ES2247637T3 - Quimeras de gnrh-leucotoxina. - Google Patents

Quimeras de gnrh-leucotoxina.

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ES2247637T3
ES2247637T3 ES97935395T ES97935395T ES2247637T3 ES 2247637 T3 ES2247637 T3 ES 2247637T3 ES 97935395 T ES97935395 T ES 97935395T ES 97935395 T ES97935395 T ES 97935395T ES 2247637 T3 ES2247637 T3 ES 2247637T3
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leukotoxin
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John G. Manns
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Abstract

SE EXPONEN NUEVOS SISTEMAS PORTADORES INMUNOLOGICOS, EL ADN QUE LOS CODIFICA Y EL USO DE LOS MISMOS. LOS SISTEMAS PORTADORES INCLUYEN PROTEINAS QUIMERICAS QUE COMPRENDEN UN POLIPEPTIDO DE LEUCOTOXINA FUNDIDO A UNO O MAS MULTIMEROS GNRH SELECCIONADOS, QUE COMPRENDEN AL MENOS UNA SECUENCIA REPETIDA DE DECAPEPTIDOS GNRH, O AL MENOS UNA UNIDAD REPETIDA DE UNA SECUENCIA QUE CORRESPONDE AL MENOS A UN EPITOPE DE UNA MOLECULA GNRH SELECCIONADA. SEGUN LA INVENCION, LAS SECUENCIAS SELECCIONADAS DE GNRH PUEDEN SER TODAS IGUALES, O CORRESPONDER A DIFERENTES DERIVADOS, ANALOGOS, VARIANTES O EPITOPES DE GNRH, SIEMPRE Y CUANDO LAS SECUENCIAS DE GNRH SEAN CAPACES DE PROVOCAR UNA RESPUESTA INMUNE. LA LEUCOTOXINA ACTUA AUMENTANDO LA INMUNOGENICIDAD DE LOS MULTIMEROS DE GNRH FUSIONADAS A LA MISMA

Description

Quimeras de GnRH-leucotoxina.
Campo técnico
La presente invención se refiere generalmente a sistemas portadores inmunológicos. Más particularmente, la invención pertenece a quimeras de leucotoxina-GnRH incluyendo más de una copia de un polipéptido de GnRH. Las quimeras muestran una inmunogenicidad potenciada en comparación con la inmunogenicidad de polipéptidos de GnRH solamente.
Antecedentes de la invención
En vertebrados, la síntesis y liberación de las dos hormonas gonadotrópicas, hormona luteinizante (LH) y hormona estimuladora de folículos (FSH), están reguladas por un polipéptido referido como hormona liberadora de Gonadotropina (GnRH) (antes llamada LHRH). Por lo tanto, una aproximación al control de fertilidad en una población animal es reducir los niveles de GnRH, mediante inmunización contra GnRH, que ejerce una reducción en los niveles de LH y FSH y la interrupción concomitante de los ciclos menstrual y de espermatogénesis. Ver p.ej., Adams et al., J. Anim. Sci (1990) 68: 2793-2802.
Estudios recientes de la molécula GnRH han mostrado que es posible aumentar el antisuero en respuesta a inyecciones repetidas de péptidos sintéticos de la GnRH (Arimura et al., Endocrinology (1973) 93(5):1092-1103). Además, los anticuerpos contra GnRH han sido aumentados en un número de especies mediante conjugación química de GnRH en un vehículo adecuado y administración del conjugado con un adyuvante apropiado (Carelli et al., Proc. Natl Acad. Sci. (1982) 79:5392-5395). La fusión de proteínas recombinantes que comprenden GnRH o análogos de GnRH ha sido descrita también para el uso en vacunas de péptidos para la castración inmunológica o inhibición de la función reproductora de varios animales domésticos y de granja (Meloen et al., Vaccine (1994) 12 (8):741-746; Hoskinson et al., Aust. J. Biotechnol. (1990) 4:166-170; y Publicaciones Internacionales Nos. WO 92119746, publicado el 12 Noviembre 1992; WO 91/02799, publicado el 7 Marzo 1991; WO 90/11298, publicado el 4 Octubre 1990 y WO 86/07383, publicado el 18 Diciembre 1986).
No obstante, los intentos no han llegado a proporcionar los productos inmunológicos de esterilización adecuados debido a la pobre inmunogenicidad de péptidos de la GnRH y debido al hecho de que los protocolos de conjugación química son difíciles de controlar, suministrando conjugados de GnRH sustancialmente heterogéneos y pobremente definidos. Además, las vacunas peptídicas basadas en la GnRH se han encontrado con poco éxito para proporcionar efectos uniformes en sujetos individuales mamíferos aun después de vacunación repetida. En esta consideración, previos constructos de la GnRH han fracasado en proporcionar un producto de vacuna de esterilización inmunológica uniformemente exitosa debido al hecho que la GnRH es una molécula pequeña, que "por sí misma" normalmente no es reconocida por el sistema inmune de un sujeto, siendo la molécula pobremente inmunogénica e inherentemente incapaz de inducir una respuesta inmune contra la GnRH endógena.
Generalmente se reconoce que la inmunogenicidad de antígenos virales, proteínas pequeñas o sustancias endógenas pueden aumentar significativamente produciendo formas inmunogénicas de aquellas moléculas que comprenden múltiples copias de epítopos seleccionados. En este aspecto, los constructos basados en dos o más repeticiones de los péptidos 9-21 de la glicoproteína D del virus Herpes simplex tipo 1 (Ploeg et al., J. Inmuno. Methods (1989) 124:211-217),de dos a seis repeticiones del tetrapéptido antigénico NPNA del circumsporozoíto de Plasmodium falciparum (Lowell et al., Science (1988) 240:800-802), de dos a cuatro copias del mayor sitio inmunogénico de VP1 en el virus de la fiebre aftosa (Broekhuijsen et al., J. gen. Viro). (1987) 68: 3137-3143) y repeticiones en tándem de un polipéptido similar a la GnRH (Meloen et al., Vaccine (1994)12(8):741-746), han mostrado ser efectivos en el aumento de la inmunogenicidad de aquellas moléculas.
También pueden conjugarse proteínas pequeñas o sustancias endógenas con un vehículo adecuado con el fin de producir una respuesta inmunológica significativa en un huésped estimulado. Vehículos adecuados generalmente son polipéptidos que incluyen regiones antigénicas de una proteína derivada de un material infeccioso así como una proteína de superficie viral, o un vehículo de secuencia peptídica. Estos vehículos sirven para estimular de forma inespecífica la actividad de las células T ayudantes y para ayudar a dirigir el antígeno hacia las células presentadoras de antígeno para procesar y presentar el péptido a la superficie celular en asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
Se han desarrollado varios sistemas de transporte para este propósito. Por ejemplo, antígenos peptídicos pequeños a menudo se acoplan a transportadores proteicos así como la hemocianina propia de las lapas (Bittle et al., Nature (1982) 298:30-33), toxoide tetánico (Muller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1982) 79:569-573), ovoalbúmina, y mioglobina de esperma de ballena, para producir una respuesta inmunológica. Estas reacciones de acoplamiento generalmente resultan en la incorporación de varios moles de antígeno peptídico por mol de proteína transportadora. Aunque la presentación del antígeno peptídico en múltiples copias generalmente mejora la inmunogenicidad, los transportadores pueden producir una fuerte inmunidad no relevante para el antígeno peptídico y esto puede inhibir la respuesta inmunológica a la vacuna peptídica en la segunda inmunización (Schutze et al, J. Immun. (1985) 135:2319-2322).
