CN110997706A - 通过利用地标转录因子的干细胞分化诱导神经祖细胞、寡树突细胞祖细胞及寡树突细胞 - Google Patents

通过利用地标转录因子的干细胞分化诱导神经祖细胞、寡树突细胞祖细胞及寡树突细胞 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种以前所未有的效率及功能性从人类iPSC诱导神经祖细胞、寡树突细胞祖细胞、寡树突细胞的新颖方法。本发明的核心是循着多能细胞到外胚层、神经外胚层到NPC到OPC到寡树突细胞路径的多个关键分化决定点处以早先未知的方式使用经实验发现的转录因子。

Description

通过利用地标转录因子的干细胞分化诱导神经祖细胞、寡树 突细胞祖细胞及寡树突细胞
相关申请案
本申请案要求2017年7月13日提交的美国临时申请案第62/532,246号的优先权。
技术领域
本发明涉及诱导及/或引导多能干细胞分化成神经祖细胞、分化成寡树突细胞祖细胞、分化成寡树突细胞的分化级联，其是透过动力学受控的细胞生长过程使用细胞密度、试剂浓度的特定组合及范围与mRNA的特定组合完成的。
背景技术
人类干细胞的产生及随之而来的分化方面的最新成果已改变关于细胞命运的可塑性、人类疾病模型及临床疗法的范例。从体细胞制得的胚胎干细胞(ESC)及诱导性多能干细胞(iPSC)二者可分化成与其对应初生细胞无法区分的一系列日益增加的特定细胞类型。
发明内容
本发明提供通过调节细胞生长动力学及相关参数来诱导干细胞及分化的方法，据此使用细胞密度、试剂浓度的特定组合及mRNA的组合来控制分化/诱导方向。在一个方面，本发明的一个有用性为提供神经祖细胞(NPC)及寡树突细胞祖细胞(OPC)(所述寡树突细胞祖细胞可变为具有功能及成熟的寡树突细胞)的新研发方案，以及直接提供用于治疗涉及各种类型的髓鞘相关疾病及损伤的寡树突细胞。
本发明提供利用在组织特异分化中具高度性能及良好表达的主控基因或关键转录因子的分化方法。更具体地说，这些因子是以经由本发明证明的经恰当修饰及纯化的mRNA分子形式引入到多能干细胞中。
在一个方面，本发明提供诱导细胞分化的方法，其包括：使用关键细胞命运因子及经优化以将干细胞朝向不同细胞类型引导的具有激活区的常规转录因子(TF)之间的融合；将这些因子作为合成信使RNA(mRNA)以优选密度通过产生适当水平的转基因表达的方法引入到经培养的多能干细胞中；以及将细胞维持在经优化条件下以产生高效特异性分化，从而将干细胞或祖细胞的多能状态或祖细胞状态朝向特异性谱系或组织细胞类型诱导。
在另一方面，本发明提供用于将干细胞或祖细胞的多能状态或祖细胞状态朝向特异性谱系或组织细胞类型改变的方法，其包括以下中的至少一者：产生表达关键细胞命运基因的干细胞(统称为干细胞)，包含关键细胞命运因子及经优化以将干细胞朝向不同类型的细胞引导的具有激活区的常规转录因子(TF)之间的融合；将这些因子作为合成信使RNA(mRNA)以优选密度通过产生适当水平的转基因表达的方法引入到经培养的多能干细胞中；将细胞维持在经优化条件下以产生高效特异性分化。
在另一方面，本文中公开用于诱导诱导性多能干细胞(iPSC)及/或胚胎干细胞(ESC)分化成神经祖细胞(NPC)的方法，其中所述方法包含以下步骤：
a)将iPSC及/或ESC接种在经涂布、未经组织处理的培养盘上；
b)用编码一或多种细胞命运因子的呈个别mRNA或组合mRNA的mRNA转染步骤a)的细胞；及
c)培养步骤b)的所述iPSC及/或ESC直到细胞分化成NPC。
d)在需要大量NPC时，来自c)的NPC可以通过以下扩增：将所述细胞转移到以便在悬浮液中生长的未经涂布、超低附着条件下。
在这个方面的一实施例中，步骤b)的所述细胞命运因子选自由以下中的一或多者组成的群组：Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2及FoxO家族因子，其是呈个别mRNA或组合mRNA转染。在一些实施例中，经转染RNA的量是6孔盘每孔约10ng到约200ng或约20ng到约200ng，或当使用其它类型的盘或培养烧瓶时，基于容器的面积或培养基量的体积按比例调整。在一些实施例中，重复转染至少再一次。可以间隔约24小时重复转染。在另一实施例中，细胞命运因子可与例如但不限于MyoD或VP16的激活区融合。在一些实施例中，培养步骤c)的细胞直到细胞表达步骤c)的细胞命运因子中的一或多者。可利用(但不限于)免疫分析及/或qt-PCR确定是否表达细胞因子。在另其它实施例中，可任选地添加SB43542、LDN193189及PD173074中的一或多者到步骤c)的细胞中。在一些实施例中，步骤a)到c)的培养条件为在约2％到约6％的氧浓度中。在本发明的一实施例中，用于步骤a)到c)的培养基是选自最低必需培养基-α(MEMa)、改良杜氏伊格尔培养基:营养混合物F-12(Dulbecco's Modified EagleMedium:Nutrient Mixture F-12；DMEM/F12)或具有B27补充剂的DMEM。培养基亦可含有其它组分，例如Knock Out血清替代物(Knock Out Serum Replacement；KSR)及bFGF、N2或B27、BSA或HSA中的一或多者。在另一实施例中，培养容器是经基质胶及/或PLO-层黏连蛋白涂布。在方法的一实施例中，步骤a)的iPSC及/ESC是以每孔约0.75×105个细胞到约1.5×106个细胞接种在六孔盘中。可利用其它尺寸的培养容器。六孔盘以外的其它培养容器的接种密度可依据使用约70,000个细胞到约14,000,000个细胞，且以细胞数目除以培养容器的生长面积来决定，例如，如表2中所展示。在一些实施例中，步骤c)的细胞经培养约3到约10天，其中细胞具有星形胶质细胞样或神经元样形态。在约3到约10天之后，接近于约100％且高于约75％的细胞将具有NPC细胞的特征形态。在一些实施例中，约40-60％的细胞将具有NPC细胞的特征形态。如果低于约40％的细胞具有NPC细胞的特征形态，那么可利用细胞分选法分离细胞。利用悬浮液培养***进一步培养可以进一步选择。在一些实施例中，NPC可通过显现例如Pax6的细胞命运因子中的一者的表达来确认。
本发明的另一方面是从NPC产生寡树突细胞祖细胞(OPC)的方法，其中所述方法包含以下步骤：
a)将NPC接种在经涂布培养容器上的培养基中；
b)用编码一或多种细胞命运因子的呈个别mRNA或组合mRNA的mRNA转染步骤a)的细胞，以将神经祖细胞分化成寡树突细胞祖细胞；
c)培养步骤c)的细胞直到NPC的形态改变为OPC的形态；
d)在需要大量OPC时，来自c)的OPC可通过以下扩增：将所述细胞转移到以便在悬浮液中生长的未经涂布、超低附着条件下。
在此方法的一实施例中，在步骤a)中，六孔盘的孔是接种约0.75×105个细胞到约1.5×106个细胞。可利用其它尺寸的培养容器。六孔盘以外的其它培养容器的接种密度可基于利用约70,000个细胞到约14,000,000个细胞且以细胞数目除以培养容器的生长面积而确定，例如，如表2中所展示。在另一实施例中，用于步骤b)中的转染的mRNA编码细胞命运因子，所述mRNA是选自由个别性地或呈组合的Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA组成的群中的一或多者。在另一实施例中，当使用六孔盘时，步骤b)中的转染剂量为约20ng-约100ng/细胞命运因子，或当使用其它类型的盘或培养烧瓶时，那么基于容器的面积或培养基量的体积而按比例调整。在另一实施例中，第一次转染之后，当使用六孔培养盘时以约10ng/细胞命运因子到约200ng/细胞命运因子或在利用其它类型的盘或培养烧瓶时基于容器的面积或培养基量的体积按比例调整的mRNA的剂量重复转染至少再两次。在另一实施例中，培养容器盘是经基质胶及/或PLO-层黏连蛋白涂布。在另一实施例中，用于步骤a)到c)的培养基选自DMEM/F12、DMEM及MEMa。在一些实施例中，培养基补充有KSR、抗坏血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰岛素、RA、B27、CAMP及/或生物素中的一或多者。在方法的一实施例中，步骤a)到d)的培养条件为在约2％到约6％的氧浓度中。在另一实施例中，步骤c)中的细胞经培养约4到约20天，直到观测到具有OPC的形态学特征的细胞。在另一实施例中，OPC产生可基于双极形态及/或细胞命运因子中的一者的表达来确认。在约4到约20天之后，接近于约100％且高于约75％将具有OPC细胞的特征形态。在一些实施例中，约40-60％的细胞将具有OPC细胞的特征形态。如果低于约40％的细胞具有OPC细胞的特征形态，那么可利用细胞分选以分离细胞。利用悬浮液培养***的进一步培养允许进一步选择。在一些实施例中，OPC的确认可通过例如Oligo2或Sox10的细胞命运因子中的一者的表达来展示。
在本发明的另一方面为从OPC产生寡树突细胞的方法，所述方法是基于以下步骤：
a)将OPC接种在经涂布培养容器上的培养基中；及
b)培养步骤a)的细胞直到细胞出现分支链细胞过程及/或产生髓鞘碱性蛋白(MBP)。
