WO2020122022A1 - 肝機能改善剤 - Google Patents

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function
liver function
acid
pyrazino
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公則 木村
大 竹原
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東京都
株式会社ＰＲＩＳＭ ＢｉｏＬａｂ
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Definitions

  • the present invention relates to a drug useful for improving liver function.
  • C-type cirrhosis In C-type cirrhosis, hepatic reserve is maintained, and no liver failure symptoms such as jaundice, ascites, hepatic encephalopathy, and gastric/esophageal varices bleeding are compensated cirrhosis, and conditions with liver failure symptoms are decompensated cirrhosis. Call.
  • extracellular matrix fiber
  • Cirrhosis with a high degree of liver fibrosis is a high risk group for hepatocarcinogenesis.
  • the liver not only secretes bile into the digestive tract at one of the digestive glands attached to the digestive tract, but also metabolizes various substances taken into the body from the digestive tract to maintain homeostasis.
  • the main functions of the liver are (1) metabolism of substances closely related to nutrition (synthesis/storage/decomposition of glycogen, metabolism of amino acids, etc.), (2) bile production, (3) generation of blood components/ Conversion, (4) detoxification and removal of foreign substances, and (5) regulation of circulating volume by storing blood.
  • Liver dysfunction means a state in which the function of the liver is lowered due to some factor, and in many cases, an abnormal value is shown in a liver function test.
  • liver dysfunction causes hepatitis caused by hepatitis virus (eg, hepatitis B and C viruses), alcoholic liver damage caused by long-term intake of alcohol, lifestyle-related diseases such as metabolic syndrome (metabolic syndrome), obesity, and diabetes.
  • Non-alcoholic liver damage eg, non-alcoholic steatohepatitis (NASH)
  • drug-induced liver damage caused by taking drugs side effects
  • autoimmune liver damage due to abnormal autoimmunity etc. Be done.
  • hepatic dysfunction progresses, histopathological changes are observed, and after normal hepatocyte destruction and reduction and fibrosis, hepatic cirrhosis leads to liver failure.
  • liver dysfunction can be improved before the histopathological changes such as the destruction and fibrosis of normal hepatocytes occur, the progression of the disease can be suppressed and the prognosis can be expected to improve.
  • the degree of progress of histopathological changes in the liver ie, liver fibrosis
  • the severity of liver dysfunction do not always match, and even if no histopathological changes are observed, significant liver dysfunction is observed. In some cases, liver function is maintained even if histopathological changes are significant.
  • the present invention aims to provide a drug useful for improving liver function.
  • PRI-724[4-(((6S,9S,9aS)-1-(benzylcarbamoyl)-2,9-dimethyl-4,7-dioxo-8-(quinolin-8-ylmethyl)octahydro-1H-pyrazino[ [2,1-c][1,2,4]triazin-6-yl)methyl)phenyldihydrogen phosphate] has been shown to induce intracellular protein-protein interactions in the Wnt pathway, which is essential for the regulation of cancer stem cells (CSCs). It is a small molecule therapeutic drug related to inhibition.
  • PRI-724 is the active species C-82 [(6S,9S,9aS)-N-benzyl-6-(4-hydroxybenzyl)-2,9-dimethyl-4,7-dioxo-8-(quinoline-8).
  • -Ylmethyl)octahydro-1H-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxamide] prodrug which is converted to C-82 in vivo and then bound to cAMP responsive element
  • the present inventors investigated the relationship with liver function in addition to histopathological examination in an open-label, dose study (Phase I) trial of PRI-724. As a result, it was found that the histopathological effects and the effects on liver function do not necessarily match, and that PRI-724 has an independent effect on liver dysfunction, and further the effect of improving such liver function is detailed.
  • the present invention has been completed through analysis. That is, the gist of the present invention is as follows.
  • a liver function-improving agent comprising, as an active ingredient, at least one selected from 1-c][1,2,4]triazine-1-carboxamide and a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • liver function is glucose metabolism function.
  • liver function is an electron transfer system function.
  • liver function is liver synthesis.
  • improvement of liver function is not accompanied by defibrosis of the liver parenchymal region.
  • improvement in liver function is an improvement in a patient with compensated cirrhosis.
  • liver function is glucose metabolism function.
  • liver function is an electron transfer system function.
  • the liver function is liver synthesis.
  • the improvement in liver function is not accompanied by defibrosis of the liver parenchymal region.
  • the improvement in liver function is an improvement in a patient with compensated cirrhosis.
  • liver function is glucose metabolism function.
  • liver function is an electron transfer system function.
  • liver function is liver synthesis.
  • the improvement in liver function is not accompanied by defibrosis of the liver parenchymal region.
  • the improvement in liver function is an improvement in a patient with compensated cirrhosis.
  • the present invention provides 4-(((6S,9S,9aS)-1-(benzylcarbamoyl)-2,9-dimethyl-4,7-dioxo-8-(quinolin-8-ylmethyl)octahydro-1H-pyrazino[ 2,1-c][1,2,4]triazin-6-yl)methyl)phenyl dihydrogen phosphate, (6S,9S,9aS)-N-benzyl-6-(4-hydroxybenzyl)-2,9 -Dimethyl-4,7-dioxo-8-(quinolin-8-ylmethyl)octahydro-1H-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxamide and their pharmaceutically acceptable
  • the present invention provides a liver function improving agent (hereinafter, also referred to as “liver function improving agent of the present invention” or “agent of the present invention”) containing at least one selected from salts as an active ingredient. The details
  • liver function and “liver function” referred to in the present invention mean all the functions of the liver and are not particularly limited. Specific functions of the liver include blood storage (adjustment of circulating amount, etc.); treatment of hemoglobin (treatment and discharge of hemoglobin, etc.); bile production; enterohepatic circulation of bile pigments; plasma protein (acute phase protein).
  • liver mitochondria contribute to energy production in the liver by its electron transport system [Electron transport system function] Other work, published June 2018, WILEY-BLACKWELL, see).
  • “improvement” of liver function is not particularly limited, but for example, prevention or suppression of deterioration of liver function (for example, activation/maintenance/improvement of liver function and aging and diseases) In addition to prevention/improvement of liver dysfunction), it also includes therapeutic effects on acute hepatitis, chronic hepatitis, liver failure, cirrhosis, and fatty liver.
  • “improving” liver function means improving the state in which at least one of the above-mentioned liver functions is impaired, and preferably the liver glycogen/sugar metabolism ability, electron transfer system. The improvement of the functions and/or their functions when the liver synthetic ability is decreased.
  • liver function examples include, but are not limited to, specifically improvement in hepatic reserve (liver synthetic capacity), for example, suppression of reduction of hepatic glycogen at the time of liver dysfunction. Suppression of decrease of albumin amount in blood; suppression of decrease of prothrombin time, which is a test item of liver function; suppression of decrease of cytochrome C. Activation of mitochondria in hepatocytes, which are responsible for electron transport function, is also an example of improvement in liver function.
