WO2020051656A1 - Polipeptídeo quimérico antigênico, construção gênica e composição antigênica para imunocastração de mamíferos não humanos - Google Patents

Polipeptídeo quimérico antigênico, construção gênica e composição antigênica para imunocastração de mamíferos não humanos Download PDF

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WO2020051656A1
WO2020051656A1 PCT/BR2019/050303 BR2019050303W WO2020051656A1 WO 2020051656 A1 WO2020051656 A1 WO 2020051656A1 BR 2019050303 W BR2019050303 W BR 2019050303W WO 2020051656 A1 WO2020051656 A1 WO 2020051656A1
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carrier protein
antigenic
gnrh
polypeptide
decapeptide
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PCT/BR2019/050303
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Inventor
Livia Maria FAIM
Lucimara Cristiane TOSO BERTOLINI
Juliano BRANDÃO
Robert Bogden
Original Assignee
Ouro Fino Saúde Animal Ltda
Amplicon Vaccine, Llc
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Publication date
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Definitions

  • the present invention relates to genetic constructs encoding immunogenic antigens comprising a carrier protein and inserts of the GnrH / LHRH (Gonadotropin Releasing Hormone / Luteinizing Hormone Releasing Hormone) or its analog to form antigenic chimeric polypeptides used in vaccine for immunocastration of non-human mammals, especially farm animals such as pigs and cattle.
  • GnrH / LHRH Gonadotropin Releasing Hormone / Luteinizing Hormone Releasing Hormone
  • antigenic chimeric polypeptides used in vaccine for immunocastration of non-human mammals, especially farm animals such as pigs and cattle.
  • WO 88/00056 describes a composition for the production in animals of antibodies specific for LHRH comprising two or more carriers individually coupled / conjugated to LHRH or an analogue thereof, in sufficient quantities to produce a response immune against LHRH.
  • Chargers are proteins that when coupled with smaller substances, such as LHRH, produce an immune response in animals.
  • Preferred examples of carriers are diphtheria toxoid, human serum albumin, staphylococcus protein A, tetanus toxoid, with diphtheria toxoid being most preferred.
  • the main problems encountered in vaccination / immunocastration using the GnrH / LHRH antigen are related to the production of insufficient levels of anti-GnrH antibodies, mainly due to the difficulty of visibility of the GnrH / LHRH decapeptide, which, due to its small size, the accessibility to its antigenic portions is hampered by steric impediment by the carrier protein.
  • composition comprising the mixture of two GnRH variants, one of which contains a carrier molecule linked to the carboxyl-terminal end of the variant of GnRH and the other variant contains the same or another carrier molecule attached to the amino-terminal end of the GnRH variant.
  • the proposed composition is intended for use in controlling benign and malignant diseases in mammals, for example, hormone-dependent cancers.
  • US 6,013,770, US 6,045,799 and US 2002/198364 describe chimeric contraceptive vaccines, the active component of which is a chimeric antigen formed by a carrier protein, preferably ovoalbumin, and LHRH inserts or an analog thereof.
  • LHRH is inserted into potentially antigenic regions of the ovoalbumin carrier protein.
  • Such antigenic regions can be B-cell epitopes, sites of T-cell antigenic epitopes, and sites located in regions of surface exposure.
  • the preferred versions of the chimeric antigen are those in which: (i) four LHRH inserts are located in the N-terminal and C-terminal regions of the ovoalbumin protein or (ii) seven inserts are located (a) in the N-terminal region, ( b) in the potentially antigenic regions of ovoalbumin (determined by computer programs) among amino acids 51-73 and 81-99 (see column 4, lines 54-60 of US6013770); and (c) in the C-terminal region (see Figure 2 in these documents).
  • the present invention aims to optimize the genetic construction, developing a new, more immunogenic and effective construction in the production of neutralizing antibodies to GnrH and, consequently, inhibiting the synthesis of LH (Luteinizing Hormone) and FSH (Follicle Stimulating Hormone), enabling the immunocastration of non-human mammals, especially for farm animals such as pigs and cattle.
  • LH Localizing Hormone
  • FSH Follicle Stimulating Hormone
  • This objective is achieved by means of genetic constructs encoding the chimeric antigen comprising the carrier protein and strategic inserts of the GnrH decapeptide or an analog thereof sufficient to provide a greater number of GnrH B cell epitopes and recruiting sequences from Th2 cells.
  • immunogenic chimeric polypeptides capable of producing sufficient anti-GnrH antibodies are provided at levels to enable the immunocastration efficacy of pigs and other non-human mammals.
  • the polypeptides of the invention are made up of amino acid sequences that comprise strategic insertions of the GnrH decapeptide with the addition of a glycine at the N-terminal end of the same in a carrier protein, said decapeptide being present in said sequence as: (i) at least three insertions in the N-terminal portion of said carrier protein; (ii) at least three insertions in the internal antigenic portion with a high B-factor of said carrier protein; and (iii) at least four insertions in the C-terminal portion of said carrier protein, said inserts being preceded by an added glycine residue to improve the flexibility and accessibility of epitopes with immunogenic activity.
  • immunogenic chimeric polypeptides capable of producing sufficient anti-GnrH antibodies are provided at levels to enable effective immunocastration of pigs and other mammals.
  • the polypeptides of this second alternative of the invention consist of amino acid sequences that comprise strategic insertions of the GnrH analog consisting of an amino acid sequence in which the Glutamine residue located in the N-terminal portion of said decapeptide is replaced by a Glycine residue, said analog is present in the sequence of said carrier protein as: (i) at least three insertions in the N-terminal portion of said carrier protein; (ii) at least three insertions in the internal antigenic portion with a high B-factor of said carrier protein; and (iii) at least four insertions in the C-terminal portion of said carrier protein.
  • an antigenic chimeric polypeptide consisting of sequences of amino acids comprising ten sequences of the GnrH decapeptide preceded by a Glycine residue added to the N-terminal portion thereof, said sequences being inserted into a carrier protein, consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • an antigenic chimeric polypeptide consisting of ten amino acid sequences comprising a GnrH decapeptide analog consisting of an amino acid sequence in which the Glutamine residue located in the N-terminal portion of said decapeptide is replaced by a Glycine residue inserted into a carrier protein, called a polypeptide consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a chimeric genetic construct comprising a nucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • this genetic construct comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the present invention relates to a chimeric genetic construct comprising a nucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 2.
  • this genetic construct comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the present invention relates to a vaccine for immunocastration of non-human mammals, especially animals production methods such as pigs and cattle comprising (i) an antigenic chimeric polypeptide of the invention, (ii) optionally an adjuvant and (iii) a veterinarily acceptable vehicle.
  • Figure 1 shows the crystallographic structure of the final construction obtained from molecular modeling (using the Swiss Model Software) indicating the regions (high B-factors) where the GnrH analog peptides were inserted (in tandem). For insertion of GnrH analog peptides, flexible residues were added at the N-terminal position of each ideal peptide for the “bent” (curved) conformation of GnRH.
  • Figure 1 A represents the final model of the protein structure generated by homology modeling of SEQ ID NO: 1
  • Figure 1 B shows the final model of the protein structure generated by homology modeling of that corresponding to SEQ ID NO: 2.
  • Figure 2 shows the prediction of epitopes in the genetic constructs of the invention and the comparison with those of the prior art.
  • Figure 2A (comprising the epitope prediction spectrum and the table identifying the corresponding amino acids) represents the epitope prediction of the genetic construct encoding the antigenic chimeric polypeptide of the invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Figure 2B (comprising the epitope prediction spectrum and the table identifying the corresponding amino acids) represents the epitope prediction of the genetic construct encoding the antigenic chimeric polypeptide of the invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Figure 2C represents the epitope prediction of the genetic construct encoding the polypeptide described in US patent 6,013,770.
  • Figure 3 shows the prediction of the secondary structures encoding the antigenic chimeric polypeptides of the invention.
