WO2020075534A1 - 神経幹細胞増殖用培地 - Google Patents

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WO2020075534A1
WO2020075534A1 PCT/JP2019/038217 JP2019038217W WO2020075534A1 WO 2020075534 A1 WO2020075534 A1 WO 2020075534A1 JP 2019038217 W JP2019038217 W JP 2019038217W WO 2020075534 A1 WO2020075534 A1 WO 2020075534A1
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proteoglycan
cells
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stem cells
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晃明 桝谷
健一 水谷
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一丸ファルコス株式会社
学校法人神戸学院
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2500/34—Sugars
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    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a novel neural stem cell growth medium, a neural stem cell growth method using the medium, and the like.
  • Transplanting neural stem cells is also being considered for the treatment of neurological diseases such as Parkinson's disease and spinal cord injury due to lack of donors and ethical issues (Non-patent Documents 1 and 1).
  • iPS cells For example, it becomes possible to generate iPS cells from the patient himself and to induce neural stem cells from the iPS cells, and it is expected to carry out autologous transplantation in which his cells can be used for therapy. .
  • iPS cells are thought to differ greatly in safety and differentiation direction depending on the cell line, and it takes longer time to verify that iPS cells are safe iPS cells. .
  • spinal cord injury transplantation of neural stem cells before the patient's symptoms are fixed is ineffective. Therefore, for example, in such a disease in which cell transplantation is effective for a limited period of time, it is considered difficult to use the patient's own cells for treatment even by using the iPS cell transplantation technique (Non-Patent Document 1). .
  • a means for easily and safely producing neural stem cells (undifferentiated tissue stem cells of the nervous system) from patients' own cells in a short time, more preferably neural stem cells without containing differentiated cells
  • the means to do is required.
  • an object of the present invention is to provide a means for easily producing neural stem cells in a short period of time.
  • the present invention has been made to solve such a problem, that is, one of the present invention is "a medium for growing neural stem cells containing FGF-2, EGF and proteoglycan".
  • the proteoglycan is a chondroitin sulfate type proteoglycan, and more preferably, the proteoglycan is a salmon nasal cartilage-derived proteoglycan.
  • Another embodiment is “a method for proliferating neural stem cells, which comprises a step of culturing neural stem cells or cells using a medium containing FGF-2, EGF and proteoglycan”.
  • neural stem cells can be easily produced in a short period of time.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of an experimental procedure performed in Experiment 1.
  • FIG. It is a measurement result of the number of neurospheres formed in each administration group.
  • the vertical axis shows the formation rate (%) of neurospheres (NS), and specifically shows the formation rate (%) of NS when the number of NS formation in the control group is 100 (%).
  • Statistical analysis was performed by the Dunnet method, and * indicates a significant difference, p ⁇ 0.05. It is an observation result of the neurosphere of each administration group.
  • 6 is a schematic diagram of an experimental procedure performed in Experiment 2.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of an experimental procedure performed in Experiment 3.
  • FIG. It is a result of Experiment 4 (observation result of sphere). “ ⁇ ” In the figure indicates 200 ⁇ m.
  • Neural stem cells are undifferentiated tissue stem cells of the nervous system that have both self-renewal ability and pluripotency. In the fetal brain of mammals such as humans, neural stem cells first proliferate vigorously to increase their numbers exponentially and then produce asymmetric divisions. It is also known that astrocytes and oligodendrocytes are produced in the postnatal and postnatal brains. Neural stem cells are the sources of neurons, astrocytes, and oligodendrocytes, which are the major cell types that make up the central nervous system. In the present invention, cells derived from mammals such as humans and mice are preferably used.
  • Proteoglycan is a glycoprotein in which a sugar chain called glycosaminoglycan (hereinafter referred to as GAG) such as chondroitin sulfate and dermatan sulfate is covalently bonded to a core protein.
  • GAG glycosaminoglycan
  • Proteoglycan is widely distributed in the body such as skin and cartilage as one of the main components of extracellular matrix.
  • the GAG chain has a long linear structure with no branching. Since it has a large number of sulfate groups and carboxyl groups, it is negatively charged, and the GAG chain has an elongated shape due to its electric repulsive force.
  • proteoglycans can retain a large amount of water due to the water affinity of sugar.
  • a large number of GAG chain groups contained in proteoglycan have a cartilage-specific function such as elasticity and impact resistance while flexibly holding water like a sponge.
  • the core protein of proteoglycan has the property of binding to various molecules in the matrix.
  • Cartilage proteoglycan has a binding region for hyaluronic acid or a link protein on the N-terminal side and may bind to these substances or may associate with the same molecule. It has a lectin-like region and an EGF-like region at the C-terminus and binds to various other molecules. Due to this property, proteoglycans build a structure suitable for each tissue.
  • chondroitin sulfate-type proteoglycans are proteoglycans in which chondroitin sulfate is covalently bound to a core protein.