  • the effect of the agent of the present invention can be preferably evaluated by the effect on the glucose metabolism function, electron transfer system function and/or liver synthetic ability in the liver.
  • a method of evaluating the glucose metabolism function of the liver for example, a method of measuring a blood glucose level can be mentioned.
  • the blood glucose level can be generally measured by measuring the ⁇ -D-glucose concentration in blood.
  • liver glucose metabolism function by staining liver glycogen by PAS staining using a histopathological technique and observing changes in the pathological tissue.
  • the Fernandes stress test (glucose stress test, glucagon stress test and galactose stress test) is also preferable.
  • liver cytochrome C is stained by immunostaining using a histopathological method as shown in Examples, and the electron of the liver is observed by observing changes in the pathological tissue. It is also possible to evaluate the function of the transmission system.
  • Other methods for evaluating the function of the electron transport system include a method for examining the activating effect on mitochondria in hepatocytes. Examples of the method include a method using a tetrazolium compound formed by mitochondrial dehydrogenase as shown in Examples and a method using a dye that stains in a mitochondrial membrane potential-dependent manner.
  • the liver synthetic ability of the liver there is a method of measuring the amount and function of the protein synthesized in the liver. For example, it can be evaluated by measuring the amount of serum albumin as shown in Examples.
  • the amount of serum albumin can be measured by an absorptiometric method (Lowry method), electrophoresis-staining densitometry method, high performance liquid chromatography-ultraviolet absorption detection method and the like. It can also be evaluated by measuring the amount of cholinesterase or cholesterol.
  • Prothrombin is mentioned as another protein synthesized in the liver, and prothrombin time is measured as a method for evaluating its function.
  • factor VII When liver function is impaired, bile secretion is reduced and absorption of fat-soluble vitamin K is inhibited.
  • coagulation factors II, VII, IX and X are vitamin K-dependent and decrease faster than other factors synthesized in the liver.
  • factor VII has the shortest half-life, so if the hepatic synthetic capacity is reduced, the prothrombin time associated with factor VII is sharply extended.
  • Factor VII is an extrinsic coagulation factor, over time, the activated partial thromboplastin time involving endogenous coagulation factors also increases.
  • the liver function-improving agent of the present invention can improve liver function even in a situation where defibrosis of the liver parenchymal region is not observed.
  • the appearance of fibrosis and defibrosis in the liver parenchymal region can be observed and evaluated by tissue staining (eg, Sirius red staining) using a histopathological method, as shown in Examples.
  • Sirius red stain is a stain for evaluating fibrosis and stains collagen fibers in red.
  • the liver function-improving agent of the present invention comprises 4-(((6S,9S,9aS)-1-(benzylcarbamoyl)-2,9-dimethyl-4,7-dioxo-8-(quinoline-8) as an active ingredient.
  • “Pharmaceutically acceptable” means useful in the preparation of pharmaceutical compositions that are generally safe, non-toxic, and not biologically or otherwise undesirable, and Including that it is acceptable not only for pharmaceutical use but also for veterinary use.
  • “Pharmaceutically acceptable salt” means a salt of a compound of the invention, which is pharmaceutically acceptable and has the desired pharmacological activity, as defined above.
  • Such salts include, for example, inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid and phosphoric acid; or, for example, acetic acid, propionic acid, hexanoic acid, heptanoic acid, cyclopentanepropionic acid, glycolic acid, pyruvic acid.
  • Acid lactic acid, malonic acid, succinic acid, malic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, o-(4-hydroxybenzoyl)benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfone Acid, 1,2-ethanedisulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-chlorobenzenesulfonic acid, 2-naphthalenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, camphorsulfonic acid, 4-methylbicyclo[2.
  • Acceptable inorganic bases include sodium hydroxide, sodium carbonate, potassium hydroxide, aluminum hydroxide and calcium hydroxide.
  • Acceptable organic bases include ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, tromethamine, N-methylglucamine and the like.
  • the liver function-improving agent of the present invention is a human or animal (eg, mouse, rat, hamster, rabbit, as a pharmaceutical preparation formulated by a conventional method (eg, injection, capsule, tablet, powder, granule, etc.), Mammals such as cats, dogs, cows, sheep, monkeys, etc.) can be administered.
  • carriers such as distilled water and physiological saline may be used, and when formulating into capsules, tablets, powders and granules, starch, lactose, sucrose, calcium carbonate.
  • Excipients such as, starch paste, gum arabic, gelatin, sodium alginate, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and other binders, magnesium stearate, talc and other lubricants, starch, agar, crystalline cellulose, calcium carbonate Disintegrators such as sodium hydrogencarbonate and sodium alginate may be used.
  • the content of the active ingredient in the preparation can be varied from 1 to 99% by weight.
  • the active ingredient in an amount of 5 to 80% by weight, and in the case of injection, 1 to 10% by weight of the active ingredient is included.
  • the administration method is not particularly limited, and examples thereof include oral administration, intravenous administration, continuous intravenous administration, intraperitoneal administration and the like.
  • an osmotic pump filled with the pharmaceutical composition of the present invention is subcutaneously implanted and continuously administered is also preferable.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention.
  • Example 1 Histopathological examination (PRI-724) Patients with liver cirrhosis caused by hepatitis C virus who have Child-Pugh classification of A or B and cannot expect improvement by current medical treatment (subject identification code: C2-02, C2 -(((6S,9S,9aS)-1-(benzylcarbamoyl)-2,9-dimethyl-4,7-dioxo-) for -06, C2-03, C2-04, C2-07) Unlabeled 8-(quinolin-8-ylmethyl)octahydro-1H-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazin-6-yl)methyl)phenyl dihydrogen phosphate (PRI-724) In the dose study (Phase I), 1 week of continuous intravenous administration and 1 week of observation period were defined as 1 cycle, and PRI- was administered at a dose of 10, 40 and 160 mg/m 2 /day for a total of 6 cycles for 12 weeks.
  • liver tissues of patients who were administered at a dose of 40 mg/m 2 /day were further examined histopathologically to examine the relationship with liver function.
  • the liver tissue (biopsy) on the 15th day before the treatment and the 15th day after the treatment (the sixth cycle Day 15), the screening period, and the blood on the 28th day before the treatment and before the treatment were used.
  • the test methods used for the study are as follows.
  • Hematoxylin and eosin (HE) staining is a staining method capable of observing the morphology of tissues by dyeing cell nuclei and cytoplasm separately, and it is possible to grasp the entire image of cells and tissue structures by HE staining. .. A section is cut from a paraffin block of liver tissue prefixed with Bouin's solution, and stained with Lillie- Mayer's Hematoxylin (Muto Chemical Co., Ltd., Japan) and Eosin solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Silver Staining is a staining method of silver-plating reticulum fibers, which is one of the connective tissue fibers, with a silver-ammonia complex, and enables observation of a tissue construction image. It was carried out according to a conventional method (for example, see http://www.mutokagaku.com/products/reagent/pathology/nf_watanabe/).