  • Figure 3A represents the prediction of the secondary structure of the genetic construct encoding the antigenic chimeric polypeptide of the invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Figure 3B represents the prediction of the structure secondary to the genetic construction encoding the antigenic chimeric polypeptide of the invention consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Figure 4 shows the maps of the genetic constructs used in the preparation of the antigenic chimeric polypeptides of the invention.
  • SEQ ID NO: 1 GnrH-ovoalbumin construction on plasmid pD451 -SR with 5535 bp.
  • B represents SEQ ID NO: 2: DGnrH-ovoalbumin construct on plasmid pD451 -SR with 5505 bp.
  • Figure 5 shows the growth curve of the mini-fermentation for expression of the polypeptide of the invention of: (A) SEQ ID NO: 1 and (B) SEQ ID NO: 2.
  • Figure 6 shows the SDS-Page gel with the protein profile of the fermentation to obtain the polypeptide of the invention of: (A) SEQ ID NO: 1 and (B) SEQ ID NO: 2.
  • Figure 7 shows the result of the vaccine efficacy test in rats (testicular weight) and achievement of the in silico prediction results.
  • the antigen dose of 125 ⁇ g / dose was used subcutaneously in the DO and D28 times.
  • the rats were euthanized at D56 days.
  • the present invention deals with immunogenic chimeric polypeptides to be used in the immunological contraception (immunocastration) of animals, especially of production animals such as swine and cattle, comprising a carrier protein and GnrH inserts located in regions of greater potential antigenicity of carrier protein, and in portions of less steric impedance of the carrier protein.
  • polypeptides of the invention are encoded by genetic constructs formed from a gene encoding the appropriate carrier protein, preferably ovoalbumin, and insertions of nucleotide sequences encoding the GnrH decapeptide in the possible correct conformation to enable the production of anti-GnrH antibodies that are neutralizing and sufficient to achieve immunological contraception in animals.
  • the genetic construction of the invention is designed to allow insertion of DNA fragments encoding at least ten inserts of the GnrH decapeptide analog in flexible and exposed internal regions of Ovoalbumin (High B-factors) and in amino-regions terminal and carboxy-terminal of the carrier protein.
  • Ovoalbumin High B-factors
  • 2 glycine residues were added to the amino terminal end in order to obtain the correct conformation of the GnrH and open the polypeptide chain of ovoalbumin without steric impediment.
  • the goal of genetic construction is (i) to improve the effectiveness of the vaccine in the field by increased exposure and conformation of the GnrH decapeptide and increased immune response and (ii) to prevent the possible agonist function (use of the GnRH analog), if GnrH cleavage by endopeptidases occurs.
  • the genetic construct that encodes the antigen for immunocastration of mammalian animals, especially pigs, is designed from the mapping of the quaternary structure of the carrier protein, that is, from the crystallographic structure of the protein albumin (PDB) code: 10VA)).
  • PDB protein albumin
  • the regions of high exposure to the solvent and high flexibility in the structure were mapped (by the parameter high B-factors).
  • secondary structures such as alpha helices or beta strips was avoided and to avoid steric hindrance and, to maintain the most correct conformation of GnrH, 2-3 glycine residues were inserted into the N-terminal portion of the decapeptides inserted in the polypeptide chain.
  • Figure 1 illustrates the structures of the final constructions obtained from molecular modeling (using the Swiss Model Software) indicating the regions (high B-factors) where the GnrH peptides for sequence 1 were inserted (A) and GnrH analogs for sequence 2 (B) (in tandem).
  • GnrH decapeptides / GnRH analog flexible residues were added at the N-terminal position of each peptide inserted in the case of two constructs 1 and 2.
  • Figure 2 shows the prediction of the epitopes of the preferred genetic constructs of the invention encoding the polypeptides of SEQ ID NO: 1 ( Figure 2A) and SEQ ID NO: 2 ( Figure 2B).
  • B cell epitopes are sites on polypeptides that are recognized by antibodies of the immune system. Knowledge of B cell epitopes can be used in the design of recombinant vaccines.
  • the prediction method for linear B cell epitopes is based on studies of the trend scale method (which has hydrophilicity / hydrophobicity, accessibility, secondary structure and antigenicity parameters).
  • Antigenicity which is an epitope's ability to react to an antibody, must be distinguished from its immunogenicity or ability to induce antibodies in an invertebrate host. Failures to distinguish B cell epitopes explain the failure of some peptide-based vaccines.
  • the Bepipred software predicts the location of epitopes using a combination of the Markov model and the trend scale method.
  • Residues with scores above the threshold are predicted to be part of an epitope and highlighted in the positive region of the graph (where the Y axes represent the residue scores and the X axis are the positions of the residues in the sequence ) and the table below indicates the epitopes that have been predicted as B cell recruiters.
  • the number of predicted epitopes of GnrH / GnrH analogs was eight for the two constructs (GnrH epitopes / GnrH analog shown prominently in the tables in Figure 2A and 2B that correspond to the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively).
  • Figure 3 shows the secondary structure prediction of the genetic constructs corresponding to the preferred sequences of the invention, SEQ ID NO: 1 ( Figure 3A) and SEQ ID NO: 2 ( Figure 3B).
  • the genetic constructs (1 and 2) were evaluated as promising in relation to: prediction of secondary structure (GnrH structure / GnrH analogue in the insertion in ovoalbumin in the form of a helix (coil); prediction of final quaternary structure (conformation and exposure of the GnrH / GnrH analog in the structure according to the structure of the natural GnrH and with high accessibility to the solvent) and prediction of B cell epitopes (increase in the number of GnrH peptides / GnrH analog in the recognition by the immune system).
  • the invention is based on the insertion of amino acid sequences in appropriate regions of the carrier protein to improve the flexibility and accessibility to antigenic epitopes for the production of polypeptides intended for the immunocastration of mammals, especially pigs.
  • the invention provides two alternative forms for said amino acid sequences. In the first alternative, a Glycine is added to the N-terminal portion of each sequence of the GnrH decapeptide. In the second alternative, the inserted peptides are analogues of the GnrH decapeptide in which the Glutamine residue is replaced by a Glycine.
  • Glycine is also added to the internal antigenic portion with a high B-factor and in the region of the C-terminal portion, which further contributes to improving flexibility and maintaining the (correct) curved conformation of GnrH and consequently generating neutralizing antibodies. .
  • a spacer and a sequence of the obtained Th peptide are added to the C-terminal region of the carrier protein from the influenza virus hemagglutinin light chain.
  • the spacer corresponds to the sequence SEQ ID NO: 5 and (ii) the T cell epitope recruiting sequence of the influenza virus hemagglutinin corresponds to the sequence SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 6 is done according to the teachings of Ghosh and Jackson (1999) (see Ghosh, S .; Jackson, DC Antigenic and immunogenic properties of totally synthetic peptide-based anti-fertility vaccines, p. 1 103-1 1 10. 1999).
  • two Glycine residues are added, one in the high B-factor internal region and the other at the N-terminal end of the four GnrH decapeptides inserted in the C-terminal region of the carrier protein.
  • the antigenic chimeric polypeptides of the invention are constructed with the same carrier protein and with ten inserts of the decapeptide GnrH of SEQ ID NO: 7 or with ten inserts of an analog thereof having the amino acid sequence in which the Glutamine residue at the N-terminal end of each of the decapeptides is replaced by Glycine - SEQ ID NO: 8.
  • the ten insertions are made with the GnrH decapeptide of SEQ ID NO: 7, it is additionally inserted, at the N-terminal end of each of the ten decapeptides, a Glycine residue to increase the flexibility of the amino acid sequence and enable greater accessibility to the antigenic portions of the chimeric polypeptide of the invention.
  • SEQ ID NO: 1 corresponds to that first preferred embodiment of the polypeptide of the invention.
  • the ten insertions are made with the GnrH decapeptide analog, as represented in SEQ ID NO: 8.
  • SEQ ID NO: 2 corresponds to this second preferred embodiment of the polypeptide of the invention.
