WO2020091405A1 - Raman spectroscopy substrate and aptasensor - Google Patents

Raman spectroscopy substrate and aptasensor Download PDF

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aptamer
porous
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양재문
김정훈
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연세대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a Raman spectroscopy substrate, a method for manufacturing the same, an analytical device and an analysis method comprising the same, and more specifically, Surface Enhanced Raman Scattering (or Surface Enhanced Raman Spectroscopy, hereinafter referred to as 'SERS') It relates to a Raman spectroscopic substrate, a manufacturing method thereof, an analytical device including the same, and an analytical method.
  • 'SERS' Surface Enhanced Raman Scattering
  • the present invention relates to an aptap sensor that can be used for precise local site drug delivery, disease diagnosis, disease treatment, near infrared imaging and photothermal treatment by improving the binding force with a target substance.
  • Raman scattering is a phenomenon in which the energy (hv) of an incident photon is scattered with energy (hv ') of a different frequency while changing the vibration state of a molecule, and scattering at this time belongs to inelastic scattering.
  • the Raman scattering exhibits a unique form of photon energy change according to the molecular structure that interacts with photons to induce scattering (Raman shift), so it is possible to detect, confirm, and analyze molecules.
  • the Raman scattering is essentially a weak signal, which requires a long time exposure to a high power laser for molecular detection, and one of the techniques used to enhance the Raman signal to detect high sensitivity is to enhance surface Raman spectroscopy (SERS). )to be.
  • SERS surface Raman spectroscopy
  • the SERS is a method using a phenomenon in which the intensity of the signal is enhanced to detect to the level of a single molecule when the molecule emitting the Raman signal is on the surface of the metal nanostructure, and the SERS-based sensing technology based on the metal nanostructure diagnoses the disease
  • it is expected to be utilized in various fields such as physics, chemistry, and biology because it provides various information such as analysis of fine structures at the single molecule level, real-time reaction observation, and orientation of molecules.
  • the SERS is a technique for amplifying the Raman signal by locally strengthening an electromagnetic field using an ultra-fine metal structure.
  • Metals such as gold, silver, copper, platinum, and aluminum are mainly used, and the ultra-fine metal structure is used.
  • Furnaces include liquid nanoparticles, nanoparticles arranged on a substrate, or nanostructures formed using various semiconductor processing techniques.
  • a surface-enhanced Raman spectroscopic substrate having a nanostructure arranged or processed on a substrate is most suitable, which means that the SERS substrate has spatial signal uniformity compared to liquid nanoparticles. This is because (signal uniformity) is excellent and is processed evenly on the substrate, making it easy to find metal nanostructures that can be sensed.
  • the area that provides the SERS signal predominantly is an electromagnetic hot spot, which is the area where the electromagnetic field is locally maximized. Since the hot spot occurs at a nano-level sharp edge in a metal nanostructure or a nanogap between metal nanostructures, design and processing of a hot spot using nano-process technology has recently been an important issue in SERS substrate fabrication. It is attracting attention.
  • Chemical methods such as electron beam lithography or deep UV lithography, have been mainly used to fabricate the SERS substrate, but these conventional methods have The cost was high, and there was a disadvantage that the large area processing was not easy.
  • the size of the analyte most of the nanogaps are manufactured at the level of several nanometers to hundreds of nanometers, but are simply formed in two dimensions, so There is a limit to increasing the number, and as a result, the limit is obvious in improving the signal strength.
  • evaporation, sputtering, cathodic arc, ion beam assisted deposition (IBAD), pulsed laser depending on the type of equipment for coating these raw material sources on a substrate (coated material) They are classified into pulsed laser deposition (PLD), thermal CVD, plasma enhanced CVD (PECVD), etc., and these equipment may be used alone or in combination.
  • PLD pulsed laser deposition
  • PECVD plasma enhanced CVD
  • Sputtering technology is a technique in which ionized atoms are accelerated by an electric field to collide with a target, and atoms constituting the target are protruded by the collision, and protruding atoms are deposited on the surface of the substrate.
  • the sputtering technique as described above can form a variety of materials, such as metals, alloys, compounds, and insulators, and the deposition rate is stable and similar in various other materials.
  • the adhesive strength of the thin film is good, it is advantageous for large area, uniform film formation is possible, and there is an advantage of excellent step coverage.
  • the conventional sputtering technique requires at least two or more process steps, such as thin film deposition after nano-finger formation and thin film deposition after formation of protrusions, and thus has difficulty in commercialization due to increased manufacturing cost due to increase in process cost. have.
  • SERS amplifies the Raman spectrum of chemicals bound to or adsorbed on the surface of metal nanoparticles, making it very sensitive compared to conventional Raman spectroscopy. Therefore, research results analyzing various biochemicals using SERS have been published.
  • a biomarker biomarker
  • surface-enhanced Raman scattering particles surface-enhanced Raman scattering dots; SERS dots
  • a surface-enhanced Raman scattering particle is attached to a chemical / biological tag, and a biomarker of the disease and the target are target-directed, and the image is acquired by an optical imaging technique.
  • the surface plasmon means a quantized vibration of free electrons propagating along the surface of a conductor, such as a metal thin film.
  • a surface plasmon is excited by incident light incident on a metal thin film at an angle greater than or equal to a critical angle of the dielectric medium after passing through a dielectric medium such as a prism to cause resonance, which is called surface plasmon resonance (SPR). .
  • the incident angle (resonance angle) of the incident light where resonance occurs and the wavelength (resonance wavelength) at which resonance occurs are very sensitive to changes in the refractive index of the material close to the metal thin film.
  • SPR sensors have been used to quantify and qualitatively analyze a sample from a material that is close to a metal thin film, that is, to change the refractive index of a sample, and to measure the thickness of a sample that is a thin film using these properties.
  • the desired analyte is put in a solution dispersed in a colloidal form, and the detection method for observing color change and the metal nanoparticles are fixed using a glass or polymer organic substrate. It is divided into sensors that detect changes in the shape of the pick and the position of the pick.
  • metal nanostructures of nanometers, nanorods, and nanoholes made of metal, rather than metal thin films, of nanometers to nanometers in size of several nanometers to hundreds of nanometers in size are subject to light at a specific frequency (wavelength) incident from the outside.
  • a specific frequency (wavelength) incident from the outside Collective oscillation of electrons in the nanostructure conduction band causes electrical dipole characteristics.
  • LSPR localized surface plasmon resonance
  • the extinction spectrum is the sum of the absorbance spectrum and the scattering spectrum.
  • the absorbance characteristics of the metal nanostructures against external incident light that is, the absorbance intensity, the line width of the absorption spectrum, and the wavelength of the absorption center, show a very strong dependence on the type of metal and the size and shape of the metal nanostructure.
  • their absorbing properties are sensitive to the external environment of the metal nanostructure, that is, the complex dielectric constant of the medium around the surface of the metal nanostructure, and biosensors using these properties have been developed.
  • An object of the present invention is to provide a porous vapor-deposited film having an inverse structure capable of efficiently controlling the surface roughness of the porous vapor-deposited film through transfer.
  • Another object of the present invention is to maximize the Raman scattering signal because the nanoparticles are formed of nanocluster particles and then deposited in a three-dimensional nanoporous structure, and accordingly, the analyte can be more easily and conveniently detected by detecting the surface-enhanced Raman scattering signal.
  • Another object of the present invention is to measure the presence or absence, expression level, and activity of a biomolecule using a local surface plasmon resonance phenomenon, and apta that can diagnose a disease related to the biomolecule using a measurement of the biomolecule. It is to provide a sensor.
  • the substrate and located on the substrate, including nano-structures made of nano-cluster particles, the spacing between the nano-structures and the substrate than the upper portion not in contact with the substrate It provides an inverse porous vapor deposition film that is narrower in the lower part in contact.
  • the nanostructures may have a branched shape divided into several branches in a downward direction in contact with the substrate from an upper portion not in contact with the substrate.
  • a method for manufacturing a porous deposition film with a sputtering apparatus having a process chamber and a cluster source, (a) forming a nucleus after forming a single atom gas vapor within the cluster source executing (nucleation), (b) controlling aggregation and size of nanocluster particles through condensation in the cluster source, (c) through the opening of the nozzle provided in the cluster source The step of discharging the nano-cluster particles grown in the step (b) to the process chamber, (d) controlling the pressure applied in the process chamber to perform the coalescence of the nano-cluster particles on the deposition substrate to form a nanostructure.
  • step (d) by controlling the initial pressure greater than the late pressure, the gap between the nano-structures is in contact with the deposition substrate than in the lower contact with the deposition substrate It provides a method of manufacturing an inverse porous vapor deposition film that is made to be narrower at the upper portion that is not.
  • the initial pressure in step (d) is 10 mTorr to 50 mTorr, and the late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr.
  • the transferring may include applying a curing composition on top of the nanostructures, followed by curing to form a transfer substrate, and removing the deposition substrate.
  • the curing composition is natural rubber (Natural Rubber), styrene-butadiene rubber (Styrene-Butadiene Rubber), silicone rubber (Silicon Rubber), polyurethane (Polyurethane), polymethyl methacrylate (polymethyl methacrylate) and polydimethylsiloxane (Polydimethylsiloxane) ) May include any one selected from the group consisting of.
  • a surface-enhanced Raman spectroscopic substrate including the inverse porous deposition film.
  • a substrate a porous deposition film located on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and a receptor molecule positioned on the porous deposition film, the nanostructures The spacing between them provides a Raman spectroscopic substrate that is narrower at the top not contacting the substrate than at the bottom contacting the substrate.
  • the nanostructures may be branched into several branches in a direction from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate.
  • the receptor molecule is an aptamer substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups, and the aptamer can be attached to the nanostructures by the functional group.
  • the aptamer may be an aptamer that specifically binds HER2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2).
  • the Raman spectroscopy substrate further comprises any one solvent selected from the group consisting of water, alcohol and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposition film, the nanostructures, and both. It can contain.
  • a step consisting of the following steps (a) to (d) of manufacturing a porous deposition film on a substrate; And (a) forming a plasma in the cluster source and then performing nucleation, (b) aggregation and aggregation of nanocluster particles through condensation in the cluster source.
  • the Microporous provides a method for producing Raman spectroscopy substrate, comprising the step of attaching the receptor molecules on the vapor-deposited film.
  • the initial pressure in step (d) is 10 mTorr to 50 mTorr, and the late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr.
  • the method of manufacturing the Raman spectroscopic substrate is any one selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposited film, between the nanostructures, and both.
  • the method may further include treating the solvent.
  • an analysis device including a Raman spectroscopy substrate, a light source irradiating light to the Raman spectroscopy substrate, and a Raman spectroscopy for measuring Raman spectroscopy of light reflected from the Raman spectroscopy substrate do.
  • exposing the Raman spectroscopy substrate to a sample containing an analyte, inducing binding between the receptor molecule of the Raman spectroscopy substrate and the analyte, and using Raman spectroscopy It provides an analysis method comprising the step of detecting or confirming the analysis object.
  • a substrate including a plurality of microgrooves (microgrooves), and a metal nanostructure fixed to the surface of the substrate, wherein the metal nanostructure is a metal nanoparticle, the metal It provides an aptamer sensor comprising a coating layer surrounding the nanoparticles and an aptamer bound to a functional group of the coating layer.
  • the coating layer of the metal nanostructure may include dopamine.
  • the aptamer includes a thiol group (-SH), and the aptamer can nucleophilically bind to a functional group of the coating layer by the thiol group.
  • -SH thiol group
  • the metal nanostructure may further include a capping agent bound to a functional group of the coating layer.
  • the capping agent may be any one selected from the group consisting of 2-Mercaptoethanol, Ethylamie, Diethyl fumarate, and mixtures thereof.
  • the porous deposited film according to an embodiment of the present invention can efficiently maximize the surface-enhanced Raman scattering signal by efficiently controlling the surface roughness of the porous deposited film through transfer, and accordingly, detect organic substances, ions, and the like through surface-enhanced Raman scattering signal detection.
  • Target substances for cancer diagnosis can be detected more easily and conveniently.
  • the Raman spectroscopic substrate according to another embodiment of the present invention is capable of maximizing the Raman scattering signal because nanoparticles are formed into nanocluster particles and then deposited in a 3D nanoporous structure, thereby detecting Raman scattering signals through surface enhancement. Not only can the analyte be detected more easily and conveniently, but also the receptor molecule can be immobilized on the surface of the 3D nanoporous structure to improve the detection efficiency for the analyte, and the process can be simplified.
  • Apta sensor according to another embodiment of the present invention can measure the presence or absence, expression level and activity of biomolecules using the local surface plasmon resonance phenomenon, and diseases related to the biomolecules using the measurement of biomolecules Can diagnose.
  • FIG. 1 is a schematic diagram conceptually showing an inverse porous deposition film of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram conceptually showing the manufacturing process of the inverse porous deposition film of the present invention.
  • 3 and 4 are photographs showing the porous vapor-deposited film and the inverse porous vapor-deposited film prepared in the manufacturing example of the present invention.
  • 5 and 6 is a photograph showing the results of measuring the porosity of the porous deposition film and the inverse porous deposition film in Experimental Example 1-1 of the present invention.
  • FIG. 7 to 9 are photographs showing the results of observation of the porous deposition film in Experimental Example 1-2 of the present invention using a Field Emission-Scanning Electron Microscopy (FE-SEM).
  • FE-SEM Field Emission-Scanning Electron Microscopy
  • 10 to 12 are graphs showing the results of measuring the Raman reaction properties of the porous deposited film and the inverse porous deposited film in Experimental Example 1-3 of the present invention.
  • FIG. 13 is a schematic diagram conceptually showing the Raman spectroscopic substrate of the present invention.
  • FIG. 14 is a schematic view for explaining a process of forming a porous deposition film.
  • 15 is a view schematically showing the analysis method of the present invention.
  • Example 16 is a graph showing the porosity measurement results of the substrate prepared in Example 2-1 of the present invention.
  • FIG. 20 is a graph in which only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4, and B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. 19 is extracted.
  • FIG. 22 is a graph in which only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, and B4) considered as characteristic Raman bands in FIG. 21 is extracted.
  • 26 is a result of expressing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIG. 25 by a heat mapping method.
  • 30 and 31 are graphs showing the results of measuring Raman bands when detecting aptamers for different substrates in Experimental Examples 2-5 of the present invention.
  • 32 to 35 is a graph showing the results of measuring the Raman signal while changing the content of the ECD HER2 protein in Experimental Example 2-6 of the present invention.
  • 41 is a view schematically showing a process of manufacturing a metal nanostructure including an aptamer.
  • 46 is a graph showing the results of a line scan analysis in which the shape of the microgroove pattern of the substrate in Experimental Example 3-1 was analyzed with a 3D optical profiler (OP).
  • 48 to 52 are graphs showing the results of measuring the properties of the gold nanostructures prepared in Preparation Example 3-1.
  • Fig. 54 is a graph showing the results of measuring the absorption coefficient of the Apta sensor in Experimental Example 3-3.
  • 55 and 56 are graphs and photographs showing the results of measuring the absorption coefficient according to the content of gold nanostructures in Experimental Example 3-3.
  • 57 and 58 are graphs showing LSPR spectroscopy results of the Apta sensor in Experimental Example 3-4.
  • 59 and 60 are graphs showing the results of evaluating the target molecule detection ability of the aptap sensor in Experimental Examples 3-5.
  • Raman spectroscopy in the context of the present invention is Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS), Surface enhanced resonance Raman spectroscopy (SERRS), Hyper-Raman and / or coherent anti- Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) may mean, and the following description mainly focuses on the case of surface-enhanced Raman spectroscopy, but the present invention is not limited thereto.
  • SERS Surface enhanced Raman spectroscopy
  • SERRS Surface enhanced resonance Raman spectroscopy
  • CARS coherent anti- Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy
  • the inverse porous deposition film according to an embodiment of the present invention is located on the substrate, and on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and the spacing between the nanostructures is the above and other objects of the present invention. New features will become more apparent through the description of the present specification and the accompanying drawings.
  • the inverse porous deposition layer according to an embodiment of the present invention is located on a substrate, and on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and the spacing between the nanostructures is higher than that on the substrate that is not in contact with the substrate. It may be narrower in the lower part in contact with the substrate.
  • the nanostructures are grown on the substrate by depositing the nanocluster particles into a three-dimensional nanostructure.
  • the nanocluster particles are formed by agglomeration of 10 to 20 nanoparticles, and the nanoparticles are made of metals such as gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), platinum (Pt), and aluminum (Al). It may be nanoparticles, and the diameter of the nanocluster particles may be 100 nm to 200 nm. When the diameter of the nanocluster particles is within the above range, the Raman scattering strength may be strongest when Raman is detected.
  • the spacing between the nanostructures may be narrower and denser at the bottom contacting the substrate than at the top not contacting the substrate, and specifically, the spacing between the nanostructures may not contact the substrate. It may be narrower as it goes from the upper part to the lower part contacting the substrate, and density may increase as it goes toward the lower part.
  • the spacing between the nanostructures refers to the horizontal distance of the empty space formed between each nanostructure, and the deposition film may be a porous deposition film by the empty space formed between the nanostructures. Accordingly, as the spacing between the nanostructures is narrower from the bottom than from the top, the porosity of the porous deposition layer may be smaller from the bottom than the top of the nanostructures, and more specifically, smaller from the top to the bottom. Can be.
  • a lower gap between the nanostructures of the inverse porous deposition film may be 10 nm to 100 ⁇ m, and specifically, 100 nm to 10 ⁇ m.
  • the upper gap between the nanostructures may be 10 nm to 200 ⁇ m, specifically 100 nm to 100 ⁇ m. At this time, even if the upper gap range and the lower gap range between the nanostructures partially overlap, the upper gap is larger than the lower gap.
  • the lower spacing between the nanostructures refers to the distance between the lowermost ends of the nanostructures in contact with the substrate, and the upper spacing between the nanostructures refers to the distance between the uppermost ends of the nanostructures not in contact with the substrate. it means.
  • the upper porosity of the inverse porous deposition film may be 10% to 85%, specifically 30% to 80%.
  • the lower porosity of the porous deposition layer may be 30% to 60%, specifically 30% to 50%. At this time, even if the upper porosity and the lower porosity of the porous deposition film partially overlap, the upper porosity is larger than the lower porosity.
  • the lower porosity of the porous deposition film means the porosity at the bottom of the nanostructures in contact with the substrate, and the upper porosity of the porous deposition film means the porosity at the top of the nanostructures not in contact with the substrate.
  • the nanostructures of the inverse porous deposition film may be divided into several branches in a downward direction in contact with the substrate from an upper portion not in contact with the substrate, and specifically, the nanostructures may have a single strand in the upper portion. It may be in the form of a thick pillar, or a branch that extends downward as it gradually branches into branches and branches. As the nanostructures have such a shape, a gap between the nanostructures may be narrower at the bottom than at the top, and the porosity of the porous deposition film may be smaller at the bottom than at the top of the nanostructures.
  • the inverse porous deposition layer 120 includes nanostructures 122 made of nanocluster particles on the substrate 121.
  • the nanostructures 122 may have a branched shape that is divided into several branches from the top to the bottom and extends downward. Accordingly, the spacing between the nanostructures 122 may be narrower at the bottom than at the top, and the porosity of the porous deposition layer 120 may be smaller at the bottom than at the top of the nanostructures 122. .
  • the substrate of the inverse porous deposition film may be any one non-metal substrate selected from the group consisting of a silicon substrate, a gallium arsenide (GaAs) substrate, a glass substrate, a quartz substrate, a plastic substrate, and a polymer.
  • GaAs gallium arsenide
  • a glass substrate a glass substrate
  • quartz substrate a quartz substrate
  • a plastic substrate a polymer.
  • an elastomer-based material that is easy to deform and easy to manufacture is used, or a rubber-based material that is easily manufactured and detachable by using other materials is easily used. It might be.
  • the elastomer-based material is divided into a thermoset elastomer (TSE) and a thermoplastic elastomer (TPE) according to a type of crosslinking bonding, and any materials included therein can be used.
  • TSE thermoset elastomer
  • TPE thermoplastic elastomer
  • natural rubber Natural Rubber, NR
  • SBR styrene-butadiene rubber
  • silicone rubber Silicon polymer
  • Polyurethane Polyurethane
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the surface roughness of the Raman spectroscopy substrate may be 5 nm to 100 nm, specifically 20 nm to 70 nm, and more specifically 50 nm to 70 nm.
  • the surface roughness of the Raman spectroscopy substrate is less than 5 nm, the absence of Raman scattering intensity increase or decrease may occur due to the absence of surface roughness, and when it exceeds 100 nm, a small-sized non-target sample is isolated into the porous deposition film, Unnecessary Raman spectra may be detected, or there may be a problem in that the adhesion of the porous deposition film itself is reduced due to an increase in porosity of the porous deposition film, resulting in peeling.
  • a method of manufacturing an inverse porous deposited film according to another embodiment of the present invention includes the steps of manufacturing a porous deposited film and transferring the nanostructures to a substrate for transfer, and transferring the nanostructures so that the top and bottom of the nanostructures are turned over. do. As described above, it is possible to efficiently control the surface roughness of the porous deposition film by a simple method through transfer.
  • the step of manufacturing the porous deposition film is specifically, (a) forming a plasma in the cluster source and then performing nucleation, (b) condensation in the cluster source. Controlling aggregation and size of the nanocluster particles, (c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source, and ( d) growing nanostructures by controlling the pressure applied to the process chamber to perform coalescence of nanocluster particles on the deposition substrate, but controlling the initial pressure to be greater than the late pressure, between the nanostructures So that the gap of the gap becomes narrower at the top not contacting the deposition substrate than at the bottom contacting the deposition substrate. It may comprise the step of growing the group nanostructure.
  • the mechanism for forming the porous vapor deposition film will be described in detail.
  • nucleation is performed, and aggregation through condensation in the cluster source is performed. Is executed.
  • Nanocluster particles are formed by the aggregation, and the size of the nanocluster particles is controllable according to the distance of the cluster source.
  • the formed nanocluster particles are discharged to the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source.
  • the internal pressure is controlled to be several hundred mTorr or less to form a nanostructure having a three-dimensional nanoporous structure on which the nanoclusters are coalesced on the deposition substrate.
  • the deposition source in the process chamber is controlled by the pressure in the process chamber.
  • the discharged nanocluster particles are deposited in a three-dimensional nanoporous structure in a coalescence state, and the thin film formation is not reached.
  • a porous deposition film having a 3D nanoporous structure is formed by controlling pressure or temperature in the process chamber so that nanostructures having a nanoporous structure formed on the deposition substrate do not form a continuous film. That is, the spacing between the nanostructures can be adjusted by adjusting pressure or temperature.
  • the initial pressure is controlled to be greater than the late pressure, so that the spacing between the nanostructures is higher in the upper portion not in contact with the deposition substrate than in the lower portion in contact with the deposition substrate. Make it narrow.
  • the late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr, and specifically 0.1 mTorr to 10 mTorr.
  • the initial pressure may be 10 mTorr to 50 mTorr, and specifically 20 mTorr to 40 mTorr. Further, the pressure may be gradually or stepwisely decreased from the initial pressure to the later pressure.
  • the initial pressure is less than 10 mTorr, the density of the porous deposited film may be too low or the film may not be formed, and accordingly, a substrate having a low Raman sensitivity may be manufactured, and if the initial pressure exceeds 50 mTorr, the process temperature Too high, so that the crystallinity is increased, a porous vapor deposition film of unwanted properties can be formed.
  • heat treatment may be selectively performed on the substrate for deposition.
  • the present invention is not limited to this, and heat treatment may be performed in the process chamber.
  • the size of the nanoparticles and the spacing between the nanostructures in the porous deposition layer may be increased.
  • the heat treatment may be performed at 100 ° C to 250 ° C, and the size of the nanoparticles and the spacing between the nanostructures increase as the heat treatment temperature increases within the range.
  • the heat treatment is preferably performed in an N 2 atmosphere or vacuum in consideration of oxidation of the metal.
  • the nano-structures are transferred to a substrate for transfer, and the top and bottom of the nano-structures are transferred to be turned over.
  • the inverse porous deposition film has a shape in which top and bottom of the nanostructures of the porous deposition film are inverted.
  • FIG. 2 is a schematic diagram conceptually showing a manufacturing process of the inverse porous deposition film.
  • the curing composition is cured to form a transfer substrate 121, and the When the deposition substrate 111 is removed, the inverse structure of the porous deposition film 120 may be manufactured so that the upper and lower portions of the nanostructures 112 are turned over.
  • the surface-enhanced Raman spectroscopic substrate according to another embodiment of the present invention includes the porous deposition film or the inverse porous deposition film.
  • the porous deposition film or the inverse porous deposition film is formed of nano-cluster particles and then deposited as a three-dimensional nanoporous structure, it is possible to maximize the surface-enhanced Raman scattering signal, and accordingly, the organic material through the surface-enhanced Raman scattering signal detection. Target substances related to ion and cancer diagnosis can be detected more easily and conveniently.
  • the inverse porous deposition film can effectively enhance the surface-enhanced Raman scattering by efficiently controlling the surface roughness of the porous deposition film through a simple method through transfer.
  • a Raman spectroscopic substrate includes a substrate, a porous deposition film disposed on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and a receptor molecule positioned on the porous deposition film.
  • the substrate may be any non-metal substrate selected from the group consisting of a silicon substrate, a gallium arsenide (GaAs) substrate, a glass substrate, a quartz substrate, a plastic substrate, and a polymer. It may be a large area substrate such as 2, 4, 6, 8, or 12 inches used in a semiconductor process.
  • GaAs gallium arsenide
  • the nanostructures are grown on the substrate by depositing the nanocluster particles into a three-dimensional nanostructure.
  • the nanocluster particles are made of 10 to 20 nanoparticles agglomerated, and the nanoparticles are made of metals such as gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), platinum (Pt), and aluminum (Al). It may be nanoparticles, and the diameter of the nanocluster particles may be 100 nm to 200 nm. When the diameter of the nanocluster particles is within the above range, the Raman scattering strength may be strongest when Raman is detected.
  • the spacing between the nanostructures may be narrower and more dense at the top not contacting the substrate than at the bottom contacting the substrate, specifically, the spacing between the nanostructures may be lower It may be that the narrower as it goes toward the upper portion not in contact with the substrate, and the density becomes higher as it goes toward the upper portion.
  • the spacing between the nanostructures refers to the horizontal distance of the empty space formed between each nanostructure, and the deposition film may be a porous deposition film by the empty space formed between the nanostructures. Accordingly, as the spacing between the nanostructures is narrower from the top than from the bottom, the porosity of the porous deposition film may be smaller from the top than from the bottom of the nanostructures, and more specifically, become smaller from the bottom to the top. Can be.
  • the lower spacing between the nanostructures may be 10 nm to 200 ⁇ m, specifically 100 nm to 100 ⁇ m.
  • the upper gap between the nanostructures may be 10 nm to 100 ⁇ m, specifically 100 nm to 10 ⁇ m. At this time, even if the lower gap range and the upper gap range between the nanostructures partially overlap, the lower gap is larger than the upper gap.
  • the lower spacing between the nanostructures means the distance between the bottom of the nanostructures in contact with the substrate, and the upper spacing between the nanostructures refers to the distance between the topmost of the nanostructures not in contact with the substrate. it means.
  • the lower porosity of the porous deposition film may be 10% to 85%, specifically 30% to 80%.
  • the upper porosity of the porous deposition layer may be 30% to 60%, specifically 30% to 50%. At this time, even if the lower porosity and the upper porosity of the porous deposition film partially overlap, the lower porosity is larger than the upper porosity.
  • the lower porosity of the porous deposition film means the porosity at the bottom of the nanostructures in contact with the substrate, and the upper porosity of the porous deposition film means the porosity at the top of the nanostructures not in contact with the substrate.
  • the nanostructures may be branched into several branches in a direction from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate.
  • the nano-structures may be a single column of thick pillars at the bottom, or a branch shape extending upwards as it is branched into several branches gradually toward the top.
  • the spacing between the nanostructures may be narrower from the top than from the bottom, and the porosity of the porous deposition film may be smaller from the top than from the bottom of the nanostructures.
  • the Raman spectroscopic substrate 210 includes nanostructures 212 made of nanocluster particles on the substrate 211.
  • the nanostructures 212 may have a branched shape that is divided into several branches from bottom to top and extended upward. Accordingly, the spacing between the nanostructures 212 may be narrower from the top than from the bottom, and the porosity of the Raman spectroscopy substrate 210 may be smaller from the top than from the bottom of the nanostructures 212. have.
  • the surface roughness of the Raman spectroscopic substrate 210 may be 5 nm to 100 nm, specifically 20 nm to 70 nm, and more specifically 50 nm to 70 nm. If the surface roughness of the Raman spectroscopy substrate 210 is less than 5 nm, the absence of a Raman scattering intensity increase or decrease may occur due to the absence of the surface roughness, and when it exceeds 100 nm, a small-sized non-target sample is introduced into the porous deposition film. Isolated, unnecessary Raman spectra may be detected, or there may be a problem that the adhesion of the porous deposition film itself is reduced due to an increase in porosity of the porous deposition film, which may cause peeling.
  • the Raman spectroscopic substrate 210 includes the receptor molecule 213 positioned on the porous deposition layer.
  • the receptor molecule 213 is not limited to the receptor molecule, and is a concept including a marker or a tracer.
  • the receptor molecule is preferably a substance capable of inducing selective binding with an analyte in a sample, such as an antibody, RNA, DNA, aptamer, PNA and ligand. Even if the receptor molecule has a strong Raman signal, it is possible to analyze the presence and concentration of the analyte by finding a characteristic Raman peak appearing in a different wavelength band from the Raman peak of the receptor molecule among the Raman peaks present in the sample. That is, as the Raman spectroscopic substrate includes the receptor molecule, it is possible to improve the detection efficiency for the analyte and simplify the process.
  • one or more analytes can be selectively analyzed in a sample by making the receptor molecule one or more types.
  • the receptor molecule may be substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups, and the receptor molecule may be attached to the nanostructures by the functional group.
  • the functional group selected from the group consisting of the amine group, thiol group, and catechol group is a functional group having high binding strength with the metal nanocluster particles, and the functional group can enhance the binding strength of the nanostructures by the receptor molecule.
  • the receptor molecule may be an aptamer that specifically binds HER2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2).
  • the aptamer binds very specifically to the HER2 protein involved in cancer metastasis, thereby inhibiting or detecting cancer, particularly breast cancer metastasis.
  • the DNA aptamer that specifically binds to the HER2 protein has the base sequence of 5'-GAGTGACCGTCTGCCTG- [Core sequence] -CAGCCACACCACCAGCC-3 ', where the Core Sequence is as shown in Table 1 below.
  • the Raman spectroscopic substrate can detect an extracellular domain (ECD) HER2 protein (malignant breast cancer expression factor) at a level of 15 ng / mL (breast cancer expressing cancer factor clinical standard), and the ECD HER2 protein present in the blood is clinical. Even a small blood volume (2 ⁇ L) of the baseline concentration can be used for prognosis in breast cancer patients.
  • ECD extracellular domain
  • the Raman spectroscopic substrate is any one solvent selected from the group consisting of water, alcohol and mixtures thereof at any one position selected from the group consisting of both the surface of the porous deposition film, the nanostructures and both. It may further include.
  • the alcohol may be any one selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, butanol, and mixtures thereof.
  • the solvent may be scattered between the surfaces of the porous deposition layer or the nanostructures, and when the Raman spectroscopy substrate further includes the solvent, the structure of DNA (oligonucleotide) is changed to make Raman detection better. do.
  • the receptor molecule such as the aptamer is known to have a 3D structure due to hydrogen bonding between base sequences in a natural state as part of a DNA strand. This is called a hairpin structure.
  • the solvent is added to a receptor molecule such as the aptamer, the hydrogen bond of the aptamer having a three-dimensional structure is broken, thereby having a linear structure, so that Raman detection can be made better.
  • the commercialized cancer diagnosis method is the same in that it uses the specificity of the antigen-antibody reaction, but there is an additional process (Fluorescence dye labeling) that uses two antibodies and synthesizes a fluorescent color factor. While the cancer is diagnosed indirectly by the concentration of the fluorescence-emitting factor, the Raman spectroscopic substrate is used to obtain the Raman spectrum of the receptor molecule and the analyte itself, so that the presence or absence of the substance itself can be reliably determined, as in the ELISA method. There is no need to synthesize fluorescence chromogenic factors, which simplifies the process.
  • the Raman spectroscopy substrate is formed of nano-cluster particles and then deposited as a three-dimensional nanoporous structure, it is possible to maximize the Raman scattering signal, thereby making it easier to analyze an object through surface-enhanced Raman scattering signal detection.
  • immobilization of receptor molecules on the surface of the 3D nanoporous structured deposition film can improve detection efficiency for analytes, and simplify the process.
  • a method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate according to another embodiment of the present invention comprises the steps of manufacturing a porous deposition film on a substrate using a sputtering apparatus having a process chamber and a cluster source, and attaching a receptor molecule on the porous deposition film It includes.
  • the step of manufacturing the porous deposition film is specifically, (a) forming a plasma in the cluster source and then performing nucleation, (b) condensation in the cluster source. Controlling aggregation and size of the nanocluster particles, (c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source, and ( d) growing nanostructures by controlling the pressure applied to the process chamber to perform coalescence of nanocluster particles on the deposition substrate, but controlling the initial pressure to be greater than the late pressure, between the nanostructures So that the gap of the gap becomes narrower at the top not contacting the deposition substrate than at the bottom contacting the deposition substrate. It may comprise the step of growing the group nanostructure.
  • FIG. 14 is a schematic view for explaining a process of forming the porous deposition film.
  • FIG. 14 (a) in the sputtering apparatus, after forming a plasma in the cluster source by the target provided in the cluster source, nucleation is performed, and the diagram continues.
  • (b) of 14 aggregation through condensation is performed in the cluster source. Nanocluster particles are formed by the aggregation, and the size of the nanocluster particles is controllable according to the distance of the cluster source.
  • the formed nanocluster particles are discharged into the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source.
  • the internal pressure is controlled to hundreds of mTorr or less, and as shown in FIG. 14 (d), a 3D nanoporous structure in which coalescence of nanocluster particles is formed on the deposition substrate 230 The nano-structure 270 is formed.
  • the deposition substrate 230 in the process chamber is controlled by pressure control in the process chamber.
  • the nano-cluster particles discharged from the cluster source are deposited in a three-dimensional nano-porous structure in a coalescence state, and the formation of a thin film is not reached.
  • the spacing between the nanostructures 270 is adjustable by adjusting pressure or temperature.
