KR102132624B1 - Substrate for raman scattering, method for manufacturing the same, analyzing apparatus and analyzing method comprising the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 라만 분광 기판, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것으로서, 상기 라만 분광 기판은 기판, 상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하는 다공성 증착막, 그리고 상기 다공성 증착막 위에 위치하는 리셉터 분자를 포함하며, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁은 것이다.
상기 라만 분광 기판은 나노 입자가 나노 클러스터 입자로 형성된 후 3차원 나노포러스 구조로 증착되기 때문에 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 분석 대상물을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 3차원 나노포러스 구조의 증착막 표면에 리셉터 분자를 고정화하여 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있다.The present invention relates to a Raman spectroscopic substrate, a method for manufacturing the same, an analytical device and an analysis method comprising the same, wherein the Raman spectroscopic substrate is located on the substrate, the substrate, and a porous deposition film comprising nanostructures composed of nanocluster particles, And it includes a receptor molecule located on the porous deposition film, the gap between the nanostructures is narrower in the upper portion not in contact with the substrate than in the lower portion in contact with the substrate.
Since the Raman spectroscopy substrate is formed of nano-cluster particles and then deposited as a 3D nanoporous structure, it is possible to maximize the Raman scattering signal, and accordingly, the analyte can be more easily and easily detected by detecting the surface-enhanced Raman scattering signal In addition, it is possible to improve the detection efficiency for the analyte by immobilizing the receptor molecules on the surface of the deposited film of the 3D nanoporous structure, and to simplify the process.
Description
본 발명은 라만 분광 기판, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 표면증강 라만 분광법(Surface Enhanced Raman Scattering, 또는 Surface Enhanced Raman Spectroscopy, 이하, 'SERS'라 함)에 사용되는 라만 분광 기판, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 분석 장치 및 분석 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a Raman spectroscopy substrate, a method for manufacturing the same, an analysis device and an analysis method including the same, and more specifically, Surface Enhanced Raman Scattering (or Surface Enhanced Raman Spectroscopy, hereinafter referred to as'SERS') It relates to a Raman spectroscopic substrate, a manufacturing method thereof, an analytical device including the same, and an analytical method.
최근 분자의 검출, 확인 및 분석을 위해 사용되는 기법의 하나로서, 예를 들면, 라만 산란(Raman scattering)을 이용한 방법이 있다. 라만 산란이란 입사되는 광자의 에너지(hv)가 분자의 진동 상태를 변화시키면서 다른 주파수의 에너지(hv')로 산란되는 현상이며, 이때의 산란은 비탄성 산란에 속한다. 이러한 라만 산란은 광자와 상호작용하여 산란을 유도하는 분자구조에 따라 고유의 광자 에너지 변화 형태를 나타내므로(Raman shift), 분자의 검출, 확인, 정성 분석 및 정량 분석이 가능하다. Recently, as one of techniques used for detection, identification and analysis of molecules, there is a method using, for example, Raman scattering. Raman scattering is a phenomenon in which the energy (hv) of incident photons is scattered with energy (hv') of different frequencies while changing the vibration state of the molecule, and the scattering at this time belongs to inelastic scattering. Such Raman scattering exhibits a unique form of photon energy change according to the molecular structure that interacts with photons to induce scattering (Raman shift), so it is possible to detect, confirm, qualitatively and quantitatively analyze molecules.
상기 라만 산란은 본질적으로 신호가 약하여, 분자 검출을 위해서는 고출력의 레이저에 오랜 시간의 노출이 필요하며, 이와 같은 라만 신호를 강화하여 고감도 검출을 하기 위하여 사용되는 기술 중 하나가 표면 증강 라만 산란(Surface Enhanced Raman Scattering, SERS)이다.The Raman scattering is essentially a weak signal, which requires a long time exposure to a high-power laser for molecular detection, and one of the techniques used to enhance the Raman signal to detect high sensitivity is to enhance surface Raman scattering (Surface). Enhanced Raman Scattering (SERS).
SERS은 금속 나노입자의 표면에 결합 또는 흡착된 화학물질의 라만 스펙트럼을 증폭하여 기존의 라만 분광 분석법에 비하여 감도가 매우 높다. 따라서, SERS을 활용하여 다양한 생화학 물질들을 분석한 연구결과들이 많이 발표되고 있다.SERS amplifies the Raman spectrum of chemicals bound to or adsorbed on the surface of metal nanoparticles, making it highly sensitive compared to conventional Raman spectroscopy. Therefore, research results analyzing various biochemicals using SERS have been published.
대한민국 공개특허 제10-2007-0097177호(2007.10.04)는 중합체로 가교된 금속 입자를 기판상에 코팅하여 분석 대상물을 포함하는 시료를 상기 금속 입자에 접촉시켜 상기 기판에 여기광을 조사한 후, 그로부터 발생한 산란광의 스펙트럼을 분석하여 시료 중의 분석 대상물을 검출하는 방법이 개시되어 있으나, 시료에 여러 물질이 혼합되어 있는 경우 시료와 나노 입자 결합의 선택성이 떨어져 분석 대상물을 검출하기 힘들다는 문제점이 있다.Republic of Korea Patent Publication No. 10-2007-0097177 (2007.10.04) is coated with a metal particle cross-linked with a polymer on the substrate to contact the sample containing the analyte to the metal particles and irradiate the substrate with excitation light, Although a method of detecting an analyte in a sample by analyzing a spectrum of scattered light generated therefrom is disclosed, there is a problem in that it is difficult to detect an analyte because the selectivity between the sample and nanoparticles is poor due to the mixture of several substances in the sample.
대한민국 공개특허 제10-2012-0087051호(2012.08.06)는 생체 표지자(biomarker)와 표면 증강 라만 산란 입자(surface-enhanced Raman scattering dots; SERS dots)를 이용하여 질병을 정확하고 신속하게 판별/진단하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 표면 증강 라만 산란 입자에 화학적/생물학적 태그(tag)를 붙이고 이것과 질병의 생체 표지자를 표적지향적으로 결합시키고, 광학적 이미징(imaging) 기법으로 그 이미지를 획득하여 질병을 진단/판별하는 방법이 개시되어 있으나, SERS 신호를 얻음으로써 질병을 진단하는 데 있어서, 대부분의 SERS 관련 기술과 마찬가지로 생체 표지자를 라만 산란 입자에 결합시키는 방법을 사용하고 있어 진단 과정이 복잡한 문제가 있었다.Republic of Korea Patent Publication No. 10-2012-0087051 (2012.08.06) using a biomarker (biomarker) and surface-enhanced Raman scattering particles (surface-enhanced Raman scattering dots; SERS dots) to accurately and quickly discriminate / diagnose the disease More specifically, a surface-enhanced Raman scattering particle is attached to a chemical/biological tag, and a biomarker of the disease is targeted to the target, and the image is acquired by an optical imaging technique. Although a method of diagnosing/determining a disease has been disclosed, in diagnosing a disease by obtaining a SERS signal, as with most SERS-related technologies, a method of binding a biomarker to a Raman scattering particle is used, which makes the diagnosis process complicated. There was.
본 발명의 목적은 나노 입자가 나노 클러스터 입자로 형성된 후 3차원 나노포러스 구조로 증착되기 때문에 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 분석 대상물을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 3차원 나노포러스 구조의 증착막 표면에 리셉터 분자를 고정화하여 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있는 라만 분광 기판을 제공하는 것이다.The object of the present invention is to maximize the Raman scattering signal because the nanoparticles are formed of nano-cluster particles and then deposited in a three-dimensional nanoporous structure, so that the analyte can be more easily and conveniently detected by detecting the surface-enhanced Raman scattering signal. In addition, it is possible to improve the detection efficiency for an analyte by immobilizing a receptor molecule on the surface of the 3D nanoporous structure-deposited film, and to provide a Raman spectroscopic substrate capable of simplifying the process.
본 발명의 다른 목적은 상기 라만 분광 기판의 제조 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing the Raman spectroscopic substrate.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 라만 분광 기판을 포함하는 분석 장치를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an analysis device including the Raman spectroscopic substrate.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 라만 분광 기판을 이용하는 분석 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an analysis method using the Raman spectroscopic substrate.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기판, 상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하는 다공성 증착막, 그리고 상기 다공성 증착막 위에 위치하는 리셉터 분자를 포함하며, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁은 것인 라만 분광 기판을 제공한다.According to an embodiment of the present invention, a substrate, a porous deposited film disposed on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and a receptor molecule positioned on the porous deposited film, between the nanostructures The spacing provides a Raman spectroscopic substrate that is narrower at the top not contacting the substrate than at the bottom contacting the substrate.
상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상일 수 있다.The nanostructures may have a branched shape, which is divided into several branches from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate.
상기 리셉터 분자는 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기로 치환된 압타머이고, 상기 압타머는 상기 관능기에 의하여 상기 나노 구조체들에 부착될 수 있다.The receptor molecule is an aptamer substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups, and the aptamer can be attached to the nanostructures by the functional group.
상기 압타머는 HER2(Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2)에 특이적으로 결합하는 압타머일 수 있다.The aptamer may be an aptamer that specifically binds HER2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2).
상기 라만 분광 기판은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 더 포함할 수 있다.The Raman spectroscopy substrate further comprises a solvent selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposition film, the nanostructures, and both. It can contain.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 프로세스 챔버와 클러스터 소스를 구비한 스퍼터링 장치를 이용하여 기판 위에 다공성 증착막을 제조하는 하기 (a) 내지 (d) 단계로 이루어진 단계; 그리고 (a) 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)을 실행하는 단계, (b) 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation) 및 나노 클러스터 입자의 크기를 제어하는 단계, (c) 상기 클러스터 소스에 마련된 노즐의 개구를 통해 상기 단계 (b)에서 성장된 나노 클러스터 입자를 프로세스 챔버로 배출하는 단계, 및 (d) 상기 프로세스 챔버 내에 인가되는 압력을 제어하여 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)를 실행하여 나노 구조체들을 성장시키되, 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 상기 나노 구조체들을 성장시키는 단계, 상기 다공성 증착막 위에 리셉터 분자를 부착시키는 단계를 포함하는 라만 분광 기판의 제조 방법을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, a step consisting of the following steps (a) to (d) for manufacturing a porous deposition film on a substrate using a sputtering apparatus having a process chamber and a cluster source; And (a) forming a plasma in the cluster source and then performing nucleation, (b) aggregation and aggregation of nanocluster particles through condensation in the cluster source. Controlling the size, (c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source, and (d) applying pressure applied in the process chamber The nanostructures are grown by controlling the coalescence of nanocluster particles on the substrate for deposition, but the initial pressure is controlled to be greater than the late pressure, so that the spacing between the nanostructures is in contact with the substrate for deposition. It provides a method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate comprising the step of growing the nanostructures to be narrower in the upper portion which is not in contact with the deposition substrate than in the lower portion, and attaching a receptor molecule on the porous deposition film.
