WO2020079216A1 - Verfahren zur bestimmung des brechungsindex eines optischen mediums in einem mikroskop und mikroskop - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des brechungsindex eines optischen mediums in einem mikroskop und mikroskop Download PDF

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WO2020079216A1
WO2020079216A1 PCT/EP2019/078350 EP2019078350W WO2020079216A1 WO 2020079216 A1 WO2020079216 A1 WO 2020079216A1 EP 2019078350 W EP2019078350 W EP 2019078350W WO 2020079216 A1 WO2020079216 A1 WO 2020079216A1
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measurement light
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reflection light
reflection
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Christian Schumann
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G01N21/21—Polarisation-affecting properties

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the refractive index of an optical medium's in a microscope, which has a lens facing a sample space, the optical medium with the refractive index to be determined in the sample space adjacent to one of two opposite surfaces of a cover glass and thereby a partially reflective Interface forms.
  • the invention further relates to a microscope with a device for determining the refractive index of the optical medium.
  • the light microscopic image of a sample is influenced by the various optical media that are adjacent to each other in a sample space of a microscope. As a result of their different refractive indices, these optical media form boundary surfaces at which the refractive index changes abruptly. Each of these interfaces has a different effect on the optical image, depending on how large the refractive index jump is there.
  • the spherical aberration in particular is significantly influenced by the abrupt variation in the refractive index.
  • the optical media influencing the image usually include a cover glass and the two optical media which adjoin the cover glass from opposite sides. The latter are formed, for example, by an immersion medium, which is located between the cover glass and the objective, and an embedding medium surrounding the sample.
  • the refractive indices of the optical media used In order to enable an effective correction of the aberrations, which are influenced by a sudden variation in the refractive index, it is important to know the refractive indices of the optical media used.
  • the refractive indices of the cover slip and the immersion medium are often known from the start with high accuracy. However, this does not apply to the refractive index of the Sample surrounding mounting medium. This refractive index should therefore be determined in a dedicated measurement outside or inside the microscope.
  • a measurement of the refractive index outside the microscope is associated with the imponderability of a sample preparation that takes place after the measurement.
  • a correlation of the measurement value obtained outside the microscope with the refractive index that is actually effective in the light microscopic image cannot be ensured. So in some applications, e.g. B. in living cell microscopy, the refractive index of the embedding medium is significantly influenced by the sample and is therefore not measurable with sufficient accuracy outside of the microscopic preparation.
  • TIRF internal total reflection microscopy
  • This TIRF microscope includes a lens through which the sample is exposed to evanescent illumination. The illumination light totally reflected on the sample is detected by a detector. The angle of incidence of the total reflection is determined on the basis of the transition at which the intensity of the illumination light reflected from the sample drops from a maximum value to zero. The refractive index is then determined on the basis of the angle of incidence.
  • an immersion objective with a high numerical aperture in order to be able to illuminate the sample with total reflection.
  • Such a lens is complex to manufacture and therefore expensive.
  • a triangulating autofocus device for a microscope is disclosed.
  • This autofocus device creates a slit image on the sample, which is imaged on a position-sensitive detector.
  • the autofocus is controlled via the incidence position detected by the detector. It is an object of the invention to provide a method for determining the refractive index of an optical medium in a microscope and a microscope, which enable simple and precise determination of the refractive index of an optical medium.
  • the method according to the invention is used to determine the refractive index of an optical medium in a microscope which has a lens facing a specimen space, the optical medium with the refractive index to be determined in the specimen space bordering on one of two opposite surfaces of a cover slip and thereby a partially reflecting one Interface forms.
  • at least one first measurement light bundle and a second measurement light bundle are generated in succession, the first measurement light bundle and the second measurement light bundle having polarization states that differ from one another.
  • the first measuring light bundle and the second measuring light bundle are each directed through the lens at an oblique angle onto the cover glass.
  • Two reflection light bundles are generated by partially reflecting the first measurement light bundle and the second measurement light bundle at the interface.
  • the first reflection light bundle and the second reflection light bundle are each received by the lens and directed onto a detector.
  • the intensities of the first reflection light beam and the second reflection light beam are detected by means of the detector.
  • the refractive index of the optical medium is determined on the basis of the detected intensities of the first reflection light bundle and the second reflection light bundle.
  • the intensities of the first reflection light bundle and the second reflection light bundle depend on the reflection and the transmission of the first measurement light bundle or of the second measurement light bundle at the interface, which are defined by the cover glass and the optical medium.
  • the reflection and transmission processes, on which ultimately the intensities of the two successive reflection light bundles are based, are essentially determined by the refractive indices of the cover glass and the optical medium adjacent to the cover glass and the respective polarization state of the first measurement light bundle or the second measurement light bundle. If the refractive index of the cover slip and the polarization state of the first or second measuring light bundle are known, the refractive index of the optical medium can be reliably determined from the intensities detected by the detector.
  • the method according to the invention requires only a single partially reflecting interface. This is particularly advantageous if only an interface is formed by the surfaces of the cover slip because, for example, the jump in refractive index between the cover slip and an immersion oil introduced between the cover slip and the lens is too small. If the jump in the refractive index is too small, reflections with respect to transmissions are suppressed, so that it is not possible to generate the first measurement light bundle or the second measurement light bundle at this interface. On the other hand, small jumps in refractive index that do not lead to measurable reflections are not a source of spherical aberration and are therefore irrelevant for the image quality.
  • the invention enables a simple and precise determination of the refractive index of an optical medium within the microscope. This can be used profitably to set additional microscope parameters.
  • the invention enables automation of a correction setting provided on the microscope objective for different embedding media, for example by automatically controlling a correction lens contained in the microscope objective as a function of the determined refractive index. It is also possible to model a spread spectrum function as part of a deconvolution depending on the refractive index determined.
  • the refractive index of the optical medium is determined as a function of the refractive index of the cover slip and the numerical aperture of the first measuring light bundle and the second measuring light bundle. The numerical aperture of the first measuring light bundle and the second measuring light bundle can be determined via the focal length of the objective and the position of the measuring light bundle in the objective pupil.
  • the degrees of reflection and transmission, the refractive indices of the cover slip and the optical medium, the numerical aperture of the first measurement light bundle or the second measurement light bundle and the polarization state of the first measurement light bundle or the second measurement light bundle are linked to one another via the Fresnel formulas.
  • the degrees of reflection and transmission can be determined on the basis of the intensities of the two successive reflection light bundles. If the refractive index of the cover slip, the numerical aperture of the first measuring light bundle or the second measuring light bundle and the polarization state of the first measuring light bundle or the second measuring light bundle are known, the refractive index of the optical medium can be easily calculated using the Fresnel formulas.
  • the refractive index of the optical medium is determined on the basis of the ratio of the intensities of the first reflection light bundle and the second reflection light bundle.
  • the measurement of the refractive index according to the invention is, as it were, self-referential. This means that the refractive index can be determined independently of the intensity of the first measurement light bundle or second measurement light bundle, i.e. no knowledge of this intensity is required.
  • a third measuring light bundle is generated on the first measuring light bundle or the second measuring light bundle, one of which has first measurement light bundle and second measurement light bundle different polarization status.
  • the third beam of measurement light is directed through the lens onto the cover glass at an oblique angle.
  • a third reflection light bundle is generated in which the third measurement light bundle is partially reflected at the interface.
  • the third reflected light beam is received by the lens and directed to the detector.
  • the intensity of the third reflection light bundle is detected by means of the position-sensitive detector.
  • the refractive index of the optical medium is determined as a complex number on the basis of the detected intensities of the first to third reflection light bundles.
  • the complex portion of the refractive index of the optical medium which is written as a complex number, is a measure of the absorption of light by the optical medium.
  • the refractive index of the optical medium can be determined therefrom as a complex number, while in the event that only the intensities of two of the three reflection light bundles are detected, only that Amount of the refractive index can be determined.
  • the first measurement light bundle, second measurement light bundle and / or third measurement light bundle are preferably directed into a partial area of an entrance pupil of the objective which is offset with respect to the center of the entrance pupil.
  • the entrance pupil of the lens is decentrally illuminated by the first measuring light bundle, second measuring light bundle and / or third measuring light bundle, so that the first measuring light bundle, second measuring light bundle or third measuring light bundle are positioned obliquely to its optical axis when exiting the lens.
  • This also defines a plane of incidence of the first measurement light bundle, second measurement light bundle or third measurement light bundle, relative to which the polarization state of the respective measurement light bundle is defined.
  • the first reflection light bundle, second reflection light bundle and / or third reflection light bundle are then preferably directed back into the lens in such a way that they penetrate another part of the entrance pupil in the direction opposite to the direction of propagation of the first measurement light bundle, second measurement light bundle and / or third measurement light bundle is offset from the aforementioned partial area of the entrance pupil.
  • the optical medium is preferably an embedding medium for a sample which borders on one of the two surfaces of the cover slip.
  • the microscope according to the invention has a sample space with a cover glass and an optical medium, a lens facing the sample space, a partially reflecting interface which is arranged in the sample space and is formed in that the optical medium in the sample space on one of two opposite surfaces of the cover glass limits, and a device for determining the refractive index of the optical medium.
  • the device is designed to generate at least one first measurement light bundle and a second measurement light bundle in time sequence, where the first measurement light bundle and the second measurement light bundle have different polarization states from one another.
  • the device is designed to direct the first measuring light bundle and the second measuring light bundle through the lens under oblique incidence onto the cover glass.
  • the device is designed to generate two reflection light bundles by partially reflecting the first measurement light bundle and the second measurement light bundle at the interface.
  • the device has a detector and is designed to receive the first reflection light beam and the second reflection light beam through the lens and to direct it to the detector.
  • the detector is designed to detect the intensities of the first reflection light bundle and the second reflection light bundle.
  • the device further comprises a determination unit which is designed to determine the refractive index of the optical medium on the basis of the detected intensities of the first reflection light bundle and the second reflection light bundle.
  • the device has a multi-part polarization element for preparing the polarization states of the first measurement light beam and the second measuring light beam.