  • the initial pressure is controlled to be greater than the late pressure, so that the gap between the nanostructures 270 is lower than that at the lower portion of the substrate for contact with the deposition substrate 230. It is made to be narrower at an upper portion not in contact with the deposition substrate 230.
  • the late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr, and specifically 0.1 mTorr to 10 mTorr.
  • the initial pressure may be 10 mTorr to 50 mTorr, and specifically 20 mTorr to 40 mTorr. Further, the pressure may be gradually or stepwisely decreased from the initial pressure to the later pressure.
  • the initial pressure is less than 10 mTorr, the density of the porous deposited film may be too low or the film may not be formed, and accordingly, a substrate having a low Raman sensitivity may be manufactured, and if the initial pressure exceeds 50 mTorr, the process temperature Too high, so that the crystallinity is increased, a porous vapor deposition film of unwanted properties can be formed.
  • the deposition substrate 230 is withdrawn from the process chamber, and heat treatment may be selectively performed on the deposition substrate 230.
  • the present invention is not limited to this, and heat treatment may be performed in the process chamber.
  • the size of the nanoparticles and the spacing between the nanostructures 270 in the porous deposition layer may be increased by the heat treatment.
  • the heat treatment may be performed at 100 ° C to 250 ° C, and as the heat treatment temperature increases within the range, the size of the nanoparticles and the spacing between the nanostructures 270 increase.
  • the heat treatment is preferably performed in an N 2 atmosphere or vacuum in consideration of oxidation of the metal.
  • a receptor molecule is attached on the prepared porous deposition film.
  • the receptor molecule may be substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups.
  • the method and conditions for attaching the receptor molecule on the porous deposition film may be drop-coating or spin coating.
  • a method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate is selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposited film, the nanostructures, and both.
  • the method may further include treating one solvent.
  • the step of treating the solvent may be performed by spraying the solvent on the surface of the porous deposition layer or between the nanostructures by a method such as spraying or immersing the porous deposition layer in the solvent.
  • An analysis apparatus includes the Raman spectroscopy substrate, a light source irradiating the Raman spectroscopy substrate, and a Raman spectroscopy measuring Raman spectroscopy of light reflected from the Raman spectroscopy substrate.
  • the light source and the Raman spectrometer can be used commonly used.
  • the light source may be generated by a frequency superimposed Nd: YAG laser at 532 nm wavelength or a frequency superimposed Ti: sapphire laser at 365 nm wavelength.
  • the light source may be a pulsed laser beam or a continuous laser beam.
  • the excitation beam can be focused over the Raman spectroscopy substrate through confocal optics and a microscope lens.
  • the Raman emission light from the analyte can be collected by a microscope lens and confocal optics and combined with a monochromatic device for spectral separation.
  • the confocal optics may include a dichroic filter, a blocking filter, a confocal pinhole, an objective lens and a mirror to reduce the background signal.
  • the Raman emission signal can be detected by the Raman spectroscopy comprising a photodiode interfaced with a computer that counts and digitizes the signal. If the Raman spectroscopy substrate is used, the Raman spectroscopy may use a portable Raman equipment of a low specification even if it is not a high-performance Raman equipment.
  • the low-end portable Raman equipment may have a laser power of 0 mW to 100 mW, a laser wavelength of 780 nm to 790 nm, and the laser irradiation time is 20 msec to 9 sec. Can be
  • the distance between the light source and the Raman spectroscopy substrate may be 0 mm to 10 mm, specifically 4 mm to 8 mm.
  • the distance between the light source and the Raman spectroscopy substrate is less than 4 mm, the laser beam as a light source may be out of focus and, if it exceeds 8 mm, the laser beam as a light source may be out of focus again.
  • An analysis method exposes the Raman spectroscopy substrate to a sample containing an analyte, thereby inducing binding between the receptor molecule of the Raman spectroscopy substrate and the analyte, and Raman spectroscopy. And detecting or confirming the analyte.
  • the sample may be liquid or gas
  • the analyte in the sample means a substance to be measured that can be measured using Raman spectroscopy, and means any substance capable of selectively binding to the receptor molecule.
  • the selective binding of the receptor molecule and a specific substance in the sample includes all general specific bindings such as antigen-antibody, DNA-DNA, DNA-RNA, PNADNA, PNA-RNA, and metal-coordination binding. Can be.
  • the analyte in the sample and the receptor molecule are selectively bound.
  • Raman spectroscopy to measure the intensity of a unique Raman Peak represented by the analyte to be bound to the receptor molecule, it is possible to measure the presence and concentration of the analyte in the sample.
  • the sample 221 is added to the Raman spectroscopic substrate 210 to induce coupling between the receptor molecule of the Raman spectroscopic substrate 210 and the analyte, and then the Raman spectrometer 222.
  • the Raman spectrometer 222 By irradiating light 223 to the Raman spectroscopy substrate 210 by using, and measuring the Raman spectroscopy of the light reflected from the Raman spectroscopy substrate 210, the analyte can be detected or confirmed.
  • An apta sensor includes a substrate and a metal nanostructure fixed to the surface of the substrate.
  • the substrate includes a plurality of microgrooves on the surface.
  • Each micro-groove formed on the surface of the substrate is concavely dug in the surface of the substrate to have a micro- or nano-sized strip extending in one direction.
  • the plurality of microgrooves may be disposed substantially parallel at intervals to form a pattern.
  • each of the micro-grooves is elongated in one direction, but need not be a linear shape, but may be a serpentine line shape. Also, the spacing between the microgrooves need not be constant. In addition, the fact that the microgrooves are substantially parallel means that the microgrooves are preferably extended without staggering with each other, but the microgrooves may be nonparallel or staggered with each other.
  • each microgroove may be defined as an inverted triangular shape consisting of three vertices and two sides.
  • a vertex having the deepest depth among the three vertices is defined as a goal, and the remaining two vertices are defined as a floor.
  • the depths of the microgrooves may not be the same as each other and may be different from each other.
  • the heights of the two floors of each microgroove may also be different.
  • the cross-sectional shape along the direction perpendicular to the direction in which the microgrooves extend is not a regular shape in which the wavelength (distance between the floor and the floor) and amplitude (distance between the floor and the valley) are constant, but the wavelength and amplitude continue. It can be a random shape that changes.
  • the substrate including the microgrooves is, for example, transferred to the microgroove by hot pressing using a polytetrafluoroethylene (PTFE) mold formed with a microgroove pattern or by applying a liquid on the mold surface and then hardening the transfer. Or by a laser light interference method described in US Patent Publication No. 2003/0017421.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the substrate comprising the plurality of microgrooves is commercially available from Edmund Optics Co., Koyo Co., Shinetsu Chemical Co., and Mitsubishi Chemical Co.
  • Sigma-Aldrich products may be used.
  • the substrate may be made of high-oil, plastic, metal, silicon, quartz, alumina, oxide crystals, or mixtures thereof.
  • the plastic may be polydimethylsiloxane (PDMS) polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), cyclic olefin copolymer (COC), etc.
  • the metal may be nickel, aluminum, iron or copper, and the oxide crystal may be SiO 2 , TiO 2 , Ta 2 O 5 or Al 2 O 3 .
  • the polydimethylsiloxane is used as the substrate, the microgroove can be easily transferred using a liquid curing method without the need for a hot press process.
  • the substrate includes the microgrooves
  • aggregation of the metal nanostructures is suppressed as the metal nanostructures are fixed in the valleys of the microgrooves. That is, the microgrooves can improve the detection performance of the tactile sensor by suppressing the colloidal motion of the metal nanostructures.
  • the metal nanostructure includes metal nanoparticles and a coating layer surrounding the metal nanoparticles.
  • the metal nanoparticle may be any one selected from the group consisting of gold, silver, copper, aluminum, platinum, silicon, germanium, and mixtures thereof.
  • the metal nanoparticles may have a diameter of 30 nm to 100 nm, and more specifically, 40 nm to 60 nm.
  • the aspect ratio of the metal nanoparticles may be a length of a long axis: a short axis of 1: 1 to 10: 1, and more specifically 3: 1 to 5: 1. .
  • the aspect ratio of the metal nanoparticles is 3: 1 or more, the highest absorbance value is formed on 650 nm to 1000 nm, so that the absorbance to water is low to increase the detection efficiency of biomolecules, but the aspect ratio of the metal nanoparticles is 5 If it exceeds: 1, the absorbance spectrum of the metal nanoparticles may reach a resolution limit, which may decrease the ease of measurement.
  • the shape of the metal nanoparticles is not limited in the present invention, for example, a cylinder, a square column, a triangular column, a pentagonal column, a hexagonal column, an octagonal column, a sphere, a hemisphere, a portion of a sphere, an elliptic sphere, a semi-elliptical sphere, a portion of an elliptical sphere , Square pyramid, square bipyramid, quadrangular pyramid, triangular pyramid, triangular bipyramid, triangular pyramid, cone, cone, ring, cube, and any one selected from the group consisting of combinations thereof.
  • the metal nanostructure includes a coating layer surrounding the metal nanoparticles.
  • the coating layer may include a compound containing catechol, and the compound containing catechol is dopamine, 5,6-dihydroxyindole, and combinations thereof It may be any one selected from the group consisting of.
  • the 5,6-dihydroxyindole is a form in which the amine moiety of dopamine is cyclized.
  • the aptamer may be attached to a functional group in the compound containing the catechol through Michael addition, and may be coupled to the substrate without any additional linker material.
  • the compound containing the catechol contains dopamine, and the tris (hydroxyalkyl) aminoalkyl group is included at one end of the dopamine, and the other end is the carboxylic acid. Pyrrole-2-carboxylic acid group.
  • the method of forming the coating layer on the metal nanoparticles may be, for example, dispersing the metal nanoparticles and dopamine hydrochloride to prepare a suspension, and stirring the suspension to form the coating layer on the surface of the metal nanoparticles.
  • the suspension may further include a tris (hydroxymethyl) aminomethane solution as a buffer solution.
  • a buffer solution is maintained at pH 8 to pH 9
  • dopamine polymerization occurs rapidly and causes aggregation of metal nanoparticles, so it is not preferable as a coating agent for metal nanoparticles, so dopamine polymerization is suppressed to pH 7 or less. It is preferred to react.
  • the stirring step may be to stir the suspension in which the metal nanoparticles are dispersed at a speed of 1,000 rpm to 1,500 rpm for 1 minute to 30 minutes.
  • the agitation may use a simple agitation method or an ultrasonic agitation method, and may be repeatedly performed.
  • the solvent of the suspension is benzene, normal butanol, butyl acetate, carbon tetrachloride, chloroform, cyclohexane, dichloroethane, dichloromethane, ethyl acetate, diethyl ester, heptane, hexane, tert-butyl methyl ester, methyl ethyl ketone, pentane, di Isopropyl ester, tetrahydrofuran, toluene, N-methyl-2-pyrrolidone, acetone, acetonitrile, carbon tetrachloride, chloroform, cyclohexane, 1,2-dichloroethane, dichloromethane, diethyl ether, dimethyl formamide , Dimethyl sulfoxide, 1,4-dioxane, ethanol, ethyl acetate, methanol, methyl tert-buryl
  • the solvent may further include a lubricant, wetting agent, emulsifying agent, suspending agent or preservative.
  • an amine group may be introduced on the surface of the substrate. Since the dopamine or the like is coated on the surface of the metal nanostructure, the metal nanostructure may be fixed to the aminated substrate by a Michael addition reaction method.
  • the metal nanostructure includes an aptamer bonded to the surface of the coating layer.
  • the aptamer refers to a substance capable of binding to a target molecule in the form of single, double helix DNA or RNA.
  • the target molecule may be any one selected from the group consisting of active viruses, activated surface proteins, proteins showing antigenicity of active viruses, and combinations thereof.
  • the aptamer is capable of specifically binding to the target molecule, and preferably may have a structure capable of complementarily binding to the target molecule.
  • the target molecule may be a membrane fusion protein present in the surface protein of the virus.
  • the influenza virus may be a fusion peptide of hemagglutinin (HA).
  • the aptamer for the detection of the fusion peptide of HA includes a complementary structure or sequence capable of specifically binding to the fusion peptide.
  • it may be a spike protein in the case of a corona virus, or an F protein in the case of a paramyxovirus.
  • the aptamer may be an Anti-HER2 aptamer that specifically binds to HER2 (Human epithermal growth factor receptor type 2) protein.
  • the aptamer binds very specifically to the HER2 protein involved in cancer metastasis, thereby inhibiting or detecting cancer, particularly breast cancer metastasis.
  • the metal nanostructure may include the aptamer in a single type or may include two or more types together.
  • the aptamer is a thiol group (-SH) substituted, and a nucleophilic bond spontaneously occurs between the thiol group and the coating layer surrounding the surface of the metal nanoparticle, so that the aptamer can be fixed without a separate linker material. .
  • the aptamer sensor can detect a virus according to the presence or absence of a specific binding reaction between an active virus, an activated surface protein, or an antigenic protein of an active virus and an aptamer. have.
  • the metal nanostructure may further include a capping agent bound to a functional group of the coating layer. That is, by binding the capping agent to a residual functional group capable of binding the aptamer of the coating layer to terminate the functional group, inhibition of non-specific analyte binding can be enhanced to improve selectivity of the aptamer sensor.
  • the capping agent may be any compound capable of polymerizing with dopamine, and may include all substances capable of adding Michael.
  • the capping agent may include any one selected from the group consisting of 2-Mercaptoethanol, Ethylamie, Diethyl fumarate, and mixtures thereof.
  • 41 is a diagram schematically showing a process of manufacturing a metal nanostructure including the aptamer.
  • the metal nanostructure 320 includes a coating layer 322 coated on the surface of the metal nanoparticle 321, and an aptamer 323 is coupled to the surface of the coating layer 322.
  • the capping agent 324 may be selectively bonded to a residual functional group capable of bonding with the aptamer 323 of the coating layer 322.
  • the Apta sensor can be used to detect specific biomolecules. Specifically, when a target molecule is bound to an aptamer bound to the metal nanostructure, a change in local surface plasmon resonance of the metal nanoparticle occurs and it is possible to determine the presence or absence of a specific biomolecule.
  • the metal nanoparticles exhibit different absorbing properties depending on the external environment, that is, the medium around the surface of the metal nanoparticles, and biomolecules can be detected using these properties.
  • the target protein specifically binds to the aptamer on the surface of the metal nanostructure to change the refractive index around the metal nanostructure. Therefore, the presence or absence of the target protein marker can be determined by measuring the change in the optical absorption spectrum according to the change in the local surface plasmon resonance signal before and after the reaction.
  • the degree of LSPR signal change depends on the concentration of the target protease
  • the expression level and activity of the target protease can also be measured.
  • the peptide and target bioenzyme are associated with a specific disease. Therefore, it is possible to provide useful information for diagnosing a related disease by detecting the presence or absence, expression level, or activity of a bioenzyme through measurement of a change in local surface plasmon resonance signal. For example, by detecting the presence or absence, expression level or activity of MT1-MMP, information for diagnosis of cancer may be provided.
  • a porous deposition film was prepared by depositing gold (Au) nanostructures on a silicon substrate under the conditions shown in Table 2 below.
  • the substrate for transfer is cured at 70 ° C. for 2 hours on a hot plate. Thereafter, the silicon substrate was removed to prepare an inverse porous deposition film (Example 1-1).
  • FIGS. 3 to 6 are pictures of the porous deposition film and the inverse porous deposition film, respectively, and FIGS. 5 and 6 are graphs showing porosity measurement results of the porous deposition film (hSERS_1208) and the inverse porous deposition film (lhSERS_1208), respectively.
  • the porosity of the porous deposition film is 50.61%
  • the porosity of the inverse porous deposition film is 71.78%
  • the porosity of the inverse porous deposition film is greater than the porosity of the porous deposition film.
  • the porous deposited film prepared in the above preparation example was observed using a scanning electron microscope (Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM), and the results are shown in FIGS. 7 to 9. 8 is a result of observing the porous deposition film from above, and FIGS. 8 and 9 are results of observing a cross section of the porous deposition film.
  • the porous deposition film includes nanostructures made of nanocluster particles, and the nanostructures are divided into several branches from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate. It can be seen that it is a branched shape. Accordingly, it can be seen that the spacing between the nanostructures is narrower and higher in the upper portion not in contact with the substrate than in the lower portion in contact with the substrate.
  • the inverse porous deposition film of Example 1-1 prepared by transferring the porous deposition film has a narrower gap between the nanostructures at the lower part of the substrate and the lower part of the substrate. have.
  • a Raman reaction property was investigated for a 1 mM rhodamine 6G (Rhodamine 6G, R6G) solution used in a biosensor.
  • a laser used for the measurement a laser having a wavelength of 725 nm was used, and 20 ml of a 1 mM solution (2X10 -5 mol) was used for the R6G solution.
  • Raman signals were measured by dropping 1 ⁇ L of a 1 mM solution (2X10 -9 mol) in a 1X1 mm region of the prepared inverse porous deposition film, and the results are shown in FIGS. 10 to 12.
  • R6G 1 ⁇ L / IhSERS is a result of dropping 1 ⁇ L rhodamine 6G (Rhodamine 6G, R6G) solution on the inverse porous deposition film prepared in Example 1-1
  • R6G 1 ⁇ L / hSERS is the comparative example It is a result of dropping 1 ⁇ L rhodamine 6G (Rhodamine 6G, R6G) solution to the porous deposited film prepared in 1-1.
  • Example 1-1 effectively maximized the surface-enhanced Raman scattering signal by efficiently controlling the surface roughness of the porous deposition film through transfer of the porous deposition film.
  • a porous deposition film was prepared by depositing gold (Au) nanostructures on a silicon substrate under the conditions shown in Table 3 below.
  • the porosity measurement results of the prepared porous deposition film are shown in FIG. 16.
  • the ordinary Raman equipment is a very expensive equipment including a microscope, but in this experiment, a portable Raman equipment was used to conduct an experiment to find an optimal condition for measuring a specific molecule using the prepared substrate.
  • the laser beam from the laser source in the near-infrared region (785 nm) scans the sample surface, and the scanning distance is adjusted to optimize the measurement.
  • Rhodamin 6G (Rhodamine 6G, R6G), which is a fluorescent dye for Raman, was dispensed at a concentration of 1 mM on the substrate prepared in the preparation example, and then dropped and coated with a volume of 10 ⁇ L to completely dry and immobilized.
  • a laser beam is used at a laser power of 100 mW and an integration time of 100 msec using a portable Raman device (IDRaman Mini2.0, manufactured by Ocean Optics).
  • the Raman signal was measured while adjusting the working distance to the samples of 1 mm, 3 mm, 5 mm, and 7 mm, respectively, and the results are shown in FIGS. 17 and 18.
  • FIG. 17 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering for the rhodamine 6G
  • FIG. 18 is a Raman corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4, B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. It is a graph that extracts only the intensity.
  • the laser beam has a working distance of 7 mm represents the strongest Raman signal among all characteristic bands
  • the laser beam has a scanning distance when measuring rhodamine 6G. It can be seen that it is most preferable to measure 7 mm.
  • Anti-HER2 aptamer which is clone number 9-ER-N-B03_G05, as a receptor molecule, and the ECD HER2 protein as an analyte.
  • the anti-HER2 aptamer and the ECD HER2 protein are immobilized on the substrate prepared in the preparation example, and the portable Raman equipment (IDRaman Mini2.0, Ocean) for the substrate on which the anti-HER2 aptamer and ECD HER2 protein are immobilized respectively.
  • Optics the laser power of 100 mW
  • the integration time integration time
  • the laser beam scanning distance working distance, WD
  • the Raman signal was measured while adjusting to mm, and the results are shown in FIGS. 19 to 22.
  • FIG. 19 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering for the anti-HER2 aptamer, and FIG. 20 corresponds to peaks (B1, B2, B3, B4, B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. This is a graph that extracts only the Raman intensity.
  • FIG. 21 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering for the ECD HER2 protein
  • FIG. 22 is only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4) considered as characteristic Raman bands in FIG. This is the extracted graph.
  • the Raman signal of a biomaterial such as anti-HER2 aptamer and ECD HER2 protein was found to have the strongest Raman signal when the working distance to the sample of the laser beam was 5 mm. .
  • the substrate of the present invention is a substrate having an excellent molecular-specific Raman signal, which indicates a molecule-specific Raman band, because the characteristic Raman band of the aptamer and protein marker is different.
  • the aptamer was replaced with an amine group and a thiol group, respectively, and then immobilized on a substrate to compare adhesion.
  • FIGS. 23 and 26 are results of measuring surface-enhanced Raman scattering in the case of attaching an amine-substituted aptamer
  • FIGS. 25 and 26 show surface-enhanced Raman in the case of attaching an aptamer substituted with a thiol group. It is the result of measuring the scattering.
  • hSERS 1201 is a result for a substrate without aptamer attached
  • Anti-HER2 Aptamer is a result of attaching an aptamer
  • Adding DI water, Adding 70% EtOH, and Adding 100% EtOH are applied with distilled water, 70% ethanol, and 100% ethanol, respectively. It is the case.
  • FIGS. 24 and 26 are results obtained by visually designing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIGS. 23 and 25 using a heat mapping method.
  • the aptamer substituted with a thiol group has a Raman band unique to the aptamer after being attached to a substrate. It can be seen from the results of this experiment that the aptamer substituted with a thiol group is very excellent in immobilization.
  • the characteristic Raman bands are also strengthened by cutting hydrogen bonds in the three-dimensional hairpin structure of the aptamer to one-dimensional structure by treating the solvent such as ethanol.
  • FIGS. 27 to 29 The substrate prepared in the above manufacturing example was observed using a scanning electron microscope (Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM), and the results are shown in FIGS. 27 to 29.
  • 27 is a result of observing the substrate from above
  • FIGS. 28 and 29 are results of observing a cross section of the substrate.
  • the substrate includes nanostructures made of nanocluster particles, and the nanostructures are branched into several branches from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate. It can be seen that the shape is. Accordingly, it can be seen that the spacing between the nanostructures is narrower and higher in the upper portion not in contact with the substrate than in the lower portion in contact with the substrate.
  • the substrate has an effect of embedding an analyte due to the presence of porosity on the surface, and the Raman signal detection density of the analyte is penetrated by penetrating both the aptamer between the substrate surface and the internal pores. It can be seen that it can be increased.
  • Raman bands during aptamer detection were measured using hSERS 909, hSERS 1177, and hSERS 1179, which are different substrate samples prepared on different dates and different batches, and the results are shown in FIG. 30.
  • the substrate has the same characteristic Raman band of the aptamer itself, and the Raman band unique to the aptamer is also observed during post-treatment using ethanol and distilled water. It can be confirmed that it is an excellent substrate.
  • Anti-HER2 aptamer 7 pmole / dual solvent treated (Aptamer / solvent) has two types of solvents (100% ethanol and distilled water) after immobilization of Anti-HER2 aptamer 7 pmole on a substrate (dual solvent), ECD HER2 Protein is a case where only ECD HER2 protein is applied, and samples A, B, C, and D are cases where the weight ratios of the aptamer and the protein are changed as shown in Table 4 below. .
  • FIGS. 32 and 33 are results before washing using ethanol and distilled water
  • FIGS. 34 and 35 are results after washing using ethanol and distilled water.
  • FIGS. 33 and 35 are results obtained by visually designing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIGS. 32 and 34 by a heat mapping method.
  • the substrate can be used as a sensor capable of quantitative analysis of the subject.
  • Anti-HER2 aptamer 7 pmole is a case in which Anti-HER2 aptamer 7 pmole is immobilized on a substrate, and Anti-HER2 aptamer / dual solvent treated (Apt / solvent) is Anti- on a substrate.
  • BSA 7 pmole After immobilization of HER2 aptamer 7 pmole with 100% ethanol and distilled water in two types of solvents (dual solvent), BSA 7 pmole (BSA) is coated with 2 ⁇ L of BSA, dried for 5 minutes, and then 7 This is when the BSA of pmole is immobilized, and the BSA / dual solvent treated (BSA / solvent) is treated with two types of solvents (100% ethanol and distilled water) after immobilization of 7 pmole BSA on the substrate.
  • BSA 7 pmole BSA 7 pmole
  • BSA / solvent BSA / dual solvent treated
  • Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole (Apt + BSA) is the case of immobilizing Anti-HER2 aptamer 7 pmole and BSA 7 pmole
  • Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole / dual solvent treated ( Apt + BSA / solvent) are two types of solvent (du) of 100% ethanol and distilled water after immobilization of the anti-HER2 aptamer 7 pmole and BSA 7 pmole (du al solvent).
  • ECD HER2 Protein is a case where only ECD HER2 protein is applied, and Samples A, B, C, and D are cases where the weight ratios of the aptamer and the protein are changed as shown in Table 3 below.
  • FIGS. 37, 38 and 40 are Anti-HER2 aptamer / dual solvent treated (Apt / solvent), Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole (Apt + BSA) and Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole / dual solvent treated (Apt + BSA / solvent).
  • FIGS. 39 and 40 are results obtained by visually designing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIGS. 36 and 37 using a heat mapping method.
  • BSA a high-molecular weight protein sample
  • It has a characteristic band that can be distinguished from graphs or other proteins (blue line in FIG. 36).
  • 1004 cm -1 which is an intrinsic peak of BSA, was clearly observed. It was also confirmed that the analyte BSA was embedded between the silver nanostructures of the substrate during the washing process.
  • Raman band of BSA was observed between 850 cm -1 and 950 cm -1 when BSA was applied on a substrate with anti-HER2 aptamer. It was confirmed that when washing with ethanol and distilled water, the Raman band of the BSA in the 850 cm -1 to 950 cm -1 region could not be observed, and only the aptamer-specific band was observed. That is, it was confirmed that the BSA was washed down in the distilled water washing process on the substrate where the aptamer is present, and the non-selectivity of the non-target albumin sample was verified.
  • a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate having a microgroove pattern (microgroove pattern) in which a plurality of microgrooves are arranged substantially parallel at regular intervals PTFE with a microgroove pattern is molded onto the PTFE surface. After coating the liquid PDMS and curing, the surface of PTFE was transferred to the PDMS.
  • the PDMS on which the microgroove pattern was formed was cut into a circle having a diameter of about 10 mm using a cork borer.
  • the substrate was immersed in 30% (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) overnight, and then washed with 100% ethanol and DI water, and additionally Water was removed by a heating process.
  • APTES (3-aminopropyl) triethoxysilane
  • dopamine was coated on the surface of gold nanorods (GNRs) using dopamine hydrochloride (CTAB).
  • CTAB dopamine hydrochloride
  • the dopamine-coated gold nanorod suspension was immobilized using a drop coating method on a PDMS substrate whose surface was aminated using 20 ⁇ L APTES.
  • Anti-HER2 aptamer (70 pmole) was applied to the dopamine-coated gold nano-rod by applying a thiolated anti-HER2 aptmer, and using Michael addition to functional groups in dopamine. ) was immobilized.
  • a metal nanostructure was prepared by terminating a functional group capable of the residual Michael addition reaction in the dopamine using 2-Mercaptoethanol (2-Mercaptoethanol, beta Mercapto ethanol, BME).
  • Example 3-1 The shape of the microgroove pattern of the PTFE mold used in Example 3-1 was analyzed, and the results are shown in FIGS. 42 to 44, respectively.
  • FIG. 42 is an optical microscopic image of the surface of the polymer substrate on which the PTFE surface has been transferred
  • FIG. 43 is a 3-dimensional OP image of the PTFE surface
  • FIG. 44 is It is a graph showing the OP scan profiles of the surface roughness along the line a in FIG. 43.
  • unidirectional microgrooves in the form of channels are formed on the surface of the PTFE, and the distance between the deep groove and the shallow groove is about 150 ⁇ m and 20 ⁇ m to 30 ⁇ m, respectively. Able to know.
  • FIG. 45A is an image showing the shape of the microgroove pattern of the substrate
  • FIG. 45B is a 3D optical profiler (OP) image of the microgroove pattern of the substrate
  • FIG. 46 is It is a graph showing the result of a line scan analysis in which the shape of the microgroove pattern of the substrate is analyzed with a 3D OP.
  • the gold nanostructure (GNR) prepared in Preparation Example 3-1 was observed with a scanning transmission electron microscope (STEM) and a scanning electron microscope (SEM), and the results are shown in FIG. 47. Did.
  • FIG. 47 (A) of FIG. 47 is a result measured by STEM brightfield and darkfield of CGNR
  • FIG. 47 (B) is a result of measurement by SEM of CGNR
  • FIG. 47 (C) is a STEM brightfield of DGNR and It is a result measured by dark field
  • Fig. 47 (d) is a result measured by SEM of DGNR.
  • the “DGNR” represents a gold nanorod coated with dopamine prepared in Preparation Example 3-1
  • the “CGNR” represents a gold nanorod coated with hexadecyltrimethylammonium (CTAB).
  • CTAB hexadecyltrimethylammonium
  • the most important material for giving shape stability to the nanorods is the hexadecyltrimethylammonium (CTAB) surfactant, or the surfactant itself does not have a ligand capable of binding to other materials.
  • CTAB hexadecyltrimethylammonium
  • the dark field observation reflects information on the composition of the material, and since the CGNR and DGNR do not differ, the physical properties of the gold nanorods are coated with dopamine and the shape of the gold nanorods is changed. It was confirmed that it was not.
  • the SEM is well imaged only the conductor, in the case of the CGNR, a clear image of the gold nanorod is observed, while in the case of the DGNR, it is confirmed that an unclear image is observed due to charging by non-conductive dopamine coating. Did.
  • 50 is a graph showing the results of FT-IR (Fourier transform) analysis of the CGNR and DGNR.
  • the CGNR and DGNR were freeze-dried to form a powder, and then FT-IR (Fourier transform) spectroscopy was observed. As a result, only the band of CTAB was observed, and the DGNR was observed. A silver dopamine band was observed.
  • 51 and 52 are graphs showing the results of XPS (X-ray photoelectron spectroscopy) analysis of the CGNR and DGNR, respectively.
  • the chemical bond in the surface can be seen from the functional group ratio of the nitrogen bond on the surface.
  • the CGNR mostly -NH4 + -binding due to CTAB is observed
  • the dopamine hydrochloride is oxidized on the surface of the gold nanorod to turn into an indole structure, and it can be seen that the -NH- functional group increased by about 25%.
  • the PDMS (represented as "P” (represented as a patterned substrate)) formed with the microgroove pattern prepared in Preparation Example 3-1 and the flat PDMS (represented as "B" (bare substrate)) without a microgroove pattern were respectively CGNR.
  • the coating properties were visually confirmed, and the results are shown in FIG. 53.
  • the gold nano-rod coating layer on the substrate surface was observed, and the CGNR coatings were peeled off of the gold foil and visually observed that a very non-uniform coating was formed. This was possible. On the other hand, it was confirmed that the DGNR coating maintains a very stable coating layer.
  • the DGNR / B it became similar to the absorption graph of the gold nanorod, and in the case of the DGNR / P, the standard deviation was smaller, and the absorption peak corresponding to the long axis and short axis was within the resolution (400 nm to 1100 nm). Since it exists, it can be seen that the DGNR / P is meaningful as a sensor.
  • the concentration of the DGNR stock solution was diluted to 1 ⁇ 2 with 1X, and the substrate was coated, and the extinction coefficient and wavelength were measured for each of them. 55 and 56.
  • the ratio I (L-LSPR) / I (T-LSPR) of the ratio of the intensity corresponding to the short axis (transverse-LSPR; T-LSPR) and the intensity corresponding to the long axis (Longitudinal-LSPR; L-LSPR) is the standard item for sensor selection As
  • the absorption result of the DGNR suspension (FIG. 48) was 3.3, and the closer to this value, the DGNR 0.5X was used as a sensor in anticipation that the dispersion of the DGNR on the substrate would be better like a suspension.
  • the anti-HER2 aptamer at a concentration of 170 ⁇ M was immobilized such that the total volume of the aptamer suspension was 30 ⁇ L, as the immobilization concentration of the anti-HER2 aptamer increased, the L-LSPR peak ( It was confirmed that the peak) was blue-shifted. In addition, when checking the tendency of the degree of blue shift according to the concentration, it can be seen that it is saturated at the highest concentration of the Anti-HER2 aptamer.
  • L-LSPR migration does not occur in the case of the non-selective protein albumin (bovine serum albumin, BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the ECD-HER2 protein was combined with the Anti-HER2 aptamer, and the L-LSPR migrated according to the concentration over time and reached a saturated state.
  • the aptamers used in this experiment modify the pyrimidine structure in the base sequence of aptamers so that they are resistant to modification by enzymes present in the blood.
  • the modified nucleic acid aptamer was used.
  • the present invention relates to an inverse porous deposition film used for surface-enhanced Raman spectroscopy, a method for manufacturing the same, and a surface-enhanced Raman spectroscopic substrate including the same, wherein the inverse porous deposition film efficiently controls the surface roughness of the porous deposition film through transfer, thereby It is possible to maximize the augmented Raman scattering signal, and accordingly, it is possible to more easily and easily detect target substances related to the diagnosis of organic matter, ions, and cancer by detecting the surface-enhanced Raman scattering signal.
  • the present invention relates to a Raman spectroscopic substrate, a method for manufacturing the same, an analytical device and an analysis method comprising the same, wherein the Raman spectroscopic substrate is formed by nano-cluster particles and then deposited into a three-dimensional nanoporous structure, thereby causing Raman scattering.
  • the signal can be maximized, and accordingly, the analyte can be more easily and conveniently detected by detecting the surface-enhanced Raman scattering signal, and the receptor molecule is immobilized on the surface of the 3D nanoporous structure to detect the analyte. Efficiency can be improved and the process can be simplified.
  • the present invention relates to an Apta sensor, wherein the Apta sensor can measure the presence or absence, expression level, and activity of a biomolecule using a local surface plasmon resonance phenomenon, and a disease related to the biomolecule using a biomolecule measurement. Can diagnose.

Abstract

The present invention relates to an inverse porous deposition film used for surface enhanced Raman spectroscopy, a method for manufacturing same, and a surface enhanced Raman spectroscopy substrate comprising same. The present invention relates to a Raman spectroscopy substrate, a method for manufacturing same, and an analysis device and analysis method comprising same. The present invention relates to an aptasensor comprising a substrate comprising a plurality of microgrooves, and a metal nanostructure fixed to a surface of the substrate.