상기 (d) 단계에서의 초기 압력은 10 mTorr 내지 50 mTorr이고, 후기 압력은 0.01 mTorr 내지 10 mTorr일 수 있다.The initial pressure in step (d) is 10 mTorr to 50 mTorr, and the late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr.
상기 라만 분광 기판의 제조 방법은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.The method of manufacturing the Raman spectroscopic substrate is any one selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposited film, between the nanostructures, and both. The method may further include treating the solvent.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 라만 분광 기판, 상기 라만 분광 기판에 빛을 조사하는 광원, 그리고 상기 라만 분광 기판으로부터 반사된 광의 라만 분광을 측정하는 라만 분광기를 포함하는 분석 장치를 제공한다.According to another embodiment of the present invention, there is provided an analysis device comprising a Raman spectroscopy substrate, a light source irradiating light to the Raman spectroscopy substrate, and a Raman spectroscopy measuring Raman spectroscopy of light reflected from the Raman spectroscopy substrate do.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 라만 분광 기판을 분석 대상물을 포함하는 시료에 노출시켜, 상기 라만 분광 기판의 리셉터 분자와 상기 분석 대상물 간의 결합을 유도하는 단계, 그리고 라만 분광법을 이용하여 상기 분석 대상물을 검출 또는 확인하는 단계를 포함하는 분석 방법을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, exposing the Raman spectroscopy substrate to a sample containing an analyte, inducing binding between the receptor molecule of the Raman spectroscopy substrate and the analyte, and using Raman spectroscopy It provides an analysis method comprising the step of detecting or confirming the analysis object.
본 발명의 라만 분광 기판은 나노 입자가 나노 클러스터 입자로 형성된 후 3차원 나노포러스 구조로 증착되기 때문에 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 분석 대상물을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 3차원 나노포러스 구조의 증착막 표면에 리셉터 분자를 고정화하여 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있다.The Raman spectroscopy substrate of the present invention is capable of maximizing the Raman scattering signal because the nanoparticles are formed into nano-cluster particles and then deposited in a three-dimensional nanoporous structure, thereby making it easier and simpler to analyze an object through surface-enhanced Raman scattering signal detection. In addition to detection, immobilization of a receptor molecule on the surface of the 3D nanoporous structured deposition film can improve detection efficiency for an analyte, and simplify the process.
도 1은 본 발명의 라만 분광 기판을 개념적으로 도시한 모식도이다.
도 2는 다공성 증착막의 형성 과정을 설명하기 위한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 분석 방법을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 기판의 다공도 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예 1에서 로다민 6G에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.
도 6은 상기 도 5에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4, B5)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실험예 2에서 anti-HER2 압타머에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.
도 8은 상기 도 7에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4, B5)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실험예 2에서 ECD HER2 단백질에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.
도 10은 상기 도 9에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실험예 3에서 아민기로 치환된 압타머를 부착한 경우에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.
도 12는 상기 도 11의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 표현한 결과이다.
도 13은 본 발명의 실험예 3에서 티올기로 치환된 압타머를 부착한 경우에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.
도 14는 상기 도 13의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 표현한 결과이다.
도 15 내지 도 17은 본 발명의 실험예 4에서 기판을 주사전자현미경(Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM)을 이용하여 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 18 및 도 19는 본 발명의 실험예 5에서 서로 다른 기판에 대하여 압타머 검지시 라만 밴드를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20 내지 도 23은 본 발명의 실험예 6에서 ECD HER2 단백질의 함량을 하기 변화시키며 라만 신호를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 24 내지 도 28은 본 발명의 실험예 7에서 알부민(Bovine serum albumin, BSA)의 라만 신호를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.1 is a schematic diagram conceptually showing the Raman spectroscopic substrate of the present invention.
2 is a schematic view for explaining a process of forming a porous deposition film.
3 is a view schematically showing the analysis method of the present invention.
4 is a graph showing the porosity measurement results of the substrate prepared in Example 1 of the present invention.
5 is a result of measuring the surface-enhanced Raman scattering for rhodamine 6G in Experimental Example 1 of the present invention.
6 is a graph in which only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4, and B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. 5 is extracted.
7 is a result of measuring the surface-enhanced Raman scattering for the anti-HER2 aptamer in Experimental Example 2 of the present invention.
FIG. 8 is a graph in which only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4, and B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. 7 is extracted.
9 is a result of measuring the surface-enhanced Raman scattering for the ECD HER2 protein in Experimental Example 2 of the present invention.
10 is a graph in which only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, and B4) considered as characteristic Raman bands in FIG. 9 is extracted.
11 is a result of measuring the surface-enhanced Raman scattering in the case of attaching an aptamer substituted with an amine group in Experimental Example 3 of the present invention.
12 is a result of expressing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIG. 11 in a heat mapping method.
13 is a result of measuring the surface-enhanced Raman scattering in the case of attaching an aptamer substituted with a thiol group in Experimental Example 3 of the present invention.
14 is a result of expressing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIG. 13 by a heat mapping method.
15 to 17 are photographs showing the results of observing the substrate in Experimental Example 4 of the present invention using a Field Emission-Scanning Electron Microscopy (FE-SEM).
18 and 19 are graphs showing the results of measuring Raman bands when detecting aptamers for different substrates in Experimental Example 5 of the present invention.
20 to 23 is a graph showing the results of measuring the Raman signal while changing the content of ECD HER2 protein in Experimental Example 6 of the present invention.
24 to 28 are graphs showing the results of measuring Raman signals of albumin (Bovine serum albumin, BSA) in Experimental Example 7 of the present invention.
본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.The above and other objects and novel features of the present invention will become more apparent through the description of the present specification and the accompanying drawings.
본 발명의 명세서에서 라만 분광법은 표면증강 라만 분광법(Surface enhanced Raman spectroscopy; SERS), 표면 증강된 공명 라만 분광법(Surface enhanced resonance Raman spectroscopy; SERRS), 하이퍼-라만(Hyper Raman) 및/또는 간섭성 반스톡스 라만 분광법(coherent anti-Stokes Raman spectroscopy; CARS)을 의미할 수 있고, 이하 설명에서는 표면증강 라만 분광법에 대한 경우를 위주로 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Raman spectroscopy in the context of the present invention is Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS), Surface enhanced resonance Raman spectroscopy (SERRS), Hyper-Raman and/or coherent anti- Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) may mean, and the following description mainly focuses on the case of surface-enhanced Raman spectroscopy, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 따른 라만 분광 기판은 기판, 상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하는 다공성 증착막, 그리고 상기 다공성 증착막 위에 위치하는 리셉터 분자를 포함한다.The Raman spectroscopic substrate according to an embodiment of the present invention includes a substrate, a porous deposited film positioned on the substrate, including nanostructures made of nanocluster particles, and a receptor molecule positioned on the porous deposited film.
상기 기판은 실리콘 기판, 갈륨비소(GaAs) 기판, 유리(Glass) 기판, 석영(Quartz) 기판, 플라스틱 기판 및 폴리머(Polymer)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 비금속 기판일 수 있고, 또한 통상의 반도체 공정에서 사용되는 2, 4, 6, 8, 12 인치 등의 대면적 기판일 수 있다. The substrate may be any one non-metal substrate selected from the group consisting of a silicon substrate, a gallium arsenide (GaAs) substrate, a glass substrate, a quartz substrate, a plastic substrate, and a polymer. It may be a large area substrate such as 2, 4, 6, 8, or 12 inches used in a semiconductor process.
상기 나노 구조체들은 상기 기판 상에 상기 나노 클러스터 입자들이 증착되어 3 차원 나노 구조로 성장된 것이다. 상기 나노 클러스터 입자는 나노 입자들이 10 개 내지 20 개가 뭉쳐져서 이루어진 것으로, 상기 나노 입자는 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 알루미늄(Al) 등의 금속의 나노 입자일 수 있고, 상기 나노 클러스터 입자의 직경은 100 nm 내지 200 nm일 수 있다. 상기 나노 클러스터 입자의 직경이 상기 범위 내인 경우, 라만 검지시 라만 산란 강도가 가장 강할 수 있다.The nanostructures are grown on a three-dimensional nanostructure by depositing the nanocluster particles on the substrate. The nano-cluster particles are formed by agglomeration of 10 to 20 nanoparticles, and the nanoparticles are made of metals such as gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), platinum (Pt), and aluminum (Al). It may be nanoparticles, and the diameter of the nanocluster particles may be 100 nm to 200 nm. When the diameter of the nanocluster particles is within the above range, the Raman scattering strength may be strongest when Raman is detected.
상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁고, 밀도가 더 높을 수 있고, 구체적으로 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부로 갈수록 더 좁아지고, 밀도는 상부로 갈수록 높아지는 것일 수 있다.The spacing between the nanostructures may be narrower and more dense at the top that is not in contact with the substrate than at the bottom that is in contact with the substrate, and specifically, the spacing between the nanostructures may be at the bottom in contact with the substrate. It may be that the narrower as it goes to the upper portion not in contact with the substrate, and the density becomes higher as it goes to the upper portion.