  • the GnrH decapeptide analogue results from the deletion of the Glutamine residue from the N-terminal end of each of said decapeptides. This modification is introduced in GnrH to solve the doubt of the antigen's agonist action, that is, the impediment of the agonist function in the probable eventuality of GnrH cleavage by endopeptidases.
  • Figure 7 shows, in tests carried out on rats, the comparison between the performance of the polypeptides of the invention with the positive and negative controls.
  • the test on mice was also compared with the ovoalbumin-LHRH-7 polypeptide described in the state of the art (US patent 6,013,770).
  • the significantly better performance of the polypeptides of the present invention can be seen as shown in Figure 7.
  • the present invention also relates to an immunogenic composition or vaccine for immunocastration of animals comprising, as an active ingredient, an antigenic chimeric polypeptide of the invention formed from a carrier protein and at least ten, preferably ten, inserts of the GnrH decapeptide or of an analog thereof, and non-pharmaceutically or veterinarily acceptable ingredients.
  • an antigenic chimeric polypeptide of the invention formed from a carrier protein and at least ten, preferably ten, inserts of the GnrH decapeptide or of an analog thereof, and non-pharmaceutically or veterinarily acceptable ingredients.
  • the polypeptide corresponds to SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide corresponds to SEQ ID NO: 2.
  • composition of the invention may be in the form of a liquid preparation, which may be aqueous or oily.
  • the preparation is in liquid form for subcutaneous administration.
  • the term "pharmaceutically or veterinarily acceptable carrier” means one or more non-active ingredients that have the function, in the vaccine, of carrying the active ingredient to the place where its pharmacological activity is required and must understand substances suitable for use in humans and animals and be compatible with the active ingredient of the invention, i.e., with the immunogenic chimeric polypeptide of the invention.
  • Those skilled in the art are able, from the invention disclosed here and from common knowledge of antigenic chimeric polypeptides, to select those suitable to be present in the vaccine as a vehicle.
  • the vaccine of the present invention may comprise, in addition to the polypeptide of the invention and the pharmaceutically or veterinarily acceptable carrier, other non-active ingredients, such as adjuvants, preservatives, diluents, emulsifiers, stabilizers and other pharmacologically acceptable ingredients that are employed in immunogenic preparations for human and animal use.
  • other non-active ingredients such as adjuvants, preservatives, diluents, emulsifiers, stabilizers and other pharmacologically acceptable ingredients that are employed in immunogenic preparations for human and animal use.
  • Non-limiting examples of adjuvants include Freund's incomplete adjuvant, Freund's complete adjuvant, b- (1, 4) bound polydispersed acetate mannan, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer adjuvants, modified lipid adjuvants, saponin-derived adjuvants, dextran sulfate , aluminum hydroxide and aluminum phosphate.
  • the antigenic chimeric polypeptides of the invention were obtained from synthetic and optimized genes, and were cloned into vector pD451 -SR as shown in Figures 4A and 4B.
  • the final polypeptides of the present invention were designed as follows: The quaternary (crystallographic) structure of ovoalbumin (regions with high B-factors) was analyzed to determine the insertion regions. After defining the regions, in the primary amino acid sequence three inserts of the peptide / analog GnrH were inserted in tandem (opening the chain with 1 -3 glycine residues which is a small and flexible amino acid, therefore, without the possibility of steric impediment with other residues polypeptide chain).
  • Table 1 presents the summary of the characteristics of the antigenic chimeric polypeptides of the invention obtained.
  • the genetic constructs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 thus eluted are in the concentration of approximately 20 ng / pL and were used in the transformation and fermentation to obtain the polypeptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO : 2 of the invention.
  • the transformed cells in each tube were seeded on LB-agar and kanamycin antibiotic plates (30 ⁇ g / mL) and incubated in the oven at 37 ° C overnight (overnight).
  • the procedure was the same, but only 10 mL (200 ng of DNA) was used.
  • the final preparation comprises the active ingredient (SEQ ID NO: 1) or (SEQ ID NO: 2) together with a pharmaceutically or veterinarily acceptable carrier, other non-active ingredients, such as adjuvants, preservatives, diluents, emulsifiers, stabilizers and others pharmacologically acceptable ingredients that are used in immunogenic preparations for human and animal use.
  • Successful pig immunocastration is defined as a testis slaughter weight of less than 150 grams. Testicle weight is directly correlated with the production of testosterone and whole male odor steroids. It has been reported that there is an excellent correlation between the size and particularly the weight of the testes and the level of androstenone in the pig (Oonk et al., Livest. Prod. Sci. 42, 63-71 (1995)). The testicles of immunized animals weighing less than 150 grams after slaughter are a clear indication of the absence of sexual odor.

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Abstract

A presente invenção se refere a construções genéticas que codificam antígenos imunogênicos compreendendo uma proteína carreadora e insertos do decapeptídeo GnrH/LHRH (Hormônio Liberador de Gonadotrofina/Hormônio Liberador do Hormônio Luteinizante) ou de um seu análogo para formar polipeptídeos quiméricos antigênicos empregados em composições imunogênicas para imunocastração de mamíferos, particularmente de suínos. A construção genética desta invenção visa a produção de um antígeno mais imunogênico e eficaz para a produção de anticorpos neutralizantes do GnrH e, consequentemente, inibir a síntese de Hormônio Luteinizante e Hormônio Folículo Estimulante, possibilitando a imunocastração de mamíferos. Esse objetivo é alcançado por meio de construções genéticas codificantes do antígeno quimérico compreendendo a proteína carreadora e inserções do decapeptídeo GnrH ou de um análogo do mesmo suficientes para proporcionar um maior número de epítopos do GnrH e de sequências recrutadoras de células Th.

Description

“POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO ANTIGÊNICO, CONSTRUÇÃO GÊNICA E COMPOSIÇÃO ANTIGÊNICA PARA IMUNOCASTRAÇÃO DE MAMÍFEROS NÃO HUMANOS”
Campo Técnico
[01] A presente invenção se refere a construções genéticas que codificam antígenos imunogênicos compreendendo uma proteína carreadora e insertos do decapeptídeo GnrH/LHRH (Hormônio Liberador de Gonadotrofina/Hormônio Liberador do Hormônio Luteinizante) ou do seu análogo para formar polipeptídeos quiméricos antigênicos empregados em vacina para imunocastração de mamíferos não humanos, especialmente de animais de produção tais como suínos e bovinos.
Histórico da Invenção
[02] Atualmente, existem no mercado veterinário vacinas para imunocastração de suínos e outros animais. Um exemplo desses produtos é o de marca Vivax®, de propriedade da Pfizer, que é uma vacina conjugada compreendendo um peptídeo de GnrH fusionado a um toxoide diftérico. Esta tecnologia tem como desvantagem envolver alto custo de produção. Também está disponível no mercado a vacina comercializada sob o nome de marca Repro- BLOC™, de propriedade da empresa Amplicon LLC, para esterilização/castração imunológica de animais.
[03] Muitos esforços têm sido empreendidos voltados para a produção de uma vacina recombinante para contracepção imunológica ou para imunocastração de animais domésticos que tenha eficácia comprovada.
[04] Por exemplo, o documento WO 88/00056 descreve uma composição para a produção em animais de anticorpos específicos para LHRH compreendendo dois ou mais carregadores individualmente acoplados/conjugados ao LHRH ou a um análogo do mesmo, em quantidades suficientes para produzir uma resposta imune contra LHRH. Os carregadores são proteínas que quando acopladas a substâncias menores, tal como o LHRH, produzem uma resposta imune em animais. Exemplos preferidos de carregadores são toxoide de difteria, albumina de soro humano, proteína A de staphylococcus, toxoide de tétano, sendo o mais preferido o toxoide de difteria.
[05] Os principais problemas encontrados na vacinação/imunocastração empregando o antígeno GnrH/LHRH são relacionados com a produção de níveis insuficientes de anticorpos anti-GnrH, principalmente devido à dificuldade de visibilidade do decapeptídeo GnrH/LHRH, que por ser de tamanho pequeno, fica com a acessibilidade a suas porções antigênicas dificultada por impedimento estérico pela proteína carreadora.