在此方法的一实施例中，用于步骤a)到c)的培养基选自DMEM/F12、DMEM或MEMa。培养基可补充有选自由以下组成的群组的培养基补充剂中的一或多者：KSR、抗坏血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3及胰岛素。在另一实施例中，步骤a)的OPC是使用6孔盘每孔接种约0.75×105个细胞到约1.5×106个细胞。六孔盘以外的其它培养容器的接种密度可基于利用约70,000个细胞到约14,000,000个细胞且以细胞数目除以培养容器的生长面积而确定，例如，如表2中所展示。在另一实施例中，步骤b)的细胞经培养约7到约30天，此时将存在具有分支链细胞过程的细胞。在另一实施例中，步骤a)中的细胞培养容器是经基质胶及/或PLO-层黏连蛋白涂布。
在本发明的另一方面中为相继地或直接地利用以下步骤来诱导例如iPSC或胚胎干细胞的干细胞分化成NPC、OPC、寡树突细胞的方法：
a)将iPSC及/或ESC接种在经涂布培养容器上，其中iPSC及/ESC是以每孔约0.75×105个细胞到约1.5×106个细胞接种在6孔盘的培养基中，或如果利用其它培养容器则按比例调整接种，所述培养基包括最低必需培养基-α(MEMa)或改良杜氏伊格尔培养基:营养混合物F-12(DMEM/F12)或具有B27补充剂的DMEM，所有培养基具有Knock Out血清替代物(KSR)；
b)用编码细胞命运因子的mRNA转染步骤a)的细胞，所述细胞命运因子选自由以下中的一或多者组成的群组：Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2及FoxO家族因子，其是呈个别mRNA或组合mRNA转染；
c)培养步骤b)的所述iPSC及/或ESC直到细胞分化成NPC；
d)分离来自步骤c)的NPC；
e)将NPC接种在经涂布细胞培养容器上，其中NPC是以每孔约0.75×105个细胞到约1.5×106个细胞接种在6孔盘的培养基中，或如果利用其它培养容器则按比例调整接种，所述培养基包括MEMa或DMEM/F12或DMEM，全部具有KSR及选自由以下组成的群组的培养基补充剂中的一或多者：抗坏血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰岛素、RA、B27、CAMP及生物素；
f)用由个别性地或呈组合的以下组成的群组中的一或多者利用转染试剂转染步骤e)的细胞：Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA；
g)以约10ng到约200ng(6孔盘的每孔)的剂量重复步骤e)的转染至少再两次；
h)培养步骤g)的细胞直到细胞的形态从NPC细胞的形态改变为OPC细胞的形态；
i)分离来自步骤h)的OPC；
j)将来自步骤j)的经分离OPC接种到经涂布细胞培养容器上，其中OPC系以每孔约0.75×105个细胞到约1.5×106个细胞接种在6孔盘的培养基中，或如果利用其它培养容器则按比例调整接种，所述培养基包括MEMa或DMEM/F12或DMEM，全部具有KSR及选自由以下组成的群组的培养基补充剂中的一或多者：抗坏血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3及胰岛素；及
K)培养所述细胞至少约1周，直到寡树突细胞出现树枝状过程及/或产生髓鞘碱性蛋白(MBP)。
在本发明的另一方面，从接受者，例如从体液或组织，采集本文中所公开的方法的起始细胞。
本发明的另一方面为从所公开的方法获得的NPC、OPC及寡树突细胞。在此方面的一实施例中，细胞可用作医药组合物以治疗疾病、病症或畸形。此类疾病、病症及畸形可包含但不限于：神经变性病状，例如急性神经变性病状，例如大脑损伤(局灶性或弥漫性大脑损伤)、脊髓损伤或外周神经损伤，例如，由物理或化学烧伤、深切口或肢体分离、脑血管机能不全造成。在其它实施例中，其为慢性或进行性神经变性病状，例如帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、肌肉萎缩性侧索硬化、肿瘤或慢性外周神经损伤、匹克症(Pick's disease)、弥漫性路易体疾病、进行性核上麻痹(斯蒂尔-理查德森症候群(Steel-Richardson syndrome))、多***变性(夏伊-德尔格症候群(Shy-Drager syndrome))、与神经变性相关的慢性癫痫病状、包含肌肉萎缩性侧索硬化的运动神经元疾病、退化性共济失调、皮层基底节变性、关岛型ALS-帕金森氏痴呆综合症、亚急性硬化性全脑炎、共核蛋白病(包含多发性***萎缩症)、原发性进行性失语症、黑质退化症、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)/3型脊髓小脑失调及橄榄体脑桥小脑变性、妥瑞症(Gilles De LaTourette's disease)、延髓及假性延髓麻痹(bulbar and pseudobulbar palsy)、脊椎及脊髓延髓肌肉萎缩(spinal and spinobulbar muscular atrophy)(肯尼迪氏病(Kennedy's disease))、原发性侧向硬化、家族性痉挛性截瘫、沃德尼格-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann disease)、库格尔伯格-威兰德病(Kugelberg-Welander disease)、塔伊-萨奇氏疾病(Tay-Sach's disease)、山多夫氏病(Sandhoff disease)、家族性痉挛性病、沃法特-库格尔伯格-威兰德病(Wohlfart-Kugelberg-Welander disease)、痉挛性截瘫、进行性多病灶脑白质病、家族性自主神经失调(里雷-戴症候群(Riley-Day syndrome))及朊病毒疾病(包含但不限于库贾氏症(Creutzfeldt-Jakob)、GSS病(Gerstmann-
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-Scheinkerdisease)、库鲁病及致死家族性失眠)。在另其它实施例中，其为与髓鞘脱失相关的疾病，例如多发性硬化症、急性播散性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、横贯性脊髓炎、慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病、格-巴二氏症候群(Guillain-Barrésyndrome)、脑桥中央髓鞘溶解症(central pontine myelinosis)、例如脑白质障碍的遗传性脱髓鞘疾病、恰克-马里-杜斯氏症(Charcot-Marie-Tooth disease)及卡纳万病(Canavan disease)。
附图说明
现将相对于如下文所描述的图式描述本发明的方面：
图1.神经祖细胞(NPC)诱导的示范性实施例。
图2.寡树突细胞祖细胞(OPC)诱导的示范性实施例。
图3.寡树突细胞诱导的示范性实施例。
图4.寡树突细胞进一步培养及成熟的示范性实施例。
图5.衍生自人类iPSC的寡树突细胞展示特异性细胞标记物的示范性实施例。
图6.利用基于CRISPR-Cas的基因表达调节剂来实现经分化的细胞内部的不同关键TF mRNA含量的示范性实施例。
具体实施方式
在描述本发明时，本文中未定义的全部术语具有其在所属领域中认识的常见含义。在以下描述具有本发明的具体实施例或特定用途范围内，打算仅为说明性的且不限制所主张的发明。以下描述打算涵盖包含于本发明的精神及范围中的所有替代方案、修改及等效物。
iPSC在个体化用药领域中展示特定潜力，这是由于细胞的无限可用性、获得细胞的程序的非侵入性及对于个别患者的各治疗为免疫匹配的可能性，从而免于使用免疫抑制药物。
细胞替代治疗为治疗各种损伤及为治疗或预防先前无实际治疗的各种人类疾病提供新希望。举例来说，由事故导致的脊髓损伤、例如多发性硬化症的其它脊髓病状及各种脑白质营养不良(leukodystrophy)当前在医院中处理而无需修正髓鞘及其神经功能损失的手段。寻找NPC、OPC及寡树突细胞的可信赖供给源仍为待克服的显著障碍。尽管明确需要可帮助具有脊髓损伤或脊椎疾病的患者的细胞，但单研究人员及公司的努力迄今尚未提供可产生具有成熟形态的完全功能寡树突细胞的方法。即使NPC或OPC将用于治疗脊髓病状，但这些前体产生成熟、功能性、正常寡树突细胞的能力仍为其用于医学治疗的潜能的关键测量。
从多能干细胞衍生功能组织细胞的最新方法需要在各步骤沿分化级联利用生长因子、激素、细胞介素、信号肽及其它细胞间信号分子(在本发明中为简单起见统称为“生长因子”)的组合，以产生医疗上适用的NPC、OPC或寡树突细胞。令人遗憾地，在作为纯化多肽供应时，生长因子通常为昂贵的、不稳定的且批次间不兼容，使得其难以使用。另外，因为生长因子以高度特异性又组合的方式起作用，所以分化的各阶段由不同组生长因子指示，其优化困难且昂贵。如本文中所公开，NPC、OPC及寡树突细胞可以极高效且以低成本通过以恰当剂量及递送条件在关键命运改变点处组合mRNA而无需利用大量生长因子来实现。
为缓解成本负担及不一致性，熟习所属领域者常常采取寻找可影响信号路径的小分子作为生长因子受体的促效剂或拮抗剂，由此以取代生长因子的方式。小分子通常远比生长因子便宜。然而，小分子的一个主要不足之处在于非特异性影响，其可作用于非预期标靶，例如细胞膜结合受体、细胞内细胞器、或基因组组分等。本发明还提供在不使用或减少使用小分子的情况下实现细胞命运确定的新颖方法。
迄今，如果有任何信息，那么仅有关于如何将多能干细胞一直分化成寡树突细胞的极有限信息，可能是因为用生长因子及小分子通过各阶段导引分化细胞的详细道路图尚待通过繁琐实验来获取。因为mRNA更具有特异性，通过编码功能性蛋白，在引导细胞及发育事件中，所公开的方法比在产生原发性寡树突细胞样细胞、为人类治疗铺设治疗脊髓损伤、缺陷、疾病及髓鞘的道路及其它相关健康问题中的任何已知方法更稳固。