상기 나노 구조체들 사이의 간격은 각각의 나노 구조체들 사이에 형성되는 빈 공간의 수평 거리를 의미하며, 상기 나노 구조체들 사이에 형성되는 빈 공간에 의하여 상기 증착막은 다공성 증착막일 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 하부에서 보다 상부에서 더 좁음에 따라 상기 다공성 증착막의 다공도는 상기 나노 구조체들의 하부에서 보다 상부에서 더 작을 수 있고, 구체적으로 하부에서 상부로 갈수록 더 작아질 수 있다.The spacing between the nanostructures refers to the horizontal distance of the empty space formed between each nanostructure, and the deposition film may be a porous deposition film by the empty space formed between the nanostructures. Accordingly, as the spacing between the nanostructures is narrower from the top than from the bottom, the porosity of the porous deposition film may be smaller from the top than from the bottom of the nanostructures, and more specifically, become smaller from the bottom to the top. Can.
상기 나노 구조체들 사이의 하부 간격은 10 nm 내지 200 ㎛일 수 있고, 구체적으로 100 nm 내지 100 ㎛일 수 있다. 상기 나노 구조체들 사이의 상부 간격은 10 nm 내지 100 ㎛일 수 있고, 구체적으로 100 nm 내지 10 ㎛일 수 있다. 이때, 상기 나노 구조체들 사이의 하부 간격 범위와 상부 간격 범위가 일부 겹치더라도 하부 간격이 상부 간격에 비하여 더 크다. 상기 나노 구조체들 사이의 하부 간격은 상기 기판과 접하고 있는 상기 나노 구조체들의 최하단 사이의 거리를 의미하고, 상기 나노 구조체들 사이의 상부 간격은 상기 기판과 접하고 있지 않은 상기 나노 구조체들의 최상단 사이의 거리를 의미한다. The lower spacing between the nanostructures may be 10 nm to 200 μm, specifically 100 nm to 100 μm. The upper gap between the nanostructures may be 10 nm to 100 μm, specifically 100 nm to 10 μm. At this time, even if the lower gap range and the upper gap range between the nanostructures partially overlap, the lower gap is larger than the upper gap. The lower spacing between the nanostructures refers to the distance between the bottom of the nanostructures that are in contact with the substrate, and the upper spacing between the nanostructures is the distance between the topmost of the nanostructures that are not in contact with the substrate. it means.
또한, 상기 다공성 증착막의 하부 다공도는 10 % 내지 85 %일 수 있고, 구체적으로 30 % 내지 80 %일 수 있다. 상기 다공성 증착막의 상부 다공도는 30 % 내지 60 %일 수 있고, 구체적으로 30 % 내지 50 %일 수 있다. 이때, 상기 다공성 증착막의 하부 다공도와 상부 다공도 범위가 일부 겹치더라도 하부 다공도가 상부 다공도에 비하여 더 크다. 상기 다공성 증착막의 하부 다공도는 상기 기판과 접하고 있는 상기 나노 구조체들의 최하단에서의 다공도를 의미하고, 상기 다공성 증착막의 상부 다공도는 상기 기판과 접하고 있지 않은 상기 나노 구조체들의 최상단에서의 다공도를 의미한다.In addition, the lower porosity of the porous deposition film may be 10% to 85%, specifically 30% to 80%. The upper porosity of the porous deposition layer may be 30% to 60%, specifically 30% to 50%. At this time, even if the lower porosity and the upper porosity of the porous deposition film partially overlap, the lower porosity is greater than the upper porosity. The lower porosity of the porous deposition film means the porosity at the bottom of the nanostructures in contact with the substrate, and the upper porosity of the porous deposition film means the porosity at the top of the nanostructures not in contact with the substrate.
상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상일 수 있다. 구체적으로, 상기 나노 구조체들은 하부에서는 한 가닥의 굵은 기둥 형상이나, 상부로 갈수록 점차 여러 갈래로 갈라져 분지되면서 위로 뻗은 나뭇가지 형상일 수 있다. 상기 나노 구조체들이 이러한 형상을 가짐에 따라 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 하부에서 보다 상부에서 더 좁을 수 있고, 상기 다공성 증착막의 다공도는 상기 나노 구조체들의 하부에서 보다 상부에서 더 작을 수 있다.The nanostructures may have a branched shape, which is divided into several branches from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate. Specifically, the nano-structures may be a single column of thick pillar shape at the bottom, or a branch shape extending upward while being branched into several branches gradually toward the top. As the nanostructures have such a shape, the spacing between the nanostructures may be narrower from the top than from the bottom, and the porosity of the porous deposition film may be smaller from the top than from the bottom of the nanostructures.
도 1은 상기 라만 분광 기판을 개념적으로 도시한 모식도이다. 상기 도 1을 참조하면, 상기 라만 분광 기판(10)은 상기 기판(11) 위에, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들(12)을 포함한다. 상기 나노 구조체들(12)은 하부에서 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 위로 뻗은 분지된 형상일 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 구조체들(12) 사이의 간격은 하부에서 보다 상부에서 더 좁을 수 있고, 상기 라만 분광 기판(10)의 다공도는 상기 나노 구조체들(12)의 하부에서 보다 상부에서 더 작을 수 있다.1 is a schematic diagram conceptually showing the Raman spectroscopic substrate. Referring to FIG. 1, the
상기 라만 분광 기판(10)의 표면 거칠기는 5 nm 내지 100 nm일 수 있고, 구체적으로 20 nm 내지 70 nm일 수 있고, 더욱 구체적으로 50 nm 내지 70 nm일 수 있다. 상기 라만 분광 기판(10)의 표면 거칠기가 5 nm 미만인 경우 표면 거칠기의 부재로 인하여 라만 산란 강도 증감 현상의 부재가 발생할 수 있고, 100 nm를 초과하는 경우 작은 크기의 비표적 검체가 다공성 증착막 속으로 고립되어, 불필요한 라만 스펙트럼이 검지되거나, 다공성 증착막의 공공율 증가로 인하여 다공성 증착막 자체의 접착력이 감소되어 박리되는 문제가 있을 수 있다.The surface roughness of the
한편, 상기 라만 분광 기판(10)은 상기 다공성 증착막 위에 위치하는 상기 리셉터 분자(13)를 포함한다. 본 발명에서 상기 리셉터 분자(13)는 리셉터 분자에만 한정되는 것은 아니고, 표지자 또는 추적자 등을 포함하는 개념이다.Meanwhile, the
상기 리셉터 분자는 항체, RNA, DNA, 압타머, PNA 및 리간드 등과 같이 시료 내 분석 대상물과 선택적인 결합을 유도할 수 있는 물질이 바람직하다. 상기 리셉터 분자가 강한 라만 신호를 가지고 있더라도, 시료 내에 존재하는 라만 피크 중에서 상기 리셉터 분자가 가진 라만 피크와 다른 파장대에서 나타나는 특징적인 라만 피크를 찾아내어 분석 대상물의 존재 여부 및 농도를 분석할 수 있다. 즉, 상기 라만 분광 기판이 상기 리셉터 분자를 포함함에 따라, 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있다.The receptor molecule is preferably a substance capable of inducing selective binding with an analyte in a sample, such as an antibody, RNA, DNA, aptamer, PNA, and ligand. Even if the receptor molecule has a strong Raman signal, it is possible to analyze the presence and concentration of the analyte by finding a characteristic Raman peak appearing in a different wavelength band from the Raman peak of the receptor molecule among the Raman peaks present in the sample. That is, as the Raman spectroscopy substrate includes the receptor molecule, it is possible to improve the detection efficiency for the analyte, and simplify the process.
또한, 상기 리셉터 분자를 한 종류 이상으로 함으로써 시료 내에서 하나 이상의 분석 대상물을 선택적으로 분석할 수도 있다.Further, one or more analytes can be selectively analyzed in a sample by making the receptor molecule one or more types.
상기 리셉터 분자는 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기로 치환될 수 있고, 상기 리셉터 분자는 상기 관능기에 의하여 상기 나노 구조체들에 부착될 수 있다. 상기 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기는 상기 금속 나노 클러스터 입자들과 결합력이 높은 관능기로, 상기 관능기는 상기 리셉터 분자가 상기 나노 구조체들의 결합력을 향상시켜 줄 수 있다.The receptor molecule may be substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups, and the receptor molecule may be attached to the nanostructures by the functional group. The functional group selected from the group consisting of the amine group, thiol group, and catechol group is a functional group having high bonding strength with the metal nanocluster particles, and the functional group may improve the bonding strength of the nanostructures by the receptor molecule.
한편, 상기 리셉터 분자는 HER2(Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2)에 특이적으로 결합하는 압타머일 수 있다. 상기 압타머는 암 전이에 관여하는 HER2 단백질에 매우 특이적으로 결합함으로써, 암, 특히 유방 암 전이를 억제하거나 검출이 가능하다.Meanwhile, the receptor molecule may be an aptamer that specifically binds HER2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2). The aptamer binds very specifically to the HER2 protein involved in cancer metastasis, thereby suppressing or detecting cancer, particularly breast cancer metastasis.
상기 HER2 단백질에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머는 5'-GAGTGACCGTCTGCCTG-[Core sequence]-CAGCCACACCACCAGCC-3'의 염기서열을 가지며, 여기서 Core Sequence는 아래의 표 1에 나타낸 바와 같다.The DNA aptamer that specifically binds to the HER2 protein has a base sequence of 5'-GAGTGACCGTCTGCCTG-[Core sequence]-CAGCCACACCACCAGCC-3', where the Core Sequence is shown in Table 1 below.
6 = NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine]6 = NapdU [5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine]
A = 2'-deoxyAdenosineA = 2'-deoxyAdenosine
G = 2'-deoxyGuanosineG = 2'-deoxyGuanosine
C = 2'-deoxyCytidineC = 2'-deoxyCytidine
T = 2'-deoxyThymidine(Thymidine)T = 2'-deoxyThymidine (Thymidine)
이 중에서도 클론 번호 9-ER-N-B03_G05와 9-ER-N-C02_D06(6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA, SEQ ID NO: 7)를 사용하는 것이 더욱 바람직한데, 그 이유는 특이적 바이오 마커인 HER2 단백질과의 우수한 결합력 때문이다. Among these, it is more preferable to use clone numbers 9-ER-N-B03_G05 and 9-ER-N-C02_D06 (6CC6GGCA6G66CGA6GGAGGCC666GA66ACAGCCCAGA, SEQ ID NO: 7) because the excellent binding ability with the specific biomarker HER2 protein Because.