  • the multi-part polarization element has at least two, preferably three regions, which are each only transparent to light with different polarization states.
  • the multi-part polarization element can be introduced, for example, in or near a pupil plane of the lens.
  • the multi-part polarization element can be arranged in a receiving device for a lens-side Nomarski prism for differential interferential contrast microscopy. Such recording devices are available in many commercial microscopes in different embodiments.
  • the device preferably has an aperture diaphragm with an aperture opening which is arranged decentrally at a distance from the optical axis of the objective.
  • the aperture diaphragm limits the cross-section of the first measurement light bundle and the second measurement light bundle in such a way that the latter illuminate the entrance pupil of the objective in a decentralized manner and thereby exit the objective at an angle to the optical axis.
  • the decentralized illumination of the entrance pupil of the lens has the advantage that beam portions close to the axis are avoided, which cause so-called reflections of the first order, which are most pronounced on the surface vertices of the lenses forming the lens, and worsen the signal-to-noise ratio.
  • the plane of incidence of the respective measurement light bundle is defined as a reference for the direction of polarization of the respective measurement light bundle by the decentralized backlighting.
  • the determination unit has a memory in which parameters for determining the refractive index of the optical medium can be stored. This makes it possible, for example, to keep the parameters relevant for the determination of the refractive index for a large number of microscope components which, depending on the application, are optionally used in the microscope. For example, the refractive indices of different immersion media and different cover glasses as well as the optical data of different lenses can be saved and read out as needed to determine the refractive index sought.
  • the opposite surfaces of the cover slip are preferably formed plane-parallel to one another.
  • the device according to the invention is also suitable for use in the microscope as an autofocus device.
  • the device offers the possibility of determining, in addition to the refractive index of an optical medium, other variables influencing the light microscopic image, such as the thickness and / or the tilting of the cover slip.
  • the invention is applicable to a variety of microscope types, e.g. inverse or upright transmitted light microscopes.
  • Figure 1 is a schematic representation of an inverted transmitted light microscope as the first embodiment
  • FIG. 2 shows a device for determining the refractive index of an optical medium, which is part of the microscope according to FIG. 1;
  • Figure 3 is a schematic representation of a multi-part polarization element, which is part of the device of Figure 2, as a first embodiment
  • FIG. 4a shows a schematic illustration of the multi-part polarization element according to FIG. 3 in an exemplary first setting
  • FIG. 4b shows a schematic illustration of the multi-part polarization element according to FIG. 3 in an exemplary second setting
  • FIG. 4c shows a schematic illustration of the multi-part polarization element according to FIG. 3 in an exemplary third setting
  • Figure 5 is a schematic representation of the further multi-part polarization element, which is part of the device of Figure 2, as a second.sbei game;
  • FIG. 6a shows a schematic illustration of the multi-part polarization element according to FIG. 5 in an exemplary first setting
  • FIG. 6b shows a schematic illustration of the multi-part polarization element according to FIG. 5 in an exemplary second setting
  • FIG. 6c shows a schematic illustration of the multi-part polarization element according to FIG. 5 in an exemplary third setting
  • Figure 7 is a flowchart showing a specific embodiment of the method of the invention for determining the refractive index
  • FIG. 8 shows a schematic illustration of an upright transmitted-light microscope, which forms a second exemplary embodiment of the microscope according to the invention.
  • FIG. 1 shows a microscope 10 as the first exemplary embodiment to which the refractive index determination according to the invention is applicable.
  • the microscope 10 is designed as an inverse transmitted light microscope. It accordingly comprises a lens 12, one from below provided with the reference numeral 14 in FIG Is facing sample space, and a light source 16, which is directed from above onto the sample space 14.
  • the microscope 10 also has a tube 18 with an eyepiece 20 through which an operator can view a sample captured by the lens 12.
  • a control unit 22 is provided which controls the various microscope components.
  • a cover glass 24 for covering a sample not explicitly shown in FIG. 1.
  • an optical medium 26 in which the sample is embedded and which is referred to below as a bed medium 26.
  • An immersion medium 28 is also arranged in the sample space 14, which borders in FIG. 1 on the lens 12 from above and on the cover glass 24 from below.
  • the microscope 10 also has a device, generally designated by the reference symbol 30 in FIG. 1, which serves to determine the refractive index of the embedding medium 26 receiving the sample.
  • the device is shown in more detail in Figure 2.
  • the device 30 has a light source 32 which emits an unpolarized light bundle 34.
  • the light source 32 is, for example, an LED, which has a slit diaphragm 33 through which the unpolarized light bundle 34 is directed to a lighting optics 36.
  • the unpolarized light bundle 34 falls on an aperture diaphragm 38 which is positioned centrally on the optical axis Ol of the illumination optics 36 and has an aperture 39 which is arranged decentrally at a distance from the optical axis Ol of the illumination optics 36.
  • the aperture opening of the aperture diaphragm 38 limits the beam cross section of the unpolarized light bundle 34 such that only the part of the unpolarized light bundle 34 lying below the optical axis O1 of the illumination optics 36 in FIG. 2 passes the aperture diaphragm in the direction of a deflection prism 40.
  • the limited in its beam cross-section unpolarized light bundle 34 is reflected on the deflection prism 40 in a transport optics 42, which is formed from a along its optical axis 02 focusing lens 44, a light field aperture 46 and a further lens 48.
  • the unpolarized light bundle 34 falls on a dichroic beam splitter 50, which reflects light in the infrared wavelength range while transmitting light in the visible range.
  • the unpolarized light bundle 34 is reflected in the direction of the objective 12 by the dichroic mirror 50.
  • the unpolarized light bundle 34 reflected on the dichroic mirror 50 runs with a parallel offset to the optical axis 03 of the objective 12.
  • the unpolarized light bundle 34 is directed into a polarization device 52 which is arranged on the image side of a pupil plane 53 of the objective 12.
  • the polarization device 52 comprises an adjustable multi-part polarization element 64, which is described in more detail with reference to FIGS. 3, 4a, 4b, 4c, 5, 6a, 6b and 6c.
  • a second measurement light bundle 35b, with a second polarization state different from the first polarization state, and a third measurement light bundle 35c, with one of the first polarization state and the second polarization state, can be temporally following the first measurement light bundle 35a generate different third polarization state.
  • all three measurement light bundles 35a to 35c are shown in FIG. 2 as a single light bundle, designated 35.
  • the three measurement light bundles 35a to 35c are successively guided in each case in a partial area of an entrance pupil 52 of the objective 12, which is laterally offset from the optical axis 03 of the objective 12 and thus opposite the center of the entrance pupil 53.
  • the entrance pupil 53 of the objective 12 is thus illuminated decentrally, which means that the three measurement light bundles 35a to 35c are each directed obliquely to the optical axis 03 into the sample space 14.
  • the embedding medium 26 and the immersion medium 28 which adjoin the cover glass 24 from opposite sides in the sample space 14 are omitted in the illustration according to FIG.
  • the three measurement light bundles 35a to 35c guided under oblique incidence into the sample space 14 are reflected on the cover glass 24, which results in three successive reflection light bundles 54a to 54c, each of which is returned to the objective 12, which in the schematic view according to FIG only, with 54 designated light beams are Darge.
  • the three reflection light bundles 54a to 54c pass through the polarization device 52, which serves as an analyzer for the three reflection light bundles 54a to 54c.
  • the three reflection light bundles 54a to 54c fall onto the dichroic mirror 50, which directs the three reflection light bundles 54a to 54c into the transport optics 42.
  • the three reflection light bundles 54a to 54c fall onto the deflection prism 40, which reflects the three reflection light bundles 54a to 54c onto a detector optics 56.
  • the detector optics 56 directs the three reflection light bundles 54a to 54c to a spectral filter 58 which is only permeable to light in the wavelength range emitted by the light source 32 and blocks stray light outside this wavelength range.
  • the reflection light bundles 54a to 54c transmitted through the spectral filter 58 finally fall on a detector 60 which is able to detect the intensities of the three reflection light bundles 54a to 54c one after the other.
  • FIG. 2 also illustrates the coupling of the tube 18 to the device 30, which is implemented via the dichroic mirror 50.
  • the dichroic mirror 50 in the present exemplary embodiment is also used to transmit the detection light 62 used for the actual microscopic imaging, which guides the lens 12 from the sample space 14 in the direction of the dichroic mirror 50, to the tube 18 by transmission.
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of the multi-part polarization element, the part of the device of Figure 2, as the first embodiment.
  • the multi-part polarization element shown in FIG. 3 is referred to in the following with the reference symbol 64a.
  • the multi-part polarization element 64a is circular and has three regions 66a, 68a, 70a.
  • the three regions 66a, 68a, 70a are each only permeable to light with a certain polarization state.
  • a first region 66a of the three regions 66a, 68a, 70a is arranged on the far left in FIG. 3 and extends over 2/3 of the total area of the multi-part polarization element 64a.
  • the first region 66a is transparent to light with a polarization direction of 45 ° to an incidence plane of the three measurement light bundles 35a to 35ca, 35b, 35c on the cover glass 24, as is indicated in FIG. 3 by an arrow Pia.
  • a second region 68a of the three regions 66a, 68a, 70a is arranged on the right of the first region 66a in FIG. 3 and extends over 1/6 of the total area of the multi-part polarization element 64a.
  • the second region 68a is transparent to light with a polarization direction of 90 ° to the plane of incidence. This is indicated in Figure 3 by an arrow P2a.
  • a third area 70a of the three areas 66a, 68a, 70a is arranged in FIG. 3 to the right of the second area 68a and it extends over 1/6 of the total area of the multi-part polarization element 64a.
  • the third region 70a is transparent to light with a polarization direction of 0 ° to the plane of incidence, as is indicated in FIG. 3 by an arrow P3a.
  • FIG. 4a shows a schematic illustration of the multi-part polarization element 64a according to FIG. 3 in an exemplary first setting.