[06] No documento US 2015/190491 , buscando aumentar a acessibilidade às porções antigênicas do decapeptídeo GnRH, é proposta uma composição compreendendo a mistura de duas variantes de GnRH, sendo que uma delas contém uma molécula carreadora ligada à extremidade carboxil-terminal da variante de GnRH e a outra variante contém a mesma ou outra molécula carreadora ligada à extremidade amino-terminal da variante de GnRH. A composição proposta tem por finalidade o emprego em controle de doenças benignas e malignas em mamíferos, por exemplo, cânceres dependentes de hormônio.
[07] Os documentos US 6.013.770, US 6.045.799 e US 2002/198364 descrevem vacinas contraceptivas quiméricas, cujo componente ativo é um antígeno quimérico formado por uma proteína carreadora, preferencialmente a ovoalbumina, e insertos de LHRH ou de um seu análogo. Preferencialmente, o LHRH é inserido em regiões potencialmente antigênicas da proteína carreadora ovoalbumina. Tais regiões antigênicas podem ser epítopos de célula-B, sítios de epítopos antigênicos de célula-T, e sítios localizados em regiões de exposição superficial. As versões preferidas do antígeno quimérico são aquelas em que: (i) quatro insertos de LHRH estão localizados nas regiões N-terminal e C-terminal da proteína ovoalbumina ou (ii) sete insertos estão localizados (a) na região N-terminal, (b) nas regiões potencialmente antigênicas da ovoalbumina (determinadas por programas de computador) entre os aminoácidos 51 -73 e 81 -99 (ver coluna 4, linhas 54-60 da US6013770); e (c) na região C-terminal (ver Figura 2 constante desses documentos). Essas localizações de inserção foram escolhidas com base na previsão da exposição superficial, flexibilidade, acessibilidade e índice antigênico baseado na sequência de aminoácidos, sendo previsto que o quimérico ovoalbumina- LHRH-7 deve ser mais antigênico do que o quimérico ovoalbumina-LHRH-4 no estímulo da produção de anticorpos anti-LHRH (ver coluna 4, linhas 60-67 da US 6.013.770).
[08] Uma das limitações das abordagens praticadas nessa técnica é basear a busca das porções antigênicas no conhecimento da estrutura primária (sequência de aminoácidos) da proteína carreadora. Porém, sem o mapeamento da estrutura quaternária da proteína carreadora é difícil realizar inserções que mantenham o enovelamento proteico correto porque tais inserções tendem a se posicionar em regiões no meio de estruturas como a- hélice e fitas b. Assim, para ter o conhecimento das posições corretas para a inserção, o mapeamento da estrutura primária deve ser feito juntamente com o da estrutura quaternária. Além do mapeamento dessas estruturas, é necessário também prover um número suficiente de sequências GnrH na conformação correta, expostas para recrutamento de células B, e uma sequência recrutadora de epítopos de células T para aumentar o favorecimento da resposta imunológica contra o GnrH em relação ao componente carreador. Se não forem tomadas essas providências, o antígeno não apresentará a eficácia desejada para se tornar uma alternativa atraente para o mercado de vacinas de imunocastração de mamíferos, em especial de suínos.
Sumário da Invenção
[09] A presente invenção tem por objetivo otimizar a construção genética, desenvolvendo uma nova construção mais imunogênica e eficaz na produção de anticorpos neutralizantes do GnrH e, consequentemente, inibir a síntese de LH (Hormônio Luteinizante) e FSH (Hormônio Folículo Estimulante), possibilitando a imunocastração de mamíferos não humanos, especialmente para animais de produção tais como suínos e bovinos.
[010] Esse objetivo é alcançado por meio de construções genéticas codificantes do antígeno quimérico compreendendo a proteína carreadora e inserções estratégicas do decapeptídeo GnrH ou de um análogo do mesmo suficientes para proporcionar um maior número de epítopos de células B do GnrH e de sequências recrutadoras de células Th2.
[011] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, são providos polipeptídeos quiméricos imunogênicos capazes de produzir suficientes anticorpos anti-GnrH em níveis para possibilitar a eficácia de imunocastração de suínos e outros mamíferos não humanos. Os polipeptídeos da invenção são constituídos de sequências de aminoácidos que compreendem inserções estratégicas do decapeptídeo GnrH com adição de uma glicina na extremidade N-terminal do mesmo em uma proteína carreadora, sendo que dito decapeptídeo está presente na dita sequência como: (i) pelo menos três inserções na porção N-terminal da dita proteína carreadora; (ii) pelo menos três inserções na porção antigênica interna com alto B-fator da dita proteína carreadora; e (iii) pelo menos quatro inserções na porção C-terminal da dita proteína carreadora, sendo que as ditas inserções são precedidas por um resíduo glicina adicionado para melhorar a flexibilidade e acessibilidade dos epítopos com atividade imunogênica.
[012] De acordo com segundo aspecto da presente invenção, são providos polipeptídeos quiméricos imunogênicos capazes de produzir suficientes anticorpos anti-GnrH em níveis para possibilitar a eficaz imunocastração de suínos e outros mamíferos. Os polipeptídeos desta segunda alternativa da invenção são constituídos de sequências de aminoácidos que compreendem inserções estratégicas do análogo do GnrH consistindo de uma sequência de aminoácidos na qual o resíduo Glutamina localizado na porção N-terminal do dito decapeptídeo é substituído por um resíduo Glicina, sendo que dito análogo está presente na sequência da dita proteína carreadora como: (i) pelo menos três inserções na porção N-terminal da dita proteína carreadora; (ii) pelo menos três inserções na porção antigênica interna com alto B-fator da dita proteína carreadora; e (iii) pelo menos quatro inserções na porção C-terminal da dita proteína carreadora.
[013] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é provido um polipeptídeo quimérico antigênico constituído de sequências de aminoácidos que compreendem dez sequências do decapeptídeo GnrH precedido por um resíduo Glicina adicionado na porção N-terminal do mesmo, ditas sequências sendo inseridas em uma proteína carreadora, consistindo de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 .
[014] De acordo com um quarto aspecto da invenção, é provido um polipeptídeo quimérico antigênico constituído de dez sequências de aminoácidos que compreendem um análogo do decapeptídeo GnrH consistindo de uma sequência de aminoácidos na qual o resíduo Glutamina localizado na porção N-terminal do dito decapeptídeo é substituído por um resíduo Glicina inseridos em uma proteína carreadora, dito polipeptídeo consistindo de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2.
[015] De acordo com um quinto aspecto da invenção, é provida uma construção genética quimérica compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificante do polipeptídeo de SEQ ID NO:1 . Particularmente, esta construção genética compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:3.
[016] Em um sexto aspecto, a presente invenção diz respeito a uma construção genética quimérica compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificante do polipeptídeo de SEQ ID NO:2. Particularmente, esta construção genética compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:4.
[017] Em um sexto aspecto, a presente invenção diz respeito a uma vacina para imunocastração de mamíferos não humanos, especialmente para animais de produção tais como suínos e bovinos compreendendo (i) um polípeptídeo quimérico antigênico da invenção, (ii) opcionalmente um adjuvante e (iii) um veículo veterinariamente aceitável.
Breve Descrição das Figuras
[018] A Figura 1 mostra a estrutura cristalográfica da construção final obtida de modelagem molecular (usando o Software Swiss Model) indicando as regiões (altos B-fatores) onde foram inseridos os peptídeos análogos de GnrH (in tandem). Para inserção dos peptídeos análogos de GnrH foram adicionados resíduos flexíveis na posição N-terminal de cada peptídeo ideal para a conformação“bent” (curvada) do GnRH. A Figura 1 A representa o modelo final da estrutura da proteína gerada por modelagem homologia da SEQ ID NO:1 e a Figura 1 B mostra o modelo final da estrutura da proteína gerada por modelagem homologia da correspondente à SEQ ID NO: 2.