이에 따라, 상기 라만 분광 기판은 15 ng/mL(유방암 발현 암 인자 임상 기준치) 수준의 ECD(Extracellular Domain) HER2 단백질(악성 유방암 발현 인자)을 검출할 수 있고, 혈액 내 존재하는 ECD HER2 단백질이 임상 기준치 농도의 아주 작은 혈액 부피(2 μL)로도 유방암 환자의 예후 관찰에 이용 가능하다.Accordingly, the Raman spectroscopic substrate can detect an extracellular domain (ECD) HER2 protein (malignant breast cancer expression factor) at a level of 15 ng/mL (breast cancer expressing cancer factor clinical standard), and the ECD HER2 protein present in the blood is clinical. Even a very small blood volume (2 μL) of the baseline concentration can be used for prognosis in breast cancer patients.
한편, 상기 라만 분광 기판은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 더 포함할 수 있다. 상기 알코올은 구체적으로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.On the other hand, the Raman spectroscopic substrate is any one solvent selected from the group consisting of water, alcohol and mixtures thereof at any one position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposition film, between the nanostructures and both. It may further include. The alcohol may be any one selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, butanol, and mixtures thereof.
상기 용매는 상기 다공성 증착막의 표면 또는 상기 나노 구조체들의 사이에 흩뿌려진 것일 수 있고, 상기 라만 분광 기판이 상기 용매를 더 포함하는 경우 DNA(oligonucleotide)의 구조를 변화시켜 라만 검지가 더 잘 이루어질 수 있도록 한다. 구체적으로, 상기 압타머 등의 리셉터 분자는 DNA 가닥 중 일부분으로 자연 상태에서 염기 서열 간 수소 결합으로 인하여 3 차원 구조(3D structure)를 갖는 것으로 알려져 있다. 이를 헤어핀 구조(hairpin structure)라고 한다. 상기 압타머 등의 리셉터 분자에 상기 용매를 가하면 3 차원 구조를 이루던 압타머의 수소 결합이 끊어지게 되어 선형 구조를 가지게 되면서 라만 검지가 더 잘 이루어질 수 있도록 한다.The solvent may be scattered between the surfaces of the porous deposition layer or the nanostructures, and when the Raman spectroscopy substrate further includes the solvent, the structure of DNA (oligonucleotide) may be changed to make Raman detection better. do. Specifically, the receptor molecule such as the aptamer is known to have a 3D structure due to hydrogen bonding between base sequences in a natural state as a part of the DNA strand. This is called a hairpin structure. When the solvent is added to a receptor molecule such as the aptamer, the hydrogen bond of the aptamer having a three-dimensional structure is broken, thereby having a linear structure, so that Raman detection can be made better.
상용화된 암 진단 방식인 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)는 항원항체반응의 특이성을 이용하는 점에서는 동일하나, 항체를 두 개 이용하며 형광 발색 인자를 합성하는 추가적인 공정(Fluorescence dye labeling)이 있으며, 이 형광발색 인자의 농도로 간접적으로 암을 진단하는 반면, 상기 라만 분광 기판을 이용하면 리셉터 분자와 분석 대상 물질 자체의 라만 스펙트럼을 얻으므로 물질 자체의 유무를 확실하게 판별할 수 있으며, ELISA 방식과 같이 형광 발색 인자를 합성할 필요가 없어 공정을 단순화시킬 수 있다.The commercial cancer diagnosis method, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), is the same in that it uses the specificity of the antigen-antibody reaction, but there is an additional process (Fluorescence dye labeling) that uses two antibodies and synthesizes a fluorescent color factor. While the cancer is diagnosed indirectly at the concentration of the fluorescence color factor, the Raman spectrum of the receptor molecule and the analyte itself is obtained when the Raman spectroscopic substrate is used, so it is possible to reliably determine the presence or absence of the substance itself. There is no need to synthesize fluorescence chromogenic factors, which simplifies the process.
구체적으로, 상기 라만 분광 기판은 나노 입자가 나노 클러스터 입자로 형성된 후 3차원 나노포러스 구조로 증착되기 때문에 라만 산란 신호의 극대화가 가능하고, 이에 따라 표면증강 라만 산란 신호 검출을 통해 분석 대상물을 보다 쉽고 간편하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 3차원 나노포러스 구조의 증착막 표면에 리셉터 분자를 고정화하여 분석 대상물에 대한 검출 효율을 향상시킬 수 있으며, 공정을 단순화할 수 있다.Specifically, since the Raman spectroscopy substrate is formed of nano-cluster particles and then deposited as a three-dimensional nanoporous structure, it is possible to maximize the Raman scattering signal, thereby making it easier to analyze an object through surface-enhanced Raman scattering signal detection. In addition to simple detection, immobilization of receptor molecules on the surface of the 3D nanoporous structured deposition layer can improve detection efficiency for analytes, and simplify the process.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 라만 분광 기판의 제조 방법은 프로세스 챔버와 클러스터 소스를 구비한 스퍼터링 장치를 이용하여 기판 위에 다공성 증착막을 제조하는 단계, 그리고 상기 다공성 증착막 위에 리셉터 분자를 부착시키는 단계를 포함한다.A method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate according to another embodiment of the present invention comprises the steps of manufacturing a porous deposition film on a substrate using a sputtering apparatus having a process chamber and a cluster source, and attaching a receptor molecule on the porous deposition film. Includes.
상기 다공성 증착막을 제조하는 단계는 구체적으로, (a) 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)을 실행하는 단계, (b) 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation) 및 나노 클러스터 입자의 크기를 제어하는 단계, (c) 상기 클러스터 소스에 마련된 노즐의 개구를 통해 상기 단계 (b)에서 성장된 나노 클러스터 입자를 프로세스 챔버로 배출하는 단계, 및 (d) 상기 프로세스 챔버 내에 인가되는 압력을 제어하여 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)를 실행하여 나노 구조체들을 성장시키되, 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 상기 나노 구조체들을 성장시키는 단계를 포함할 수 있다.The step of manufacturing the porous deposition film is specifically, (a) forming a plasma in the cluster source and then performing nucleation, (b) condensation in the cluster source. Controlling aggregation and the size of the nanocluster particles, (c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source, and ( d) growing nanostructures by controlling the pressure applied to the process chamber to perform coalescence of nanocluster particles on the substrate for deposition, but controlling the initial pressure to be greater than the late pressure, between the nanostructures It may include the step of growing the nanostructures so that the gap of the gap is narrower in the upper portion not in contact with the deposition substrate than in the lower portion in contact with the deposition substrate.
상기 다공성 증착막 형성 메카니즘에 대해 도 2를 참조하여 설명한다. 상기 도 2는 상기 다공성 증착막의 형성 과정을 설명하기 위한 모식도이다. 상기 도 2의 (a)에 도시된 바와 같이, 스퍼터링 장치에서는 상기 클러스터 소스에 마련된 상기 타깃에 의해 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)이 실행되고, 계속해서 도 2의 (b)에 도시된 바와 같이, 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation)이 실행된다. 상기 응집에 의해 나노 클러스터 입자가 형성되며, 이때 상기 나노 클러스터 입자의 크기는 상기 클러스터 소스의 거리에 따라 제어 가능하다.The mechanism for forming the porous deposition film will be described with reference to FIG. 2. 2 is a schematic view for explaining the process of forming the porous deposition film. As shown in (a) of FIG. 2, in the sputtering apparatus, after forming a plasma in the cluster source by the target provided in the cluster source, nucleation is performed, and the diagram continues. As shown in (b) of 2, aggregation through condensation is performed in the cluster source. Nanocluster particles are formed by the aggregation, and the size of the nanocluster particles can be controlled according to the distance of the cluster source.
이어서, 상기 도 2의 (c)에 도시된 바와 같이 상기 클러스터 소스에 마련된 상기 노즐의 개구를 통하여 상기 형성된 나노 클러스터 입자가 프로세스 챔버로 배출된다. 상기 프로세스 챔버에서는 내부 압력이 수백 mTorr 이하로 제어되어 상기 도 2의 (d)에 도시된 바와 같이, 상기 증착용 기판(120) 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)가 이루어진 3 차원 나노 포러스 구조의 나노 구조체(700)가 형성된다.Subsequently, as shown in FIG. 2C, the formed nanocluster particles are discharged into the process chamber through the opening of the nozzle provided in the cluster source. In the process chamber, the internal pressure is controlled to hundreds of mTorr or less, and as shown in FIG. 2(d), a 3D nanoporous structure in which coalescence of nanocluster particles is formed on the
즉, 상기 증착용 기판(120) 상에 핵을 형성한 후 박막(continuous film) 형성까지 진행하는 일반적인 스퍼터 장치와 달리, 상기 프로세스 챔버 내의 압력 제어에 의해 상기 프로세스 챔버에서의 상기 증착용 기판(120)에는 상기 클러스터 소스에서 배출된 상기 나노 클러스터 입자가 합체 상태인 3 차원 나노 포러스 구조로 증착되고, 박막 형성까지 도달하지 않게 된다. That is, unlike a general sputter device that forms a nucleus on the
본 발명에서는 상기 증착용 기판(120)에 형성된 나노 포러스 구조의 나노 구조체들(700)이 연속적인 막을 형성하지 못하도록 상기 프로세스 챔버 내의 압력 또는 온도를 제어하여 3 차원 나노 포러스 구조의 다공성 증착막을 형성한다. 즉, 상기 나노 구조체들(700) 사이의 간격은 압력 또는 온도의 조절에 의해 조정 가능하다. In the present invention, a porous deposition film having a 3D nanoporous structure is formed by controlling pressure or temperature in the process chamber so that the
이때, 상기 나노 구조체들(700)을 성장시키는 단계에서 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들(700) 사이의 간격이 상기 증착용 기판(120)과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판(120)과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 한다.At this time, in the step of growing the
상기 후기 압력은 0.01 mTorr 내지 10 mTorr일 수 있고, 구체적으로 0.1 mTorr 내지 10 mTorr일 수 있다. 상기 초기 압력은 10 mTorr 내지 50 mTorr일 수 있고, 구체적으로 20 mTorr 내지 40 mTorr일 수 있다. 또한, 상기 압력은 상기 초기 압력부터 상기 후기 압력까지 점차적으로 또는 단계적으로 감소할 수도 있다.The late pressure may be 0.01 mTorr to 10 mTorr, and specifically 0.1 mTorr to 10 mTorr. The initial pressure may be 10 mTorr to 50 mTorr, and specifically 20 mTorr to 40 mTorr. In addition, the pressure may be gradually or stepwisely decreased from the initial pressure to the later pressure.