Description

라만 분광기판 및 압타센서Raman spectrometer and apt sensor
본 발명은 라만 분광 기판, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 표면증강 라만 분광법(Surface Enhanced Raman Scattering, 또는 Surface Enhanced Raman Spectroscopy, 이하, 'SERS'라 함)에 사용되는 라만 분광 기판, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a Raman spectroscopy substrate, a method for manufacturing the same, an analytical device and an analysis method comprising the same, and more specifically, Surface Enhanced Raman Scattering (or Surface Enhanced Raman Spectroscopy, hereinafter referred to as 'SERS') It relates to a Raman spectroscopic substrate, a manufacturing method thereof, an analytical device including the same, and an analytical method.
또한, 본 발명은 표적 대상 물질과의 결합력을 향상시켜 정밀한 국소 부위 약물 전달, 질병 진단, 질병 치료, 근적외선 영상화 및 광열 치료에 이용 가능한 압타 센서에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to an aptap sensor that can be used for precise local site drug delivery, disease diagnosis, disease treatment, near infrared imaging and photothermal treatment by improving the binding force with a target substance.
최근 분자의 검출, 확인 및 분석을 위해 사용되는 기법의 하나로서, 예를 들면, 라만 산란(Raman scattering)을 이용한 방법이 있다. 라만 산란이란 입사되는 광자의 에너지(hv)가 분자의 진동 상태를 변화시키면서 다른 주파수의 에너지(hv')로 산란되는 현상이며, 이때의 산란은 비탄성 산란에 속한다. 이러한 라만 산란은 광자와 상호작용하여 산란을 유도하는 분자구조에 따라 고유의 광자 에너지변화 형태를 나타내므로(Raman shift), 분자의 검출, 확인 및 분석 가능하다.Recently, as one of the techniques used for detection, identification and analysis of molecules, there is a method using, for example, Raman scattering. Raman scattering is a phenomenon in which the energy (hv) of an incident photon is scattered with energy (hv ') of a different frequency while changing the vibration state of a molecule, and scattering at this time belongs to inelastic scattering. The Raman scattering exhibits a unique form of photon energy change according to the molecular structure that interacts with photons to induce scattering (Raman shift), so it is possible to detect, confirm, and analyze molecules.
상기 라만 산란은 본질적으로 신호가 약하여, 분자 검출을 위해서는 고출력의 레이저에 오랜 시간의 노출이 필요하며, 이와 같은 라만 신호를 강화하여 고감도 검출을 하기 위하여 사용되는 기술 중 하나가 표면증강 라만 분광법(SERS)이다.The Raman scattering is essentially a weak signal, which requires a long time exposure to a high power laser for molecular detection, and one of the techniques used to enhance the Raman signal to detect high sensitivity is to enhance surface Raman spectroscopy (SERS). )to be.
상기 SERS은 라만 신호를 내는 분자가 금속 나노 구조체 표면에 있을 때, 신호의 세기가 단분자 수준까지 검지할 수 있을 정도로 증강되는 현상을 이용하는 방법이며, 금속 나노 구조에 의한 SERS 기반 센싱 기술은 질병 진단뿐만 아니라, 단일 분자 수준의 미세 구조 분석, 실시간 반응 관찰, 분자들의 배향 등 다양한 정보를 제공해주기 때문에 물리, 화학, 생물 등 다양한 분야로의 활용이 이루어질 전망이다.The SERS is a method using a phenomenon in which the intensity of the signal is enhanced to detect to the level of a single molecule when the molecule emitting the Raman signal is on the surface of the metal nanostructure, and the SERS-based sensing technology based on the metal nanostructure diagnoses the disease In addition, it is expected to be utilized in various fields such as physics, chemistry, and biology because it provides various information such as analysis of fine structures at the single molecule level, real-time reaction observation, and orientation of molecules.
즉, 상기 SERS은 극미세 금속 구조물을 이용하여 국소적으로 전자기장을 강화, 라만 신호를 증폭시키는 기술로서, 금, 은, 구리, 백금, 알루미늄 등의 금속이 주로 사용되며, 사용되는 극미세 금속 구조로는, 액상의 나노 입자(nanoparticle), 기판 위에 배열된 나노 입자 또는 각종 반도체 공정기법을 이용하여 형성된 나노 구조체 등이 있다.That is, the SERS is a technique for amplifying the Raman signal by locally strengthening an electromagnetic field using an ultra-fine metal structure. Metals such as gold, silver, copper, platinum, and aluminum are mainly used, and the ultra-fine metal structure is used. Furnaces include liquid nanoparticles, nanoparticles arranged on a substrate, or nanostructures formed using various semiconductor processing techniques.
상술한 바와 같은 진단 및 센싱(sensing)을 위해서는 기판 위에 배열 또는 가공된 나노 구조체를 가지는 표면증강 라만 분광 기판(SERS substrate)이 가장 적합하며, 이는 SERS 기판이 액상의 나노 입자에 비해 공간적 신호 균일성(signal uniformity)이 뛰어나고, 기판 위에 고르게 가공되어 있어 센싱이 가능한 금속 나노 구조를 찾기 용이한 특성을 가지고 있기 때문이다.For the diagnosis and sensing as described above, a surface-enhanced Raman spectroscopic substrate (SERS substrate) having a nanostructure arranged or processed on a substrate is most suitable, which means that the SERS substrate has spatial signal uniformity compared to liquid nanoparticles. This is because (signal uniformity) is excellent and is processed evenly on the substrate, making it easy to find metal nanostructures that can be sensed.
SERS 신호를 주도적으로 제공하는 영역은 전자기적 핫 스팟(hot spot)으로서, 이 부분은 전자기장이 국소적으로 극대화되는 공간이다. 상기 핫 스팟은 금속 나노 구조체에서 나노 수준의 날카로운 모서리 또는 금속 나노 구조 사이의 나노갭(nanogap)에서 발생하므로, 최근, 나노 공정 기술을 응용한 핫 스팟의 디자인 및 가공이 SERS 기판 제작에 있어서 중요한 이슈로 주목되고 있다.The area that provides the SERS signal predominantly is an electromagnetic hot spot, which is the area where the electromagnetic field is locally maximized. Since the hot spot occurs at a nano-level sharp edge in a metal nanostructure or a nanogap between metal nanostructures, design and processing of a hot spot using nano-process technology has recently been an important issue in SERS substrate fabrication. It is attracting attention.
이러한 SERS 기판의 제작에는 예를 들면, 전자빔 리소그래피(E-beam lithography)나, 딥 UV 리소그래피(Deep UV lithography)와 같은 화학적 방법들(chemical methods)이 주로 사용되었으나, 이러한 종래의 방법들은 공정 자체의 비용이 고가이며, 대면적 가공이 용이하지 못한 단점이 있는 것이었다.Chemical methods, such as electron beam lithography or deep UV lithography, have been mainly used to fabricate the SERS substrate, but these conventional methods have The cost was high, and there was a disadvantage that the large area processing was not easy.
일반적으로, 나노 갭은 작을수록 SERS 신호의 강도가 증가하는 것으로 알려졌으며, 분석물질의 크기를 고려하여 대부분 수 나노미터에서 수백 나노미터 수준으로 제작되고 있으나 단순히 2차원적으로 형성되므로, 나노 갭의 수를 늘리는데 한계가 있어 결과적으로 신호 강도를 개선하는데 그 한계가 명백하다.In general, it is known that the smaller the nanogap is, the more the strength of the SERS signal is increased. Considering the size of the analyte, most of the nanogaps are manufactured at the level of several nanometers to hundreds of nanometers, but are simply formed in two dimensions, so There is a limit to increasing the number, and as a result, the limit is obvious in improving the signal strength.
또한, 이러한 원료 소스를 기판(피코팅재)에 코팅시키는 장비의 형태에 따라 증발(evaporation), 스퍼터링(sputtering), 음극 아크(cathodic arc), 이온빔 적용 증착(ion beam assisted deposition; IBAD), 펄스 레이저 증착(pulsed laser deposition; PLD), 열화학 기상증착(thermal CVD), 플라즈마 화학기상증착(plasma enhanced CVD; PECVD) 등으로 구분되며, 이러한 장비가 단독 또는 복합 방식으로 사용되기도 한다.In addition, evaporation, sputtering, cathodic arc, ion beam assisted deposition (IBAD), pulsed laser, depending on the type of equipment for coating these raw material sources on a substrate (coated material) They are classified into pulsed laser deposition (PLD), thermal CVD, plasma enhanced CVD (PECVD), etc., and these equipment may be used alone or in combination.
스퍼터링(Sputtering) 기술은 이온화된 원자를 전기장에 의해 가속시켜 타깃에 충돌시키면, 이 충돌에 의해 타깃을 구성하는 원자들이 튀어나오게 되며, 튀어나온 원자들이 기판의 표면에 증착되는 기술이다.Sputtering technology is a technique in which ionized atoms are accelerated by an electric field to collide with a target, and atoms constituting the target are protruded by the collision, and protruding atoms are deposited on the surface of the substrate.
상술한 바와 같은 스퍼터링 기술은 금속, 합금, 화합물, 절연체 등 다양한 재료의 성막이 가능하며, 여러 가지 다른 재료에서도 성막 속도가 안정되고 비슷하게 된다. 또한, 박막의 접착력이 좋고 대면적화에 유리하고 균일한 성막이 가능하며 스텝 커버리지(step coverage)가 우수한 장점이 있다.The sputtering technique as described above can form a variety of materials, such as metals, alloys, compounds, and insulators, and the deposition rate is stable and similar in various other materials. In addition, the adhesive strength of the thin film is good, it is advantageous for large area, uniform film formation is possible, and there is an advantage of excellent step coverage.
그러나 종래의 스퍼터링 기술은 나노 핑거 형성 후 박막 증착, 돌출부 형성 후 박막 증착하는 등의 적어도 2 단계 이상의 공정 단계를 필요로 하고 이에 따른 공정 비용의 증가로 인한 제조 원가가 상승하여 상용화가 곤란다는 문제가 있다.However, the conventional sputtering technique requires at least two or more process steps, such as thin film deposition after nano-finger formation and thin film deposition after formation of protrusions, and thus has difficulty in commercialization due to increased manufacturing cost due to increase in process cost. have.
또한, 구조 및 공정 방법의 특성상 높은 검출 감도를 얻기 위해서 수 나노 내지 수십 나노 수준의 표면 요철을 형성해야 하며, 2 차원 구조의 나노 갭만 존재하거나 돌출부 형성 후 금속을 증착해야 하므로 돌출부 내부의 나노 갭 제어의 한계로 인해 SERS 신호의 극대화가 곤란하다는 문제도 있다.In addition, due to the characteristics of the structure and process method, in order to obtain high detection sensitivity, it is necessary to form surface irregularities of several nano to tens of nanometers, and only nano-gaps having a two-dimensional structure exist or metals must be deposited after formation of the protrusions to control the nanogaps inside the protrusions. There is also a problem that it is difficult to maximize the SERS signal due to the limitation of.
또한, SERS은 금속 나노입자의 표면에 결합 또는 흡착된 화학물질의 라만 스펙트럼을 증폭하여 기존의 라만 분광 분석법에 비하여 감도가 매우 높다. 따라서, SERS을 활용하여 다양한 생화학 물질들을 분석한 연구결과들이 많이 발표되고 있다.In addition, SERS amplifies the Raman spectrum of chemicals bound to or adsorbed on the surface of metal nanoparticles, making it very sensitive compared to conventional Raman spectroscopy. Therefore, research results analyzing various biochemicals using SERS have been published.
대한민국 공개특허 제10-2007-0097177호(2007.10.04)는 중합체로 가교된 금속 입자를 기판상에 코팅하여 분석 대상물을 포함하는 시료를 상기 금속 입자에 접촉시켜 상기 기판에 여기광을 조사한 후, 그로부터 발생한 산란광의 스펙트럼을 분석하여 시료 중의 분석 대상물을 검출하는 방법이 개시되어 있으나, 시료에 여러 물질이 혼합되어 있는 경우 시료와 나노 입자 결합의 선택성이 떨어져 분석 대상물을 검출하기 힘들다는 문제점이 있다.Republic of Korea Patent Publication No. 10-2007-0097177 (2007.10.04) is coated with a metal particle cross-linked with a polymer on the substrate to contact the sample containing the analyte to the metal particles and irradiate the substrate with excitation light, Although a method of detecting an analyte in a sample by analyzing a spectrum of scattered light generated therefrom is disclosed, there is a problem in that it is difficult to detect an analyte because the selectivity between the sample and nanoparticles is poor due to the mixture of several substances in the sample.
대한민국 공개특허 제10-2012-0087051호(2012.08.06)는 생체 표지자(biomarker)와 표면 증강 라만 산란 입자(surface-enhanced Raman scattering dots; SERS dots)를 이용하여 질병을 정확하고 신속하게 판별/진단하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 표면 증강 라만 산란 입자에 화학적/생물학적 태그(tag)를 붙이고 이것과 질병의 생체 표지자를 표적지향적으로 결합시키고, 광학적 이미징(imaging) 기법으로 그 이미지를 획득하여 질병을 진단/판별하는 방법이 개시되어 있으나, SERS 신호를 얻음으로써 질병을 진단하는 데 있어서, 대부분의 SERS 관련 기술과 마찬가지로 생체 표지자를 라만 산란 입자에 결합시키는 방법을 사용하고 있어 진단 과정이 복잡한 문제가 있었다.Republic of Korea Patent Publication No. 10-2012-0087051 (2012.08.06) using a biomarker (biomarker) and surface-enhanced Raman scattering particles (surface-enhanced Raman scattering dots; SERS dots) to accurately and quickly determine the disease / diagnosis More specifically, a surface-enhanced Raman scattering particle is attached to a chemical / biological tag, and a biomarker of the disease and the target are target-directed, and the image is acquired by an optical imaging technique. Although a method of diagnosing / determining a disease has been disclosed, in diagnosing a disease by obtaining a SERS signal, as with most SERS-related technologies, a method of binding a biomarker to a Raman scattering particle is used, so the diagnosis process is complicated. There was.
한편, 표면 플라즈몬(Surface Plasmon)이란 도체 표면, 이를테면 금속 박막의 표면을 따라 전파하는 자유전자의 양자화된 진동을 의미한다. 이와 같은 표면 플라즈몬은 프리즘과 같은 유전매체(dielectric medium)를 지나 유전매체의 임계각 이상의 각도로 금속 박막에 입사하는 입사광에 의해 여기되어 공명을 일으키는데, 이를 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR)이라 한다.On the other hand, the surface plasmon (Surface Plasmon) means a quantized vibration of free electrons propagating along the surface of a conductor, such as a metal thin film. Such a surface plasmon is excited by incident light incident on a metal thin film at an angle greater than or equal to a critical angle of the dielectric medium after passing through a dielectric medium such as a prism to cause resonance, which is called surface plasmon resonance (SPR). .
단색 입사광을 사용할 때, 공명이 일어나는 입사광의 입사각(공명각) 및 공명이 일어나는 파장(공명파장)은 금속 박막에 근접한 물질의 굴절률 변화에 매우 민감하다. SPR 센서는 이러한 성질을 이용하여 금속 박막에 근접한 물질 즉, 시료의 굴절률 변화로부터 시료의 정량·정성 분석 및 박막인 시료의 두께를 측정하는 데에 이용되어 왔다.When using monochromatic incident light, the incident angle (resonance angle) of the incident light where resonance occurs and the wavelength (resonance wavelength) at which resonance occurs are very sensitive to changes in the refractive index of the material close to the metal thin film. SPR sensors have been used to quantify and qualitatively analyze a sample from a material that is close to a metal thin film, that is, to change the refractive index of a sample, and to measure the thickness of a sample that is a thin film using these properties.
SPR을 이용한 센서에는 크게 콜로이드 형태(Colloidal)로 분산시킨 용액에 원하는 피분석물을 넣어서 색변화를 관찰하는 감지 방법과 유리나 고분자 유기물 기판을 이용하여 금속 나노 입자를 고정한 뒤 입자 하나에 대한 흡광 그래프의 개형, 픽의 위치 등의 변화를 감지하는 센서로 구분된다In the sensor using SPR, the desired analyte is put in a solution dispersed in a colloidal form, and the detection method for observing color change and the metal nanoparticles are fixed using a glass or polymer organic substrate. It is divided into sensors that detect changes in the shape of the pick and the position of the pick.
후자의 경우 금속 박막이 아닌 금속으로 이루어진 나노 입자, 나노막대(nanorod) 및 나노구멍(nanohole) 등의 수 nm~수백 nm 크기의 금속 나노 구조체는 외부에서 입사되는 특정한 주파수(파장)의 빛에 의하여 나노 구조체 전도대(conduction band)에 있는 전자들의 집단적 진동(collective oscillation)이 유발되어 전기 쌍극자 특성을 띠게 된다. 그 결과, 해당 주파수 영역의 빛을 강하게 산란 및 흡수를 하게 되는데, 이를 국소표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance; LSPR)이라 한다.In the latter case, metal nanostructures of nanometers, nanorods, and nanoholes made of metal, rather than metal thin films, of nanometers to nanometers in size of several nanometers to hundreds of nanometers in size are subject to light at a specific frequency (wavelength) incident from the outside. Collective oscillation of electrons in the nanostructure conduction band causes electrical dipole characteristics. As a result, light in the corresponding frequency region is scattered and absorbed strongly, which is called localized surface plasmon resonance (LSPR).
LSPR에 의한 산란과 흡수는 SPR과는 달리 프리즘 또는 회절격자 없이 단순 투과분광학적 방법에 의하여 소멸 스펙트럼(extinction spectrum) 측정이 가능하다. 소멸 스펙트럼은 흡광 스펙트럼과 산란 스펙트럼의 합인데, 금속 나노 구조체의 경우 소멸 스펙트럼의 대부분이 흡광도가 차지하기 때문에 흡광을 측정하여도 무방하다. 금속 나노 구조체의 외부 입사광에 대한 흡광도 특성, 즉 흡광세기, 흡광스펙트럼의 선폭, 흡광중심 파장 등은 금속의 종류, 금속 나노 구조체의 크기 및 형상에 매우 강한 의존성을 보인다. 뿐만 아니라, SPR과 유사하게, 그들의 흡광 특성은 금속 나노 구조체의 외부환경, 즉 금속 나노 구조체 표면 주위 매질의 복소 유전율에 민감하게 반응하는데, 이러한 성질을 이용한 바이오 센서가 개발되고 있다.Unlike SPR, scattering and absorption by LSPR can measure extinction spectrum by simple transmission spectroscopy without prism or diffraction grating. The extinction spectrum is the sum of the absorbance spectrum and the scattering spectrum. In the case of a metal nanostructure, since most of the extinction spectrum occupies the absorbance, it is acceptable to measure the absorbance. The absorbance characteristics of the metal nanostructures against external incident light, that is, the absorbance intensity, the line width of the absorption spectrum, and the wavelength of the absorption center, show a very strong dependence on the type of metal and the size and shape of the metal nanostructure. In addition, similar to SPR, their absorbing properties are sensitive to the external environment of the metal nanostructure, that is, the complex dielectric constant of the medium around the surface of the metal nanostructure, and biosensors using these properties have been developed.
[선행기술문헌][Advanced technical literature]
[특허문헌][Patent Document]
대한민국 공개특허 제10-2007-0097177호(공개일: 2007.10.04)Republic of Korea Patent Publication No. 10-2007-0097177 (Publication date: 2007.10.04)
대한민국 공개특허 제10-2012-0087051호(공개일: 2012.08.06)Republic of Korea Patent Publication No. 10-2012-0087051 (Publication date: 2012.08.06)
대한미국 특허공개 제2012-0107686호(공개일: 2012년 10월 4일)Korean American Patent Publication No. 2012-0107686 (Publication date: October 4, 2012)
대한미국 특허공개 제2009-0113990호(공개일: 2009년 11월 3일)Korean American Patent Publication No. 2009-0113990 (Publication date: November 3, 2009)
본 발명의 목적은 전사를 통하여 다공성 증착막의 표면 거칠기를 효율적으로 제어할 수 있는 인버스 구조의 다공성 증착막을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a porous vapor-deposited film having an inverse structure capable of efficiently controlling the surface roughness of the porous vapor-deposited film through transfer.
본 발명의 다른 목적은 나노 입자가 나노 클러스터 입자로 형성된 후 3차원 나노포러스 구조로 증착되기 때문에 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 분석 대상물을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 3차원 나노포러스 구조의 증착막 표면에 리셉터 분자를 고정화하여 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있는 라만 분광 기판을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to maximize the Raman scattering signal because the nanoparticles are formed of nanocluster particles and then deposited in a three-dimensional nanoporous structure, and accordingly, the analyte can be more easily and conveniently detected by detecting the surface-enhanced Raman scattering signal. In addition, it is possible to improve the detection efficiency for an analyte by immobilizing a receptor molecule on the surface of the 3D nanoporous structure deposited film, and to provide a Raman spectroscopic substrate that can simplify the process.
본 발명의 또 다른 목적은 국소표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하여 생체 분자의 존재유무, 발현량 및 활성을 측정할 수 있고, 생체 분자의 측정을 이용하여 상기 생체 분자와 관련된 질병을 진단할 수 있는 압타 센서를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to measure the presence or absence, expression level, and activity of a biomolecule using a local surface plasmon resonance phenomenon, and apta that can diagnose a disease related to the biomolecule using a measurement of the biomolecule. It is to provide a sensor.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기판, 그리고 상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하며, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 보다 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 더 좁은 것인 인버스 다공성 증착막을 제공한다.According to an embodiment of the present invention, the substrate, and located on the substrate, including nano-structures made of nano-cluster particles, the spacing between the nano-structures and the substrate than the upper portion not in contact with the substrate It provides an inverse porous vapor deposition film that is narrower in the lower part in contact.
상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 상기 기판과 접하고 있는 하부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상일 수 있다.The nanostructures may have a branched shape divided into several branches in a downward direction in contact with the substrate from an upper portion not in contact with the substrate.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 프로세스 챔버와 클러스터 소스를 구비한 스퍼터링 장치로 다공성 증착막을 제조하는 방법으로서, (a) 상기 클러스터 소스 내에서 단일 원자의 기체 상태(vapor)를 형성한 후핵 형성(nucleation)을 실행하는 단계, (b) 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation) 및 나노 클러스터 입자의 크기를 제어하는 단계, (c) 상기 클러스터 소스에 마련된 노즐의 개구를 통해 상기 단계 (b)에서 성장된 나노 클러스터 입자를 프로세스 챔버로 배출하는 단계, (d) 상기 프로세스 챔버 내에 인가되는 압력을 제어하여 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)를 실행하여 나노 구조체들을 성장시키는 단계, 그리고 상기 나노 구조체들을 전사용 기판에 전사시키되, 상기 나노 구조체들의 상부와 하부가 뒤집어 지도록 전사시키는 단계를 포함하며, 상기 (d) 단계에서 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 하는 것인 인버스 다공성 증착막의 제조 방법을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, as a method for manufacturing a porous deposition film with a sputtering apparatus having a process chamber and a cluster source, (a) forming a nucleus after forming a single atom gas vapor within the cluster source executing (nucleation), (b) controlling aggregation and size of nanocluster particles through condensation in the cluster source, (c) through the opening of the nozzle provided in the cluster source The step of discharging the nano-cluster particles grown in the step (b) to the process chamber, (d) controlling the pressure applied in the process chamber to perform the coalescence of the nano-cluster particles on the deposition substrate to form a nanostructure. Growing them, and transferring the nanostructures to a substrate for transfer, the upper and lower portions of the nanostructures being followed It includes a step of transferring to be picked up, in step (d) by controlling the initial pressure greater than the late pressure, the gap between the nano-structures is in contact with the deposition substrate than in the lower contact with the deposition substrate It provides a method of manufacturing an inverse porous vapor deposition film that is made to be narrower at the upper portion that is not.
상기 (d) 단계에서의 초기 압력은 10 mTorr 내지 50 mTorr이고, 후기 압력은 0.01 mTorr 내지 10 mTorr일 수 있다.The initial pressure in step (d) is 10 mTorr to 50 mTorr, and the late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr.
상기 전사시키는 단계는 상기 나노 구조체들의 상부에 경화 조성물을 도포한 후, 경화시켜 전사용 기판을 형성하는 단계, 및 상기 증착용 기판을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.The transferring may include applying a curing composition on top of the nanostructures, followed by curing to form a transfer substrate, and removing the deposition substrate.
상기 경화 조성물은 천연 고무(Natural Rubber), 스티렌-부타디엔 고무(Styrene-Butadiene Rubber), 실리콘 고무(Silicon Rubber), 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 및 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.The curing composition is natural rubber (Natural Rubber), styrene-butadiene rubber (Styrene-Butadiene Rubber), silicone rubber (Silicon Rubber), polyurethane (Polyurethane), polymethyl methacrylate (polymethyl methacrylate) and polydimethylsiloxane (Polydimethylsiloxane) ) May include any one selected from the group consisting of.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 인버스 다공성 증착막을 포함하는 표면증강 라만 분광기판을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, there is provided a surface-enhanced Raman spectroscopic substrate including the inverse porous deposition film.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 기판, 상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하는 다공성 증착막, 그리고 상기 다공성 증착막 위에 위치하는 리셉터 분자를 포함하며, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁은 것인 라만 분광 기판을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, a substrate, a porous deposition film located on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and a receptor molecule positioned on the porous deposition film, the nanostructures The spacing between them provides a Raman spectroscopic substrate that is narrower at the top not contacting the substrate than at the bottom contacting the substrate.
상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상일 수 있다.The nanostructures may be branched into several branches in a direction from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate.
상기 리셉터 분자는 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기로 치환된 압타머이고, 상기 압타머는 상기 관능기에 의하여 상기 나노 구조체들에 부착될 수 있다.The receptor molecule is an aptamer substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups, and the aptamer can be attached to the nanostructures by the functional group.
상기 압타머는 HER2(Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2)에 특이적으로 결합하는 압타머일 수 있다.The aptamer may be an aptamer that specifically binds HER2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2).
상기 라만 분광 기판은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 더 포함할 수 있다.The Raman spectroscopy substrate further comprises any one solvent selected from the group consisting of water, alcohol and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposition film, the nanostructures, and both. It can contain.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 프로세스 챔버와 클러스터 소스를 구비한 스퍼터링 장치를 이용하여 기판 위에 다공성 증착막을 제조하는 하기 (a) 내지 (d) 단계로 이루어진 단계; 그리고 (a) 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)을 실행하는 단계, (b) 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation) 및 나노 클러스터 입자의 크기를 제어하는 단계, (c) 상기 클러스터 소스에 마련된 노즐의 개구를 통해 상기 단계 (b)에서 성장된 나노 클러스터 입자를 프로세스 챔버로 배출하는 단계, 및 (d) 상기 프로세스 챔버 내에 인가되는 압력을 제어하여 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)를 실행하여 나노 구조체들을 성장시키되, 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 상기 나노 구조체들을 성장시키는 단계, 상기 다공성 증착막 위에 리셉터 분자를 부착시키는 단계를 포함하는 라만 분광 기판의 제조 방법을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, using a sputtering apparatus having a process chamber and a cluster source, a step consisting of the following steps (a) to (d) of manufacturing a porous deposition film on a substrate; And (a) forming a plasma in the cluster source and then performing nucleation, (b) aggregation and aggregation of nanocluster particles through condensation in the cluster source. Controlling the size, (c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into a process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source, and (d) applying pressure applied in the process chamber The nanostructures are grown by controlling the coalescence of nanocluster particles on the substrate for deposition, but the initial pressure is controlled to be greater than the late pressure, so that the spacing between the nanostructures is in contact with the substrate for deposition. Growing the nanostructures so that they become narrower at the top that is not in contact with the deposition substrate than at the bottom, the Microporous provides a method for producing Raman spectroscopy substrate, comprising the step of attaching the receptor molecules on the vapor-deposited film.
상기 (d) 단계에서의 초기 압력은 10 mTorr 내지 50 mTorr이고, 후기 압력은 0.01 mTorr 내지 10 mTorr일 수 있다.The initial pressure in step (d) is 10 mTorr to 50 mTorr, and the late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr.
상기 라만 분광 기판의 제조 방법은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.The method of manufacturing the Raman spectroscopic substrate is any one selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposited film, between the nanostructures, and both. The method may further include treating the solvent.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 라만 분광 기판, 상기 라만 분광 기판에 빛을 조사하는 광원, 그리고 상기 라만 분광 기판으로부터 반사된 광의 라만 분광을 측정하는 라만 분광기를 포함하는 분석 장치를 제공한다.According to another embodiment of the present invention, there is provided an analysis device including a Raman spectroscopy substrate, a light source irradiating light to the Raman spectroscopy substrate, and a Raman spectroscopy for measuring Raman spectroscopy of light reflected from the Raman spectroscopy substrate do.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 라만 분광 기판을 분석 대상물을 포함하는 시료에 노출시켜, 상기 라만 분광 기판의 리셉터 분자와 상기 분석 대상물 간의 결합을 유도하는 단계, 그리고 라만 분광법을 이용하여 상기 분석 대상물을 검출 또는 확인하는 단계를 포함하는 분석 방법을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, exposing the Raman spectroscopy substrate to a sample containing an analyte, inducing binding between the receptor molecule of the Raman spectroscopy substrate and the analyte, and using Raman spectroscopy It provides an analysis method comprising the step of detecting or confirming the analysis object.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 복수개의 마이크로그루브들(microgrooves)을 포함하는 기판, 그리고 상기 기판의 표면에 고정된 금속 나노 구조체를 포함하고, 상기 금속 나노 구조체는 금속 나노 입자, 상기 금속 나노 입자를 둘러싸는 코팅층, 및 상기 코팅층의 관능기에 결합된 압타머를 포함하는 것인 압타 센서를 제공한다.According to another embodiment of the present invention, a substrate including a plurality of microgrooves (microgrooves), and a metal nanostructure fixed to the surface of the substrate, wherein the metal nanostructure is a metal nanoparticle, the metal It provides an aptamer sensor comprising a coating layer surrounding the nanoparticles and an aptamer bound to a functional group of the coating layer.
상기 금속 나노 구조체의 코팅층은 도파민을 포함할 수 있다. The coating layer of the metal nanostructure may include dopamine.
상기 압타머는 티올기(-SH)를 포함하고, 상기 압타머는 상기 티올기에 의하여 상기 코팅층의 관능기와 친핵성 결합할 수 있다.The aptamer includes a thiol group (-SH), and the aptamer can nucleophilically bind to a functional group of the coating layer by the thiol group.
상기 금속 나노 구조체는 상기 코팅층의 관능기에 결합된 캡핑제(capping agent)를 더 포함할 수 있다.The metal nanostructure may further include a capping agent bound to a functional group of the coating layer.
상기 캡핑제는 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol), 에틸아민(Ethylamie), 디메틸 푸마레이트(Diethyl fumarate) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.The capping agent may be any one selected from the group consisting of 2-Mercaptoethanol, Ethylamie, Diethyl fumarate, and mixtures thereof.
본 발명의 일 실시예에 따른 다공성 증착막은 전사를 통하여 다공성 증착막의 표면 거칠기를 효율적으로 제어함으로써, 표면증강 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 유기물, 이온, 암 진단 관련 표적 물질들을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있다. The porous deposited film according to an embodiment of the present invention can efficiently maximize the surface-enhanced Raman scattering signal by efficiently controlling the surface roughness of the porous deposited film through transfer, and accordingly, detect organic substances, ions, and the like through surface-enhanced Raman scattering signal detection. Target substances for cancer diagnosis can be detected more easily and conveniently.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 라만 분광 기판은 나노 입자가 나노 클러스터 입자로 형성된 후 3차원 나노포러스 구조로 증착되기 때문에 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 분석 대상물을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 3차원 나노포러스 구조의 증착막 표면에 리셉터 분자를 고정화하여 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있다.The Raman spectroscopic substrate according to another embodiment of the present invention is capable of maximizing the Raman scattering signal because nanoparticles are formed into nanocluster particles and then deposited in a 3D nanoporous structure, thereby detecting Raman scattering signals through surface enhancement. Not only can the analyte be detected more easily and conveniently, but also the receptor molecule can be immobilized on the surface of the 3D nanoporous structure to improve the detection efficiency for the analyte, and the process can be simplified.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 압타 센서는 국소표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하여 생체 분자의 존재유무, 발현량 및 활성을 측정할 수 있고, 생체 분자의 측정을 이용하여 상기 생체 분자와 관련된 질병을 진단할 수 있다.Apta sensor according to another embodiment of the present invention can measure the presence or absence, expression level and activity of biomolecules using the local surface plasmon resonance phenomenon, and diseases related to the biomolecules using the measurement of biomolecules Can diagnose.
도 1은 본 발명의 인버스 다공성 증착막을 개념적으로 도시한 모식도이다.1 is a schematic diagram conceptually showing an inverse porous deposition film of the present invention.
도 2는 본 발명의 인버스 다공성 증착막의 제조 과정을 개념적으로 도시한 모식도이다.Figure 2 is a schematic diagram conceptually showing the manufacturing process of the inverse porous deposition film of the present invention.
도 3 및 도 4는 본 발명의 제조예에서 제조된 다공성 증착막 및 인버스 다공성 증착막을 나타내는 사진이다.3 and 4 are photographs showing the porous vapor-deposited film and the inverse porous vapor-deposited film prepared in the manufacturing example of the present invention.
도 5 및 도 6은 본 발명의 실험예 1-1에서 다공성 증착막 및 인버스 다공성 증착막의 다공도(porosity)를 측정한 결과를 나타내는 사진이다.5 and 6 is a photograph showing the results of measuring the porosity of the porous deposition film and the inverse porous deposition film in Experimental Example 1-1 of the present invention.
도 7 내지 도 9는 본 발명의 실험예 1-2에서 다공성 증착막을 주사전자현미경(Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM)을 이용하여 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.7 to 9 are photographs showing the results of observation of the porous deposition film in Experimental Example 1-2 of the present invention using a Field Emission-Scanning Electron Microscopy (FE-SEM).
도 10 내지 도 12는 본 발명의 실험예 1-3에서 다공성 증착막 및 인버스 다공성 증착막의 라만 반응 특성을 측정한 결과를 나타내는 그래프들이다.10 to 12 are graphs showing the results of measuring the Raman reaction properties of the porous deposited film and the inverse porous deposited film in Experimental Example 1-3 of the present invention.
도 13은 본 발명의 라만 분광 기판을 개념적으로 도시한 모식도이다.13 is a schematic diagram conceptually showing the Raman spectroscopic substrate of the present invention.
도 14는 다공성 증착막의 형성 과정을 설명하기 위한 모식도이다.14 is a schematic view for explaining a process of forming a porous deposition film.
도 15는 본 발명의 분석 방법을 모식적으로 나타낸 도면이다.15 is a view schematically showing the analysis method of the present invention.