  • Specimen sample is deparaffinized, dexyleneed, washed with water, then treated with potassium permanganate solution, 2% oxalic acid solution, 2% iron alum aqueous solution in that order, washed with water, and then reacted with ammoniacal silver solution for 5 to 10 minutes
  • the solution is treated with a reducing solution, washed with water, and then reacted with a 0.2% gold chloride solution for 10 minutes to overnight.
  • it is treated with a 2% aqueous oxalic acid solution, dipped in a photographic acidic hardener fixing solution, washed with water, dehydrated, clarified and sealed for observation.
  • PAS staining can be performed primarily for the demonstration of glycogen in tissues. Periodic acid selectively oxidizes glucose residues to produce aldehydes, which are turned red-purple by the Schiff reagent. It was carried out according to the usual method (eg, see http://www.mutokagaku.com/products/reagent/pathology/passtain/). The sample is deparaffinized, dexylene, washed with water, reacted with 0.5% periodic acid solution for 10 minutes, washed with water, reacted with Schiff reagent for 5 to 30 minutes, and treated with sulfite water and Mayer's hematoxylin solution sequentially. After washing with water and bleaching, dehydration, clearing, enclosing, and observing.
  • Cytochrome C oxidase forms a transmembrane protein complex in mitochondria with other proteins. It is the last enzyme in the electron transport system in the mitochondrial membrane, and has the function of accepting electrons from four molecules of cytochrome C, transferring them to one molecule of oxygen, and converting them into two molecules of water. During this process, water is generated from four protons derived from the mitochondrial matrix, and at the same time, four protons permeate from the matrix into the intermembrane space, and the resulting difference in the electrochemical potential between the membranes results in ATP synthase.
  • cytochrome C oxidase can be measured by the following method.
  • a method utilizing an oxidative polymerization reaction (color reaction) of diaminobenzidine (3,3'-diaminobenzidine) is carried out.
  • a solution DAB 1 mg/mL (0.1 M PBS) and B solution 0.6 mg/mL Cytochrome C, 80 mg/mL (0.1 M PBS) are prepared, and an equal amount is dropped on the deparaffinized tissue sample and incubated for several hours. After that, wash with 0.1 M PBS, dehydrate, seal, and use for microscopy.
  • Serum albumin is a protein produced in the liver, and its amount is known to decrease as liver function declines. Serum albumin can be measured by a conventional method. For example, the amount of albumin in the sample is determined by spectroscopically measuring the dye using a reagent that produces a dye when bound to albumin. Examples of such a dye include bromocresol green which reacts with albumin at around pH 4.0 to produce a blue albumin-binding dye. It is also possible to use a commercially available measuring reagent (Silica Liquid ALB, Kanto Chemical Co., Inc.). A sample is mixed with a reagent, and the absorbance of the produced binding dye is measured.
  • Prothrombin time Prothrombin is a blood coagulation factor II that is synthesized by the liver and has the property of solidifying by the addition of thromboplastin.
  • a blood sample eg, plasma
  • the measurement of PT can be performed using a commercially available measuring reagent (Coagsearch (registered trademark) PT, A&T Co., Ltd.) in the following manner. (1) Transfer reagents (including thromboplastin) dissolved in purified water to a plastic test tube and heat at 37°C.
  • Subject identification code: C2-02 (Fig. 1)
  • Subject identification code: C2-02 is Baseline and Child-Pugh Score 6 and 5 which are liver cirrhosis severity classifications in Day 15 of the 6th cycle, and Hepatitis Histology Index (HAI) 10 and 9 which is the classification of chronic hepatitis pathology. This is a case in which the fibrotic area in the liver parenchymal region slightly increased although it was improved by one stage (Table 1).
  • PAS staining (PAS staining in Fig. 1), which is a histopathological method, is a method for staining liver glycogen
  • Cytochrome C (Cyto C) is one of the constituent enzymes of the electron transfer system and important for energy production.
  • Subject identification code C2-06 (Fig. 2)
  • HAI Hepatitis Histology Index
  • the fibrotic area in the liver parenchymal region tended to improve, but it was not a significant change (Table 1).
  • Histopathological examination of the biopsy specimens revealed that PAS and Cyto C markedly increased the number of favorable sites and improved liver function.
  • Serum albumin changed from 3.7 to 4.0 during the screening period and 3.3 to 4.0 during the treatment period, but reached 4.3 after 28 days of post-treatment observation.
  • the prothrombin time (PT) was 77% during the screening period and 74% to 86% during the treatment period, but it was 92% at 28 days after treatment.
  • Subject identification code C2-03 (Fig. 3)
  • the fibrotic area in the liver parenchymal region was significantly reduced as shown in Table 1. Histopathological examination of the biopsy specimen revealed that the number of Cyto C favorable sites was slightly reduced (PAS-stained images before treatment could not be obtained).
  • Serum albumin changed from 3.1 to 3.3 during the screening period and 2.3 during the treatment period, but reached 3.4 at 28 days after treatment.
  • the prothrombin time (PT) was 51% during the screening period and 44% to 64% during the treatment period, but it was 67% at 28 days after the treatment.
  • Subject identification code C2-04 (Fig. 4)
  • Subject identification code: C2-04 had a Child-Pugh Score of 7 and 7, and a Hepatitis Histology Index (HAI) of 12 and 11 at baseline and Day 15 of the 6th cycle.
  • HAI Hepatitis Histology Index
  • the fibrotic area in the liver parenchymal region was significantly reduced as shown in Table 1.
  • a histopathological examination of the biopsy specimen revealed that the number of Cyto C favorable sites was significantly increased (PAS-stained images after treatment could not be obtained).
  • Serum albumin changed from 3.4 to 2.7 during the screening period and 2.7 to 3.3 during the treatment period, but reached 3.2 at 28 days after treatment.
  • the prothrombin time (PT) was 62% during the screening period and 61% to 67% during the treatment period, but it was 69% at 28 days after the treatment.
  • Subject identification code C2-07 (Fig. 5)
  • HAI Hepatitis Histology Index
  • the fibrotic area in the liver parenchymal region was significantly reduced as shown in Table 1. Histopathological examination of the biopsy specimens revealed that the number of PAS and Cyto C favorable sites was significantly increased. Serum albumin changed from 2.3 to 3.5 during the screening period and 2.3 during the treatment period, but reached 3.0 on the 28th post-treatment observation day.
  • the prothrombin time (PT) was 79% during the screening period and 68% to 82% during the treatment period, but was 79% at 28 days after the treatment.
  • Example 2 Cytological examination (C-82) It was verified using cell lines that C-82, which is an activator of PRI-724, activates mitochondria in hepatocytes. Human hepatoma-derived HepG2 cells and Huh7 cells were used as cell lines. Both cells are commercially available. 2-1: WST-8 assay (purpose) To verify that C82, the activator of PRI-724, activates hepatocyte intracellular mitochondria, a WST-8 assay was first performed.