典型分化方案的另一关键组分是培养细胞的培养基，所述培养基可由营养物质(脂质、氨基酸、碳水化合物、维生素等)、恰当浓度的盐、pH缓冲剂、关键元素及例如胰岛素或血清白蛋白的常见蛋白因子形成。不同类型的细胞具有不同的营养物质及培养基组分需求且由用于信号传递的细胞类型特异性生长因子及小分子进一步复杂化。因此，专用“分化培养基”常常通过每次去除或添加一种组分来费力地测试。本发明的主要益处是通过利用恰当供应的引导分化基因的mRNA来简化建立分化培养基。然而，mRNA及适当培养基的最优选组合可进一步有益于过程且为本发明的整体部分。
在干细胞衍生的组织细胞的临床应用中，所建立的分化培养基的大多数组分需要在当前良好作业规范(cGMP)规章下的个体认证；例如，需要通过专用程序生产且需要个体认证的生长因子。同样地，添加到特异性分化培养基中的一些小分子通过在纯度、稳定性及毒性方面变化的专用化学合成方法制造。在干细胞培养物的领域中，一些先前公开的方案同样依赖于动物产物，例如血清或基质胶。本发明背后的另一激励为创建主要基于适合于均匀认证及质量控制过程的单一类型的分子的新方法。
本文中所描述的是涉及可如何控制细胞密度及***速率以实现所需分化结果的过程。本发明进一步教示优化时序、添加顺序、RNA剂量及在RNA转染期间不同RNA之间的比值以及其持续时间或重复次数。本发明进一步涉及培养容器的表面及例如氧浓度的环境条件的选择。本发明进一步包含选择所需细胞或提高其在总群体中的百分比的方法，以及冷冻保存及再培养分化细胞的方法。
基于在肌肉(MyoD)、眼睛(Pax6)及发生生物学的其它领域中的研究，一般已接受以下概念：“主控”基因，即一种关键基因(通常为转录因子基因，有时是共同发挥作用的少数基因)，其在发育期间可决定细胞及组织的命运及最终整个器官的形成。ShinyaYamanaka发现：经分化细胞可通过透过病毒传递干细胞中所表达的一群选择的转录因子的表达作用而逆转成多能状态，这证明少数关键转录因子在通过冗长多阶段命运变化驱动细胞中的能力。其它团体对iPSC产生的研究扩大了再程序化因子的选择且证明出于再程序化的目的可容许转录因子选择中有一些变化。在Yamanaka的初始研究中，透过将病毒载体整合到基因组中的应用可以完成再程序化因子的表达，因为需要这些因子的长期表达来影响细胞转形。伴随所产生的基因组的修饰是对iPSC的治疗性应用的重要障碍，而从经整合病毒盒的再活化表达的可能性即使在活体外的研究仍为关注点。如由当前发明人团体最近公开的将mRNA转染应用于再程序化为尤其吸引人的，因为此***可以让再程序化混合物的表达及甚至仅通过改变添加到细胞培养基中的转录物在短时间范围内即调节个体组分因子。一旦终止特定因子的转染，靶细胞内的异位表达会因为细胞质内mRNA的快速衰减而迅速停止。尽管mRNA不会继续留存于靶细胞中，但其在细胞质中直接被转译，而无需如在转染DNA及整合病毒载体的情况下的速率限制核易位的能力远超过对mRNA的短暂半衰期的补偿，从而在一段小时间段引起高效表达但表达良好，这对于细胞命运确定而言至关重要。
当持久性DNA载体(例如附加型质体(episomal plasmid))用于细胞命运改变时，其需要断开(weaning)，以降低任何逢机性基因组整合的风险。例如仙台病毒(Sendaivirus)或委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis，VEE)病毒的RNA病毒或病毒衍生物即使经修饰成非感染性RNA复制子之后仍携带有易于与隐藏在宿主基因组中的病毒元素再结合的病毒元素。在没有频繁发现呈负面数据形式的证明下始终难以完全确定细胞不含病毒载体。本发明公开多个发明步骤，旨在将基于mRNA的细胞命运确定的优势应用于引导式分化。综上所述，本发明是教示在简化方法中的单轮或多轮异位转录因子表达以引导细胞分化。
尽管如此，基于mRNA的干细胞分化存在技术障碍。并非所有干细胞类型及培养基均同等有助于高效mRNA传递，且此目前为基于mRNA的分化的障碍。另外，干细胞(尤其是大部分人类干细胞系)在没有形成抗转染贴片的情况下相当难以培养。如本文中所公开，多能干细胞可在使得大部分细胞可经mRNA转染的条件下生长。在另一实施例中，将RNA及转染试剂的以下剂量(两者具有关联性的毒性)提供给细胞：能够发挥主控基因影响，同时在面对因细胞命运改变过程产生的促凋亡及细胞生长抑制力时支持靶细胞的存活率。
因此，鉴于与先前已知干细胞分化程序相关的问题，本文中所描述的新颖方法、材料及方案以所得细胞的过程及质量的改进效率从iPSC或胚胎干细胞(ESC)产生不同细胞类型。本发明展示经由增强传递到标靶干细胞的TF mRNA的显著改进。本发明还提供支持在不利用滋养细胞或任何其它可能异种污染物的情况下，从人类干细胞产生无痕迹组织细胞的新颖方案。新方案扩展经修饰的mRNA的益处且帮助清除干细胞衍生技术的治疗性应用的剩余障碍。
鉴于从多能到末端分化状态的分化常常采取多步骤，从而需要若干周到甚至若干月的时间范围，基于生长因子的步进式策略本质上为低效且繁琐的。因此，本发明的实施例根本上去除在导引神经祖细胞到寡树突细胞祖细胞到寡树突细胞的产生中对生长因子的需求。
更具体地说，本发明涉及通过表达关键细胞命运基因将干细胞或祖细胞(统称为干细胞)的多能状态或祖细胞状态朝向特异性谱系或组织细胞类型改变，所述关键细胞命运基因包含关键细胞命运因子及经优化以将干细胞朝向不同类型的细胞引导的具有例如MyoD或VP16的激活区的常规转录因子(TF)与本领域中通常已知的提供较强转录活化活性的多种其它转录因子之间的融合；将这些因子作为合成信使RNA(mRNA)以优选密度通过产生适当水平的转基因表达的方法引入经培养多能干细胞中；将细胞维持在经优化条件下以产生先前难达成的特异性分化效率。通过引入mRNA表达的因子还可包含生长因子、细胞介素、激素、信号肽及影响分泌因子或修饰酶的其它细胞命运。利用类似程序，微RNA(miRNA)或其它编码非蛋白质的RNA可在细胞状态转换下引入细胞中，以便引导分化，这是因为这些非编码RNA可控制或影响TF、基本上提供与直接转染TF mRNA相同的效果。此外，如实例中所描述的对分化关键的TF可通过使用经修饰CRISPR-Cas9***活化，其中经工程改造的Cas9(例如未切割Cas9)或其它Cas家族成员蛋白质与转录活化结构域(及在一些情况下，用于抑制具有与所需TF相反效果的TF的转录抑制结构域)、染色体修饰酶或其酶促结构域或其它表观遗传修饰酶或其酶促结构域连同将这些作用结构域引导到染色体上的标靶TF基因附近的导引RNA融合。本文中所公开的为除在需要DNA分子作为模板以改变基因组序列时外，出于与上文所描述相同的益处，用于细胞分化、优选地仅利用RNA作为在标靶细胞内部传递的分子的CRISPR-Cas***。与所属领域中已知的其它方法相比，本文中所公开的方法大大减少涉及干细胞分化成NPC、OPC及寡树突细胞的时间、成本及工作量。
本文中本发明特异性详细描述将干细胞或祖细胞的多能状态或原始状态朝向特异性谱系或组织细胞类型改变的方法，包括以下中的至少一者：表达关键细胞命运基因，包含经优化用于将干细胞朝向不同类型的细胞引导的关键细胞命运因子；将这些因子作为合成信使RNA(mRNA)以优选密度通过产生适当水平的转基因表达的方法引入经培养多能干细胞中；以及将细胞维持在经优化条件下以产生高效特异性分化。
在某些实施例中，提供完全稳定化、经扩增的人类ESC或iPSC。
在某些实施例中，无需清除游离基因体或RNA病毒(例如仙台病毒)，其在分离后可进行10多次iPSC继代。
在某些实施例中，所述过程没有滋养层。
在某些实施例中，所述过程没有异种成分，包括所有合成性或人类试剂，且没有非人类动物衍生的组分。
在某些实施例中，所述过程没有留下足迹：不会将DNA逢机性整合到基因组中(如附加型DNA构建体常常发生)。
在某些实施例中，mRNA的功能可通过利用非编码RNA(包含miRNA)或导引RNA/Cas融合***在理解哪些TF的活性对下文实例中所公开的特异性分化步骤为关键的情况下来实现。
在某些实施例中，所述过程经由患者特异性起始组织及/或基因组编辑来获得完全客制化的遗传基因背景。
定义
如本文中所使用，术语“约”意谓20％内、更优选地10％内且最优选地5％内。当用于天数的上下文中时，术语“约”意谓或多或少一天或两天。因此，如果细胞培养物经培养约3到约10天，那么这可意谓3到10天、1到12天或2到11天。
术语“寡树突细胞样细胞”欲意谓与寡树突细胞共有特性的细胞。寡树突细胞样细胞通过形态特征以及藉特异性标记物特征进一步定义。由于诱导性多能干细胞衍生的寡树突细胞样细胞与原发性寡树突细胞共有类似特征(包含标记物及激素特征)，所以诱导多能衍生的寡树突细胞样细胞可与诱导性多能干细胞衍生的寡树突细胞或简单地寡树突细胞互换使用。
“胚状体”是指衍生自多能细胞的细胞的聚集体，其中细胞聚集可通过防止细胞黏附到表面以形成典型的集落生长的任何方法引发。如本文中所使用，“胚状体”是指多能干细胞的三维球状体聚集体，包含但不限于衍生自来自哺乳动物来源的胚胎的囊胚阶段的胚胎干细胞。胚状体可由经由所属领域中一般已知的任何技术衍生的胚胎干细胞形成，所述技术包含但不限于为获得诱导性多能干细胞的体细胞的体细胞核转移或再程序化。
如本文中所使用，术语“诱导性多能干细胞”是指衍生自体细胞(例如成人体细胞)的多能干细胞。诱导性多能干细胞在其形成任何成人细胞类型的分化能力方面类似于胚胎干细胞，但并非衍生自胚胎，即能够分化成自非多能细胞人工衍生(非天然地衍生)的多种细胞类型的细胞。