[019] A Figura 2 mostra a predição de epítopos nas construções genéticas da invenção e a comparação com as do estado da técnica. A Figura 2A (compreendendo o espectro de predição de epítopos e a tabela identificando os correspondentes aminoácidos) representa a predição de epítopos da construção genética codificante do polipeptídeo quimérico antigênico da invenção constituído da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 . A Figura 2B (compreendendo o espectro de predição de epítopos e a tabela identificando os correspondentes aminoácidos) representa a predição de epítopos da construção genética codificante do polipeptídeo quimérico antigênico da invenção constituído da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. A Figura 2C representa a predição de epítopos da construção genética codificante do polipeptídeo descrito na patente US 6.013.770.
[020] A Figura 3 mostra a predição das estruturas secundárias codificantes dos polipeptídeos quiméricos antigênicos da invenção. A Figura 3A representa a predição da estrutura secundária da construção genética codificante do polipeptídeo quimérico antigênico da invenção constituído da sequência de amínoácídos da SEQ ID NO:1 . A Figura 3B representa a predição da estrutura secundária da construção genética codificante do polipeptídeo quimérico antigênico da invenção constituído da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
[021] A Figura 4 mostra os mapas das construções genéticas utilizadas na preparação dos polipeptídeos quiméricos antigênicos da invenção. (A) SEQ ID NO:1 : construção GnrH-ovoalbumina em plasmídeo pD451 -SR com 5535 pb. (B) representa a SEQ ID NO:2: construção DGnrH-ovoalbumina em plasmídeo pD451 -SR com 5505 pb.
[022] A Figura 5 mostra a curva de crescimento da mini-fermentação para expressão do polipeptídeo da invenção de: (A) SEQ ID NO:1 e (B) SEQ ID NO:2.
[023] A Figura 6 mostra o gel SDS-Page com o perfil proteico da fermentação para obtenção do polipeptídeo da invenção de: (A) SEQ ID NO:1 e (B) SEQ ID NO:2.
[024] A Figura 7 mostra o resultado do teste de eficácia da vacina em ratos (peso testicular) e concretização dos resultados de predição in silico. Foi utilizada a dose de antígeno de 125 ug/dose por via subcutânea nos tempos DO e D28. Os ratos foram eutanasiados em D56 dias. (A) SEQ ID NO:1 e (B) SEQ ID NO:2 [Neste caso foi inserido o antígeno do estado da técnica (ovoalbumina- LHRH-7, patente US 6.013.770) para comparação].
Descricão Detalhada da Invenção
[025] A presente invenção trata de polipeptídeos quiméricos imunogênicos a serem empregados na contracepção imunológica (imunocastração) de animais, especialmente de animais de produção tais como suínos e bovinos, compreendendo uma proteína carreadora e insertos de GnrH localizados em regiões de maior antigenicidade potencial da proteína carreadora, e em porções de menor impedimento estérico da proteína carreadora.
[026] Os polipeptídeos da invenção são codificados por construções genéticas formadas a partir de um gene codificador da proteína carreadora apropriada, preferencialmente a ovoalbumina, e inserções de sequências nucleotídicas codificantes do decapeptídeo GnrH na possível conformação correta para possibilitar a produção de anticorpos anti-GnrH que sejam neutralizantes e em nível suficiente para alcançar a contracepção imunológica em animais.
[027] A construção genética da invenção é desenhada de modo a possibilitar a inserção de fragmentos de DNA codificantes de pelo menos dez insertos do análogo do decapeptídeo GnrH em regiões internas flexíveis e expostas da Ovoalbumina (Altos B-fatores) e nas regiões amino-terminal e carboxi-terminal da proteína carreadora. Para inserção dos decapeptídeos foram adicionados 2 resíduos glicina (Gly) na extremidade amino terminal com intuito de obter a correta conformação do GnrH e abrir a cadeia polipeptídica da ovoalbumina sem impedimento estérico.
[028] O objetivo da construção genética é (i) melhorar a eficácia da vacina em campo pela maior exposição e conformação do decapeptídeo GnrH e aumento da resposta imunológica e (ii) impedir a possível função de agonista (uso do análogo de GnRH), caso ocorra a clivagem do GnrH por endopeptidases.
[029] A construção genética que codifica o antígeno para imunocastração de animais mamíferos, especialmente suínos, é desenhada a partir do mapeamento da estrutura quaternária da proteína carregadora, ou seja, a partir da estrutura cristalográfica da proteína ovoalbumina (PDB ( protein data bank, code: 10VA)). Assim, foram mapeadas as regiões de alta exposição ao solvente e alta flexibilidade na estrutura (pelo parâmetro altos B-fatores). Para preservar a integridade da proteína, foi evitada a escolha para inserção no meio de estruturas secundárias como alfa hélices ou fitas beta e para evitar o impedimento estérico e, para manter a conformação mais correta do GnrH, foram inseridos 2-3 resíduos de glicina na porção N-terminal dos decapeptídeos inseridos na cadeia polipeptídica.
[030] A Figura 1 ilustra as estruturas das construções finais obtidas de modelagem molecular (usando o Software Swiss Model) indicando as regiões (altos B-fatores) onde foram inseridos os peptídeos GnrH para a sequência 1 (A) e análogos de GnrH para a sequência 2 (B) (in tandem). Para inserção dos decapeptídeos GnrH/análogo GnRH, foram adicionados resíduos flexíveis na posição N-terminal de cada peptídeo inserido no caso das duas construções 1 e 2.
Predição dos Epítopos
[031] Para realização da predição dos epítopos foi utilizado um software Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0. Disponível em <(http://tools. immuneepitope. ora/bcell/)>.
[032] A Figura 2 mostra a predição dos epítopos das construções genéticas preferidas da invenção codificantes dos polipeptídeos de SEQ ID NO:1 (Figura 2A) e de SEQ ID NO:2 (Figura 2B).
[033] Os epítopos de células B são sítios nos polipeptídeos que são reconhecidos por anticorpos do sistema imunológico. O conhecimento de epítopos de células B pode ser usado no desenho de vacinas recombinantes. O método de predição de epítopos lineares de células B é baseado em estudos do método de escala de tendência (que tem como parâmetros hidrofilicidade/hidrofobicidade, acessibilidade, estrutura secundária e antigenicidade). A antigenicidade, que é a capacidade de um epítopo reagir a um anticorpo, deve ser distinguida a partir de sua imunogenicidade ou capacidade de induzir anticorpos em um hospedeiro invertebrado. Falhas em distinguir epítopos de células B explicam o não sucesso de algumas vacinas baseadas em peptídeos. O software Bepipred prediz a localização de epítopos usando uma combinação do modelo de Markov e o método de escala de tendência. Os resíduos com escores acima do threshold (valor referência é uma pontuação média) são preditos ser parte de um epítopo e destacados na região positiva do gráfico (onde os eixos Y representam os escores de resíduos e o eixo X são as posições dos resíduos na sequência) e a tabela abaixo indica os epítopos que foram preditos como recrutadores de células B. [034] No caso das construções genéticas preferidas da invenção o número de epítopos de análogos de GnrH/GnrH preditos foram de oito para as duas construções (epítopos de GnrH/análogo GnrH mostrados em destaque nas tabelas da Figura 2A e 2B que correspondem às sequências SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente).
[035] Fazendo a comparação desses epítopos preditos (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) com uma construção conhecida (ovoalbumina-LHRH-7, patente US 6.013.770, ver Figura 2C), foi verificado que o número de epítopos contemplando o decapeptídeo GnrH do estado da técnica corresponde a quatro (4) (destacados na tabela de epítopos preditos da Figura 2C) significando que as construções preferidas da invenção têm um número maior (oito (8)) de epítopos de GnrH/análogo GnrH recrutadores de células B do que a construção do estado da técnica, demonstrando que a estratégia de inserção dos decapeptídeos dobrou o número de epítopos de GnrH que são recrutados pelo sistema imunológico. Esse achado foi devido à estratégia de inserção do decapeptídeo GnrH/análogo GnrH.
Predição da Estrutura Secundária
[036] Para predição da estrutura secundária foi utilizado o software Psipred. Disponível em <(http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/)>.