Los sistemas de distribución de antígenos también se han basado en transportadores particulares. Por ejemplo, se han usado partículas preformadas como plataformas sobre las que los antígenos se pueden acoplar e incorporar. Se han desarrollado sistemas basados en proteosomas (Lowell et al., Science (1988) 240:800-802), complejos inmunológicos estimulatorios (Morein et al,, Nature (1984) 308:457-460), y partículas virales así como HBsAg (Neurath et al., Mol Immunol (1989) 26:53-62) y proteínas propias de la cápside de rotavirus (Redmond et al., Mol, Immunol. (1991) 28:269-278).
Los sistemas transportadores también han sido diseñados usando proteínas quiméricas producidas recombinantemente que se ensamblan con partículas. Por ejemplo, el retrotransposón de levadura, Ty, codifica una serie de proteínas que se ensamblan con virus como partículas (Ti-VLP5; Kingsman, S. M., y A. J, Kingsman Vacc, (1988) 6:304-306). Se han insertado genes foráneos en el gen TyA y se expresan en levadura como una proteína de fusión. La proteína de fusión tiene la capacidad de autoensamblarse con partículas de tamaño uniforme.
Otras partículas proteicas quiméricas se han examinado así como HBsAg, (Valenzuela et al., Bio/Technol. (1985 3:323-326; Patente Estadounidense No. 4.722.840; Delpeiroux et al., Science (1986) 233:472-475), antígeno del núcleo de la Hepatitis B (Clarke et al., Vaccines 88 (Ed. H. Ginsberg, et al., 1988) pp. 127-131), Poliovirus (Burke et al,, Nature (1988) 332:81-82), y virus del Mosaico del Tabaco (Haines et al., Bio/Technol. (1986) 4:637-641). Sin embargo, estos transportadores están restringidos en su utilidad por virtud del tamaño limitado del agente activo que se puede insertar en la proteína estructural sin interferir con el ensamblaje de la partícula.
Finalmente, los sistemas quiméricos se han diseñado usando un polipéptido de la leucotoxina (LKT) de Pasteurella haemolytica fusionado al antígeno seleccionado. Ver, p.ej., la Publicación Internacional No. WO 93/08290, publicada el 29 de abril de 1993 y WO 92/03558, publicada el 5 de marzo de 1992, así como las Patentes Estadounidenses Nos. 5.238.823 y 5.273.889. La inclusión de una porción transportadora de LKT en una quimera de un antígeno peptídico suplió la inmunogenicidad mejorada a la quimera proporcionando epítopes de células T que tienen reactividad amplia de especies, de manera que producen una respuesta inmunológica dependiente de células T en sujetos inmunizados. En esta consideración, la inducción de células T ayudantes adecuadas es esencial en la generación de una respuesta inmunológica a la porción de antígeno peptídico de la quimera, particularmente donde el antígeno es una molécula endógena. Sin embargo, hasta ahora no se ha descrito el uso de un transportador polipeptídico de leucotoxina en combinación con múltiples epítopes del péptido GnRH.
Divulgación de la invención
La presente invención está basada en la construcción de fusiones de genes nuevos entre el gen de la leucotoxina de P. haemolytica, variantes del mismo, y una o más secuencias nucleotídicas que codifican múltiples polipéptidos GnRH. Estos constructos producen proteínas quiméricas que sorprendentemente muestran inmunogenicidad mejorada cuando se compara con la reacción inmunológica producida por la administración de GnRH sola.
De acuerdo con la presente invención se proporciona una proteína quimérica que comprende un polipéptido de leucotoxina fusionado con el primero y segundo multímeros, en donde el C-terminal del primer multímero se fusiona al N-terminal del polipéptido de leucotoxina y el N-terminal del segundo multímero se fusiona al C-terminal del polipéptido de leucotoxina, y además en donde cada uno de dichos multímeros comprende más de un polipéptido de GnRH seleccionado, en donde dicha proteína quimérica comprende la secuencia aminoacídica representada en las Figuras 9-1 hasta 9-6, o una secuencia aminoacídica en donde al menos el 90% de los aminoácidos se relacionan sobre la longitud definida de la molécula representada en las Figuras 9-1 hasta 9-6 y dicha secuencia aminoacídica es funcionalmente equivalente a la misma.
Así en una realización, la presente invención se dirige a una proteína quimérica que comprende un polipéptido de leuco toxinafusionado a uno o más multímeros en donde cada multímero comprende más de un polipéptido GnRH seleccionado. La porción de leucotoxina de la quimera actúa para incrementar la inmunogenicidad de los polipéptidos GnRH. Más particularmente, los multímeros usados aquí pueden corresponder a más de una copia de un polipéptido GnRH seleccionado o epítope, o múltiples repeticiones en tándems de un polipéptido GnRH seleccionado o epítope. Además, multímeros GnRH se pueden localizar en los extremos carboxilo y/o amino terminal del polipéptido de la leucotoxina, a sitios internos al polipéptido de la leucotoxina, o alguna combinación de tales sitios. Cada multímero de la GnRH también puede corresponder a una molécula de fórmula general GnRH-X-GnRH, en donde X se selecciona del grupo formado por un enlace peptídico, un grupo espaciador de aminoácidos y [GnRH], donde n es superior o igual a 1, y además en donde "GnRH" puede comprender cualquier polipéptido de la GnRH. Se proporciona una proteína quimérica que comprende un polipéptido de leucotoxina fusionado a dos multímeros de la GnRH. En esta molécula, el C-terminal de uno de los multímeros de la GnRH se fusiona al N-terminal del polipéptido de la leucotoxina, y el C-terminal del polipéptido de la leucotoxina se fusiona al N-terminal del otro multímero de la
GnRH.
En otra realización, la invención proporciona composiciones de vacuna que comprenden las proteínas quiméricas de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se discuten los métodos para presentar uno o más multímeros de GnRH seleccionados a un sujeto huésped por la administración de una cantidad efectiva al sujeto de composiciones de vacuna.
En otra realización, la invención se dirige a constructos de DNA que codifican las proteínas quiméricas de la presente invención en donde dicho constructo de DNA comprende una primera secuencia nucleotídica que codifica el primer multímero de la GnRH; y una segunda secuencia nucleotídica que codifica el segundo multímero de la GnRH; en donde dichas primera y segunda secuencias nucleotídicas se unen operativamente a una tercera secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de la leucotoxina.
