WO2018220198A1 - Dispositif et procede de detection et d'imagerie d'elements biocontaminants - Google Patents

Dispositif et procede de detection et d'imagerie d'elements biocontaminants Download PDF

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WO2018220198A1
WO2018220198A1 PCT/EP2018/064513 EP2018064513W WO2018220198A1 WO 2018220198 A1 WO2018220198 A1 WO 2018220198A1 EP 2018064513 W EP2018064513 W EP 2018064513W WO 2018220198 A1 WO2018220198 A1 WO 2018220198A1
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WO
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biocontaminant
light
elements
support
incident
Prior art date
Application number
PCT/EP2018/064513
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English (en)
Inventor
Ludovic Escoubas
Marcel Pasquinelli
Léon ESPINOSA
Isabelle Tovena-Pecault
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Université D'aix-Marseille (Amu)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements

Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for detecting and imaging biocontaminant elements.
  • the device according to the present invention more particularly comprises a matrix of detector pixels having an active face on which a light is incident, a support transparent to light and which covers the active face, on which the biocontaminant elements are likely to be deposited, lighting means, which produce a light beam which is incident on the active face, and display means able to display, in the form of still images or video images, a digital signal delivered by processing means.
  • Control of bioburden is a public health issue, both in terms of food safety and health facilities or pharmacopoeia.
  • housing especially in collective housing (schools, catering, nursery, school, day care, nursing home), compliance with hygiene rules must be guaranteed. It is therefore necessary to have means of monitoring the quality of the air and the cleanliness of the environments and surfaces.
  • particulate monitoring in the area of clean and bio-clean rooms, there are optical counters for particulate monitoring (viable particle or not) as well as active monitoring samplers.
  • biocontaminants by impaction, filtration or bubbling
  • passive by sedimentation agar plates.
  • the air is usually contaminated by a diverse microbial flora that is often resistant and variable in time and space.
  • To set up a global chain of cleanliness and hygiene control we must be able to accurately and reactively measure biocontaminants.
  • we need to have in situ control means reliable and fast monitoring the growth of these biocontaminants.
  • levels of bacteriological cleanliness are defined in standard NF S 90 351.
  • the standard NF S 90 351 recommends technical performance according to the areas at risk.
  • the Good Manufacturing Practice (GMP) guide proposes four levels of cleanliness (see reference [1]). French and European GMPs also offer microbiological monitoring and classification of active production areas, in the case of the manufacture of sterile drugs.
  • the standard NF EN ISO 14698-1 describes two categories of air sampling devices applicable to controlled environments:
  • active samplers by impaction, filtration and bubbling. All these sampling techniques are based on conventional methods of culture (or culture), that is to say the ability of microorganisms, deposited on an appropriate agar culture medium, to give rise to colonies visible to the naked eye. , depending on the culture medium used and the incubation conditions (time and temperature).
  • the incubation period is usually 2 to 5 days for bacteria and 5 to 7 days for yeasts and molds. In practice, a first reading is done in the laboratory after 48 hours for bacteria and at 5 days for yeasts and molds.
  • the incubation temperature is usually 30 to 35 ° C for bacteria and 20 to 25 ° C for yeasts and molds. Note the development of alternative methods (faster than conventional methods) with a shorter response level and a level of quality of results at least equivalent to that of conventional methods.
  • This method is required by the Good Manufacturing Practices of the pharmaceutical industry for the manufacture of sterile drugs. This method does not allow a quantitative result of the aerobiocontamination but rather serves to evaluate the risk of biocontamination of an exposed surface in this environment, from a number of viable particles sedimented on the box according to the surface and exposure time. Active samplers offer active collection of biocontaminants. The different methods of collecting biocontaminants collected in a certain volume drawn from air for a certain time (or biocollectors) are:
  • Passive samplers are control plates that are exposed under the same conditions as those in which the individual or object whose biocontamination is to be monitored is being exposed.
  • control plates are then removed, packaged cleanly and transported to an incubator for incubation that will promote the growth of biocontaminants and allow a counting visible to the eye but after a significant period of up to 72h- one week following microorganisms and culture media. It is a long and tedious process which, moreover, does not guarantee the quality of the result, insofar as some of the micro-organisms present on the plates can die before arriving at the laboratory of biological analyzes, or to put in state said "adverse", that is to say a quasi lethargic state, without reproduction and therefore not detectable.
  • active samplers sedimented biocontamination results expressed in CFU per unit area.
  • Active samplers, or biocollectors have the same disadvantages as passive samplers in terms of their long response time related to the incubation period.
  • R M Rapid Microbiology Method
  • a device for detecting and imaging biocontaminant elements comprising a matrix of detector pixels having an active face on which light is incident, a light-transparent support which covers the active face, support on which the biocontaminant elements are likely to be deposited, illumination means which produce the light which is incident on the active face, processing means able to transform the signal delivered by the detector pixel array into digital signal, and display means adapted to display in the form of still images or video images the digital signal delivered by the processing means.
  • This device is described in the patent document FR 2 964 980 published on 23/03/2010.
  • the invention proposes a device for detecting and imaging biocontaminant elements which does not have the aforementioned drawbacks of the devices of the prior art and which, in particular, presents images of improved quality by emancipating itself. "speckle".
  • the invention firstly relates to a device for detecting and imaging biocontaminant elements, comprising: an array of detector pixels having an active face on which light is incident,
  • display means adapted to display, in the form of still images or video images, a digital signal delivered by processing means,
  • the device further comprises at least one filter, a polarizer and an analyzer, said polarizer and said analyzer being positioned in crossed configuration to overcome the granularities laser in said images.
  • Its second object is a method for detecting and imaging biocontaminant elements comprising the steps of:
  • a device comprising a matrix (M) of detector pixels having an active surface on which a light is incident, a light-transparent support which covers the active surface, on which support the biocontaminant elements are capable of being deposited and of multiply, lighting means that produce the incident light on the active side, viewing means capable of displaying, in the form of still images or video images, a digital signal delivered by processing means, and at least one filter, a polarizer and an analyzer, said polarizer and said analyzer being positioned in a crossed configuration; depositing and multiplying biocontaminant elements on the support;
  • M matrix
  • the support comprises one or more biocontaminant growth media; - The growth medium or biocontaminants are nutrient media of said biocontaminants; the growth medium (s) of the biocontaminants comprise fluorescent chemical markers; the support comprises a mosaic of biocontaminant growth media, the characteristics of at least two of these growth media being different; the device comprises a filter of high optical density centered around the emission wavelength of the incident light beam, with a narrow bandwidth of between plus and minus 20 nm; the device comprises a high pass filter filtering the incident light beam; the device comprises a heating system, and means for controlling the temperature of the nutrient medium or media; - The device further comprises an opaque lid enslaved; the lighting means are laser means; the matrix and / or the support are mobile; - the support is divided into one mosaic of biocontaminant growth media, the characteristics of at least two of these growth media being different; - The device further comprises an
  • Figure 1 is a schematic representation of the device according to the invention.