  • the multi-part polarization element 64a is arranged in the polarization device 52 such that both the first measurement light bundle 35a and the first reflection light bundle 54a generated by reflection of the first measurement light bundle 35a on the cover glass 24 strike the first region 66a of the multi-part polarization element 66a . Since the direction of polarization of light changes upon reflection at an interface and thus the first measurement light bundle 35a and the first reflection light bundle 54a have different polarization states, the first setting shown in FIG. 4a is a dark position, ie the first reflection light beam 54a cannot pass through the multi-part polarization element 64a. The region 66a of the polarization element 64a thus acts both as a polarizer for the first measurement light bundle 35a and as an analyzer for the first reflection light bundle 54a.
  • FIG. 4b shows a schematic illustration of the multi-part polarization element 64a according to FIG. 3 in an exemplary second setting.
  • the multi-part polarization element 64a is arranged in the polarization device 52 such that the second measurement light bundle 35b onto the second region 68a and the second reflection light bundle 54b generated by reflection of the second measurement light bundle 35b on the cover glass 24 onto the first region 66a of the multi-part Polarisa tion element 64a.
  • the region 68a of the polarization element 64a thus acts as a polarizer for the second measurement light bundle 35b, and the region 66a acts as an analyzer for the second reflection light bundle 54b.
  • FIG. 4c shows a schematic illustration of the multi-part polarization element 64a according to FIG. 3 in an exemplary third setting.
  • the multi-part polarization element 64a is arranged in the polarization device 52 such that the third measurement light bundle 35c on the third region 70a and the third reflection light bundle 54c generated by reflection of the third measurement light bundle 35c on the cover glass 24 on the first region 66a of the multi-part Impact polarization elements 64a.
  • the region 70a of the polarization element 64a thus acts as a polarizer for the third measurement light bundle 35c, and the region 66a acts as an analyzer for the third reflection light bundle 54c.
  • the second measurement light bundle 35b and the third measurement light bundle 35c can each have a different polarization state - in particular in the form of different polarization directions to the plane of incidence of the respective measurement light bundle 35b, 35c on the cover slip 24. Furthermore, a dark position can be realized, in which the first reflection light bundle 54a generated by reflection of the first measurement light bundle 35a on the cover glass 24 cannot pass through the multi-part polarization element 64a.
  • FIG. 5 shows a schematic representation of the multi-part polarization element, which is part of the device according to FIG. 2 and is provided with reference number 64, as a second exemplary embodiment.
  • the multi-part polarization element shown in FIG. 5 is given the reference symbol 64b below.
  • the multi-part polarization element 64b according to FIG. 5 has no dark position.
  • the multi-part polarization element 64b is circular and has four regions 66b, 68b, 70b, 72b, which are each only permeable to light with a specific polarization state.
  • a first region 66b of the four regions 66b, 68b, 70b, 72b is arranged on the far left in FIG. 5 and extends over 1/6 of the total area of the multi-part polarization element 64b.
  • the first region 66b is transparent to light with a polarization direction of -45 ° to the plane of incidence of the three measurement light bundles 35a to 35ca, 35b, 35c on the cover glass 24, as is indicated in FIG. 5 by an arrow Plb.
  • a second region 68b of the four regions 66b, 68b, 70b, 72b is arranged to the right of the first region 66b in FIG. 5 and extends over half the total area of the multi-part polarization element 64b.
  • the second region 68b is transparent to light with a polarization direction of 45 ° to the plane of incidence. This is indicated in Figure 3 by an arrow P2b.
  • a third region 70b of the four regions 66b, 68b, 70b, 72b is arranged on the right of the second region 68b in FIG. 5 and extends over 1/6 of the total area of the multi-part polarization element 64b.
  • the third region 70b is transparent to light with a polarization direction of 0 ° to the plane of incidence, as is indicated in FIG. 5 by an arrow P3b.
  • a fourth area 72b of the four areas 66b, 68b, 70b, 72b is shown in FIG. 5 on the right of the third area 70b. arranges and extends over 1/6 of the total area of the multi-part polarization element 64b.
  • the fourth area 72b is transparent to light with a polarization direction of 90 ° to the plane of incidence, as indicated by an arrow P4b in FIG.
  • FIG. 6a shows a schematic illustration of the multi-part polarization element 64b according to FIG. 5 in an exemplary first setting.
  • the multi-part polarization element 64b is arranged in the polarization device 52 such that the first measurement light bundle 35a onto the second region 68b and the first reflection light bundle 54a generated by reflection of the first measurement light bundle 35a on the cover glass 24 onto the first region 66b of the multi-part Polarization elements 64b hit.
  • the region 68b acts as a polarizer for the first measurement light bundle 35a
  • the region 66b acts as an analyzer for the first reflection light bundle 54a.
  • FIG. 6b shows a schematic illustration of the multi-part polarization element 64b according to FIG. 5 in an exemplary second setting.
  • the multi-part polarization element 64b is arranged in the polarization device 52 such that the second measurement light bundle 35b onto the third region 70b and the second reflection light bundle 54b generated by reflection of the second measurement light bundle 35b on the cover glass 24 onto the second region 68b of the multi-part Polarization elements 64b.
  • the region 70b acts as a polarizer for the second measurement light bundle 35b
  • the region 68b acts as an analyzer for the second reflection light bundle 54b.
  • FIG. 6c shows a schematic illustration of the multi-part polarization element 64b according to FIG. 5 in an exemplary third setting.
  • the multi-part polarization element 64b is arranged in the polarization device 52 such that the third measurement light bundle 35c is directed onto the fourth region 72b and the third generated by reflection of the third measurement light bundle 35c on the cover glass 24 Reflecting light bundles 54c impinge on the third region 70b of the multi-part polarization element 64b.
  • the area 68b acts as a polarizer for the third measurement light bundle 35c
  • the area 72b acts as an analyzer for the third reflection light bundle 54c.
  • the three measurement light bundle 35a, the second measurement light bundle 35b and the third measurement light bundle 35c, each with a different polarization state, can be realized by the three settings of the multi-part polarization element 64b according to FIG. 3 shown in FIGS. 6a to 6c - in particular realized in the form of different polarization directions to the incidence level of the respective measurement light bundle 35a, 35b, 35c on the cover glass 24.
  • FIG. 7 shows a flow chart which illustrates, purely by way of example, how the refractive index of the embedding medium 26 can be determined according to the invention.
  • a first step S1 the three measurement light bundles 35a to 35ca, 35b, 35c are successively guided through the objective 12 into the sample space 14. After passing through the immersion liquid 28, the three measurement light bundles 35a to 35c meet the cover glass 24 obliquely at an angle a.
  • the angle a can be obtained from the distance between the lens 12, the cover glass 24 and the numerical aperture of the respective measurement light bundle 35a, 35b, 35c be determined.
  • the numerical aperture 34 of the respective measuring light bundle 35a, 35b, 35c results from the focal length of the objective 12 and the position of the respective measuring light bundle 35a, 35b, 35c in the entrance pupil 53 of the objective 12 or based on the positioning of the aperture 39 of the aperture diaphragm 38 and the magnification with which the aperture diaphragm 38 is imaged into the entrance pupil 53 of the objective 12.
  • a second step S2 three reflection light bundles 54a, 54b, 54c are generated in succession by the partial reflections on a surface of the cover glass 24 facing the embedding medium 26.
  • the three reflection light bundles 54a, 54b, 54c are directed onto the detector 60. The three successive reflection light bundles 54a, 54b, 54c hit the detector 60 at different times.
  • a fourth step S4 the intensities of the three reflection light bundles 54a, 54b, 54c, hereinafter referred to as l a , l b and I c , are detected by the detector 60.
  • the refractive index of the embedding medium 26 is determined on the basis of the intensities of the three reflection light beams 54a, 54b, 54c. This is explained in more detail below.
  • the intensity / of the first, second and third reflection light bundles 54a, 54b, 54c detected by the detector 60 results as
  • n Imm , n Dgl and n Spc are the refractive index of the immersion medium 28, the cover slip 24 and the embedding medium 26, and NA is the numerical aperture of the first, second and third reflection light bundles 54a, 54b, 54c.
  • the polarization direction a a of the first and second reflection light bundles 54a, 54b Using the polarization direction a p of the first and second measurement light bundles 35a, 35b, the refractive index of the immersion medium n Imrn and the respective numerical aperture NA of the first and second measurement light bundles 35a, 35b solve the system of equations formed by the above equations (3) to (6) according to the amount of the refractive index n Spc of the embedding medium 26.
  • the complex refractive index can be obtained from the equation system formed by equations (3) to (6) n Spc of the embedding medium 26 be determined. This can be done, for example, by minimizing quadratic deviations in the intensities of the three reflection light bundles 54a, 54b, 54c measured by the detector in relation to a numerical simulation depending on the Refractive index n Spc of the embedding medium 26 take place.
  • FIG. 8 shows a microscope 74 which, in contrast to the microscope 10 shown in FIG. 1, is designed as an upright transmitted light microscope.
  • those microscope components that correspond to the components of the microscope 10 according to FIG. 1 are provided with the reference symbols already used in FIG. 1.
  • the objective 12 is arranged above the sample space 18, while the light source 16 is located below the sample space 18.
  • Polarization element 68, 70, 72 area

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Abstract

Ein Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums (26) in einem Mikroskop (10, 74), das ein einem Probenraum (14) zugewandtes Objektiv (12) aufweist, wobei das optische Medium (26) eine teilreflektierende Grenzfläche bildet, und wobei zeitlich aufeinanderfolgend wenigstens ein erstes Messlichtbündel (35a) und ein zweites Messlichtbündel (35b) erzeugt werden, wobei das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) voneinander verschiedene Polarisationszustände aufweisen, das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) jeweils durch das Objektiv (12) unter schrägem Einfall auf das Deckglas (24) gelenkt werden, zwei Reflexionslichtbündel (54a, 54b) erzeugt werden, indem das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden, das erste Reflexionslichtbündel und das zweite Reflexionslichtbündel (54a, 54b) jeweils durch das Objektiv (12) empfangen und auf einen Detektor (60) gelenkt werden, die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Reflexionslichtbündels (54b) mittels des Detektors (60) erfasst werden, und auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Reflexionslichtbündels (54b) der Brechungsindex des optischen Mediums ermittelt wird.