Los constructos de DNA que comprenden una primera secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de leucotoxina operativamente unido a una o más secuencias nucleotídicas, cada secuencia nucleotídica seleccionada codifica más de una copia de un polipéptido GnRH o epítope se divulgan aquí.
En otra realización, la invención se dirige a un cassette de expresión comprendido de un constructo de DNA de la presente invención y secuencias control que dirigen la transcripción de dicho constructo por medio del cual dicho constructo puede ser transcrito y traducido en una célula huésped.
Los cassettes de expresión que comprenden los constructos de DNA antes descritos operativamente unidos a las secuencias control que dirigen la transcripción de los mismos, por lo que los constructos pueden ser transcritos y traducidos en una célula huésped se divulgan aquí.
En otra realización, la invención se dirige a células huésped transformadas con los cassettes de expresión de la presente invención.
Otra realización de la invención proporciona un método de producción de un polipéptido recombinante. El método comprende (a) proporcionar una población de células huésped descritas antes y (b) cultivar la población de células bajo condiciones por las que se expresa el polipéptido quimérico codificado por el cassette de expresión. En una realización más de la presente invención se proporciona una proteína quimérica de acuerdo con la presente invención o una composición vacuna de acuerdo con la presente invención para el uso en la esterilización inmunológica de un sujeto vertebrado.
En otra realización, la presente invención proporciona el uso de una proteína quimérica de acuerdo con la presente invención o una composición vacuna de acuerdo con la presente invención para la elaboración de un medicamento para la esterilización inmunológica de un sujeto vertebrado.
La presente invención proporciona en una realización más una proteína quimérica de acuerdo con la presente invención o una composición vacuna de acuerdo con la presente invención para el uso en la reducción de la incidencia de tumores de mama en un sujeto mamífero.
En una realización más, la presente invención proporciona el uso de una proteína quimérica de acuerdo con la presente invención o una composición vacuna de acuerdo con la presente invención para la elaboración de un medicamento para reducir la incidencia de tumores de mama en un sujeto mamífero.
Estas y otras realizaciones de la presente invención tendrán lugar rápidamente por aquellos entendidos en la materia en vista de lo divulgado aquí.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A y 1B muestran las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de los constructos de GnRH usados en las fusiones genéticas de la leucotoxina quimérica y el polipéptido GnRH. La Figura 1A representa GnRH-1 que incluye una copia individual de un decapéptido de GnRH; la Figura 1B representa GnRH-2 que incluye cuatro copias de un decapéptido de GnRH cuando n=1, y ocho copias de GnRH cuando n=2, etc.
La Figura 2 representa la estructura del Plásmido pAA352 en donde tac es el promotor híbrido trp::lac de E. coli; bla representa el gen de \beta-lactamasa (resistencia a ampicilina); ori es el origen de replicación del plásmido basado en ColE1; lktA es el gen estructural de la leucotoxina de P. haemolytica; y lacI es el represor del operón lac de E. coli. La dirección de la transcripción/traducción del gen de la leucotoxina está indicada por la flecha. El tamaño de cada componente no está dibujado a escala.
Las Figuras 3-1 hasta 3-9 muestran la secuencia nucleotídica y secuencia aminoacídica previstas de la leucotoxina 352 (LKT 352). Se muestran tanto el gen estructural para LKT 352 como las secuencias de las regiones flanqueantes del vector.
La Figura 4 muestra la estructura del plásmido pCB113 que lleva a una fusión del gen de la leucotoxina-GnRH (LKT-GnRH).
Las Figuras 5-1 hasta 5-8 muestran la secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica previstas de la proteína quimérica de LKT-GnRH de pCB113. La secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica previstas de la proteína quimérica LKT-GnRH del pCB112 son idénticas a las secuencias de la proteína quimérica derivada del pCB113 excepto que la secuencia para múltiples copias de GnRH se insertó dos veces como se ha descrito anteriormente en consideración con la Figura 4.
La Figura 6 muestra la estructura del Plásmido pCB111 que lleva una fusión del gen de la leucotoxina-GnRH (LKT-GnRH).
Las Figuras 7-1 hasta 7-5 muestran la secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica prevista de la proteína quimérica LKT-GnRH del pCB111. La secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica prevista de la proteína quimérica LKT-GnRH de pCB114 son idénticas a las secuencias de la proteína quimérica derivada del pCB111 excepto que la secuencia para copias múltiples de GnRH se insertó dos veces como se ha descrito antes en consideración con la Figura 6.
Las Figuras 8-1 hasta 8-2 muestran la secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica prevista del punto de fusión del extremo romo del gen truncado de la leucotoxina del plásmido pCB111 (Figure 8-2), donde un fragmento de DNA interno de aproximadamente 1300 pb de longitud se eliminó de la LKT 352 por digestión con enzimas de restricción BstBl y Nae1 (Figura 8-1).
Las Figuras 9-1 hasta 9-6 muestran la secuencia nucleotídica y secuencia aminoacídica prevista de la proteína quimérica LKT-GnRH de pCB122.
La Figura 10 muestra la estructura del Plásmido pAA101 llevando el polipéptido de la leucotoxina LKT 101 que carece de actividad citotóxica.
La Figura 11 representa la secuencia aminoacídica prevista del polipéptido de la leucotoxina LKT 101.
La Figura 12 muestra una comparación con la cantidad media de anticuerpos anti-GnRH del suero en capones, verracos no tratados, y verracos inmunocastrados (vacunados con proteínas de fusión leucotoxina-GnRH) como se ha descrito en el Ejemplo 10.
La Figura 13 muestra una comparación de los niveles medios de testosterona en suero en capones, verracos no tratados, y verracos inmunocastrados (vacunados con proteínas de fusión leucotoxina-GnRH) como se ha descrito en el Ejemplo 10.
La Figura 14 muestra una comparación de la eficiencia de conversión de alimento (expresada como la proporción de Kg de alimento: ganancia de peso en Kg) en capones, verracos no tratados, y verracos inmunocastrados (vacunados con proteínas de fusión leucotoxina-GnRH) como se ha descrito en el Ejemplo 10.
La Figura 15 muestra una comparación de la cantidad media de anticuerpos anti-GnRH en suero en animales inyectados con una composición de vacuna que contiene una proteína de fusión de LKT::8 copias de GnRH, o una composición vacuna que contiene una proteína de fusión 8 copias de GnRH::LKT::8 copias de GnRH como se describe en el Ejemplo 11.
La Figura 16 muestra una comparación del peso medio ovárico (mg), peso uterino medio (mg), y estradiol medio en suero (pg/mL), en animales control (barras sólidas) y animales tratados con una composición de vacuna que contiene una proteína de fusión 8 copias de GnRH::LKT::8 copias de GnRH como se ha descrito antes en el Ejemplo 13 (barras sombreadas).