  • FIG. 2 schematically shows an embodiment of the device according to the invention, in which the collection medium forms a mosaic of specific agars, and in which the device comprises an optionally heated lid designed to facilitate incubation, for short durations of the order of the hour, and to optimize the detection and image of viable fluorescent particles; and
  • FIGS. 3A and 3B are real images (FIG 3A) and obtained by means of a device according to the invention (FIG 3B) in the case of an example in which a very concentrated solution (10 hours of culture in liquid medium "LB” with agitation at 32 ° C) of Bacillus subtilis whose membranes have been labeled by the fluorescent marker referenced FM 1-43 specific to the plasma membrane of any living being.
  • a very concentrated solution (10 hours of culture in liquid medium "LB” with agitation at 32 ° C) of Bacillus subtilis whose membranes have been labeled by the fluorescent marker referenced FM 1-43 specific to the plasma membrane of any living being.
  • Bacteria are microscopic unicellular living organisms, reproducing by scissiparity and whose nucleus is not delimited by a membrane. Bacteria, like all other cells, need energy. ATP is the source of universal biochemical energy. ATP is common to all forms of life, but the redox reactions involved in its synthesis are very varied according to the organisms and in particular to the bacteria. They can thus use a very wide variety of carbon source and / or energy.
  • bacteria Although their name derives from the Greek baktêria, "stick”, bacteria have various forms:
  • the size of the bacteria ranges from 0.02 micrometer for nanobacteria to 0.75 millimeter for Thiomargari ta namibiensis, visible to the naked eye. Most, however, measure between 0.5 and ⁇ .
  • Bacteria reproduce asexually, by scissiparity (a simple cell division). The genetic material is first duplicated, then the bacterium elongates, contracts in the middle and divides, forming two daughter cells identical to the mother cell.
  • the offspring of a bacterial cell is a genetically identical cell clone, called a colony.
  • the bacteria are then counted in terms of Colony Forming Units (CFU). Some bacteria divide every 20 to 40 minutes. Under favorable conditions, at the rate of a division every 30 minutes, a single cell will have produced, in fifteen hours only, one billion daughter-cells, colony visible to the naked eye. On the other hand, in bad conditions, some species produce spores, dormant forms of the cell, able to withstand extreme conditions of temperature or drought. The rate of spontaneous bacterial mutations is very high, especially when placed in an unfavorable environment.
  • a yeast is a unicellular fungus (some yeasts are however capable of displaying a pseudo-pluricellular appearance by the formation, eg, of pseudomycelium) capable of provoking the fermentation of organic animal or vegetable matter.
  • Yeasts are used for making wine, beer, spirits, industrial spirits, bread and antibiotics. These micro-organisms, of variable shape according to the species (spherical, ovoid, bottled, triangular) but generally oval, about 6 to 10 microns and up to 50 micrometers, multiply by budding or scissiparity. They are often able to perform sporulation either for the purpose of dormancy in an unfavorable environment, or for the purpose of dispersal.
  • Micro-organisms are microbiological entities, cellular or not, capable of reproducing or transferring genetic material. Mold:
  • Molds are multicellular organisms. They are filamentous microscopic fungi of the kingdom of the fungi. There are thousands of different varieties. A given species of microscopic fungus can generate several types of mycotoxins, and the same mycotoxin can be produced by several species of mold. They are molecules of low molecular weight ( ⁇ 1000 d), most often thermostable in a non-aqueous medium. Difficult to degrade, they can remain in the food even after the elimination of mold.
  • a sedimentation plate is a suitable receptacle, for example a petri dish, of suitable size, containing a suitable sterile culture medium, which is left open for a defined period of time in order to allow viable airborne particles to settle (standard NF EN ISO 14698-1) ⁇
  • Viable Unit A viable unit is one or more viable particles that are counted as one unit. When we count viable units on an agar medium, it is customary to call them "Units Formant Colonies" (UFC).
  • UBC Units Formant Colonies
  • a CEU may consist of one or more UV (NF EN ISO 14698-1 standard).
  • the invention relates to a device for sampling, early detection, and imaging of growing microorganisms.
  • This device is shown in Figure 1.
  • This device is generally a passive sampling device. However, in some embodiments, this device is an active sampling device.
  • the device according to the invention comprises:
  • visualization means MV able to display, in the form of still images or video images, a digital signal SMT delivered by processing means MT,
  • the device further comprises at least one filter F, a polarizer P and an analyzer A, said polarizer P and said analyzer A being positioned in configuration crossed to overcome the laser granularities in said images.
  • the invention proposes a new concept of so-called active sedimentation and growth plates, because they alone enable near real-time monitoring of the sedimented airborne biocontamination or surface bioburden.
  • the device according to the invention does not generally modify the aeraulic of the room to collect the viable particles. These particles settle naturally on the nutrient collection medium.
  • a pump is added to the device according to the invention, and coupled to a flow meter, so as to actively take air from the room, which is then projected onto the surface of the support, allowing a calculation of the Colony Forming Units per m 3 of air sampled for the measurement of the aerobiocontamination.
  • the support S forms a collection surface by sedimentation of the microorganisms, coated with a G agar with optimized optical properties and preferably incorporating fluorescent markers. These markers mark viable particles such as plasma membranes, nucleic acids or specific enzymatic reactions. Their use makes it possible to increase the contrast of growing biocontaminants on the nutrient medium.
  • the support S is transparent to light. It covers the active FA side of lighting and detection. It is treated to allow the development of viable particles likely to be deposited there. Furthermore, the diopter porthole-nutrient medium is treated so as to reduce the signal losses emitted by the viable particles.
  • a further originality of the invention is associated with the possibility of using disposable removable blades covered with a specific culture medium or not, in place of the porthole collector.
  • a heating system controls the temperature of the transparent support in order to promote the optimized growth of the viable particles collected, and a system for controlling the hygrometry of the nutrient medium which determines the shelf life of the nutrient medium before change.
  • a cover device C or opaque cover is disposed at the collection surface to prevent, during growth, dissemination of developing bacteria in the clean environment and optimizing the detection conditions. Synchronous servocontrol allows the placement of the opaque cover on the collection surface before the beginning of the automatic detection of viable particles deposited on the collection surface.
  • the opening and closing of the lid are synchronized with the detection phase to improve the signal / noise ratio.
  • the lid itself is optionally heated, in order to facilitate the incubation of biocontaminants for a short time, and thus improve the detection.
  • the lid is optionally equipped with at least one suction nozzle, said at least one suction nozzle being connected to a pump, for example a variable flow pump and controlled by a flowmeter allowing air aspirations at flow rates, in particular less than 100 L / min.
  • a pump for example a variable flow pump and controlled by a flowmeter allowing air aspirations at flow rates, in particular less than 100 L / min.
  • the inlet of the air sucked at the level of said at least one nozzle is carried out on the outside of the hood, and the outlet of the sucked air is located opposite the collecting agar of the biocontaminant elements, directly above the CCD or CMOS matrix.
  • the illumination means ME produce the monochromatic light which is incident on the active face. These means comprise for example a light emitting diode, a laser diode or a laser.
  • the matrix M of detector pixels is arranged directly beneath the transparent support. It has an active face on which a light is incident.