  • WST-8 is generally used in cytotoxicity tests and cell growth tests of compounds, and NADH produced by intracellular dehydrogenase is WST-8(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3- (4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt) is reduced to formazan.
  • the amount of this formazan dye reflects intracellular metabolism. It is known that this dehydrogenase reaction mainly takes place in mitochondria and correlates well with the MTT assay for measuring mitochondrial enzyme activity. (Test method) For the measurement, Cell Counting Kit-8 (Dojindo) was used, and the absorbance at 450 nM was measured with an iMark microplate reader (Bio-rad).
  • HepG2 cells or Huh7 cells were seeded at 5000 cells/well in a 96-well microplate with 100 ⁇ l of DMEM 10% FBS in each well. After that, it was implemented according to the attached technical manual. (result) Results are shown in FIG. In both HepG2 cells (upper panel) and Huh7 cells (lower panel), the enzyme activity was increased up to 10% when C82 was 50 nM to 500 nM. It was suggested that the enzyme activity of C82 (1 ⁇ M) antagonized the control group, and that when C82 concentration was further increased, cytotoxicity appeared. DMSO was added to the control group.
  • C82 which is an active form of PRI-724, also has a drug effect of increasing the mitochondrial enzyme activity, and it was suggested that the peak is from 100 nM to 500 nM. This effect supports the liver function improving effect of C82.

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Abstract

本発明は、肝機能の改善に有用な薬剤を提供することを目的とする。４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート、（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド及びそれらの医薬上許容し得る塩から選択される少なくとも１種を有効成分として含む肝機能改善剤は、肝機能、特に肝疾患等の際に観察される肝臓の糖代謝機能、電子伝達系機能及び肝合成能における障害を改善することができる。

Description

肝機能改善剤
　本発明は肝機能の改善に有用な薬剤に関する。
　Ｃ型肝硬変において、肝予備能が保たれ、黄疸、腹水、肝性脳症、胃・食道静脈瘤出血などの肝不全症状がない状態を代償性肝硬変、肝不全症状を伴う状態を非代償性肝硬変と呼ぶ。肝硬変の病態は炎症により傷害を受けた生体組織の修復機能により細胞外マトリックス（線維）が蓄積するが、この過剰な線維が除去されない場合、臓器線維症を引き起こし様々な病因となる。高度の肝線維化進行がみられる肝硬変の場合、肝発癌の高リスク群となる。また、肝発癌を生じない場合でも、肝不全に進展すれば生命予後が非常に不良となる。したがって、肝硬変の治療目的は肝発癌と肝不全の両者を抑制することにある。現在、Ｃ型肝炎に起因する代償性肝硬変ではウイルスの排除を目指して積極的な抗ウイルス治療が行われている。しかし現状では、どのレジメンにおいても非代償性肝硬変に対する投与は禁忌であり、Child-Pugh分類grade B症例に対する使用も禁忌ないし避けるべきとなっている。このような状況下において、肝線維化が進展して肝不全症状を伴う非代償性肝硬変の肝機能を改善する治療薬の開発が急務であると考えられている。
　その一環として、線維自体を積極的に除去し得る薬剤の開発が進められており、例えば、熱ショックタンパク質47（Heat Shock Protein 47, HSP47）に対するsiRNAを用いた製剤が報告されている（特許文献１）。
　肝臓は、消化管に付属する消化腺の一つで消化管へ胆汁を分泌するだけでなく、消化管から体内に取り込まれた諸物質を代謝して恒常性維持にあずかる。肝臓の主な機能には、（１）栄養に関係の深い諸物質の代謝（グリコーゲンの合成・貯蔵・分解、アミノ酸の代謝等）、（２）胆汁の生産、（３）血液成分の生成・変換、（４）解毒と異物除去、（５）血液の貯蔵による循環量の調節が挙げられる。肝機能障害とはなんらかの要因で上記肝臓の機能が低下している状態を意味し、多くの場合、肝機能検査で異常値を示す。
　肝機能障害の主な原因は肝炎ウイルス（例、Ｂ型・Ｃ型肝炎ウイルス）による肝炎や、アルコールの長期摂取によるアルコール性肝障害、メタボリックシンドローム（メタボ）、肥満、糖尿病といった生活習慣病等によって起こる非アルコール性の肝障害（例、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ））、薬物の服用（副作用）によって起こる薬物誘導性の肝障害、自己免疫の異常による自己免疫性の肝障害等が挙げられる。肝機能障害は進行すると病理組織学的な変化が観察されるようになり、正常な肝細胞の破壊と減少、線維化を経て、肝硬変から肝不全に至る。
　正常肝細胞の破壊や線維化等の病理組織学的な変化が起こる前に肝機能障害を改善することができれば、病気の進行を抑制することができ予後の改善が期待できる。また、肝臓の病理組織学的な変化（即ち、肝線維化）の進行度と肝機能障害の重篤度とは必ずしも一致せず、病理組織学的な変化が観察されない場合でも著しい肝機能障害を起こしている場合があり、また、病理組織学的な変化が顕著であっても肝機能が維持されている場合もある。
特表２０１３－５１４７６１号公報
　本発明は、肝機能の改善に有用な薬剤の提供を目的とする。
　ＰＲＩ－７２４［４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート］は、がん幹細胞（ＣＳＣ）の制御に不可欠なＷｎｔ経路における細胞内のタンパク質間相互作用の阻害に関連する低分子治療薬である。ＰＲＩ－７２４は活性分子種Ｃ－８２［（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド］のプロドラッグであり、生体内でＣ－８２に変換されたのち、ｃＡＭＰ応答エレメント結合（ＣＲＥＢ）蛋白（ＣＢＰ）とβ－カテニンとの相互作用を阻害し、Ｗｎｔシグナル伝達経路の不可欠な転写ステップを停止させる薬剤で脱線維化治療薬としての開発が進められてきた。