如本文中所使用，“细胞”、“细胞系”及“细胞培养物”包含子代。还应理解因有意或无意突变所致，所有子代在DNA内含物方面可能不会精确一致。包含具有与最初转型细胞中所筛检相同的功能或生物性质的变异体子代。
如本文中所使用，“组合物”是指活性剂与至少一种其它惰性(例如，可检测试剂或标记)或活性化合物或分子，例如佐剂的组合。在本发明的上下文中，组合物还将包含从本文中所描述的方法产生的经分化细胞，包含NPC、OPC及寡树突细胞。
如本文中所使用，“培养”是指将细胞维持在其中所述细胞可增殖且避免以细胞群形式衰老的条件下。“培养”还可包含细胞亦或可替代地分化的条件。
如本文中所使用，“差异表达”是指相比于由正常或对照细胞中的相同基因或调节区产生RNA的水平，RNA的差异产量，所述RNA包含但不限于从基因组或由基因编码的蛋白质产物的基因或调节区转录的mRNA、tRNA、miRNA、siRNA、snRNA及piRNA。在另一情况中，“差异表达”亦指与正常或对照细胞相比，具有不同时间及/或空间表达图谱的细胞或组织中的核苷酸序列或蛋白质。
如本文中所使用，“过度表达(overexpressed/overexpression)”是指相比于正常或对照细胞中的RNA或蛋白质产物的表达量，由基因编码的RNA或蛋白质产物的表达量增加。
如本文中所使用，“不足表达(underexpressed/underexpression)”是指相比于正常或对照细胞中的RNA或蛋白质产物的表达量，由基因编码的RNA或蛋白质产物的表达量减小。
如本文中所使用，“分化(differentiate/differentiation)”是指前体或祖细胞(即，神经祖细胞)分化成例如寡树突细胞的特异性细胞类型的过程。
如本文中所使用，“有效量”是足以实现细胞、组织、***、动物或人类的有益或所需生物、情感、医药或临床反应的量。有效量可以一或多次投药、施用或剂量形式来投与。所述术语在其范围内还包含有效增强正常生理功能的量。
如本文中所使用，在细胞的上下文中的“扩增(expansion/expanded)”是指特征细胞类型或可能相同或可能不相同的来自原始细胞群的细胞类型的数目的增加。用于扩增的原始细胞不必与经扩增所产生的细胞相同。举例来说，经扩增的细胞可通过原始细胞群以离体方式或活体外方式生长及分化而产生。
如本文中所使用，“表达”是指聚核苷酸转录成RNA转录物的过程。在mRNA及其它转译RNA物种的上下文中，“表达”亦指经转录的RNA随后转译成肽、多肽或蛋白质的一或多个过程。
如本文中所使用，“不含整合的iPS细胞”是指不含整合于非多能细胞的基因组中的外源性转基因的iPS细胞。
如本文中所使用，“分离”意谓与成分、细胞及其它者分离，其中聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常在性质上相关。非天然产生的聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”以将其与其天然产生的对应物区分。相对于如本文中所描述的NPC、OPC及寡树突细胞，分离意谓与未经分化细胞分开且分离所关注细胞的纯净群体。
如本文中所使用，“浓缩”是指可与其天然存在对应物区分的分子，包含但不限于细胞、特定类型的细胞、聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，因为每体积的分子浓度或数目大于其天然存在对应物的每体积的分子浓度或数目。
如本文中所使用，“稀释”是指可与其天然存在对应物区分的分子，包含但不限于细胞、特定类型的细胞、聚核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段，因为每体积的分子浓度或数目小于其天然存在对应物的每体积的分子浓度或数目。
如本文中所使用，“分离”是指与初始源或群体物理分开的状态，以使得可不再考虑分离的化合物、细胞、试剂、颗粒或分子为初始源或群体的部分。
如本文中所使用，出于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包含人类、家畜及农畜、非人类灵长类动物及动物园、运动或宠物动物，例如但不限于狗、马、猫及牛。
如本文中所使用，“干细胞”是指能够分化成多个细胞类型的任何自身更新分化全能、多能细胞或多潜能细胞或祖细胞或前体细胞。
如本文中所使用，“分化全能”是指可分化且在生物体中产生所有细胞类型的细胞加胚胎外细胞或胎盘细胞。
如本文中所使用，“多能”是指除胚胎外细胞或胎盘细胞以外，可分化且产生构成生物体的包含任何胎儿或成人细胞类型的所有细胞类型的细胞。
如本文中所使用，“多潜能”是指可产生超过一种细胞类型但在其可产生的细胞类型方面比多能细胞更加受限的细胞。
如在本文中可互换地使用，“受试者(subject)”、“个体(individual)”或“患者”是指脊椎动物生物体。
如本文中所使用，“大体上纯细胞群”是指具有指定细胞标记物特征及为构成总细胞群的细胞的约50％、优选地约75％到80％、更优选地约85％到90％、及最优选地至少约95％的分化潜能的细胞群。因此，“大体上纯细胞群”是指含有在指定检验条件下不呈现指定标记物特征及分化潜能的细胞的少于约50％、优选地少于约20％到25％、更优选地少于约10％到15％、且最优选地少于约5％的细胞群。
如本文中所使用，“前分化”是指前体或祖细胞(例如，多能干细胞)分化成具有进一步分化成最终效应细胞(例如寡树突细胞)的潜能的例如神经或寡树突细胞祖细胞的中间细胞类型的过程。
如本文中所使用，“治疗性”是指治疗、治愈及/或改善疾病、病症、病状或副作用或是指降低疾病、病症、病状或副作用的进展速率。所述术语在其范围内还包含增强正常生理功能、缓解性治疗及疾病、病症、病状或副作用的局部补救。
如本文中所使用的术语“治疗(treating/treatment)”一般是指获得所需药理及/或生理效果。所述效果就预防或部分预防疾病或其症状或病况而言可具防治性，且/或就部分或完全治愈疾病、病状、症状或可归因于所述疾病的不良影响而言可具治疗性。如本文中所使用的术语“治疗”涵盖对哺乳动物，尤其人类的任何治疗，且包含：(a)预防疾病在易患所述疾病但尚未诊断患有所述疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即遏制其发展；或(c)减轻疾病，即缓和或改善疾病及/或其症状或病状。如本文中所使用的术语“治疗”是指治疗性治疗及防治性或预防性措施两者。需要治疗者包含已患有病症者以及待预防病症者。
如本文中所使用，“预防性”是指在疾病或病状发生之前(即使未诊断出)或在疾病或病状仍处于亚临床阶段时妨碍或阻止疾病或病状。
如本文中所使用，“活性剂”是指在生物学上具有活性或以其它方式诱导对投予受试者的生物或生理影响的物质、化合物或分子。在本发明的上下文中，由本文中所描述的方法产生的NPC、OPC及寡树突细胞为“活性剂”。
如本文中所使用，“药学上可接受的载剂”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂，其中活性剂、本发明的软骨细胞或含有本发明的寡树突细胞的组合物与其结合投予且其经联邦或州政府的监管机构批准或列于美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其它一般认识的供用于动物及/或人类的药典中。
如本文中所使用，“FoxO”是指叉形头转录因子家庭成员的亚类。对于本文中所公开的实验，可使用来自例如FoxO1、FoxO2、FoxO3a及FoxO4的FoxO家庭成员中的一或多者的mRNA。
除非本文中另外定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语均具有与所属领域的一般技术人员通常理解相同的含义。
细胞类型：示范性细胞类型可包含例如外胚层细胞；神经祖细胞；寡树突细胞祖细胞；寡树突细胞。
用于iPSC的培养容器的适合表面的实例包含但不限于：Vitronetin、E-钙黏附蛋白、
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II或基质胶；对于神经外胚层及神经祖细胞而言，适合表面包含但不限于基质胶、PLO-层黏连蛋白；对于神经祖细胞及寡树突细胞祖细胞及寡树突细胞而言，适合表面包含但不限于基质胶或PLO-层黏连蛋白或胶原蛋白。
在一个方面，用于去分化或再程序化体细胞的示范性方法可包含使用选自Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog及Lin28的合成mRNA再程序化因子及激活区中的任何一或多者，从而体细胞经再程序化或去分化。用于iPSC调节的方法及组合物描述于美国专利申请案第13/893,166号及第14/292,317号中，这类iPSC可用于本文中所描述的方法。所述申请案的内容以引用的方式并入本文中。
如果可能，以临床应用而言，用于大规模生产的悬浮液***更实际。因此，在各阶段，所述步骤方案是经测试以观察细胞是否能以悬浮液方式顺利扩增。在某些实施例中，针对此悬浮培养，存在有针对使用悬浮细胞培养，及低细胞附着培养盘及容器的步骤方案可使用。
在某些实施例中，可针对最优选诱导条件调节例如氧浓度的环境条件。
在某些实施例中，提供选择所需细胞或提高其在总细胞培养物群体中的汇合百分比或细胞密度的过程及方法。