  • the detector pixel array is for example a CCD sensor array or a CMOS sensor array.
  • the exposure times of the sensor are advantageously relatively large, between 10 and 100 ms.
  • the imaging means, comprising the detector and the matrix M, and / or the support S, are displaceable in a plane, along XY axes, or in space, along XYZ axes.
  • the filter F comprises a high pass filter which cuts the incident beam.
  • the device further comprises an additional filter, centered around the emission wavelength, with a fine bandwidth, for example of the order of +/- 10 to 20 nm.
  • the polarizer P and the crossed analyzer A makes it possible to dispense with the possible "speckle" of the illumination means ME, especially when it is a laser light source.
  • the processing means MT are able to transform the signal delivered by the matrix M of detector pixels into a digital signal SMT. They comprise means capable of counting the biocontaminant elements per unit area and / or per unit of time, and means making it possible to visualize the morphology of growing biocontaminant elements.
  • the visualization means MV are able to display in the form of still images or video images the digital signal SMT delivered by the processing means in order to follow the growth of the viable particles over long periods, in particular of the order of day, a week or more. These means make it possible to follow the evolution of the size of a particle over time.
  • the device of the invention may allow a classification of certain biocontaminants.
  • biocontaminants are the GRAM + and GRAM- bacteria.
  • a marker that could be implemented for this classification is a mixture of hexidium iodide and SYTO TM 13 from ThermoFisher TM.
  • said GRAM + and GRAM- bacteria can also be the subject of a posteriori identification.
  • Such a posteriori identification may furthermore be used for a classification of other biocontaminant elements, such as yeasts, molds or fungi. It can be done, for example, by direct observation of biocontaminant elements, after sufficiently long growth. It would also provide morphological information on biocontaminant elements (eg hulls, bacilli, etc.).
  • the device advantageously has a "mosaic" culture medium G.
  • a "mosaic" culture medium G This is, in the example of Figure 2, a mosaic of 4 different agar specific different viable particles.
  • the culture medium can be a medium capable of promoting the growth of a large number of elements different biocontaminants or a specific culture medium that favors a particular type of biocontaminant.
  • Each part of the culture medium is then specific for the contaminants to be detected either because it incorporates - or not - fluorescent markers or growth inhibitors or a specific nutrient medium of a particular contaminant.
  • the processing means MT comprise means able to visualize the morphology of the biocontaminant elements.
  • the invention also relates to a system for detecting and imaging biocontaminant elements, characterized in that it comprises a set of microorganism detection and imaging devices according to the invention, the detector pixel matrices of the devices detection and imaging being networked.
  • a device as described above is provided.
  • the opaque lid is open, and said elements are deposited naturally on the agar carried by the support, by sedimentation, or actively, if said lid is provided with nozzles connected to a suction pump coupled to a flow meter. These biocontaminant elements multiply on the support.
  • the lid is closed and the transparent support carrying said elements is illuminated from below by the lighting means. The light produced by these lighting means is reemitted by the biocontaminant elements. It is filtered, then crosses the crossed set formed by the polarizer and the analyzer, before treatment, which eliminates the shimmering in the images.
  • An image signal is acquired by the detector pixel array and this acquired signal is processed by the processing means and then sent to the display means for viewing of still images or video representative of the biocontaminant elements.
  • the device and the method according to the invention constitute a simple and easily transportable means which makes it possible to follow, in situ and continuously, or even in network, the microorganisms likely to develop in biofilm on the surfaces.
  • a list of advantages of the device and method according to the invention is mentioned below:
  • the invention has applications in all industries (pharmaceutical and food industry, but also space, micromechanics, optics, nanotechnologies), and in health facilities and in the fight against bioterrorism.
  • a device according to the invention was made using a petri dish comprising a TSA culture medium incorporating a fluorescent marker referenced FM 1-43 in Thermofisher TM.
  • a drop of very concentrated solution (10 hours of culture in LB liquid medium with agitation at 32 ° C.) of Bacillus subtilis was deposited in this box, the objective of the experiment not being to be representative of the mode of deposit but to show the proper functioning of the opto-mechanical device.
  • a monochromatic incident laser source at 447 nm was used with a cross polarizer and analyzer.
  • the exposure times were between 10 and 100 ms and 8 and 20 images were acquired.
  • a pixel of the image corresponds to 18 ⁇ .
  • the sensor itself has pixels of 6.45 ⁇ of sides, which can be optimized, given the quality of cameras available today.
  • the assembly of the optimized device with opaque cover of the petri dish corresponds to the configuration optimized in terms of contrasts of the bacteria on the agar plate.
  • the photograph of Figure 3A corresponds to the actual image.
  • the photograph of FIG. 3B is the fluorescence image obtained by means of a device according to the invention, under the specific conditions implemented in this example. It is clear that the device according to the invention eliminates the "speckle".

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Abstract

L'invention concerne un dispositif et un procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants (BC), comprenant une matrice (M) de pixels détecteurs ayant une face active (FA) sur laquelle une lumière (L) est incidente, un support (S) transparent à la lumière qui couvre la face active (FA) et des moyens d'éclairage (ME) qui produisent la lumière (L) incidente sur la face active (FA), des moyens de visualisation (MV). L'invention se caractérise en ce que la lumière incidente (L) est la lumière émise par les éléments biocontaminants (BC) et en ce que le dispositif comprend en outre en outre au moins un filtre (F), un polariseur (P) et un analyseur (A), ledit polariseur (P) et ledit analyseur (A) étant positionnés en configuration croisée pour s'affranchir des granularités laser dans les images.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE DE DETECTION ET D'IMAGERIE
D'ELEMENTS BIOCONTAMINANTS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un dispositif et un procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants . Le dispositif selon la présente invention comprend plus particulièrement une matrice de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière et qui recouvre la face active, sur lequel les éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer, des moyens d'éclairage, qui produisent un faisceau de lumière qui est incident sur la face active, et des moyens de visualisation aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique délivré par des moyens de traitement.
ART ANTERIEUR
La maîtrise de la biocontamination est un enjeu de santé publique, aussi bien au niveau de la sécurité alimentaire qu'au niveau des établissements de santé ou de la pharmacopée. De même, dans l'habitat, en particulier dans l'habitat collectif (établissements scolaires, restauration, crèche, école, garderie, maison médicalisée) , le respect des règles d'hygiène doit être garanti. Il est donc nécessaire de disposer de moyens de suivi de la qualité de l'air et de la propreté des environnements et surfaces.
Dans le domaine des salles propres et bio-propres, il existe des compteurs optiques pour le suivi particulaire (particule viable ou non) ainsi des échantillonneurs actifs de suivi des biocontaminants (par impaction, filtration ou barbotage) ou passifs par sédimentation (géloses) .