  • Salmon nasal cartilage-derived proteoglycans are proteoglycans extracted from salmon nasal cartilage.
  • the salmon is, for example, a fish belonging to the genus Salmon (Oncorhynchus), but preferably the salmon having the scientific name “Oncorhynchus keta” from the viewpoint of cell proliferation (for example, culturing cells to be cultured more efficiently). Is selected.
  • the content of proteoglycan contained in the medium according to the present invention is, for example, from the viewpoint of cell proliferation, the lower limit is preferably 1 ⁇ g / ml or more, more preferably 2 ⁇ g / ml or more, more preferably 5 ⁇ g / ml or more, further It is preferably 10 ⁇ g / ml or more.
  • the proteoglycan contained in the medium according to the present invention is produced, for example, by the method described in the publication (Japanese Patent No. 6317053).
  • FGF-2 Fibroblast Growth Factor-2, fibroblast growth factor
  • bFGF fibroblast growth factor
  • FGF-2 can be isolated from animal neural tissue, pituitary gland, adrenal cortex, placenta and the like. FGF-2 is known to induce neural differentiation, survival, and regeneration, and regulate embryogenesis and differentiation. FGF-2 has a wide range of functions as, for example, a cell growth factor, an angiogenic factor, and a neurotrophic factor, and exhibits proliferative activity on various cells such as ES cells and iPS cells.
  • EGF Epidermal Growth Factor, epidermal growth factor
  • EGF Epidermal growth factor
  • epidermal growth factor is a polypeptide having an action of promoting the growth of various cells including epithelial cells.
  • the action of EGF has little species specificity and has a proliferative effect on various cells such as epithelial cells, fibroblasts, and hepatocytes. It is considered to be a growth factor that plays an important role in cell proliferation and differentiation in the living body.
  • a known medium can be used.
  • a medium eg, Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)
  • RPMI RPMI
  • DMEM eg, used in Examples below, containing components necessary for cell survival and growth (inorganic salts, carbohydrates, hormones, essential amino acids, vitamins).
  • DMEM / Ham's F-12 medium Nacalai Tesque, Inc. 08460-95
  • Fischer medium ⁇ medium, Leibovitz medium, L-15 medium
  • NCTC medium F-12 medium
  • MEM McCoy medium
  • further additives such as antibiotics
  • the medium used in the present invention may preferably not contain serum.
  • the serum may not be contained in the serum, because the serum contains an unknown differentiation inducer, and there is a possibility that the high neuronal ratio of the present invention may inhibit differentiation.
  • the presence of serum may increase the induction rate of GABAergic neurons, so it is considered preferable that serum is not present. There is.
  • the state of the substance of the medium used in the present invention is not particularly limited, but the liquid medium is preferable from the viewpoint of the ease of medium preparation (for example, it is considered that the medium preparation is easier when performing suspension culture).
  • the period for culturing to grow neural stem cells using the medium of the present invention is not particularly limited, but is preferably at least 3 days or more, preferably 5 days or more, more preferably 7 days or more after seeding the cells to be cultured. .
  • the culturing temperature is not particularly limited, but from the viewpoint of further optimizing the growth, the lower limit is preferably 36 to 37 ° C. or higher, more preferably 36 ° C. or higher, further preferably 36.5 ° C. or higher. From the viewpoint of further achieving the above, the upper limit is preferably 38.5 ° C. or lower, more preferably 38 ° C. or lower, still more preferably 37.5 ° C. or lower.
  • the CO 2 concentration in this culture environment is not particularly limited, but from the viewpoint of further optimizing the growth, the lower limit is preferably 3.5% or more, more preferably 4% or more, further preferably 4.5% or more, From the viewpoint of further optimizing the growth, the upper limit is preferably 10% or less, more preferably 6% or less, still more preferably 5.5% or less.
  • the method of culturing is not particularly limited, but suspension culture is preferable from the viewpoint of easiness of culture (eg, it is considered that the contained components can be easily mixed homogeneously).
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of this experimental procedure.
  • Female mice on the 14th day of pregnancy were prepared using ICR mice manufactured by Japan SLC, Inc. Then, a mouse fetus existing in the body of the mouse was taken out, and cells dispersed from the cerebral cortex of the mouse fetus were prepared. In this dispersion, 0.05 w / v% trypsin (product of FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the cells were cultured for 7 days in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 . After culturing for 7 days, the formed cell mass in the 6-well plate of each administration group was observed by a predetermined phase contrast microscope (magnification: 20 times). In this observation, among the formed cell clusters, those having a radius of 50 ⁇ m or more were defined as neurospheres, and the number of these neurospheres was measured. As a comparison target for the observation after the 7-day culture, the observation on the 0th day of the culture of each administration group was also similarly performed using a predetermined phase contrast microscope (magnification: 20 times).
  • composition of the liquid medium of each administration group (control, medium 1, medium 2, medium 3) is as follows.
