos de detección del sensor de imagen CMOS 80 se elimina. El sensor de imagen CMOS 80 puede utilizar una configuración de filtro de Bayer para estructurar sus pixeles. Cada 2 x 2 pixeles contiguos contiene un píxel rojo, uno azul, y dos verdes. Una única captura consiste en cuatro matrices bidimensionales con un tamaño de 1640 x 1232 pixeles con 10 bits para cada pixel, por ejemplo. El tiempo de exposición y la ganancia del sensor de imagen CMOS 80 pueden regularse utilizando el software, por ejemplo. El sensor de imagen CMOS 80, de acuerdo con un ejemplo, es un sensor diagonal de 4,6 mm con una matriz de pixeles de 3280 x 2464 pixeles conocido como la versión 2 del módulo de cámara de Raspberry Pi.
El dispositivo óptico 100 también comprende una electrónica de control y procesamiento de datos (no mostrada en la figura 1). La electrónica de control y procesamiento de datos puede estar basada en un Raspberry Pi 3 Modelo B, que procesa la señal electrónica adquirida después de la detección por el sensor de imagen CMOS 80 con el fin proporcionar un recuento de fluorescencia proporcional al nivel de la emisión de la muestra. El Raspberry Pi incluye entrada/salidas de uso general (GPIOs) para conectar otros componentes electrónicos diversos según se desee. Puede diseñarse una placa de circuito impreso (PCB) para controlar la fuente de luz 10. Puede utilizarse una corriente nominal de 1A y una caída de tensión directa de 3,5 V para accionar la fuente de luz incoherente 10. Una fuente de alimentación de 5 V a 5 A puede alimentar todo el dispositivo óptico 100.
La configuración global del dispositivo óptico 100 que se muestra en la figura 1 puede tener una altura (a lo largo del eje óptico vertical) de aproximadamente 20 cm y una dimensión total de aproximadamente 20 cm x 20 cm x 10 cm. Los componentes ópticos individuales pueden montarse en unos soportes de precisión apropiados (no mostrados en la figura 1). El dispositivo óptico 100 tiene la capacidad de monitorizar la aparición temprana de formación de película de bacterias en aplicaciones clínicas, ambientales o de control de calidad de alimentos.
Ventajas principales proporcionadas por el dispositivo óptico 100, además del tamaño, portabilidad y costes, incluyen un campo visual grande de por lo menos 300 mm2 y una profundidad de campo relativamente grande que superan las limitaciones de técnicas conocidas tales como espectrofotometría y microscopía de fluorescencia. Puede conseguirse un umbral de detección de aproximadamente 104 células/mm2, lo cual está en consonancia con la técnica anterior. Además, el dispositivo óptico 100 proporciona una medición directa sin necesidad de un procesamiento de imagen posterior complejo. El dispositivo óptico 100 permite construir rápidamente una curva de crecimiento para microorganismos tales como bacterias. Una preparación de la muestra simple y un tiempo de medición rápido (<1 minuto) permiten una monitorización en tiempo real de biopelículas para controlar su formación en varias superficies incluyendo instrumentos de hospitales, alimentos, y tuberías en plantas de tratamiento de agua.
La figura 1 presenta el dispositivo funcionando en modo de transmisión. Alternativamente, puede disponerse una configuración en modo de reflexión para superficies que no son transparentes (por ejemplo, superficies metálicas o láminas delgadas). Para ello, es necesario que la trayectoria de luz de excitación y la trayectoria de detección se encuentren situadas en el mismo lado y encima de la superficie muestreada. Existen varios modos de conseguir esto: inclinando ligeramente las trayectorias de detección y excitación, utilizando polarizaciones diferentes en cada trayectoria, y utilizando espejos para redirigir la luz al detector. La configuración final para detectar la fluorescencia desde superficies reflexivas puede implicar cualquiera o una combinación de los elementos mencionados anteriormente.
En la figura 2 se ilustra un procedimiento para detectar emisión de fluorescencia de una muestra de partículas. En la etapa 210 se prepara una muestra. En la siguiente descripción se da un ejemplo concreto para la preparación de la muestra. Puede formarse una muestra
de superficie en un sustrato (portador). El sustrato puede ser un sustrato de cristal de bajo coste. Por ejemplo, puede formarse una biopelícula sobre el sustrato. Pueden añadirse fluoroforos a la superficie de la muestra donde se encuentran localizadas las partículas. Los fluoroforos puede ser tintes que intercalan ADN, tales como, por ejemplo, Verde SYBR.