在某些实施例中，提供低温保存NPC、OPC或寡树突细胞样细胞的方法。有些分化细胞出于最优选细胞存活率的目的可能需要在存储期间低温保存。举例来说，可在培养基中使用含10％DMSO的2.5％HSA。可使用此应用优化细胞数量，以进一步改进存储的存活率。
还提供再培养分化细胞方法。细胞可在大部分培养容器中再培养：例如但不限于T75烧瓶、T25烧瓶、4孔盘、6孔盘、8孔盘、24孔盘、48孔盘及96孔盘。细胞可依不同细胞密度再培养，以供不同应用。
在某些实施例中，本发明还提供在操作整个分化过程期间处理细胞受到的物理应激压力，借以改进存活率的方法。在分化期间某些类型的细胞极小，如iPSC。这些小细胞对离心力极其敏感。进行维持时，这些细胞可培养成群落，随后再解离为集群而非单细胞。进行分化时，如果需要单细胞，那么吾人可在剥离细胞之前先结束解离，去除解离溶液，且使剩余解离溶液进一步解离细胞。这个方案常用在细胞培养物中。iPSC对过度离心力极其敏感。有些类型的细胞在分化期间极具黏性，如iPSC。这些细胞对剪切力极其敏感。当处理这些细胞时，利用10mL移液管以避免利用任何小尖端且避免反复上下移液细胞。寡树突细胞具有包含多个分支的独特细胞形态，有能力处理而附着到轴突。需要精细操作及本发明的发明人经由试验及磨难获得的不常见技能，才能将寡树突细胞从一个容器移到另一个容器。
通过本发明的方法产生的NPC、OPC及寡树突细胞可用于治疗脊损伤及其它损伤。举例来说，利用本发明的方法产生的NPC、OPC及/或寡树突细胞的高度增浓或纯化群可用于移植到脑及脊柱疾病及损伤的各种病况中--背景信息参见(Liu K等人，“轴突再生的神经元内在机制(Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration)”神经科学年鉴(Annu Rev Neurosci.)2011；34:131-152)。(Tuszynski MH,Steward O.,中枢神经***轴突再生研究的概念及方法(Concepts and Methods for the Study of AxonalRegeneration in the CNS.)神经元(Neuron.)2012；74:777-791)。(Gage,“哺乳动物神经干细胞(Mammalian Neural Stem Cells)”，科学(Science)287:1433-1438(2000)，其皆以全文引用的方式并入本文中)。(Goldman,“成年神经形成：从金丝雀到临床(AdultNeurogenesis:From Canaries to the Clinic)”，神经生物学杂志(J.Neurobiology)36:267-286(1998)；Pincus等人,“神经干细胞及祖细胞：用于基因疗法及大脑修复的策略(Neural Stem and Progenitor Cells:A Strategy for Gene Therapy and BrainRepair)”，神经外科(Neurosurgery)42:858-868(1998)；Svendsen等人,“中枢神经***发展中的神经干细胞：移植对细胞疗法的影响(Neural Stem Cells in the DevelopingCentral Nervous System:Implications for Cell Therapy ThroughTransplantation)”，大脑研究进展(Prog.Brain Res.)127:13-34(2000)；以及Svendsen等人,“人类干细胞疗法在神经***中的新前景(New Prospects for Human Stem-CellTherapy in the Nervous System)”，神经科学趋势(Trends Neurosci.)22:357-364(1999)，所述文献全部以全文引用的方式并入本文中)。(Snyder等人,“成年小鼠新皮层中多能神经前体可分化以替换经历凋亡性退化的神经元(Multipotent Neural PrecursorsCan Differentiate Toward Replacement of Neurons Undergoing Targeted ApoptoticDegeneration in Adult Mouse Neocortex)”，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 94:11663-11668(1997)，其以全文引用的方式并入本文中)，且可用于在化学脱髓鞘中使脱髓鞘的大脑区域再髓鞘化(Windrem等人,“衍生自成年人皮质下白质的祖细胞以寡树突状细胞形式分散且分化在大鼠大脑脱髓鞘区内(Progenitor Cells Derived from theAdult Human Subcortical White Matter Disperse and Differentiate asOligodendrocytes Within Demyelinated Regions of the Rat Brain)”，神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)69:966-975(2002)，其以全文引用的方式并入本文中)或在自身免疫脱髓鞘中使脱髓鞘的大脑区域再髓鞘化(Pluchino等人,“成人神经球的注射诱导慢性多发性硬化症模型的恢复(Injection of Adult Neurospheres Induces Recovery in aChronic Model of Multiple Sclerosis)”，自然(Nature)422:688-694(2003)，其以全文引用的方式并入本文中)。(Yandava等人，“经由神经干细胞移植可进行整体细胞替换：从脱髓鞘的颤抖小鼠大脑得到证据(Global Cell Replacement is Feasible Via NeuralStem Cell Transplantation:Evidence from the Dysmyelinated Shiverer MouseBrain)”，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)96:7029-7034(1999)，其以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，根据本发明所产生及投予的细胞会分化成神经元、寡树突细胞及星形胶质细胞，且因而使受伤大脑及脊髓的损失细胞元素重建。在一些实施例中，将本发明的NPC、OPC及寡树突细胞植入到患病区域中可媒介结构再生作用及修复。此可包含但不限于因中风及损伤的大脑组织损失的重建。另外，神经干细胞在产期前后的大脑中具有高度迁移性，且因此还可用以添补在遗传性及代谢疾病中有缺陷或突变的酶。
迄今，神经干细胞及祖细胞移植的大部分实验治疗性研究已利用胎儿或成人类组织作为神经干细胞及祖细胞的来源来完成。这些方法需要从动物及人类供体两者持续采集新胎儿及成人组织。人类供体作为来源特别是个问题，这是因为人类组织衍生的细胞(不论是胎儿或成人来源)均难以获得且更难以标准化及按比例增长(Keyoung等人,“特异性识别、选择及提取来自人类胎儿大脑的神经干细胞(Specific Identification,Selectionand Extraction of Neural Stem Cells from the Fetal Human Brain)”，自然生物技术(Nature Biotech.)19:843-850(2001)；Pincus等人,“成纤维细胞生长因子-2/脑源性神经营养因子相关的成年人表皮细胞产生的新神经元的成熟(Fibroblast Growth Factor-2/Brain-Derived Neurotrophic Factor-Associated Maturation of New NeuronsGenerated from Adult Human Subependymal Cells)”，神经学年鉴(Ann.Neurol.)43:576-585(1998)；Roy等人,“启动子靶向选择及分离来自成年人心室区的神经祖细胞(Promoter-Targeted Selection and Isolation of Neural Progenitor Cells fromthe Adult Human Ventricular Zone)”，神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)59:321-331(2000)；以及Roy等人，“分离自成年人类海马的祖细胞的活体内神经形成(In VitroNeurogenesis by Progenitor Cells Isolated from the Adult Human Hippocampus)”，自然医学(Nature Med.)6:271-277(2000)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。相反地，利用本发明的方法产生的NPC、OPC及寡树突细胞允许神经干细胞及祖细胞事先采集、可扩展性的扩增及引导式分化。
此外，根据本发明，在一些实施例中可使用自体NPC、OPC及寡树突细胞。可替代地，在本发明的治疗方法中的任一者中可使用异源NPC、OPC及寡树突细胞。已认为衍生自鼠类及人类源两者的ES细胞的神经干细胞及祖细胞能够在ES衍生的神经胶质及寡树突细胞情况下进行再髓鞘化且在ES衍生的中脑多巴胺激导性神经元情况下于实验性帕金森氏病中进行多巴胺激导性补给两者。现通过实现从ES细胞培养物纯化神经干细胞，本发明大体上增加其用途的可靠性及安全性两者，且因此可除去对人类组织采集的需求。