Description

Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums in einem
Mikroskop und Mikroskop
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines opti schen Mediums in einem Mikroskop, das ein einem Probenraum zugewandtes Objektiv aufweist, wobei das optische Medium mit dem zu bestimmenden Brechungsindex in dem Probenraum an eine von zwei entgegengesetzte Oberflächen eines Deckglases grenzt und dadurch eine teilreflektierende Grenzfläche bildet. Der Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop mit einer Einrichtung zur Bestimmung des Brechungsindex des optischen Mediums.
Die lichtmikroskopische Abbildung einer Probe wird durch die verschiedenen optischen Medien beeinflusst, die in einem Probenraum eines Mikroskops aneinandergrenzen. Diese optischen Medien bilden infolge ihrer unterschiedlichen Brechungsindizes Grenz flächen, an denen sich der Brechungsindex sprunghaft ändert. Jede dieser Grenzflä chen wirkt sich abhängig davon, wie groß der Sprung des Brechungsindex dort ist, un terschiedlich auf die optische Abbildung aus. Insbesondere die sphärische Aberration wird durch die sprunghafte Variation des Brechungsindex signifikant beeinflusst. Zu den die Abbildung beeinflussenden optischen Medien zählen üblicherweise ein Deck glas sowie die beiden optischen Medien, die von entgegengesetzten Seiten her an das Deckglas grenzen. Letztere sind beispielsweise durch ein Immersionsmedium, das sich zwischen dem Deckglas und dem Objektiv befindet, und ein die Probe umgebendes Einbettmedium gebildet.
Um eine wirksame Korrektion der Abbildungsfehler, die durch eine sprunghafte Varia tion des Brechungsindex beeinflusst werden, zu ermöglichen, ist es wichtig, die Bre chungsindizes der verwendeten optischen Medien zu kennen. Dabei sind häufig die Brechungsindizes des Deckglases und des Immersionsmediums von Vorneherein mit hoher Genauigkeit bekannt. Dies gilt jedoch nicht für den Brechungsindex des die Probe umgebenden Einbettmediums. Dieser Brechungsindex sollte deshalb in einer ei gens hierfür vorgesehenen Messung außerhalb oder innerhalb des Mikroskops ermit telt werden.
Eine Messung des Brechungsindex außerhalb des Mikroskops ist mit der Unwägbarkeit einer nach der Messung erfolgenden Probenpräparation verbunden. Eine Korrelation des außerhalb des Mikroskops gewonnenen Messwertes mit dem in der lichtmikrosko pischen Abbildung tatsächlich wirksamen Brechungsindex kann nicht sichergestellt werden. So wird in manchen Anwendungen, z. B. in der Lebendzellmikroskopie, der Brechungsindex des Einbettmediums signifikant von der Probe beeinflusst und ist so mit außerhalb der mikroskopischen Präparation gar nicht mit hinreichender Genauig keit messbar.
DE 10 2006 021 996 Al offenbart ein Mikroskop zur internen Totalreflexionsmikrosko pie, kurz TIRF, das eine Bestimmung des Brechungsindex innerhalb des Mikroskops er möglicht. Dieses TIRF-Mikroskop umfasst ein Objektiv, durch das die Probe mit einer evaneszenten Beleuchtung beaufschlagt wird. Das an der Probe totalreflektierte Be leuchtungslicht wird mittels eines Detektors erfasst. Anhand des Übergangs, an dem die Intensität des an der Probe reflektierten Beleuchtungslichts von einem maximalen Wert auf null abfällt, wird der Einfallswinkel der Totalreflexion bestimmt. Auf Basis des Einfallswinkels wird dann der Brechungsindex ermittelt. Eine derartige Bestimmung des Brechungsindex erfordert jedoch ein Immersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur, um die Probe unter Totalreflexion beleuchten zu können. Ein solches Objektiv ist aufwändig zu fertigen und somit teuer.
Zum Stand der Technik wird ferner auf DE 10 2010 030 430 Al verwiesen, worin eine triangulierende Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop offenbart ist. Diese Autofokus einrichtung erzeugt ein Spaltbild auf der Probe, das auf einen positionssensitiven De tektor abgebildet wird. Über die durch den Detektor erfasste Einfallsposition wird der Autofokus gesteuert. Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums in einem Mikroskop und ein Mikroskop anzugeben, die eine einfa che und präzise Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums ermögli chen.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 und das Mikroskop nach An spruch 7 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen an gegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Bestimmung des Brechungsindex eines op tischen Mediums in einem Mikroskop, das ein einem Probenraum zugewandtes Objek tiv aufweist, wobei das optische Medium mit dem zu bestimmenden Brechungsindex in dem Probenraum an eine von zwei entgegengesetzte Oberflächen eines Deckglases grenzt und dadurch eine teilreflektierende Grenzfläche bildet. Bei dem Verfahren wird zeitlich aufeinanderfolgend wenigstens ein erstes Messlichtbündel und ein zweites Messlichtbündel erzeugt, wobei das erste Messlichtbündel und das zweite Messlicht bündel voneinander verschiedene Polarisationszustände aufweisen. Das erste Mess lichtbündel und das zweite Messlichtbündel werden jeweils durch das Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deckglas gelenkt. Es werden zwei Reflexionslichtbündel er zeugt, indem das erste Messlichtbündel und das zweite Messlichtbündel jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden. Das erste Reflexionslichtbündel und das zweite Reflexionslichtbündel werden jeweils durch das Objektiv empfangen und auf ei nen Detektor gelenkt. Die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zwei ten Reflexionslichtbündels werden mittels des Detektors erfasst. Auf Grundlage der er fassten Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslicht bündels wird der Brechungsindex des optischen Mediums ermittelt.
Die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbün dels hängen von der Reflexion und der Transmission des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels an der Grenzfläche ab, die durch das Deckglas und das optische Medium definiert sind. Die Reflexions- und Transmissionsvorgänge, auf denen letztlich die Intensitäten der beiden zeitlich aufeinanderfolgenden Reflexionslichtbün del beruhen, werden wesentlich durch die Brechungsindizes des Deckglases sowie des an das Deckglas grenzenden optischen Mediums und den jeweiligen Polarisationszu stand des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels bestimmt. Ist der Brechungsindex des Deckglases sowie der Polarisationszustand des ersten bzw. zweiten Messlichtbündels bekannt, lässt sich der Brechungsindex des optischen Medi ums zuverlässig aus den durch den Detektor erfassten Intensitäten bestimmen.
Insbesondere erfordert das erfindungsgemäße Verfahren nur eine einzige teilreflektie rende Grenzfläche. Dies ist besonders dann von Vorteil, wenn durch die Oberflächen des Deckglases nur eine Grenzfläche gebildet wird, weil beispielsweise der Brechzahl sprung zwischen dem Deckglas und einem zwischen dem Deckglas und dem Objektiv eingebrachten Immersionsöl zu gering ist. Ist der Brechzahlsprung zu gering, werden Reflexionen gegenüber Transmissionen unterdrückt, so dass es nicht möglich ist, an dieser Grenzfläche das erste Messlichtbündel bzw. das zweite Messlichtbündel zu er zeugen. Geringe Brechzahlsprünge, die nicht zu messbaren Reflektionen führen, sind andererseits aber auch keine Quelle für sphärische Aberration und daher irrelevant für die Abbildungsqualität.
Die Erfindung ermöglicht eine einfache und präzise Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums innerhalb des Mikroskops. Dies kann gewinnbringend zur Einstellung weiterer Mikroskop-Parameter genutzt werden. Insbesondere ermöglicht die Erfindung eine Automatisierung einer am Mikroskopobjektiv vorgesehenen Korrek tionseinsteinstellung für unterschiedliche Einbettmedien, indem beispielsweise eine in dem Mikroskopobjektiv enthaltende Korrekturlinse in Abhängigkeit des ermittelten Brechungsindex automatisch angesteuert wird. Auch ist es möglich, eine Modellierung einer Punktspreizfunktion im Rahmen einer Dekonvolution in Abhängigkeit des ermit telten Brechungsindex vorzunehmen. In einer vorteilhaften Weiterbildung wird der Brechungsindex des optischen Mediums in Abhängigkeit des Brechungsindex des Deckglases und der numerischen Apertur des ersten Messlichtbündels und des zweiten Messlichtbündels ermittelt. Dabei können die numerische Apertur des ersten Messlichtbündels und des zweiten Messlichtbün dels über die Brennweite des Objektivs und die Position des Messlichtbündels in der Objektivpupille bestimmt werden.
Die Reflexions- und Transmissionsgrade, die Brechungsindizes des Deckglases und des optischen Mediums, die numerische Apertur des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels und der Polarisationszustand des ersten Messlichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels sind über die fresnelschen Formeln miteinander verknüpft. Die Reflexions- und Transmissionsgrade lassen sich auf Basis der Intensitä ten der beiden zeitlich aufeinanderfolgenden Reflexionslichtbündel bestimmen. Sind der Brechungsindex des Deckglases, die numerische Apertur des ersten Messlichtbün dels bzw. des zweiten Messlichtbündels und der Polarisationszustand des ersten Mess lichtbündels bzw. des zweiten Messlichtbündels bekannt, so kann der Brechungsindex des optischen Mediums über die fresnelschen Formeln einfach berechnet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Brechungsindex des optischen Medi ums auf Grundlage des Verhältnisses der Intensitäten des ersten Reflexionslichtbün dels und des zweiten Reflexionslichtbündels ermittelt. Dadurch ist die erfindungsge mäße Messung des Brechungsindex gleichsam selbstreferentiell. Dies bedeutet, dass der Brechungsindex unabhängig von der Intensität des ersten Messlichtbündels bzw. zweiten Messlichtbündels bestimmt werden kann, d.h. keine Kenntnis dieser Intensität erforderlich ist.