La muestra es irradiada por un haz de luz de excitación 220. El haz de excitación puede formarse a partir de un haz de luz emitido por un dispositivo LED, por ejemplo, la fuente de luz 10 mostrada en la figura 1 , y una lente de colimación y un filtro de excitación, por ejemplo, la lente de colimación 20 y el filtro de excitación 30 mostrados en la figura 1. El haz de excitación provoca una emisión de luz de fluorescencia de las partículas de la muestra, por ejemplo, la muestra 40 mostrada en la figura 1.
La luz que proviene de la muestra es filtrada 230 por un filtro de color, por ejemplo, el filtro de color 50 del dispositivo óptico 100 mostrado en la figura 1. La luz filtrada por el filtro de color es filtrada 240 por un filtro de emisión, por ejemplo, el filtro de emisión 60 mostrado en la figura 1. El filtro de color y el filtro de emisión bloquean con eficacia luz del haz de luz de excitación que pasa por la muestra. La luz que pasa por el filtro de color y el filtro de emisión es colimada 250 por una lente de formación de imágenes en un plano de detección de superficie de un sensor de imagen CMOS configurado para detectar 260 la luz que proviene de la lente de formación de imágenes. Pueden utilizarse el filtro de emisión 70 y el sensor de imagen CMOS 80 del dispositivo óptico 100 que se muestra en la figura 1.
A continuación, se describe con algunos detalles un ejemplo específico para el funcionamiento de un dispositivo óptico.
Ejemplo
- Especificaciones del dispositivo óptico: La fuente de luz es un LED de alta potencia de espacio libre, que está limitada en banda utilizando un filtro de interferencia con una longitud de onda central de 466 nm y un ancho de banda de 40 nm. Se utiliza una lente acromática con una focal de 50 mm, un filtro de interferencia (que funciona como un filtro de emisión) con una longitud de onda central de 526 nm y un ancho de banda de 53 nm, un filtro de color verde, y una lente de formación de imágenes con una longitud focal eficaz de 6 mm equipada con un foco manual y un iris.
La lente de formación de imágenes se utilizó para enfocar la detección sobre el plano de la superficie y se dispuso para obtener un campo visual de 300 mm2 y una resolución espacial de 280 pm utilizando un objeto de prueba USAF 1951 positivo. El sensor de imagen CMOS es un sensor diagonal de 4,6 mm con 3280 x 2464 pixeles, también conocido como versión 2 del módulo de cámara Raspberry Pi, habiéndose eliminado la lente que va originalmente montada sobre los elementos de detección.
- Crecimiento de bacterias e incubación: Para preparar las muestras analizadas y situaciones modelo de proliferación rápida de un patógeno oportunista, se cultivó Escheríchia coli
(Invitrogen DH5 alpha strain) a 37°C en un medio de Caldo LB (Scharlau 02-384-500) con una incubadora agitadora (Thermo Fisher Scientific MaxQ8000).
El crecimiento bacteriano se controló monitorizando la densidad óptica con un espectrofotómetro (Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000c). La densidad óptica se midió a 600 nm. El crecimiento de bacterias fue monitorizado a lo largo de 8 horas. Para cada vez analizada, se coloreó una parte alícuota del cultivo y se midió con el dispositivo óptico sin procesamiento adicional. Cada parte alícuota fue tratada en triplicados y se hizo un promedio de tres adquisiciones para cada medida.
- Coloración de ácido nucleico de bacterias: Con el fin de monitorizar el crecimiento de bacterias con el dispositivo óptico, se marcaron células E. coli con un tinte de ácido nucleico fluorescente, concretamente Verde SYBR 1 (SG), a partir de una solución madre de concentrado 10.000X (Invitrogen S7563) en sulfóxido de dimetilo (DMSO). El SG tiene una absorción máxima a 490 nm y una emisión máxima a 520 nm. El SG se intercala dentro de hélices de ADN de doble cadena sin especificidad. Si está vinculada a ADN, la fluorescencia aumenta varios ordenes de magnitud. Se disolvió 10 pl de solución madre de SG en 100 mI de una solución salina tamponada de fosfato (PBS, Sigma-Aldrich P4417). Cada 1 mi de la muestra fue tratado con 1 mI. Antes de cada medición, las muestras se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para fines de monitorización del crecimiento, las muestras se marcan y se miden en diferentes valores de densidad óptica, y los resultados la citometría de superficie se comparan con resultados obtenidos con el
espectrofotómetro y un microscopio de fluorescencia (microscopio invertido Nikon Ti con cámara Andor iXon).