[037] A Figura 3 mostra a predição de estrutura secundária das construções genéticas correspondentes às sequências preferidas da invenção, SEQ ID NO:1 (Figura 3A) e SEQ ID NO:2 (Figura 3B).
[038] A partir da predição da estrutura secundária das construções genéticas preferidas da invenção é possível notar que as regiões que correspondem ao decapeptídeo GnrH (Gin His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly) são estruturas em hélice (coils), tornando necessária a inserção de regiões expostas e de acessibilidade à superfície, como provida pela invenção para recrutamento dos epítopos. Análise da Estrutura Quaternária da Ovoalbumina
[039] O mapeamento da estrutura quaternária do polipeptídeo carreador ovoalbumina, mais especificamente o mapeamento das regiões com altos B- fatores (fatores altos de temperatura, isto é, alta flexibilidade) foi realizado utilizando o software Pymol para inserção dos peptídeos GnrH.
Construções Genéticas
[040] Com a informação provida pela análise da estrutura quaternária da ovoalbumina contemplando regiões de altos B-fatores, foram realizadas as duas construções genéticas (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) com inserções estratégicas do decapeptídeo GnrH (1 ) e (2) análogo do decapeptídeo GnrH. As construções genéticas (1 e 2) foram avaliadas como promissoras em relação a: predição de estrutura secundária (estrutura do GnrH/análogo de GnrH na inserção na ovoalbumina em forma de hélice ( coil ); predição de estrutura quaternária final (conformação e exposição do GnrH/análogo de GnrH na estrutura de acordo com a estrutura do GnrH natural e com alta acessibilidade ao solvente) e predição de epítopos de células B (aumento do número de peptídeos GnrH/análogo de GnrH no reconhecimento pelo sistema imunológico).
[041] Preferencialmente, são feitas dez inserções para obtenção dos polipeptídeos quiméricos (com alto potencial de recrutamento do sistema imunológico) da invenção em três regiões da proteína carregadora ovoalbumina:
(i) na região N-terminal - inserção de pelo menos três peptídeos de GnrH ou de um análogo dos mesmos,
(ii) na região interna com alto B-fator - inserção de pelo menos três peptídeos de GnrH ou de um análogo dos mesmos in tandem.
(iii) na região C-terminal - inserção de pelo menos quatro peptídeos GnrH ou de um análogo dos mesmos. [042] Como relatado acima, a invenção se fundamenta na inserção de sequências de aminoácidos em regiões apropriadas da proteína carregadora para melhorar a flexibilidade e acessibilidade aos epítopos antigênicos para a produção de polipeptídeos destinados à imunocastração de mamíferos, em especial de suínos. A invenção provê duas formas alternativas para as referidas sequências de aminoácidos. Na primeira alternativa, é adicionada uma Glicina na porção N-terminal de cada sequência do decapeptídeo GnrH. Na segunda alternativa, os peptídeos inseridos são análogos do decapeptídeo GnrH nos quais o resíduo Glutamina é substituído por uma Glicina. Em ambas alternativas, são ainda adicionadas Glicina na porção antigênica interna com alto B-fator e na região da porção C-terminal, o que contribui mais ainda para melhorar a flexibilidade e manter a conformação curvada (correta) do GnrH e consequentemente gerar anticorpos neutralizantes.
[043] Para conferir maior imunogenicidade ao polipeptídeo quimérico da invenção, antes de serem feitas as inserções do decapeptídeo GnrH ou de um análogo do mesmo, são adicionadas, na região C-terminal da proteína carreadora, um espaçador e uma sequência do peptídeo Th obtido a partir da cadeia leve da hemaglutinina do vírus da influenza.
[044] Preferencialmente, (i) o espaçador corresponde à sequência SEQ ID NO:5 e (ii) a sequência recrutadora de epítopos de células T da hemaglutinina do vírus da influenza corresponde à sequência SEQ ID NO:6. A adição da SEQ ID NO:6 é feita de acordo com os ensinamentos de Ghosh e Jackson (1999) (ver Ghosh, S.; Jackson, D.C. Antigenic and immunogenic properties of totally synthetic peptide-based anti-fertility vacines, p. 1 103-1 1 10. 1999).
[045] Mais preferencialmente, com a finalidade de abrir a cadeia para a inserção são adicionados dois resíduos Glicina (um aminoácido flexível), um na região interna de alto B-fator e outro na extremidade N-terminal dos quatro decapeptídeos de GnrH inseridos na região C-terminal da proteína carreadora.
[046] Preferencialmente, os polipeptídeos quiméricos antigênicos da invenção são construídos com a mesma proteína carreadora e com dez inserções do decapeptídeo GnrH de SEQ ID NO:7 ou com dez inserções de um análogo do mesmo tendo a sequência de aminoácidos em que o resíduo Glutamina da extremidade N-terminal de cada um dos decapeptídeos é substituído por Glicina - SEQ ID NO:8.
[047] De acordo com a primeira concretização dos polipeptídeos quiméricos antigênicos da invenção, na qual são feitas as dez inserções com o decapeptídeo GnrH de SEQ ID NO:7, é adicionalmente inserido, na extremidade N-terminal de cada um dos dez decapeptídeos, um resíduo Glicina para aumentar a flexibilidade da sequência de aminoácidos e possibilitar maior acessibilidade às porções antigênicas do polipeptídeo quimérico da invenção. A SEQ ID NO:1 corresponde a essa primeira concretização preferencial do polipeptídeo da invenção.
[048] Como mostrado na sequência da SEQ ID NO:1 , o decapeptídeo de GnrH, em cada uma das dez inserções, é precedido pelo resíduo Glicina adicionado.
[049] Na segunda concretização do polipeptídeo quimérico antigênico da invenção, preferencialmente, as dez inserções são feitas com o análogo do decapeptídeo GnrH, como representado na SEQ ID NO: 8. A SEQ ID NO:2 corresponde a esta segunda concretização preferencial do polipeptídeo da invenção.
[050] Na SEQ ID NO:2, o análogo do decapeptídeo de GnrH é resultante da deleção do resíduo Glutamina da extremidade N-terminal de cada um dos ditos decapeptídeos. Esta modificação é introduzida no GnrH para sanar a dúvida da ação agonista do antígeno, ou seja, o impedimento da função de agonista na provável eventualidade de clivagem do GnrH por endopeptidases.
[051] A Figura 7 mostra, em testes realizados em ratos, a comparação entre o desempenho dos polipeptídeos da invenção com os controles positivos e negativos. No caso do polipeptídeo (SEQ ID NO:2) da invenção o teste em ratos foi comparado também com o polipeptídeo da ovoalbumina-LHRH-7 descrito no estado da técnica (patente US 6.013.770). Pode ser observado o desempenho significativamente melhor dos polipeptídeos da presente invenção como evidenciado na Figura 7.
[052] Com a quimérica ovoalbumina e decapeptídeo GnrH ou análogo do mesmo construída, as sequências de aminoácidos SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 foram traduzidas reversamente para as sequências de nucleotídeos para a síntese dos genes correspondes às SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, respectivamente.
[053] Finalmente, as construções genéticas foram transformadas em células competentes apropriadas, tendo sido selecionadas as colónias e os melhores clones produtores dos polipeptídeos quiméricos antigênicos da invenção, polipeptídeos esses que são produzidos (processo de upstream e downstream) e formulados para a produção da vacina da invenção.
[054] A presente invenção também diz respeito a uma composição imunogênica ou vacina para imunocastração de animais compreendendo, como ingrediente ativo, um polipeptídeo quimérico antigênico da invenção formado a partir de uma proteína carreadora e pelo menos dez, preferencialmente dez insertos do decapeptídeo GnrH ou de um análogo do mesmo, e ingredientes não ativos farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis. Preferencialmente, em uma primeira concretização, o polipeptídeo corresponde à SEQ ID NO:1 . Ainda preferencialmente, em uma segunda concretização o polipeptídeo corresponde à SEQ ID NO:2.