In einer vorteilhaften Weiterbildung wird zeitlich auf das erste Messlichtbündel oder das zweite Messlichtbündel ein drittes Messlichtbündel erzeugt, das einen von dem ersten Messlichtbündel und zweiten Messlichtbündel verschiedenen Polarisationszu stand aufweist. Das dritte Messlichtbündel wird durch das Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deckglas gelenkt. Es wird ein drittes Reflexionslichtbündel erzeugt, in dem das dritte Messlichtbündel zum Teil an der Grenzfläche reflektiert wird. Das dritte Reflexionslichtbündel wird durch das Objektiv empfangen und auf den Detektor ge lenkt. Die Intensität des dritten Reflexionslichtbündels wird mittels des positionssensi tiven Detektors erfasst. Auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten bis dritten Reflexionslichtbündels wird der Brechungsindex des optischen Mediums als komplexe Zahl ermittelt. Dabei ist der komplexe Anteil des als komplexe Zahl geschriebenen Bre chungsindex des optischen Mediums ein Maß für die Absorption von Licht durch das optische Medium ist. Für den Fall, dass die Intensitäten des ersten bis dritten Reflexi onslichtbündels erfasst werden, kann aus daraus der Brechungsindex des optischen Mediums als komplexe Zahl bestimmt werden, während für den Fall, dass nur die In tensitäten von zwei der drei Reflexionslichtbündel erfasst werden, nur der Betrag des Brechungsindex bestimmt werden kann.
Vorzugsweise werden das erste Messlichtbündel, zweite Messlichtbündel und/oder dritte Messlichtbündel in einen Teilbereich einer Eintrittspupille des Objektivs geleitet, der gegenüber der Mitte der Eintrittspupille versetzt ist. Auf diese Weise wird die Ein trittspupille des Objektivs durch das erste Messlichtbündel, zweite Messlichtbündel und/oder dritte Messlichtbündel dezentral unterleuchtet, wodurch das erste Mess lichtbündel, zweite Messlichtbündel bzw. dritte Messlichtbündel beim Austritt aus dem Objektiv schräg zu dessen optischer Achse gestellt werden. Hierdurch wird ferner jeweils eine Einfallsebene des ersten Messlichtbündels, zweiten Messlichtbündels bzw. dritten Messlichtbündels definiert, relativ zu welcher der Polarisationszustand des je weiligen Messlichtbündels definiert wird. Das erste Reflexionslichtbündel, zweite Re flexionslichtbündel und/oder dritte Reflexionslichtbündel werden dann vorzugsweise so zurück in das Objektiv geleitet, dass sie in der der Ausbreitungsrichtung des ersten Messlichtbündels, zweiten Messlichtbündels und/oder dritten Messlichtbündels entge gengesetzten Richtung einen anderen Teilbereich der Eintrittspupille durchsetzen, der gegenüber dem vorgenannten Teilbereich der Eintrittspupille versetzt ist.
Vorzugsweise ist das optische Medium, dessen Brechungsindex erfindungsgemäß zu bestimmen ist, ein Einbettmedium für eine Probe, das an eine der beiden Oberflächen des Deckglases grenzt.
Das erfindungsgemäße Mikroskop hat einen Probenraum mit einem Deckglas und ein optisches Medium, ein dem Probenraum zugewandtes Objektiv, eine teilreflektierende Grenzfläche, die in dem Probenraum angeordnet und dadurch gebildet ist, dass das op tische Medium in dem Probenraum an eine von zwei entgegengesetzten Oberflächen des Deckglases grenzt, und eine Einrichtung zur Bestimmung des Brechungsindex des optischen Mediums. Die Einrichtung ist ausgebildet, zeitlich aufeinanderfolgend we nigstens ein erstes Messlichtbündel und ein zweites Messlichtbündel zu erzeugen, wo bei das erste Messlichtbündel und das zweite Messlichtbündel voneinander verschie dene Polarisationszustände aufweisen. Die Einrichtung ist ausgebildet, das erste Mess lichtbündel und das zweite Messlichtbündel jeweils durch das Objektiv unter schrägem Einfall auf das Deckglas zu lenken. Die Einrichtung ist ausgebildet, zwei Reflexionslicht bündel zu erzeugen, indem das erste Messlichtbündel und das zweite Messlichtbündel jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden. Die Einrichtung weist einen De tektor auf und ist ausgebildet ist, das erste Reflexionslichtbündel und das zweite Refle xionslichtbündel jeweils durch das Objektiv zu empfangen und auf den Detektor zu len ken. Der Detektor ist ausgebildet, die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels zu erfassen. Die Einrichtung umfasst ferner eine Ermittlungseinheit, die ausgebildet ist, auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ers ten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels den Brechungsindex des optischen Mediums zu ermitteln.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Einrichtung ein mehrteiliges Polarisationselement zum Präparieren der Polarisationszustände des ersten Messlicht- bündels und des zweiten Messlichtbündels auf. Insbesondere weist das mehrteilige Po larisationselement wenigstens zwei, bevorzugt drei Bereiche auf, die jeweils nur für Licht mit jeweils verschiedenen Polarisationszuständen transparent sind. Das mehrtei lige Polarisationselement ist beispielsweise in oder nahe einer Pupillenebene des Ob jektivs einbringbar. Beispielsweise kann das mehrteilige Polarisationselement in einer Aufnahmevorrichtung für ein objektivseitiges Nomarski-Prisma für differentielle Inter ferenzkontrast-Mikroskopie angeordnet werden. Derartige Aufnahmevorrichtungen sind in vielen kommerziellen Mikroskopen in unterschiedlichen Ausführungsformen verfügbar.
Vorzugsweise weist die Einrichtung eine Aperturblende mit einer Blendenöffnung auf, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse des Objektivs angeordnet ist. Die Aperturblende begrenzt den Querschnitt des ersten Messlichtbündels und des zweiten Messlichtbündels derart, dass letztere die Eintrittspupille des Objektivs dezentral un terleuchten und dadurch schräg zur optischen Achse aus dem Objektiv austreten. Die dezentrale Unterleuchtung der Eintrittspupille des Objektivs hat den Vorteil, dass achs- nahe Strahlanteile vermieden werden, die sogenannte Reflexe erster Ordnung verursa chen, die am stärksten an den Flächenscheiteln der das Objektiv bildenden Linsen ent stehen und das Signal-Rausch-Verhältnis verschlechtern. Ferner wird durch die dezent rale Unterleuchtung die Einfallsebene des jeweiligen Messlichtbündels als Referenz für die Polarisationsrichtung des jeweiligen Messlichtbündels definiert.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung hat die Ermittlungseinheit einen Speicher, in dem Parameter zur Ermittlung des Brechungsindex des optischen Mediums speicherbar sind. Dadurch ist es beispielsweise möglich, die für die Ermittlung des Brechungsindex relevanten Parameter für eine Vielzahl von Mikroskopkomponenten vorzuhalten, die je nach Anwendung wahlweise in dem Mikroskop zum Einsatz kommen. So können etwa die Brechungsindizes verschiedener Immersionsmedien und verschiedener Deck gläser sowie die optischen Daten verschiedener Objektive gespeichert und nach Bedarf zur Bestimmung des gesuchten Brechungsindex ausgelesen werden. Vorzugsweise sind die entgegengesetzten Oberflächen des Deckglases planparallel zu einander ausgebildet.
Die erfindungsgemäße Einrichtung ist aufgrund ihrer vorliegend beschriebenen struk turellen und funktionellen Eigenschaften auch dazu geeignet, in dem Mikroskop als Au tofokuseinrichtung genutzt zu werden. Zudem bietet die Einrichtung aufgrund ihrer Ei genschaften die Möglichkeit, neben dem Brechungsindex eines optischen Mediums an dere, die lichtmikroskopische Abbildung beeinflussende Größen zu bestimmen, wie etwa die Dicke und/oder die Verkippung des Deckglases.
Die Erfindung ist auf eine Vielzahl von Mikroskoptypen anwendbar, z.B. inverse oder aufrechte Durchlichtmikroskope.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines inversen Durchlichtmikroskops als ers tes Ausführungsbeispiel;
Figur 2 eine zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums be stimmte Einrichtung, die Teil des Mikroskops nach Figur 1 ist;
Figur 3 eine schematische Darstellung eines mehrteiligen Polarisationselements, das Teil der Einrichtung nach Figur 2 ist, als erstes Ausführungsbeispiel;
Figur 4a eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach Figur 3 in einer beispielhaften ersten Einstellung;
Figur 4b eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach Figur 3 in einer beispielhaften zweiten Einstellung; Figur 4c eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach Figur 3 in einer beispielhaften dritten Einstellung;
Figur 5 eine schematische Darstellung des weiteren mehrteiligen Polarisationsele ments, das Teil der Einrichtung nach Figur 2 ist, als zweites Ausführungsbei spiel;
Figur 6a eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach Figur 5 in einer beispielhaften ersten Einstellung;
Figur 6b eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach Figur 5 in einer beispielhaften zweiten Einstellung;
Figur 6c eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements nach Figur 5 in einer beispielhaften dritten Einstellung;
Figur 7 ein Flussdiagramm, das eine spezielle Ausführungsform des erfindungsge mäßen Verfahrens zur Bestimmung des Brechungsindex zeigt; und
Figur 8 eine schematische Darstellung eines aufrechten Durchlichtmikroskop, das ein zweites Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Mikroskops bil det.
Figur 1 zeigt ein Mikroskop 10 als erstes Ausführungsbeispiel, auf das die erfindungsge mäße Brechungsindexbestimmung anwendbar ist.
Das Mikroskop 10 ist als inverses Durchlichtmikroskop ausgeführt. Es umfasst demnach ein Objektiv 12, das von unten einem in Figur 1 mit dem Bezugszeichen 14 versehenen Probenraum zugewandt ist, sowie eine Lichtquelle 16, die von oben auf den Proben raum 14 gerichtet ist. Das Mikroskop 10 weist ferner einen Tubus 18 mit einem Okular 20 auf, durch das eine Bedienperson ein durch das Objektiv 12 eingefangenes Proben bild betrachten kann. Zudem ist eine Steuereinheit 22 vorgesehen, welche die ver schiedenen Mikroskopkomponenten ansteuert.