- Medición de superficie: Para las mediciones con el dispositivo óptico, las superficies de la muestra se prepararon combinando cubreobjetos de borosilicato con un grosor de 100 pm (cristal de Knittel) con aislantes de silicio (Grace Bio-labs GBL665301) para confinar la muestra a un zona más grande que el campo visual del instrumento. Dado que la atención se volvió hacia el efecto añadido de las células en la superficie, se limitó el procesamiento de la señal para obtener un recuento de la fluorescencia a partir de la muestra. Se correlacionó a una concentración de bacterias en células/mm2 o se utilizó para construir una curva de crecimiento completa de manera similar a las mediciones comparativas con el espectrofotómetro. Para fines de caracterización y comparación, las muestras también fueron visualizadas con un microscopio fluorescente.
- Resultados: Uno de los procedimientos más estándares para medir el crecimiento bacteriano es utilizando mediciones de absorbencia. La figura 3A muestra la curva de crecimiento promedio obtenida realizando un promedio de curvas de crecimiento individual medido en varios experimentos realizados durante varias semanas cultivando Escheríchia coli en LB líquido a 37 °C y tomando una parte alícuota (1 mL) en los instantes indicados para realizar la medición de absorbencia (densidad óptica) a 600 nm.
Los datos se dan en términos de cambios de densidad óptica, lo cual tiene en cuenta varios fenómenos incluyendo dispersión y absorción que modifican la intensidad de la luz transmitida por un medio respecto al flujo de luz incidente. Las barras de error obtenidas se originan a partir de experimentos realizados durante días diferentes con células en estados latentes diferentes antes sembrar el medio de cultivo LB. La curva resultante es un ajuste a un modelo de crecimiento de población logístico que da lugar a una proporción de semillas del tamaño del inoculo a la capacidad de carga xo = 0,0077 ± 0,001 y una tasa de crecimiento máxima r = 0,0140 ± 0,0004 s-1.
Una parte alícuota del cultivo del mismo lote se coloreó con Verde SYBR y se depositó sobre la superficie de detección del dispositivo óptico. El campo visual es mucho más grande que en un microscopio de fluorescencia convencional, lo que permite realizar mejor un promedio de la señal fluorescente de bacterias presentes en la parte alícuota coloreada. Además, el uso
de una lente de formación de imágenes en lugar de un objetivo de microscopio para interrogación de la muestra permite mayores profundidades de campo y la medición de la fluorescencia no está limitada a un volumen delgado en la superficie como en microscopía de fluorescencia. Por lo tanto, la señal fluorescente media que da el sistema proporciona una mejor evaluación del número de bacterias presentes en la parte alícuota del cultivo.
Dado que el tinte Verde SYBR permeable se une de manera muy fiable a material de ADN en cada bacteria con una alta eficacia (> 99% de bacterias individuales marcadas), puede suponerse que la señal de fluorescencia promediada sobre el gran campo visual del lector del citómetro es directamente proporcional al número de bacterias presentes. Esto indica que, de manera similar a la medición de la densidad óptica, los modelos disponibles para el crecimiento bacteriano se aplican a la situación experimental.
Además, con el fin de comparar mediciones de densidad óptica y fluorescencia obtenidas mediante el dispositivo óptico, la señal de medición es procesada para obtener /(t) = ln(C (t)/Co). C es la intensidad de la señal promediada sobre todo el sensor de imagen CMOS en el periodo de incubación t y Co es la señal promediada del sensor CMOS antes de que se introduzca cualquier muestra y es análoga a la potencia de la luz incidente utilizada para mediciones de densidad óptica /(t) constituye una medición directa y no requiere un procesamiento de imagen posterior complejo.
La figura 3B muestra la curva de crecimiento típica obtenida por el dispositivo óptico inventivo y el ajuste a un modelo de crecimiento de población logístico. Los puntos de datos por debajo del umbral de detección conocido se ignoraron en el ajuste y se omitieron de la figura 3B. Para fines de comparación, los primeros puntos de datos confiables para la curva de crecimiento obtenida por el citómetro se desplazaron para superponerse a la curva de densidad óptica.
La curva de crecimiento da xo = 0,017 ± 0,005 y r = 0,0120 ± 0,0009 s-1. Las barras de error representan ±2s donde s es la desviación estándar. La fase del retardo es ligeramente más corta que para la medición de densidad óptica y se debe probablemente a la ausencia de sensibilidad para señales débiles cuando sólo hay presentes algunas bacterias. La aparición de la fase de crecimiento exponencial y su duración antes de llegar a la fase estacionaria, sin embargo, están en consonancia con las obtenidas por mediciones de absorbencia. La fase de meseta estacionaria es ligeramente más pronunciada que para la curva de absorbencia, que
podría provenir de la saturación de la señal en el sensor CMOS. El experimento demuestra claramente la exactitud total de las mediciones y la determinación de una curva de crecimiento de un cultivo bacteriano mediante el dispositivo óptico inventivo. Todas las realizaciones citadas anteriormente no pretenden ser limitaciones, sino servir como ejemplos que ilustran características y ventajas de la invención. Debe entenderse que algunas o todas las características descritas anteriormente también pueden combinarse de maneras diferentes.