La Figura 17 representa una comparación de los niveles de androstenona grasa en capones, verracos, animales castrados tardíos, y animales inmunocastrados (vacunados con proteínas de fusión leucotoxina-GnRH) como se ha descrito en el Ejemplo 14.
Descripción detallada
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, virología, tecnología del DNA recombinante, e inmunología, que son técnicas de la materia. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, p.ej., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; DNA Cloning, Vols. I y II (D.N. Glover ed.) ; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.); Animal Cell Culture (R.K. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; las series, Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (DM. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications).
A. Definiciones
Al describir la presente invención, se emplean los siguientes términos, y pretenden ser definidos como se indica adelante.
El término "Hormona de Liberación de Gonadotropina" o "GnRH" se refiere a un decapéptido secretado por el hipotálamo que controla la liberación de ambas hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del folículo (FSH) en vertebrados (Fink, G., British Medical Bulletin (1979) 35:155-160). La secuencia aminoacídica de GnRH es altamente conservada entre los vertebrados, y especialmente en mamíferos. En esta consideración, GnRH derivada de la mayoría de mamíferos incluyendo la GnRH humana, bovina, porcina y ovina (antiguamente designada LHRH) tiene la secuencia aminoacídica piroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2} (Murad et al., Hormones and Hormone Antagonists, en The Pharmacological Basis of Therapeutics, Sexta Edición (1980) y Seeburg et al., Natura (1984) 311:666-668).
Como se usa aquí un "polipéptido GnRH" incluye una molécula derivada de una secuencia nativa de GnRH, tanto polipéptidos de GnRH producidos recombinantemente como sintetizados químicamente que tienen secuencias aminoacídicas que son sustancialmente homólogas a la GnRH nativa y que permanecen inmunogénicas, como se describe más adelante. Así, el término abarca derivados y análogos de la GnRH incluyendo adiciones simples o múltiples de aminoácidos, sustituciones y/o deleciones que tienen lugar internamente o al amino o carboxi terminal del péptido. Por lo tanto, según la invención, un "polipéptido de la GnRH" incluye moléculas que tienen la secuencia nativa, moléculas como las que se representan en la Figura 1A (que tienen un residuo Gln N-terminal a parte de un residuo piroGlu), y moléculas con otras adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos que tienen la capacidad de producir anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con GnRH secretada naturalmente. Particularmente se contemplan aquí secuencias repetidas de polipéptidos GnRH como el oligómero representado en la Figura 1B (en donde cada uno de los polipéptidos de GnRH seleccionados comprenden una sustitución del Gln N-terminal, y además en donde cada uno de los otros polipéptidos de GnRH comprende una sustitución del residuo Asp en la posición 2). Epítopes de la GnRH también son capturados por la definición.
El término "epítope" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al que se une una molécula anticuerpo. Puesto que GnRH es una molécula muy pequeña, se logra la identificación de epítopes de la misma que son capaces de producir una respuesta anticuerpo rápidamente usando técnicas bien conocidas en el campo. Ver, p.ej., Geysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:3998-4002 (método general para sintetizar rápidamente péptidos para determinar la localización de epítopes inmunogénicos en un antígeno dado); Patente Estadounidense No. 4,708,871 (procedimientos para identificar y sintetizar químicamente epítopes de antígenos); y Geysen et al., Molecular Immunology (1986) 23:709-715 (técnica para identificar péptidos con alta afinidad para un anticuerpo dado).
Como se ha usado aquí el término "epítope de célula T" se refiere a una característica de una estructura peptídica que es capaz de inducir la inmunidad de células T hacia la estructura peptídica o un hapteno asociado. En esta consideración, se acepta que los epítopes de células T comprendan determinantes peptídicos lineales que asumen conformaciones extendidas con la hendidura de unión al péptido de las moléculas del MHC, (Unanue et al., Science (1987) 236:551-557). La conversión de polipéptidos a determinantes peptídicos lineales asociados al MHC de clase II (generalmente entre los aminoácidos 5 y 14 en longitud) se llama "procesamiento del antígeno" que se lleva a cabo por células presentadoras de antígeno (APCs). Más particularmente, un epítope de célula T está definido por características locales de la estructura del péptido corto, así como las propiedades primarias de la secuencia aminoacídica que implican carga e hidrofobicidad, y ciertos tipos de estructura secundaria, así como de hélice, que no depende del plegamiento del polipéptido entero. Además, se piensa que los péptidos cortos capaces de ser reconocidos por células T ayudantes generalmente son estructuras amfipáticas que comprenden una región hidrofóbica (para la interacción con la molécula MHC) y una región hidrofílica (para interaccionar con el receptor de las células T), (Margalit et al., Computer Prediction of T cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, ed. G.C. Woodrow et al., (1990) pp.109-116) y además de las estructuras amfipáticas tienen una configuración de \alpha-hélice (ver, p.ej., Spouge et al., J. Immunol. (1987) 138:204-212; Berkower et al., J. Inmunol. (1986) 136:2498-2503).
Por lo tanto, los segmentos de proteínas que incluyen epítopes de células T pueden ser previstos usando numerosos programas informáticos. (Ver p.ej., Margalit et al., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, ed. G.C. Woodrow et al., (1990) pp. 109-116). Tales programas generalmente comparan la secuencia aminoacídica de un péptido con las secuencias conocidas para inducir una respuesta de la célula T, y buscar patrones de aminoácidos que se cree que son necesarios para un epítope de célula T.
Una "proteína inmunogénica" o "secuencia aminoacídica inmunogénica" es una proteína o secuencia aminoacídica, respectivamente, que produce una respuesta inmunológica en un sujeto que sea administrado. Bajo la invención, un "inmunógeno GnRH" se refiere a una molécula de GnRH que, cuando se introduce en un sujeto huésped, estimula una respuesta inmune. En esta consideración, un inmunógeno de GnRH incluye un multímero que corresponde a más de un polipéptido de GnRH seleccionado; y, más particularmente, a un multímero que tiene cualquiera de las repeticiones múltiples o en tándem de secuencias polipeptídicas seleccionadas de GnRH, repeticiones múltiples o en tándem de epítopes seleccionados de GnRH, o alguna combinación de las mismas.
Una "respuesta inmunológica" a un antígeno o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta celular y/o inmune mediada por un anticuerpo a la composición o vacuna de interés. Normalmente, esta respuesta incluye pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos; la producción de anticuerpos, células B, células T ayudantes, células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T \gamma\delta, dirigidas directamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Una respuesta inmunológica puede ser detectada usando alguno de los varios inmunoensayos bien conocidos en el campo.