In dem Probenraum 14 des Mikroskops 10 befindet sich ein Deckglas 24 zum Bedecken einer in Figur 1 nicht explizit dargestellten Probe. Auf dem Deckglas 24 befindet sich ein optisches Medium 26, in das die Probe eingebettet ist und das im Weiteren als Ein bettmedium 26 bezeichnet wird. In dem Probenraum 14 ist ferner ein Immersionsme dium 28 angeordnet, das in Figur 1 von oben an das Objektiv 12 und von unten an das Deckglas 24 grenzt.
Das Mikroskop 10 weist ferner eine in Figur 1 allgemein mit dem Bezugszeichen 30 be- zeichnete Einrichtung auf, die dazu dient, den Brechungsindex des die Probe aufneh menden Einbettmediums 26 zu ermitteln. Die Einrichtung ist in Figur 2 genauer darge stellt.
Wie in Figur 2 gezeigt, weist die Einrichtung 30 eine Lichtquelle 32 auf, die ein unpola- risiertes Lichtbündel 34 emittiert. Die Lichtquelle 32 ist beispielweise eine LED, die eine Spaltblende 33 aufweist, durch die das unpolarisierte Lichtbündel 34 auf eine Beleuch tungsoptik 36 gerichtet wird. Nach Durchtritt durch die Beleuchtungsoptik 36 fällt das unpolarisierte Lichtbündel 34 auf eine Aperturblende 38, die mittig auf der optischen Achse Ol der Beleuchtungsoptik 36 positioniert ist und eine Blendenöffnung 39 auf weist, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse Ol der Beleuchtungsoptik 36 angeordnet ist. Die Blendenöffnung der Aperturblende 38 begrenzt den Strahlquer schnitt des unpolarisierten Lichtbündels 34 derart, dass nur der in Figur 2 unterhalb der optischen Achse Ol der Beleuchtungsoptik 36 liegende Teil des unpolarisierten Lichtbündels 34 die Aperturblende in Richtung eines Umlenkprismas 40 passiert. Das in seinem Strahlquerschnitt begrenzte unpolarisierte Lichtbündel 34 wird an dem Umlenkprisma 40 in eine Transportoptik 42 reflektiert, die aus einer längs ihrer opti schen Achse 02 verschiebbaren Fokussierlinse 44, einer Leuchtfeldblende 46 und einer weiteren Linse 48 gebildet ist. Nach Durchtritt durch die Transportoptik 42 fällt das un polarisierte Lichtbündel 34 auf einen dichroitischen Strahlteiler 50, der Licht im Infra rot-Wellenlängenbereich reflektiert, während er Licht im sichtbaren Bereich transmit- tiert. Durch den dichroitischen Spiegel 50 wird das unpolarisierte Lichtbündel 34 in Richtung des Objektivs 12 reflektiert. Das an dem dichroitischen Spiegel 50 reflektierte unpolarisierte Lichtbündel 34 verläuft dabei mit einem Parallelversatz zur optischen Achse 03 des Objektivs 12. Auf diese Weise wird das unpolarisierte Lichtbündel 34 in eine Polarisationseinrichtung 52 gelenkt, die bildseitig einer Pupillenebene 53 des Ob jektivs 12 angeordnet ist. Die Polarisationseinrichtung 52 umfasst ein verstellbares mehrteiliges Polarisationselement 64, das anhand der Figuren 3, 4a, 4b, 4c, 5, 6a, 6b und 6c näher beschrieben ist. Mittels der Polarisationseinrichtung 52 wird aus dem un- polarisierten Lichtbündel 34 ein erstes Messlichtbündel 35a erzeugt, das einen ersten Polarisationszustand aufweist. Durch verstellen des mehrteiligen Polarisationselemen tes 64 lassen sich zeitlich auf das erste Messlichtbündel 35a folgend ein zweites Mess lichtbündel 35b, mit einem von dem ersten Polarisationszustand verschiedenen zwei ten Polarisationszustand, und ein drittes Messlichtbündel 35c, mit einem von dem ers ten Polarisationszustand und dem zweiten Polarisationszustand verschiedenen dritten Polarisationszustand erzeugen. Der Einfachheit halber sind alle drei Messlichtbündel 35a bis 35c in Figur 2 als ein einzelnes mit 35 bezeichnetes Lichtbündel dargestellt.
Die drei Messlichtbündel 35a bis 35c werden zeitlich aufeinanderfolgend jeweils in ei nen Teilbereich einer Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 geleitet, der gegenüber der optischen Achse 03 des Objektivs 12 und damit gegenüber der Mitte der Eintrittspu pille 53 seitlich versetzt ist. Die Eintrittspupille 53 des Objektivs 12 wird somit dezent ral unterleuchtet, was dazu führt, dass die drei Messlichtbündel 35a bis 35c jeweils schräg zur optischen Achse 03 in den Probenraum 14 gelenkt werden. Der Einfachheit halber sind in der Darstellung nach Figur 2 das Einbettmedium 26 und das Immersionsmedium 28, die in dem Probenraum 14 von entgegengesetzten Seiten her an das Deckglas 24 grenzen, weggelassen. Die drei unter schrägem Einfall in den Probenraum 14 geleiteten drei Messlichtbündel 35a bis 35c werden an dem Deckglas 24 reflektiert, wodurch zeitlich aufeinanderfolgend drei jeweils in das Objektiv 12 zu rückgeleitete Reflexionslichtbündel 54a bis 54c entstehen, die in der schematischen Ansicht nach Figur 2 in Form eines einzigen, mit 54 bezeichneten Lichtbündels darge stellt sind. Die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c treten durch die Polarisationsein richtung 52, die für die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c als Analysator dient.
Nach Durchtritt durch das Objektiv 12 fallen die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c auf den dichroitischen Spiegel 50, der die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c in die Transportoptik 42 lenkt. Nach Passieren der Transportoptik 42 fallen die drei Reflexi onslichtbündel 54a bis 54c auf das Umlenkprisma 40, das die drei Reflexionslichtbün del 54a bis 54c auf eine Detektoroptik 56 reflektiert. Die Detektoroptik 56 richtet die drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c auf ein Spektralfilter 58, das nur für Licht in dem von der Lichtquelle 32 emittiertem Wellenlängenbereich durchlässig ist und Streulicht außerhalb dieses Wellenlängenbereichs blockiert. Die durch das Spektralfilter 58 trans- mittierten Reflexionslichtbündel 54a bis 54c fallen schließlich auf einen Detektor 60, der im Stande ist, die Intensitäten der drei Reflexionslichtbündel 54a bis 54c nachei nander zu erfassen.
In der Figur 2 ist der Vollständigkeit halber auch die über den dichroitischen Spiegel 50 realisierte Ankopplung des Tubus 18 an die Einrichtung 30 veranschaulicht. Demnach dient der dichroitische Spiegel 50 im vorliegenden Ausführungsbeispiel auch dazu, das für die eigentliche mikroskopische Bildgebung genutzte Detektionslicht 62, welches das Objektiv 12 aus dem Probenraum 14 in Richtung des dichroitischen Spiegels 50 lei tet, durch Transmission dem Tubus 18 zuzuführen.
Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements, das Teil der Einrichtung nach Figur 2, als erstes Ausführungsbeispiel. Das in Figur 3 ge zeigte mehrteilige Polarisationselement wird im Folgenden mit dem Bezugszeichen 64a bezeichnet.
Das mehrteilige Polarisationselement 64a ist kreisförmig und weist drei Bereiche 66a, 68a, 70a auf. Die drei Bereiche 66a, 68a, 70a sind jeweils nur für Licht mit einem be stimmten Polarisationszustand durchlässig. Ein erster Bereich 66a der drei Bereiche 66a, 68a, 70a ist in Figur 3 ganz links angeordnet und erstreckt sich über 2/3 der Ge samtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64a. Der erste Bereich 66a ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 45° zu einer Einfallebene der drei Messlicht bündel 35a bis 35ca, 35b, 35c auf das Deckglas 24 durchlässig, wie es in Figur 3 durch einen Pfeil Pia angedeutet ist. Ein zweiter Bereich 68a der drei Bereiche 66a, 68a, 70a ist in Figur 3 rechts des ersten Bereichs 66a angeordnet und erstreckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64a. Der zweite Bereich 68a ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 90° zu der Einfallebene durchlässig. Dies ist in Figur 3 durch einen Pfeil P2a angedeutet. Ein dritter Bereich 70a der drei Berei che 66a, 68a, 70a ist in Figur 3 rechts des zweiten Bereichs 68a angeordnet und er streckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64a.
Der dritte Bereich 70a ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 0° zu der Einfall ebene durchlässig, wie es in Figur 3 durch einen Pfeil P3a angedeutet ist.
Figur 4a zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64a nach Figur 3 in einer beispielhaften ersten Einstellung. In der ersten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64a in der Polarisationseinrichtung 52 angeord net, dass sowohl das erste Messlichtbündel 35a als auch das durch Reflexion des ers ten Messlichtbündels 35a an dem Deckglas 24 erzeugte erste Reflexionslichtbündel 54a auf den ersten Bereich 66a des mehrteiligen Polarisationselements 66a auftreffen. Da sich die Polarisationsrichtung von Licht bei Reflexion an einer Grenzfläche ändert und damit das erste Messlichtbündel 35a und das erste Reflexionslichtbündel 54a ver- schiedene Polarisationszustände aufweisen, ist die in Figur 4a gezeigte erste Einstel lung eine Dunkelstellung, d.h. das erste Reflexionslichtbündel 54a kann das mehrteilige Polarisationselement 64a nicht passieren. Der Bereich 66a des Polarisationselements 64a wirkt also sowohl als Polarisator für das erste Messlichtbündel 35a, als auch als Analysator für das erste Reflexionslichtbündel 54a.