L'air est généralement contaminé par une flore microbienne diversifiée qui est souvent résistante et variable dans le temps et l'espace. Pour mettre en place une chaîne globale de la maîtrise de la propreté et de l'hygiène, il faut pouvoir mesurer de manière précise et réactive les biocontaminants . De plus, compte tenu de la cinétique de reproduction de ces biocontaminants (pour certaines bactéries, toutes les 20 à 40 minutes) , il faut pouvoir disposer de moyens de contrôle in situ, fiables et rapides de suivi de la croissance de ces biocontaminants . Pour les établissements de santé, les niveaux de propreté bactériologique sont définis dans la norme NF S 90 351. La norme NF S 90 351 recommande des performances techniques en fonction des zones à risques. Dans le domaine pharmaceutique, le guide des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) propose quatre niveaux de propreté (cf. référence [1]) . Les BPF françaises et européennes proposent aussi une surveillance et une classification microbiologique des zones de production en activité, dans le cas de la fabrication des médicaments stériles.
La norme NF EN ISO 14698-1 décrit deux catégories de dispositifs de prélèvement d'air applicables aux environnements maîtrisés :
les échantillonneurs passifs : plaques de sédimentation
les échantillonneurs actifs : par impaction, filtration et barbotage. Toutes ces techniques de prélèvement reposent sur les méthodes conventionnelles de culture (ou culturales) c'est- à-dire l'aptitude des microorganismes, déposés sur un milieu de culture gélosé approprié, à donner naissance à des colonies visibles à 1 'œil nu, en fonction du milieu de culture utilisé et des conditions d'incubation (durée et température) .
La durée d'incubation est habituellement de 2 à 5 jours pour les bactéries et de 5 à 7 jours pour les levures et moisissures. En pratique, une première lecture est faite en laboratoire après 48h pour les bactéries et à 5 jours pour les levures et moisissures. La température d'incubation est habituellement de 30 à 35 °C pour les bactéries et 20 à 25°C pour les levures et moisissures. A noter le développement de méthodes alternatives (plus rapides que les méthodes conventionnelles) présentant un niveau de réponse plus court et un niveau de qualité des résultats au moins équivalent à celui des méthodes conventionnelles.
Parmi ces méthodes alternatives, retenons la cytométrie de flux, la fluorescence des particules, intrinsèque ou après marquage par un fluorochrome . Pour ce qui concerne le marquage reposant sur une réaction enzymatique avec le réactif fluorochrome, seuls les micro¬ organismes viables sont rendus fluorescents. Cette technologie allie la filtration de l'échantillon, le marquage direct des micro-organismes viables et le dénombrement de cellules par cytométrie à balayage laser et visualisation au moyen d'un microscope à épi-fluorescence automatisé, en moins de 3 heures. A ce jour, le suivi des processus de biocontamination s'effectue en utilisant des échantillonneurs passifs ou actifs . Les échantillonneurs actifs fonctionnent par sédimentation. La sédimentation est une méthode simple consistant à collecter les micro-organismes par gravité sur des boites de Pétri ouvertes contenant des milieux de culture gélosés. Les résultats sont exprimés par unité de surface pendant un temps donné. Cette méthode est requise par les Bonnes Pratiques de Fabrication de l'industrie pharmaceutique pour la fabrication des médicaments stériles. Cette méthode ne permet pas d'avoir un résultat quantitatif de 1 ' aérobiocontamination mais sert plutôt à évaluer le risque de biocontamination d'une surface exposée dans cet environnement, à partir d'un nombre de particules viables sédimentées sur la boite en fonction de la surface et du temps d'exposition. Les échantillonneurs actifs proposent une collecte active des biocontaminants . Les différentes méthodes de collecte des biocontaminants recueillis dans un certain volume aspiré d'air pendant un certain temps (ou biocollecteurs) sont :
- la méthode par impaction sur le milieu de culture qui est la plus répandue et qui impose une brève durée d'échantillonnage suivie d'une longue durée de mise en culture et d'analyse microbiologique ;
- la méthode par filtration qui permet des prélèvements plus longs (optimaux sur 8h) et le recours à différentes méthodes d'analyse microbiologique après récupération de la membrane filtrante en milieu liquide et dilutions successives de l'échantillon (il convient toutefois de s'assurer que les conditions de filtration n'affectent pas la viabilité des micro-organismes recueillis) ;
- la méthode par barbotage en milieu liquide qui a pour intérêt majeur d'éviter le risque de dessiccation de l'échantillon, les microorganismes étant transférés directement en milieu liquide. Cette méthode de collecte est jugée moins stressante pour les biocontaminants et serait donc à privilégier. L'art antérieur présente les inconvénients suivants.
Les échantillonneurs passifs sont des plaques témoins que l'on expose dans les mêmes conditions que celles dans lesquelles est exposé l'individu ou l'objet dont on cherche à surveiller la biocontamination.
Ces plaques témoin sont ensuite prélevées, conditionnées proprement et transportées jusqu'à une étuve pour une mise en incubation qui va favoriser la croissance des biocontaminants et permettre un dénombrement visible à l'ceil mais après une durée non négligeable pouvant aller jusqu'à 72h-une semaine suivant les microorganismes et les milieux de culture. C'est un processus long et fastidieux qui, de plus, ne garantit pas la qualité du résultat, dans la mesure où certains des micro-organismes présents sur les plaques peuvent mourir avant d'arriver au laboratoire d'analyses biologiques, ou encore se mettre en état dit « adverse », c'est-à-dire un état quasi léthargique, sans reproduction et donc non détectable.
Les résultats obtenus avec ces échantillonneurs actifs sont des résultats de biocontamination sédimentée exprimés en UFC par unité de surface. Les échantillonneurs actifs, ou biocollecteurs, présentent les mêmes inconvénients que les échantillonneurs passifs quant à leur temps de réponse longs liés à la période d'incubation.
A noter toutefois qu'il existe aujourd'hui des échantillonneurs actifs qui permettent de palier à cet inconvénient car ils sont couplés à des méthodes de microbiologie rapide (Rapid Microbiology Method ou R M) . Citons parmi ces RMM, les méthodes qui reposent sur 1 ' autofluorescence détectée par un système d'imagerie CCD ou CMOS. Une méthode encore plus efficace est la méthode de marquage fluorescent et excitation laser qui permet de détecter des microcolonnies en croissance. Les résultats de biocontamination obtenus avec ces préleveurs actifs sont des données de biocontamination aéroportée et s'expriment en UFC par unité de volume prélevé. II existe en conséquence au moins deux sources d'erreur dans le dénombrement actuel des micro-organismes selon les, techniques de l'art antérieur :
au niveau de la collecte dynamique des microorganismes (une étude récente (cf. référence [2]) a montré une efficacité physique qui varie entre 1 et 100% suivant les modèles de biocollecteurs,
- au niveau de la culture elle-même car la même étude montre que l'efficacité biologique de culture à partir d'un échantillon de L. Pneumophila par exemple en milieu liquide peut varier de 1 à 5.
Le dispositif selon l'invention ne présente pas ces inconvénients . Par ailleurs, on connaît, selon l'art antérieur, un dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants comprenant une matrice de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière et qui recouvre la face active, support sur lequel les éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer, des moyens d'éclairage qui produisent la lumière qui est incidente sur la face active, des moyens de traitement aptes à transformer le signal délivré par la matrice de pixels détecteurs en signal numérique, et des moyens de visualisation aptes à visualiser sous forme d'images fixes ou d'images vidéo le signal numérique délivré par les moyens de traitement. Ce dispositif est décrit dans le document brevet FR 2 964 980 publié le 23/03/2010.