도 16은 본 발명의 실시예 2-1에서 제조된 기판의 다공도 측정 결과를 나타내는 그래프이다.16 is a graph showing the porosity measurement results of the substrate prepared in Example 2-1 of the present invention.
도 17은 본 발명의 실험예 2-1에서 로다민 6G에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.17 is a result of measuring the surface-enhanced Raman scattering for rhodamine 6G in Experimental Example 2-1 of the present invention.
도 18은 상기 도 17에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4, B5)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.18 is a graph in which only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4, and B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. 17 are extracted.
도 19는 본 발명의 실험예 2-2에서 anti-HER2 압타머에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.19 is a result of measuring the surface-enhanced Raman scattering for the anti-HER2 aptamer in Experimental Example 2-2 of the present invention.
도 20은 상기 도 19에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4, B5)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.20 is a graph in which only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4, and B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. 19 is extracted.
도 21은 본 발명의 실험예 2-2에서 ECD HER2 단백질에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.21 is a result of measuring the surface-enhanced Raman scattering of the ECD HER2 protein in Experimental Example 2-2 of the present invention.
도 22는 상기 도 21에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.22 is a graph in which only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, and B4) considered as characteristic Raman bands in FIG. 21 is extracted.
도 23은 본 발명의 실험예 2-3에서 아민기로 치환된 압타머를 부착한 경우에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다. 23 is a result of measuring the surface-enhanced Raman scattering in the case of attaching an amine-substituted aptamer in Experimental Example 2-3 of the present invention.
도 24는 상기 도 23의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 표현한 결과이다.24 is a result of expressing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIG. 23 by a heat mapping method.
도 25는 본 발명의 실험예 2-3에서 티올기로 치환된 압타머를 부착한 경우에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.25 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering in the case of attaching an aptamer substituted with a thiol group in Experimental Example 2-3 of the present invention.
도 26은 상기 도 25의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 표현한 결과이다.26 is a result of expressing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIG. 25 by a heat mapping method.
도 27 내지 도 29는 본 발명의 실험예 2-4에서 기판을 주사전자현미경(Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM)을 이용하여 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.27 to 29 are photographs showing the results of observing the substrate in Experimental Example 2-4 of the present invention using a Field Emission-Scanning Electron Microscopy (FE-SEM).
도 30 및 도 31은 본 발명의 실험예 2-5에서 서로 다른 기판에 대하여 압타머 검지시 라만 밴드를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.30 and 31 are graphs showing the results of measuring Raman bands when detecting aptamers for different substrates in Experimental Examples 2-5 of the present invention.
도 32 내지 도 35는 본 발명의 실험예 2-6에서 ECD HER2 단백질의 함량을 하기 변화시키며 라만 신호를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.32 to 35 is a graph showing the results of measuring the Raman signal while changing the content of the ECD HER2 protein in Experimental Example 2-6 of the present invention.
도 36 내지 도 40은 본 발명의 실험예 2-7에서 알부민(Bovine serum albumin, BSA)의 라만 신호를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.36 to 40 are graphs showing the results of measuring Raman signals of albumin (Bovine serum albumin, BSA) in Experimental Example 2-7 of the present invention.
도 41은 압타머를 포함하는 금속 나노 구조체를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 그림이다.41 is a view schematically showing a process of manufacturing a metal nanostructure including an aptamer.
도 42 내지 도 44는 실험예 3-1에서 PTFE 주형의 마이크로그루브 패턴 형상을 분석한 결과를 나타내는 이미지 및 그래프이다.42 to 44 are images and graphs showing the results of analyzing the microgroove pattern shape of the PTFE mold in Experimental Example 3-1.
도 45는 실험예 3-1에서 기판의 마이크로그루브 패턴의 형상을 분석한 결과를 나타내는 이미지(가) 및 3 차원 OP(Optical Profiler) 이미지(3-dimensional OP image)(나)이다.45 is an image (A) and a three-dimensional optical profiler (OP) image (3-dimensional OP image) (B) showing the results of analyzing the shape of the microgroove pattern of the substrate in Experimental Example 3-1.
도 46은 실험예 3-1에서 기판의 마이크로그루브 패턴의 형상을 3 차원 OP(Optical Profiler)로 분석한 라인 스캔(line scan) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.46 is a graph showing the results of a line scan analysis in which the shape of the microgroove pattern of the substrate in Experimental Example 3-1 was analyzed with a 3D optical profiler (OP).
도 47은 제조예 3-1에서 제조된 금 나노 구조체를 주사 투과 전자 현미경(STEM) 및 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.47 is a photograph showing the results of observing the gold nanostructures prepared in Preparation Example 3-1 with a scanning transmission electron microscope (STEM) and a scanning electron microscope (SEM).
도 48 내지 도 52는 제조예 3-1에서 제조된 금 나노 구조체의 물성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.48 to 52 are graphs showing the results of measuring the properties of the gold nanostructures prepared in Preparation Example 3-1.
도 53은 실험예 3-3에서 기판의 코팅성을 측정한 결과를 나타내는 사진이다.53 is a photograph showing the results of measuring the coating properties of the substrate in Experimental Example 3-3.
도 54는 실험예 3-3에서 압타 센서의 흡광계수를 측정 결과를 나타내는 그래프이다.Fig. 54 is a graph showing the results of measuring the absorption coefficient of the Apta sensor in Experimental Example 3-3.
도 55 및 도 56은 실험예 3-3에서 금 나노 구조체의 함량에 따른 흡광계수를 측정한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.55 and 56 are graphs and photographs showing the results of measuring the absorption coefficient according to the content of gold nanostructures in Experimental Example 3-3.
도 57 및 도 58는 실험예 3-4에서 압타 센서의 LSPR 분광 결과를 나타내는 그래프이다.57 and 58 are graphs showing LSPR spectroscopy results of the Apta sensor in Experimental Example 3-4.
도 59 및 도 60은 실험예 3-5에서 압타 센서의 표적 분자 검지 능력을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.59 and 60 are graphs showing the results of evaluating the target molecule detection ability of the aptap sensor in Experimental Examples 3-5.
본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.The above and other objects and new features of the present invention will become more apparent through the description and accompanying drawings of the present specification.
본 발명의 명세서에서 라만 분광법은 표면증강 라만 분광법(Surface enhanced Raman spectroscopy; SERS), 표면 증강된 공명 라만 분광법(Surface enhanced resonance Raman spectroscopy; SERRS), 하이퍼-라만(Hyper Raman) 및/또는 간섭성 반스톡스 라만 분광법(coherent anti-Stokes Raman spectroscopy; CARS)을 의미할 수 있고, 이하 설명에서는 표면증강 라만 분광법에 대한 경우를 위주로 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Raman spectroscopy in the context of the present invention is Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS), Surface enhanced resonance Raman spectroscopy (SERRS), Hyper-Raman and / or coherent anti- Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) may mean, and the following description mainly focuses on the case of surface-enhanced Raman spectroscopy, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 따른 인버스 다공성 증착막은 기판, 그리고 상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하며, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.The inverse porous deposition film according to an embodiment of the present invention is located on the substrate, and on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and the spacing between the nanostructures is the above and other objects of the present invention. New features will become more apparent through the description of the present specification and the accompanying drawings.
본 발명의 일 실시예에 따른 인버스 다공성 증착막은 기판, 그리고 상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하며, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 보다 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 더 좁은 것일 수 있다.The inverse porous deposition layer according to an embodiment of the present invention is located on a substrate, and on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and the spacing between the nanostructures is higher than that on the substrate that is not in contact with the substrate. It may be narrower in the lower part in contact with the substrate.
상기 나노 구조체들은 상기 기판 상에 상기 나노 클러스터 입자들이 증착되어 3 차원 나노 구조로 성장된 것이다. 상기 나노 클러스터 입자는 나노 입자들이 10 개 내지 20 개가 뭉쳐져서 이루어진 것으로, 상기 나노 입자는 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 알루미늄(Al) 등의 금속의 나노 입자일 수 있고, 상기 나노 클러스터 입자의 직경은 100 nm 내지 200 nm일 수 있다. 상기 나노 클러스터 입자의 직경이 상기 범위 내인 경우, 라만 검지시 라만 산란 강도가 가장 강할 수 있다.The nanostructures are grown on the substrate by depositing the nanocluster particles into a three-dimensional nanostructure. The nanocluster particles are formed by agglomeration of 10 to 20 nanoparticles, and the nanoparticles are made of metals such as gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), platinum (Pt), and aluminum (Al). It may be nanoparticles, and the diameter of the nanocluster particles may be 100 nm to 200 nm. When the diameter of the nanocluster particles is within the above range, the Raman scattering strength may be strongest when Raman is detected.
상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 보다 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 더 좁고, 밀도가 더 높을 수 있고, 구체적으로 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 상기 기판과 접하고 있는 하부로 갈수록 더 좁아지고, 밀도는 하부로 갈수록 높아지는 것일 수 있다.The spacing between the nanostructures may be narrower and denser at the bottom contacting the substrate than at the top not contacting the substrate, and specifically, the spacing between the nanostructures may not contact the substrate. It may be narrower as it goes from the upper part to the lower part contacting the substrate, and density may increase as it goes toward the lower part.
상기 나노 구조체들 사이의 간격은 각각의 나노 구조체들 사이에 형성되는 빈 공간의 수평 거리를 의미하며, 상기 나노 구조체들 사이에 형성되는 빈 공간에 의하여 상기 증착막은 다공성 증착막일 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상부에서 보다 하부에서 더 좁음에 따라 상기 다공성 증착막의 다공도는 상기 나노 구조체들의 상부에서 보다 하부에서 더 작을 수 있고, 구체적으로 상부에서 하부로 갈수록 더 작아질 수 있다.The spacing between the nanostructures refers to the horizontal distance of the empty space formed between each nanostructure, and the deposition film may be a porous deposition film by the empty space formed between the nanostructures. Accordingly, as the spacing between the nanostructures is narrower from the bottom than from the top, the porosity of the porous deposition layer may be smaller from the bottom than the top of the nanostructures, and more specifically, smaller from the top to the bottom. Can be.
이에 따라, 상기 인버스 다공성 증착막의 상기 나노 구조체들 사이의 하부 간격은 10 nm 내지 100 ㎛일 수 있고, 구체적으로 100 nm 내지 10 ㎛일 수 있다. 상기 나노 구조체들 사이의 상부 간격은 10 nm 내지 200 ㎛일 수 있고, 구체적으로 100 nm 내지 100 ㎛일 수 있다. 이때, 상기 나노 구조체들 사이의 상부 간격 범위와 하부 간격 범위가 일부 겹치더라도 상부 간격이 하부 간격에 비하여 더 크다. 상기 나노 구조체들 사이의 하부 간격은 상기 기판과 접하고 있는 상기 나노 구조체들의 최하단 사이의 거리를 의미하고, 상기 나노 구조체들 사이의 상부 간격은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상기 나노 구조체들의 최상단 사이의 거리를 의미한다.Accordingly, a lower gap between the nanostructures of the inverse porous deposition film may be 10 nm to 100 μm, and specifically, 100 nm to 10 μm. The upper gap between the nanostructures may be 10 nm to 200 μm, specifically 100 nm to 100 μm. At this time, even if the upper gap range and the lower gap range between the nanostructures partially overlap, the upper gap is larger than the lower gap. The lower spacing between the nanostructures refers to the distance between the lowermost ends of the nanostructures in contact with the substrate, and the upper spacing between the nanostructures refers to the distance between the uppermost ends of the nanostructures not in contact with the substrate. it means.
또한, 상기 인버스 다공성 증착막의 상부 다공도는 10 % 내지 85 %일 수 있고, 구체적으로 30 % 내지 80 %일 수 있다. 상기 다공성 증착막의 하부 다공도는 30 % 내지 60 %일 수 있고, 구체적으로 30 % 내지 50 %일 수 있다. 이때, 상기 다공성 증착막의 상부 다공도와 하부 다공도 범위가 일부 겹치더라도 상부 다공도가 하부 다공도에 비하여 더 크다. 상기 다공성 증착막의 하부 다공도는 상기 기판과 접하고 있는 상기 나노 구조체들의 최하단에서의 다공도를 의미하고, 상기 다공성 증착막의 상부 다공도는 상기 기판과 접하고 있지 않은 상기 나노 구조체들의 최상단에서의 다공도를 의미한다.In addition, the upper porosity of the inverse porous deposition film may be 10% to 85%, specifically 30% to 80%. The lower porosity of the porous deposition layer may be 30% to 60%, specifically 30% to 50%. At this time, even if the upper porosity and the lower porosity of the porous deposition film partially overlap, the upper porosity is larger than the lower porosity. The lower porosity of the porous deposition film means the porosity at the bottom of the nanostructures in contact with the substrate, and the upper porosity of the porous deposition film means the porosity at the top of the nanostructures not in contact with the substrate.
또한, 상기 인버스 다공성 증착막의 상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 상기 기판과 접하고 있는 하부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상일 수 있고, 구체적으로, 상기 나노 구조체들은 상부에서는 한 가닥의 굵은 기둥 형상이나, 하부로 갈수록 점차 여러 갈래로 갈라져 분지되면서 아래로 뻗은 나뭇가지 형상일 수 있다. 상기 나노 구조체들이 이러한 형상을 가짐에 따라 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상부에서 보다 하부에서 더 좁을 수 있고, 상기 다공성 증착막의 다공도는 상기 나노 구조체들의 상부에서 보다 하부에서 더 작을 수 있다.In addition, the nanostructures of the inverse porous deposition film may be divided into several branches in a downward direction in contact with the substrate from an upper portion not in contact with the substrate, and specifically, the nanostructures may have a single strand in the upper portion. It may be in the form of a thick pillar, or a branch that extends downward as it gradually branches into branches and branches. As the nanostructures have such a shape, a gap between the nanostructures may be narrower at the bottom than at the top, and the porosity of the porous deposition film may be smaller at the bottom than at the top of the nanostructures.
도 1은 상기 인버스 다공성 증착막을 개념적으로 도시한 모식도이다. 상기 도 1을 참조하면, 상기 인버스 다공성 증착막(120)은 상기 기판(121) 위에, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들(122)을 포함한다. 상기 나노 구조체들(122)은 상부에서 하부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 아래로 뻗은 분지된 형상일 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 구조체들(122) 사이의 간격은 상부에서 보다 하부에서 더 좁을 수 있고, 상기 다공성 증착막(120)의 다공도는 상기 나노 구조체들(122)의 상부에서 보다 하부에서 더 작을 수 있다.1 is a schematic diagram conceptually showing the inverse porous deposition film. Referring to FIG. 1, the inverse porous deposition layer 120 includes nanostructures 122 made of nanocluster particles on the substrate 121. The nanostructures 122 may have a branched shape that is divided into several branches from the top to the bottom and extends downward. Accordingly, the spacing between the nanostructures 122 may be narrower at the bottom than at the top, and the porosity of the porous deposition layer 120 may be smaller at the bottom than at the top of the nanostructures 122. .
상기 인버스 다공성 증착막의 상기 기판은 실리콘 기판, 갈륨비소(GaAs) 기판, 유리(Glass) 기판, 석영(Quartz) 기판, 플라스틱 기판 및 폴리머(Polymer)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 비금속 기판일 수도 있으나, 상기 인버스 다공성 증착막을 전사 방법을 이용하여 간단하게 제조하는 경우, 변형이 용이하고 제작이 쉬운 엘라스토머(elastomer) 계열 재료를 사용하거나, 해당 재료 외에도 쉽게 제작하여 탈부착이 용이한 고무 계열 재료를 사용할 수도 있다.The substrate of the inverse porous deposition film may be any one non-metal substrate selected from the group consisting of a silicon substrate, a gallium arsenide (GaAs) substrate, a glass substrate, a quartz substrate, a plastic substrate, and a polymer. However, when the inverse porous vapor deposition film is simply manufactured by using a transfer method, an elastomer-based material that is easy to deform and easy to manufacture is used, or a rubber-based material that is easily manufactured and detachable by using other materials is easily used. It might be.
상기 엘라스토머 계열 재료는 가교 결합(crosslinking bonding) 유형에 따라 열경화성 엘라스토머(Thermoset Elastomer, TSE)와 열가소성 엘라스토머(Thermoplastic Elastomer, TPE)로 나뉘는데, 이에 포함되는 재료는 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 천연 고무(Natural Rubber, NR), 스티렌-부타디엔 고무(Styrene-Butadiene Rubber, SBR), 실리콘 고무(Silicon Rubber 또는 Silicon polymer), 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate, PMMA) 및 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane, PDMS)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다.The elastomer-based material is divided into a thermoset elastomer (TSE) and a thermoplastic elastomer (TPE) according to a type of crosslinking bonding, and any materials included therein can be used. Specifically, natural rubber (Natural Rubber, NR), styrene-butadiene rubber (Styrene-Butadiene Rubber, SBR), silicone rubber (Silicon Rubber or Silicon polymer), polyurethane (Polyurethane), polymethyl methacrylate (polymethyl methacrylate, PMMA) and polydimethylsiloxane (Polydimethylsiloxane, PDMS) may be used.
상기 라만 분광 기판의 표면 거칠기는 5 nm 내지 100 nm일 수 있고, 구체적으로 20 nm 내지 70 nm일 수 있고, 더욱 구체적으로 50 nm 내지 70 nm일 수 있다. 상기 라만 분광 기판의 표면 거칠기가 5 nm 미만인 경우 표면 거칠기의 부재로 인하여 라만 산란 강도 증감 현상의 부재가 발생할 수 있고, 100 nm를 초과하는 경우 작은 크기의 비표적 검체가 다공성 증착막 속으로 고립되어, 불필요한 라만 스펙트럼이 검지되거나, 다공성 증착막의 공공율 증가로 인하여 다공성 증착막 자체의 접착력이 감소되어 박리되는 문제가 있을 수 있다.The surface roughness of the Raman spectroscopy substrate may be 5 nm to 100 nm, specifically 20 nm to 70 nm, and more specifically 50 nm to 70 nm. When the surface roughness of the Raman spectroscopy substrate is less than 5 nm, the absence of Raman scattering intensity increase or decrease may occur due to the absence of surface roughness, and when it exceeds 100 nm, a small-sized non-target sample is isolated into the porous deposition film, Unnecessary Raman spectra may be detected, or there may be a problem in that the adhesion of the porous deposition film itself is reduced due to an increase in porosity of the porous deposition film, resulting in peeling.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 인버스 다공성 증착막의 제조 방법은 다공성 증착막을 제조하는 단계, 그리고 상기 나노 구조체들을 전사용 기판에 전사시키되, 상기 나노 구조체들의 상부와 하부가 뒤집어 지도록 전사시키는 단계를 포함한다. 상기와 같이 전사를 통하여 간단한 방법으로 상기 다공성 증착막의 표면 거칠기를 효율적으로 제어할 수 있다.A method of manufacturing an inverse porous deposited film according to another embodiment of the present invention includes the steps of manufacturing a porous deposited film and transferring the nanostructures to a substrate for transfer, and transferring the nanostructures so that the top and bottom of the nanostructures are turned over. do. As described above, it is possible to efficiently control the surface roughness of the porous deposition film by a simple method through transfer.
상기 다공성 증착막을 제조하는 단계는 구체적으로, (a) 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)을 실행하는 단계, (b) 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation) 및 나노 클러스터 입자의 크기를 제어하는 단계, (c) 상기 클러스터 소스에 마련된 노즐의 개구를 통해 상기 단계 (b)에서 성장된 나노 클러스터 입자를 프로세스 챔버로 배출하는 단계, 및 (d) 상기 프로세스 챔버 내에 인가되는 압력을 제어하여 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)를 실행하여 나노 구조체들을 성장시키되, 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 상기 나노 구조체들을 성장시키는 단계를 포함할 수 있다.The step of manufacturing the porous deposition film is specifically, (a) forming a plasma in the cluster source and then performing nucleation, (b) condensation in the cluster source. Controlling aggregation and size of the nanocluster particles, (c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source, and ( d) growing nanostructures by controlling the pressure applied to the process chamber to perform coalescence of nanocluster particles on the deposition substrate, but controlling the initial pressure to be greater than the late pressure, between the nanostructures So that the gap of the gap becomes narrower at the top not contacting the deposition substrate than at the bottom contacting the deposition substrate. It may comprise the step of growing the group nanostructure.
상기 다공성 증착막 형성 메카니즘에 대해 자세하게 설명한다. 스퍼터링 장치에서는 상기 클러스터 소스에 마련된 상기 타깃에 의해 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)이 실행되고, 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation)이 실행된다. 상기 응집에 의해 나노 클러스터 입자가 형성되며, 이때 상기 나노 클러스터 입자의 크기는 상기 클러스터 소스의 거리에 따라 제어 가능하다.The mechanism for forming the porous vapor deposition film will be described in detail. In the sputtering apparatus, after forming a plasma in the cluster source by the target provided in the cluster source, nucleation is performed, and aggregation through condensation in the cluster source is performed. Is executed. Nanocluster particles are formed by the aggregation, and the size of the nanocluster particles is controllable according to the distance of the cluster source.
이어서, 상기 클러스터 소스에 마련된 상기 노즐의 개구를 통하여 상기 형성된 나노 클러스터 입자가 프로세스 챔버로 배출된다. 상기 프로세스 챔버에서는 내부 압력이 수백 mTorr 이하로 제어되어 상기 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)가 이루어진 3 차원 나노 포러스 구조의 나노 구조체가 형성된다.Subsequently, the formed nanocluster particles are discharged to the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source. In the process chamber, the internal pressure is controlled to be several hundred mTorr or less to form a nanostructure having a three-dimensional nanoporous structure on which the nanoclusters are coalesced on the deposition substrate.
즉, 상기 증착용 기판 상에 핵을 형성한 후 박막(continuous film) 형성까지 진행하는 일반적인 스퍼터 장치와 달리, 상기 프로세스 챔버 내의 압력 제어에 의해 상기 프로세스 챔버에서의 상기 증착용 기판에는 상기 클러스터 소스에서 배출된 상기 나노 클러스터 입자가 합체 상태인 3 차원 나노 포러스 구조로 증착되고, 박막 형성까지 도달하지 않게 된다. That is, unlike a typical sputtering device that forms a nucleus on the deposition substrate and then proceeds to form a continuous film, the deposition source in the process chamber is controlled by the pressure in the process chamber. The discharged nanocluster particles are deposited in a three-dimensional nanoporous structure in a coalescence state, and the thin film formation is not reached.
상기 증착용 기판에 형성된 나노 포러스 구조의 나노 구조체들이 연속적인 막을 형성하지 못하도록 상기 프로세스 챔버 내의 압력 또는 온도를 제어하여 3 차원 나노 포러스 구조의 다공성 증착막을 형성한다. 즉, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 압력 또는 온도의 조절에 의해 조정 가능하다. A porous deposition film having a 3D nanoporous structure is formed by controlling pressure or temperature in the process chamber so that nanostructures having a nanoporous structure formed on the deposition substrate do not form a continuous film. That is, the spacing between the nanostructures can be adjusted by adjusting pressure or temperature.
이때, 상기 나노 구조체들을 성장시키는 단계에서 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 한다.At this time, in the step of growing the nanostructures, the initial pressure is controlled to be greater than the late pressure, so that the spacing between the nanostructures is higher in the upper portion not in contact with the deposition substrate than in the lower portion in contact with the deposition substrate. Make it narrow.
상기 후기 압력은 0.01 mTorr 내지 10 mTorr일 수 있고, 구체적으로 0.1 mTorr 내지 10 mTorr일 수 있다. 상기 초기 압력은 10 mTorr 내지 50 mTorr일 수 있고, 구체적으로 20 mTorr 내지 40 mTorr일 수 있다. 또한, 상기 압력은 상기 초기 압력부터 상기 후기 압력까지 점차적으로 또는 단계적으로 감소할 수도 있다.The late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr, and specifically 0.1 mTorr to 10 mTorr. The initial pressure may be 10 mTorr to 50 mTorr, and specifically 20 mTorr to 40 mTorr. Further, the pressure may be gradually or stepwisely decreased from the initial pressure to the later pressure.
상기 초기 압력이 10 mTorr 미만이면 다공성 증착막의 밀도가 너무 낮아지거나 필름 형성이 안 될 수 있고, 이에 따라 라만 감도가 떨어지는 기판이 제조될 수 있으며, 상기 초기 압력이 50 mTorr를 초과하면, 공정 온도가 너무 높아져 결정성이 증가되어 원치 않는 물성의 다공성 증착막이 형성될 수 있다.If the initial pressure is less than 10 mTorr, the density of the porous deposited film may be too low or the film may not be formed, and accordingly, a substrate having a low Raman sensitivity may be manufactured, and if the initial pressure exceeds 50 mTorr, the process temperature Too high, so that the crystallinity is increased, a porous vapor deposition film of unwanted properties can be formed.
한편, 상기 나노 구조체들 사이 간격의 미세 제어를 위해 상기 프로세스 챔버에서 상기 증착용 기판을 인출한 후, 상기 증착용 기판에 대해 열처리를 선택적으로 진행할 수 있다. 다만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 프로세스 챔버 내에서 열처리를 진행할 수도 있다.Meanwhile, in order to finely control the spacing between the nanostructures, after the substrate for deposition is withdrawn from the process chamber, heat treatment may be selectively performed on the substrate for deposition. However, the present invention is not limited to this, and heat treatment may be performed in the process chamber.
상기 열처리에 의하여 상기 다공성 증착막에서 상기 나노 입자의 크기 및 나노 구조체들 사이의 간격을 증가시킬 수 있다. 상기 열처리는 100 ℃ 내지 250 ℃에서 진행할 수 있고, 상기 범위 내에서 열처리 온도가 증가할수록 상기 나노 입자의 크기 및 나노 구조체들 사이의 간격이 증가한다.By the heat treatment, the size of the nanoparticles and the spacing between the nanostructures in the porous deposition layer may be increased. The heat treatment may be performed at 100 ° C to 250 ° C, and the size of the nanoparticles and the spacing between the nanostructures increase as the heat treatment temperature increases within the range.
상기 열처리는 금속의 산화를 고려하여 N2 분위기 또는 진공에서 열처리를 진행하는 것이 바람직하다.The heat treatment is preferably performed in an N 2 atmosphere or vacuum in consideration of oxidation of the metal.
다음으로, 상기 나노 구조체들을 전사용 기판에 전사시키되, 상기 나노 구조체들의 상부와 하부가 뒤집어 지도록 전사시킨다. 이에 의하여, 상기 인버스 다공성 증착막은 상기 다공성 증착막의 나노 구조체들의 상부와 하부가 뒤집어진 형상이 된다.Next, the nano-structures are transferred to a substrate for transfer, and the top and bottom of the nano-structures are transferred to be turned over. As a result, the inverse porous deposition film has a shape in which top and bottom of the nanostructures of the porous deposition film are inverted.
도 2는 상기 인버스 다공성 증착막의 제조 과정을 개념적으로 도시한 모식도이다. 상기 도 2를 참조하면, 상기 제조된 다공성 증착막(110)의 상기 나노 구조체들(112)의 상부에 경화 조성물을 도포한 후, 상기 경화 조성물을 경화시켜 전사용 기판(121)을 형성하고, 상기 증착용 기판(111)을 제거하면, 상기 나노 구조체들(112)의 상부와 하부가 뒤집어 지도록 전사된 인버스 구조의 다공성 증착막(120)을 제조할 수 있다.2 is a schematic diagram conceptually showing a manufacturing process of the inverse porous deposition film. Referring to FIG. 2, after applying a curing composition to the top of the nanostructures 112 of the prepared porous deposition film 110, the curing composition is cured to form a transfer substrate 121, and the When the deposition substrate 111 is removed, the inverse structure of the porous deposition film 120 may be manufactured so that the upper and lower portions of the nanostructures 112 are turned over.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 표면증강 라만 분광기판은 상기 다공성 증착막 또는 상기 인버스 다공성 증착막을 포함한다.The surface-enhanced Raman spectroscopic substrate according to another embodiment of the present invention includes the porous deposition film or the inverse porous deposition film.
상기 다공성 증착막 또는 상기 인버스 다공성 증착막은 나노 입자가 나노 클러스터 입자로 형성된 후 3차원 나노포러스 구조로 증착되기 때문에 표면증강 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 유기물, 이온, 암 진단 관련 표적 물질들을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있다. 특히, 상기 인버스 다공성 증착막은 전사를 통하여 간단한 방법으로 상기 다공성 증착막의 표면 거칠기를 효율적으로 제어하여 표면증강 라만 산란을 더욱 강화할 수 있다.Since the porous deposition film or the inverse porous deposition film is formed of nano-cluster particles and then deposited as a three-dimensional nanoporous structure, it is possible to maximize the surface-enhanced Raman scattering signal, and accordingly, the organic material through the surface-enhanced Raman scattering signal detection. Target substances related to ion and cancer diagnosis can be detected more easily and conveniently. In particular, the inverse porous deposition film can effectively enhance the surface-enhanced Raman scattering by efficiently controlling the surface roughness of the porous deposition film through a simple method through transfer.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 라만 분광 기판은 기판, 상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하는 다공성 증착막, 그리고 상기 다공성 증착막 위에 위치하는 리셉터 분자를 포함한다.According to another embodiment of the present invention, a Raman spectroscopic substrate includes a substrate, a porous deposition film disposed on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and a receptor molecule positioned on the porous deposition film.
상기 기판은 실리콘 기판, 갈륨비소(GaAs) 기판, 유리(Glass) 기판, 석영(Quartz) 기판, 플라스틱 기판 및 폴리머(Polymer)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 비금속 기판일 수 있고, 또한 통상의 반도체 공정에서 사용되는 2, 4, 6, 8, 12 인치 등의 대면적 기판일 수 있다. The substrate may be any non-metal substrate selected from the group consisting of a silicon substrate, a gallium arsenide (GaAs) substrate, a glass substrate, a quartz substrate, a plastic substrate, and a polymer. It may be a large area substrate such as 2, 4, 6, 8, or 12 inches used in a semiconductor process.
상기 나노 구조체들은 상기 기판 상에 상기 나노 클러스터 입자들이 증착되어 3 차원 나노 구조로 성장된 것이다. 상기 나노 클러스터 입자는 나노 입자들이 10 개 내지 20 개가 뭉쳐져서 이루어진 것으로, 상기 나노 입자는 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 알루미늄(Al) 등의 금속의 나노 입자일 수 있고, 상기 나노 클러스터 입자의 직경은 100 nm 내지 200 nm일 수 있다. 상기 나노 클러스터 입자의 직경이 상기 범위 내인 경우, 라만 검지시 라만 산란 강도가 가장 강할 수 있다.The nanostructures are grown on the substrate by depositing the nanocluster particles into a three-dimensional nanostructure. The nanocluster particles are made of 10 to 20 nanoparticles agglomerated, and the nanoparticles are made of metals such as gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), platinum (Pt), and aluminum (Al). It may be nanoparticles, and the diameter of the nanocluster particles may be 100 nm to 200 nm. When the diameter of the nanocluster particles is within the above range, the Raman scattering strength may be strongest when Raman is detected.
상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁고, 밀도가 더 높을 수 있고, 구체적으로 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부로 갈수록 더 좁아지고, 밀도는 상부로 갈수록 높아지는 것일 수 있다.The spacing between the nanostructures may be narrower and more dense at the top not contacting the substrate than at the bottom contacting the substrate, specifically, the spacing between the nanostructures may be lower It may be that the narrower as it goes toward the upper portion not in contact with the substrate, and the density becomes higher as it goes toward the upper portion.
상기 나노 구조체들 사이의 간격은 각각의 나노 구조체들 사이에 형성되는 빈 공간의 수평 거리를 의미하며, 상기 나노 구조체들 사이에 형성되는 빈 공간에 의하여 상기 증착막은 다공성 증착막일 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 하부에서 보다 상부에서 더 좁음에 따라 상기 다공성 증착막의 다공도는 상기 나노 구조체들의 하부에서 보다 상부에서 더 작을 수 있고, 구체적으로 하부에서 상부로 갈수록 더 작아질 수 있다.The spacing between the nanostructures refers to the horizontal distance of the empty space formed between each nanostructure, and the deposition film may be a porous deposition film by the empty space formed between the nanostructures. Accordingly, as the spacing between the nanostructures is narrower from the top than from the bottom, the porosity of the porous deposition film may be smaller from the top than from the bottom of the nanostructures, and more specifically, become smaller from the bottom to the top. Can be.
상기 나노 구조체들 사이의 하부 간격은 10 nm 내지 200 ㎛일 수 있고, 구체적으로 100 nm 내지 100 ㎛일 수 있다. 상기 나노 구조체들 사이의 상부 간격은 10 nm 내지 100 ㎛일 수 있고, 구체적으로 100 nm 내지 10 ㎛일 수 있다. 이때, 상기 나노 구조체들 사이의 하부 간격 범위와 상부 간격 범위가 일부 겹치더라도 하부 간격이 상부 간격에 비하여 더 크다. 상기 나노 구조체들 사이의 하부 간격은 상기 기판과 접하고 있는 상기 나노 구조체들의 최하단 사이의 거리를 의미하고, 상기 나노 구조체들 사이의 상부 간격은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상기 나노 구조체들의 최상단 사이의 거리를 의미한다. The lower spacing between the nanostructures may be 10 nm to 200 μm, specifically 100 nm to 100 μm. The upper gap between the nanostructures may be 10 nm to 100 μm, specifically 100 nm to 10 μm. At this time, even if the lower gap range and the upper gap range between the nanostructures partially overlap, the lower gap is larger than the upper gap. The lower spacing between the nanostructures means the distance between the bottom of the nanostructures in contact with the substrate, and the upper spacing between the nanostructures refers to the distance between the topmost of the nanostructures not in contact with the substrate. it means.
또한, 상기 다공성 증착막의 하부 다공도는 10 % 내지 85 %일 수 있고, 구체적으로 30 % 내지 80 %일 수 있다. 상기 다공성 증착막의 상부 다공도는 30 % 내지 60 %일 수 있고, 구체적으로 30 % 내지 50 %일 수 있다. 이때, 상기 다공성 증착막의 하부 다공도와 상부 다공도 범위가 일부 겹치더라도 하부 다공도가 상부 다공도에 비하여 더 크다. 상기 다공성 증착막의 하부 다공도는 상기 기판과 접하고 있는 상기 나노 구조체들의 최하단에서의 다공도를 의미하고, 상기 다공성 증착막의 상부 다공도는 상기 기판과 접하고 있지 않은 상기 나노 구조체들의 최상단에서의 다공도를 의미한다.In addition, the lower porosity of the porous deposition film may be 10% to 85%, specifically 30% to 80%. The upper porosity of the porous deposition layer may be 30% to 60%, specifically 30% to 50%. At this time, even if the lower porosity and the upper porosity of the porous deposition film partially overlap, the lower porosity is larger than the upper porosity. The lower porosity of the porous deposition film means the porosity at the bottom of the nanostructures in contact with the substrate, and the upper porosity of the porous deposition film means the porosity at the top of the nanostructures not in contact with the substrate.