　本発明者らは、ＰＲＩ－７２４の非盲検・用量検討試験（第Ｉ相）治験において、病理組織学的検討を加えて肝機能との関係を検討した。結果、病理組織学的な作用と肝機能に及ぼす作用とは必ずしも一致せず、ＰＲＩ－７２４が肝機能障害に対して独立した効果を有することを見出し、さらに、かかる肝機能の改善効果を詳細に解析して本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
[１]４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート、
（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド及びそれらの医薬上許容し得る塩から選択される少なくとも１種
を有効成分として含む肝機能改善剤。
[２]肝機能が糖代謝機能である、上記[１]記載の剤。
[３]肝機能が電子伝達系機能である、上記[１]記載の剤。
[４]肝機能が肝合成能である、上記[１]記載の剤。
[５]肝機能の改善が、肝実質領域の脱線維化を伴わない、上記[１]～[４]のいずれかに記載の剤。
[６]肝機能の改善が、代償性肝硬変患者における改善である、上記[１]記載の剤。
[７]４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート、
（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド及びそれらの医薬上許容し得る塩の少なくとも１種の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、肝機能を改善する方法。
[８]肝機能が糖代謝機能である、上記[７]記載の方法。
[９]肝機能が電子伝達系機能である、上記[７]記載の方法。
[１０]肝機能が肝合成能である、上記[７]記載の方法。
[１１]肝機能の改善が肝実質領域の脱線維化を伴わない、上記[７]～[１０]のいずれかに記載の方法。
[１２]肝機能の改善が、代償性肝硬変患者における改善である、上記[７]記載の方法。
[１３]肝機能の改善に使用する為の４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート、
（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド及びそれらの医薬上許容し得る塩から選択される少なくとも1種の化合物。
[１４]肝機能が糖代謝機能である、上記[１３]記載の化合物。
[１５]肝機能が電子伝達系機能である、上記[１３]記載の化合物。
[１６]肝機能が肝合成能である、上記[１３]記載の化合物。
[１７]肝機能の改善が肝実質領域の脱線維化を伴わない、上記[１３]～[１６]のいずれかに記載の化合物。
[１８]肝機能の改善が、代償性肝硬変患者における改善である、上記[１３]記載の化合物。
　４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート及び（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミドは、肝機能、特に肝臓の糖代謝機能、電子伝達系機能及び肝合成能における機能低下を改善する作用を有し、従って、肝機能改善剤として有効である。
治療前後での病理組織学的変化を示した図である（被験者識別コードＣ２－０２の場合）。 治療前後での病理組織学的変化を示した図である（被験者識別コードＣ２－０６の場合）。 治療前後での病理組織学的変化を示した図である（被験者識別コードＣ２－０３の場合）。 治療前後での病理組織学的変化を示した図である（被験者識別コードＣ２－０４の場合）。 治療前後での病理組織学的変化を示した図である（被験者識別コードＣ２－０７の場合）。 肝細胞内ミトコンドリアをＣ８２が活性化することをＷＳＴ－８アッセイにより示したグラフである。上図はＨｅｐＧ2細胞の、下図はＨｕｈ７細胞の結果をそれぞれ示す。縦軸は吸光度を、横軸はＣ８２の濃度（μＭ）をそれぞれ示す。 肝細胞内ミトコンドリアをＣ８２が活性化することをMitoBrightを用いた細胞染色により示した図である。
　本発明は、４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート、（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド及びそれらの医薬上許容される塩から選択される少なくとも１種を有効成分として含む肝機能改善剤（以下、「本発明の肝機能改善剤」あるいは「本発明の剤」とも称する）を提供するものである。以下、詳細に説明する。
　本発明でいう「肝機能」「肝臓の機能」とは、肝臓の有する機能全てを意味し、特に制限はない。肝臓が有する機能としては、具体的には、血液貯蔵（循環量の調整等）；血色素の処理（ヘモグロビンの処理排出等）；胆汁の生成；胆汁色素の腸肝循環；血漿タンパク質（急性期タンパク質、アルブミン、血液凝固因子、ステロイド結合タンパク質、他のホルモン結合タンパク質等）の合成等の血液および循環における機能［肝合成能］；栄養素とビタミン（グルコースおよび／または他の糖類、アミノ酸、脂質および／または脂肪酸、コレステロール、リポタンパク、脂溶性ビタミン、ならびに水溶性ビタミンなど）の代謝などの栄養素の代謝機能［代謝機能］；種々の物質（毒素、エストロゲンおよびアンドロステロンなどのステロイド、ならびに他のホルモンなど）の不活性化などの解毒または分解機能；および免疫機能などが挙げられる。また、肝ミトコンドリアはその電子伝達系により肝臓におけるエネルギー生産に寄与している［電子伝達系機能］（Sherlock's Diseases of the Liver & Biliary System, 13th ed. S.Dooley, A.S.F.Lok, G.Garcia-Tsao他著、2018年06月発行、WILEY-BLACKWELL社、参照）。
　本明細書中において、肝機能の「改善」とは、特に限定されないが、例えば、肝機能の低下を防止または抑制すること（例えば、肝機能の活性化・維持・改善ならびに老化および疾患に伴う肝機能障害の予防・改善など）の他、急性肝炎、慢性肝炎、肝不全、肝硬変、および脂肪肝などの治療効果をも包含して言う。本発明において、肝機能の「改善」とは、上記した肝機能のうちの少なくとも１つの機能が損なわれた状態を改善することであり、好ましくは、肝臓のグリコーゲン・糖代謝能、電子伝達系機能及び／又は肝合成能が低下した場合におけるそれらの機能の改善である。
　肝機能の「改善」の具体的な例としては、特に限定されないが、具体的には肝予備能（肝合成能）における改善であって、例えば、肝機能障害時の、肝グリコーゲンの減少抑制；血液中のアルブミン量の減少抑制；肝機能の検査項目であるプロトロンビン時間の減少抑制；チトクロームＣの減少抑制などが挙げられる。電子伝達系機能を担う、肝細胞内ミトコンドリアに対する活性化もまた、肝機能の改善の一例である。
　本発明の剤の効果は、好ましくは、肝臓における糖代謝機能、電子伝達系機能及び／又は肝合成能における作用効果によって評価することができる。
　肝臓の糖代謝機能を評価する方法としては、例えば血糖値を測定する方法が挙げられる。血糖値は、一般に血中のβ－Ｄ－グルコース濃度を測定することにより行うことができる。また、実施例に示されるように病理組織学的手法を用いたＰＡＳ染色によって肝臓のグリコーゲンを染色し、病理組織の変化を観察することによって肝臓の糖代謝機能を評価することもできる。また、フェルナンデス負荷試験（グルコース負荷試験、グルカゴン負荷試験およびガラクトース負荷試験）も好ましい。
　肝臓の電子伝達系機能を評価する方法としては、実施例に示されるように病理組織学的手法を用いた免疫染色によって肝臓チトクロームＣを染色し、病理組織の変化を観察することによって肝臓の電子伝達系機能を評価することもできる。電子伝達系機能を評価する方法としては他に、肝細胞内ミトコンドリアに対する活性化作用を調べる方法が挙げられる。当該方法としては、実施例に示されるようにミトコンドリア脱水素酵素によって形成されるテトラゾリウム化合物を用いて測定する方法やミトコンドリア膜電位依存的に染色される色素を用いた方法が挙げられる。