Toutefois, les images fixes ou vidéo obtenues par ce dispositif comportent des granularités laser, des tavelures et/ou présentent un chatoiement, formant des petites taches. En langue anglaise, ces taches sont dénommées "speckle".
RESUME DE L'INVENTION L'invention propose un dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants qui ne présente pas les inconvénients précités des dispositifs de l'art antérieur et qui, notamment, présente des images de qualité améliorée en s ' affranchissant du "speckle".
A cet effet, l'invention a pour premier objet un dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants , comprenant : une matrice de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente,
un support transparent à la lumière qui couvre la face active, sur lequel support, des éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer et de se multiplier,
des moyens d'éclairage qui produisent la lumière incidente sur la face active,
des moyens de visualisation aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique délivré par des moyens de traitement,
caractérisé en ce que la lumière est la lumière réémise par les éléments biocontaminants et en ce que le dispositif comprend en outre au moins un filtre, un polariseur et un analyseur, ledit polariseur et ledit analyseur étant positionnés en configuration croisée pour s'affranchir des granularités laser dans lesdites images.
Elle a pour second objet un procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants comprenant les étapes de :
fourniture d'un dispositif comprenant une matrice (M) de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière qui couvre la face active, sur lequel support les éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer et de se multiplier, des moyens d'éclairage qui produisent la lumière incidente sur la face active, des moyens de visualisation aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique délivré par des moyens de traitement, et au moins un filtre, un polariseur et un analyseur, ledit polariseur et ledit analyseur étant positionnés en configuration croisée ; dépose et multiplication des éléments biocontaminants sur le support ;
éclairage du support portant les éléments biocontaminants par les moyens d'éclairage ;
filtration de la lumière réémise par les éléments biocontaminants par le filtre, et polarisation et analyse de ladite lumière filtrée ;
acquisition d'un signal d'image par la matrice de pixels détecteurs ;
traitement de ce signal acquis par les moyens de traitement et communication du signal numérique aux moyens de visualisation en vue de la visualisation d'images fixes ou vidéo représentatives des éléments biocontaminants . De manière avantageuse, - le support comprend un ou plusieurs milieux de croissance des biocontaminants ; - le ou les milieux de croissance des biocontaminants sont des milieux nutritifs desdits biocontaminants ; - le ou les milieux de croissance des biocontaminants comprennent des marqueurs chimiques fluorescents ; - le support comprend une mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants, les caractéristiques d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes ; - le dispositif comprend un filtre de forte densité optique centré autour de la longueur d'onde d'émission du faisceau de lumière incident, avec une bande passante étroite, comprise entre plus et moins 20 nm ; le dispositif comprend un filtre passe haut filtrant le faisceau de lumière incident ; - le dispositif comprend un système de chauffage, et des moyens de contrôle de la température du ou des milieux nutritifs ; - le dispositif comporte en outre un couvercle opaque asservi ; - les moyens d'éclairage sont des moyens laser ; - la matrice et/ou le support sont mobiles ; - le support est divisé en une mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants, les caractéristiques d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes ; - le dispositif comprend en outre un couvercle opaque (C) , et l'ouverture et la fermeture de ce couvercle sont synchronisées avec la phase de détection ; et - le dispositif comprend en outre une pompe couplée à un débitmètre, de manière à prélever activement l'air de la salle, qui est projeté à la surface du support et les Unités Formant Colonies par m3 d'air prélevé sont calculées, et 1 ' aérobiocontamination mesurée.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description non limitative qui suit, rédigée au regard des dessins annexés, dans lesquels :
la figure 1 est une représentation schématique du dispositif selon l'invention ;
la figure 2 présente, de manière schématique, un mode de réalisation du dispositif selon l'invention, dans lequel le milieu de collecte forme une mosaïque de géloses spécifiques, et dans lequel le dispositif comprend un couvercle éventuellement chauffant visant à faciliter l'incubation, sur des courtes durées de l'ordre de l'heure, et à optimiser la détection et l'image des particules viables fluorescentes ; et
les figures 3A et 3B sont des images réelle (Fig. 3A) et obtenues au moyen d'un dispositif selon l'invention (Fig. 3B) dans le cas d'un exemple dans lequel une solution très concentrée (10 heures de culture en milieu liquide « LB » avec agitation à 32°C) de Bacillus subtilis dont les membranes ont été marquées par le marqueur fluorescent référencé FM 1-43 spécifique de la membrane plasmique de tout être vivant.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Des définitions sont données ci-dessous, de termes utilisés dans la présente description selon l'invention.
Bio-contamination :
Contamination d'une matière, d'un appareil, d'un individu, d'une surface, d'un liquide, d'un gaz ou de l'air par des particules viables selon la norme ISO 14698-1. Les biocontaminants présentent pour particularités supplémentaires par rapport à une contamination particulaire ou chimique :
- leur capacité à se reproduire très rapidement,
- leur capacité à muter, s'adapter aux conditions même les plus sévères.
Les grandes familles de biocontaminants sont :
- les bactéries,
- les virus,
- les levures, les moisissures et les champignons.
Bactéries :
Les bactéries sont des êtres vivants unicellulaires microscopiques, se reproduisant par scissiparité et dont le noyau n'est pas délimité par une membrane. Les bactéries, comme toutes les autres cellules, ont besoin d'énergie. L'ATP est la source d'énergie biochimique universelle. L'ATP est commune à toutes les formes de vie, mais les réactions d ' oxydoréduction impliquées dans sa synthèse sont très variées selon les organismes et notamment chez les bactéries. Elles peuvent ainsi utiliser une très large variété de source de carbone et/ou d'énergie.
Bien que leur nom dérive du grec baktêria, « bâton », les bactéries ont des formes variables :
- sphérique (cocci, du grec kôkkos, grain ou microcoques) ,
- en bâtonnet (bacilles pl. baccili, du Latin baculus, bâton) ,
- ou spiralée ( spirochètes ) . La taille des bactéries varie de 0,02 micromètre pour les nanobactéries à 0,75 millimètre pour Thiomargari ta namibiensis, visible à 1 'œil nu. La plupart mesure toutefois entre 0,5 et ΙΟΟμιη. Les bactéries se reproduisent de façon asexuée, par scissiparité (une simple division cellulaire) . Le matériel génétique est tout d'abord dupliqué, puis la bactérie s'allonge, se contracte en son milieu et se divise, formant deux cellules filles identiques à la cellule mère.
Ainsi, la descendance d'une cellule bactérienne est un clone de cellules génétiquement identiques, appelé colonie. On dénombre ensuite les bactéries en termes d'Unités Formant Colonies (UFC) . Certaines bactéries se divisent toutes les 20 à 40 min. Dans des conditions favorables, à raison d'une division toutes les 30 min, une seule cellule aura produit, en quinze heures seulement, un milliard de cellules-filles, colonie visible à l'oeil nu. En revanche, dans de mauvaises conditions, certaines espèces produisent des spores, formes dormantes de la cellule, capables de supporter des conditions extrêmes de température ou de sécheresse. Le taux de mutations spontanées des bactéries est très élevé, surtout lorsqu'elles sont placées dans un environnement défavorable.