  • DMEM / Ham F-12 (Nacalai Tesque, Inc. 08460-95) was used as the basal medium, but the composition of each component in 50 ml is shown below.
  • N2 N-2 Supplement (100X) (Gibco: 17502-048)
  • B27 B-27 TM Plus Supplement Vitamin A-free (50X) (gibco: A35828-01)
  • Heparin Sodium heparin (Nacalai Tesque (Product Codes: 17513-96, 17513-41, 17513-54)
  • Antibiotic Penicillin-Streptomycin (WAKO: 168-23191)
  • -BFGF bFGF (funakoshi: 100-18B)
  • EGF EGF (funakoshi: 315-09)
  • Proteoglycan Proteoglycan, derived from salmon nasal cartilage (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (product code: 162-22131, 168-22133))
  • FIG. 2 shows the NS formation ratio (%) when the number of NS formation in the control group is 100 (%).
  • Medium 1 is 117.31757353746014%
  • medium 2 is 134.6777950940218%
  • medium 3 is 149.30505508553623%. It was confirmed that the number of NSs formed increased as the content of proteoglycan increased. It was confirmed that Medium 2 and Medium 3 had a statistically significant increase in the number of NSs formed, as compared with the control.
  • results of NS observation The results of this observation are shown in FIG. As a comparison target of the observation results after 7 days of culture (“7 days of culture” in FIG. 3), the observation results of 0 days of culture (“0 days of culture” in FIG. 3) are also listed. As compared with the control, more NS was confirmed in the media 1 to 3. Note that some NSs are indicated by arrows in FIG.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of this experimental procedure.
  • Female mice on the 14th day of pregnancy were prepared using ICR mice manufactured by Japan SLC, Inc. Then, a mouse fetus existing in the body of the mouse was taken out, and cells dispersed from the cerebral cortex of the mouse fetus were prepared. In this dispersion, 0.05 w / v% trypsin (a product of FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • a Hes-1 cDNA and a reporter gene were introduced into this sample by using a transfection reagent (Thermo Fisher SCIENTIFIC, Neon (registered trademark) Transfection System).
  • a transfection reagent Thermo Fisher SCIENTIFIC, Neon (registered trademark) Transfection System.
  • pHes1 (2.5k) -luc “Lasmid # 43806)” manufactured by addgene was used.
  • pHes1 (2.5k) -luc (Plasmid # 43806)” manufactured by addgene was used.
  • a liquid medium of each administration group control, medium 1, medium 2, medium 3, medium 4, medium 5, medium 6
  • a luciferase substrate (Thermo Fisher SCIENTIFIC, Neon TM Transfection System) was added to each sample, and a luciferase of each sample was observed using a detection system (Promega Corporation, GloMax TM Discover Microplate Reader). did.
  • composition of the liquid medium of each administration group (control, medium 1, medium 2, medium 3, medium 4, medium 5, medium 6) used in this dual luciferase assay is as follows.
  • Control, medium 1, medium 2 and medium 3 have the same composition as the liquid medium used in Experiment 1 above.
  • DMEM / Ham F-12 (Nacalai Tesque, Inc. 08460-95) was used as the basal medium, but the composition of each component in 50 ml is shown below.
  • “Costar TM 24 wells" manufactured by Corning Inc. was used.
  • N2 N-2 Supplement (100X) (Gibco: 17502-048)
  • B27 B-27 TM Plus Supplement Vitamin A-free (50X) (Gibco: A35828-01)
  • Heparin Sodium heparin (Nacalai Tesque (Product Codes: 17513-96, 17513-41, 17513-54)
  • Antibiotic Penicillin-Streptomycin (WAKO: 168-23191)
  • -BFGF bFGF (funakoshi: 100-18B)
  • EGF EGF (funakoshi: 315-09)
  • Proteoglycan Proteoglycan, derived from salmon nasal cartilage (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (product code: 162-22131, 168-22133))
  • the observation results of the expression level of luciferase (transcriptional activity of Hes-1) in each well are described below.
  • the expression level of the control group is 100
  • the expression level of the group of medium 1 is 123.83
  • the expression level of the group of medium 2 is 131.24
  • the expression level of the group of medium 3 is 159.51
  • the expression level of medium 4 is The expression level of the group was 113.85
  • the expression level of the group of medium 5 was 119.67
  • the expression level of the group of medium 6 was 131.55. It is considered that the higher the expression level of luciferase, the higher the transcriptional activity of Hes-1 and that the cells maintain the undifferentiated state of neural stem cells.
  • Medium 6 is a cell that maintains the undifferentiated capacity of neural stem cells as a positive control, but compared to Medium 6 (medium that does not contain proteoglycan but has 3 times the bFGF content compared to the control). It was confirmed that the groups of medium 1, medium 2 and medium 3 (cells cultured in containing FGF-2, EGF and proteoglycan) maintained the undifferentiated state of neural stem cells.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of this experimental procedure.