상기 초기 압력이 10 mTorr 미만이면 다공성 증착막의 밀도가 너무 낮아지거나 필름 형성이 안 될 수 있고, 이에 따라 라만 감도가 떨어지는 기판이 제조될 수 있으며, 상기 초기 압력이 50 mTorr를 초과하면, 공정 온도가 너무 높아져 결정성이 증가되어 원치 않는 물성의 다공성 증착막이 형성될 수 있다.If the initial pressure is less than 10 mTorr, the density of the porous deposited film may be too low or the film may not be formed, and accordingly, a substrate having a low Raman sensitivity may be manufactured. If the initial pressure exceeds 50 mTorr, the process temperature Too high, so that the crystallinity is increased, a porous vapor deposition film of unwanted properties can be formed.
한편, 상기 나노 구조체들(700) 사이 간격의 미세 제어를 위해 상기 프로세스 챔버에서 상기 증착용 기판(120)을 인출한 후, 상기 증착용 기판(120)에 대해 열처리를 선택적으로 진행할 수 있다. 다만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 프로세스 챔버 내에서 열처리를 진행할 수도 있다.On the other hand, for fine control of the spacing between the
상기 열처리에 의하여 상기 다공성 증착막에서 상기 나노 입자의 크기 및 나노 구조체들(700) 사이의 간격을 증가시킬 수 있다. 상기 열처리는 100 ℃ 내지 250 ℃에서 진행할 수 있고, 상기 범위 내에서 열처리 온도가 증가할수록 상기 나노 입자의 크기 및 나노 구조체들(700) 사이의 간격이 증가한다.By the heat treatment, the size of the nanoparticles in the porous deposition layer and the spacing between the
상기 열처리는 금속의 산화를 고려하여 N2 분위기 또는 진공에서 열처리를 진행하는 것이 바람직하다.The heat treatment is preferably performed in an N 2 atmosphere or vacuum in consideration of oxidation of the metal.
다음으로, 상기 제조된 다공성 증착막 위에 리셉터 분자를 부착시킨다.Next, a receptor molecule is attached on the prepared porous deposition film.
이때, 상기 다공성 증착막의 나노 클러스터 입자들과 상기 리셉터 분자의 결합력을 높이기 위하여, 상기 리셉터 분자는 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기로 치환될 수 있다.At this time, in order to increase the bonding force between the nanocluster particles of the porous deposition film and the receptor molecule, the receptor molecule may be substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups.
상기 다공성 증착막 위에 상기 리셉터 분자를 부착시키는 방법 및 조건은 드랍코팅(drop-coating)또는 스핀 코팅법(spin coating) 일 수 있다.The method and conditions for attaching the receptor molecule on the porous deposition film may be drop-coating or spin coating.
선택적으로, 라만 분광 기판의 제조 방법은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.Optionally, a method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate is selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at any one position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposited film, between the nanostructures, and both. The method may further include treating one solvent.
구체적으로, 상기 용매를 처리하는 단계는 상기 다공성 증착막의 표면 또는 상기 나노 구조체들의 사이에 상기 용매를 스프레이 등의 방법에 의하여 흩뿌리거나, 상기 다공성 증착막을 상기 용매에 침지시켜 이루어질 수 있다.Specifically, the step of treating the solvent may be performed by spraying the solvent on the surface of the porous deposition layer or between the nanostructures by a method such as spraying or immersing the porous deposition layer in the solvent.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 분석 장치는 상기 라만 분광 기판, 상기 라만 분광 기판에 빛을 조사하는 광원, 그리고 상기 라만 분광 기판으로부터 반사된 광의 라만 분광을 측정하는 라만 분광기를 포함한다.An analysis apparatus according to another embodiment of the present invention includes the Raman spectroscopy substrate, a light source irradiating light to the Raman spectroscopy substrate, and a Raman spectroscopy measuring Raman spectroscopy of light reflected from the Raman spectroscopy substrate.
상기 광원과 라만 분광기는 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 광원은 532 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Nd:YAG 레이저 또는 365 nm 파장에서의 주파수 중첩된 Ti:사파이어 레이저에 의해 생성된 것일 수 있다. 상기 광원은 펄스 레이저 빔 또는 연속 레이저 빔일 수 있다. The light source and the Raman spectrometer can be used commonly used. For example, the light source may be generated by a frequency superimposed Nd:YAG laser at 532 nm wavelength or a frequency superimposed Ti:sapphire laser at 365 nm wavelength. The light source may be a pulse laser beam or a continuous laser beam.
상기 여기 빔은 공초점의 광학기 및 현미경 렌즈를 통과하여 상기 라만 분광 기판 위로 초점이 모아질 수 있다. 상기 분석 대상물로부터의 라만 방출 광은 현미경 렌즈 및 공초점 광학기에 의해 모아지고 스펙트럼 분리를 위해 단색광 장치와 결합될 수 있다. 상기 공초점 광학기는 배경 신호를 감소시키기 위한 다이크로익 필터(dichroic filter), 차단 필터, 공초점 핀홀, 대물렌즈 및 거울을 포함할 수 있다. The excitation beam can be focused over the Raman spectroscopy substrate through confocal optics and a microscope lens. The Raman emission light from the analyte can be collected by a microscope lens and confocal optics and combined with a monochromatic device for spectral separation. The confocal optic may include a dichroic filter, a blocking filter, a confocal pinhole, an objective lens and a mirror to reduce the background signal.
라만 방출 신호는 신호를 카운팅하고 디지털화하는 컴퓨터와 인터페이스로 연결된 광다이오드를 포함하는 상기 라만 분광기에 의해 검출될 수 있다. 상기 라만 분광 기판을 이용하면, 상기 라만 분광기는 굳이 고성능의 라만 장비가 아니어도 저 사양의 휴대용 라만 장비를 이용하는 것도 가능하다. 상기 저 사양의 휴대용 라만 장비는 레이저 파워(Laser power)가 0 mW 내지 100 mW일 수 있고, 레이저 파장(excitation wavelength)가 780 nm 내지 790 nm일 수 있고, 상기 레이저 조사 시간은 20 msec 내지 9 sec일 수 있다.The Raman emission signal can be detected by the Raman spectroscopy comprising a photodiode interfaced with a computer that counts and digitizes the signal. If the Raman spectroscopy substrate is used, the Raman spectroscopy may use a portable Raman equipment of low specification even if it is not a high-performance Raman equipment. The low-end portable Raman equipment may have a laser power of 0 mW to 100 mW, a laser wavelength of 780 nm to 790 nm, and the laser irradiation time is 20 msec to 9 sec. Can be
또한, 상기 광원과 상기 라만 분광 기판 사이의 거리는 0 mm 내지 10 mm일 수 있고, 구체적으로 4 mm 내지 8 mm일 수 있다. 상기 광원과 상기 라만 분광 기판 사이의 거리가 4 mm 미만인 경우 광원인 레이저 빔이 퍼져서 초점이 안 맞을 수 있고, 8 mm를 초과하는 경우 광원인 레이저 빔이 다시 퍼져서 초점이 안 맞을 수 있다.In addition, the distance between the light source and the Raman spectroscopic substrate may be 0 mm to 10 mm, specifically 4 mm to 8 mm. When the distance between the light source and the Raman spectroscopy substrate is less than 4 mm, the laser beam as a light source may be out of focus, and when it exceeds 8 mm, the laser beam as a light source may be out of focus again.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 분석 방법은 상기 라만 분광 기판을 분석 대상물을 포함하는 시료에 노출시켜, 상기 라만 분광 기판의 리셉터 분자와 상기 분석 대상물 간의 결합을 유도하는 단계, 그리고 라만 분광법을 이용하여 상기 분석 대상물을 검출 또는 확인하는 단계를 포함한다.An analysis method according to another embodiment of the present invention exposes the Raman spectroscopy substrate to a sample containing an analyte, thereby inducing binding between the receptor molecule of the Raman spectroscopy substrate and the analyte, and Raman spectroscopy. And detecting or confirming the analyte.
상기 시료는 액체 또는 기체일 수 있으며, 상기 시료 내 분석 대상물은 라만 분광을 사용하여 측정될 수 있는 측정 대상 물질을 의미하는 것으로, 상기 리셉터 분자에 대하여 선택적 결합을 할 수 있는 모든 물질을 의미한다. 이때, 상기 리셉터 분자와 시료 내 특정물질의 선택적 결합이란 항원-항체, DNA-DNA, DNA-RNA, PNADNA, PNA-RNA, 금속-배위결합 등과 같은 일반적인 특이적 결합(specific binding)을 모두 포함할 수 있다.The sample may be liquid or gas, and the analyte in the sample means a substance to be measured that can be measured using Raman spectroscopy, and means any substance capable of selectively binding to the receptor molecule. In this case, the selective binding of the receptor molecule to a specific substance in a sample includes all general specific bindings such as antigen-antibody, DNA-DNA, DNA-RNA, PNADNA, PNA-RNA, and metal-coordination binding. Can.