Levure :
Une levure est un champignon unicellulaire (certaines levures sont cependant capables d'arborer un aspect pseudo pluricellulaire par la formation, par ex., de pseudomycélium) apte à provoquer la fermentation des matières organiques animales ou végétales. Les levures sont employées pour la fabrication du vin, de la bière, des spiritueux, des alcools industriels, du pain et d' antibiotiques . Ces micro-organismes, de forme variable selon l'espèce (sphérique, ovoïde, en bouteille, triangulaire) mais généralement ovales, d'environ 6 à 10 microns et jusqu'à 50 micromètres, se multiplient par bourgeonnement ou par scissiparité. Ils sont souvent capables d'accomplir une sporulation soit dans un but de dormance en milieu défavorable, soit dans un but de dispersion.
Micro-organismes : Les micro-organismes sont des entités microbiologiques, cellulaires ou non, capables de se reproduire ou de transférer du matériel génétique. Moisissures :
Les moisissures sont des organismes pluricellulaires . Ce sont des champignons microscopiques filamenteux du règne des mycètes. Il en existe des milliers de variétés différentes. Une espèce donnée de champignon microscopique peut générer plusieurs types de mycotoxines, et une même mycotoxine peut être produite par plusieurs espèces de moisissures. Ce sont des molécules de faible poids moléculaire (<1000 d) , le plus souvent thermostables en milieu non aqueux. Difficilement dégradables, elles peuvent subsister dans les denrées même après l'élimination des moisissures.
Plaque de sédimentation :
Une plaque de sédimentation est un réceptacle adapté, par exemple une boite de Pétri, de taille appropriée, renfermant un milieu de culture approprié, stérile, que l'on laisse ouvert pendant une durée définie afin de laisser se déposer des particules viables aéroportées (norme NF EN ISO 14698- 1) ·
Unité viable (UV) : Une unité viable est formée d'une ou plusieurs particules viables que l'on dénombre comme une seule unité. Lorsque l'on dénombre des unités viables sur un milieu gélosé, il est d'usage de les appeler « Unités Formant Colonies » (UFC) . Une UFC peut se composer d'une ou de plusieurs UV (norme NF EN ISO 14698-1) .
Classification des micro-organismes : Dans les normes actuellement accessibles de la série 14644 et 14698, il n'existe pas de classification de la biocontamination ni en volume, ni en surface. Toutefois, la norme ISO 14698-1 préconise des mesures visant à dénombrer des unités viables par dm2 et par heure pour évaluer des cinétiques de contamination.
L'invention concerne un dispositif de prélèvement, de détection précoce, et d'imagerie de microorganismes en croissance. Ce dispositif est montré à la figure 1. Ce dispositif constitue généralement un dispositif d'échantillonnage passif. Toutefois, dans certains modes de réalisation, ce dispositif est un dispositif d'échantillonnage actif.
De manière générale, le dispositif selon l'invention comprend :
une matrice M de pixels détecteurs ayant une face active FA sur laquelle une lumière L est incidente,
un support S transparent à la lumière qui couvre la face active FA, sur lequel support S, des éléments biocontaminants BC sont susceptibles de se déposer et de se multiplier, des moyens d'éclairage ME qui produisent la lumière L incidente sur la face active FA,
des moyens de visualisation MV aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique SMT délivré par des moyens de traitement MT,
caractérisé en ce que la lumière L est la lumière réémise par les éléments biocontaminants BC et en ce que le dispositif comprend en outre au moins un filtre F, un polariseur P et un analyseur A, ledit polariseur P et ledit analyseur A étant positionnés en configuration croisée pour s'affranchir des granularités laser dans lesdites images. L'invention propose un nouveau concept de plaques de sédimentation et de croissance dites actives, car elles permettent à elles seules un suivi en quasi temps réel de la biocontamination aéroportée sédimentée ou de biocontamination surfacique. Le dispositif selon l'invention ne modifie généralement pas l'aéraulique de la salle pour prélever les particules viables. Ces particules se déposent naturellement sur le milieu nutritif de collecte. Toutefois, dans certains modes de réalisation, une pompe est ajoutée au dispositif selon l'invention, et couplée à un débitmètre, de manière à prélever activement l'air de la salle, qui est projeté ensuite à la surface du support, en permettant un calcul des Unités Formant Colonies par m3 d'air prélevé, pour la mesure de 1 ' aérobiocontamination .
Le support S forme une surface de collecte par sédimentation des microorganismes, recouverte d'une gélose G à propriétés optiques optimisées et intégrant, préfèrentiellement , des marqueurs fluorescents. Ces marqueurs marquent les particules viables telles que les membranes plasmiques, les acides nucléiques ou les réactions enzymatiques spécifiques. Leur utilisation permet d'augmenter le contraste des biocontaminants en croissance sur le milieu nutritif. Le support S est transparent à la lumière. Il couvre la face active FA d'éclairage et de détection. Il est traité pour permettre le développement des particules viables susceptibles de s'y déposer. Par ailleurs, le dioptre hublot- milieu nutritif est traité de manière à diminuer les pertes de signal émis par les particules viables. Une originalité supplémentaire de l'invention est associée à la possibilité d'utiliser des lames amovibles jetables recouvertes d'un milieu de culture spécifique ou non, en lieu et place du hublot collecteur. Ces lames pourront être chauffées in situ pour optimiser les conditions de croissance et permettre la visualisation de la croissance des UFC, voire des biofilms en temps réel. Enfin, un système de chauffage contrôle la température du support transparent afin de favoriser la croissance optimisée des particules viables collectées, et un système de contrôle de l'hygrométrie du milieu nutritif qui détermine la durée de vie du milieu nutritif avant changement .
Un dispositif de couverture C ou de cache opaque est disposé à la surface de collecte pour éviter, pendant la croissance, la dissémination des bactéries en développement dans l'environnement propre et optimisant les conditions de détection. Un asservissement synchrone permet la mise en place du cache opaque sur la surface de collecte avant le début de la détection automatique des particules viables déposées sur la surface de collecte. L'ouverture et la fermeture du couvercle sont donc synchronisées avec la phase de détection pour améliorer le rapport signal/bruit. Par ailleurs, le couvercle lui-même est éventuellement chauffant, en vue de faciliter l'incubation des biocontaminants sur une durée courte, et d'améliorer ainsi la détection. Le couvercle est éventuellement équipé d'au moins une buse d'aspiration, ladite au moins une buse d'aspiration étant reliée à une pompe par exemple à débit variable et contrôlé par un débitmètre autorisant des aspirations d'air à des débits notamment inférieurs à 100 L/min. L'entrée de l'air aspiré au niveau de ladite au moins une buse est effectuée sur la partie extérieure du capot, et la sortie de l'air aspiré est située face à la gélose collectrice des éléments biocontaminants , à l'aplomb de la matrice CCD ou CMOS. Les moyens d'éclairage ME produisent la lumière monochromatique qui est incidente sur la face active. Ces moyens comprennent par exemple une diode électroluminescente, une diode laser ou un laser.