  • Female mice on the 14th day of pregnancy were prepared using ICR mice manufactured by Japan SLC, Inc. Then, a mouse fetus existing in the body of the mouse was taken out, and cells dispersed from the cerebral cortex of the mouse fetus were prepared.
  • 0.05 w / v% trypsin a product of FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (0.25 w / v% trypsin-1 mmol / l EDTA.4Na solution (containing phenol red) (product code: 201-16945, 209-16941)
  • PBS a product of FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the following administration groups (control, medium 2, medium 7) were prepared using 180,000 cells out of the dispersed cells. The cells were used separately by 60,000 cells / sample. Seeding is performed in a 6-well plate (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., CAT # 140675) in which a predetermined liquid medium is present. In a 6-well plate, 2 ml of a predetermined liquid medium and 10,000 cells of this cell were uniformly seeded in each well. After this seeding, the cells were cultured for 6 days in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 . After culturing for 6 days, the formed cell mass in the 6-well plate of each administration group was observed by a predetermined phase contrast microscope (magnification: 20 times).
  • the composition of the liquid medium of each administration group (control, medium 2, medium 7) is as follows.
  • the control and medium 2 have the same composition as the liquid medium used in Experiment 1 above.
  • DMEM / Ham F-12 (Nacalai Tesque, Inc. 08460-95) was used as the basal medium, but the composition of each component in 50 ml is shown below.
  • N2 N-2 Supplement (100X) (Gibco: 17502-048)
  • B27 B-27 TM Plus Supplement Vitamin A-free (50X) (Gibco: A35828-01)
  • Heparin Sodium heparin (Nacalai Tesque (Product Codes: 17513-96, 17513-41, 17513-54)
  • Antibiotic Penicillin-Streptomycin (WAKO: 168-23191)
  • -BFGF bFGF (funakoshi: 100-18B)
  • EGF EGF (funakoshi: 315-09)
  • Proteoglycan Proteoglycan, derived from salmon nasal cartilage (Fujifilm Wako Pure Chemicals Co., Ltd. (product code: 162-22131, 168-22133)) It was GAG.
  • NS can be formed by the structure of proteoglycan (bonding structure of core protein and GAG structure).
  • neural stem cells were prepared as follows. Female mice on the 14th day of pregnancy were prepared using ICR mice manufactured by Japan SLC, Inc. Then, a mouse fetus existing in the body of the mouse was taken out, and cells dispersed from the cerebral cortex of the mouse fetus were prepared. In this dispersion, 0.05 w / v% trypsin (a product of FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (0.25 w / v% trypsin-1 mmol / l EDTA.4Na solution (containing phenol red) (product code: 201-16945, 209-16941)) diluted with PBS) was used.
  • trypsin a product of FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the dispersed cells 120,000 cells were used to prepare the following administration groups (control, medium 3). The cells were used separately by 60,000 cells / sample. A 6-well plate (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., CAT # 140675) in which a predetermined liquid medium was present was seeded. In a 6-well plate, 2 ml of a predetermined liquid medium and 10,000 cells of this cell were uniformly seeded in each well. After this seeding, the cells were cultured for 7 days in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 . After culturing for 7 days, the resulting cell mass was redispersed.
  • the following administration groups were prepared using the redispersed cells (120,000 cells).
  • the cells were used separately by 60,000 cells / sample.
  • a 6-well plate (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd., CAT # 140675) in which a predetermined liquid medium was present was seeded.
  • 2 ml of a predetermined liquid medium and 10,000 cells of this cell were uniformly seeded in each well.
  • the cells were cultured for 7 days in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the number of spheres (secondary spheres) formed in the resulting cell mass was confirmed using a predetermined phase contrast microscope (magnification: 20 times).
  • control and medium 3 have the same composition as the liquid medium used in Experiment 1 above.
  • FIG. 6 shows a photograph of this sphere (secondary sphere).
  • the secondary sphere is shown by the arrow in FIG.
  • formation of secondary spheres stem cells that may give rise to glial cells
  • Regarding the number of spheres formed when the number of spheres formed in the control group was 100%, it was 132.7% in the medium 3 group.