상기 리셉터 분자에 상기 시료를 반응시키면, 상기 시료 내 분석 대상 물질과 상기 리셉터 분자는 선택적으로 결합하게 된다. 라만 분광을 이용하여 상기 리셉터 분자와 결합된 상기 분석 대상 물질이 나타내는 고유한 라만 피크(Raman Peak)의 세기를 측정함으로써, 상기 시료 내 상기 분석 대상 물질의 유무 및 농도를 측정할 수 있다.When the sample is reacted with the receptor molecule, the analyte in the sample and the receptor molecule are selectively bound. By using Raman spectroscopy to measure the intensity of a unique Raman Peak represented by the analyte to be bound to the receptor molecule, the presence and concentration of the analyte in the sample can be measured.
도 3은 상기 분석 방법을 모식적으로 나타낸 도면이다. 상기 도 3을 참고하면, 상기 라만 분광 기판(10)에 상기 시료(21)를 가하여, 상기 라만 분광 기판(10)의 리셉터 분자와 상기 분석 대상물 간의 결합을 유도한 후, 상기 라만 분광기(22)를 이용하여 상기 라만 분광 기판(10)에 빛(23)을 조사하고, 상기 라만 분광 기판(10)으로부터 반사된 광의 라만 분광을 측정함으로써, 상기 분석 대상물을 검출 또는 확인할 수 있다.3 is a view schematically showing the analysis method. Referring to FIG. 3, the
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail so that those skilled in the art to which the present invention pertains can easily practice. However, the present invention can be implemented in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.
[제조예 1: 다공성 증착막의 제조][Production Example 1: Preparation of porous deposition film]
(실시예 1)(Example 1)
하기 표 2에 표시한 조건으로 금(Au) 나노 구조체들을 실리콘 기판 위에 증착시켜 다공성 증착막을 제조하였다.A porous deposition film was prepared by depositing gold (Au) nanostructures on a silicon substrate under the conditions shown in Table 2 below.
(W)DC power
(W)
상기 제조된 다공성 증착막의 다공도 측정 결과를 도 4에 나타내었다.The porosity measurement results of the prepared porous deposition film are shown in FIG. 4.
[실험예 1][Experimental Example 1]
보통의 라만 장비는 현미경이 포함된 매우 고가의 장비이나, 본 실험에서는 휴대용 라만 장비를 이용하여, 상기 제조된 기판을 이용하여 특정 분자를 측정하는 최적화 조건을 찾아내는 실험을 진행하였다. 구체적으로, 근적외선 영역(785 nm)의 레이저 소스(laser source)로부터 레이저 빔(beam)이 샘플 표면에 주사하는데 주사 거리(Working distance)를 조절하여 측정 최적화를 진행하였다.Normal Raman equipment is a very expensive equipment including a microscope, but in this experiment, a portable Raman equipment was used to conduct an experiment to find the optimal conditions for measuring a specific molecule using the prepared substrate. Specifically, the laser beam from the laser source in the near-infrared region (785 nm) scans the sample surface, and the scanning distance is adjusted to optimize the measurement.
상기 제조예에서 제조된 기판에 라만용 형광 염료인 로다민 6G(Rhodamine 6G, R6G)를 1 mM 농도로 분주 후 10 μL 의 부피로 드랍 코팅(drop coating)하여 완전 건조시켜 고정화 하였다.Rhodamin 6G (Rhodamine 6G, R6G), which is a fluorescent dye for Raman, was dispensed at a concentration of 1 mM on the substrate prepared in the above Preparation Example, and then dropped and coated with a volume of 10 μL to completely dry and immobilized.
상기 로다민 6G가 고정화된 기판에 대하여, 휴대용 라만 장비(IDRaman Mini2.0, Ocean Optics社 제품)를 이용하여, 레이저 파워(laser power) 100 mW, 인테그레이션 시간(integration time) 100 msec에서, 레이저 빔의 샘플로의 주사 거리(working distance)를 각각 1 mm, 3 mm, 5 mm 및 7 mm로 조절하며 라만 신호를 측정하였고, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. For the substrate on which the rhodamine 6G is immobilized, a laser beam is used at a laser power of 100 mW and an integration time of 100 msec, using a portable Raman device (IDRaman Mini2.0, manufactured by Ocean Optics). The Raman signal was measured while adjusting the working distance to the samples of 1 mm, 3 mm, 5 mm, and 7 mm, respectively, and the results are shown in FIGS. 5 and 6.
상기 도 5는 상기 로다민 6G에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이고, 상기 도 6은 상기 도 5에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4, B5)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.5 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering for the rhodamine 6G, and FIG. 6 is a Raman corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4, B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. It is a graph that extracts only the intensity.
상기 도 5 및 도 6을 참고하면, 레이저 빔의 주사 거리(working distance)가 7 mm일 때가 모든 특성 밴드 중에서 가장 강한 라만 신호를 나타내는 것을 알 수 있으므로, 로다민 6G 측정시에는 레이저 빔의 주사 거리를 7 mm 로 측정하는 것이 가장 바람직함을 알 수 있다. Referring to FIGS. 5 and 6, it can be seen that when the laser beam has a working distance of 7 mm, it indicates the strongest Raman signal among all characteristic bands. It can be seen that it is most preferable to measure 7 mm.
[실험예 2][Experimental Example 2]
상기 실험예 1에서와 같이, 리셉터 분자로서 클론 번호 9-ER-N-B03_G05인 anti-HER2 압타머(Anti-HER2 aptamer)와 분석 대상물인 ECD HER2 단백질에 대한 측정 최적화 실험을 진행하였다. As in Experimental Example 1, measurement optimization experiments were performed on the anti-HER2 aptamer, clone number 9-ER-N-B03_G05, as an acceptor molecule and the ECD HER2 protein, which is an analyte.
상기 제조예에서 제조된 기판에 상기 anti-HER2 압타머와 ECD HER2 단백질을 고정화하고, 상기 anti-HER2 압타머와 ECD HER2 단백질이 각각 고정화된 기판에 대하여, 휴대용 라만 장비(IDRaman Mini2.0, Ocean Optics社 제품)를 이용하여, 레이저 파워(laser power) 100 mW, 인테그레이션 시간(integration time) 100 msec에서, 레이저 빔의 주사 거리(working distance, WD)를 각각 1 mm, 3 mm, 5 mm 및 7 mm로 조절하며 라만 신호를 측정하였고, 그 결과를 도 7 내지 도 10에 나타내었다. The anti-HER2 aptamer and the ECD HER2 protein are immobilized on the substrate prepared in the preparation example, and the portable Raman equipment (IDRaman Mini2.0, Ocean) for the substrate on which the anti-HER2 aptamer and ECD HER2 protein are immobilized respectively. Optics), the
상기 도 7은 상기 anti-HER2 압타머에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이고, 상기 도 8은 상기 도 7에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4, B5)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.7 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering for the anti-HER2 aptamer, and FIG. 8 corresponds to peaks (B1, B2, B3, B4, B5) considered as characteristic Raman bands in FIG. This is a graph that extracts only the Raman intensity.
상기 도 9는 상기 ECD HER2 단백질에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이고, 상기 도 10은 상기 도 9에서 특성 라만 밴드로 여겨지는 피크(B1, B2, B3, B4)에 해당하는 라만 강도만 추출한 그래프이다.9 is a result of measuring surface-enhanced Raman scattering for the ECD HER2 protein, and FIG. 10 is only Raman intensity corresponding to peaks (B1, B2, B3, B4) considered as characteristic Raman bands in FIG. 9. This is the extracted graph.
상기 도 7 내지 도 10을 참고하면, anti-HER2 압타머와 ECD HER2 단백질 같은 생체 재료의 라만 신호는 레이저 빔의 샘플로의 주사 거리(working distance)가 5 mm일 때 라만 신호가 가장 강한 것으로 나타났다. Referring to FIGS. 7 to 10, the Raman signal of a biomaterial such as anti-HER2 aptamer and ECD HER2 protein was found to have the strongest Raman signal when the working distance to the sample of the laser beam was 5 mm. .
또한, 본 발명의 기판은 상기 압타머, 단백질 마커의 특성 라만 밴드가 다른 것으로부터 분자 특이적 라만 밴드를 잘 나타내는 분자 특이적 라만 신호가 우수한 기판임을 알 수 있다.In addition, it can be seen that the substrate of the present invention is a substrate having an excellent molecular specific Raman signal that exhibits a molecular specific Raman band from the ones in which the characteristic Raman bands of the aptamer and protein marker are different.
[실험예 3][Experimental Example 3]
상기 제조예에서 제조된 기판 표면에 클론 번호 9-ER-N-B03_G05인 anti-HER2 압타머를 고정화하여, 단백질 마커인 ECD HER2 단백질을 검지하는 센서를 제작한 후, 휴대용 라만 장비(IDRaman Mini2.0, Ocean Optics社 제품)를 이용하여, 레이저 파워(laser power) 100 mW, 인테그레이션 시간(integration time) 100 msec에서, 레이저 빔의 주사 거리(working distance, WD)를 5 mm로 조절하며 라만 신호를 측정하였고, 그 결과를 도 11 내지 도 14에 나타내었다. After immobilizing the anti-HER2 aptamer of clone number 9-ER-N-B03_G05 on the surface of the substrate prepared in the preparation example, to prepare a sensor to detect the protein marker ECD HER2 protein, a portable Raman equipment (IDRaman Mini2. 0, using Ocean Optics), at a laser power of 100 mW and an integration time of 100 msec, the laser beam's working distance (WD) is adjusted to 5 mm and the Raman signal is Measurement was made, and the results are shown in FIGS. 11 to 14.
이때, 상기 압타머는 말단을 각각 아민기와 티올기로 치환시킨 후, 기판에 고정화하여 부착력을 비교하였다. At this time, the aptamer was replaced with an amine group and a thiol group, respectively, and then immobilized on a substrate to compare adhesion.
또한, 상기 기판 표면에 각각 증류수, 70 % 에탄올 및 100 % 에탄올을 도포한 후, 라만 신호를 측정하였다.In addition, after applying distilled water, 70% ethanol, and 100% ethanol to the substrate surface, Raman signals were measured.