El término "polipéptido leucotoxina" o "polipéptido LKT" se refiere a un polipéptido que incluye al menos un epítope de célula T y es derivado a partir de una proteína que pertenece a la familia de moléculas caracterizadas por la secuencia aminoacídica consenso carboxi-terminal Gly-Gly-X-Gly-X-Asp (Highlander et al., DNA (1989) 8:15-28), donde X es Lys, Asp, Val o Asn. Estas proteínas incluyen, entre otras, leucotoxinas derivadas de P. haemolytica y Actinobacillus pleuropneumoniae, así como alfa hemolisina de E. coli (Strathdee et al., Infect Immun. (1987) 55:3233-3236; Lo, Can. J. Vet. Res. (1990) 54:S33-535; Welch, Mol. Microbiol. (1991) 5:521-528). Esta familia de toxinas se conoce como la familia "RTX" de toxinas (Lo, Can. J. Vet Res. (1990) 54:S33-S35). Además, el término "polipéptido leucotoxina" se refiere a un polipéptido leucotoxina que se sintetiza químicamente, aislado de un organismo que lo expresa, o que lo produce recombinantemente. Además, el término se refiere a una proteína inmunogénica que tiene una secuencia aminoacídica sustancialmente homóloga a una secuencia aminoacídica contigua encontrada en la molécula particular de leucotoxina nativa. Así, el término incluye las dos secuencias de longitud completa y parcial, así como análogos. Aunque la actividad citotóxica que muestran las leucotoxinas nativas de longitud completa, el término "leucotoxina" también se refiere a moléculas que a pesar de eso mantienen la falta del carácter de las leucotoxinas nativas. Se conocen las secuencias nucleotídicas y secuencias aminoacídicas correspondientes para varias leucotoxinas. Ver, p.ej., Patente Estadounidense Nos. 4,957,739 y 5,055,400; Lo et al., Infect. Immun. (1985) 50:667-67; Lo et al., Infect. Immun. (1987) 55:1987-1996; Strathdee et al., Infect Immun. (1987) 55:3233-3236; Highlander et al., DNA (1989) 8:15-28; Welch, Mol. Microbiol. (1991) 5:521-528. En las quimeras producidas de acuerdo con la presente invención, una secuencia polipeptídica de leucotoxina imparte inmunogenicidad potenciada a uno o más multímeros GnRH fusionados proporcionando, entre otras cosas, epítopes de células T que comprenden segmentos peptídicos pequeños en un rango de cinco a catorce aminoácidos en longitud que son capaces de acomplejarse con moléculas del MHC clase II para la presentación a, y activación de, células T ayudantes. Como se discute más adelante, estos epítopes de células T se encuentran a lo largo de toda la molécula de leucotoxina y se pensaron para ser concentradas en las porciones N-terminales de la leucotoxina, esto es, entre los residuos aminoacídicos 1 a 199.
Como se ha usado aquí, un polipéptido leucotoxina "que carece de actividad citotóxica" se refiere a un polipéptido leucotoxina como se ha descrito antes que carece de citotoxicidad significativa comparado con una leucotoxina nativa, de longitud completa (así como la leucotoxina de longitud completa de P. haemolytica descrita en la Patente Estadounidense Nos. 5,055,400 y 4,957,739) aún tiene inmunogenicidad y al menos un epítope de célula T. Los polipéptidos de leucotoxina pueden ser testados para su actividad citotóxica usando alguno de los varios ensayos así como el ensayo de liberación de la lactato deshidrogenasa, descrito por Korzeniewski et al., Journal of Immunological Methods 64:313-320, en donde la citotoxicidad se mide por la liberación de lactato deshidrogenasa de neutrófilos bovinos. Una molécula de leucotoxina se identifica como citotóxica si causa una liberación estadísticamente significativa de lactato deshidrogenasa cuando se compara con una molécula control no-citotóxica.
La provisión de quimeras de LKT-GnRH que comprenden polipéptidos leucotoxina que carecen de actividad citotóxica proporciona varios beneficios importantes. Inicialmente, un polipéptido de leucotoxina que carece de actividad citotóxica es deseable puesto que la inyección de una toxina activa en un sujeto puede resultar en muerte celular localizada (PMNs y macrófagos) y, en consecuencia, causa una respuesta inflamatoria severa y absceso en el sitio de la inyección. En esta consideración, la actividad citotóxica que resulta en la muerte de macrófagos puede conducir a reducir la presentación del antígeno y por lo tanto a una respuesta inmunológica subóptima. La eliminación de la porción citotóxica como se ha encontrado en los polipéptidos LKT no-citotóxicos usada para producir las proteínas de fusión de la invención también resulta en un gen de LKT truncado que es capaz de ser expresado a niveles mucho más altos que la LTK de longitud completa. Además, el uso de polipéptidos LTK no-citotóxicos en las fusiones aquí instruidas que tienen antigenicidad suficiente de células reduce la cantidad global del antígeno para leucotoxina-GnRH que necesita ser administrado a un sujeto huésped para proporcionar una respuesta suficiente de la célula B a los polipéptidos seleccionados de GnRH. Ejemplos particulares de polipéptidos leucotoxina inmunogénica que carecen de actividad citotóxica incluyen LKT 352, LKT III, y LKT 101 que se describen con más detalle más adelante.
Por "LKT 352" se entiende una proteína que es derivada del gen lkta presente en el plásmido pAA352 (Figura 2, No. de acceso a ATCC 68283). La secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica correspondiente de este gen se describen en la Publicación Internacional No. W091/15237 y se muestran en la Figura 3. El gen codifica una leucotoxina truncada, que tiene 914 aminoácidos y un peso molecular estimado alrededor de 99kDa, que carece de la porción citotóxica de la molécula. El gen truncado producido así se expresa a niveles mucho más altos que la molécula de longitud completa (más del 40% de la proteína total frente a menos del 1% de la proteína celular total para la forma de longitud completa) y se purifica más fácilmente. La LKT 352 derivada no se deriva necesariamente físicamente de la secuencia presente en el plásmido pAA352. Más bien, puede ser generada de alguna manera, incluyendo por ejemplo, por síntesis química o producción recombinante. Además, la secuencia aminoacídica de la proteína solo necesita ser sustancialmente homóloga a la secuencia presentada. Así, las variaciones de secuencia pueden estar presentes a lo largo del polipéptido de LKT que funciona para potenciar la inmunogenicidad del antígeno con que también ya se asocia la falta de actividad citotóxica.
Por "LKT 111" se entiende un polipéptido de leucotoxina que es derivado del gen lktA presente en el plásmido pCB111 (Figura 6, No. de acceso a ATCC 69748). La secuencia nucleotídica de este gen y su secuencia aminoacídica correspondiente se muestran en la Figura 7. El gen codifica una versión acortada de leucotoxina que se ha desarrollado a partir del gen de la leucotoxina recombinante presente en el plásmido pAA352 (Figura 2, No. de acceso ATCC 68283) por eliminación de un fragmento de DNA interno de aproximadamente 1300 pb en longitud. El polipéptido de la LKT 111 tiene un peso molecular estimado de 52 kDa (comparado con los 99 kDa del polipéptido de la LKT 352), pero tiene porciones N-terminales de la LKT 352 que contienen epítopes de células T que son necesariamente para la inmunogenicidad suficiente de las células T, y porciones C-terminales de la LKT 352 que contienen sitios de restricción para el uso de producir las proteínas de fusión de la presente invención. Mediante la invención, el péptido de la leucotoxina LKT 111 no es necesariamente derivado físicamente de la secuencia presente en el plásmido pOB111. Más bien, puede ser generado de alguna manera, incluyendo por ejemplo, por síntesis química o producción recombinante. Además, la secuencia aminoacídica de la proteína solamente necesita ser sustancialmente homóloga a la secuencia representada. Así, las variaciones de la secuencia pueden estar presentes a lo largo de las funciones de la proteína para potenciar la inmunogenicidad del antígeno con que se asocia y carece de citotoxicidad.