상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상일 수 있다. 구체적으로, 상기 나노 구조체들은 하부에서는 한 가닥의 굵은 기둥 형상이나, 상부로 갈수록 점차 여러 갈래로 갈라져 분지되면서 위로 뻗은 나뭇가지 형상일 수 있다. 상기 나노 구조체들이 이러한 형상을 가짐에 따라 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 하부에서 보다 상부에서 더 좁을 수 있고, 상기 다공성 증착막의 다공도는 상기 나노 구조체들의 하부에서 보다 상부에서 더 작을 수 있다.The nanostructures may be branched into several branches in a direction from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate. Specifically, the nano-structures may be a single column of thick pillars at the bottom, or a branch shape extending upwards as it is branched into several branches gradually toward the top. As the nanostructures have this shape, the spacing between the nanostructures may be narrower from the top than from the bottom, and the porosity of the porous deposition film may be smaller from the top than from the bottom of the nanostructures.
도 13은 상기 라만 분광 기판을 개념적으로 도시한 모식도이다. 상기 도 13을 참조하면, 상기 라만 분광 기판(210)은 상기 기판(211) 위에, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들(212)을 포함한다. 상기 나노 구조체들(212)은 하부에서 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 위로 뻗은 분지된 형상일 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 구조체들(212) 사이의 간격은 하부에서 보다 상부에서 더 좁을 수 있고, 상기 라만 분광 기판(210)의 다공도는 상기 나노 구조체들(212)의 하부에서 보다 상부에서 더 작을 수 있다.13 is a schematic diagram conceptually showing the Raman spectroscopic substrate. Referring to FIG. 13, the Raman spectroscopic substrate 210 includes nanostructures 212 made of nanocluster particles on the substrate 211. The nanostructures 212 may have a branched shape that is divided into several branches from bottom to top and extended upward. Accordingly, the spacing between the nanostructures 212 may be narrower from the top than from the bottom, and the porosity of the Raman spectroscopy substrate 210 may be smaller from the top than from the bottom of the nanostructures 212. have.
상기 라만 분광 기판(210)의 표면 거칠기는 5 nm 내지 100 nm일 수 있고, 구체적으로 20 nm 내지 70 nm일 수 있고, 더욱 구체적으로 50 nm 내지 70 nm일 수 있다. 상기 라만 분광 기판(210)의 표면 거칠기가 5 nm 미만인 경우 표면 거칠기의 부재로 인하여 라만 산란 강도 증감 현상의 부재가 발생할 수 있고, 100 nm를 초과하는 경우 작은 크기의 비표적 검체가 다공성 증착막 속으로 고립되어, 불필요한 라만 스펙트럼이 검지되거나, 다공성 증착막의 공공율 증가로 인하여 다공성 증착막 자체의 접착력이 감소되어 박리되는 문제가 있을 수 있다.The surface roughness of the Raman spectroscopic substrate 210 may be 5 nm to 100 nm, specifically 20 nm to 70 nm, and more specifically 50 nm to 70 nm. If the surface roughness of the Raman spectroscopy substrate 210 is less than 5 nm, the absence of a Raman scattering intensity increase or decrease may occur due to the absence of the surface roughness, and when it exceeds 100 nm, a small-sized non-target sample is introduced into the porous deposition film. Isolated, unnecessary Raman spectra may be detected, or there may be a problem that the adhesion of the porous deposition film itself is reduced due to an increase in porosity of the porous deposition film, which may cause peeling.
한편, 상기 라만 분광 기판(210)은 상기 다공성 증착막 위에 위치하는 상기 리셉터 분자(213)를 포함한다. 본 발명에서 상기 리셉터 분자(213)는 리셉터 분자에만 한정되는 것은 아니고, 표지자 또는 추적자 등을 포함하는 개념이다.Meanwhile, the Raman spectroscopic substrate 210 includes the receptor molecule 213 positioned on the porous deposition layer. In the present invention, the receptor molecule 213 is not limited to the receptor molecule, and is a concept including a marker or a tracer.
상기 리셉터 분자는 항체, RNA, DNA, 압타머, PNA 및 리간드 등과 같이 시료 내 분석 대상물과 선택적인 결합을 유도할 수 있는 물질이 바람직하다. 상기 리셉터 분자가 강한 라만 신호를 가지고 있더라도, 시료 내에 존재하는 라만 피크 중에서 상기 리셉터 분자가 가진 라만 피크와 다른 파장대에서 나타나는 특징적인 라만 피크를 찾아내어 분석 대상물의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다. 즉, 상기 라만 분광 기판이 상기 리셉터 분자를 포함함에 따라, 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있다.The receptor molecule is preferably a substance capable of inducing selective binding with an analyte in a sample, such as an antibody, RNA, DNA, aptamer, PNA and ligand. Even if the receptor molecule has a strong Raman signal, it is possible to analyze the presence and concentration of the analyte by finding a characteristic Raman peak appearing in a different wavelength band from the Raman peak of the receptor molecule among the Raman peaks present in the sample. That is, as the Raman spectroscopic substrate includes the receptor molecule, it is possible to improve the detection efficiency for the analyte and simplify the process.
또한, 상기 리셉터 분자를 한 종류 이상으로 함으로써 시료 내에서 하나 이상의 분석 대상물을 선택적으로 분석할 수도 있다.In addition, one or more analytes can be selectively analyzed in a sample by making the receptor molecule one or more types.
상기 리셉터 분자는 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기로 치환될 수 있고, 상기 리셉터 분자는 상기 관능기에 의하여 상기 나노 구조체들에 부착될 수 있다. 상기 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기는 상기 금속 나노 클러스터 입자들과 결합력이 높은 관능기로, 상기 관능기는 상기 리셉터 분자가 상기 나노 구조체들의 결합력을 향상시켜 줄 수 있다.The receptor molecule may be substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups, and the receptor molecule may be attached to the nanostructures by the functional group. The functional group selected from the group consisting of the amine group, thiol group, and catechol group is a functional group having high binding strength with the metal nanocluster particles, and the functional group can enhance the binding strength of the nanostructures by the receptor molecule.
한편, 상기 리셉터 분자는 HER2(Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2)에 특이적으로 결합하는 압타머일 수 있다. 상기 압타머는 암 전이에 관여하는 HER2 단백질에 매우 특이적으로 결합함으로써, 암, 특히 유방 암 전이를 억제하거나 검출이 가능하다.Meanwhile, the receptor molecule may be an aptamer that specifically binds HER2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2). The aptamer binds very specifically to the HER2 protein involved in cancer metastasis, thereby inhibiting or detecting cancer, particularly breast cancer metastasis.
상기 HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 5'-GAGTGACCGTCTGCCTG-[Core sequence]-CAGCCACACCACCAGCC-3'의 염기서열을 가지며, 여기서 Core Sequence는 아래의 표 1에 나타낸 바와 같다.The DNA aptamer that specifically binds to the HER2 protein has the base sequence of 5'-GAGTGACCGTCTGCCTG- [Core sequence] -CAGCCACACCACCAGCC-3 ', where the Core Sequence is as shown in Table 1 below.
No.No. 클론 번호Clone number 코어 시퀀스(core sequence)Core sequence
1One 9-ER-N-A01_A059-ER-N-A01_A05 A6G66AGAG666GCC6GAG6GCC6CG6AAGGGCG6AACAA (SEQ ID NO: 1)A6G66AGAG666GCC6GAG6GCC6CG6AAGGGCG6AACAA (SEQ ID NO: 1)
22 9-ER-N-A02_B059-ER-N-A02_B05 6AC6GGGCCCG66AGCC6C6GGCGC6CC66CGC66G6GCC (SEQ ID NO: 2)6AC6GGGCCCG66AGCC6C6GGCGC6CC66CGC66G6GCC (SEQ ID NO: 2)
33 9-ER-N-A03_C059-ER-N-A03_C05 66A6CAACGCAC6GAGGGCG6CAGC66C66666AGG (SEQ ID NO: 3)66A6CAACGCAC6GAGGGCG6CAGC66C66666AGG (SEQ ID NO: 3)
44 9-ER-N-A04_D059-ER-N-A04_D05 A6G6AGAG666GCC6GAG6GCC6CGCAAGGGCG6AACAG (SEQ ID NO: 4)A6G6AGAG666GCC6GAG6GCC6CGCAAGGGCG6AACAG (SEQ ID NO: 4)
55 9-ER-N-A06_E059-ER-N-A06_E05 6CC6G6CCCGG666ACACAAG66AAGGCAGCCGC6GGA6A (SEQ ID NO: 5)6CC6G6CCCGG666ACACAAG66AAGGCAGCCGC6GGA6A (SEQ ID NO: 5)
66 9-ER-N-B02_F059-ER-N-B02_F05 G6C6GAACACCGAGA66AGC6GAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 6)G6C6GAACACCGAGA66AGC6GAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 6)
77 9-ER-N-B03_G059-ER-N-B03_G05 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
88 9-ER-N-B04_H059-ER-N-B04_H05 CGCGA66AGA6GAACGCACAA6ACCCG66C6GAG6AAAG6 (SEQ ID NO: 8)CGCGA66AGA6GAACGCACAA6ACCCG66C6GAG6AAAG6 (SEQ ID NO: 8)
99 9-ER-N-B08_A069-ER-N-B08_A06 G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)
1010 9-ER-N-B09_B069-ER-N-B09_B06 G66AGAC6GAACGCAC6GAGGGCCGCAGCC6A6C6GAAGG (SEQ ID NO: 10)G66AGAC6GAACGCAC6GAGGGCCGCAGCC6A6C6GAAGG (SEQ ID NO: 10)
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3838 9-ER-N-F09_F099-ER-N-F09_F09 6GAGAAGGGC6G6GCC66AC6CAAAA666GGGGA6C6GAA (SEQ ID NO: 30)6GAGAAGGGC6G6GCC66AC6CAAAA666GGGGA6C6GAA (SEQ ID NO: 30)
3939 9-ER-N-F11_G099-ER-N-F11_G09 6GAGAAGGGC6G6GCC66AC6CAAAA666GGGGA6C6GAA (SEQ ID NO: 31)6GAGAAGGGC6G6GCC66AC6CAAAA666GGGGA6C6GAA (SEQ ID NO: 31)
4040 9-ER-N-G02_H099-ER-N-G02_H09 A66AGA6GAAAGCGCA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 18)A66AGA6GAAAGCGCA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 18)
4141 9-ER-N-G03_A109-ER-N-G03_A10 G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)
4242 9-ER-N-G04_B109-ER-N-G04_B10 CG6CC66GG6GAG666GGG6C6GAGCAGGAGCACG6GAG6 (SEQ ID NO: 32)CG6CC66GG6GAG666GGG6C6GAGCAGGAGCACG6GAG6 (SEQ ID NO: 32)
4343 9-ER-N-G08_C109-ER-N-G08_C10 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
4444 9-ER-N-G09_D109-ER-N-G09_D10 G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)G6C6GAACACCGAGA66AGCCGAACGAACGG6A6GGACG6 (SEQ ID NO: 9)
4545 9-ER-N-H01_E109-ER-N-H01_E10 A66AGA6GAAAGCACA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 33)A66AGA6GAAAGCACA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 33)
4646 9-ER-N-H02_F109-ER-N-H02_F10 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
4747 9-ER-N-H03_G109-ER-N-H03_G10 A66AGA6GAAAGCACA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 34)A66AGA6GAAAGCACA66CCAACAACAGA6AA6C6GAGGG (SEQ ID NO: 34)
4848 9-ER-N-H04_H109-ER-N-H04_H10 G66AGAC6GAACGCAC6GAGGGCCGCAGCC6A6C6GAAGG (SEQ ID NO: 10)G66AGAC6GAACGCAC6GAGGGCCGCAGCC6A6C6GAAGG (SEQ ID NO: 10)
4949 9-ER-N-H08_A119-ER-N-H08_A11 6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA (SEQ ID NO: 7)
5050 9-ER-N-H09_B119-ER-N-H09_B11 A6G66AGAG6C6GCC6GAG6GCC6CGCAAGGGCG6AACAG (SEQ ID NO: 35)A6G66AGAG6C6GCC6GAG6GCC6CGCAAGGGCG6AACAG (SEQ ID NO: 35)
6 = NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine]6 = NapdU [5- (N-Naphthylcarboxyamide) -2'-deoxyuridine]
Figure PCTKR2019014438-appb-I000001
Figure PCTKR2019014438-appb-I000001
A = 2'-deoxyAdenosineA = 2'-deoxyAdenosine
G = 2'-deoxyGuanosineG = 2'-deoxyGuanosine
C = 2'-deoxyCytidineC = 2'-deoxyCytidine
T = 2'-deoxyThymidine(Thymidine)T = 2'-deoxyThymidine (Thymidine)
이 중에서도 클론 번호 9-ER-N-B03_G05와 9-ER-N-C02_D06(6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA, SEQ ID NO: 7)를 사용하는 것이 더욱 바람직한데, 그 이유는 특이적 바이오 마커인 HER2 단백질과의 우수한 결합력 때문이다. Among these, it is more preferable to use clone numbers 9-ER-N-B03_G05 and 9-ER-N-C02_D06 (6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA, SEQ ID NO: 7), because of their excellent binding ability with the specific biomarker HER2 protein Because.
이에 따라, 상기 라만 분광 기판은 15 ng/mL(유방암 발현 암 인자 임상 기준치) 수준의 ECD(Extracellular Domain) HER2 단백질(악성 유방암 발현 인자)을 검출할 수 있고, 혈액 내 존재하는 ECD HER2 단백질이 임상 기준치 농도의 아주 작은 혈액 부피(2 μL)로도 유방암 환자의 예후 관찰에 이용 가능하다.Accordingly, the Raman spectroscopic substrate can detect an extracellular domain (ECD) HER2 protein (malignant breast cancer expression factor) at a level of 15 ng / mL (breast cancer expressing cancer factor clinical standard), and the ECD HER2 protein present in the blood is clinical. Even a small blood volume (2 μL) of the baseline concentration can be used for prognosis in breast cancer patients.
한편, 상기 라만 분광 기판은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 더 포함할 수 있다. 상기 알코올은 구체적으로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.On the other hand, the Raman spectroscopic substrate is any one solvent selected from the group consisting of water, alcohol and mixtures thereof at any one position selected from the group consisting of both the surface of the porous deposition film, the nanostructures and both. It may further include. The alcohol may be any one selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, butanol, and mixtures thereof.
상기 용매는 상기 다공성 증착막의 표면 또는 상기 나노 구조체들의 사이에 흩뿌려진 것일 수 있고, 상기 라만 분광 기판이 상기 용매를 더 포함하는 경우 DNA(oligonucleotide)의 구조를 변화시켜 라만 검지가 더 잘 이루어질 수 있도록 한다. 구체적으로, 상기 압타머 등의 리셉터 분자는 DNA 가닥 중 일부분으로 자연 상태에서 염기 서열 간 수소 결합으로 인하여 3 차원 구조(3D structure)를 갖는 것으로 알려져 있다. 이를 헤어핀 구조(hairpin structure)라고 한다. 상기 압타머 등의 리셉터 분자에 상기 용매를 가하면 3 차원 구조를 이루던 압타머의 수소 결합이 끊어지게 되어 선형 구조를 가지게 되면서 라만 검지가 더 잘 이루어질 수 있도록 한다.The solvent may be scattered between the surfaces of the porous deposition layer or the nanostructures, and when the Raman spectroscopy substrate further includes the solvent, the structure of DNA (oligonucleotide) is changed to make Raman detection better. do. Specifically, the receptor molecule such as the aptamer is known to have a 3D structure due to hydrogen bonding between base sequences in a natural state as part of a DNA strand. This is called a hairpin structure. When the solvent is added to a receptor molecule such as the aptamer, the hydrogen bond of the aptamer having a three-dimensional structure is broken, thereby having a linear structure, so that Raman detection can be made better.
상용화된 암 진단 방식인 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)는 항원항체반응의 특이성을 이용하는 점에서는 동일하나, 항체를 두 개 이용하며 형광 발색 인자를 합성하는 추가적인 공정(Fluorescence dye labeling)이 있으며, 이 형광발색 인자의 농도로 간접적으로 암을 진단하는 반면, 상기 라만 분광 기판을 이용하면 리셉터 분자와 분석 대상 물질 자체의 라만 스펙트럼을 얻으므로 물질 자체의 유무를 확실하게 판별할 수 있으며, ELISA 방식과 같이 형광 발색 인자를 합성할 필요가 없어 공정을 단순화시킬 수 있다.The commercialized cancer diagnosis method, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), is the same in that it uses the specificity of the antigen-antibody reaction, but there is an additional process (Fluorescence dye labeling) that uses two antibodies and synthesizes a fluorescent color factor. While the cancer is diagnosed indirectly by the concentration of the fluorescence-emitting factor, the Raman spectroscopic substrate is used to obtain the Raman spectrum of the receptor molecule and the analyte itself, so that the presence or absence of the substance itself can be reliably determined, as in the ELISA method. There is no need to synthesize fluorescence chromogenic factors, which simplifies the process.
구체적으로, 상기 라만 분광 기판은 나노 입자가 나노 클러스터 입자로 형성된 후 3차원 나노포러스 구조로 증착되기 때문에 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 분석 대상물을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 3차원 나노포러스 구조의 증착막 표면에 리셉터 분자를 고정화하여 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있다.Specifically, since the Raman spectroscopy substrate is formed of nano-cluster particles and then deposited as a three-dimensional nanoporous structure, it is possible to maximize the Raman scattering signal, thereby making it easier to analyze an object through surface-enhanced Raman scattering signal detection. In addition to simple detection, immobilization of receptor molecules on the surface of the 3D nanoporous structured deposition film can improve detection efficiency for analytes, and simplify the process.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 라만 분광 기판의 제조 방법은 프로세스 챔버와 클러스터 소스를 구비한 스퍼터링 장치를 이용하여 기판 위에 다공성 증착막을 제조하는 단계, 그리고 상기 다공성 증착막 위에 리셉터 분자를 부착시키는 단계를 포함한다.A method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate according to another embodiment of the present invention comprises the steps of manufacturing a porous deposition film on a substrate using a sputtering apparatus having a process chamber and a cluster source, and attaching a receptor molecule on the porous deposition film It includes.
상기 다공성 증착막을 제조하는 단계는 구체적으로, (a) 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)을 실행하는 단계, (b) 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation) 및 나노 클러스터 입자의 크기를 제어하는 단계, (c) 상기 클러스터 소스에 마련된 노즐의 개구를 통해 상기 단계 (b)에서 성장된 나노 클러스터 입자를 프로세스 챔버로 배출하는 단계, 및 (d) 상기 프로세스 챔버 내에 인가되는 압력을 제어하여 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)를 실행하여 나노 구조체들을 성장시키되, 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 상기 나노 구조체들을 성장시키는 단계를 포함할 수 있다.The step of manufacturing the porous deposition film is specifically, (a) forming a plasma in the cluster source and then performing nucleation, (b) condensation in the cluster source. Controlling aggregation and size of the nanocluster particles, (c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source, and ( d) growing nanostructures by controlling the pressure applied to the process chamber to perform coalescence of nanocluster particles on the deposition substrate, but controlling the initial pressure to be greater than the late pressure, between the nanostructures So that the gap of the gap becomes narrower at the top not contacting the deposition substrate than at the bottom contacting the deposition substrate. It may comprise the step of growing the group nanostructure.
상기 다공성 증착막 형성 메카니즘에 대해 도 14를 참조하여 설명한다. 상기 도 14는 상기 다공성 증착막의 형성 과정을 설명하기 위한 모식도이다. 상기 도 14의 (a)에 도시된 바와 같이, 스퍼터링 장치에서는 상기 클러스터 소스에 마련된 상기 타깃에 의해 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)이 실행되고, 계속해서 도 14의 (b)에 도시된 바와 같이, 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation)이 실행된다. 상기 응집에 의해 나노 클러스터 입자가 형성되며, 이때 상기 나노 클러스터 입자의 크기는 상기 클러스터 소스의 거리에 따라 제어 가능하다.The mechanism for forming the porous deposited film will be described with reference to FIG. 14. 14 is a schematic view for explaining a process of forming the porous deposition film. As shown in FIG. 14 (a), in the sputtering apparatus, after forming a plasma in the cluster source by the target provided in the cluster source, nucleation is performed, and the diagram continues. As shown in (b) of 14, aggregation through condensation is performed in the cluster source. Nanocluster particles are formed by the aggregation, and the size of the nanocluster particles is controllable according to the distance of the cluster source.
이어서, 상기 도 14의 (c)에 도시된 바와 같이 상기 클러스터 소스에 마련된 상기 노즐의 개구를 통하여 상기 형성된 나노 클러스터 입자가 프로세스 챔버로 배출된다. 상기 프로세스 챔버에서는 내부 압력이 수백 mTorr 이하로 제어되어 상기 도 14의 (d)에 도시된 바와 같이, 상기 증착용 기판(230) 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)가 이루어진 3 차원 나노 포러스 구조의 나노 구조체(270)가 형성된다.Subsequently, as shown in FIG. 14C, the formed nanocluster particles are discharged into the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source. In the process chamber, the internal pressure is controlled to hundreds of mTorr or less, and as shown in FIG. 14 (d), a 3D nanoporous structure in which coalescence of nanocluster particles is formed on the deposition substrate 230 The nano-structure 270 is formed.
즉, 상기 증착용 기판(230) 상에 핵을 형성한 후 박막(continuous film) 형성까지 진행하는 일반적인 스퍼터 장치와 달리, 상기 프로세스 챔버 내의 압력 제어에 의해 상기 프로세스 챔버에서의 상기 증착용 기판(230)에는 상기 클러스터 소스에서 배출된 상기 나노 클러스터 입자가 합체 상태인 3 차원 나노 포러스 구조로 증착되고, 박막 형성까지 도달하지 않게 된다. That is, unlike a general sputter device that forms a nucleus on the deposition substrate 230 and then proceeds to form a continuous film, the deposition substrate 230 in the process chamber is controlled by pressure control in the process chamber. ), The nano-cluster particles discharged from the cluster source are deposited in a three-dimensional nano-porous structure in a coalescence state, and the formation of a thin film is not reached.
본 발명에서는 상기 증착용 기판(230)에 형성된 나노 포러스 구조의 나노 구조체들(270)이 연속적인 막을 형성하지 못하도록 상기 프로세스 챔버 내의 압력 또는 온도를 제어하여 3 차원 나노 포러스 구조의 다공성 증착막을 형성한다. 즉, 상기 나노 구조체들(270) 사이의 간격은 압력 또는 온도의 조절에 의해 조정 가능하다. In the present invention, to control the pressure or temperature in the process chamber so that the nano-porous structure of the nano-porous structure formed on the substrate 230 for deposition does not form a continuous film to form a porous deposition film of a three-dimensional nano-porous structure . That is, the spacing between the nanostructures 270 is adjustable by adjusting pressure or temperature.
이때, 상기 나노 구조체들(270)을 성장시키는 단계에서 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들(270) 사이의 간격이 상기 증착용 기판(230)과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판(230)과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 한다.At this time, in the step of growing the nanostructures 270, the initial pressure is controlled to be greater than the late pressure, so that the gap between the nanostructures 270 is lower than that at the lower portion of the substrate for contact with the deposition substrate 230. It is made to be narrower at an upper portion not in contact with the deposition substrate 230.
상기 후기 압력은 0.01 mTorr 내지 10 mTorr일 수 있고, 구체적으로 0.1 mTorr 내지 10 mTorr일 수 있다. 상기 초기 압력은 10 mTorr 내지 50 mTorr일 수 있고, 구체적으로 20 mTorr 내지 40 mTorr일 수 있다. 또한, 상기 압력은 상기 초기 압력부터 상기 후기 압력까지 점차적으로 또는 단계적으로 감소할 수도 있다.The late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr, and specifically 0.1 mTorr to 10 mTorr. The initial pressure may be 10 mTorr to 50 mTorr, and specifically 20 mTorr to 40 mTorr. Further, the pressure may be gradually or stepwisely decreased from the initial pressure to the later pressure.
상기 초기 압력이 10 mTorr 미만이면 다공성 증착막의 밀도가 너무 낮아지거나 필름 형성이 안 될 수 있고, 이에 따라 라만 감도가 떨어지는 기판이 제조될 수 있으며, 상기 초기 압력이 50 mTorr를 초과하면, 공정 온도가 너무 높아져 결정성이 증가되어 원치 않는 물성의 다공성 증착막이 형성될 수 있다.If the initial pressure is less than 10 mTorr, the density of the porous deposited film may be too low or the film may not be formed, and accordingly, a substrate having a low Raman sensitivity may be manufactured, and if the initial pressure exceeds 50 mTorr, the process temperature Too high, so that the crystallinity is increased, a porous vapor deposition film of unwanted properties can be formed.
한편, 상기 나노 구조체들(270) 사이 간격의 미세 제어를 위해 상기 프로세스 챔버에서 상기 증착용 기판(230)을 인출한 후, 상기 증착용 기판(230)에 대해 열처리를 선택적으로 진행할 수 있다. 다만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 프로세스 챔버 내에서 열처리를 진행할 수도 있다.Meanwhile, for fine control of the spacing between the nanostructures 270, the deposition substrate 230 is withdrawn from the process chamber, and heat treatment may be selectively performed on the deposition substrate 230. However, the present invention is not limited to this, and heat treatment may be performed in the process chamber.
상기 열처리에 의하여 상기 다공성 증착막에서 상기 나노 입자의 크기 및 나노 구조체들(270) 사이의 간격을 증가시킬 수 있다. 상기 열처리는 100 ℃ 내지 250 ℃에서 진행할 수 있고, 상기 범위 내에서 열처리 온도가 증가할수록 상기 나노 입자의 크기 및 나노 구조체들(270) 사이의 간격이 증가한다.The size of the nanoparticles and the spacing between the nanostructures 270 in the porous deposition layer may be increased by the heat treatment. The heat treatment may be performed at 100 ° C to 250 ° C, and as the heat treatment temperature increases within the range, the size of the nanoparticles and the spacing between the nanostructures 270 increase.
상기 열처리는 금속의 산화를 고려하여 N2 분위기 또는 진공에서 열처리를 진행하는 것이 바람직하다.The heat treatment is preferably performed in an N 2 atmosphere or vacuum in consideration of oxidation of the metal.
다음으로, 상기 제조된 다공성 증착막 위에 리셉터 분자를 부착시킨다.Next, a receptor molecule is attached on the prepared porous deposition film.
이때, 상기 다공성 증착막의 나노 클러스터 입자들과 상기 리셉터 분자의 결합력을 높이기 위하여, 상기 리셉터 분자는 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기로 치환될 수 있다.At this time, in order to increase the bonding force between the nanocluster particles of the porous deposition film and the receptor molecule, the receptor molecule may be substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups.
상기 다공성 증착막 위에 상기 리셉터 분자를 부착시키는 방법 및 조건은 드랍코팅(drop-coating)또는 스핀 코팅법(spin coating) 일 수 있다.The method and conditions for attaching the receptor molecule on the porous deposition film may be drop-coating or spin coating.
선택적으로, 라만 분광 기판의 제조 방법은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.Optionally, a method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate is selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposited film, the nanostructures, and both. The method may further include treating one solvent.
구체적으로, 상기 용매를 처리하는 단계는 상기 다공성 증착막의 표면 또는 상기 나노 구조체들의 사이에 상기 용매를 스프레이 등의 방법에 의하여 흩뿌리거나, 상기 다공성 증착막을 상기 용매에 침지시켜 이루어질 수 있다.Specifically, the step of treating the solvent may be performed by spraying the solvent on the surface of the porous deposition layer or between the nanostructures by a method such as spraying or immersing the porous deposition layer in the solvent.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 분석 장치는 상기 라만 분광 기판, 상기 라만 분광 기판에 빛을 조사하는 광원, 그리고 상기 라만 분광 기판으로부터 반사된 광의 라만 분광을 측정하는 라만 분광기를 포함한다.An analysis apparatus according to another embodiment of the present invention includes the Raman spectroscopy substrate, a light source irradiating the Raman spectroscopy substrate, and a Raman spectroscopy measuring Raman spectroscopy of light reflected from the Raman spectroscopy substrate.
상기 광원과 라만 분광기는 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 광원은 532 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Nd:YAG 레이저 또는 365 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Ti:사파이어 레이저에 의해 생성된 것일 수 있다. 상기 광원은 펄스 레이저 빔 또는 연속 레이저 빔일 수 있다. The light source and the Raman spectrometer can be used commonly used. For example, the light source may be generated by a frequency superimposed Nd: YAG laser at 532 nm wavelength or a frequency superimposed Ti: sapphire laser at 365 nm wavelength. The light source may be a pulsed laser beam or a continuous laser beam.
상기 여기 빔은 공초점의 광학기 및 현미경 렌즈를 통과하여 상기 라만 분광 기판 위로 초점이 모아질 수 있다. 상기 분석 대상물로부터의 라만 방출 광은 현미경 렌즈 및 공초점 광학기에 의해 모아지고 스펙트럼 분리를 위해 단색광 장치와 결합될 수 있다. 상기 공초점 광학기는 배경 신호를 감소시키기 위한 다이크로익 필터(dichroic filter), 차단 필터, 공초점 핀홀, 대물렌즈 및 거울을 포함할 수 있다. The excitation beam can be focused over the Raman spectroscopy substrate through confocal optics and a microscope lens. The Raman emission light from the analyte can be collected by a microscope lens and confocal optics and combined with a monochromatic device for spectral separation. The confocal optics may include a dichroic filter, a blocking filter, a confocal pinhole, an objective lens and a mirror to reduce the background signal.
라만 방출 신호는 신호를 카운팅하고 디지털화하는 컴퓨터와 인터페이스로 연결된 광다이오드를 포함하는 상기 라만 분광기에 의해 검출될 수 있다. 상기 라만 분광 기판을 이용하면, 상기 라만 분광기는 굳이 고성능의 라만 장비가 아니어도 저 사양의 휴대용 라만 장비를 이용하는 것도 가능하다. 상기 저 사양의 휴대용 라만 장비는 레이저 파워(Laser power)가 0 mW 내지 100 mW일 수 있고, 레이저 파장(excitation wavelength)가 780 nm 내지 790 nm일 수 있고, 상기 레이저 조사 시간은 20 msec 내지 9 sec일 수 있다.The Raman emission signal can be detected by the Raman spectroscopy comprising a photodiode interfaced with a computer that counts and digitizes the signal. If the Raman spectroscopy substrate is used, the Raman spectroscopy may use a portable Raman equipment of a low specification even if it is not a high-performance Raman equipment. The low-end portable Raman equipment may have a laser power of 0 mW to 100 mW, a laser wavelength of 780 nm to 790 nm, and the laser irradiation time is 20 msec to 9 sec. Can be
또한, 상기 광원과 상기 라만 분광 기판 사이의 거리는 0 mm 내지 10 mm일 수 있고, 구체적으로 4 mm 내지 8 mm일 수 있다. 상기 광원과 상기 라만 분광 기판 사이의 거리가 4 mm 미만인 경우 광원인 레이저 빔이 퍼져서 초점이 안 맞을 수 있고, 8 mm를 초과하는 경우 광원인 레이저 빔이 다시 퍼져서 초점이 안 맞을 수 있다.In addition, the distance between the light source and the Raman spectroscopy substrate may be 0 mm to 10 mm, specifically 4 mm to 8 mm. When the distance between the light source and the Raman spectroscopy substrate is less than 4 mm, the laser beam as a light source may be out of focus and, if it exceeds 8 mm, the laser beam as a light source may be out of focus again.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 분석 방법은 상기 라만 분광 기판을 분석 대상물을 포함하는 시료에 노출시켜, 상기 라만 분광 기판의 리셉터 분자와 상기 분석 대상물 간의 결합을 유도하는 단계, 그리고 라만 분광법을 이용하여 상기 분석 대상물을 검출 또는 확인하는 단계를 포함한다.An analysis method according to another embodiment of the present invention exposes the Raman spectroscopy substrate to a sample containing an analyte, thereby inducing binding between the receptor molecule of the Raman spectroscopy substrate and the analyte, and Raman spectroscopy. And detecting or confirming the analyte.
상기 시료는 액체 또는 기체일 수 있으며, 상기 시료 내 분석 대상물은 라만 분광을 사용하여 측정될 수 있는 측정 대상 물질을 의미하는 것으로, 상기 리셉터 분자에 대하여 선택적 결합을 할 수 있는 모든 물질을 의미한다. 이때, 상기 리셉터 분자와 시료 내 특정물질의 선택적 결합이란 항원-항체, DNA-DNA, DNA-RNA, PNADNA, PNA-RNA, 금속-배위결합 등과 같은 일반적인 특이적 결합(specific binding)을 모두 포함할 수 있다.The sample may be liquid or gas, and the analyte in the sample means a substance to be measured that can be measured using Raman spectroscopy, and means any substance capable of selectively binding to the receptor molecule. At this time, the selective binding of the receptor molecule and a specific substance in the sample includes all general specific bindings such as antigen-antibody, DNA-DNA, DNA-RNA, PNADNA, PNA-RNA, and metal-coordination binding. Can be.
상기 리셉터 분자에 상기 시료를 반응시키면, 상기 시료 내 분석 대상 물질과 상기 리셉터 분자는 선택적으로 결합하게 된다. 라만 분광을 이용하여 상기 리셉터 분자와 결합된 상기 분석 대상 물질이 나타내는 고유한 라만 피크(Raman Peak)의 세기를 측정함으로써, 상기 시료 내 상기 분석 대상 물질의 유무 및 농도를 측정할 수 있다.When the sample is reacted with the receptor molecule, the analyte in the sample and the receptor molecule are selectively bound. By using Raman spectroscopy to measure the intensity of a unique Raman Peak represented by the analyte to be bound to the receptor molecule, it is possible to measure the presence and concentration of the analyte in the sample.