Figur 4b zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64a nach Figur 3 in einer beispielhaften zweiten Einstellung. In der zweiten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64a derart in der Polarisationseinrichtung 52 angeordnet, dass das zweite Messlichtbündel 35b auf den zweiten Bereich 68a und das durch Reflexion des zweiten Messlichtbündels 35b an dem Deckglas 24 erzeugte zweite Reflexionslichtbündel 54b auf den ersten Bereich 66a des mehrteiligen Polarisa tionselements 64a auftreffen. Der Bereich 68a des Polarisationselements 64a wirkt also als Polarisator für das zweite Messlichtbündel 35b, und der Bereich 66a wirkt als Analysator für das zweite Reflexionslichtbündel 54b.
Figur 4c zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64a nach Figur 3 in einer beispielhaften dritten Einstellung. In der dritten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64a derart in der Polarisationseinrichtung 52 an geordnet, dass das dritte Messlichtbündel 35c auf den dritten Bereich 70a und das durch Reflexion des dritten Messlichtbündels 35c an dem Deckglas 24 erzeugte dritte Reflexionslichtbündel 54c auf den ersten Bereich 66a des mehrteiligen Polarisations elements 64a auftreffen. Der Bereich 70a des Polarisationselements 64a wirkt also als Polarisator für das dritte Messlichtbündel 35c, und der Bereich 66a wirkt als Analysator für das dritte Reflexionslichtbündel 54c.
Durch die drei in den Figuren 4a, bis 4c gezeigten Einstellungen des mehrteiligen Pola risationselements 64a nach Figur 3 lassen sich das zweite Messlichtbündel 35b und das dritte Messlichtbündel 35c mit jeweils verschiedenem Polarisationszustand - insbeson dere realisiert in Form von verschiedenen Polarisationsrichtungen zu der Einfallebene des jeweiligen Messlichtbündels 35b, 35c auf das Deckglas 24 - erzeugen. Ferner lässt sich eine Dunkelstellung realisieren, bei der das durch Reflexion des ersten Messlicht bündels 35a an dem Deckglas 24 erzeugte erste Reflexionslichtbündel 54a das mehrtei lige Polarisationselement 64a nicht passieren kann.
Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements, das Teil der Einrichtung nach Figur 2 und dort mit dem Bezugszeichen 64 versehen ist, als zweiten Ausführungsbeispiel. Das in Figur 5 gezeigte mehrteilige Polarisationsele ment wird im Folgenden mit dem Bezugszeichen 64b versehen. Das mehrteilige Polari sationselement 64b nach Figur 5 weist im Gegensatz zu dem mehrteiligen Polarisati onselement 64a nach Figur 3 keine Dunkelstellung auf.
Das mehrteilige Polarisationselement 64b ist kreisförmig und hat vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b, die jeweils nur für Licht mit einem bestimmten Polarisationszustand durchlässig sind. Ein erster Bereich 66b der vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b ist in Figur 5 ganz links angeordnet und erstreckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64b. Der erste Bereich 66b ist für Licht mit einer Polarisations richtung von -45° zu der Einfallebene der drei Messlichtbündel 35a bis 35ca, 35b, 35c auf das Deckglas 24 durchlässig, wie es in Figur 5 durch einen Pfeil Plb angedeutet ist. Ein zweiter Bereich 68b der vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b ist in Figur 5 rechts des ersten Bereichs 66b angeordnet und erstreckt sich über die Hälfte der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64b. Der zweite Bereich 68b ist für Licht mit ei ner Polarisationsrichtung von 45° zu der Einfallebene durchlässig. Dies ist in Figur 3 durch einen Pfeil P2b angedeutet. Ein dritter Bereich 70b der vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b ist in Figur 5 rechts des zweiten Bereichs 68b angeordnet und erstreckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationselements 64b. Der dritte Be reich 70b ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 0° zu der Einfallebene durch lässig, wie es in Figur 5 durch einen Pfeil P3b angedeutet ist. Ein vierter Bereich 72b der vier Bereiche 66b, 68b, 70b, 72b ist in Figur 5 rechts des dritten Bereichs 70b ange- ordnet und erstreckt sich über 1/6 der Gesamtfläche des mehrteiligen Polarisationsele ments 64b. Der vierte Bereich 72b ist für Licht mit einer Polarisationsrichtung von 90° zu der Einfallebene durchlässig, wie es in Figur 5 durch einen Pfeil P4b angedeutet ist.
Figur 6a zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64b nach Figur 5 in einer beispielhaften ersten Einstellung. In der ersten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64b derart in der Polarisationseinrichtung 52 an geordnet, dass das erste Messlichtbündel 35a auf den zweiten Bereich 68b und das durch Reflexion des ersten Messlichtbündels 35a an dem Deckglas 24 erzeugte erste Reflexionslichtbündel 54a auf den ersten Bereich 66b des mehrteiligen Polarisations elements 64b auftreffen. Der Bereich 68b wirkt als Polarisator für das erste Messlicht bündel 35a, und der Bereich 66b wirkt als Analysator für das erste Reflexionslichtbün del 54a.
Figur 6b zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64b nach Figur 5 in einer beispielhaften zweiten Einstellung. In der zweiten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64b derart in der Polarisationseinrichtung 52 angeordnet, dass das zweite Messlichtbündel 35b auf den dritten Bereich 70b und das durch Reflexion des zweiten Messlichtbündels 35b an dem Deckglas 24 erzeugte zwei ten Reflexionslichtbündel 54b auf den zweiten Bereich 68b des mehrteiligen Polarisati onselements 64b auftreffen. Der Bereich 70b wirkt als Polarisator für das zweite Mess lichtbündel 35b, und der Bereich 68b wirkt als Analysator für das zweite Reflexions lichtbündel 54b.
Figur 6c zeigt eine schematische Darstellung des mehrteiligen Polarisationselements 64b nach Figur 5 in einer beispielhaften dritten Einstellung. In der dritten Einstellung ist das mehrteilige Polarisationselement 64b derart in der Polarisationseinrichtung 52 angeordnet, dass das dritte Messlichtbündel 35c auf den vierten Bereich 72b und das durch Reflexion des dritten Messlichtbündels 35c an dem Deckglas 24 erzeugte dritte Reflexionslichtbündel 54c auf den dritten Bereich 70b des mehrteiligen Polarisations elements 64b auftreffen. Der Bereich 68b wirkt als Polarisator für das dritte Messlicht bündel 35c, und der Bereich 72b wirkt als Analysator für das dritte Reflexionslichtbün del 54c.
Durch die drei in den Figuren 6a, bis 6c gezeigten Einstellungen des mehrteiligen Pola risationselements 64b nach Figur 3 lassen sich das ersten Messlichtbündel 35a, das zweite Messlichtbündel 35b und das dritte Messlichtbündel 35c mit jeweils verschiede nem Polarisationszustand - insbesondere realisiert in Form von verschiedenen Polari sationsrichtungen zu der Einfallebene des jeweiligen Messlichtbündels 35a, 35b, 35c auf das Deckglas 24 - erzeugen.
Figur 7 zeigt ein Flussdiagramm, das rein beispielhaft veranschaulicht, wie der Bre chungsindex des Einbettmediums 26 erfindungsgemäß ermittelt werden kann.
In einem ersten Schritt S1 werden zeitlich aufeinanderfolgend die drei Messlichtbündel 35a bis 35ca, 35b, 35c durch das Objektiv 12 in den Probenraum 14 geleitet. Nach Durchtritt durch die Immersionsflüssigkeit 28 treffen die drei Messlichtbündel 35a bis 35c unter einem Winkel a schräg auf das Deckglas 24. Der Winkel a kann aus dem Ab stand zwischen dem Objektiv 12 dem Deckglases 24 sowie der numerischen Apertur des jeweiligen Messlichtbündels 35a, 35b, 35c bestimmt werden. Dabei ergibt sich die numerische Apertur 34 des jeweiligen Messlichtbündels 35a, 35b, 35c anhand der Brennweite des Objektivs 12 und der Position des jeweiligen Messlichtbündels 35a, 35b, 35c in der Eintrittspupille 53 des Objektivs 12 bzw. anhand der Positionierung der Blendenöffnung 39 der Aperturblende 38 und des Vergrößerungsmaßstabs, mit dem die Aperturblende 38 in die Eintrittspupille 53 des Objektivs 12 abgebildet wird.
In einem zweiten Schritt S2 werden zeitlich aufeinanderfolgend drei Reflexionslicht bündel 54a, 54b, 54c durch die Teilreflexionen an einer dem Einbettmedium 26 zuge wandten Oberfläche des Deckglases 24 generiert. In einem dritten Schritt S3 werden die drei Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c auf den Detektor 60 geleitet. Die drei zeitlich aufeinanderfolgenden Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c treffen zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf den Detektor 60.
In einem vierten Schritt S4 werden die im Weiteren als la, lb bzw. Ic bezeichneten Inten sitäten der drei Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c durch den Detektor 60 erfasst.
In einem fünften Schritt S5 wird schließlich der Brechungsindex des Einbettmediums 26 auf Grundlage der Intensitäten der drei Reflexionslichtbündel 54a, 54b, 54c ermit telt. Dies ist im Folgenden näher erläutert.
Die jeweils durch den Detektor 60 erfasste Intensität / des ersten, zweiten bzw. dritten Reflexionslichtbündels 54a, 54b, 54c ergibt sich als
Figure imgf000021_0001
In die obige Gleichung (2) gehen die jeweilige Polarisationsrichtung aa des ersten, zweiten bzw. dritten Reflexionslichtbündels 54a, 54b, 54c und die jeweilige Polarisati onsrichtung ap des ersten, zweiten bzw. dritten Messlichtbündels 35a, 35b, 35c und die komplexen Fresnel-Amplitudenkoeffizienten für Reflexion rs und Transmission ts für die zwischen dem Deckglas 24 und dem Einbettmedium 26 gebildete optische Grenzfläche sowie den komplexen Fresnel-Amplitudenkoeffizienten für Reflexion rp und Transmission tp für die zwischen dem Deckglas 24 und dem Immersionsmedium 28 gebildete weitere optische Grenzfläche ein. Die Fresnel-Amplitudenkoeffizienten lauten explizit
Figure imgf000022_0001
Dabei sind nImm, nDgl und nSpc jeweils der Brechungsindex des Immersionsmediums 28, des Deckglases 24 und des Einbettmediums 26, und NA ist die numerische Apertur des ersten, zweiten bzw. dritten Reflexionslichtbündels 54a, 54b, 54c.