本发明的另一方面提供治疗患有神经变性病状的受试者的方法，所述方法包括以有效治疗神经变性病状的量向患者投予如上文所描述的产后衍生细胞。在某些实施例中，神经变性病状为急性神经变性病状，例如大脑损伤(病灶性或弥漫性大脑损伤)、脊髓损伤或外周神经损伤，例如，因物理或化学烧伤、深切口或肢体分离、脑血管机能不全造成。在其它实施例中，其为慢性或进行性神经变性病状，例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、肌肉萎缩性侧索硬化、肿瘤或慢性外周神经损伤、匹克症、泛发性路易体疾病、进行性核上麻痹(斯蒂尔-理查德森症候群)、多***变性(夏伊-德尔格症候群)、与神经变性相关的慢性癫痫病症、包含肌肉萎缩性侧索硬化的运动神经元疾病、变性运动失调、皮层基底节变性、关岛型ALS-帕金森氏痴呆综合症、亚急性硬化性全脑炎、共核蛋白病(包含多发性***萎缩症)、原发性进行性失语症、黑质退化症、马查多-约瑟夫病/3型脊髓小脑失调及橄榄体脑桥小脑变性、妥瑞症、延髓及假性延髓麻痹、脊及脊髓延髓肌肉萎缩(肯尼迪氏病)、原发性侧向硬化、家族性痉挛性截瘫、沃德尼格-霍夫曼病、库格尔伯格-威兰德病、塔伊-萨奇氏疾病、山多夫氏病、家族性痉挛性病、沃法特-库格尔伯格-威兰德病、痉挛性截瘫、进行性多病灶脑白质病、家族性自主神经失调(里雷-戴症候群)及朊病毒疾病(包含但不限于库贾氏症、GSS氏病(Gerstmann-
Figure BDA0002386840590000181
-Scheinker disease)、库鲁病及致死家族性失眠)。
在另其它实施例中，其为与脱髓鞘相关的疾病，例如多发性硬化症、急性播散性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、横贯性脊髓炎、慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病、格-巴二氏症候群、脑桥中央髓鞘溶解症、例如脑白质障碍的遗传性脱髓鞘疾病、恰克-马里-杜斯氏症及卡纳万病。
在某些实施例中，本发明的iPSC、ESC、NPC、OPC、寡树突细胞可个别性地、共同或以两种或多于两种的组合形式投予。在另其它实施例中，细胞与例如用于神经治疗的药物的至少一种其它试剂或例如抗炎剂、抗凋亡剂、抗氧化剂或生长因子的另一有益辅助试剂共同投予。
在某些实施例中，细胞在患者的中枢神经***或外周神经***中的预定位点处投予。其可通过注入或输液或包封于可植入器件内或通过植入含有细胞的基质或架构来投予。
本发明的另一方面提供用于治疗患有神经变性病状的患者的医药组合物，其包括本发明的细胞类型中的一或多者及药学上可接受的载剂。待治疗的神经变性病状可为急性神经变性病状，或其可为慢性或进行性病状。
在某些实施例中，医药组合物包括例如用于神经治疗的药物的至少一种其它试剂或例如抗炎剂、抗凋亡剂、抗氧化剂或生长因子的另一有益辅助试剂。
在某些实施例中，调配医药组合物供用于通过注入或输液投予。可替代地，其可包括包封细胞的可植入器件或含有细胞的基质或架构。医药组合物可含有例如天然生物材料的其它材料，例如明胶、胶原蛋白、羧基甲基、纤维素。可注射传递可利用生理盐水媒剂。
实例
现参考以下实例描述本发明。仅出于说明的目的提供这些实例，且本发明不限于这些实例，而是涵盖由于本文中所提供的教示显而易见的变化形式。下表包含供用于一些实施例的实验条件，包含实验上检验的条件。来自下表或本文中所提供的参数、参数范围或示范性参数中的任一者可与下表或本文中所提供的参数、参数范围或示范性参数中的任何其它者一起使用。
表1：寡树突细胞分化
Figure BDA0002386840590000191
在一些实施例中，用于接种的细胞数目可为例如约(7.1250×104、1.187500×106、2.375000×106、4.750000×106、7.125000×106、9.500000×106、1.1875000×107或1.4250000×107)或任何两个所列举细胞数目之间的任何细胞数目。可通过以细胞数目除以培养容器的生长面积来确定任何培养容器的以细胞数目/cm2为单位的接种密度(参见表2)，例如利用具有9.5cm2生长面积的6孔盘，接种密度将为约(0.75×105、1×105、1.25×105、2.50×105、5.00×105、7.50×105、1×106、1.25×106或1.5×106个细胞/cm2)/六孔盘，或任何两个所列举密度之间的任何密度。因此，任何培养容器所需的细胞密度可以类似方式确定。
表2常见培养容器的生长面积
生长面积(cm<sup>2</sup>) 培养基体积(ml) 最大体积(ml)
培养盘
6孔 9.5 9.5 1.9-2.0
12孔 3.8 3.8 0.76-1.14
24孔 1.9 1.9 0.38-0.57
48孔 0.95 0.95 0.19-0.28
96孔 0.32 0.32 0.1-0.2
24孔 1.9 1.9 0.38-0.57
烧瓶
T25 25 25 5-7.5
T75 75 75 15-22.5
T150 150 150 30-45
在一些实施例中，氧浓度可为例如约(2％、2.25％、2.5％、2.75％、3.0％、3.25％、3.5％、3.75％、4.0％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％或6.0％)氧气或任何两个所列举百分比之间的任何范围。
实例1：从iPSC产生神经祖细胞
将iPSC接种于标准尺寸6孔细胞培养盘(约9.5cm2生长面积/孔)或标准尺寸12孔细胞培养盘(约3.8cm2生长面积/孔)中以开始分化。其它尺寸的培养容器任选地也可应用且有时由于利用试剂及时间的更高效率可比6孔或12孔盘更优选。申请人已确认所公开的方法可用于其它尺寸培养容器。
在6孔盘中，已成功地利用约1×105到约1×106/孔的群体尺寸的细胞。在存在足够具有清晰界定边缘的典型iPSC群落时，认为iPSC准备分化，其中细胞为紧凑的且群落未过度生长。即使本申请人能够成功地衍生由其它工作人员利用非mRNA方法制得的iPSC，例如通过NIH/Lonza(数据未展示)制得的NCL2 iPSC株，利用这些指标产生的本发明的iPSC的质量也证明在本发明的iPSC株与由其它者利用其它方法产生的iPSC株相比较时对分化到关重要。在另一方面，所公开的技术也可在过程期间在任何阶段应用，例如NPC开始朝向OPC、星形胶质细胞或其它胶细胞衍生；或OPC开始朝向星形胶质细胞或其它胶细胞衍生。在一个示范性实验中，申请人利用从供给组织分离的原发性NPC，且利用相同方案将其进一步分化成OPC及寡树突细胞并同时从iPSC直接地分化NPC。利用两种不同来源的NPC的结果通常与具有略高效率及在申请人尝试在彼阶段在悬浮液中生长细胞时(数据未展示)形成球体的较高趋势的iPSC衍生的NPC类似。
诱导在此阶段的iPSC以分化成外胚层谱系细胞。吾等发现悬浮液培养***极其适用于在此阶段的规模扩大，尽管用于分化的最新方案倾向于利用附着单层细胞。吾等发现用于诱导的生长于悬浮液中的iPSC对化学毒性更具有抵抗性且在后续阶段更易于再接种。吾等在针对特定分化“回合”选择悬浮液培养途径时是利用超低附着盘(Sigma-Aldrich)或其它低附着盘以促进iPSC悬浮液细胞生长。
在需要继代iPS细胞时，重要的是用引起低细胞毒性且产生更小iPSC集群的方案解离iPSC群落，所述iPSC群落可在需要悬浮液培养时迅速形成球体。利用TripLETM(赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisher))、Accutase(生命科学技术(Life Technology))或EDTA通过用含约0.1mM、有时约0.5mM或约1mM EDTA的DPBS(赛默飞世尔科技有限公司(FisherScientific))在约37℃下解离5分钟来解离iPSC。成功利用各种解离时间，包含约1到约2分钟，及有时对此步骤约10到约20分钟。在一些实施例中，解离时间可为约(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)或在任何两个所列举之间的任何时间范围内。
针对培养基，吾等用5％KSR测试MEMa或DMEM/F12或DMEM+B27且能够视需要在此分化阶段得到结果。培养基补充剂N2、BSA或HAS及bFGF也取决于在此阶段利用哪种基础培养基而用于培养基中。随后诱导iPSC离开多能阶段且作为任选地步骤通过例如约(5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM)或任何两个所列举浓度之间的任何范围的SB431542、LDN193189、PD173074的存在而朝向外胚层分化。LDN-193189为骨形态生成蛋白(BMP)I型受体ALK2及ALK3的高效小分子抑制剂。LDN193189为选择性转录活性形态生成蛋白质(BMP)I型受体抑制剂。其抑制活化素受体样激酶-2(ALK2)及ALK3。SB431542为TGF-β/活化素/NODAL路径的选择性及强力抑制剂且为ALK5的强力及选择性抑制剂。PD173074为强力FGFR1抑制剂且还抑制VEGFR2。在其它实施例中，还可使用这些路径的其它抑制剂。