Por "LKT 101" se entiende un polipéptido leucotoxina que es derivado del gen lktA presente en el plásmido pAA101 (Figura 10, No. de acceso a ATCC 67883). La secuencia aminoacídica representada de la leucotoxina de P. haemolytica producida a partir del constructo pAA101 está representada en la figura 11. El polipéptido LKT 101 se expresa a partir de una forma truncada del gen lktA que contiene el extremo 5' del gen hasta el único sitio de restricción de la endonucleasa Pst1. El gen truncado se fusionó con el gen de la \beta-galactosidasa (lacZ) para facilitar la purificación del polipéptido LKT 101. Mediante la invención, el péptido de leucotoxina LKT 101 no es necesariamente derivado físicamente de la secuencia presente en el plásmido pAA101. Más bien, puede ser generada de alguna manera, incluyendo por ejemplo, por síntesis química o producción recombinante. Además, la secuencia aminoacídica de la proteína sólo necesita ser sustancialmente homóloga a la secuencia representada. Así, las variaciones de la secuencia pueden estar presentes a lo largo de las funciones de la proteína para potenciar la inmunogenicidad del antígeno con que se asocia y carece de citotoxicidad.
Una quimera del polipéptido leucotoxina-GnRH produce "inmunogenicidad incrementada" ya que posee una capacidad mayor para producir una respuesta inmune que uno o más multímeros de GnRH solos. Esta inmunogenicidad incrementada puede ser determinada por administración del polipéptido leucotoxina-GnRH y controles de multímero de GnRH a animales, y comparar las cantidades de anticuerpos anti-GnRH de manera que se obtienen usando ensayos estándares así como radionmunoensayos y ELISAs, bien conocidos en el campo.
Proteínas o polipéptidos "recombinantes" se refieren a polipéptidos producidos por técnicas de DNA recombinante; es decir, producidos a partir de células transformadas por un constructo de DNA exógeno que codifica el polipéptido deseado. Proteínas o polipéptidos "sintéticos" son aquéllos preparados por síntesis química.
Una "secuencia codificante" de DNA o una "secuencia nucleotídica codificante" de una proteína particular, es una secuencia de DNA que se transcribe y se traduce en un polipéptido in vivo o in vitro cuando se pone bajo control de las secuencias regulatorias apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por el codón de inicio en el extremo 5' (amino) terminal y un codón de parada de traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias procarióticas, cDNA de mRNA eucariótico, secuencias de DNA genómico a partir de DNA eucariótico (p.ej., de mamíferos), e incluso secuencias de DNA sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción normalmente estará localizada en el extremo 3' de la secuencia codificante.
Las "secuencias control" de DNA se refieren colectivamente a secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios regulatorios corriente arriba, potenciadores, y similares, que colectivamente proporcionan la transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula huésped.
Una secuencia codificante es "operativamente unida a" otra secuencia codificante cuando la RNA polimerasa transcribirá las dos secuencias codificantes en mRNA, que luego se traduce en un polipéptido quimérico codificado por las dos secuencias codificantes. Las secuencias codificantes no necesitan ser contiguas una a la otra a lo largo de la secuencia transcrita que finalmente es procesada para producir la proteína quimérica deseada. Una secuencia control es "operativamente unida a" una secuencia codificante cuando controla la transcripción de la secuencia codificante.
Una secuencia control "dirige la transcripción" de una secuencia codificante en una célula cuando la RNA polimerasa se unirá a la secuencia promotora y transcribe la secuencia codificante en mRNA, que luego se traduce en el polipéptido codificado por la secuencia codificante.
Una "célula huésped" es una célula que ha sido transformada, o es capaz de realizar la transformación, por una secuencia de DNA exógena.
Una célula ha sido "transformada" por DNA exógeno cuando este DNA exógeno ha sido introducido en la membrana celular. El DNA exógeno puede o no ser integrado (covalentemente unido) al DNA cromosómico estructurando el genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el DNA exógeno se puede mantener en un elemento episomal, así como un plásmido. Con respecto a células eucariotas, una célula establemente transformada es una en las que el DNA exógeno empezaría a ser integrado en el cromosoma de manera que se herede a las células hijas a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones que comprendan una población de células hijas que contengan DNA exógeno.
Dos secuencias de DNA o de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" cuando al menos alrededor del 80% (preferiblemente al menos alrededor del 90%, y más preferiblemente al menos alrededor del 95%) de los nucleótidos o aminoácidos corresponden a una longitud definida de la molécula. Las secuencias de DNA que son sustancialmente homólogas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación por Southern bajo, por ejemplo, condiciones estrictas, como se ha definido para este sistema particular. Definiendo condiciones de hibridación apropiadas en el alcance de la materia. Ver, p.ej., Sambrook et al., supra; DNA Cloning, vols I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Una región "heteróloga" de un constructo de DNA es un segmento de DNA identificable o unido a otra molécula de DNA que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. Así, cuando la región heteróloga codifica un gen bacteriano, el gen normalmente será flanqueado por DNA que hace que no flanquee el gen bacteriano en el genoma de la bacteria de origen. Otro ejemplo de la secuencia heteróloga es un constructo donde la secuencia codificante por sí misma no se encuentra en la naturaleza (p.ej., secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). La variación alélica o eventos mutacionales que tienen lugar naturalmente no producen un incremento a una región heteróloga de DNA, como se ha usado aquí.
Por "sujeto vertebrado" se entiende algún miembro de la subfamilia cordata, incluyendo, sin limitación, mamíferos tales como roedores, ganado, cerdos, ovejas, cabras, caballos y el hombre, animales domésticos así como perros y gatos, pájaros, incluyendo pájaros domésticos, salvajes y de caza tales como gallos y gallinas incluyendo pollos, pavos y otras aves gallináceas. El término no denota una edad particular. Así, los dos animales adulto y recién nacido pretenden ser cubiertos.