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Abstract

【課題】神経幹細胞（特に成人細胞段階）の増殖を効率的に行いたい。 【解決手段】　ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する、神経幹細胞増殖用培地。好ましくは、プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである。更に好ましくは、プロテオグリカンがサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンである。

Description

神経幹細胞増殖用培地
　本発明は、新規神経幹細胞増殖用培地、その培地を用いた神経幹細胞増殖方法などに関する。
　パーキンソン病や脊椎損傷などの神経疾患の治療に、ドナー不足さらには倫理的問題などから、神経幹細胞を移植することも検討されている（非特許文献１、特許文献１）。
　ｉＰＳ細胞の発見により、例えば、患者本人からｉＰＳ細胞を作って、そのｉＰＳ細胞から神経幹細胞を誘導することが可能になり、自分の細胞を治療に使用できる自家移植を行うことも期待されている。しかし、患者本人の細胞からｉＰＳ細胞を経て神経幹細胞を作成するのに、半年以上と長い期間を要すると考えられている。それに加えて、ｉＰＳ細胞は細胞の株ごとに安全性や分化の方向性が大きく異なると考えらえており、安全なｉＰＳ細胞であることを検証するにはさらに長い期間を要するのが現状である。更に、脊髄損傷においては、患者の症状が固定する前に神経幹細胞を移植しないと効果がないと考えられている。そのため、例えば、このように細胞移植が有効な期間が限られる疾患では、ｉＰＳ細胞の移植技術を用いても患者本人の細胞を治療に使うことは難しいと考えられている（非特許文献１）。
Ｔａｋｅｓｈｉ　Ｍａｔｓｕｉら：ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ　２０１２，３０：１１０９－１１１９頁
特開２００５－２７８６４１
　現在も、例えば、患者自身の細胞から短時間で容易に安全な神経幹細胞（神経系の未分化な組織幹細胞）を製造する手段、より好ましくは分化された細胞が含有されずに神経幹細胞を製造する手段、が求められている。
　そこで、本発明は、短期間で容易に神経幹細胞を製造する手段を提供することを目的とする。
　本発明はかかる課題を解決するためになされたものであり、すなわち、本発明の１つは、「ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する、神経幹細胞増殖用培地」である。好ましくは、プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンであり、より好ましくは、プロテオグリカンがサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンである。
　他の実施形態は、「ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する培地を用いて、神経幹細胞又を培養する工程を含む、神経幹細胞の増殖方法」である。
　この培地を用いることにより、短期間で容易に神経幹細胞を製造することができる。
実験１にて行った実験手順の模式図である。 各投与群のニューロスフェアの形成数の測定結果である。縦軸は、ニューロスフェア（ＮＳ）の形成割合（％）を示すが、具体的にはコントロール群のＮＳの形成数を１００（％）とした場合のＮＳの形成割合（％）を示す。Ｄｕｎｎｅｔ法による統計解析を行い、＊は有意差を示し、ｐ＜０．０５である。 各投与群のニューロスフェアの観察結果である。 実験２にて行った実験手順の模式図である。 実験３にて行った実験手順の模式図である。 実験４の結果（スフェアの観察結果）である。図中の「―」は、２００μｍを示す。
　以下、本発明にかかる培地について説明する。
（神経幹細胞）
　神経幹細胞は、自己複製能と多分化能を併せもった、神経系の未分化な組織幹細胞、である。ヒトなどの哺乳類の胎生期の脳では、神経幹細胞が先ずは盛んに増殖することで自らの数を指数関数的に増やし、次いで、非対称***を生み出す。また、胎生後期や生後の脳では、アストロサイトやオリゴデンドロサイトを生み出すことが知られている。神経幹細胞は、中枢神経系を構成する主要な細胞型であるニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの供給源となる細胞である。本発明では、好ましくはヒト、マウスなどの哺乳類由来の細胞を用いる。
（プロテオグリカン）
　プロテオグリカンはコアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等のグリコサミノグリカン（以下ＧＡＧと表す。）と呼ばれる糖鎖が共有結合した糖タンパク質である。プロテオグリカンは、細胞外マトリックスの主要構成成分の一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。ＧＡＧ鎖は分岐を持たない長い直鎖構造を持つ。多数の硫酸基とカルボキシル基を持つため負に荷電しており、ＧＡＧ鎖はその電気的反発力のために延びた形状をとる。また、プロテオグリカンは、糖の持つ水親和性により、多量の水を保持することができる。プロテオグリカンに含まれる多数のＧＡＧ鎖群はスポンジのように水を柔軟に保持しながら、弾性や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。
　プロテオグリカンのコアタンパク質はマトリックス中の様々な分子と結合する性質をもつ。軟骨プロテオグリカンの場合、Ｎ末端側にヒアルロン酸やリンクタンパク質との結合領域を持ち、これらの物質と結合すること、同一分子間で会合することもある。Ｃ末端にはレクチン様領域、ＥＧＦ様領域などを持ち様々な他の分子と結合する。この性質により、プロテオグリカンはそれぞれの組織にあった構造を築く。プロテオグリカンのうち、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは、コンドロイチン硫酸がコアタンパク質に共有結合されているプロテオグリカンである。
　サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンは、サケの鼻軟骨から抽出して得られたプロテオグリカンである。ここで、サケは、例えばサケ属（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）に属する魚であるが、好ましくは細胞増殖性（例えば、培養したい細胞をより効率的に培養すること）の観点で学名が「Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｋｅｔａ」のサケが選択される。また、本発明に係る培地に含まれるプロテオグリカンの含有量は、例えば細胞増殖性の観点で、下限は好ましくは１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以上、更に好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上である。
　本発明に係る培地に含まれるプロテオグリカンは、例えば公報（日本特許第６３１７０５３号公報）に記載の方法で作製される。
（ＦＧＦ－２）
　ＦＧＦ－２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－２、繊維芽細胞成長因子）は、ｂＦＧＦとも呼ばれ、動物の神経組織、下垂体、副腎皮質、胎盤などから単離できる。ＦＧＦ－２は、神経分化、生存、再生を誘導すると共に、胚発生や分化を調節することが知られている。ＦＧＦ－２は、例えば、細胞増殖因子、血管新生因子、神経栄養因子として幅広い機能を有し、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を始めとする様々な細胞に対して、増殖活性を示す。
（ＥＧＦ）
　ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ、上皮増殖因子）は、上皮性細胞をはじめとする種々の細胞に対し増殖を促進する作用を持つポリペプチドである。ＥＧＦの作用は種特異性が少なく，上皮細胞，繊維芽細胞，肝細胞などさまざまな細胞に対し増殖効果を示す。生体においては細胞の増殖・分化に重要な役割を果たしている成長因子と考えられている。
（培地について）
　本発明で用いる、ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有されるために用いる基礎培地は、公知の培地を用いることができる。例えば、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミン）を含む培地（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ（例えば、以下実施例にて用いたＤＭＥＭ／ハムＦ－１２培地（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５））、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、α培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、Ｌ－１５培地、ＮＣＴＣ培地、Ｆ－１２培地、ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ培地）などである。また、必要に応じて、更なる添加物（抗生物質など）も含まれてもよい。
　本発明で用いる培地には、好ましくは、血清は含まれない場合もある。血清が含まれない場合もあるのは、血清には未知の分化誘導剤が含まれており、本発明のニューロン割合が高い分化を阻害し得る可能性もあるためである。例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン以外のニューロンを優先的に誘導したい場合には、血清の存在によりＧＡＢＡ作動性ニューロンの誘導割合が高くなる可能性があるため、血清は存在しないことが好ましいと考えられている。
　本発明で用いる培地の物質の状態は特に制限がないが、培地調製の簡便さ（例えば浮遊培養を行うときには培地調製をよりしやすいと考えられること）などの観点で液体培地の方が好ましい。
　（神経幹細胞の増殖方法）
　本発明の培地を用いて神経幹細胞を増殖させるために培養する期間は特に限定しないが、培養させる細胞を播種してから少なくとも３日間以上、好ましくは５日間以上、更に好ましくは７日以上が好ましい。
　この培養する温度は特に限定しないが、増殖の最適化を更に図る観点で、下限は好ましくは３６～３７℃以上、より好ましくは３６℃以上、更に好ましくは３６．５℃以上、増殖の最適化を更に図る観点で、上限は好ましくは３８．５℃以下、より好ましくは３８℃以下、更に好ましくは３７．５℃以下、である。
　この培養する環境のＣＯ２濃度は特に限定しないが、増殖の最適化を更に図る観点で、下限は好ましくは３．５％以上、より好ましくは４％以上、更に好ましくは４．５％以上、増殖の最適化を更に図る観点で、上限は好ましくは１０％以下、より好ましくは６％以下、更に好ましくは５．５％以下、である。
　この培養の仕方（例えば、浮遊培養、接着培養）は特に限定しないが、培養の簡便さ（例えば、含有成分を均質に混合しやすいと考えられること）などの観点で浮遊培養の方が好ましい。
［実験１：ニューロスフェア（ＮＳ）の形成数の測定と、ＮＳの観察］
　ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することに培養される細胞が神経幹細胞であることを確認等するために、ＮＳの形成数の測定とＮＳの形態の観察を行った。
（神経幹細胞の培養の手順）
　実験１で行った神経幹細胞の培養の手順（実験手順）を以下説明する。なお、図１には、この実験手順の模式図を示す。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％トリプシン－１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１－１６９４５、２０９－１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち２４万個の細胞を用いて、以下の投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種する。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、７日間培養した。７日間培養後、所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）により、各投与群の６ウェルプレート中の形成された細胞塊を観察した。この観察において、形成された細胞塊のうち半径５０μｍ以上のものをニューロスフェアと定めて、このニューロスフェアの数を測定した。なお、この７日間培養後の観察の比較対象として、各投与群の培養０日の観察も所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）を用いて同様に行った。
　各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３）の液体培地の組成は以下である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ－１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。
（コントロール）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカンの含有なし
（培地１）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１０μｇ／ｍｌ
（培地２）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１００μｇ／ｍｌ
（培地３）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１０００μｇ／ｍｌ
　なお、この各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３）に含有されている成分は、以下のものを用いた。
　・Ｎ２：Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：１７５０２－０４８）
　・Ｂ２７：Ｂ－２７ＴＭ　Ｐｌｕｓ　ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）　（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８－０１）
　・Ｈｅｐａｒｉｎ：　ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３－９６、１７５１３－４１、１７５１３－５４）
　・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８－２３１９１）
　・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００－１８Ｂ）
　・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５－０９）
　・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））
（各投与群のニューロスフェア（ＮＳ）の形成数の測定結果）
　この測定結果を図２に示す。この図２で示しているのは、コントロール群のＮＳの形成数を１００（％）とした場合のＮＳの形成割合（％）である。培地１は１１７．３１７７５３３７６０１４％であり、培地２は１３４．６７７９５０９４０２１８％であり、培地３は１４９．３０５５０８５５３６２３％である。プロテオグリカンの含有量が増加することにより、ＮＳの形成数が増加することが確認された。培地２と培地３については、コントロールと比べ、統計学的に有意にＮＳの形成数が増加することが確認された。
（ＮＳの観察結果）