상기 도 11 및 도 14는 아민기로 치환된 압타머를 부착한 경우에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이고, 도 13 및 도 14는 티올기로 치환된 압타머를 부착한 경우에 대하여 표면 증강 라만 산란을 측정한 결과이다.11 and 14 are the results of measuring the surface-enhanced Raman scattering in the case of attaching the aptamer substituted with an amine group, and FIGS. 13 and 14 show the surface-enhanced Raman in the case of attaching the aptamer substituted with a thiol group. It is the result of measuring the scattering.
상기 도 11 내지 도 14에서 hSERS 1201는 압타머를 부착하지 않은 기판에 대한 결과이고, Anti-HER2 Aptamer는 압타머를 부착한 경우에 대한 결과이고, Adding DI water, Adding 70 % EtOH, Adding 100 % EtOH는 압타머를 부착한 후, 각각 증류수, 70 % 에탄올 및 100 % 에탄올을 도포한 경우이다.In FIGS. 11 to 14,
또한, 상기 도 12 및 도 14는 각각 상기 도 11 및 도 13의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 고안하여 가시적으로 표현한 결과이다.In addition, FIGS. 12 and 14 are results obtained by visually designing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIGS. 11 and 13 by a heat mapping method.
상기 도 11 및 도 12를 참고하면, 상기 압타머 말단이 아민기로 치환된 압타머의 경우 고정화가 잘 이루어지지 않았으며, 기판 고유의 라만 밴드만 관찰되었다. 다만, 고정화 진행 후 에탄올 처리시 라만 밴드가 변화하는 양상을 보였으나, 아민기로 치환된 압타머의 경우 고정화에 문제가 있음을 나타낸다. 11 and 12, in the case of the aptamer where the aptamer end was substituted with an amine group, immobilization was not well performed, and only Raman bands unique to the substrate were observed. However, after the immobilization proceeded, the Raman band showed a change in ethanol treatment, but in the case of an aptamer substituted with an amine group, there was a problem in immobilization.
반면, 상기 도 13 및 도 14를 참고하면, 상기 압타머 말단이 티올기로 치환된 압타머의 경우 기판에 부착 후 압타머 고유의 라만 밴드를 나타냄을 알 수 있다. 이 실험 결과로부터 티올기로 치환된 압타머는 고정화가 매우 우수한 것을 알 수 있다. On the other hand, referring to FIGS. 13 and 14, it can be seen that in the case of the aptamer where the aptamer end is substituted with a thiol group, it shows a Raman band unique to the aptamer after attachment to the substrate. It can be seen from the results of this experiment that the aptamer substituted with a thiol group is very excellent in immobilization.
또한, 상기 에탄올 등의 용매를 처리함으로써 상기 압타머의 3 차원 헤어핀 구조(hairpin structure)에서 수소 결합을 끊어 1 차원 구조로 바꿈으로써 특성 라만 밴드들도 강화되는 것을 확인할 수 있다.In addition, it can be seen that the characteristic Raman bands are also enhanced by treating the solvent such as ethanol to break hydrogen bonds in the three-dimensional hairpin structure of the aptamer and converting it to a one-dimensional structure.
[실험예 4][Experimental Example 4]
상기 제조예에서 제조된 기판을 주사전자현미경(Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM)을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 15 내지 도 17에 나타내었다. 상기 도 15는 상기 기판을 위에서 관찰한 결과이고, 상기 도 16 및 도 17은 상기 기판의 단면을 관찰한 결과이다.The substrate prepared in the above manufacturing example was observed using a scanning electron microscope (Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM), and the results are shown in FIGS. 15 to 17. 15 is a result of observing the substrate from above, and FIGS. 16 and 17 are results of observing a cross section of the substrate.
상기 도 15 내지 도 17을 참고하면, 상기 기판은 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하며, 상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상임을 알 수 있다. 이에 따라, 상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁고, 밀도가 더 높은 것을 알 수 있다.15 to 17, the substrate includes nanostructures made of nanocluster particles, and the nanostructures are branched into several branches from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate. It can be seen that the shape is. Accordingly, it can be seen that the spacing between the nanostructures is narrower and higher in the upper portion not in contact with the substrate than in the lower portion in contact with the substrate.
즉, 상기 기판은 표면에 다공도(porosity)가 존재하여 피 분석물을 임베딩(embedding)하는 효과가 있으며, 상기 압타머를 상기 기판 표면과 내부 공극들 사이로 모두 침투시켜 피 분석물의 라만 신호 검지 집적도를 높일 수 있음을 알 수 있다.That is, the substrate has an effect of embedding an analyte due to the presence of porosity on the surface, and the Raman signal detection density of the analyte is penetrated by penetrating the aptamer between the substrate surface and internal pores. It can be seen that it can be increased.
[실험예 5][Experimental Example 5]
서로 다른 날짜, 서로 다른 배치(batch)에서 제작된 서로 다른 기판 샘플인 hSERS 909, hSERS 1177, hSERS 1179를 이용하여 압타머 검지시 라만 밴드를 측정하였고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.Raman bands during aptamer detection were measured using
또한, 상기 서로 다른 기판 hSERS 909, hSERS 1177, hSERS 1179을 에탄올 및 증류수를 이용하여 후처리한 후 압타머 검지시 라만 밴드를 측정하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.In addition, after the
상기 도 18 및 도 19를 참고하면, 상기 기판은 압타머 자체의 특성 라만 밴드가 동일하게 관찰되고, 에탄올 및 증류수를 이용하여 후처리시에도 압타머 고유의 라만 밴드가 동일하게 관찰되므로, 재현성이 우수한 기판임을 확인할 수 있다.18 and 19, the substrate has the same characteristic Raman band of the aptamer itself, and the Raman band unique to the aptamer is also observed during post-treatment using ethanol and distilled water. It can be confirmed that it is an excellent substrate.
[실험예 6][Experimental Example 6]
상기 실험예 3에서 제조된 기판을 이용하여, ECD HER2 단백질의 함량을 하기 표 3과 같이 변화시키며 라만 신호를 측정하였고, 그 결과를 하기 도 20 내지 도 23에 나타내었다.Using the substrate prepared in Experimental Example 3, the content of ECD HER2 protein was changed as shown in Table 3 below, and Raman signals were measured, and the results are shown in FIGS. 20 to 23 below.
상기 도 20 내지 도 23에서, Anti-HER2 aptamer 7 pmole / dual solvent treated(Aptamer/solvent)는 기판에 Anti-HER2 압타머 7 pmole을 고정화 이후에 100% 에탄올 및 증류수의 2 가지 종류의 용매(dual solvent)로 처리를 한 경우이고, ECD HER2 Protein은 ECD HER2 단백질만을 적용한 경우이고, 샘플 A, B, C, D는 각각 상기 압타머와 상기 단백질의 중량비를 하기 표 3에서와 같이 변화시킨 경우이다.In FIGS. 20 to 23, the
또한, 상기 도 20 및 도 21은 에탄올과 증류수를 이용하여 워싱(Washing)하기 전의 결과이고, 상기 도 22 및 도 23은 에탄올과 증류수를 이용하여 워싱(Washing)한 후의 결과이다.20 and 21 are results before washing with ethanol and distilled water, and FIGS. 22 and 23 are results after washing with ethanol and distilled water.
또한, 상기 도 21 및 도 23은 상기 도 20 및 도 22의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 고안하여 가시적으로 표현한 결과이다.In addition, FIGS. 21 and 23 are results obtained by visually designing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIGS. 20 and 22 by a heat mapping method.
상기 도 20 내지 도 23을 참고하면, 에탄올과 증류수를 이용하여 워싱(Washing)하기 전에는, 870 cm-1 영역의 특성 라만 밴드의 신호의 세기가 ECD HER2 단백질(IV)의 농도에 따라 줄어드는 것을 알 수 있다. 이로써, 상기 기판은 피검사체의 정량적 분석이 가능한 센서로 사용할 수 있음을 알 수 있다.20 to 23, before washing with ethanol and distilled water, it was found that the intensity of the signal of the characteristic Raman band in the 870 cm -1 region decreases according to the concentration of ECD HER2 protein (IV). Can. Thus, it can be seen that the substrate can be used as a sensor capable of quantitative analysis of the subject.
[실험예 7][Experimental Example 7]
상기 실험예 3에서 제조된 기판을 이용하여, 알부민(Bovine serum albumin, BSA)의 검출을 시험하였고, 그 결과를 도 24 내지 도 28에 나타내었다.Using the substrate prepared in Experimental Example 3, the detection of albumin (Bovine serum albumin, BSA) was tested, and the results are shown in FIGS. 24 to 28.
상기 도 24 내지 도 28에서 Anti-HER2 aptamer 7 pmole(Apt)는 기판에 Anti-HER2 압타머 7 pmole을 고정화한 경우이고, Anti-HER2 aptamer / dual solvent treated(Apt/solvent)는 기판에 Anti-HER2 압타머 7 pmole을 고정화 이후에 100% 에탄올 및 증류수의 2 가지 종류의 용매(dual solvent)로 처리를 한 경우이고, BSA 7 pmole(BSA)는 BSA를 2 μL 도포 후 5 분 동안 건조하여 7 pmole의 BSA를 고정화한 경우이고, BSA / dual solvent treated(BSA/solvent)는 기판에 7 pmole의 BSA를 고정화 이후에 100% 에탄올 및 증류수의 2 가지 종류의 용매(dual solvent)로 처리를 한 경우이고, Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole(Apt+BSA)은 Anti-HER2 압타머 7 pmole과 BSA 7 pmole을 고정화한 경우이고, Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole / dual solvent treated(Apt+BSA/solvent)는 Anti-HER2 압타머 7 pmole과 BSA 7 pmole을 고정화 이후에 100% 에탄올 및 증류수의 2 가지 종류의 용매(dual solvent)로 처리를 한 경우이다. In FIGS. 24 to 28,
상기 도 20 내지 도 23에서, ECD HER2 Protein은 ECD HER2 단백질만을 적용한 경우이고, 샘플 A, B, C, D는 각각 상기 압타머와 상기 단백질의 중량비를 하기 표 3에서와 같이 변화시킨 경우이다.20 to 23, ECD HER2 Protein is a case where only ECD HER2 protein is applied, and Samples A, B, C, and D are cases where the weight ratios of the aptamer and the protein are changed as shown in Table 3 below.