도 15는 상기 분석 방법을 모식적으로 나타낸 도면이다. 상기 도 15를 참고하면, 상기 라만 분광 기판(210)에 상기 시료(221)를 가하여, 상기 라만 분광 기판(210)의 리셉터 분자와 상기 분석 대상물 간의 결합을 유도한 후, 상기 라만 분광기(222)를 이용하여 상기 라만 분광 기판(210)에 빛(223)을 조사하고, 상기 라만 분광 기판(210)으로부터 반사된 광의 라만 분광을 측정함으로써, 상기 분석 대상물을 검출 또는 확인할 수 있다.15 is a view schematically showing the analysis method. Referring to FIG. 15, the sample 221 is added to the Raman spectroscopic substrate 210 to induce coupling between the receptor molecule of the Raman spectroscopic substrate 210 and the analyte, and then the Raman spectrometer 222. By irradiating light 223 to the Raman spectroscopy substrate 210 by using, and measuring the Raman spectroscopy of the light reflected from the Raman spectroscopy substrate 210, the analyte can be detected or confirmed.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 압타 센서는 기판, 그리고 상기 기판의 표면에 고정된 금속 나노 구조체를 포함한다.An apta sensor according to another embodiment of the present invention includes a substrate and a metal nanostructure fixed to the surface of the substrate.
상기 기판은 표면에 복수개의 마이크로그루브들(microgrooves)을 포함한다.The substrate includes a plurality of microgrooves on the surface.
상기 기판의 표면에 형성된 각각의 마이크로그루브는 상기 기판의 표면에서 오목하게 파여져 일 방향으로 길게 연장된 마이크로 크기 또는 나노 크기의 줄 형상이다. 상기 복수개의 마이크로그루브들은 간격을 두고 실질적으로 평행하게 배치되어 패턴(pattern)을 형성할 수 있다.Each micro-groove formed on the surface of the substrate is concavely dug in the surface of the substrate to have a micro- or nano-sized strip extending in one direction. The plurality of microgrooves may be disposed substantially parallel at intervals to form a pattern.
다만, 상기 각각의 마이크로그루브는 일 방향으로 길게 연장되지만 직선 형상일 필요는 없고 구불구불한 선 형상일 수도 있다. 또한, 상기 마이크로그루브들 사이의 간격은 일정할 필요가 없다. 또한, 상기 마이크로그루브들이 실질적으로 평행하다는 의미는 상기 마이크로그루브들이 가능하면 서로 엇갈리지 않으면서 연장되는 것이 바람직함을 의미하는 것이나, 상기 마이크로그루브들이 평행하지 않거나, 서로 엇갈려도 무방하다.However, each of the micro-grooves is elongated in one direction, but need not be a linear shape, but may be a serpentine line shape. Also, the spacing between the microgrooves need not be constant. In addition, the fact that the microgrooves are substantially parallel means that the microgrooves are preferably extended without staggering with each other, but the microgrooves may be nonparallel or staggered with each other.
상기 마이크로그루브들이 연장되는 방향과 수직하는 방향에 따른 단면에서, 각각의 마이크로그루브는 3 개의 꼭지점과 2 개의 변으로 이루어진 역삼각형 형상으로 정의될 수 있다. 이때, 상기 3 개의 꼭지점 중 깊이가 가장 깊은 꼭지점을 골이라 정의하고, 나머지 2 개의 꼭지점을 마루라 정의한다.In the cross section along the direction in which the microgrooves extend and perpendicular, each microgroove may be defined as an inverted triangular shape consisting of three vertices and two sides. In this case, a vertex having the deepest depth among the three vertices is defined as a goal, and the remaining two vertices are defined as a floor.
이때, 상기 마이크로그루브들의 골의 깊이는 서로 동일하지 않고 제 각각 다를 수 있다. 또한, 각각의 마이크로그루브의 2 개의 마루의 높이도 서로 다를 수 있다. 이에 따라, 상기 마이크로그루브들이 연장되는 방향과 수직하는 방향에 따른 단면 형상은 파장(마루와 마루 사이의 거리)과 진폭(마루와 골 사이의 거리)가 일정한 규칙적인 형상이 아니라, 파장과 진폭가 계속 변하는 무작위적인 형상일 수 있다.At this time, the depths of the microgrooves may not be the same as each other and may be different from each other. In addition, the heights of the two floors of each microgroove may also be different. Accordingly, the cross-sectional shape along the direction perpendicular to the direction in which the microgrooves extend is not a regular shape in which the wavelength (distance between the floor and the floor) and amplitude (distance between the floor and the valley) are constant, but the wavelength and amplitude continue. It can be a random shape that changes.
상기 마이크로그루브들을 포함하는 기판은 일 예로 마이크로그루브 패턴이 형성된 PTFE(polytetrafluoroethylene) 주형(mold)을 이용하여, 핫프레스하여 상기 마이크로그루브를 전사시키거나 또는 상기 주형 표면에 액상을 도포한 후 경화시켜 전사시켜 제조하거나, 미국특허공개 제2003/0017421호에서 기재된 레이저 광 간섭 방법에 의해 제조될 수도 있다.The substrate including the microgrooves is, for example, transferred to the microgroove by hot pressing using a polytetrafluoroethylene (PTFE) mold formed with a microgroove pattern or by applying a liquid on the mold surface and then hardening the transfer. Or by a laser light interference method described in US Patent Publication No. 2003/0017421.
또한, 상기 복수개의 마이크로그루브들을 포함하는 기판은 상업적으로 에드문드 옵틱스사(Edmund Optics Co.), 코요사(Koyo Co.), 신에쯔사(Shinetsu Chemical Co.), 미쓰비시사(Mitsubishi Chemical Co.) 또는 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)의 제품들을 이용할 수도 있다.In addition, the substrate comprising the plurality of microgrooves is commercially available from Edmund Optics Co., Koyo Co., Shinetsu Chemical Co., and Mitsubishi Chemical Co. Alternatively, Sigma-Aldrich products may be used.
상기 기판은 고유리, 플라스틱, 금속, 실리콘, 석영, 알루미나, 산화물 결정 또는 이들의 혼합물로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 플라스틱은 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane, PDMS) 폴리메틸 메타크릴레이트(Polymethyl methacrylate, PMMA), 폴리카보네이트(Polycarbonate, PC), 싸이클릭 올레핀 코폴리머(Cyclic olefin copolymer, COC) 등 일 수 있고, 상기 금속은 니켈, 알루미늄, 철 또는 구리일 수 있으며, 상기 산화물 결정은 SiO2, TiO2, Ta2O5 또는 Al2O3일 수 있다. 다만, 상기 기판으로 상기 폴리디메틸실록산을 이용하는 경우, 핫프레스 공정이 필요 없이 액상 경화 방법을 이용하여 쉽게 마이크로그루브를 전사할 수 있다.The substrate may be made of high-oil, plastic, metal, silicon, quartz, alumina, oxide crystals, or mixtures thereof. For example, the plastic may be polydimethylsiloxane (PDMS) polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), cyclic olefin copolymer (COC), etc. And the metal may be nickel, aluminum, iron or copper, and the oxide crystal may be SiO 2 , TiO 2 , Ta 2 O 5 or Al 2 O 3 . However, when the polydimethylsiloxane is used as the substrate, the microgroove can be easily transferred using a liquid curing method without the need for a hot press process.
상기 기판이 상기 마이크로그루브들을 포함하는 경우, 상기 금속 나노 구조체가 상기 마이크로그루브들의 골 내에 고정됨에 따라, 상기 금속 나노 구조체들의 응집이 억제된다. 즉, 상기 마이크로그루브들은 상기 금속 나노 구조체들의 콜로이드 모션(colloidal motion)을 억제함으로써, 상기 압타 센서의 검출 성능을 향상시킬 수 있다.When the substrate includes the microgrooves, aggregation of the metal nanostructures is suppressed as the metal nanostructures are fixed in the valleys of the microgrooves. That is, the microgrooves can improve the detection performance of the tactile sensor by suppressing the colloidal motion of the metal nanostructures.
상기 금속 나노 구조체는 금속 나노 입자, 및 상기 금속 나노 입자를 둘러싸고 있는 코팅층을 포함한다.The metal nanostructure includes metal nanoparticles and a coating layer surrounding the metal nanoparticles.
상기 금속 나노 입자는 금, 은, 구리, 알루미늄, 백금, 실리콘, 게르마늄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.The metal nanoparticle may be any one selected from the group consisting of gold, silver, copper, aluminum, platinum, silicon, germanium, and mixtures thereof.
상기 금속 나노 입자는 직경이 30 nm 내지 100 nm일 수 있고, 보다 상세하게는 40 nm 내지 60 nm일 수 있다. 또한, 상기 금속 나노 입자의 형태가 기둥 형태인 경우 상기 금속 나노 입자의 종횡비는 장축: 단축의 길이가 1:1 내지 10:1일 수 있고, 보다 상세하게 3:1 내지 5:1일 수 있다.The metal nanoparticles may have a diameter of 30 nm to 100 nm, and more specifically, 40 nm to 60 nm. In addition, when the shape of the metal nanoparticles is a columnar shape, the aspect ratio of the metal nanoparticles may be a length of a long axis: a short axis of 1: 1 to 10: 1, and more specifically 3: 1 to 5: 1. .
상기 금속 나노 입자의 종횡비가 3:1 이상이면 흡광도 최고값이 650 nm 내지 1000 nm 상에 형성되므로, 물에 대한 흡광도가 낮아 생체분자의 검출 효율을 높일 수 있으나, 상기 금속 나노 입자의 종횡비가 5:1을 초과하면, 상기 금속 나노 입자의 흡광 스펙트럼이 분해능 한계에 도달하여 측정의 용이성이 떨어질 수 있다.If the aspect ratio of the metal nanoparticles is 3: 1 or more, the highest absorbance value is formed on 650 nm to 1000 nm, so that the absorbance to water is low to increase the detection efficiency of biomolecules, but the aspect ratio of the metal nanoparticles is 5 If it exceeds: 1, the absorbance spectrum of the metal nanoparticles may reach a resolution limit, which may decrease the ease of measurement.
상기 금속 나노 입자의 형태는 본 발명에서 제한이 없고, 일 예를 들면 원기둥, 사각기둥, 삼각기둥, 오각기둥, 육각기둥, 팔각기둥, 구, 반구, 구의 일부분, 타원구, 반타원구, 타원구의 일부분, 사각뿔, 사각쌍뿔, 사각뿔대, 삼각뿔, 삼각쌍뿔, 삼각뿔대, 원뿔, 원뿔대, 링, 큐브(cube) 및 이들의 조합 형태로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 등일 수 있다.The shape of the metal nanoparticles is not limited in the present invention, for example, a cylinder, a square column, a triangular column, a pentagonal column, a hexagonal column, an octagonal column, a sphere, a hemisphere, a portion of a sphere, an elliptic sphere, a semi-elliptical sphere, a portion of an elliptical sphere , Square pyramid, square bipyramid, quadrangular pyramid, triangular pyramid, triangular bipyramid, triangular pyramid, cone, cone, ring, cube, and any one selected from the group consisting of combinations thereof.
상기 금속 나노 구조체는 상기 금속 나노 입자를 둘러싸는 코팅층을 포함한다.The metal nanostructure includes a coating layer surrounding the metal nanoparticles.
상기 코팅층은 카테콜(catechol)을 포함하는 화합물을 포함할 수 있고, 상기 카테콜을 포함하는 화합물은 도파민(dopamine), 5,6-디하이드록시인돌(5,6-dihydroxyindole) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 5,6-디하이드록시인돌은 도파민의 아민 잔기(Amine moiety)가 고리화(Cyclization)된 형태이다. 상기 카테콜을 포함하는 화합물 내의 관능기에 마이클 첨가 반응(Michael addition)을 통하여 압타머를 결합시킬 수 있으며, 상기 기판에 다른 추가적인 연결기(linker material)이 없이도 결합될 수 있다.The coating layer may include a compound containing catechol, and the compound containing catechol is dopamine, 5,6-dihydroxyindole, and combinations thereof It may be any one selected from the group consisting of. The 5,6-dihydroxyindole is a form in which the amine moiety of dopamine is cyclized. The aptamer may be attached to a functional group in the compound containing the catechol through Michael addition, and may be coupled to the substrate without any additional linker material.
구체적으로, 상기 카테콜을 포함하는 화합물로 도파민을 포함하고, 상기 도파민의 한쪽 말단에 상기 트리스(하이드록시알킬)아미노알킬(tris(hydroxyalkyl)aminoalkyl)기를 포함하고, 다른 한쪽 말단은 상기 카르복실릭 피롤(Pyrrole-2-carboxylic acid)기를 포함할 수 있다.Specifically, the compound containing the catechol contains dopamine, and the tris (hydroxyalkyl) aminoalkyl group is included at one end of the dopamine, and the other end is the carboxylic acid. Pyrrole-2-carboxylic acid group.
상기 금속 나노 입자에 상기 코팅층을 형성하는 방법은 일 예로, 상기 금속 나노 입자와 도파민 염산염을 분산시켜 현탁액을 제조하고, 상기 현탁액을 교반하여 상기 금속 나노 입자의 표면에 상기 코팅층을 형성시킬 수 있다. The method of forming the coating layer on the metal nanoparticles may be, for example, dispersing the metal nanoparticles and dopamine hydrochloride to prepare a suspension, and stirring the suspension to form the coating layer on the surface of the metal nanoparticles.
상기 현탁액은 완충용액으로 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 용액을 더 포함할 수 있다. 다만, 상기 완충용액을 pH 8 내지 pH 9로 유지하게 되면 도파민 중합이 빠르게 일어나 금속 나노 입자의 응집(aggregation)을 유발하므로 금속 나노 입자의 코팅제로 바람직하지 않으므로, pH 7 이하로 도파민 중합을 억제하며 반응시키는 것이 바람직하다.The suspension may further include a tris (hydroxymethyl) aminomethane solution as a buffer solution. However, if the buffer solution is maintained at pH 8 to pH 9, dopamine polymerization occurs rapidly and causes aggregation of metal nanoparticles, so it is not preferable as a coating agent for metal nanoparticles, so dopamine polymerization is suppressed to pH 7 or less. It is preferred to react.
상기 교반 단계는 상기 금속 나노 입자를 분산시킨 현탁액을 1,000 rpm 내지 1,500 rpm의 속도로 1 분 내지 30 분 동안 교반하는 것일 수 있다. 상기 교반은 단순 교반 또는 초음파 교반 방법을 이용할 수 있고, 이를 반복하여 실시할 수 있다. The stirring step may be to stir the suspension in which the metal nanoparticles are dispersed at a speed of 1,000 rpm to 1,500 rpm for 1 minute to 30 minutes. The agitation may use a simple agitation method or an ultrasonic agitation method, and may be repeatedly performed.
상기 현탁액의 용매는 벤젠, 노말부탄올, 부틸아세테이트, 사염화탄소, 클로로포름, 시클로헥산, 디클로로에탄, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 디에틸에스터, 헵탄, 헥산, tert-부틸메틸에스터, 메틸에틸케톤, 펜탄, 디이소프로필에스터, 테트라하이트로퓨란, 톨루엔, N-메틸-2-피롤리돈, 아세톤, 아세토니트릴, 사염화탄소, 클로로포름, 사이클로헥산, 1,2-디클로로에탄, 디클로로메탄, 디에틸에테르, 디메틸 포름아마이드, 디메틸 설폭사이드, 1,4-디옥산, 에탄올, 에틸 아세테이트, 메탄올, 메틸 3급 부틸 에테르(methyl-tert-buryl ether), 1-프로판올, 2-프로판올, 2,2,4-트리메틸펜탄, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. The solvent of the suspension is benzene, normal butanol, butyl acetate, carbon tetrachloride, chloroform, cyclohexane, dichloroethane, dichloromethane, ethyl acetate, diethyl ester, heptane, hexane, tert-butyl methyl ester, methyl ethyl ketone, pentane, di Isopropyl ester, tetrahydrofuran, toluene, N-methyl-2-pyrrolidone, acetone, acetonitrile, carbon tetrachloride, chloroform, cyclohexane, 1,2-dichloroethane, dichloromethane, diethyl ether, dimethyl formamide , Dimethyl sulfoxide, 1,4-dioxane, ethanol, ethyl acetate, methanol, methyl tert-buryl ether, 1-propanol, 2-propanol, 2,2,4-trimethylpentane, It may be any one selected from the group consisting of water and mixtures thereof, but is not limited thereto.
상기 용매는 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.The solvent may further include a lubricant, wetting agent, emulsifying agent, suspending agent or preservative.
한편, 상기 금속 나노 구조체를 상기 기판에 효과적으로 결합시키기 위해서, 상기 기판 표면에는 아민기가 도입될 수 있다. 상기 금속 나노 구조체의 표면에는 상기 도파민 등이 코팅이 되어 있기 때문에, 상기 아민화된 기판에 상기 금속 나노 구조체가 마이클 첨가 반응 방식으로 고정될 수 있다.Meanwhile, in order to effectively bind the metal nanostructure to the substrate, an amine group may be introduced on the surface of the substrate. Since the dopamine or the like is coated on the surface of the metal nanostructure, the metal nanostructure may be fixed to the aminated substrate by a Michael addition reaction method.
상기 금속 나노 구조체는 상기 코팅층의 표면에 결합되는 압타머(Aptamer)를 포함한다. 상기 압타머는 단일, 이중 나선의 DNA, RNA 형태로 표적 분자에 결합할 수 있는 물질을 의미한다.The metal nanostructure includes an aptamer bonded to the surface of the coating layer. The aptamer refers to a substance capable of binding to a target molecule in the form of single, double helix DNA or RNA.
상기 표적 분자는 활성형 바이러스, 활성화된 표면 단백질, 활성형 바이러스의 항원성을 나타내는 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 압타머는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 것이고, 바람직하게는 표적 분자에 상보적으로 결합할 수 있는 구조를 가진 것 일 수 있다.The target molecule may be any one selected from the group consisting of active viruses, activated surface proteins, proteins showing antigenicity of active viruses, and combinations thereof. The aptamer is capable of specifically binding to the target molecule, and preferably may have a structure capable of complementarily binding to the target molecule.
상기 표적 분자는 바이러스의 표면 단백질에 존재하는 막 융합 단백질일 수 있다. 또한 일 예에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 경우 헤마글루티닌(HA)의 융합 펩타이드일 수 있다. 상기 HA의 융합 펩타이드의 검출을 위한 압타머는 상기 융합 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 상보적 구조 또는 서열을 포함한다. 또한, 코로나 바이러스인 경우 스파이크 단백질일 수 있고, 파라믹소 바이러스인 경우 F 단백질 일 수 있다.The target molecule may be a membrane fusion protein present in the surface protein of the virus. In addition, in one example, the influenza virus may be a fusion peptide of hemagglutinin (HA). The aptamer for the detection of the fusion peptide of HA includes a complementary structure or sequence capable of specifically binding to the fusion peptide. In addition, it may be a spike protein in the case of a corona virus, or an F protein in the case of a paramyxovirus.
또한, 상기 압타머는 HER2(Human epithermal growth factor receptor type 2) 단백질에 특이적으로 결합하는 Anti-HER2 압타머일 수 있다. 상기 압타머는 암 전이에 관여하는 HER2 단백질에 매우 특이적으로 결합함으로써, 암, 특히 유방 암 전이를 억제하거나 검출이 가능하다.In addition, the aptamer may be an Anti-HER2 aptamer that specifically binds to HER2 (Human epithermal growth factor receptor type 2) protein. The aptamer binds very specifically to the HER2 protein involved in cancer metastasis, thereby inhibiting or detecting cancer, particularly breast cancer metastasis.
상기 압타머의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 방법을 이용하여 압타머를 제조, 선별할 수 있다. 또한, 상기 금속 나노 구조체는 상기 압타머를 단일 종류로 포함하거나 2 종류 이상을 함께 포함할 수 있다.Methods for preparing the aptamer are well known in the art, and aptamers can be prepared and selected using known methods. In addition, the metal nanostructure may include the aptamer in a single type or may include two or more types together.
구체적으로 상기 압타머는 티올기(-SH)가 치환된 것으로, 상기 티올기와 상기 금속 나노 입자의 표면을 감싸고 있는 코팅층 사이에 친핵성 결합이 자발적으로 발생하여 별도의 링커 재료 없이 압타머가 고정될 수 있다.Specifically, the aptamer is a thiol group (-SH) substituted, and a nucleophilic bond spontaneously occurs between the thiol group and the coating layer surrounding the surface of the metal nanoparticle, so that the aptamer can be fixed without a separate linker material. .
상기 금속 나노 구조체가 상기 압타머를 포함하는 경우, 상기 압타 센서는 활성형 바이러스, 활성화된 표면 단백질이나 활성형 바이러스의 항원성 단백질과 압타머의 특이적 결합 반응의 유무에 따라서 바이러스를 검출할 수 있다.When the metal nanostructure includes the aptamer, the aptamer sensor can detect a virus according to the presence or absence of a specific binding reaction between an active virus, an activated surface protein, or an antigenic protein of an active virus and an aptamer. have.
한편, 상기 금속 나노 구조체는 상기 코팅층의 관능기에 결합된 캡핑제(capping agent)를 더 포함할 수 있다. 즉, 상기 코팅층의 상기 압타머와 결합할 수 있는 잔여 관능기에 상기 캡핑제를 결합시켜 상기 관능기를 종결(termination)시킴으로써, 비특이적 피분석물 결합의 억제하여 압타 센서의 선택성을 향상시킬 수 있다.Meanwhile, the metal nanostructure may further include a capping agent bound to a functional group of the coating layer. That is, by binding the capping agent to a residual functional group capable of binding the aptamer of the coating layer to terminate the functional group, inhibition of non-specific analyte binding can be enhanced to improve selectivity of the aptamer sensor.
상기 캡핑제는 도파민과 중합반응 할 수 있는 어떠한 화합물도 가능하며, 마이클 첨가 반응이 가능한 물질 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 캡핑제는 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol), 에틸아민(Ethylamie), 디메틸 푸마레이트(Diethyl fumarate) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.The capping agent may be any compound capable of polymerizing with dopamine, and may include all substances capable of adding Michael. For example, the capping agent may include any one selected from the group consisting of 2-Mercaptoethanol, Ethylamie, Diethyl fumarate, and mixtures thereof.
도 41은 상기 압타머를 포함하는 금속 나노 구조체를 제조하는 과정을 개략적으로 나타낸 그림이다. 41 is a diagram schematically showing a process of manufacturing a metal nanostructure including the aptamer.
상기 도 41을 참고하면, 상기 금속 나노 구조체(320)는 상기 금속 나노 입자(321)의 표면에 코팅된 코팅층(322)을 포함하고, 상기 코팅층(322)의 표면에 압타머(323)가 결합될 수 있다. 또한, 선택적으로 상기 코팅층(322)의 상기 압타머(323)와 결합할 수 있는 잔여 관능기에 상기 캡핑제(324)를 결합시킬 수 있다.Referring to FIG. 41, the metal nanostructure 320 includes a coating layer 322 coated on the surface of the metal nanoparticle 321, and an aptamer 323 is coupled to the surface of the coating layer 322. Can be. In addition, the capping agent 324 may be selectively bonded to a residual functional group capable of bonding with the aptamer 323 of the coating layer 322.
상기 압타 센서는 특정 생체 분자의 검출에 이용될 수 있다. 구체적으로, 상기 금속 나노 구조체에 결합되는 압타머에 표적 분자가 결합되는 경우 상기 금속 나노 입자의 국소표면 플라즈몬 공명에 변화가 일어나고 이를 측정함으로써 특정 생체 분자의 존재 여부를 판단할 수 있다. The Apta sensor can be used to detect specific biomolecules. Specifically, when a target molecule is bound to an aptamer bound to the metal nanostructure, a change in local surface plasmon resonance of the metal nanoparticle occurs and it is possible to determine the presence or absence of a specific biomolecule.
즉, 상기 국소표면 플라즈몬 공명 신호 변화에 의해, 상기 금속 나노 입자는 외부환경, 즉 상기 금속 나노 입자 표면 주위 매질에 따라 다른 흡광 특성을 나타내게 되고 이러한 특성을 이용하여 생체 분자를 검출할 수 있다.That is, due to the change in the local surface plasmon resonance signal, the metal nanoparticles exhibit different absorbing properties depending on the external environment, that is, the medium around the surface of the metal nanoparticles, and biomolecules can be detected using these properties.
예를 들어, 상기 압타머로 검출 대상 생체 분자와 특이적으로 결합하는 단백마커를 이용하는 경우, 표적 단백질이 금속 나노 구조체 표면의 압타머에 특이적으로 결합하여 금속 나노 구조체 주변의 굴절률을 변화시키게 된다. 따라서 반응 전후의 국소표면 플라즈몬 공명 신호 변화에 따른 광학적 흡광스펙트럼의 변화를 측정하면 표적 단백마커의 존재 유무를 판별할 수 있다. For example, when a protein marker specifically binding to a biomolecule to be detected is used as the aptamer, the target protein specifically binds to the aptamer on the surface of the metal nanostructure to change the refractive index around the metal nanostructure. Therefore, the presence or absence of the target protein marker can be determined by measuring the change in the optical absorption spectrum according to the change in the local surface plasmon resonance signal before and after the reaction.
또한, 상기 LSPR 신호 변화의 정도는 표적 단백질분해효소의 농도에 의존적이므로 표적 단백질분해효소의 발현량 및 활성도 측정할 수 있다.In addition, since the degree of LSPR signal change depends on the concentration of the target protease, the expression level and activity of the target protease can also be measured.
특히, 상기 펩타이드 및 표적 생체효소는 특정 질병과 관련이 있다고 알려져 있다. 따라서, 국소표면 플라즈몬 공명 신호 변화의 측정을 통하여, 생체효소의 존재 유무, 발현량 또는 활성을 감지함으로써 해당 관련 질병을 진단하는데 유용한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, MT1-MMP의 존재 유무, 발현량 또는 활성을 감지함으로써 암의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.In particular, it is known that the peptide and target bioenzyme are associated with a specific disease. Therefore, it is possible to provide useful information for diagnosing a related disease by detecting the presence or absence, expression level, or activity of a bioenzyme through measurement of a change in local surface plasmon resonance signal. For example, by detecting the presence or absence, expression level or activity of MT1-MMP, information for diagnosis of cancer may be provided.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail so that those skilled in the art to which the present invention pertains can easily practice. However, the present invention can be implemented in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.
[제조예 1-1: 인버스 다공성 증착막의 제조][Production Example 1-1: Preparation of Inverse Porous Deposition Film]
(실시예 1-1 및 비교예 1-1)(Example 1-1 and Comparative Example 1-1)
하기 표 2에 표시한 조건으로 금(Au) 나노 구조체들을 실리콘 기판 위에 증착시켜 다공성 증착막을 제조하였다.A porous deposition film was prepared by depositing gold (Au) nanostructures on a silicon substrate under the conditions shown in Table 2 below.
DC power(W)DC power (W) 압력(mTorr)Pressure (mTorr) 소스 온도(℃)Source temperature (℃) 가스 유량(sccm)Gas flow rate (sccm)
클러스터 소스Cluster source 프로세스 챔버Process chamber ArAr HeHe He ratioHe ratio
비교예 1-1Comparative Example 1-1 250250 380380 3030 1515 8484 1414 16 %16%
상기 제조된 다공성 증착막의 나노 구조체들의 상부에 PDMS(Dow Corning사 제품, PDMS : 경화제 = 10 : 1(부피비) 경화 조성물을 도포한 후, 핫 플레이트 위에서 70 ℃, 2 시간 동안 경화시켜 전사용 기판을 형성시켰다. 이후, 상기 실리콘 기판을 제거하여 인버스 다공성 증착막(실시예 1-1)을 제조하였다.After coating the curing composition of PDMS (product of Dow Corning, PDMS: curing agent = 10: 1 (volume ratio)) on the top of the nanostructures of the prepared porous deposition film, the substrate for transfer is cured at 70 ° C. for 2 hours on a hot plate. Thereafter, the silicon substrate was removed to prepare an inverse porous deposition film (Example 1-1).
[실험예 1-1][Experimental Example 1-1]
상기 제조예에서 제조된 다공성 증착막 및 인버스 다공성 증착막의 다공도(porosity)를 측정하였고, 그 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다. 상기 도 3 및 도 4는 각각 상기 다공성 증착막과 인버스 다공성 증착막의 사진이고, 상기 도 5 및 도 6은 각각 상기 다공성 증착막(hSERS_1208)과 인버스 다공성 증착막(lhSERS_1208)의 다공도 측정 결과를 나타내는 그래프이다.The porosity of the porous vapor-deposited film and the inverse porous vapor-deposited film prepared in the preparation example was measured, and the results are shown in FIGS. 3 to 6. 3 and 4 are pictures of the porous deposition film and the inverse porous deposition film, respectively, and FIGS. 5 and 6 are graphs showing porosity measurement results of the porous deposition film (hSERS_1208) and the inverse porous deposition film (lhSERS_1208), respectively.
상기 도 5 및 도 6을 참조하면, 상기 다공성 증착막의 다공도는 50.61 %이고, 상기 인버스 다공성 증착막의 다공도는 71.78 %로 상기 인버스 다공성 증착막의 다공도가 상기 다공성 증착막의 다공도 보다 더 큼을 알 수 있다.5 and 6, the porosity of the porous deposition film is 50.61%, the porosity of the inverse porous deposition film is 71.78%, it can be seen that the porosity of the inverse porous deposition film is greater than the porosity of the porous deposition film.
[실험예 1-2][Experimental Example 1-2]
상기 제조예에서 제조된 다공성 증착막을 주사전자현미경(Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM)을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 7 내지 도 9에 나타내었다. 상기 도 8은 상기 다공성 증착막을 위에서 관찰한 결과이고, 상기 도 8 및 도 9는 상기 다공성 증착막의 단면을 관찰한 결과이다.The porous deposited film prepared in the above preparation example was observed using a scanning electron microscope (Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM), and the results are shown in FIGS. 7 to 9. 8 is a result of observing the porous deposition film from above, and FIGS. 8 and 9 are results of observing a cross section of the porous deposition film.
상기 도 7 내지 도 9를 참조하면, 상기 다공성 증착막은 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하며, 상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상임을 알 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁고, 밀도가 더 높은 것을 알 수 있다.Referring to FIGS. 7 to 9, the porous deposition film includes nanostructures made of nanocluster particles, and the nanostructures are divided into several branches from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate. It can be seen that it is a branched shape. Accordingly, it can be seen that the spacing between the nanostructures is narrower and higher in the upper portion not in contact with the substrate than in the lower portion in contact with the substrate.
따라서, 상기 다공성 증착막을 전사시켜 제조한 상기 실시예 1-1의 인버스 다공성 증착막은 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 보다 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 더 좁은 것임을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the inverse porous deposition film of Example 1-1 prepared by transferring the porous deposition film has a narrower gap between the nanostructures at the lower part of the substrate and the lower part of the substrate. have.
[실험예 1-3][Experimental Example 1-3]
상기 실시예 1-1에서 제조된 인버스 다공성 증착막의 표면증강 라만 분광기판으로서의 적용 가능성을 검증하기 위해, 바이오 센서에 사용된 1 mM 로다민 6G(Rhodamine 6G, R6G) 용액에 대한 라만 반응 특성을 조사하였다. 측정에 사용된 레이저는 725 nm의 파장을 가지는 레이저를 사용하였고, R6G 용액은 1 mM 용액(2X10-5 mol) 20 ml를 사용하였다. In order to verify the applicability of the inverse porous vapor-deposited film prepared in Example 1-1 as a surface-enhanced Raman spectroscopy substrate, a Raman reaction property was investigated for a 1 mM rhodamine 6G (Rhodamine 6G, R6G) solution used in a biosensor. Did. As the laser used for the measurement, a laser having a wavelength of 725 nm was used, and 20 ml of a 1 mM solution (2X10 -5 mol) was used for the R6G solution.
상기 제조된 인버스 다공성 증착막 1X1 mm 영역에 1 μL의 1 mM 용액(2X10-9 mol)을 적하하여 라만 신호를 측정하였고, 그 결과를 도 10 내지 도 12에 나타내었다.Raman signals were measured by dropping 1 μL of a 1 mM solution (2X10 -9 mol) in a 1X1 mm region of the prepared inverse porous deposition film, and the results are shown in FIGS. 10 to 12.
상기 도 10 내지 도 12에서 R6G 2 mL는 로다민 6G 용액의 결과이고, IhSERS는 상기 실시예 1-1에서 제조된 인버스 다공성 증착막의 결과이고, hSERS는 상기 비교예 1-1에서 제조된 다공성 증착막의 결과이고, R6G 1 μL/IhSERS는 상기 실시예 1-1에서 제조된 인버스 다공성 증착막에 1 μL 로다민 6G(Rhodamine 6G, R6G) 용액을 적하한 결과이고, R6G 1 μL/hSERS는 상기 비교예 1-1에서 제조된 다공성 증착막에 1 μL 로다민 6G(Rhodamine 6G, R6G) 용액을 적하한 결과이다.In FIGS. 10 to 12, 2 mL of R6G is the result of the rhodamine 6G solution, IhSERS is the result of the inverse porous deposition film prepared in Example 1-1, and hSERS is the porous deposition film prepared in Comparative Example 1-1. As a result, R6G 1 μL / IhSERS is a result of dropping 1 μL rhodamine 6G (Rhodamine 6G, R6G) solution on the inverse porous deposition film prepared in Example 1-1, and R6G 1 μL / hSERS is the comparative example It is a result of dropping 1 μL rhodamine 6G (Rhodamine 6G, R6G) solution to the porous deposited film prepared in 1-1.
상기 도 10 내지 도 12를 참조하면, 상기 실시예 1-1에서 제조된 인버스 다공성 증착막은 다공성 증착막의 전사를 통하여 다공성 증착막의 표면 거칠기를 효율적으로 제어함으로써, 표면증강 라만 산란 신호의 극대화되었음을 알 수 있다.10 to 12, it can be seen that the inverse porous deposition film prepared in Example 1-1 effectively maximized the surface-enhanced Raman scattering signal by efficiently controlling the surface roughness of the porous deposition film through transfer of the porous deposition film. have.
[제조예 2-1: 다공성 증착막의 제조][Production Example 2-1: Preparation of porous deposition film]
(실시예 2-1)(Example 2-1)
하기 표 3에 표시한 조건으로 금(Au) 나노 구조체들을 실리콘 기판 위에 증착시켜 다공성 증착막을 제조하였다.A porous deposition film was prepared by depositing gold (Au) nanostructures on a silicon substrate under the conditions shown in Table 3 below.
DC power(W)DC power (W) 압력(mTorr)Pressure (mTorr) 소스 온도(℃)Source temperature (℃) 가스 유량(sccm)Gas flow rate (sccm)
클러스터 소스Cluster source 프로세스 챔버Process chamber ArAr HeHe He ratioHe ratio
실시예 2-1Example 2-1 250250 380380 3030 1515 8484 1414 16 %16%
상기 제조된 다공성 증착막의 다공도 측정 결과를 도 16에 나타내었다.The porosity measurement results of the prepared porous deposition film are shown in FIG. 16.