　この観察結果を図３に示す。７日間培養後の観察結果（図３の「培養７日」）の比較対象として、培養０日（図３の「培養０日」）の観察結果も挙げている。コントロールに比べ、培地１～３では、多くのＮＳが確認された。なお、図３の矢印で示しているのは、一部のＮＳである。
　よって、ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することにより、より多くの神経幹細胞を増殖することが確認された。
［実験２：デュアルルシフェラーゼアッセイ（Ｈｅｓ－１の転写活性の確認）］
　神経幹細胞の未分化性の維持とアストロサイトへの分化を制御するタンパク質（転写因子）であるＨｅｓ－１の転写活性を確認することにより、上述の神経幹細胞（ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することに培養された細胞）が、未分化性の維持等がされているかどうかを確認した。
　このデュアルルシフェラーゼアッセイの手順を以下説明する。
　まず、神経幹細胞を準備した。なお、図４には、この実験手順の模式図を示す。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％　トリプシン－１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１－１６９４５、２０９－１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞を、約６万個／１サンプルずつに分けて、以下の７つの投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）用のサンプルを作製した。
　このサンプルに、トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、Ｎｅｏｎ（登録商標）　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、Ｈｅｓ－１ｃＤＮＡ及びレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）を遺伝子導入した。Ｈｅｓ－１ｃＤＮＡ及びレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）は、ａｄｄｇｅｎｅ社製の「ｐＨｅｓ１（２．５ｋ）－ｌｕｃ（Ｐｌａｓｍｉｄ　＃４３８０６）」を用いた。この遺伝子導入後、各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）の液体培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、１日間培養した。１日間培養後、各サンプルにルシフェラーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、ＮｅｏｎＴＭ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、検出システム（プロメガ株式会社、ＧｌｏＭａｘＴＭ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ）を用いて、各サンプルのルシフェラーゼの発現を観察した。
　このデュアルルシフェラーゼアッセイで用いた各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）の液体培地の組成は以下である。コントロールと培地１と培地２と培地３は、上述の実験１で用いた液体培地と同じ組成である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ－１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。なお、この培養において、コーニング社の「ＣｏｓｔａｒＴＭ　２４　ウェル」を用いた。
（コントロール）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカンの含有なし
（培地１）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１０μｇ／ｍｌ
（培地２）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１００μｇ／ｍｌ
（培地３）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１０００μｇ／ｍｌ
（培地４）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦの含有なし
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１０００μｇ／ｍｌ
（培地５）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦの含有なし
　・プロテオグリカン　最終濃度１０００μｇ／ｍｌ
（培地６）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  １５０μｌ（最終濃度３０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカンの含有なし
　なお、この各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）に含有されている成分は、以下のものを用いた。
　・Ｎ２：Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
　　　　　（ｇｉｂｃｏ：１７５０２－０４８）
　・Ｂ２７：Ｂ－２７ＴＭ　Ｐｌｕｓ　ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）
　　　　　（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８－０１）
　・Ｈｅｐａｒｉｎ：　ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３－９６、１７５１３－４１、１７５１３－５４）
　・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８－２３１９１）
　・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００－１８Ｂ）
　・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５－０９）
　・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））
　各ウェルにおけるルシフェラーゼの発現量（Ｈｅｓ－１の転写活性）の観察結果を以下記載する。コントロール群の発現量を１００としたところ、培地１の群の発現量は１２３．８３、培地２の群の発現量は１３１．２４、培地３の群の発現量は１５９．５１、培地４の群の発現量は１１３．８５、培地５の群の発現量は１１９．６７、培地６の群の発現量は１３１．５５であった。ルシフェラーゼの発現量が高いほど、Ｈｅｓ－１の転写活性が高くなり、神経幹細胞の未分化性を維持している細胞と考えられる。培地６はポジティブコントロールとして神経幹細胞の未分化能を維持している細胞とするが、培地６（プロテオグリカンは含有しないがコントロールと比較してｂＦＧＦの含有量が３倍である培地）と比較して、培地１、培地２及び培地３の群（ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することに培養された細胞）が神経幹細胞の未分化性を維持していることが確認された。
［実験３：ＮＳの形成数の測定］
　プロテオグリカンの代わりに、ＧＡＧを含有した培地にて、この培地で培養された細胞がＮＳの形成ができるかどうかを確認した。この実験３において、ＧＡＧは、プロテオグリカンと異なり、コアタンパク質が結合されていない。