[055] A composição da invenção pode estar na forma de uma preparação líquida, podendo ser aquosa ou oleosa. Preferencialmente, a preparação está na forma líquida para administração subcutânea.
[056] De acordo com a invenção, o termo “veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável” significa um ou mais ingredientes não ativos que têm a função, na vacina, de portar o ingrediente ativo até o local onde é requerida a sua atividade farmacológica e deve compreender substâncias apropriadas para uso em humanos e animais e serem compatíveis com o ingrediente ativo da invenção, ou seja, com o polipeptídeo quimérico imunogênico da invenção. Os técnicos no assunto são capazes de, a partir da invenção aqui revelada e do conhecimento comum sobre polipeptídeos quiméricos antigênicos, selecionar aqueles adequados para estar presentes na vacina na função de veículo.
[057] A vacina da presente invenção pode compreender, além do polipeptídeo da invenção e do veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, outros ingredientes não ativos, tais como, adjuvantes, preservativos, diluentes, emulsificantes, estabilizantes e outros ingredientes farmacologicamente aceitáveis e que são empregados em preparações imunogênicas para uso humano e animal. Exemplos não limitantes de adjuvantes incluem o adjuvante incompleto de Freund, o adjuvante completo de Freund, manana acetilada polidispersa b-(1 ,4) ligada, adjuvantes de copolímero de polioxietileno- polioxipropileno, adjuvantes lipídicos modificados, adjuvantes derivados de saponina, sulfato de dextrana, hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio.
[058] A seguir são providos exemplos que ilustram e representam concretizações específicas da invenção. Os exemplos a seguir não devem ser interpretados como limitativos da presente invenção.
EXEMPLO 1
[059] Os polipeptídeos quiméricos antigênicos da invenção foram obtidos a partir dos genes sintéticos e otimizados, e foram clonados em vetor pD451 -SR como representado nas Figuras 4A e 4B. Os polipeptídeos finais da presente invenção foram desenhados da seguinte forma: A estrutura quaternária (cristalográfica) da ovoalbumina (regiões com altos B-fatores) foi analisada para determinação das regiões de inserções. Após definida as regiões, na sequência primária de aminoácidos foram inseridos três insertos do peptídeo/análogo GnrH in tandem (abrindo a cadeia com 1 -3 resíduos de Glicina que é um aminoácido pequeno e flexível, portanto, sem possibilidade de impedimento estérico com outros resíduos da cadeia polipeptídica). Três insertos do peptídeo foram inseridos na região no meio da macromolécula com alto B-fator, abrindo a cadeia na glicina da sequência FDKLG (utilizando a glicina da própria cadeia). Quatro insertos foram adicionados a porção C- terminal, porém antes da sua adição foi visto que essa região pode participar da interação com outra molécula de ovoalbumina formando tetrâmero. Assim, foi adicionado ao C-terminal um espaçador antes da adição do peptídeo (para possibilitar maior exposição do epítopo), seguido de uma sequência recrutadora de células Th2.
[060] A sequência primária de aminoácidos foi traduzida reversamente para a sequência de nucleotídeos (códons otimizados para expressão em E. coli) e em seguida sintetizada.
[061] A Tabela 1 apresenta o resumo das características dos polipeptídeos quiméricos antigênicos da invenção obtidos.
Tabela 1. Parâmetros das proteínas das construções 1 e 2
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EXEMPLO 2: TRANSFORMAÇÃO E MINI-FERMENTACÃO DAS
CONSTRUÇÕES GENÉTICAS DA INVENÇÃO
- Eluicão do aene:
[062] Os DNAs (genes sintéticos 10GnrH-pD451 -SR (SEQ ID NO:3) e 10DGnrH-pD451 -SR (SEQ ID NO:4)) codificantes dos polipeptídeos quiméricos antigênicos preferidos da invenção, correspondentes às sequências de aminoácidos SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, ou seja, as construções genéticas de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, foram eluídos.
[063] As construções genéticas de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 assim eluídas estão na concentração de aproximadamente 20 ng/pL e foram empregadas na transformação e fermentação para obtenção dos polipeptídeos de SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 da invenção.
- Transformação e Fermentação com as construções genéticas de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4:
[064] As construções quiméricas/recombinantes de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 foram separadamente transformadas por choque térmico em células competentes de E. coli BL21 (DE3).
[065] Duas alíquotas de 50 mL de células E. coli BL21 (DE3) competentes foram retirados do freezer (-80ºC) e descongelados em gelo por 10 minutos. Após descongelamento dessas duas alíquotas, foram adicionados em cada tubo: (a) 2,5 mL (50 ng de DNA) e (b) 10 mL (200 ng de DNA) da construção gênica correspondente à SEQ ID NO:4 clonada em pD451 -SR (construção 2). As misturas foram incubadas em gelo por 30 minutos e, posteriormente, incubadas a 42°C por 10 segundos e novamente no gelo por mais 5 minutos. Foi adicionado a cada tubo 900 mL de Meio LB e incubado no agitador (shaker) por 1 hora a 37°C. Terminado esse tempo, as células transformadas de cada tubo foram semeadas em placas de LB-ágar e antibiótico canamicina (30 ug/mL) e incubadas na estufa a 37°C durante a noite ( overnight ). No caso da construção gênica correspondente à SEQ ID NO:3 clonada em pD451 -SR (construção 1 ), o procedimento foi o mesmo, mas foi utilizada somente a quantidade de 10 mL (200 ng de DNA).
[066] Cada uma das quatro colónias advindas da transformação da construção genética tubo B (E. coli BL21 (DE3) + SEQ ID NO 4 clonada em pD451 -SR, denominado clone B) e cada uma das três colónias da transformação da construção genética tubo A (E. coli BL21 (DE3) + SEQ ID NO 3 clonada em pD451 -SR, denominada clone A) dentre várias foram selecionadas e colocadas para crescer em frascos de 50 ml_ contendo 5 mL (clone B) de meio LB suplementado com canamicina (30 ug/mL) por 14 horas a temperatura de 37 °C e agitação de aproximadamente 240 rpm. Após isso, foram medidas as D.Oeoonm de cada um dos cultivos (4 do clone B e 3 do clone A) e congelados a -80°C com 10% Glicerol na D.Oeoonm = 0,9 para posterior condução a testes de fermentação com objetivo da escolha do melhor clone produtor. As Tabelas 2 e 3 mostram o resultado desses testes de fermentação.
Tabela 2. Medida da D.Oeoom das 4 diferentes colónias crescidas
Figure imgf000020_0001
Tabela 3. Quantificação relativa do antígeno produzido em cada colónia
Figure imgf000020_0002
[067] Assim, com base nos resultados mostrados na Tabela 2 e na Tabela 3, foi verificado que as transformações gênicas correspondentes à construção 1 (SEQ ID N0:3) e à construção 2 (SEQ ID NO:4) realizadas nas células competentes E. coli BL21 (DE3) são eficientes porque resultaram em colónias em todas as placas e tiveram crescimento exponencial, produzindo o antígeno de interesse (banda de 57,7 kDa e de 56,4 kDa no SDS-Page para as construções 1 e 2, respectivamente). Adicionalmente, foi selecionada a colónia C para a construção 1 (SEQ 1 ) e a colónia B para a construção 2 (SEQ 2), tal seleção tendo sido baseada nos parâmetros de maior quantidade produzida e na curva de crescimento.
EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DOS POLIPEPTÍDEOS ÍSEQ ID NO:1 E SEQ ID
NO:2) E CONCRETIZAÇÃO DA INVENÇÃO (ESTUDOS DE EFICÁCIA IN
VIVO)
[068] Após a seleção dos clones (colónias) produtores dos polipeptídeos SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, foi realizado o processo de upstream e downstream para produção dos ingredientes ativos (polipeptídeos SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2). A preparação final compreende do o ingrediente ativo (SEQ ID NO:1 ) ou (SEQ ID NO:2) juntamente com veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, outros ingredientes não ativos, tais como, adjuvantes, preservativos, diluentes, emulsificantes, estabilizantes e outros ingredientes farmacologicamente aceitáveis e que são empregados em preparações imunogênicas para uso humano e animal.