在一个实验中，细胞随后用Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2、FoxO(亚类的一或多个成员)mRNA以个别性地或呈组合形式以20ng/孔的剂量利用具有Stemgent转染剂(Stemgent)或其它转染试剂的六孔盘进行转染。当使用其它类型培养盘时，mRNA剂量可基于培养容器的面积或培养培养基量的体积按比例调整。此转染有时以高约10倍的mRNA剂量利用Stemgent转染剂或其它可商购转染试剂重复3、4、5或6次。本文中所公开的实例的重复转染可在第一次转染之后执行约24小时加或减2到3小时或从第一次转染执行隔夜或在第一次转染之后执行约(6-24小时、7-24小时、8-24小时、9-24小时、10-24小时、11-24小时、12-24小时、13-24小时、14-24小时、15-24小时、16-24小时、17-24小时、18-24小时、19-24小时、20-24小时、21-24小时、22-24小时)或两个所列举时间点之间的所有范围。在此阶段的细胞展示比间叶细胞更接近于神经祖细胞的形态，但由表达TF产生的这些NPC相比于由其它大部分基于化学的方法产生的NPC似乎在寡树突细胞路径中产生细胞的更高产率。在此阶段的NPC通过抗体染色为Pax6阳性，从而证明其在神经原始谱系中的一致性(图1)。mRNA DNA及Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2、FoxO的蛋白质序列为所属领域中已知的，例如GenBank。制备供用于本文中所描述的方法转染的mRNA的方法为所属领域中已知的，例如美国专利申请案第13/893,166号及第14/292,317号；(内容以引用的方式并入本文中)。
实例2：从神经祖细胞产生寡树突细胞祖细胞
将神经祖细胞或NPC接种在商业细胞培养容器上。将6孔盘用于图2中所展示的实验，但也可应用其它孔尺寸。盘用基质胶(BD Biosciences)及PLO-层黏连蛋白预涂，随后将约1×105到1×106个细胞接种于补充有常用浓度的KSR以及抗坏血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰岛素、RA、B27、CAMP、生物素的DMEM/F12或DMEM或MEM3中。通过利用本领域中通常已知的基于化学的方案产生的NPC还用于在以下步骤中产生OPC，观测到通过引入TF活性产生的NPC产生更多且更好的OPC。
在一个实验中，细胞随后用Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA中的一种或各种组合以个别性地或呈组合形式以约20ng/孔/细胞命运因子的剂量在培养基中使用Stemgent转染剂(Stemgent)进行转染，且在约24小时以低到约10ng且高达约200ng/孔的剂量利用Stemgent转染剂或其它可商购转染试剂重复2、3、4或更多次。在此阶段的细胞呈现从NPC的典型形态改变到OPC且对A2B5及O4为染色阳性(图2)。
实例3：从OPC产生寡树突细胞
寡树突细胞祖细胞培养于用含基质胶(BD Biosciences)及/或PLO-层黏连蛋白的DMEM/F12或MEMa或DMEM B27预涂的6孔或其它盘中。其它类似附着细胞培养基亦适合于使用。培养基通常补充有常用浓度的抗坏血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3、胰岛素及KSR。细胞经培养约1周、有时约2、约3或甚到约4周，在此期间成熟状寡树突细胞出现且从OPC集群向外转移随后扩散到空间中，其中其形成增加数目的树枝状过程(图3)。
实例4：在进一步培养期间，寡树突细胞形成新集群
在使来自阶段2的寡树突细胞样细胞继续再生长约1周到约4周或甚至更久时，其以重迭过程，在某种程度上模拟活体内外鞘形成来形成新集群(图4)。
实例5：衍生自人类iPSC的寡树突细胞展示特异性细胞标记物的示范性实施例
为证明衍生自人类多能干细胞的寡树突细胞为成熟寡树突细胞，通过化学或物理手段将其从分化培养盘移到球体中、固定且用抗MBP抗体染色。呈现出如此产生的所有细胞对于MBP(一种通常已知的成熟寡树突细胞标记物)为染色阳性(图5)。
实例6：动物模型中的iPSC衍生寡树突细胞功能
为进一步测试根据本发明产生的成熟寡树突细胞的功能，可在例如由MarkTuszynski组及其它者描述的那些的脊髓损伤大鼠模型中测试iPSC衍生的寡树突细胞的脊髓修复功能。寡树突细胞可传递为细胞、细胞片、细胞集群、个别细胞类型或与例如OPC或NPC的其它细胞组合。通过所公开的方法从iPSC衍生的OPC亦将作为治疗脊髓损伤或其它中枢神经疾病和病状的治疗候选物来测试。在另一实施例中，在一些情况下，在存在例如BDNF、NGF等的细胞营养因子的情况下，寡树突细胞、OPC、NPC或其组合可存在于水凝胶上。
例如猴及黑猩猩的非人类灵长类模型也可用于就安全性及功效而言使用免疫抑制剂或使用对应非人类灵长类iPSC衍生NPC、OPC或寡树突细胞利用基本上本文中所公开的相同方法测试例如中枢神经元***的寡树突细胞的人类细胞。
实例7：治疗患有脊髓损伤或其它中枢神经疾病和病状的人类患者中的iPSC衍生 寡树突细胞
利用人类iPSC衍生寡树突细胞、OPC、NPC、神经元或以上的组合利用经调适以符合根据cGMP程序的要求的所公开的方案的临床试验将参考其它细胞治疗根据动物研究给药。所制造细胞可传递到脊髓或可能传递到人类中枢神经***的其它部分，例如大脑。
实例8：利用驱动关键基因表达的CRISPR-Cas9***由此利用通过细胞内转录产生 的mRNA以供细胞命运决策
如图6中所展示，Cas9、dCas9的核酸酶去活化版本键联到荧光蛋白、mNeonGreen(等位基因生物技术(Allele Biotechnology))，作为实例展示功能蛋白可通过由gRNA引导的Cas9融合定位到基因组内所关注的区域。相同策略可应用于功能结构域、蛋白质、肽等，以便驱动基因表达(即细胞内的mRNA产生将为细胞命运决定的)，实例为图6中所展示的MyoD转录活化结构域；其它实例可为VP16及多个其它此类结构域。在此转录活化融合Cas9融合蛋白质通过接通例如Ngn2或Pax6或Sox2或Brn2或FoxO或Oligo2或NKX2.2或SOX10的关键TF的gRNA放置于区域中时，可得到转染活体外经转录mRNA的结果。相同策略可应用于通过表观遗传修饰染色体上的特定区域而影响基因表达的酶活性域或蛋白质，例如利用DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1或DMNT1。与Cas9融合的核苷酸转化酶可用于将特定核苷酸转换成另一核苷酸，由此改变所编码蛋白质或致使蛋白质产生的提前终止。以此方式，细胞的基因表达概况可改变且细胞命运在所改变基因为例如上文所列的基因及其它基因的关键TF时遵循本申请案中所公开的一般策略确定。
核酸酶去活化Cas9以及利用导引RNA融合转录活化结构域及标靶的方法为所属领域中已知的。(Didovyk等人,生物技术的最新观点(Current Opinion in Biotechnology)(2016),40:177-184)(内容以引用的方式并入本文中)。制备靶向细胞命运因子启动子的导引RNA序列可如Balboa等人，干细胞报告(Stem Cell Reports)(2015)5:448-459(内容以引用的方式并入本文中)中制备。

Claims (51)

1.一种用于诱导诱导性多能干细胞iPSC及/或胚胎干细胞ESC分化成神经祖细胞NPC的方法，所述方法包括：
a)将iPSC及/或ESC接种在经涂布、未经组织处理的培养容器上的培养基中；
b)用编码一或多种细胞命运因子的呈个别mRNA或组合mRNA的mRNA转染步骤a)的所述细胞；及
c)培养步骤b)的所述iPSC及/或ESC直到所述细胞分化成NPC。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的所述细胞命运因子选自由以下中的一或多者组成的群组：Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2及FoxO家族因子，其是呈个别mRNA或组合mRNA转染。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)的所述细胞命运因子为Ngn2。
4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)的所述细胞命运因子为Pax6。
5.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)的所述细胞命运因子为Sox2。
6.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)的所述细胞命运因子为Brn2。
7.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)的所述细胞命运因子为FoxO家族因子。
8.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)的所述细胞命运因子中的一或多者与激活区融合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)的所述细胞是经培养直到所述细胞表达步骤c)的所述细胞命运因子中的一或多者。