Claims
1. Dispositivo óptico para la detección de emisión de fluorescencia de una muestra de partículas localizadas en una superficie, que comprende una fuente de luz configurada para emitir un haz de luz hacia una superficie donde se encuentra situada una muestra de partículas; un filtro de color y un filtro de interferencia, estando ambos configurados para filtrar la luz que proviene de la muestra de partículas en una superficie; y un sensor de imagen de semiconductor complementario de óxido metálico, CMOS, configurado para detectar luz que pasa través del filtro de color y el filtro de interferencia.
2. Dispositivo óptico de acuerdo con la reivindicación 1 , en el que el sensor de imagen CMOS tiene elementos de detección y ninguna lente compleja y costosa montados sobre los elementos de detección.
3. Dispositivo óptico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende, además, una lente de formación de imágenes configurada y dispuesta para colimar luz al sensor de imagen
CMOS que ha pasado a través del filtro de color y el filtro de interferencia.
4. Dispositivo óptico de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la lente de formación de imágenes está configurada y dispuesta para producir un campo visual del sensor de imagen CMOS de por lo menos 250 mm2 y, en particular, por lo menos 300 mm2.
5. Dispositivo óptico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, además, una lente de colimación configurada y dispuesta para colimar el haz de luz emitido por la fuente de luz y un filtro de excitación configurado y dispuesto para filtrar el haz de luz emitido por la fuente de luz y colimado por la lente de colimación.
6. Dispositivo óptico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de luz es un dispositivo diodo emisor de luz, LED, en particular, que comprende una matriz de LEDs.
7. Dispositivo óptico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sensor de imagen CMOS comprende matrices de fotodetectores de diodos de avalancha de fotón individual (SPAD).
8. Dispositivo óptico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de partículas localizadas en una superficie es una muestra de células vivas, en particular, microorganismos, más particularmente, bacterias y en el que la muestra es o comprende, en particular, una micropelícula o biopelícula.
9. Dispositivo óptico de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende, además, un medio de procesamiento de datos configurado para derivar una tasa de crecimiento de células vivas en una superficie a partir de datos suministrados por el sensor de imagen CMOS.
10. Procedimiento para detectar emisión de fluorescencia de una muestra de partículas localizadas en una superficie, que comprende las etapas de: irradiar un haz de excitación sobre la muestra de partículas con el fin de producir la emisión de fluorescencia de la muestra de partículas; filtrar luz que proviene de la muestra de partículas en una superficie por medio de un filtro de color y un filtro de interferencia; y detectar luz que proviene de la muestra de partículas en una superficie y filtrada por el filtro de color y el filtro de interferencia mediante un sensor de imagen de semiconductor complementario de óxido metálico, CMOS.
11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende, además, generar el haz de excitación irradiando un haz de luz de un dispositivo diodo emisor de luz, LED, en particular, que comprende una matriz de LEDs, y filtrar el haz de luz irradiada por el dispositivo LED mediante un filtro de excitación.
12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 o 11 , en el que las partículas son células vivas, en particular, microorganismos, más particularmente, bacterias y en el que la muestra es o comprende, en particular, una micropelícula o biopelícula.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende colimar la luz filtrada por el filtro de color y el filtro de interferencia mediante una lente de formación de imágenes y disponer la lente de formación de imágenes de manera que se obtiene un campo visual del sensor de imagen CMOS de por lo menos 250 mm2, en particular, por lo menos 300 mm2.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 13, en el que las partículas son microorganismos, en particular, bacterias, y la muestra, en particular, es una biopelícula de microorganismos o bacterias, y que comprende, además, monitorizar el crecimiento superficial de los microorganismos en tiempo real en base a datos proporcionados por el sensor de imagen CMOS, en el que la monitorización del crecimiento superficial, en particular, comprende generar una curva de crecimiento para los microorganismos.
15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 14, que comprende, además, preparar la muestra de partículas formando una biopelícula sobre un sustrato de cristal.
16. Producto del programa de ordenador que comprende uno o más medios legibles por ordenador que tienen instrucciones ejecutables por ordenador para realizar las etapas del procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 14 cuando se ejecuta un medio de procesamiento.
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