B. Métodos generales
Central a la invención instantánea es el descubrimiento que los polipéptidos leucotoxina, cuando se acoplan a las repeticiones del polipéptido seleccionado de GnRH (o multímeros), son capaces de conferir más inmunogenicidad a las porciones de GnRH asociadas. En esta consideración, los polipéptidos leucotoxina actúan como transportadores proteicos que presentan los multímeros de GnRH al sistema inmune de un sujeto de forma altamente inmunogénica. Así, las proteínas quiméricas construidas mediante la invención pueden ser formuladas en composiciones de vacunas que proporcionan una inmunogenicidad potenciada a polipéptidos de GnRH presentados allí. La fusión del gen de leucotoxina a los polipéptidos seleccionados de GnRH también facilita la purificación de la proteína quimérica de las células que expresan lo mismo.
Por lo tanto, aquí están ejemplificadas las quimeras de leucotoxina que incluyen la leucotoxina fusionada a más de un polipéptido GnRH. Realizaciones particulares de la presente invención incluyen quimeras que comprenden un polipéptido de leucotoxina fusionado a uno o más multímeros de GnRH, en donde dichos multímeros tienen al menos una secuencia decapeptídica repetida en GnRH, o al menos una unidad repetida de una secuencia correspondiente a al menos un epítope de una molécula de GnRH seleccionada. Además, las secuencias peptídicas de GnRH seleccionadas pueden ser todas las mismas, o pueden corresponder a diferentes derivados, análogos, variantes o epítopes de GnRH mientras que tienen capacidad de producir respuesta inmune. Una secuencia nucleotídica representativa de un decapéptido GnRH se representa en la Figura 1A. La secuencia sujeto de la GnRH se modifica por la sustitución de un residuo glutamina en el N-terminal en lugar de ácido piroglutámico que se encuentra en la secuencia nativa. Esta sustitución particular da una molécula que tiene la estructura nativa de ácido glutámico pero también conserva la estructura no cargada de piroglutamato. Por lo tanto, el péptido resultante no requiere ciclación del residuo de ácido glutámico y puede ser producido en ausencia de condiciones necesarias para efectuar la ciclación.
A causa de que la secuencia de la GnRH es relativamente corta, puede ser fácilmente generada usando técnicas sintéticas, como se ha descrito con más detalle más adelante. Mediante la invención, una secuencia polipeptídica de la leucotoxina se usa para conferir inmunogenicidad asociada a los polipéptidos GnRH (como un transportador proteico) con el fin de producir una respuesta inmune adecuada hacia GnRH endógena en sujetos vertebrados. De esta manera, la inmunización con GnRH puede regular la fertilidad en sujetos no vacunados por interrupción del ciclo estral o espermatogénesis. Se puede encontrar una discusión más detallada de GnRH en la Patente Estadounidense No. 4,975,420.
Es un objetivo particular de la invención proporcionar una alternativa fiable y efectiva en procedimientos de esterilización invasiva actualmente practicados en el mantenimiento de animales domésticos y de granja, así como una castración quirúrgica, ovario-histerectomia quirúrgica y similares. La inmunosupresión de la actividad reproductiva en sujetos vertebrados usando quimeras de leucotoxina-GnRH construidas de acuerdo con la presente invención proporciona una alternativa efectiva en que los constructos efectúan inactivación uniforme de la actividad reproductiva en animales inmunizados. En esta consideración, un producto de vacuna de esterilización debe servir para las capacidades reproductivas uniformemente inactivas en animales individuales en respuesta a un mínimo de vacunaciones con el fin de proporcionar una alternativa exitosa a los procedimientos quirúrgicos. Esta característica es particularmente importante para la inmunoesterilización del grupo de animales, y particularmente donde se desea inmunocastrar verracos machos para prevenir el "cruce con verracos" que se produce por síntesis de esteroides sexuales en testículos funcionalmente normales de verracos machos. Ver p.ej. Meloen et al., Vaccine (1994) 12(8):741-746. Previos intentos en el desarrollo de este producto no han producido resultados uniformes debido a la insuficiente inmunogenicidad de los péptidos de GnRH y/o sistemas transportadores relacionados, y la incapacidad resultante de varias vacunas previas basadas en la GnRH para inducir la respuesta inmune suficiente a GnRH
endógena.
También es un objetivo particular de la invención proporcionar un método para reducir la incidencia de tumores mamarios en sujetos mamíferos usando las moléculas de fusión leucotoxina-GnRH producidas aquí en una vacuna para bloquear las funciones ováricas reguladas por la GnRH así como la producción de hormonas ováricas estrógenos y progesterona en sujetos vacunados. El papel de los estrógenos y la progesterona en la etiología de tumores mamarios está bien establecido. Estos ovarios estrogénicos son importantes en los estados iniciales de cáncer, pero una vez los tumores mamarios empiezan a establecerse, algunos tumores empiezan a ser independientes de esteroides. Ver p.ej., el Textbook of Endocrinology, 7th Edition, Wilson et al. (eds), (1985) pp 68-69. También se sabe que los estrógenos y la progesterona son carcinogénicos y primariamente responsables de formar tumores mamarios en perros.
Por lo tanto, quimeras del polipéptido leucotoxina-GnRH contempladas aquí comprenden una o más porciones de GnRH que tienen una pluralidad de las secuencias polipeptídicas de la GnRH seleccionadas con el fin de dar un antígeno peptídico de GnRH más inmunogénico. Esta característica se basa en el reconocimiento de que proteínas endógenas en general pueden ser consideradas autoantígenos efectivos por multimerización de sus epítopes como se ha descrito antes con más detalle. Más particularmente, las porciones de las quimeras que presentan leucotoxina-GnRH pueden comprender cualquier repetición múltiple o en tándem de las secuencias de GnRH seleccionadas, repeticiones múltiples o en tándem de los epítopes de GnRh seleccionados, o alguna combinación concebible de los mismos. Los epítopes de GnRH se pueden identificar usando técnicas como se ha descrito con detalle antes, o fragmentos de las proteínas de GnRH pueden ser testados para su inmunogenicidad y los fragmentos activos se usaron en composiciones en lugar del polipéptido entero. Cuando más de un multímero de GnRH se incluye en las moléculas quiméricas, cada porción de GnRH puede ser la misma o diferente de las otras que incluyen porciones de GnRH en la
molécula.
La secuencia de una porción particular de GnRH usada aquí se representa en la Figura 1B en donde cuatro secuencias de la GnRH, indicadas en (1), (2), (3) y (4) respectivamente, se separan por secuencias espaciadoras de tripletes de aminoácidos que comprenden varias combinaciones de residuos de serina y glicina. En el oligómero en cuestión, cada secuencia GnRH (aquellas indicadas en (2) y (4), respectivamente) contiene una sustitución aminoacídica no-conservativa en la segunda posición del decapéptido de la GnRH comprendiendo un residuo Asp en lugar del residuo de His encontrado en la secuencia de la GnRH nativa. La secuencia multimérica alternada de la GnRH producida de esta manera suministra un péptido antígeno de la GnRH altamente inmunogénico para el uso en las proteínas de fusión de la invención. Otros análogos de la GnRH correspondiente de algunas adiciones aminoacídicas simples o múltiples, sustituciones y/o deleciones también son particularmente contempladas aquí para el uso en cualquiera de las secuencias multiméricas repetitivas o alternadas. En una fusión particular leucotoxina-GnRH, cuatro copias de la porción de GnRH representadas en la Figura 1B se fusionan a una molécula de leucotoxina de manera que la molécula de leucotoxina se flanquea sobre su N- y C- terminal con dos copias del multímero en cuestión de la GnRH.