La matrice M de pixels détecteurs est disposée directement au-dessous du support transparent. Elle a une face active sur laquelle une lumière est incidente. La matrice de pixels détecteurs est par exemple une matrice de capteurs CCD ou une matrice de capteurs CMOS. Les temps d'exposition du capteur sont avantageusement relativement importants, compris entre 10 et 100 ms . Les moyens d'imagerie, comprenant le détecteur et la matrice M, et/ou le support S, sont déplaçables dans un plan, selon des axes XY, ou dans l'espace, selon des axes XYZ .
Le filtre F comprend un filtre passe haut qui coupe le faisceau incident. Le dispositif comprend en outre un filtre supplémentaire, centré autour de la longueur d'onde d'émission, avec une bande passante fine, par exemple de l'ordre de +/-10 à 20 nm. Le polariseur P et l'analyseur A croisés permet de s'affranchir du « speckle » éventuel des moyens d'éclairage ME, notamment lorsqu'il s'agit d'une source de lumière laser.
Les moyens de traitement MT sont aptes à transformer le signal délivré par la matrice M de pixels détecteurs en signal numérique SMT . Ils comprennent des moyens aptes à dénombrer les éléments biocontaminants par unité de surface et/ou par unité de temps, et des moyens permettant de visualiser la morphologie des éléments biocontaminants en croissance .
Les moyens de visualisation MV sont aptes à visualiser sous forme d'images fixes ou d'images vidéo le signal numérique SMT délivré par les moyens de traitement afin de suivre la croissance des particules viables sur des longues périodes, notamment de l'ordre de la journée, à une semaine ou plus. Ces moyens permettent de suivre l'évolution de la taille d'une particule au cours du temps.
Le dispositif de l'invention peut permettre une classification de certains biocontaminants . Ces biocontaminants sont les bactéries GRAM+ et GRAM- . Un marqueur, qui pourrait être mis en œuvre pour cette classification, est un mélange d'hexidium iodide et de SYTO™ 13 de ThermoFisher™. Toutefois, lesdites bactéries GRAM+ et GRAM- peuvent aussi faire l'objet d'une identification a posteriori . Une telle identification a posteriori peut en outre être utilisée pour une classification d'autres éléments biocontaminants , tels que les levures, moisissures ou champignons. Elle peut se faire, par exemple, par observation directe des éléments biocontaminants , après croissance suffisamment longue. Elle permettrait de donner également des informations morphologiques sur les éléments biocontaminants (ex. coques, bacilles, etc.).
A cet effet, et ainsi que cela est montré à la figure 2, le dispositif dispose avantageusement d'un milieu de culture G « mosaïque ». Il s'agit, dans l'exemple de la figure 2, d'une mosaïque de 4 géloses différentes spécifiques de différentes particules viables. Le milieu de culture peut être un milieu apte à favoriser la croissance d'un grand nombre d'éléments biocontaminants différents ou un milieu de culture spécifique qui favorise un type de biocontaminant particulier. Chaque partie du milieu de culture est alors spécifique des contaminants à détecter soit parce qu'elle intègre - ou non - des marqueurs fluorescents ou des inhibiteurs de croissance ou un milieu nutritif spécifique de tel ou tel contaminant.
Selon encore une autre caractéristique supplémentaire de l'invention, les moyens de traitement MT comprennent des moyens aptes à visualiser la morphologie des éléments biocontaminants .
L'invention concerne également un système de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants , caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble de dispositifs de détection et d'imagerie de microorganismes conformes à l'invention, les matrices de pixels détecteurs des dispositifs de détection et d'imagerie étant mises en réseau.
Pour la mise en œuvre du procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants selon l'invention, un dispositif tel que décrit ci-dessus est fourni. Le couvercle opaque est ouvert, et lesdits éléments se déposent naturellement sur la gélose portée par le support, par sédimentation, ou alors, activement, si ledit couvercle est muni de buses reliées à une pompe d'aspiration couplée à un débitmètre. Ces éléments biocontaminants se multiplient sur le support. Pour la visualisation de ces éléments, le couvercle est refermé et le support transparent portant lesdits éléments est éclairé, par le dessous, par les moyens d'éclairage. La lumière produite par ces moyens d'éclairage est réémise par les éléments biocontaminants . Elle est filtrée, puis traverse l'ensemble croisé formé du polariseur et de l'analyseur, avant traitement, ce qui supprime les chatoiements dans les images. Un signal d'image est acquis par la matrice de pixels détecteurs et ce signal acquis est traité par les moyens de traitement, puis envoyé aux moyens de visualisation en vue de la visualisation d'images fixes ou vidéo représentatives des éléments biocontaminants .
En définitive, le dispositif et le procédé selon l'invention constituent un moyen simple et facilement transportable qui permet de suivre, in situ et en continu, voire en réseau, les microorganismes susceptibles de se développer en biofilm sur les surfaces. Une liste d'avantages du dispositif et du procédé selon l'invention est mentionnée ci-après :
contrôler les particules viables sédimentées des environnements à risques biologiques,
- permettre un suivi en continu et sur des longues périodes des particules viables en environnement contrôlé ou autre environnement même extérieur,
fournir en temps réel l'évolution des particules viables surfaciques déposées sur les surfaces d'une salle ou de plusieurs salles en même temps,
- ne pas modifier l' aéraulique de la salle par des prélèvements dynamiques,
- fournir des preuves objectives de la présence de ces particules viables avec prise de photos et suivi vidéo de leur évolution (traçabilité assurée) ,
- suivre la cinétique de croissance des unités formant colonies à partir d'une unité viable, - alerter au plus tôt de la présence de ces particules viables par détection des premiers instants de croissance, dans des temps l'ordre de l'heure,
- déduire une cinétique de biocontamination en fonction des conditions d'exploitation des salles, du nombre d'opérateurs, de visiteurs, de la température, du débit de filtration, etc. grâce au mode de prélèvement statique représentatif de la situation d'exposition des médicaments, patients ou aliments à protéger,
- permettre d'optimiser la fréquence de nettoyage des surfaces par un suivi en temps réel de la biocontamination des surfaces,
- permettre un gain réel de temps par rapport aux plaques témoins passives de l'art antérieur,
- améliorer la fiabilité des résultats en évitant tout transfert des plaques de collecte du point d'échantillonnage au point d'analyse,
- différencier les unités viables des unités mortes ou en état adverse par un suivi vidéo ou régulier de leur croissance,
- différencier les unités viables des unités mortes ou en état adverse par un éclairage laser UV et un milieu de culture intégrant des fluorochromes ,
- permettre le développement spécifique de tel ou tel micro-organisme en utilisant des milieux de culture sélectifs ,
- réaliser des procédés d'analyses de biocontaminants peu coûteux par rapport aux procédés d'analyse a posteriori en laboratoire de l'art antérieur.