　肝臓の肝合成能を評価する方法としては、肝臓で合成されるタンパク質の量や機能を測定する方法が挙げられる。例えば実施例に示されるように血清アルブミンの量を測定することによって評価することができる。血清アルブミンの量は、吸光光度法（ローリー法）や電気泳動－染色デンシトメトリー法及び高速液体クロマトグラフ－紫外吸光検出法等によって測定できる。コリンエステラーゼやコレステロールの量を測定することでも評価できる。他の肝臓で合成されるタンパク質としてプロトロンビンが挙げられ、その機能を評価する方法として、プロトロンビン時間の測定がある。肝機能が損なわれると胆汁の分泌が少なくなり、脂溶性のビタミンKの吸収が阻害される。凝固因子の中で、II、VII、IXおよびXはビタミンK依存性で、肝臓で合成される他の因子よりも減少が早い。この中で第VII因子の半減期が一番短いので、肝合成能が低下すると第VII因子が関与するプロトロンビン時間が鋭敏に延長する。さらに、第VII因子は外因系凝固因子であるが、時間が経てば、内因系凝固因子が関与する活性化部分トロンボプラスチン時間も延長する。
　本発明の肝機能改善剤は、実施例にて後述するように、肝実質領域の脱線維化が観察されない状況下でも肝機能を改善することができる。
　肝実質領域の線維化及び脱線維化の様子は、実施例に示すように、病理組織学的手法を用いた組織染色（例、シリウスレッド染色）によって観察し、また評価することができる。シリウスレッド染色は、線維化を評価するための染色であり、コラーゲン線維を赤色に染色する。
　本発明の肝機能改善剤は、有効成分として、４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート、（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド（これらを総称して本発明化合物ともいう）、及びそれらの医薬上許容される塩から選択される少なくとも１種、好ましくは４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート、（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド（これらを総称して本発明化合物ともいう）、又はそれらの医薬上許容される塩を含む。
　「医薬上許容される」とは、一般に安全で無毒性であり、そして生物学的にもそれ以外にも望ましくないものではない医薬組成物の調製に有用であることを意味し、且つヒトの医薬的用途のみならず獣医学的用途にも許容され得ることを含む。
　「医薬上許容される塩」とは、上で定義したように、医薬上許容され、且つ所望の薬理学的活性を有する本発明化合物の塩を意味する。このような塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸及びリン酸等の無機酸；又は例えば、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ｏ－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２－エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４－メチルビシクロ［２．２．２］オクト－２－エン－１－カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４’－メチレンビス（３－ヒドロキシ－２－エン－１－カルボン酸）、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ－ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸及びムコン酸等の有機酸で形成された酸付加塩が挙げられる。医薬上許容される塩としては、存在する酸性プロトンが無機又は有機の塩基と反応できる場合に形成され得る、塩基付加塩も挙げられる。許容され得る無機塩基としては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム及び水酸化カルシウムが挙げられる。許容され得る有機塩基としては、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン及びＮ－メチルグルカミン等が挙げられる。
　本発明の肝機能改善剤は、常法により製剤化した医薬製剤（例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤など）として、ヒト又は動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等の哺乳動物）に投与することができる。例えば、有効成分の量に換算して、１日あたり約０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．１～５００ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１回または数回に分けて投与するとよいが、その投与量、投与方法や投与回数は、症状、年齢などにより適宜変更しうる。例えば注射剤に製剤化する場合には、蒸留水、生理食塩水などの担体を用いるとよく、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤に製剤化する場合には、デンプン、乳糖、白糖、炭酸カルシウムなどの賦形剤、デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤など、デンプン、寒天、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤などを用いるとよい。製剤中の有効成分の含有率は、１～９９重量％の間で変動させることができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの形態をとる場合には、有効成分を５～８０重量％含有させるのが好ましく、注射剤の場合には、有効成分を１～１０重量％含有させるのが好ましい。
　投与方法としては特に限定されないが、経口投与、静脈内投与、静脈内持続投与、腹腔内投与などが挙げられる。
　また、本発明の医薬組成物を充填した浸透圧ポンプを、例えば、皮下に埋め込み、持続的に投与する態様も好ましい。
　以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：病理組織学的検討（ＰＲＩ－７２４）
　Ｃ型肝炎ウイルスに起因する肝硬変を有する者のうち、Child-Pugh分類がＡ又はＢの状態にあり、現行の内科的な治療法では改善が見込めない患者（被験者識別コード：Ｃ２－０２、Ｃ２－０６、Ｃ２－０３、Ｃ２－０４、Ｃ２－０７）を対象とした４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート（ＰＲＩ－７２４）の非盲検・用量検討試験（第Ｉ相）において、１週間持続静脈内投与と１週間の観察期間を１サイクルとし、計６サイクル、１２週間にわたって、１０、４０及び１６０ｍｇ／ｍ２／日の用量でＰＲＩ－７２４を投与した。
　この治験において、４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で投与を受けた患者の肝組織について、更に病理組織学的検討を加えて肝機能との関係を検討した。
　試料は、各患者において、治療前及び治療後観察１５日目（第６サイクルDay15）の肝組織（生検）、スクリーニング期、治療前及び治療後観察２８日目の血液を用いた。
　検討の為に実施した各試験方法は以下の通り。
１．ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色
　ＨＥ染色は、細胞核及び細胞質を染め分け、組織の形態を観察することが可能な染色方法であり、ＨＥ染色により細胞や組織構造の全体像を把握することが可能となる。
　Bouin溶液で前固定した肝組織のパラフィンブロックから切片を切り出し、Lillie-Mayer’s Hematoxylin（武藤化学株式会社、日本）及びエオシン溶液（和光純薬工業株式会社）で染色する。
２．シリウスレッド染色