[실험예 2-1][Experimental Example 2-1]
보통의 라만 장비는 현미경이 포함된 매우 고가의 장비이나, 본 실험에서는 휴대용 라만 장비를 이용하여, 상기 제조된 기판을 이용하여 특정 분자를 측정하는 최적화 조건을 찾아내는 실험을 진행하였다. 구체적으로, 근적외선 영역(785 nm)의 레이저 소스(laser source)로부터 레이저 빔(beam)이 샘플 표면에 주사하는데 주사 거리(Working distance)를 조절하여 측정 최적화를 진행하였다.The ordinary Raman equipment is a very expensive equipment including a microscope, but in this experiment, a portable Raman equipment was used to conduct an experiment to find an optimal condition for measuring a specific molecule using the prepared substrate. Specifically, the laser beam from the laser source in the near-infrared region (785 nm) scans the sample surface, and the scanning distance is adjusted to optimize the measurement.
상기 제조예에서 제조된 기판에 라만용 형광 염료인 로다민 6G(Rhodamine 6G, R6G)를 1 mM 농도로 분주 후 10 μL 의 부피로 드랍 코팅(drop coating)하여 완전 건조시켜 고정화 하였다.Rhodamin 6G (Rhodamine 6G, R6G), which is a fluorescent dye for Raman, was dispensed at a concentration of 1 mM on the substrate prepared in the preparation example, and then dropped and coated with a volume of 10 μL to completely dry and immobilized.
상기 로다민 6G가 고정화된 기판에 대하여, 휴대용 라만 장비(IDRaman Mini2.0, Ocean Optics社 제품)를 이용하여, 레이저 파워(laser power) 100 mW, 인테그레이션 시간(integration time) 100 msec에서, 레이저 빔의 샘플로의 주사 거리(working distance)를 각각 1 mm, 3 mm, 5 mm 및 7 mm로 조절하며 라만 신호를 측정하였고, 그 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다. For the substrate on which the rhodamine 6G is immobilized, a laser beam is used at a laser power of 100 mW and an integration time of 100 msec using a portable Raman device (IDRaman Mini2.0, manufactured by Ocean Optics). The Raman signal was measured while adjusting the working distance to the samples of 1 mm, 3 mm, 5 mm, and 7 mm, respectively, and the results are shown in FIGS. 17 and 18.
상기 도 17은 상기 로다민 6G에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이고, 상기 도 18은 상기 도 17에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4, B5)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.17 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering for the rhodamine 6G, and FIG. 18 is a Raman corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4, B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. It is a graph that extracts only the intensity.
상기 도 17 및 도 18을 참고하면, 레이저 빔의 주사 거리(working distance)가 7 mm일 때가 모든 특성 밴드 중에서 가장 강한 라만 신호를 나타내는 것을 알 수 있으므로, 로다민 6G 측정시에는 레이저 빔의 주사 거리를 7 mm 로 측정하는 것이 가장 바람직함을 알 수 있다. Referring to FIGS. 17 and 18, it can be seen that when the laser beam has a working distance of 7 mm represents the strongest Raman signal among all characteristic bands, the laser beam has a scanning distance when measuring rhodamine 6G. It can be seen that it is most preferable to measure 7 mm.
[실험예 2-2][Experimental Example 2-2]
상기 실험예 2-1에서와 같이, 리셉터 분자로서 클론 번호 9-ER-N-B03_G05인 anti-HER2 압타머(Anti-HER2 aptamer)와 분석 대상물인 ECD HER2 단백질에 대한 측정 최적화 실험을 진행하였다. As in Experimental Example 2-1, a measurement optimization experiment was performed for the anti-HER2 aptamer (Anti-HER2 aptamer), which is clone number 9-ER-N-B03_G05, as a receptor molecule, and the ECD HER2 protein as an analyte.
상기 제조예에서 제조된 기판에 상기 anti-HER2 압타머와 ECD HER2 단백질을 고정화하고, 상기 anti-HER2 압타머와 ECD HER2 단백질이 각각 고정화된 기판에 대하여, 휴대용 라만 장비(IDRaman Mini2.0, Ocean Optics社 제품)를 이용하여, 레이저 파워(laser power) 100 mW, 인테그레이션 시간(integration time) 100 msec에서, 레이저 빔의 주사 거리(working distance, WD)를 각각 1 mm, 3 mm, 5 mm 및 7 mm로 조절하며 라만 신호를 측정하였고, 그 결과를 도 19 내지 도 22에 나타내었다. The anti-HER2 aptamer and the ECD HER2 protein are immobilized on the substrate prepared in the preparation example, and the portable Raman equipment (IDRaman Mini2.0, Ocean) for the substrate on which the anti-HER2 aptamer and ECD HER2 protein are immobilized respectively. Optics), the laser power of 100 mW, the integration time (integration time) at 100 msec, the laser beam scanning distance (working distance, WD) of 1 mm, 3 mm, 5 mm and 7, respectively. The Raman signal was measured while adjusting to mm, and the results are shown in FIGS. 19 to 22.
상기 도 19는 상기 anti-HER2 압타머에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이고, 상기 도 20은 상기 도 19에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4, B5)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.19 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering for the anti-HER2 aptamer, and FIG. 20 corresponds to peaks (B1, B2, B3, B4, B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. This is a graph that extracts only the Raman intensity.
상기 도 21은 상기 ECD HER2 단백질에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이고, 상기 도 22는 상기 도 21에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.21 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering for the ECD HER2 protein, and FIG. 22 is only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4) considered as characteristic Raman bands in FIG. This is the extracted graph.
상기 도 19 내지 도 22를 참고하면, anti-HER2 압타머와 ECD HER2 단백질 같은 생체 재료의 라만 신호는 레이저 빔의 샘플로의 주사 거리(working distance)가 5 mm일 때 라만 신호가 가장 강한 것으로 나타났다. Referring to FIGS. 19 to 22, the Raman signal of a biomaterial such as anti-HER2 aptamer and ECD HER2 protein was found to have the strongest Raman signal when the working distance to the sample of the laser beam was 5 mm. .
또한, 본 발명의 기판은 상기 압타머, 단백질 마커의 특성 라만 밴드가 다른 것으로부터 분자 특이적 라만 밴드를 잘 나타내는 분자 특이적 라만 신호가 우수한 기판임을 알 수 있다.In addition, it can be seen that the substrate of the present invention is a substrate having an excellent molecular-specific Raman signal, which indicates a molecule-specific Raman band, because the characteristic Raman band of the aptamer and protein marker is different.
[실험예 2-3][Experimental Example 2-3]
상기 제조예에서 제조된 기판 표면에 클론 번호 9-ER-N-B03_G05인 anti-HER2 압타머를 고정화하여, 단백질 마커인 ECD HER2 단백질을 검지하는 센서를 제작한 후, 휴대용 라만 장비(IDRaman Mini2.0, Ocean Optics社 제품)를 이용하여, 레이저 파워(laser power) 100 mW, 인테그레이션 시간(integration time) 100 msec에서, 레이저 빔의 주사 거리(working distance, WD)를 5 mm로 조절하며 라만 신호를 측정하였고, 그 결과를 도 23 내지 도 26에 나타내었다. After immobilizing the anti-HER2 aptamer of clone number 9-ER-N-B03_G05 on the substrate surface prepared in the above preparation example, to prepare a sensor for detecting the protein marker ECD HER2 protein, a portable Raman equipment (IDRaman Mini2. 0, using Ocean Optics), at a laser power of 100 mW and an integration time of 100 msec, the laser beam's working distance (WD) is adjusted to 5 mm and the Raman signal is Measurement was made, and the results are shown in FIGS. 23 to 26.
이때, 상기 압타머는 말단을 각각 아민기와 티올기로 치환시킨 후, 기판에 고정화하여 부착력을 비교하였다. At this time, the aptamer was replaced with an amine group and a thiol group, respectively, and then immobilized on a substrate to compare adhesion.
또한, 상기 기판 표면에 각각 증류수, 70 % 에탄올 및 100 % 에탄올을 도포한 후, 라만 신호를 측정하였다.In addition, after applying distilled water, 70% ethanol, and 100% ethanol to the substrate surface, Raman signals were measured.
상기 도 23 및 도 26은 아민기로 치환된 압타머를 부착한 경우에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이고, 도 25 및 도 26은 티올기로 치환된 압타머를 부착한 경우에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.23 and 26 are results of measuring surface-enhanced Raman scattering in the case of attaching an amine-substituted aptamer, and FIGS. 25 and 26 show surface-enhanced Raman in the case of attaching an aptamer substituted with a thiol group. It is the result of measuring the scattering.
상기 도 23 내지 도 26에서 hSERS 1201는 압타머를 부착하지 않은 기판에 대한 결과이고, Anti-HER2 Aptamer는 압타머를 부착한 경우에 대한 결과이고, Adding DI water, Adding 70 % EtOH, Adding 100 % EtOH는 압타머를 부착한 후, 각각 증류수, 70 % 에탄올 및 100 % 에탄올을 도포한 경우이다.In FIGS. 23 to 26, hSERS 1201 is a result for a substrate without aptamer attached, Anti-HER2 Aptamer is a result of attaching an aptamer, and after adding aptamer, Adding DI water, Adding 70% EtOH, and Adding 100% EtOH are applied with distilled water, 70% ethanol, and 100% ethanol, respectively. It is the case.
또한, 상기 도 24 및 도 26은 각각 상기 도 23 및 도 25의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 고안하여 가시적으로 표현한 결과이다.In addition, FIGS. 24 and 26 are results obtained by visually designing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIGS. 23 and 25 using a heat mapping method.
상기 도 23 및 도 24를 참고하면, 상기 압타머 말단이 아민기로 치환된 압타머의 경우 고정화가 잘 이루어지지 않았으며, 기판 고유의 라만 밴드만 관찰되었다. 다만, 고정화 진행 후 에탄올 처리시 라만 밴드가 변화하는 양상을 보였으나, 아민기로 치환된 압타머의 경우 고정화에 문제가 있음을 나타낸다. Referring to FIGS. 23 and 24, in the case of the aptamer where the aptamer end was substituted with an amine group, immobilization was not well performed, and only Raman bands unique to the substrate were observed. However, after the immobilization proceeded, the Raman band showed a change in ethanol treatment, but in the case of an aptamer substituted with an amine group, there was a problem in immobilization.
반면, 상기 도 25 및 도 26을 참고하면, 상기 압타머 말단이 티올기로 치환된 압타머의 경우 기판에 부착 후 압타머 고유의 라만 밴드를 나타냄을 알 수 있다. 이 실험 결과로부터 티올기로 치환된 압타머는 고정화가 매우 우수한 것을 알 수 있다. On the other hand, referring to FIGS. 25 and 26, it can be seen that, in the case of the aptamer where the aptamer end is substituted with a thiol group, the aptamer has a Raman band unique to the aptamer after being attached to a substrate. It can be seen from the results of this experiment that the aptamer substituted with a thiol group is very excellent in immobilization.
또한, 상기 에탄올 등의 용매를 처리함으로써 상기 압타머의 3 차원 헤어핀 구조(hairpin structure)에서 수소 결합을 끊어 1 차원 구조로 바꿈으로써 특성 라만 밴드들도 강화되는 것을 확인할 수 있다.In addition, it can be seen that the characteristic Raman bands are also strengthened by cutting hydrogen bonds in the three-dimensional hairpin structure of the aptamer to one-dimensional structure by treating the solvent such as ethanol.
[실험예 2-4][Experimental Example 2-4]
상기 제조예에서 제조된 기판을 주사전자현미경(Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM)을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 27 내지 도 29에 나타내었다. 상기 도 27은 상기 기판을 위에서 관찰한 결과이고, 상기 도 28 및 도 29는 상기 기판의 단면을 관찰한 결과이다.The substrate prepared in the above manufacturing example was observed using a scanning electron microscope (Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM), and the results are shown in FIGS. 27 to 29. 27 is a result of observing the substrate from above, and FIGS. 28 and 29 are results of observing a cross section of the substrate.
상기 도 27 내지 도 29를 참고하면, 상기 기판은 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하며, 상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상임을 알 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁고, 밀도가 더 높은 것을 알 수 있다.Referring to FIGS. 27 to 29, the substrate includes nanostructures made of nanocluster particles, and the nanostructures are branched into several branches from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate. It can be seen that the shape is. Accordingly, it can be seen that the spacing between the nanostructures is narrower and higher in the upper portion not in contact with the substrate than in the lower portion in contact with the substrate.
즉, 상기 기판은 표면에 다공도(porosity)가 존재하여 피 분석물을 임베딩(embedding)하는 효과가 있으며, 상기 압타머를 상기 기판 표면과 내부 공극들 사이로 모두 침투시켜 피 분석물의 라만 신호 검지 집적도를 높일 수 있음을 알 수 있다.That is, the substrate has an effect of embedding an analyte due to the presence of porosity on the surface, and the Raman signal detection density of the analyte is penetrated by penetrating both the aptamer between the substrate surface and the internal pores. It can be seen that it can be increased.
[실험예 2-5][Experimental Example 2-5]
서로 다른 날짜, 서로 다른 배치(batch)에서 제작된 서로 다른 기판 샘플인 hSERS 909, hSERS 1177, hSERS 1179를 이용하여 압타머 검지시 라만 밴드를 측정하였고, 그 결과를 도 30에 나타내었다.Raman bands during aptamer detection were measured using hSERS 909, hSERS 1177, and hSERS 1179, which are different substrate samples prepared on different dates and different batches, and the results are shown in FIG. 30.
또한, 상기 서로 다른 기판 hSERS 909, hSERS 1177, hSERS 1179을 에탄올 및 증류수를 이용하여 후처리한 후 압타머 검지시 라만 밴드를 측정하였고, 그 결과를 도 31에 나타내었다.In addition, after the different substrates hSERS 909, hSERS 1177, and hSERS 1179 were post-treated using ethanol and distilled water, Raman bands were measured during aptamer detection, and the results are shown in FIG. 31.
상기 도 30 및 도 31을 참고하면, 상기 기판은 압타머 자체의 특성 라만 밴드가 동일하게 관찰되고, 에탄올 및 증류수를 이용하여 후처리시에도 압타머 고유의 라만 밴드가 동일하게 관찰되므로, 재현성이 우수한 기판임을 확인할 수 있다.30 and 31, the substrate has the same characteristic Raman band of the aptamer itself, and the Raman band unique to the aptamer is also observed during post-treatment using ethanol and distilled water. It can be confirmed that it is an excellent substrate.
[실험예 2-6][Experimental Example 2-6]
상기 실험예 2-3에서 제조된 기판을 이용하여, ECD HER2 단백질의 함량을 하기 표 4와 같이 변화시키며 라만 신호를 측정하였고, 그 결과를 하기 도 32 내지 도 35에 나타내었다.Using the substrate prepared in Experimental Example 2-3, the Raman signal was measured while changing the content of ECD HER2 protein as shown in Table 4 below, and the results are shown in FIGS. 32 to 35 below.
상기 도 32 내지 도 35에서, Anti-HER2 aptamer 7 pmole / dual solvent treated(Aptamer/solvent)는 기판에 Anti-HER2 압타머 7 pmole을 고정화 이후에 100% 에탄올 및 증류수의 2 가지 종류의 용매(dual solvent)로 처리를 한 경우이고, ECD HER2 Protein은 ECD HER2 단백질만을 적용한 경우이고, 샘플 A, B, C, D는 각각 상기 압타머와 상기 단백질의 중량비를 하기 표 4에서와 같이 변화시킨 경우이다.In FIGS. 32 to 35, Anti-HER2 aptamer 7 pmole / dual solvent treated (Aptamer / solvent) has two types of solvents (100% ethanol and distilled water) after immobilization of Anti-HER2 aptamer 7 pmole on a substrate (dual solvent), ECD HER2 Protein is a case where only ECD HER2 protein is applied, and samples A, B, C, and D are cases where the weight ratios of the aptamer and the protein are changed as shown in Table 4 below. .
또한, 상기 도 32 및 도 33은 에탄올과 증류수를 이용하여 워싱(Washing)하기 전의 결과이고, 상기 도 34 및 도 35는 에탄올과 증류수를 이용하여 워싱(Washing)한 후의 결과이다.In addition, FIGS. 32 and 33 are results before washing using ethanol and distilled water, and FIGS. 34 and 35 are results after washing using ethanol and distilled water.
또한, 상기 도 33 및 도 35는 상기 도 32 및 도 34의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 고안하여 가시적으로 표현한 결과이다.In addition, FIGS. 33 and 35 are results obtained by visually designing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIGS. 32 and 34 by a heat mapping method.
샘플Sample AA BB CC DD
압타며 : 단백질(중량비)Absolutely: protein (weight ratio) 1 : 11: 1 1 : 0.11: 0.1 1 : 0.011: 0.01 1 : 0011: 001
Anti-HER2 압타머 함량Anti-HER2 aptamer content 7.06 pmole7.06 pmole 7.06 pmole7.06 pmole 7.06 pmole7.06 pmole 7.06 pmole7.06 pmole
ECD HER2 단백질(IV) 함량ECD HER2 protein (IV) content 7.06 pmole7.06 pmole 7.06X10-1 pmole7.06X10 -1 pmole 7.06X10-2 pmole7.06X10 -2 pmole 7.06X10-3 pmole7.06X10 -3 pmole
상기 도 32 내지 도 35를 참고하면, 에탄올과 증류수를 이용하여 워싱(Washing)하기 전에는, 870 cm-1 영역의 특성 라만 밴드의 신호의 세기가 ECD HER2 단백질(IV)의 농도에 따라 줄어드는 것을 알 수 있다. 이로써, 상기 기판은 피검사체의 정량적 분석이 가능한 센서로 사용할 수 있음을 알 수 있다.Referring to FIGS. 32 to 35, before washing with ethanol and distilled water, it was found that the signal intensity of the characteristic Raman band in the 870 cm -1 region decreases according to the concentration of ECD HER2 protein (IV). Can be. Thus, it can be seen that the substrate can be used as a sensor capable of quantitative analysis of the subject.
[실험예 2-7][Experimental Example 2-7]
상기 실험예 2-3에서 제조된 기판을 이용하여, 알부민(Bovine serum albumin, BSA)의 검출을 시험하였고, 그 결과를 도 36 내지 도 40에 나타내었다.Using the substrate prepared in Experimental Example 2-3, detection of albumin (Bovine serum albumin, BSA) was tested, and the results are shown in FIGS. 36 to 40.
상기 도 36 내지 도 40에서 Anti-HER2 aptamer 7 pmole(Apt)는 기판에 Anti-HER2 압타머 7 pmole을 고정화한 경우이고, Anti-HER2 aptamer / dual solvent treated(Apt/solvent)는 기판에 Anti-HER2 압타머 7 pmole을 고정화 이후에 100% 에탄올 및 증류수의 2 가지 종류의 용매(dual solvent)로 처리를 한 경우이고, BSA 7 pmole(BSA)는 BSA를 2 μL 도포 후 5 분 동안 건조하여 7 pmole의 BSA를 고정화한 경우이고, BSA / dual solvent treated(BSA/solvent)는 기판에 7 pmole의 BSA를 고정화 이후에 100% 에탄올 및 증류수의 2 가지 종류의 용매(dual solvent)로 처리를 한 경우이고, Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole(Apt+BSA)은 Anti-HER2 압타머 7 pmole과 BSA 7 pmole을 고정화한 경우이고, Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole / dual solvent treated(Apt+BSA/solvent)는 Anti-HER2 압타머 7 pmole과 BSA 7 pmole을 고정화 이후에 100% 에탄올 및 증류수의 2 가지 종류의 용매(dual solvent)로 처리를 한 경우이다. In FIGS. 36 to 40, Anti-HER2 aptamer 7 pmole (Apt) is a case in which Anti-HER2 aptamer 7 pmole is immobilized on a substrate, and Anti-HER2 aptamer / dual solvent treated (Apt / solvent) is Anti- on a substrate. After immobilization of HER2 aptamer 7 pmole with 100% ethanol and distilled water in two types of solvents (dual solvent), BSA 7 pmole (BSA) is coated with 2 μL of BSA, dried for 5 minutes, and then 7 This is when the BSA of pmole is immobilized, and the BSA / dual solvent treated (BSA / solvent) is treated with two types of solvents (100% ethanol and distilled water) after immobilization of 7 pmole BSA on the substrate. , Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole (Apt + BSA) is the case of immobilizing Anti-HER2 aptamer 7 pmole and BSA 7 pmole, Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole / dual solvent treated ( Apt + BSA / solvent) are two types of solvent (du) of 100% ethanol and distilled water after immobilization of the anti-HER2 aptamer 7 pmole and BSA 7 pmole (du al solvent).
상기 도 32 내지 도 35에서, ECD HER2 Protein은 ECD HER2 단백질만을 적용한 경우이고, 샘플 A, B, C, D는 각각 상기 압타머와 상기 단백질의 중량비를 하기 표 3에서와 같이 변화시킨 경우이다.32 to 35, ECD HER2 Protein is a case where only ECD HER2 protein is applied, and Samples A, B, C, and D are cases where the weight ratios of the aptamer and the protein are changed as shown in Table 3 below.
이 중 상기 도 37, 도 38 및 도 40은 Anti-HER2 aptamer / dual solvent treated(Apt/solvent), Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole(Apt+BSA) 및 Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole / dual solvent treated(Apt+BSA/solvent)에 대한 결과만을 나타낸 결과이다.Of these, FIGS. 37, 38 and 40 are Anti-HER2 aptamer / dual solvent treated (Apt / solvent), Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole (Apt + BSA) and Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole / dual solvent treated (Apt + BSA / solvent).
또한, 상기 도 39 및 도 40은 각각 상기 도 36 및 도 37의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 고안하여 가시적으로 표현한 결과이다.In addition, FIGS. 39 and 40 are results obtained by visually designing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIGS. 36 and 37 using a heat mapping method.
상기 도 36 내지 도 40을 참고하면, 압타머가 없는 기판에 BSA를 2 μL 도포 후 5 분 동안 건조한 후 라만 분광 측정하면, 고분자량의 단백질 시료인 BSA는 첨형 형태의 특성 밴드는 관찰하기 어려운 형태의 그래프이나 다른 단백질들과 구분할 수 있는 특성 밴드를 가진다(도 36의 파란색 선). 이 후 100 % 에탄올 처리와 증류수 세척 후 BSA의 고유의 피크(peak)인 1004 cm-1가 확연히 관찰되었다. 피분석물인 BSA가 워싱(washing) 과정 상에서 기판의 은 나노 구조체 사이로 임베딩(embedding)되는 결과도 확인하였다. Referring to FIGS. 36 to 40, after applying 2 μL of BSA to an aptamer-free substrate and drying for 5 minutes, Raman spectroscopy measures, BSA, a high-molecular weight protein sample, has a characteristic band that is difficult to observe. It has a characteristic band that can be distinguished from graphs or other proteins (blue line in FIG. 36). After this, after 100% ethanol treatment and distilled water washing, 1004 cm -1, which is an intrinsic peak of BSA, was clearly observed. It was also confirmed that the analyte BSA was embedded between the silver nanostructures of the substrate during the washing process.
또한, anti-HER2 압타머가 있는 기판 위에 BSA 도포시 850 cm-1 내지 950 cm-1 사이에서 BSA의 라만 밴드 관찰할 수 있었다. 에탄올, 증류수로 워싱(washing)하면 850 cm-1 내지 950 cm-1 영역의 BSA의 라만 밴드를 관찰할 수 없으며, 압타머 고유의 밴드만 관찰됨을 확인하였다. 즉, 압타머가 존재하는 기판에서 BSA는 증류수 세척 과정 상에서 씻겨 내려가는 것을 확인하였으며, 비표적 알부민 시료의 비선택성 검증 완료하였다.In addition, Raman band of BSA was observed between 850 cm -1 and 950 cm -1 when BSA was applied on a substrate with anti-HER2 aptamer. It was confirmed that when washing with ethanol and distilled water, the Raman band of the BSA in the 850 cm -1 to 950 cm -1 region could not be observed, and only the aptamer-specific band was observed. That is, it was confirmed that the BSA was washed down in the distilled water washing process on the substrate where the aptamer is present, and the non-selectivity of the non-target albumin sample was verified.
[제조예 3-1: 압타 센서의 제조][Production Example 3-1: Preparation of aptar sensor]
복수개의 마이크로그루브들이 일정 간격을 두고 실질적으로 평행하게 배열된 마이크로그루브 패턴(Microgroove pattern)이 형성된 PDMS(polydimethylsiloxane) 기판을 제조하기 위하여, 마이크로그루브 패턴이 있는 PTFE를 주형(mold)으로 상기 PTFE 표면에 액상 PDMS를 도포한 후 경화시켜 PTFE의 표면을 PDMS에 전사하였다. In order to manufacture a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate having a microgroove pattern (microgroove pattern) in which a plurality of microgrooves are arranged substantially parallel at regular intervals, PTFE with a microgroove pattern is molded onto the PTFE surface. After coating the liquid PDMS and curing, the surface of PTFE was transferred to the PDMS.
상기 마이크로그루브 패턴이 형성된 PDMS를 코르크 보어러(Cork borer)를 이용하여 지름 10 mm 가량의 원형으로 잘랐다.The PDMS on which the microgroove pattern was formed was cut into a circle having a diameter of about 10 mm using a cork borer.
상기 기판을 30 % (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane, APTES)에 밤새(overnight) 담근 뒤 100 % 에탄올, 탈이온수(DI water)로 세척(washing)하고, 추가적인 가열 공정으로 수분을 제거하였다.The substrate was immersed in 30% (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) overnight, and then washed with 100% ethanol and DI water, and additionally Water was removed by a heating process.
한편, 도파민 염산염(Dopamine hydrochloride, CTAB)을 이용하여 금 나노 로드(Gold nanorods, GNRs) 표면에 도파민을 코팅시켰다. 상기 도파민 염산염으로 코팅 된 GNR 을 2 ml의 고순도 탈이온수에 재현탁시킨 후 추가적으로 원심분리 및 상청액 제거를 수행하여 결합되지 않은 도파민을 제거하였다. 상기 도파민이 코팅된 금 나노 로드 현탄액을 20 μL APTES를 이용하여 표면이 아민화된 PDMS 기판 위에 드랍 코팅 방식을 이용하여 고정화시켰다.Meanwhile, dopamine was coated on the surface of gold nanorods (GNRs) using dopamine hydrochloride (CTAB). After the GNR coated with the dopamine hydrochloride was resuspended in 2 ml of high-purity deionized water, centrifugation and supernatant removal were additionally performed to remove unbound dopamine. The dopamine-coated gold nanorod suspension was immobilized using a drop coating method on a PDMS substrate whose surface was aminated using 20 μL APTES.
상기 도파민이 코팅된 금 나노 로드에 티올화된 Anti-HER2 압타머(Thiolated Anti-HER2 aptmer)를 도포하고, 도파민 내 관능기에 마이클 첨가 반응(Michael addition)을 이용하여 Anti-HER2 압타머(70 pmole)를 고정화시켰다.Anti-HER2 aptamer (70 pmole) was applied to the dopamine-coated gold nano-rod by applying a thiolated anti-HER2 aptmer, and using Michael addition to functional groups in dopamine. ) Was immobilized.
2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol, beta Mercapto ethanol, BME)를 이용하여 상기 도파민 내 잔여 마이클 첨가 반응이 가능한 관능기를 종결(termination)시켜 금속 나노 구조체를 제조하였다.A metal nanostructure was prepared by terminating a functional group capable of the residual Michael addition reaction in the dopamine using 2-Mercaptoethanol (2-Mercaptoethanol, beta Mercapto ethanol, BME).
[실험예 3-1: 기판의 마이크로그루브 패턴 형상 분석][Experimental Example 3-1: Microgroove pattern shape analysis of substrate]
상기 실시예 3-1에서 사용된 PTFE 주형의 마이크로그루브 패턴의 형상을 분석하였고, 그 결과를 각각 도 42 내지 도 44에 나타내었다.The shape of the microgroove pattern of the PTFE mold used in Example 3-1 was analyzed, and the results are shown in FIGS. 42 to 44, respectively.
도 42는 상기 PTFE 표면이 전사된 폴리머 기판 표면의 광학 현미경 이미지(Optical microscopic image)이고, 도 43은 상기 PTFE 표면의 3 차원 OP(Optical Profiler) 이미지(3-dimensional OP image)이고, 도 44는 상기 도 43의 a 라인에 따른 표면 거칠기의 OP 스캔 프로파일(OP scanned profiles)을 나타내는 그래프이다.42 is an optical microscopic image of the surface of the polymer substrate on which the PTFE surface has been transferred, FIG. 43 is a 3-dimensional OP image of the PTFE surface, and FIG. 44 is It is a graph showing the OP scan profiles of the surface roughness along the line a in FIG. 43.
상기 도 42 내지 도 44를 참고하면, 상기 PTFE의 표면에 채널 형태의 단일 방향 마이크로그루브들이 형성된 것을 알 수 있고, 깊은 홈과 얕은 홈 사이의 거리는 각각 약 150 ㎛와, 20 ㎛ 내지 30 ㎛라는 것을 알 수 있다. Referring to FIGS. 42 to 44, it can be seen that unidirectional microgrooves in the form of channels are formed on the surface of the PTFE, and the distance between the deep groove and the shallow groove is about 150 μm and 20 μm to 30 μm, respectively. Able to know.
또한, 상기 실시예 3-1에서 제조된 기판의 마이크로그루브 패턴의 형상을 분석하였고, 그 결과를 도 45 및 도 46에 나타내었다.In addition, the shape of the microgroove pattern of the substrate prepared in Example 3-1 was analyzed, and the results are shown in FIGS. 45 and 46.
상기 도 45의 (가)는 상기 기판의 마이크로그루브 패턴의 형상을 나타내는 이미지이고, 상기 도 45의 (나)는 상기 기판의 마이크로그루브 패턴의 3 차원 OP(Optical Profiler) 이미지이고, 상기 도 46은 상기 기판의 마이크로그루브 패턴의 형상을 3 차원 OP로 분석한 라인 스캔(line scan) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.45A is an image showing the shape of the microgroove pattern of the substrate, and FIG. 45B is a 3D optical profiler (OP) image of the microgroove pattern of the substrate, and FIG. 46 is It is a graph showing the result of a line scan analysis in which the shape of the microgroove pattern of the substrate is analyzed with a 3D OP.
상기 도 45 및 도 46을 참고하면, 상기 PTFE 내의 거의 규칙적으로 이격된 마이크로그루브들은 상기 폴리머 기판 표면으로 옮겨졌음을 확인할 수 있다. Referring to FIGS. 45 and 46, it can be confirmed that the almost regularly spaced microgrooves in the PTFE were transferred to the surface of the polymer substrate.
[실험예 3-2: 금 나노 구조체의 물성 측정][Experimental Example 3-2: Measurement of physical properties of gold nanostructure]
상기 제조예 3-1에서 제조된 금 나노 구조체(GNR)를 주사 투과 전자 현미경(STEM, scanning transmission electron microscope) 및 주사 전자 현미경(SEM, scanning electron microscope)로 관찰하였고, 그 결과를 도 47에 나타내었다.The gold nanostructure (GNR) prepared in Preparation Example 3-1 was observed with a scanning transmission electron microscope (STEM) and a scanning electron microscope (SEM), and the results are shown in FIG. 47. Did.
상기 도 47의 (가)는 CGNR의 STEM 명시야 및 암시야로 측정한 결과이고, 도 47의 (나)는 CGNR의 SEM으로 측정한 결과이고, 도 47의 (다)는 DGNR의 STEM 명시야 및 암시야로 측정한 결과이고, 도 47의 (라)는 DGNR의 SEM으로 측정한 결과이다. 상기 도 47에서, 상기 "DGNR"은 상기 제조예 3-1에서 제조된 도파민으로 코팅된 금 나노 로드를 나타내고, 상기 "CGNR"은 CTAB(hexadecyltrimethylammonium)로 코팅된 금 나노 로드를 나타낸다.(A) of FIG. 47 is a result measured by STEM brightfield and darkfield of CGNR, FIG. 47 (B) is a result of measurement by SEM of CGNR, and FIG. 47 (C) is a STEM brightfield of DGNR and It is a result measured by dark field, and Fig. 47 (d) is a result measured by SEM of DGNR. In FIG. 47, the “DGNR” represents a gold nanorod coated with dopamine prepared in Preparation Example 3-1, and the “CGNR” represents a gold nanorod coated with hexadecyltrimethylammonium (CTAB).
상기 금 나노 로드 형성 시 나노 로드에 형태 안정성을 주기 위해 가장 중요한 물질이 상기 CTAB(hexadecyltrimethylammonium) 계면활성제이나 상기 계면활성제 자체로는 다른 재료와 결합할 수 있는 리간드(ligand)가 없다.When forming the gold nanorods, the most important material for giving shape stability to the nanorods is the hexadecyltrimethylammonium (CTAB) surfactant, or the surfactant itself does not have a ligand capable of binding to other materials.
상기 도 47을 참고하면, 상기 CTAB을 도파민 코팅으로 바꾼 DGNR의 경우 STEM 모드 중 명시야(brightfield image) 관측시 DGNR 주변에 10 nm 정도 두께의 도파민이 코팅된 이미지가 관찰되었다. 반면, CGNR의 경우 명시야 이미지에서 도파민 코팅이 관찰되지 않았다.Referring to FIG. 47, in the case of DGNR in which the CTAB was replaced with dopamine coating, when a brightfield image was observed during STEM mode, an image coated with dopamine having a thickness of about 10 nm was observed around DGNR. On the other hand, in the case of CGNR, dopamine coating was not observed in the bright field image.
또한, 암시야 관찰은 물질의 조성에 대한 정보를 반영하는데, 상기 CGNR과 DGNR이 별다른 차이가 없는 것으로 보아 금 나노 로드가 도파민으로 코팅되는 것에 의해 물성이 변하지 않았으며, 금 나노 로드의 모양을 변화시키지 않았음을 확인하였다.In addition, the dark field observation reflects information on the composition of the material, and since the CGNR and DGNR do not differ, the physical properties of the gold nanorods are coated with dopamine and the shape of the gold nanorods is changed. It was confirmed that it was not.