　この実験３の手順を以下説明する。なお、図５には、この実験手順の模式図を示す。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％　トリプシン－１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１－１６９４５、２０９－１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち１８万個の細胞を用いて、以下の投与群（コントロール、培地２、培地７）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種する。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、６日間培養した。６日間培養後、所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）により、各投与群の６ウェルプレート中の形成された細胞塊を観察した。この観察において、形成された細胞塊のうち半径５０μｍ以上のものをニューロスフェアと定めて、このニューロスフェアの数を測定した。なお、この６日間培養後の観察の比較対象として、各投与群の培養０日の観察も所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）を用いて同様に行った。
　各投与群（コントロール、培地２、培地７）の液体培地の組成は以下である。コントロールと培地２は、上述の実験１で用いた液体培地と同じ組成である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ－１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。
（コントロール）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカンの含有なし
（培地２）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１００μｇ／ｍｌ
（培地７）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ  ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＧＡＧ　最終濃度１００μｇ／ｍｌ
　なお、この各投与群（コントロール、培地２、培地７）に含有されている成分は、以下のものを用いた。
　・Ｎ２：Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
　　　　（ｇｉｂｃｏ：１７５０２－０４８）
　・Ｂ２７：Ｂ－２７ＴＭ　Ｐｌｕｓ　ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）
　　　　（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８－０１）
　・Ｈｅｐａｒｉｎ：　ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３－９６、１７５１３－４１、１７５１３－５４）
　・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８－２３１９１）
　・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００－１８Ｂ）
　・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５－０９）
　・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））、なおこのプロテオグリカンから常法によりＧＡＧのみを精製し作製したものが実験３で用いたＧＡＧである。
ＮＳの形成数の測定結果を次に記載する。コントロールの群のＮＳの形成数を１００（％）とした場合のＮＳの形成割合（％）である。培地２の群は１１８．７％であり、培地７の群は５８．８％であった。プロテオグリカンの構造（コアタンパク質とＧＡＧ構造との結合構造）により、ＮＳの形成ができることが示唆された。
　［実験４：グリア細胞を生み出す可能性のある幹細胞の作製結果］
　本発明で用いる、ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有されるために用いる培地が、神経幹細胞だけでなく、グリア細胞を生み出す可能性のある幹細胞（神経幹細胞に比べ老化した細胞）を作製できる可能性について記載する。次のように実験を行った。
　まず、次のように、神経幹細胞を準備した。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％　トリプシン－１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１－１６９４５、２０９－１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち１２万個の細胞を用いて、以下の投与群（コントロール、培地３）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種した。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、７日間培養した。７日間培養後、できた細胞塊を再分散した。
　次に、この再分散した細胞（１２万個）を用いて、以下の投与群（コントロール、培地３）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種した。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、７日間培養した。７日間培養後、できた細胞塊について、所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）を用いて、スフェア（二次スフェア）の形成数などを確認した。
　なお、コントロールと培地３は、上述の実験１で用いた液体培地と同じ組成である。
　実験結果を図６に示す。図６では、このスフェア（二次スフェア）の写真を示す。図６の矢印で示すのが二次スフェアである。培地３の群では、二次スフェア（グリア細胞を生み出す可能性のある幹細胞）の形成を確認できた。このスフェアの形成数であるが、コントロールの群のスフェアの形成数を１００％とした場合、培地３の群では１３２．７％であった。
　以上、本発明の実施の形態（実施例も含め）について、図面も参照して説明してきたが、本発明の具体的構成は、これに限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、設計変更等があっても、本発明に含まれるものである。

Claims (8)

  1. ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する、神経幹細胞増殖用培地。
  2. 　プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである、請求項１に記載の培地。
  3. 　プロテオグリカンがサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンである、請求項１又は２に記載の培地。
  4. 　プロテオグリカンの含有量が、１μｇ／ｍｌ以上である、請求項１～３いずれかに記載の培地。
  5. 　ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有する培地を用いて、神経幹細胞を培養する工程を含む、神経幹細胞の増殖方法。
  6. 　プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである、請求項５に記載の神経幹細胞の増殖方法。
  7. 　プロテオグリカンがサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンである、請求項５又は６に記載の神経幹細胞の増殖方法。
  8. 　プロテオグリカンの培地中の含有量が、１μｇ／ｍｌ以上である、請求項５～７いずれかに記載の神経幹細胞の増殖方法。

     
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