　コラーゲンの沈着を可視化するために、Bouin固定された肝切片をピクロシリウスレッド溶液（Waldeck GmbH & Co., Germany）を用いて染色する。定量的解析には、デジタルカメラ（DFC280, Leica, Germany）を用いて、２００倍拡大で、中心静脈付近でシリウスレッド染色された切片をキャプチャーして、１切片あたり５視野で陽性の領域をImageJ software(ImageJ, National Institute of Health, USA）を用いて測定する。
３．銀染色
　銀染色は、結合組織線維の1つである細網線維を銀アンモニア錯体によって銀メッキする染色法であり、組織構築像の観察が可能となる。
　常法（例、http://www.mutokagaku.com/products/reagent/pathology/nf_watanabe/を参照）に従って実施した。検体試料を脱パラフィン、脱キシレン、水洗した後、過マンガン酸カリウム液、2％しゅう酸液、2％鉄ミョウバン水溶液で順に処理し、水洗した後、アンモニア性の銀溶液で5～10分反応させ、還元液で処理し、水洗した後0.2％塩化金液で10分～一晩反応させる。その後、2％しゅう酸水溶液で処理し、写真用酸性硬膜定着液に浸して水洗、脱水、透徹、封入して観察に供する。
４．ＰＡＳ染色
　ＰＡＳ染色は、主に組織におけるグリコーゲンの証明のために行うことができる。過ヨウ素酸がグルコース残基を選択的に酸化してアルデヒドを生成し、シッフ試薬によって赤紫色に変色する。
　常法（例、http://www.mutokagaku.com/products/reagent/pathology/passtain/を参照）に従って実施した。検体試料を脱パラフィン、脱キシレン、水洗した後、0.5％過よう素酸液で10分間反応させ、水洗後、シッフ試薬で5～30分間反応させ、亜硫酸水、マイヤーヘマトキシリン液で順次処理し、水洗、色だしの後に脱水、透徹、封入して観察に供する。
５．チトクロームＣオキシダーゼ（CytoC）
　チトクロームＣオキシダーゼは他のタンパク質とともにミトコンドリアで膜貫通タンパク質複合体を形成している。ミトコンドリア膜における電子伝達系の最後の酵素であり、４分子のチトクロームＣからそれぞれ電子を受け取り、酸素１分子に転移させ２分子の水に変換する機能を有する。この過程でミトコンドリアマトリックス由来の４個のプロトンから水が生成されるのと同時に４個のプロトンがマトリックスから膜間スペースに透過し、これにより発生した膜間の電気化学ポテンシャルの差がＡＴＰ合成酵素によるＡＴＰ合成に用いられることになる。ミトコンドリアの主要機能である電子伝達系におけるエネルギー産生に関わる重要な酵素である。
　チトクロームＣオキシダーゼは具体的には、以下の方法で測定することができる。
　ジアミノベンチジン（3,3'-diaminobenzidine）の酸化的重合反応（呈色反応）を利用した方法を実施する。A液 DAB 1mg/mL（0.1 M PBS）とB液 0.6mg/mL Cytochrome C、80 mg/mL (0.1M PBS)を作成し、脱パラフィンした組織標本に等量滴下して数時間インキュベーションする。その後0.1M PBSで洗浄、脱水、封入して検鏡に供する。
６．血清アルブミン
　血清アルブミンは、肝臓で作られるタンパク質で肝機能の低下とともにその量が減少することが知られている。
　血清アルブミンの測定は常法に従って行うことができる。例えば、アルブミンと結合することで色素を生成するような試薬を用いて、当該色素を分光学的に測定することによって検体中のアルブミン量を求める。このような色素としてはｐＨ４．０付近でアルブミンと反応し青色のアルブミン結合色素を生成するブロモクレゾールグリーンが挙げられる。
　市販の測定用試薬（シカリキッド　ＡＬＢ、関東化学株式会社）を用いることもできる。検体に試薬を混合し、生成した結合色素の吸光度を測定する。
７．プロトロンビン時間（PT）
　プロトロンビンは肝臓によって合成される血液凝固因子の第II因子で、トロンボプラスチンを添加することにより固まる性質を有する。血液試料（例、血漿）にトロンボプラスチンを加え、固まるまでの時間を測定することによって肝合成能を評価することができる。
　PTの測定には市販の測定用試薬（コアグサーチ（登録商標）ＰＴ、株式会社エイアンドティー）を用いて以下の要領で実施することができる。
(1)精製水で溶解した試薬（トロンボプラスチンを含む）を、プラスチック試験管に移し37℃で加温する。
(2) 血漿検体0.1mLをガラス試験管にとり、37℃の恒温槽に入れ3分間加温する。
(3)(2)の加温した血漿に、(1)の予め加温しておいた試薬0.2mLを添加し、混合する。混合すると同時に、計測を開始し、軽く振とうして傾斜させながらフィブリンが析出するまでの時間を測定する。
（結果）
　４０ｍｇ／ｍ２／日の用量で治療を受けたコホートで認められた線維化の変化を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
被験者識別コード：C2-02（図１）
　被験者識別コード：C2-02はベースラインと第6サイクルDay15における肝硬変重症度分類であるChild-Pugh Scoreが６及び５、慢性肝炎の病態分類であるHepatitis Histology Index（HAI）が10及び9と各々1段階改善しているが、肝実質領域での線維化面積が微増した症例である（表1）。
　病理組織学的手法であるPAS染色（図１ではPASと表記）は肝臓のグリコーゲンを染色する手法であり、またCytochrome C（Cyto C）は電子伝達系の構成酵素の一つでエネルギー生産に重要な働きを担い、ともに肝機能の状態を反映する。生検検体を病理組織学的に検討したところ、PAS及びCyto Cの好染部位が増加して病理組織学的には肝機能が改善していることが示唆された。血清アルブミンはスクリーニング期3.9、治療期間中は3.4から3.9を推移したが、治療後観察28日には4となった。またプロトロンビン時間（PT）は、スクリーニング期70％、治療期間中は66％から74％を推移したが、治療後観察28日には79％となった。これらの結果は、被験者識別コード：C2-02では肝実質領域での線維化が改善していないにも関わらず肝機能が改善していることを示すものである。
被験者識別コード：C2-06（図２）
　被験者識別コード：C2-06はベースラインと第6サイクルDay15におけるChild-Pugh Scoreが５及び５、Hepatitis Histology Index（HAI）が13及び12であった。肝実質領域での線維化面積は改善傾向にあったが有意な変化ではなかった（表１）。
　生検検体を病理組織学的に検討したところ、PAS及びCyto Cの好染部位が顕著に増加して肝機能が改善していることが明らかになった。血清アルブミンはスクリーニング期3.7、治療期間中は3.3から4.0を推移したが、治療後観察28日には4.3となった。またプロトロンビン時間（PT）は、スクリーニング期77％、治療期間中は74％から86％を推移したが、治療後観察28日には92％となった。これらの結果は、被験者識別コード：C2-06では肝実質領域での線維化がわずかに改善しているだけであるのに、肝機能の改善が著明であることを示すものである。
被験者識別コード：C2-03（図3）
　被験者識別コード：C2-03はベースラインと第6サイクルDay15におけるChild-Pugh Scoreが7及び7、Hepatitis Histology Index（HAI）が13及び12であった。肝実質領域での線維化面積は表１に示したように有意に減少した。
　生検試料を病理組織学的に検討したところ、Cyto Cの好染部位がやや減少していることが明らかになった（治療前のPAS染色像を得ることが出来なかった）。血清アルブミンはスクリーニング期3.1、治療期間中は2 .3から3.3を推移したが、治療後観察28日には3.4となった。またプロトロンビン時間（PT）は、スクリーニング期51％、治療期間中は44％から64％を推移したが、治療後観察28日には67％となった。これらの結果は、被験者識別コード：C2-03 では肝実質領域での線維化は有意に改善しているのに、肝機能はわずかに改善したに過ぎなかったことを示すものである。
被験者識別コード：C2-04（図4）