또한, 상기 SEM은 도체만 이미징이 잘 되는데, 상기 CGNR의 경우 뚜렷한 금 나노 로드의 이미지가 관찰되는 반면, 상기 DGNR의 경우 비전도성 도파민 코팅에 의해 차징(charging)이 일어나서 불분명한 이미지가 관찰됨을 확인하였다.In addition, the SEM is well imaged only the conductor, in the case of the CGNR, a clear image of the gold nanorod is observed, while in the case of the DGNR, it is confirmed that an unclear image is observed due to charging by non-conductive dopamine coating. Did.
또한, 상기 제조예 3-1에서 제조된 금 나노 구조체의 물성을 측정하였고, 그 결과를 도 48 내지 도 52에 나타내었다. In addition, the physical properties of the gold nanostructures prepared in Preparation Example 3-1 were measured, and the results are shown in FIGS. 48 to 52.
상기 도 48은 상기 CGNR과 DGNR의 흡광 결과를 나타내는 그래프이다.48 is a graph showing the absorption results of the CGNR and DGNR.
상기 도 48을 참고하면, 상기 CGNR과 DGNR 흡광 결과 관측시 장축에 해당하는 800 nm 영역대의 그래프가 약 36 nm 정도 블루-시프트(blue-shift)되었으며, 이를 통해 도파민이 코팅되었음을 확인할 수 있다.Referring to FIG. 48, when observing the CGNR and DGNR absorption results, a graph of an 800 nm region corresponding to the long axis was blue-shifted by about 36 nm, and it can be confirmed that dopamine was coated.
상기 도 49는 상기 CGNR과 DGNR의 DLS(Dynamic light scattering) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.49 is a graph showing the results of dynamic light scattering (DLS) analysis of the CGNR and DGNR.
상기 도 49를 참고하면, 상기 DLS 관측시 콜로이드 크기(colloid size)가 DGNR이 증가하였음을 알 수 있다. 이것 역시 도파민 코팅에 기인한 결과이다.Referring to FIG. 49, it can be seen that when the DLS was observed, the colloid size increased DGNR. This is also a result of the dopamine coating.
상기 도 50은 상기 CGNR과 DGNR의 FT-IR(Fourier transform) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.50 is a graph showing the results of FT-IR (Fourier transform) analysis of the CGNR and DGNR.
상기 도 50을 참고하면, 상기 CGNR과 DGNR을 각각 동결 건조를 하여 파우더 형태로 만든 뒤 FT-IR(Fourier transform) 분광을 관찰한 결과, 상기 CGNR은 CTAB의 밴드(band)만 관찰되었으며, 상기 DGNR은 도파민 밴드가 관찰되었다.Referring to FIG. 50, the CGNR and DGNR were freeze-dried to form a powder, and then FT-IR (Fourier transform) spectroscopy was observed. As a result, only the band of CTAB was observed, and the DGNR was observed. A silver dopamine band was observed.
상기 도 51과 도 52는 각각 상기 CGNR과 DGNR의 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy) 분석 결과를 나타내는 그래프이다.51 and 52 are graphs showing the results of XPS (X-ray photoelectron spectroscopy) analysis of the CGNR and DGNR, respectively.
상기 도 51 및 도 52를 참고하면, 표면의 질소 결합의 작용기 비율로부터 표면내 화학 결합을 알 수 있다. 상기 CGNR의 경우 대부분 CTAB에 기인한 -NH4+- 결합이 관찰되며, 상기 DGNR의 경우 금 나노 로드 표면에 도파민 염산염이 산화되어 인돌 구조로 변하여 -NH- 작용기가 25 % 정도로 증가한 것을 알 수 있다.Referring to FIGS. 51 and 52, the chemical bond in the surface can be seen from the functional group ratio of the nitrogen bond on the surface. In the case of the CGNR, mostly -NH4 + -binding due to CTAB is observed, and in the case of the DGNR, the dopamine hydrochloride is oxidized on the surface of the gold nanorod to turn into an indole structure, and it can be seen that the -NH- functional group increased by about 25%.
[실험예 3-3: 기판의 코팅성 측정][Experimental Example 3-3: Measurement of coating properties of substrate]
상기 제조예 3-1에서 제조된 마이크로그루브 패턴이 형성된 PDMS("P"(Patterned substrate)로 표시됨)와 마이크로그루브 패턴이 형성되지 않은 평평한 PDMS("B"(bare substrate)로 표시됨)에 각각 CGNR, DGNR을 드롭 코팅(drop coating) 방식으로 고정화한 후, 코팅성을 육안으로 확인하였고, 그 결과를 도 53에 나타내었다.The PDMS (represented as "P" (represented as a patterned substrate)) formed with the microgroove pattern prepared in Preparation Example 3-1 and the flat PDMS (represented as "B" (bare substrate)) without a microgroove pattern were respectively CGNR. , After fixing the DGNR by a drop coating method, the coating properties were visually confirmed, and the results are shown in FIG. 53.
상기 도 53을 참고하면, 상기 B에 CGNR이 코팅된 경우 코팅 바깥 테두리에 금박이 관찰되는데 이는 건조된 콜로이드(drying colloid)의 커피 링 효과(coffee ring effect)에 의하여 테두리 쪽으로 콜로이드가 쏠린 현상이다.Referring to FIG. 53, when CGNR is coated on B, gold foil is observed on the outer edge of the coating, which is a phenomenon in which colloids are focused toward the edge by a coffee ring effect of a drying colloid.
상기 P에 CGNR 코팅시 B에 코팅된 경우보다 커피 링 효과가 줄어들었으며 코팅 면적도 더 넓어졌다. 이는 마이크로그루브 패턴에 의해 콜로이드 모션(colloid motion)이 조절되어 커피 링 효과가 억제되었음을 보여주는 결과이다.When the CGNR coating was applied to the P, the coffee ring effect was reduced and the coating area was also wider than that of the B coating. This is a result showing that the colloidal motion was controlled by the microgroove pattern to suppress the coffee ring effect.
상기 DGNR의 경우 상기 B, P에 코팅시 커피 링 효과가 관찰되지 않았으며 매우 균일하게 같은 금 나노 로드 현탁액(suspension) 색깔로 코팅이 되었음을 확인할 수 있다. 이는 도파민의 접착 특성(adhesive property)에 의해 기판에 화학적으로 공유 결합을 이루어 용매 증발 시 콜로이드 모션이 조절되어 균일하게 코팅된 결과이다.In the case of the DGNR, it was confirmed that the coffee ring effect was not observed when coated on the B and P, and that the coating was performed with the same gold nanorod suspension color. This is a result of chemically covalent bonding to the substrate due to the adhesive property of dopamine, thereby uniformly coating the colloidal motion when the solvent is evaporated.
이후 탈이온수(DI water)를 이용하여 세게 흔들어서 세척을 진행한 뒤 기판 표면의 금 나노 로드 코팅층을 관측하였는데, 상기 CGNR 코팅들의 경우 금박의 박리가 일어나며 매우 불균일한 코팅을 이루었음을 육안으로도 관측이 가능하였다. 반면, 상기 DGNR 코팅의 경우 매우 안정한 코팅층을 유지함을 확인하였다.After washing with strong deionized water (DI water), the gold nano-rod coating layer on the substrate surface was observed, and the CGNR coatings were peeled off of the gold foil and visually observed that a very non-uniform coating was formed. This was possible. On the other hand, it was confirmed that the DGNR coating maintains a very stable coating layer.
또한, 상기 CGNR/B, CGNR/P, DGNR/B 및 DGNR/P 각각에 대하여 흡광계수(Extinction coefficient) 및 파장(Wavelength)을 측정하였고, 그 결과를 도 54에 나타내었다. In addition, extinction coefficient and wavelength were measured for each of the CGNR / B, CGNR / P, DGNR / B and DGNR / P, and the results are shown in FIG. 54.
상기 도 54를 참고하면, 상기 CGNR/B의 경우 금 나노 로드의 LSPR 흡광 그래프와 모양이 다르며 1 차원적인 선형 그래프만 관찰되는 것으로 보아, 상기 금 나노 로드가 매우 응집(aggregation)되었음을 확인하였다.Referring to FIG. 54, it was confirmed that the CGNR / B was different from the LSPR absorbance graph of gold nanorods and that only a one-dimensional linear graph was observed, so that the gold nanorods were very aggregated.
상기 CGNR/P의 경우 금 나노 로드의 LSPR 흡광 그래프와 같이 2 개의 봉우리가 있는 그래프 개형으로 변하였으며, 이는 마이크로그루브 패턴에 의해 금 나노 로드 코팅시 금 나노 로드의 콜로이드 모션(colloidal motion)이 억제되었음을 확인하였다.In the case of the CGNR / P, it was changed to a graph shape with two peaks, such as the LSPR absorbance graph of gold nanorods, which was suppressed by the colloidal motion of gold nanorods when gold nanorods were coated by the microgroove pattern. Confirmed.
상기 DGNR/B의 경우 금 나노 로드의 흡광 그래프와 유사해졌으며, 상기DGNR/P의 경우 표준 편차가 더 작으며, 분해능(400 nm 내지 1100 nm) 이내로 장축, 단축에 해당하는 흡광 피크(peak)가 존재하므로 상기 DGNR/P가 센서로써 의미가 있음을 알 수 있다.In the case of the DGNR / B, it became similar to the absorption graph of the gold nanorod, and in the case of the DGNR / P, the standard deviation was smaller, and the absorption peak corresponding to the long axis and short axis was within the resolution (400 nm to 1100 nm). Since it exists, it can be seen that the DGNR / P is meaningful as a sensor.
또한, DGNR 농축액(stock solution)의 농도를 1X로 하여 ½씩 희석을 진행하여 상기 기판에 코팅을 하였고, 이들 각각에 대하여 흡광계수(Extinction coefficient) 및 파장(Wavelength)을 측정하였고, 그 결과를 도 55 및 도 56에 나타내었다.In addition, the concentration of the DGNR stock solution was diluted to ½ with 1X, and the substrate was coated, and the extinction coefficient and wavelength were measured for each of them. 55 and 56.
상기 도 55를 참고하면, 상기 DGNR 코팅액의 농도에 따라 DGNR의 LSPR 그래프 개형이 바뀌는 것을 알 수 있다.Referring to FIG. 55, it can be seen that the LSPR graph reformation of DGNR changes according to the concentration of the DGNR coating solution.
즉, DGNR의 농도가 희석될 수록 단축(520 nm) 영역의 밴드의 강도(intensity)가 커지며 단축, 장축 간의 거리가 멀어지게 되는데, 이는 LSPR 분광 분해능을 초과하게 되므로 센서로써 의미를 상실하게 됨을 의미한다.That is, as the concentration of DGNR is diluted, the intensity of the band in the short axis (520 nm) region increases, and the distance between the short axis and the long axis increases, which means that the LSPR spectral resolution is exceeded, meaning that the meaning is lost. do.
단축에 해당하는 강도(Transverse-LSPR; T-LSPR)와 장축에 해당하는 강도(Longitudinal-LSPR; L-LSPR)의 비율 I(L-LSPR)/I(T-LSPR)을 센서 선택의 기준 항목으로 삼았다.The ratio I (L-LSPR) / I (T-LSPR) of the ratio of the intensity corresponding to the short axis (transverse-LSPR; T-LSPR) and the intensity corresponding to the long axis (Longitudinal-LSPR; L-LSPR) is the standard item for sensor selection As
상기 DGNR 현탁액의 흡광 결과(도 48)에서는 3.3이었는데, 이 수치와 가까울수록 기판에서 상기 DGNR이 현탁액처럼 분산 상태가 좋을 것이라 예상하여, 상기 DGNR 0.5X를 센서로 사용하였다.The absorption result of the DGNR suspension (FIG. 48) was 3.3, and the closer to this value, the DGNR 0.5X was used as a sensor in anticipation that the dispersion of the DGNR on the substrate would be better like a suspension.
[실험예 3-4: LSPR 분광 결과][Experimental Example 3-4: LSPR spectral results]
상기 실험예 3-3에서 DGNR 농축액(stock solution)의 농도가 0.5X인 경우에 대하여, Anti-HER2 압타머의 고정화 농도를 변화시키면서 국소표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance; LSPR) 분광을 측정한 결과를 도 57에 나타내었다.For the case where the concentration of the DGNR stock solution in Experimental Example 3-3 was 0.5X, localized surface plasmon resonance (LSPR) spectroscopy was measured while changing the immobilization concentration of the Anti-HER2 aptamer. The results are shown in Figure 57.
상기 도 57을 참고하면, 170 μM 농도의 Anti-HER2 압타머를 압타머 현탁액의 전체 부피가 30 μL가 되게끔 고정화하였을 때, Anti-HER2 압타머의 고정화 농도가 진해질수록 L-LSPR 피크(peak)가 블루 시프트(blue-shifting)되는 것을 확인하였다. 또한, 농도에 따른 블루 시프트 정도의 경향성 확인시 Anti-HER2 압타머의 최고 농도에서 포화(saturation)됨을 알 수 있다.Referring to FIG. 57, when the anti-HER2 aptamer at a concentration of 170 μM was immobilized such that the total volume of the aptamer suspension was 30 μL, as the immobilization concentration of the anti-HER2 aptamer increased, the L-LSPR peak ( It was confirmed that the peak) was blue-shifted. In addition, when checking the tendency of the degree of blue shift according to the concentration, it can be seen that it is saturated at the highest concentration of the Anti-HER2 aptamer.
또한, 상기 마이크로그루브 패턴을 포함하는 기판에 DGNR만 고정화한 경우(PLaS), 상기 마이크로그루브 패턴을 포함하는 기판에 Anti-HER2 압타머를 결합시킨 DGNR을 고정한 경우(+ HER2 aptamer), 및 DGNR 표면에 있는 도파민의 마이클 첨가 반응 사이트(Michael addition site)를 2-머캅토에탄올을 이용하여 종결(termination)시킨 경우(+ Mercapto EtOH termination) 각각에 대하여, 국소표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance; LSPR) 분광, 및 라만(Raman) 분광을 측정하였고, 그 결과를 도 58에 나타내었다.In addition, when only DGNR is immobilized on the substrate containing the microgroove pattern (PLaS), when DGNR is combined with Anti-HER2 aptamer on the substrate containing the microgroove pattern (+ HER2 aptamer), and the DGNR surface For each of the Michael addition sites of dopamine in termination with 2-mercaptoethanol (+ Mercapto EtOH termination), localized surface plasmon resonance (LSPR) The spectroscopy and Raman spectroscopy were measured, and the results are shown in FIG. 58.
상기 도 58의 (가)를 참고하면, 상기 DGNR 표면에 있는 도파민의 마이클 첨가 반응 사이트(Michael addition site)를 2-머캅토에탄올을 이용하여 종결(termination)시키면 L-LSPR이 다시 이동함을 알 수 있다.Referring to (a) of FIG. 58, it was found that L-LSPR moves again when termination of the Michael addition site of dopamine on the DGNR surface with 2-mercaptoethanol is performed. Can be.
또한, 상기 도 58의 (나)를 통하여, 해당 3 가지 물질들(PLaS, PLaS + HER2 aptamer, PLaS + Mercapto EtOH termination)이 상기 기판 표면에 고정화되었는지를 라만(Raman) 분광을 이용하여 검증하였고, 그 결과 모두 상기 기판 표면에 잘 고정화되었음을 확인하였다.In addition, through (b) of FIG. 58, it was verified using Raman spectroscopy whether the three materials (PLaS, PLaS + HER2 aptamer, PLaS + Mercapto EtOH termination) were immobilized on the substrate surface, As a result, it was confirmed that all were well immobilized on the substrate surface.
[실험예 3-5: 표적 분자 검지 능력 평가][Experimental Example 3-5: Target molecule detection ability evaluation]
ECD-HER2 단백질을 각 농도별로 PBS(Phosphate buffered saline)에 분주한 뒤 실시간(real-time)으로 L-LSPR의 이동을 관찰하였고, 그 결과를 도 59에 나타내었다.After the ECD-HER2 protein was dispensed into PBS (Phosphate buffered saline) for each concentration, the movement of L-LSPR was observed in real-time, and the results are shown in FIG. 59.
상기 도 59의 (가)를 참고하면, 비선택적 단백질인 알부민(bovine serum albumin, BSA)의 경우 L-LSPR 이동이 일어나지 않음을 확인할 수 있다.Referring to (a) of FIG. 59, it can be confirmed that L-LSPR migration does not occur in the case of the non-selective protein albumin (bovine serum albumin, BSA).
반면, ECD-HER2 단백질이 있는 경우에는 ECD-HER2 단백질이 Anti-HER2 압타머와 결합하여 시간 경과시 농도에 따라 L-LSPR이 이동하였으며 포화 상태에 도달하였다.On the other hand, in the case of the ECD-HER2 protein, the ECD-HER2 protein was combined with the Anti-HER2 aptamer, and the L-LSPR migrated according to the concentration over time and reached a saturated state.
상기 도 59의 (나)는 유체 역학 모델 중 다니엘 벤-아브라함(Daniel Ben-Avraham)이 정립한 정지한 유체(statistic fluid)에서의 응고 모델(coagulation model)의 일반해(general solution) 결과이며, 이는 리얼 타임 바인딩 키네틱(Real time binding kinetic) 실험의 L-LSPR과 같은 결과이다.59 (B) is a result of a general solution of a coagulation model in a static fluid established by Daniel Ben-Avraham among fluid dynamics models, This is the same result as the L-LSPR of the real time binding kinetic experiment.
상기 도 59의 (나)를 참고하면, ECD-HER2 단백질의 선택성이 우수하며, 검지 한계(limit of detection, LOD)는 4 ng/mL 내지 5 ng/mL임을 알 수 있다. 이는 임상 검출 농도가 15 ng/mL 임을 감안하면 충분히 임상에서 사용 가능한 센서임을 나타낸다.59 (B), it can be seen that the selectivity of the ECD-HER2 protein is excellent, and the limit of detection (LOD) is 4 ng / mL to 5 ng / mL. This indicates that the sensor is sufficiently clinically available considering that the clinical detection concentration is 15 ng / mL.
또한, 임상에서 사용 가능한 센서로써 의미가 있는지를 확인하기 위하여, 실제 혈액과 같은 성분의 혈장에서도 검지가 가능한지 여부를 확인하는 실험을 진행하였고, 그 결과를 도 60에 나타내었다. In addition, in order to confirm whether it is meaningful as a sensor usable in clinical practice, an experiment was conducted to determine whether detection is possible in plasma of a component such as actual blood, and the results are shown in FIG. 60.
이때, 쥐(Rat)에서 혈액을 뽑아 적혈구를 응고시킨 뒤 혈장을 얻어서 ECD HER2 단백질 농도를 맞추어 실험을 진행하였다. 또한, 보통의 압타머는 혈액 내 존재하는 효소들에 의해 변형이 쉽게 일어나기 때문에, 이 실험에서 사용한 압타머는 혈액 내 존재하는 효소들에 의한 변형에 저항성이 있도록 압타머의 염기서열 중 피리미딘 구조를 변형시킨 변형 핵산 압타머를 사용하였다.At this time, blood was drawn from rats (Rat), the red blood cells were coagulated, and plasma was obtained to adjust the ECD HER2 protein concentration to perform the experiment. In addition, since normal aptamers are easily modified by enzymes present in the blood, the aptamers used in this experiment modify the pyrimidine structure in the base sequence of aptamers so that they are resistant to modification by enzymes present in the blood. The modified nucleic acid aptamer was used.
도 60을 참고하면, ECD HER2 단백질을 포함하는 세럼(serum)의 경우(30 ng/mL), 혈액 내에는 무수한 단백질이 많아서 초반 30 분까지는 L-LSPR 피크의 이동이 매우 불안정하게 움직이나 60 분 이후 압타머와 단백질 결합이 이루어져 포화 상태에 이루었다.Referring to FIG. 60, in the case of a serum containing ECD HER2 protein (30 ng / mL), there are many innumerable proteins in the blood, so the movement of the L-LSPR peak is very unstable until the first 30 minutes, but 60 minutes Afterwards, the aptamer and protein were bound to saturate.
반면, ECD HER2 단백질이 없는 세럼(serum)의 경우(0 ng/mL), 표준 편차가 2 nm 정도에서 진동(oscillation)하였으며 변화가 없었다.On the other hand, in the case of a serum without ECD HER2 protein (0 ng / mL), the standard deviation oscillation was about 2 nm and there was no change.
이상에서 본 명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.Although the embodiments of the present invention have been described in detail above, the scope of the present invention is not limited thereto, and it is possible in the art that various modifications and variations are possible without departing from the technical spirit of the present invention as set forth in the claims. It will be obvious to those with ordinary knowledge of
[도면 부호의 설명][Description of Drawing Codes]
110: 다공성 증착막110: porous deposition film
111: 증착용 기판111: substrate for deposition
112: 나노 구조체들112: nanostructures
120: 인버스 다공성 증착막120: inverse porous deposition film
121: 기판121: substrate
122: 나노 구조체들122: nano structures
210: 라만 분광 기판210: Raman spectroscopic substrate
211: 기판211: substrate
212: 나노 구조체들212: Nano structures
213: 리셉터 분자213: receptor molecule
221: 시료221: sample
222: 라만 분광기222: Raman spectrometer
223: 빛223: light
2120: 증착용 기판2120: substrate for deposition
2700: 나노 구조체들2700: nanostructures
320: 금속 나노 구조체320: metal nano structure
321: 금속 나노 입자321: metal nanoparticles
322: 코팅층322: coating layer
323: 압타머323: aptamer
324: 캡핑제324: capping agent
본 발명은 표면증강 라만 분광법에 사용되는 인버스 다공성 증착막, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 표면증강 라만 분광기판에 관한 것으로서, 상기 인버스 다공성 증착막은 전사를 통하여 다공성 증착막의 표면 거칠기를 효율적으로 제어함으로써, 표면증강 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 유기물, 이온, 암 진단 관련 표적 물질들을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있다.The present invention relates to an inverse porous deposition film used for surface-enhanced Raman spectroscopy, a method for manufacturing the same, and a surface-enhanced Raman spectroscopic substrate including the same, wherein the inverse porous deposition film efficiently controls the surface roughness of the porous deposition film through transfer, thereby It is possible to maximize the augmented Raman scattering signal, and accordingly, it is possible to more easily and easily detect target substances related to the diagnosis of organic matter, ions, and cancer by detecting the surface-enhanced Raman scattering signal.
또한, 본 발명은 라만 분광 기판, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것으로서, 상기 라만 분광 기판은 나노 입자가 나노 클러스터 입자로 형성된 후 3차원 나노포러스 구조로 증착되기 때문에 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 분석 대상물을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 3차원 나노포러스 구조의 증착막 표면에 리셉터 분자를 고정화하여 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있다.In addition, the present invention relates to a Raman spectroscopic substrate, a method for manufacturing the same, an analytical device and an analysis method comprising the same, wherein the Raman spectroscopic substrate is formed by nano-cluster particles and then deposited into a three-dimensional nanoporous structure, thereby causing Raman scattering. The signal can be maximized, and accordingly, the analyte can be more easily and conveniently detected by detecting the surface-enhanced Raman scattering signal, and the receptor molecule is immobilized on the surface of the 3D nanoporous structure to detect the analyte. Efficiency can be improved and the process can be simplified.
본 발명은 압타 센서에 관한 것으로서, 상기 압타 센서는 국소표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하여 생체 분자의 존재유무, 발현량 및 활성을 측정할 수 있고, 생체 분자의 측정을 이용하여 상기 생체 분자와 관련된 질병을 진단할 수 있다.The present invention relates to an Apta sensor, wherein the Apta sensor can measure the presence or absence, expression level, and activity of a biomolecule using a local surface plasmon resonance phenomenon, and a disease related to the biomolecule using a biomolecule measurement. Can diagnose.

Claims (22)

  1. 기판, 그리고Substrate, and
    상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하며,Located on the substrate, including nano-structures made of nano-cluster particles,
    상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 보다 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 더 좁은 것인 인버스 다공성 증착막.The gap between the nanostructures is an inverse porous deposition layer that is narrower in the lower portion contacting the substrate than in the upper portion not contacting the substrate.
  2. 제 1 항에 있어서,According to claim 1,
    상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 상기 기판과 접하고 있는 하부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상인 것인 인버스 다공성 증착막.The nanostructures are inverse porous vapor-deposited films that are branched into several branches in a downward direction in contact with the substrate from an upper portion not in contact with the substrate.
  3. 프로세스 챔버와 클러스터 소스를 구비한 스퍼터링 장치로 다공성 증착막을 제조하는 방법으로서,A method for manufacturing a porous deposition film with a sputtering device having a process chamber and a cluster source,
    (a) 상기 클러스터 소스 내에서 단일 원자의 기체 상태(vapor)를 형성한 후핵 형성(nucleation)을 실행하는 단계,(a) performing a nucleation after forming a vapor of a single atom in the cluster source,
    (b) 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation) 및 나노 클러스터 입자의 크기를 제어하는 단계,(b) controlling aggregation and size of nanocluster particles through condensation in the cluster source,
    (c) 상기 클러스터 소스에 마련된 노즐의 개구를 통해 상기 단계 (b)에서 성장된 나노 클러스터 입자를 프로세스 챔버로 배출하는 단계,(c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into a process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source,
    (d) 상기 프로세스 챔버 내에 인가되는 압력을 제어하여 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)를 실행하여 나노 구조체들을 성장시키는 단계, 그리고(d) controlling the pressure applied to the process chamber to perform coalescence of nanocluster particles on a deposition substrate to grow nanostructures, and
    상기 나노 구조체들을 전사용 기판에 전사시키되, 상기 나노 구조체들의 상부와 하부가 뒤집어 지도록 전사시키는 단계를 포함하며,Transferring the nanostructures to a substrate for transfer, including transferring the top and bottom of the nanostructures to be turned over,
    상기 (d) 단계에서 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 하는 것인 인버스 다공성 증착막의 제조 방법.In step (d), the initial pressure is controlled to be greater than the late pressure, so that the gap between the nanostructures becomes narrower at the top not contacting the deposition substrate than at the bottom contacting the deposition substrate. Method for manufacturing in-inverse porous deposition film.
  4. 제 3 항에 있어서,The method of claim 3,
    상기 (d) 단계에서의 초기 압력은 10 mTorr 내지 50 mTorr 이고, 후기 압력은 0.01 mTorr 내지 10 mTorr 인 것인 다공성 증착막의 제조 방법.The initial pressure in step (d) is 10 mTorr to 50 mTorr, and the late pressure is 0.01 mTorr to 10 mTorr.
  5. 제 3 항에 있어서,The method of claim 3,
    상기 전사시키는 단계는 The step of transferring
    상기 나노 구조체들의 상부에 경화 조성물을 도포한 후, 경화시켜 전사용 기판을 형성하는 단계, 및After applying a curing composition on top of the nanostructures, curing to form a transfer substrate, and
    상기 증착용 기판을 제거하는 단계Removing the substrate for deposition
    를 포함하는 것인 인버스 다공성 증착막의 제조 방법.Method of manufacturing an inverse porous deposition film comprising a.
  6. 제 3 항에 있어서,The method of claim 3,
    상기 경화 조성물은 천연 고무(Natural Rubber), 스티렌-부타디엔 고무(Styrene-Butadiene Rubber), 실리콘 고무(Silicon Rubber), 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethyl methacrylate) 및 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것인 인버스 다공성 증착막의 제조 방법.The curing composition includes natural rubber, styrene-butadiene rubber, silicone rubber, polyurethane, polymethyl methacrylate, and polydimethylsiloxane ) Is selected from the group consisting of inverse porous vapor deposition method.
  7. 제 1 항에 따른 인버스 다공성 증착막을 포함하는 표면증강 라만 분광기판.A surface-enhanced Raman spectroscopic substrate comprising the inverse porous deposition film according to claim 1.
  8. 기판, Board,
    상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하는 다공성 증착막, 그리고A porous deposition film located on the substrate and including nano-structures composed of nano-cluster particles, and
    상기 다공성 증착막 위에 위치하는 리셉터 분자를 포함하며,It includes a receptor molecule located on the porous deposition film,
    상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁은 것인 라만 분광 기판.The spacing between the nanostructures is a Raman spectroscopy substrate that is narrower at the top not contacting the substrate than at the bottom contacting the substrate.
  9. 제 8 항에 있어서,The method of claim 8,
    상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상인 것인 라만 분광 기판.The nanostructures are Raman spectroscopy substrates that are branched into several branches in a direction from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate.
  10. 제 8 항에 있어서,The method of claim 8,
    상기 리셉터 분자는 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기로 치환된 압타머이고,The receptor molecule is an aptamer substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups,
    상기 압타머는 상기 관능기에 의하여 상기 나노 구조체들에 부착되는 것인 라만 분광 기판.The aptamer is attached to the nanostructures by the functional group Raman spectroscopic substrate.
  11. 제 10 항에 있어서,The method of claim 10,
    상기 압타머는 HER2(Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2)에 특이적으로 결합하는 압타머인 것인 라만 분광 기판.The aptamer is a Raman spectroscopic substrate that is an aptamer specifically binding to HER2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2).
  12. 제 8 항에 있어서,The method of claim 8,
    상기 라만 분광 기판은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 더 포함하는 것인 라만 분광 기판.The Raman spectroscopy substrate further comprises any one solvent selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposition film, the nanostructures, and both. Raman spectroscopy substrate containing.
  13. 프로세스 챔버와 클러스터 소스를 구비한 스퍼터링 장치를 이용하여 기판 위에 다공성 증착막을 제조하는 하기 (a) 내지 (d) 단계로 이루어진 단계; 그리고(A) to (d) steps of manufacturing a porous deposition layer on a substrate using a sputtering apparatus having a process chamber and a cluster source; And
    (a) 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)을 실행하는 단계,(a) forming a plasma in the cluster source, and then performing nucleation,
    (b) 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation) 및 나노 클러스터 입자의 크기를 제어하는 단계,(b) controlling aggregation and size of nanocluster particles through condensation in the cluster source,
    (c) 상기 클러스터 소스에 마련된 노즐의 개구를 통해 상기 단계 (b)에서 성장된 나노 클러스터 입자를 프로세스 챔버로 배출하는 단계, 및(c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into a process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source, and
    (d) 상기 프로세스 챔버 내에 인가되는 압력을 제어하여 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)를 실행하여 나노 구조체들을 성장시키되, 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 상기 나노 구조체들을 성장시키는 단계,(d) The nanostructures are grown by controlling the pressure applied to the process chamber to perform coalescence of nanocluster particles on the substrate for deposition, but controlling the initial pressure to be greater than the late pressure to control the nanostructures. Growing the nanostructures so that the gap between them is narrower at an upper portion not contacting the deposition substrate than at a lower portion contacting the deposition substrate,
    상기 다공성 증착막 위에 리셉터 분자를 부착시키는 단계Attaching a receptor molecule on the porous deposition film
    를 포함하는 라만 분광 기판의 제조 방법.Method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate comprising a.
  14. 제 13 항에 있어서,The method of claim 13,
    상기 (d) 단계에서의 초기 압력은 10 mTorr 내지 50 mTorr이고, 후기 압력은 0.01 mTorr 내지 10 mTorr인 것인 라만 분광 기판의 제조 방법.The initial pressure in step (d) is 10 mTorr to 50 mTorr, and the late pressure is 0.01 mTorr to 10 mTorr.
  15. 제 13 항에 있어서,The method of claim 13,
    상기 라만 분광 기판의 제조 방법은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 처리하는 단계를 더 포함하는 것인 라만 분광 기판의 제조 방법.The method of manufacturing the Raman spectroscopic substrate is any one selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposited film, the nanostructures, and both. The method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate further comprising the step of treating a solvent.
  16. 제 8 항에 따른 라만 분광 기판,Raman spectroscopic substrate according to claim 8,
    상기 라만 분광 기판에 빛을 조사하는 광원, 그리고A light source irradiating light to the Raman spectroscopic substrate, and
    상기 라만 분광 기판으로부터 반사된 광의 라만 분광을 측정하는 라만 분광기Raman spectroscopy measuring Raman spectroscopy of light reflected from the Raman spectroscopy substrate
    를 포함하는 분석 장치.Analysis device comprising a.
  17. 제 8 항에 따른 라만 분광 기판을 분석 대상물을 포함하는 시료에 노출시켜, 상기 라만 분광 기판의 리셉터 분자와 상기 분석 대상물 간의 결합을 유도하는 단계, 그리고Inducing the binding between the Raman spectroscopic substrate according to claim 8 to a sample containing an analyte, the receptor molecule of the Raman spectroscopic substrate and the analyte, and
    라만 분광법을 이용하여 상기 분석 대상물을 검출 또는 확인하는 단계Detecting or confirming the analyte using Raman spectroscopy
    를 포함하는 분석 방법.Analysis method comprising a.
  18. 복수개의 마이크로그루브들(microgrooves)을 포함하는 기판, 그리고Substrate comprising a plurality of microgrooves (microgrooves), and
    상기 기판의 표면에 고정된 금속 나노 구조체를 포함하고,It includes a metal nanostructure fixed to the surface of the substrate,
    상기 금속 나노 구조체는 금속 나노 입자, 상기 금속 나노 입자를 둘러싸는 코팅층, 및 상기 코팅층의 관능기에 결합된 압타머를 포함하는 것인 압타 센서.The metal nanostructures include metal nanoparticles, a coating layer surrounding the metal nanoparticles, and an aptamer sensor comprising an aptamer bound to a functional group of the coating layer.
  19. 제 18 항에 있어서,The method of claim 18,
    상기 금속 나노 구조체의 코팅층은 도파민을 포함하는 것인 압타 센서.Apta sensor that the coating layer of the metal nano-structure comprises dopamine.
  20. 제 18 항에 있어서, The method of claim 18,
    상기 압타머는 티올기(-SH)를 포함하고,The aptamer contains a thiol group (-SH),
    상기 압타머는 상기 티올기에 의하여 상기 코팅층의 관능기와 친핵성 결합하는 것인 압타 센서.The aptamer is an aptamer sensor that is nucleophilically bonded to the functional group of the coating layer by the thiol group.
  21. 제 18 항에 있어서,The method of claim 18,
    상기 금속 나노 구조체는 상기 코팅층의 관능기에 결합된 캡핑제(capping agent)를 더 포함하는 것인 압타 센서.The metal nano-structure further comprises a capping agent (capping agent) bonded to the functional group of the coating layer sensor.
  22. 제 21 항에 있어서,The method of claim 21,
    상기 캡핑제는 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol), 에틸아민(Ethylamie), 디메틸 푸마레이트(Diethyl fumarate) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 압타 센서.The capping agent is any one selected from the group consisting of 2-Mercaptoethanol, Ethylamie, Diethyl fumarate, and mixtures thereof.
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