[069] As preparações finais foram testadas em ratos e suínos para concretização da invenção (Figura 7 - 7A e 7B).
[070] O estudo em ratos foi realizado utilizando a dose de antígeno de 125mg de antígeno por via subcutânea nos tempos DO e D28. Foram testadas as formulações finais (SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2), controle positivo e ovoalbumina-LHRH-7 (patente US 6.013.770). Após 56 dias de estudo, os ratos foram eutanasiados, os testículos extraídos e pesados.
[071] A imunocastração bem-sucedida de suínos é definida como peso do testículo no abate inferior a 150 gramas. O peso do testículo está diretamente correlacionado com a produção de testosterona e de esteroides de odor de macho inteiro. Foi descrito que existe uma excelente correlação entre o tamanho e particularmente o peso dos testículos e o nível de androstenona no suíno (Oonk et al., Livest. Prod. Sei. 42, 63-71 (1995)). Os testículos de animais imunizados pesando menos de 150 gramas após o abate são uma indicação clara da ausência de odor sexual.
[072] Visto isso, foram conduzidos três estudos em grupos de 10 suínos com 80-90 dias de idade. Foram administradas doses contendo mínimo 1500 mg/mL dos polipeptídeos da presente invenção (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) e um estudo com o polipeptídeo ovoalbumina-LHRH-7 (patente US 6.013.770). O protocolo vacinai consistiu de 2 doses administradas por via subcutânea, sendo a primeira dose no D0 e a segunda dose 4-5 semanas antes do abate (4 semanas após o D0). Em todos os estudos foram incluídos controles positivos e negativos. Após o abate foram mensurados os pesos testiculares e realizada a média e o desvio padrão. Os resultados podem ser visualizados na tabela abaixo que apontam que foram obtidos os melhores resultados com o polipeptídeo da invenção (SEQ ID NO:2).
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
[073] O estudo com o polipeptídeo da SEQ ID NO:2 foi conduzido em granja. Para condução do estudo foram utilizados 2 grupos, sendo um grupo controle positivo e o outro grupo com o polipeptídeo SEQ ID NO:2. Cada grupo continha 100 suínos e foi utilizado o mesmo protocolo vacinai dos estudos de suínos mencionados acima. Após o abate foram avaliadas as larguras testiculares e a partir disso a porcentagem de animais considerados imunocastrados (considerando a largura media testicular <=1 1 cm e scatol (teste de cocção)). Os resultados estão apresentados na tabela abaixo.
Figure imgf000023_0002

Claims

Reivindicações
1. POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO ANTIGÊNICO, constituído de sequências de aminoácidos que compreendem o decapeptídeo GnrH e uma proteína carreadora, caracterizado pelo fato de que dito decapeptídeo está presente na dita sequência como:
(i) pelo menos três inserções na porção N-terminal da dita proteína carreadora;
(ii) pelo menos três inserções na porção antigênica interna com alto B-fator da dita proteína carreadora;
(iii) pelo menos quatro inserções na porção C-terminal da dita proteína carreadora, sendo que as ditas inserções do dito decapeptídeo GnrH são feitas com adição de resíduos flexíveis, na extremidade N-terminal de cada decapeptídeo GnrH inserido, que mantêm a conformação curvada do GnrH para produzir anticorpos neutralizantes.
2. POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO ANTIGÊNICO, constituído de sequências de aminoácidos que compreendem um análogo do decapeptídeo gnrh e uma proteína carreadora, caracterizado pelo fato de que dito análogo consiste de uma sequência de aminoácidos na qual o resíduo glutamina localizado na porção N-terminal do dito decapeptídeo é substituído por um resíduo glicina, sendo que dito análogo está presente na sequência da dita proteína carreadora como:
(i) pelo menos três inserções na porção N-terminal da dita proteína carreadora;
(ii) pelo menos três inserções na porção antigênica interna com alto B-fator da dita proteína carreadora; e
(iii) pelo menos quatro inserções na porção C-terminal da dita proteína carreadora.
3. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de serem feitas dez inserções de dito decapeptídeo GnrH ou de dito análogo do mesmo.
4. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é a ovoalbumina.
5. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado por serem adicionados resíduos glicina à porção N-terminal do dito decapeptídeo GnrH ou de dito análogo do mesmo, estando um desses ditos resíduos localizado na dita porção antigênica interna com alto B-fator e os outros na dita porção C-terminal da dita proteína carreadora.
6. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de serem adicionadas na porção C- terminal da dita proteína carreadora, antes da primeira inserção do dito decapeptídeo ou do dito análogo do mesmo, um espaçador e uma sequência do peptídeo Th obtido a partir da cadeia leve de hemaglutinina do vírus da influenza.
7. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito espaçador é 2x (Gly Gly Gly Gly Ser).
8. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita sequência do peptídeo Th é a sequência Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gin lle Lys Gly Vai Glu Leu Lys Ser.
9. POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO ANTIGÊNICO, constituído de sequências de aminoácidos que compreendem o decapeptídeo GnrH e uma proteína carreadora, caracterizado pelo fato de consistir de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 .
10. POLIPEPTÍDEO QUIMÉRICO ANTIGÊNICO, constituído de sequências de aminoácidos que compreendem um análogo do decapeptídeo GnrH e uma proteína carreadora, caracterizado pelo fato de consistir de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2.
1 1 . CONSTRUÇÃO GÊNICA, compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificante de uma sequência de aminoácidos que compreende uma proteína carreadora e inserções do decapeptídeo GnrH, caracterizada por codificar um polipeptídeo como definido na reivindicação 1 .
12. CONSTRUÇÃO GÊNICA, compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificante de uma sequência de aminoácidos que compreende uma proteína carreadora e inserções do decapeptídeo GnrH, caracterizada por codificar um polipeptídeo como definido na reivindicação 9.
13. CONSTRUÇÃO GÊNICA, compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificante de uma sequência de aminoácidos que compreende uma proteína carreadora e inserções do decapeptídeo GnrH, caracterizada por codificar um polipeptídeo como definido na reivindicação 2.
14. CONSTRUÇÃO GÊNICA, compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificante de uma sequência de aminoácidos que compreende uma proteína carreadora e inserções do decapeptídeo GnrH, caracterizada por codificar um polipeptídeo como definido na reivindicação 10.
15. COMPOSIÇÃO ANTIGÊNICA PARA IMUNOCASTRAÇÃO DE
MAMÍFEROS NÃO HUMANOS, caracterizada por compreender: (i) um polipeptídeo quimérico antigênico como definido na reivindicação 1 , (ii) opcionalmente um adjuvante e (iii) um veículo veterinariamente aceitável.
16. COMPOSIÇÃO ANTIGÊNICA PARA IMUNOCASTRAÇÃO DE
MAMÍFEROS NÃO HUMANOS, caracterizada por compreender: (i) um polipeptídeo quimérico antigênico como definido na reivindicação 2, (ii) opcionalmente um adjuvante e (iii) um veículo veterinariamente aceitável.
17. COMPOSIÇÃO ANTIGÊNICA PARA IMUNOCASTRAÇÃO DE
MAMÍFEROS NÃO HUMANOS, caracterizada por compreender: (i) um polipeptídeo quimérico antigênico como definido na reivindicação 9, (ii) opcionalmente um adjuvante e (iii) um veículo veterinariamente aceitável.
18. COMPOSIÇÃO ANTIGÊNICA PARA IMUNOCASTRAÇÃO DE
MAMÍFEROS NÃO HUMANOS, caracterizada por compreender: (i) um polipeptídeo quimérico antigênico como definido na reivindicação 10, (ii) opcionalmente um adjuvante e (iii) um veículo veterinariamente aceitável.
19. COMPOSIÇÃO ANTIGÊNICA PARA IMUNOCASTRAÇÃO DE
MAMÍFEROS NÃO HUMANOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada pelo fato do dito mamífero ser das espécies suína ou bovina.
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