Anhand der Polarisationsrichtung aa des ersten und zweiten Reflexionslichtbündels 54a, 54b, der Polarisationsrichtung ap des ersten und zweiten Messlichtbündels 35a, 35b, des Brechungsindex des Immersionsmediums nImrn und der jeweiligen numeri schen Apertur NA des ersten und zweiten Messlichtbündels 35a, 35b lässt sich das durch die obigen Gleichungen (3) bis (6) gebildete Gleichungssystem nach dem Betrag des Brechungsindex nSpc des Einbettmediums 26 auflösen. Sind zusätzlich die Polarisa tionsrichtung aa des dritten Reflexionslichtbündels 54c und die Polarisationsrichtung ap des dritten Messlichtbündels 35c sowie die numerische Apertur NA des dritten Messlichtbündels 35c bekannt, kann aus dem durch die Gleichungen (3) bis (6) gebilde ten Gleichungssystem der komplexe Brechungsindex nSpc des Einbettmediums 26 be stimmt werden. Dies kann beispielsweise durch eine Minimierung von quadratischen Abweichungen der durch den Detektor gemessenen Intensitäten der drei Reflexions lichtbündel 54a, 54b, 54c in Bezug auf eine numerische Simulation in Abhängigkeit des Brechungsindex nSpc des Einbettmediums 26 erfolgen.
Figur 8 zeigt ein Mikroskop 74, das im Unterschied zu dem in Figur 1 dargestellten Mik roskop 10 als aufrechtes Durchlichtmikroskop ausgeführt ist. Dabei sind in Figur 8 die jenigen Mikroskopkomponenten, die den Komponenten des Mikroskops 10 nach Figur 1 entsprechen, mit den schon in Figur 1 verwendeten Bezugszeichen versehen.
Im Unterschied zur Ausführungsform nach Figur 1 ist bei dem in Figur 8 dargestellten Mikroskop das Objektiv 12 oberhalb des Probenraums 18 angeordnet, während sich die Lichtquelle 16 unterhalb des Probenraums 18 befindet. Dementsprechend befindet sich das Immersionsmedium 28, das zum einen an das Objektiv 12 und zum anderen an das Deckglas 24 grenzt, oberhalb des Deckglases 24, während sich das Einbettmedium 26, dessen Brechungsindex erfindungsgemäß zu bestimmen ist, unterhalb des Deckgla ses 24 angeordnet ist.
Bezugszeichenliste
10 Mikroskop
12 Objektiv
14 Probenraum
16 Lichtquelle
18 Tubus
20 Okular
22 Steuereinheit
24 Deckglas
26, 28 optisches Medium
30 Einrichtung
32 Lichtquelle
33 Spaltblende
34 Messlichtbündel
36 Beleuchtungsoptik
38 Aperturblende
39 Blendenöffnung
40 Umlenkprisma
42 Transportoptik
44 Fokussierlinse
46 Leuchtfeldblende
48 Linse
50 Strahlteiler
52 Polarisationseinrichtung
53 Eintrittspupille
54 Reflexionslichtbündel 56 Detektoroptik
58 Spektralfilter
60 Detektor Abbildungsstrahlengang
Polarisationselement, 68, 70, 72 Bereich
Mikroskop

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung des Brechungsindex eines optischen Mediums (26) in einem Mikroskop (10, 74), das ein einem Probenraum (14) zugewandtes Ob jektiv (12) aufweist,
wobei das optische Medium (26) mit dem zu bestimmenden Brechungsindex in dem Probenraum (14) an eine von zwei entgegengesetzte Oberflächen eines Deckglases (24) grenzt und dadurch eine teilreflektierende Grenzfläche bildet, dadurch gekennzeichnet, dass
zeitlich aufeinanderfolgend wenigstens ein erstes Messlichtbündel (35a) und ein zweites Messlichtbündel (35b) erzeugt werden, wobei das erste Messlicht bündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) voneinander verschiedene Polarisationszustände aufweisen,
das erste Messlichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) jeweils durch das Objektiv (12) unter schrägem Einfall auf das Deckglas (24) gelenkt werden,
zwei Reflexionslichtbündel (54a, 54b) erzeugt werden, indem das erste Mess lichtbündel (35a) und das zweite Messlichtbündel (35b) jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden,
das erste Reflexionslichtbündel und das zweite Reflexionslichtbündel (54a, 54b) jeweils durch das Objektiv (12) empfangen und auf einen Detektor (60) gelenkt werden,
die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Refle xionslichtbündels (54b) mittels des Detektors (60) erfasst werden, und auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Reflexionslichtbündels (54b) der Brechungsindex des op tischen Mediums ermittelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Brechungsindex des optischen Mediums in Abhängigkeit des Brechungsindex des Deckglases (24) und der numerischen Apertur des ersten Messlichtbündels (35a) und des zweiten Messlichtbündels (35b) ermittelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Bre
chungsindex des optischen Mediums (26) auf Grundlage des Verhältnisses der Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels (54a) und des zweiten Reflexi onslichtbündels (54b) ermittelt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zeitlich auf das erste Messlichtbündel (35a) oder das zweite Messlichtbündel (35a) ein drittes Messlichtbündel (35b) erzeugt wird, das einen von dem ersten Messlichtbündel (35a) und zweiten Messlichtbündel (35a) verschiedenen Pola risationszustand aufweist,
das dritte Messlichtbündel (35c) durch das Objektiv (12) unter schrägem Einfall auf das Deckglas (24) gelenkt wird,
ein drittes Reflexionslichtbündel (54c) erzeugt wird, indem das dritte Messlicht bündel (35c) zum Teil an der Grenzfläche reflektiert wird,
das dritte Reflexionslichtbündel (54c) durch das Objektiv (12) empfangen und auf den Detektor (60) gelenkt wird,
die Intensität des dritten Reflexionslichtbündels (54c) mittels des positionssen sitiven Detektors (60) erfasst wird, und
auf Grundlage der erfassten Intensitäten der drei Reflexionslichtbündel (54a, 54b, 54c) der Brechungsindex des optischen Mediums (26) als komplexe Zahl ermittelt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Messlichtbündel (54a), zweite Messlichtbündel (54b) und/oder dritte Messlichtbündel (54c) in einen Teilbereich einer Eintrittspupille (53) des Objek tivs (12) geleitet wird, der gegenüber der Mitte der Eintrittspupille (53) versetzt ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Medium (26) ein Einbettmedium für eine Probe ist, das an eine der beiden Flächen des Deckglases (24) grenzt.
7. Mikroskop, umfassend:
einen Probenraum (14) mit einem Deckglas (24) und ein optisches Medium, ein dem Probenraum (14) zugewandtes Objektiv (12),
eine teilreflektierende Grenzfläche, die in dem Probenraum (14) angeordnet und dadurch gebildet ist, dass das optische Medium (26) in dem Probenraum (14) an eine von zwei entgegengesetzten Oberflächen des Deckglases (24) grenzt, und
eine Einrichtung (30) zur Bestimmung des Brechungsindex des optischen Medi ums (26),
dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (30) ausgebildet ist, zeitlich aufei nanderfolgend wenigstens ein erstes Messlichtbündel (54a) und ein zweites Messlichtbündel (54b) zu erzeugen, wobei das erste Messlichtbündel (54a) und das zweite Messlichtbündel (54b) voneinander verschiedene Polarisationszu stände aufweisen,
die Einrichtung (30) ausgebildet ist, das erste Messlichtbündel (54a) und das zweite Messlichtbündel (54b) jeweils durch das Objektiv (12) unter schrägem Einfall auf das Deckglas (24) zu lenken,
die Einrichtung (30) ausgebildet ist, zwei Reflexionslichtbündel (54a, 54b) zu er zeugen, indem das erste Messlichtbündel (54a) und das zweite Messlichtbündel (54b) jeweils zum Teil an der Grenzfläche reflektiert werden,
die Einrichtung einen Detektor (60) aufweist und ausgebildet ist, das erste Re flexionslichtbündel und das zweite Reflexionslichtbündel (54a, 54b) jeweils durch das Objektiv (12) zu empfangen und auf den Detektor (60) zu lenken, der Detektor (60) ausgebildet ist, die Intensitäten des ersten Reflexionslichtbün dels und des zweiten Reflexionslichtbündels (54a, 54b) zu erfassen, und die Einrichtung (30) eine Ermittlungseinheit umfasst, die ausgebildet ist, auf Grundlage der erfassten Intensitäten des ersten Reflexionslichtbündels und des zweiten Reflexionslichtbündels (54a, 54b) der Brechungsindex des optischen Mediums zu ermitteln.
8. Mikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (30) ein mehrteiliges Polarisationselement (64) zum Präparieren der Polarisationszu stände des ersten Messlichtbündels (35a) und des zweiten Messlichtbündels (35b) aufweist.
9. Mikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das mehrteilige Po larisationselement wenigstens zwei, bevorzugt drei Bereiche (66, 68, 70) auf weist, die jeweils nurfür Licht mit jeweils verschiedenen Polarisationszuständen transparent sind.
10. Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (30) eine Aperturblende (38) mit einer Blendenöffnung (39) auf weist, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse (03) des Objektivs (12) angeordnet ist.
11. Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Ermittlungseinheit einen Speicher hat, in dem Parameter zur Ermittlung des Brechungsindex des optischen Mediums (26) speicherbar sind.
12. Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die entgegengesetzten Oberflächen des Deckglases (24) planparallel zueinander ausgebildet sind.
13. Mikroskop nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ein inverses Mikroskop oder ein aufrechtes Mikroskop ist.
14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Polarisationszustände des ersten Messlichtbündels (35a) und des zweiten Messlichtbündels (35b) durch eine Rotationsbewegung des mehrteiligen Polari sationselements (64) eingestellt werden.
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