L'invention trouve des applications dans toutes les industries (industrie pharmaceutique et agroalimentaire, mais aussi spatiale, micromécanique, optique, les nanotechnologies ) , et dans les établissements de santé et dans la lutte contre le bioterrorisme.
A ce jour, la maîtrise de la biocontamination passe par des prélèvements de courtes durées, via des échantillonneurs passifs ou actifs. Ensuite, ces prélèvements doivent suivre un long processus de culture à une température et pendant des durées pouvant atteindre sept jours. Le moyen de visualisation du dépôt de microorganismes en quasi temps réel proposé par l'invention est un substitut avantageux à ces échantillonneurs , d'autant qu'il est sur le concept très proche de la méthode de référence basée sur l'exposition passive de géloses aux points à risques de biocontamination de l'installation. Il permet de signaler instantanément que les niveaux d'alerte ou/et d'action sont atteints dans telle ou telle zone.
Exemple de mise en œuyre
Un dispositif selon l'invention a été réalisé en utilisant une boite de Pétri comprenant un milieu de culture TSA intégrant un marqueur fluorescent référencé FM 1-43 chez Thermofisher™. Une goutte de solution très concentrée (10 heures de culture en milieu liquide LB avec agitation à 32°C) de Bacillus subtilis a été déposée dans cette boite, l'objectif de l'expérience n'étant pas d'être représentatif du mode de dépôt mais bien de montrer le bon fonctionnement du dispositif opto-mécanique . Dans cet exemple, on a utilisé une source laser incidente monochromatique à 447 nm avec un polariseur et un analyseur croisés. Ces tests montrent que la configuration polariseur/analyseur croisés permet de s'affranchir du "speckle" de la source laser. Un filtre uniquement ne suffirait pas pour s'affranchir du "speckle". Un filtre passe-haut coupant les signaux lumineux réémis et imagé à 500 nm (DO de 6) a été utilisé. Un filtre supplémentaire, centré autour de la longueur d'onde d'émission du marqueur FM 1-43, ici centré à 600nm, avec une bande passante de +/- 16 nm a été utilisé pour n'analyser que la lumière émise par les bacillus subtilis. Les temps d'exposition ont été compris entre 10 et 100 ms et 8 et 20 images ont été acquises. Dans la configuration de cet exemple, avec l'objectif mis en œuvre, un pixel de l'image correspond à 18 μιη. Le capteur en lui-même présente des pixels de 6,45 μιη de côtés, ce qui peut être optimisé, compte tenu de la qualité des caméras disponibles aujourd'hui. Le montage du dispositif optimisé avec couverture opaque de la boite de Pétri correspond à la configuration optimisée en termes de contrastes des bactéries sur la gélose. La photographie de la figure 3A correspond à l'image réelle. La photographie de la figure 3B est l'image de fluorescence obtenue au moyen d'un dispositif selon l'invention, dans les conditions spécifiques mises en œuvre dans cet exemple. Il apparaît clairement que le dispositif selon l'invention permet de s'affranchir du "speckle".
Bibliographie
[1] Bonnes Pratiques de Fabrication de l'industrie pharmaceutique, Ministère de l'emploi, de la cohésion sociale et du logement, Ministère de la santé et des solidarités et AFSSAPS, bulletin officiel n°2007-l bis, fascicule spécial, JO du 28 décembre 2006 [2] T.L. Ha, L. Mathieu, E. Robine, Evaluation de biocollecteurs pour la détection de légionelles, Salles propres n°60, Pp 35-40, Mars 2009.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants (BC) , comprenant :
une matrice (M) de pixels détecteurs ayant une face active (FA) sur laquelle une lumière (L) est incidente,
un support (S) transparent à la lumière qui couvre la face active (FA) , sur lequel support (S) les éléments biocontaminants (BC) sont susceptibles de se déposer et de se multiplier,
des moyens d'éclairage (ME) qui produisent la lumière (L) incidente sur la face active (FA) ,
des moyens de visualisation (MV) aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique (SMT) délivré par des moyens de traitement (MT) , caractérisé en ce que la lumière incidente (L) est la lumière émise par les éléments biocontaminants (BC) et en ce que le dispositif comprend en outre au moins un filtre (F) , un polariseur (P) et un analyseur (A) , ledit polariseur (P) et ledit analyseur (A) étant positionnés en configuration croisée pour s'affranchir des granularités laser dans lesdites images.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support (S) comprend un ou plusieurs milieux de croissance des biocontaminants .
3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que le ou les milieux de croissance des biocontaminants sont des milieux nutritifs desdits biocontaminants .
4. Dispositif selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le ou les milieux de croissance des biocontaminants comprennent des marqueurs chimiques fluorescents .
5. Dispositif selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le support (S) comprend une mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants , les caractéristique d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes.
6. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un filtre de forte densité optique centré autour de la longueur d'onde d'émission du faisceau de lumière incident, avec une bande passante étroite, comprise entre plus et moins 20 nm.
7. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un filtre passe haut filtrant le faisceau de lumière incident.
8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend un système de chauffage, et des moyens de contrôle de la température du ou des milieux nutritifs.
9. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un couvercle opaque asservi.
10. Dispositif selon l'une des revendications précédente, caractérisé en ce que les moyens d'éclairage sont des moyens laser.
11. Dispositif selon l'un des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice (M) et/ou le support (S) sont mobiles.
12. Procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants (BC) comprenant les étapes de :
fourniture d'un dispositif comprenant une matrice (M) de pixels détecteurs ayant une face active (FA) sur laquelle une lumière (L) est incidente, un support (S) transparent à la lumière qui couvre la face active (FA) , sur lequel support (S) les éléments biocontaminants (BC) sont susceptibles de se déposer et de se multiplier, des moyens d'éclairage (ME) qui produisent la lumière (L) incidente sur la face active (FA) , des moyens de visualisation (MV) aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique (SMT) délivré par des moyens de traitement (MT) , et au moins un filtre, un polariseur et un analyseur, ledit polariseur et ledit analyseur étant positionnés en configuration croisée ;
dépose et multiplication des éléments biocontaminants
(BC) sur le support (S) ;
éclairage du support (S) portant les éléments biocontaminants (BC) par les moyens d'éclairage (ME) ;
filtration de la lumière réémise par les éléments biocontaminants (BC) par le filtre, et polarisation et analyse de ladite lumière filtrée ;
acquisition d'un signal d'image par la matrice de pixels détecteurs ;
traitement de ce signal acquis par les moyens de traitement et communication du signal numérique (SMT) aux moyens de visualisation (MV) en vue de la visualisation d'images fixes ou vidéo représentatives des éléments biocontaminants (BC) .
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que support (S) est divisé en une mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants , les caractéristique d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes.
14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que le dispositif comprend en outre un couvercle opaque (C) , et en ce que l'ouverture et la fermeture de ce couvercle sont synchronisées avec la phase de détection.
15. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le dispositif comprend en outre une pompe couplée à un débitmètre, de manière à prélever activement l'air de la salle, qui est projeté à la surface du support (S) et en ce que les Unités Formant Colonies par m3 d'air prélevé sont calculées, et 1 ' aérobiocontamination mesurée .
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