10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将SB43542、LDN193189及PD173074中的一或多者添加到步骤c)的所述细胞中。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)到c)的所述培养条件为在约2％到约6％的氧浓度中。
12.根据权利要求1所述的方法，其中用于步骤a)到c)的所述培养基选自由以下组成的群组：最低必需培养基-α(minimal essential media-alpha；MEMa)或改良杜氏伊格尔培养基:营养混合物F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12；DMEM/F12)或具有B27补充剂的DMEM。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所使用的所述培养基还含有Knock Out血清替代物(Knock Out Serum Replacement；KSR)。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养基进一步由bFGF、N2或B27、BSA或HSA(人类血清白蛋白)中的一或多者组成。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养容器是经基质胶(Matrigel)及/或PLO-层黏连蛋白涂布。
16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的所述iPSC及/ESC是每个培养烧瓶或培养孔盘使用约70,000个细胞到约14,000,000个细胞进行接种。
17.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)的所述细胞经培养约3到约10天。
18.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的所述转染重复至少一次。
19.一种用于从神经祖细胞产生寡树突细胞祖细胞OPC的方法，所述方法包括：
a)将NPC接种在经涂布细胞培养容器上的培养基中；
b)用编码一或多种细胞命运因子的呈个别mRNA或组合mRNA的mRNA转染步骤a)的所述细胞，以将神经祖细胞分化成寡树突细胞祖细胞；
c)培养步骤c)的所述细胞直到所述NPC的形态改变成OPC的形态。
20.根据权利要求19所述的方法，其中步骤a)的所述NPC是每个培养烧瓶或培养孔盘使用约70,000个细胞到约14,000,000个细胞进行接种。
21.根据权利要求19所述的方法，其中用于步骤b)中的转染的所述mRNA编码细胞命运因子，所述mRNA是选自由个别性地或呈组合的Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA组成的群组中的一或多者。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述mRNA编码Oligo2。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述mRNA编码NKX2.2。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述mRNA编码Sox10。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述mRNA编码Oligo1。
26.根据权利要求19所述的方法，其中是使用六孔培养盘，且用于步骤b)中的转染剂量为约20ng/细胞命运因子。
27.根据权利要求19所述的方法，其中第一次转染之后，所述转染重复至少再两次。
28.根据权利要求19所述的方法，其中步骤a)到d)的所述培养条件为在约2％到约6％的氧浓度中。
29.根据权利要求19所述的方法，其中所述培养容器盘是经基质胶及PLO-层黏连蛋白涂布。
30.根据权利要求19所述的方法，其中用于步骤a)到c)的所述培养基选自由以下组成的群组：DMEM/F12、DMEM及MEMa。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述培养基补充有以下中的一或多者：KSR、抗坏血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰岛素、RA、B27、CAMP及生物素。
32.一种用于从OPC产生寡树突细胞的方法，其包括：
a)将OPC接种在经涂布细胞培养容器上的培养基中；及
b)培养步骤a)的所述细胞直到细胞出现树枝状过程或产生髓鞘碱性蛋白MBP。
33.根据权利要求32所述的方法，其中用于步骤a)到c)的所述培养基选自由以下组成的群组：DMEM/F12、DMEM及MEMa。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述培养基补充有选自由以下组成的群组的培养基补充剂中的一或多者：KSR、抗坏血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3及胰岛素。
35.根据权利要求32所述的方法，其中步骤a)的所述OPC是每个培养烧瓶或培养孔盘使用约70,000个细胞到约14,000,000个细胞进行接种。
36.根据权利要求32所述的方法，其中步骤b)的所述细胞经培养约7到约30天。
37.根据权利要求32所述的方法，其中步骤a)中的所述细胞培养容器是经基质胶及/或PLO-层黏连蛋白涂布。
38.一种细胞，其是以权利要求1、19或32所述的方法获得。
39.一种用于治疗疾病、病症或畸形的组合物，其包括根据权利要求38所述的细胞。
40.一种用于治疗疾病、病症及/或畸形的方法，其包括向有需要的个体投予根据权利要求38所述的细胞及/或组合物。
41.一种用于诱导干细胞相继或直接地分化成NPC、OPC、寡树突细胞的方法，所述方法包括执行根据权利要求1所述的步骤、随后根据权利要求19所述的步骤、随后根据权利要求32所述的步骤。
42.一种用于诱导干细胞相继或直接地分化成NPC、OPC、寡树突细胞的方法，所述方法包括：
a)将iPSC及/或ESC接种在经涂布培养容器上，其中所述iPSC及/ESC是每个培养烧瓶或培养孔盘使用约70,000个细胞到约14,000,000个细胞接种于培养基中，所述培养基包括最低必需培养基-αMEMa或改良杜氏伊格尔培养基:营养混合物F-12DMEM/F12或具有B27补充剂的DMEM，所有培养基具有Knock Out血清替代物KSR；
b)用编码细胞命运因子的mRNA转染步骤a)的所述细胞，所述细胞命运因子选自由以下中的一或多者组成的群组：Ngn2、Pax6、Sox2、Brn2及FoxO家族因子，其是呈个别mRNA或组合mRNA转染；
c)培养步骤b)的所述iPSC及/或ESC直到所述细胞分化成NPC；
d)分离来自步骤c)的所述NPC；
e)将NPC接种在经涂布细胞培养容器上，其中所述NPC是每个培养烧瓶或培养孔盘使用约70,000个细胞到约14,000,000个细胞接种于培养基中，所述培养基包括MEMa或DMEM/F12或DMEM，所有培养基具有KSR及选自由以下组成的群组的所述培养基补充剂中的一或多者：抗坏血酸、SAG、PDGF、HGF、IGF1、T3、胰岛素、RA、B27、CAMP及生物素；
f)用由个别性地或呈组合的以下组成的群组中的一或多者利用转染试剂转染步骤e)的所述细胞：Oligo2、NKX2.2、SOX10及Oligo1 mRNA；
g)重复步骤e)的转染至少再两次；
h)培养步骤g)的所述细胞直到所述细胞的形态从NPC细胞的形态改变成OPC细胞的形态；
i)分离来自步骤h)的所述OPC；
j)将来自步骤j)的所述分离的OPC接种在经涂布细胞培养容器上，其中所述OPC是每个培养烧瓶或培养孔盘使用约70,000个细胞到约14,000,000个细胞接种于培养基中，所述培养基包括MEMa或DMEM/F12或DMEM，所有培养基具有KSR及选自由以下组成的群组的所述培养基补充剂中的一或多者：抗坏血酸、N2、B27、生物素、CAMP、T3及胰岛素；及
K)培养所述细胞至少约1周，直到寡树突细胞出现树枝状过程及/或产生髓鞘碱性蛋白MBP。
43.根据权利要求1、19、41或42所述的方法，其中所述NPC衍生自所述接受者个体。
44.根据权利要求1、19、41或42所述的方法，其中所述起始细胞是采集自体液或组织。
45.根据权利要求1、19、41或42所述的方法，其中所述起始细胞是采集自所述接受者。
46.根据权利要求1或19所述的方法，其进一步包括以下步骤d)：
d)将所述来自步骤c)的NPC通过转移到未经涂布超低附着培养盘进行扩增。
47.根据权利要求27所述的方法，其中利用六孔培养盘，且所述转染剂量为呈约10ng/细胞命运因子到约200ng/细胞命运因子的mRNA剂量。
48.根据权利要求19所述的方法，其中步骤c)的所述细胞经培养约4到约20天。
49.一种用于活体内再生细胞或组织的方法，其包括向有需要的个体投予有效量的根据权利要求1所述的NPC，其中所述NPC在移植或投予后在活体内环境中转化，由此使所述细胞或组织再生。
50.一种医药组合物，其包括根据权利要求1所述的NPC。
51.一种试剂盒，其包括根据权利要求50所述的医药组合物及使用说明书。
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