이 중 상기 도 25, 도 26 및 도 28은 Anti-HER2 aptamer / dual solvent treated(Apt/solvent), Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole(Apt+BSA) 및 Anti-HER2 aptamer 7 pmole + BSA 7 pmole / dual solvent treated(Apt+BSA/solvent)에 대한 결과만을 나타낸 결과이다.Of these, FIGS. 25, 26 and 28 are Anti-HER2 aptamer / dual solvent treated (Apt/solvent),
또한, 상기 도 27 및 도 28은 각각 상기 도 24 및 도 25의 라만 스펙트럼에서 특성 라만 밴드를 히트 맵핑(HEAT mapping) 방식으로 고안하여 가시적으로 표현한 결과이다.In addition, FIGS. 27 and 28 are results obtained by visually designing a characteristic Raman band in the Raman spectrum of FIGS. 24 and 25 in a heat mapping method.
상기 도 24 내지 도 28을 참고하면, 압타머가 없는 기판에 BSA를 2 μL 도포 후 5 분 동안 건조한 후 라만 분광 측정하면, 고분자량의 단백질 시료인 BSA는 첨형 형태의 특성 밴드는 관찰하기 어려운 형태의 그래프이나 다른 단백질들과 구분할 수 있는 특성 밴드를 가진다(도 24의 파란색 선). 이 후 100 % 에탄올 처리와 증류수 세척 후 BSA의 고유의 피크(peak)인 1004 cm-1가 확연히 관찰되었다. 피분석물인 BSA가 워싱(washing) 과정 상에서 기판의 은 나노 구조체 사이로 임베딩(embedding)되는 결과도 확인하였다. Referring to FIGS. 24 to 28, after applying 2 μL of BSA to an aptamer-free substrate and drying for 5 minutes, Raman spectroscopy measures, BSA, a high-molecular weight protein sample, has a characteristic band that is difficult to observe. It has a characteristic band that can be distinguished from graphs or other proteins (blue line in FIG. 24). After this, after 100% ethanol treatment and distilled water washing, 1004 cm -1, which is an intrinsic peak of BSA, was clearly observed. It was also confirmed that the analyte BSA was embedded between the silver nanostructures of the substrate during the washing process.
또한, anti-HER2 압타머가 있는 기판 위에 BSA 도포시 850 cm-1 내지 950 cm-1 사이에서 BSA의 라만 밴드 관찰할 수 있었다. 에탄올, 증류수로 워싱(washing)하면 850 cm-1 내지 950 cm-1 영역의 BSA의 라만 밴드를 관찰할 수 없으며, 압타머 고유의 밴드만 관찰됨을 확인하였다. 즉, 압타머가 존재하는 기판에서 BSA는 증류수 세척 과정 상에서 씻겨 내려가는 것을 확인하였으며, 비표적 알부민 시료의 비선택성 검증 완료하였다.In addition, Raman band of BSA was observed between 850 cm -1 and 950 cm -1 when BSA was applied on a substrate with anti-HER2 aptamer. It was confirmed that when washing with ethanol and distilled water, the Raman band of the BSA in the 850 cm -1 to 950 cm -1 region could not be observed, and only the aptamer-specific band was observed. That is, in the substrate where the aptamer is present, it was confirmed that the BSA was washed down in the distilled water washing process, and the non-selectivity of the non-target albumin sample was verified.
이상에서 본 명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.Although the embodiments of the present invention have been described in detail above, the scope of the present invention is not limited to this, and it is possible in the art that various modifications and variations are possible without departing from the technical spirit of the present invention as set forth in the claims. It will be obvious to those with ordinary knowledge of
10: 라만 분광 기판
11: 기판
12: 나노 구조체들
13: 리셉터 분자
21: 시료
22: 라만 분광기
23: 빛
120: 증착용 기판
700: 나노 구조체들10: Raman spectroscopic substrate
11: Substrate
12: Nano structures
13: Receptor molecule
21: sample
22: Raman spectroscopy
23: Light
120: substrate for deposition
700: nanostructures
Claims (10)
상기 기판 위에 위치하며, 나노 클러스터 입자들로 이루어진 나노 구조체들을 포함하는 다공성 증착막, 그리고
상기 다공성 증착막 위에 위치하는 리셉터 분자를 포함하며,
상기 나노 구조체들은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상으로,
상기 나노 구조체들 사이의 간격은 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁은 것인 라만 분광 기판.Board,
A porous deposition film positioned on the substrate and including nano-structures composed of nano-cluster particles, and
It includes a receptor molecule located on the porous deposition film,
The nanostructures are divided into several branches in a downward direction in contact with the substrate in an upward direction not in contact with the substrate.
The spacing between the nanostructures is a Raman spectroscopy substrate that is narrower at the top not contacting the substrate than at the bottom contacting the substrate.
상기 리셉터 분자는 아민기, 티올기 및 카테콜기로 이루어진 군에서 선택되는 관능기로 치환된 압타머이고,
상기 압타머는 상기 관능기에 의하여 상기 나노 구조체들에 부착되는 것인 라만 분광 기판.According to claim 1,
The receptor molecule is an aptamer substituted with a functional group selected from the group consisting of amine groups, thiol groups and catechol groups,
The aptamer is attached to the nanostructures by the functional group Raman spectroscopic substrate.
상기 압타머는 HER2(Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2)에 특이적으로 결합하는 압타머인 것인 라만 분광 기판.The method of claim 3,
The aptamer is a Raman spectroscopic substrate that is an aptamer specifically binding to HER2 (Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2).
상기 라만 분광 기판은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 더 포함하는 것인 라만 분광 기판.According to claim 1,
The Raman spectroscopy substrate further comprises a solvent selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposition film, the nanostructures, and both. Raman spectroscopy substrate containing.
(a) 상기 클러스터 소스 내에서 플라즈마(plasma)를 형성한 후 핵 형성(nucleation)을 실행하는 단계,
(b) 상기 클러스터 소스 내에서 응축(condensation)을 통한 응집(aggregation) 및 나노 클러스터 입자의 크기를 제어하는 단계,
(c) 상기 클러스터 소스에 마련된 노즐의 개구를 통해 상기 단계 (b)에서 성장된 나노 클러스터 입자를 프로세스 챔버로 배출하는 단계, 및
(d) 상기 프로세스 챔버 내에 인가되는 압력을 제어하여 증착용 기판 상에 나노 클러스터 입자의 합체(coalescence)를 실행하여 나노 구조체들을 상기 기판과 접하고 있는 하부에서 상기 기판과 접하고 있지 않은 상부 방향으로 여러 갈래로 갈라져 분지된 형상으로 성장시키되, 초기 압력을 후기 압력 보다 더 크게 제어하여, 상기 나노 구조체들 사이의 간격이 상기 증착용 기판과 접하고 있는 하부에서 보다 상기 증착용 기판과 접하고 있지 않은 상부에서 더 좁아지도록 상기 나노 구조체들을 성장시키는 단계,
상기 다공성 증착막 위에 리셉터 분자를 부착시키는 단계
를 포함하는 라만 분광 기판의 제조 방법.A step consisting of the following steps (a) to (d) of manufacturing a porous deposition film on a substrate using a sputtering apparatus having a process chamber and a cluster source; And
(a) forming a plasma in the cluster source and then performing nucleation,
(b) controlling aggregation and size of nanocluster particles through condensation in the cluster source,
(c) discharging the nanocluster particles grown in step (b) into a process chamber through an opening of a nozzle provided in the cluster source, and
(d) Controlling the pressure applied to the process chamber to perform coalescence of nano-cluster particles on the substrate for deposition to divert the nanostructures from the bottom contacting the substrate to the top not contacting the substrate. Split into a branched shape to grow, but by controlling the initial pressure greater than the late pressure, the spacing between the nanostructures is narrower at the top not contacting the deposition substrate than at the bottom contacting the deposition substrate. Growing the nanostructures to be,
Attaching a receptor molecule on the porous deposition film
Method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate comprising a.
상기 (d) 단계에서의 초기 압력은 10 mTorr 내지 50 mTorr이고, 후기 압력은 0.01 mTorr 내지 10 mTorr인 것인 라만 분광 기판의 제조 방법.The method of claim 6,
The initial pressure in step (d) is 10 mTorr to 50 mTorr, and the late pressure is 0.01 mTorr to 10 mTorr.
상기 라만 분광 기판의 제조 방법은 상기 다공성 증착막의 표면, 상기 나노 구조체들의 사이 및 이 둘 모두로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에 물, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 용매를 처리하는 단계를 더 포함하는 것인 라만 분광 기판의 제조 방법.The method of claim 6,
The method of manufacturing the Raman spectroscopic substrate is any one selected from the group consisting of water, alcohol, and mixtures thereof at a position selected from the group consisting of both the surfaces of the porous deposited film, between the nanostructures, and both. The method of manufacturing a Raman spectroscopic substrate further comprising the step of treating a solvent.
상기 라만 분광 기판에 빛을 조사하는 광원, 그리고
상기 라만 분광 기판으로부터 반사된 광의 라만 분광을 측정하는 라만 분광기
를 포함하는 분석 장치.Raman spectroscopic substrate according to claim 1,
A light source irradiating light to the Raman spectroscopic substrate, and
Raman spectroscopy for measuring Raman spectroscopy of light reflected from the Raman spectroscopy substrate
Analysis device comprising a.
라만 분광법을 이용하여 상기 분석 대상물을 검출 또는 확인하는 단계
를 포함하는 분석 방법.A step of exposing the Raman spectroscopic substrate according to claim 1 to a sample containing an analyte, thereby inducing binding between the receptor molecule of the Raman spectroscopic substrate and the analyte, and
Detecting or confirming the analyte using Raman spectroscopy
Analysis method comprising a.
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