　被験者識別コード：C2-04はベースラインと第6サイクルDay15におけるChild-Pugh Scoreが7及び7、Hepatitis Histology Index（HAI）が12及び11であった。肝実質領域での線維化面積は表１に示したように有意に減少した。
　生検検体を病理組織学的に検討したところ、Cyto Cの好染部位が顕著に増加していることが明らかになった（治療後のPAS染色像を得ることが出来なかった）。血清アルブミンはスクリーニング期3.4、治療期間中は2.7から3.3を推移したが、治療後観察28日には3.2となった。またプロトロンビン時間（PT）は、スクリーニング期62％、治療期間中は61％から67％を推移したが、治療後観察28日には69％となった。これらの結果は、被験者識別コード：C2-02では肝実質領域での線維化が有意に改善しているにも関わらず、肝機能はわずかに改善しているに過ぎなかったことを示している。
被験者識別コード：C2-07（図５）
　被験者識別コード：C2-07はベースラインと第6サイクルDay15におけるChild-Pugh Scoreが8及び6、Hepatitis Histology Index（HAI）が15及び13であった。肝実質領域での線維化面積は表１に示したように有意に減少した。
　生検検体を病理組織学的に検討したところ、PAS及びCyto Cの好染部位が顕著に増加していることが明らかになった。血清アルブミンはスクリーニング期2.3、治療期間中は2.3から3.5を推移したが、治療後観察28日には3.0となった。またプロトロンビン時間（PT）は、スクリーニング期79％、治療期間中は68％から82％を推移したが、治療後観察28日には79％となった。これらの結果は、被験者識別コード：C2-07では肝実質領域での線維化が有意に改善し、肝機能も改善していることを示している。
考察及び結論
　C2-03を除いた、どの被験者においてもCyto C・PASの両方又は片方で好染部位が増加して病理組織学的に肝機能の改善が示唆された。この結果は慢性肝炎の病態分類であるHAIとほぼ一致する結果であった。しかし、この結果は表１に示した肝実質領域の線維化面積の治療に伴う変化と明確に相関するものではなく、特にChild-Pugh分類がＡ（代償性肝硬変患者）である被験者C2-02及びC2-06の線維化の変化との間には明確な相関は認めらなかった。また被験者C2-03では線維化が顕著に改善したにも関わらずCyto C好染部位の減少が認められた。生化学的指標として血清アルブミンとPTを比較したところ、Child-Pugh分類がＡの被験者では顕著に、Ｂの被験者でも緩慢な改善が認められたが、線維化の改善の程度と明確に相関したものではなかった。これらの結果はＰＲＩ－７２４の肝機能改善作用は肝実質領域の脱線維化によって生じたものではなく、肝機能の改善と肝実質領域の脱線維化が独立して起きていることを強く示唆するものである。つまりＰＲＩ―７２４は脱線維化だけでなく、肝機能改善作用を有することを示していると結論される。
実施例２：細胞学的検討（Ｃ－８２）
　ＰＲＩ－７２４の活性体であるＣ－８２が肝細胞内ミトコンドリアを活性化することを、株化細胞を用いて検証した。株化細胞としては、ヒト肝癌由来のHepG2細胞及びHuh7細胞を用いた。いずれの細胞も商業的に入手可能である。
２－１：ＷＳＴ－８アッセイ
（目的）
　ＰＲＩ－７２４の活性体であるＣ８２が肝細胞内ミトコンドリアを活性化することを検証するために、まずＷＳＴ－８アッセイを実施した。ＷＳＴ－８は化合物の細胞毒性試験や細胞増殖試験に一般的に用いられ、細胞内の脱水素酵素により産生されるＮＡＤＨがＷＳＴ－８(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt)をホルマザンに還元する。このホルマザン色素の量が細胞内代謝を反映する。この脱水素酵素反応は主にミトコンドリアで行われ、ミトコンドリアの酵素活性を測定するＭＴＴアッセイとよく相関している事が知られている。
（試験方法）
　測定はCell Counting Kit-8（同仁化学）を用い、iMarkマイクロプレートリーダー(Bio-rad)にて450nMの吸光度を測定した。HepG2細胞又はHuh7細胞を5000 cells/wellにて96穴マイクロプレートに各ウェル100μlのDMEM 10%FBSで播種した。その後、添付のテクニカルマニュアルに従い実施した。
（結果）
　結果を図６に示す。HepG2細胞（上図）、Huh7細胞（下図）の両方で、Ｃ８２が50nMから500nMで酵素活性が最大１０％上昇した。Ｃ８２（1μM）では酵素活性がコントロール（control）群と拮抗し、さらにＣ８２濃度を上げると、細胞毒性が現れてくる事が示唆された。コントロール群にはDMSOを加えた。
（考察）
　これらの結果より、ＰＲＩ－７２４の活性体であるＣ８２には、ミトコンドリアの酵素活性を上昇させる薬効を併せ持つ事が明らかとなり、そのピークは100nMから500nMにある事が示唆された。当該効果は、Ｃ８２の肝機能改善効果を裏付けるものである。
２－２：細胞染色
（目的）
　ＰＲＩ－７２４の活性体であるＣ８２が肝細胞内ミトコンドリアを活性化することを検証するために、MitoBright（同仁化学）を用い、蛍光顕微鏡にて観察した。MitoBrightは、生細胞のミトコンドリアを染色する蛍光試薬である。染色はミトコンドリアの膜電位に依存しており、細胞膜透過後、正常なミトコンドリアに特異的に集積する。また、集積後、ミトコンドリアとの強い相互作用により色素の滞留性がある。
（試験方法）
　HepG2細胞、Huh7細胞を35mmガラスボトムディッシュに播き、24時間後にＣ８２（1μM）を加え、その後８時間後に100nM MitoBright（同仁化学）を加えて３７℃で３０分間インキュベートした後、蛍光顕微鏡（BZ-X800　キーエンス）にて観察した。コントロール群（Cont）にはDMSOを加えた。結果を図７に示す。
（考察）
　Ｃ８２(1μM)にて８時間処理した細胞は、コントロールに比べ、蛍光が強い像が得られた。当該結果は、Ｃ８２により肝ミトコンドリアの電子伝達系機能が改善（向上）したことを示している。
　４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート、及び（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミドは、肝機能、特に肝疾患等の際に観察される肝臓の糖代謝機能、電子伝達系機能及び肝合成能における障害を改善する作用を有し、従って、肝機能改善剤として有効である。
　本出願は、日本で出願された特願２０１８－２３１２２０（出願日：２０１８年１２月１０日）及び特願２０１９－０９４０５５（出願日：２０１９年５月１７日）を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (6)

  1. 　４－（（（６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－１－（ベンジルカルバモイル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－６－イル）メチル）フェニルジヒドロゲンホスフェート、
    （６Ｓ，９Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（４－ヒドロキシベンジル）－２，９－ジメチル－４，７－ジオキソ－８－（キノリン－８－イルメチル）オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド及びそれらの医薬上許容し得る塩から選択される少なくとも１種
    を有効成分として含む肝機能改善剤。
  2. 　肝機能が糖代謝機能である、請求項１記載の剤。
  3. 　肝機能が電子伝達系機能である、請求項１記載の剤。
  4. 　肝機能が肝合成能である、請求項１記載の剤。
  5. 　肝機能の改善が、肝実質領域の脱線維化を伴わない、請求項１～４のいずれか１項に記載の剤。
  6. 　肝機能の改善が、代償性肝硬変患者における改善である、請求項１記載の剤。
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