Además, la porción particular de la GnRH representada en la figura 1B contiene secuencias espaciadoras entre las porciones de la GnRH. El uso estratégico de varias secuencias espaciadoras entre los polipéptidos de la GnRH seleccionadas se usa aquí para conferir inmunogenicidad incrementada en los constructos en cuestión.
Por lo tanto, mediante la invención, una secuencia espaciadora seleccionada puede codificar una amplia variedad de porciones de uno o más aminoácidos en longitud. Grupos espaciadores seleccionados pueden proporcionar preferiblemente sitios de acoplamiento del enzima de manera que la quimera expresada pueda ser procesada por enzimas proteolíticos in vivo (por APCs o similares) para proporcionar un número de péptidos, cada uno de los cuales contiene al menos un epítope de célula T derivado de la porción transportadora (porción leucotoxina), y que son preferiblemente fusionados a una secuencia polipeptídica sustancialmente completa de la GnRH. Los grupos espaciadores pueden ser construidos de manera que la región de enlace entre las porciones de la GnRH comprenda una secuencia claramente foránea al sujeto inmunizado, por esa razón confiriendo inmunogenicidad potenciada sobre los péptidos de la GnRH asociados. Adicionalmente, las secuencias espaciadoras pueden ser construidas para proporcionar la antigenicidad de la célula T, tal como aquellas secuencias que codifican secuencias peptídicas amfipáticas y/o secuencias peptídicas \alpha-hélice que son generalmente reconocidas en el campo proporcionando epítopes inmunogénicos de células T ayudantes. La elección de epítopes particulares de células T para ser proporcionadas por estas secuencias espaciadoras puede variar dependiendo de las especies de vertebrados que sean vacunadas. Aunque las porciones particulares de la GnRH que se ejemplifican incluyan secuencias espaciadoras, también es objetivo de la invención proporcionar uno o más multímeros de la GnRH que comprenden directamente secuencias adyacentes de la GnRH (sin que intervengan secuencias espaciadoras).
El complejo polipeptídico leucotoxina-GnRH puede ser convenientemente producido recombinantemente como una proteína quimérica. Las porciones GnRH de la quimera pueden ser fusionadas en 5' y/o en 3' de la porción de leucotoxina de la molécula, una o más porciones de la GnRH puede ser localizada en sitios internos en la molécula leucotoxina, o la quimera puede comprender alguna combinación de las porciones de la GnRH en estos sitios. Se ha determinado la secuencia nucleotídica que codifica para la leucotoxina A1 de longitud completa de P. haemolytica. Ver, p.ej., Lo, Infect. Immun. (1987) 55:1987-1996; Patente Estadounidense No. 5,055,400. Adicionalmente, aquí se describen varias secuencias genéticas de leucotoxina variantes.
Similarmente, se han determinado las secuencias codificantes para la GnRH porcina, bovina y ovina, (Mural et al., Hormones and Hormone Antagonists, en The Pharmacological Basis of Therapeutics, Sexta Edición (1980)), y el cDNA para la GnRH humana se ha clonado de manera que si la secuencia ha sido bien establecida (Seeburg et al., Nature (1984) 311:666-668).Se han descrito polipéptidos de la GnRH adicionales de secuencias conocidas, así como la molécula GnRH que se encuentra en salmón y pollos (Publicación Internacional No. WO 86107383, publicada el 18 de Diciembre 1986). La secuencia codificante de la GnRH está altamente conservada en vertebrados, particularmente en mamíferos; y las secuencias de la GnRH porcina, bovina, ovina y humana son idénticas una a la otra. La leucotoxina deseada y los genes de la GnRH pueden ser clonados, aislados y ligados juntos usando técnicas recombinantes generalmente conocidos en el campo. Ver, p.ej., Sambrook et al., supra.
Alternativamente, las secuencias de DNA que codifican las proteínas quiméricas pueden ser preparadas sintéticamente mejor que clonadas. La secuencia de DNA puede ser diseñada con los codones apropiados para la secuencia aminoacídica particular. En general, se seleccionarán codones preferidos para el huésped supuesto si la secuencia va a ser usada para la expresión. La secuencia completa se ensambla a partir de los oligonucleótidos imbricados preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia codificante completa. Ver, p.ej., Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al. Science (1984) 223:1299; Jay et al. J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.
Una vez han sido preparadas o aisladas las secuencias codificantes para las proteínas quiméricas, pueden ser clonadas en algún vector adecuado o replicón. Los entendidos en la materia conocen numerosos vectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado es cuestión de elección. Ejemplos de vectores de DNA recombinante para células clonantes y huéspedes que pueden transformar incluso el bacteriófago lambda(E. coli),pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacteria gram-negativa), pGV1106 (bacteria gram-negativa), pLAFR1 (bacteria gram-negativa), pME290 (no E. coli bacteria gram-negativa), fV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de mamíferos). Ver, generalmente, DNA Cloning: Vols I & II, supra; T. Maniatis et al., supra; B. Perbal, supra.
El gen de fusión puede ser reemplazado bajo el control de un promotor, sitio de unión al ribosoma (para la expresión en bacterias) y, opcionalmente, un operador (colectivamente referido hasta aquí como elementos "control"), de manera que la secuencia de DNA que codifica la proteína quimérica se transcribe en el RNA en la célula huésped transformada por un vector que contiene esta construcción de expresión. La secuencia codificante puede o no contener un péptido señal o secuencia líder. Las proteínas quiméricas de la presente invención pueden ser expresadas usando, por ejemplo, el promotor de P. haemolytica nativa, el promotor tac de E. coli o el promotor y secuencia señal del gen de la proteína A (spa). La secuencia líder puede ser eliminada por la bacteria huésped en el procesamiento post-traduccional. Ver, p.ej., Patente Estadounidense Nos. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.
Además de las secuencias control, puede ser deseable añadir secuencias regulatorias que permitan la regulación de la expresión de las secuencias proteicas relativas al crecimiento de la célula huésped. Las secuencias regulatorias son conocidas por aquellos entendidos de la materia, y los ejemplos incluyen aquellos que causan la expresión de un gen para ser activado o desactivado en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulatorio. Otros tipos de elementos regulatorios también pueden estar presentes en el vector, por ejemplo, secuencias potenciadoras.
Un vector de expresión se construye de manera que la fusión particular que codifica la secuencia se localiza en el vector con las secuencias regulatorias apropiadas, la posición y orientación de la secuencia codificante con respecto al control siendo tal que la secuencia codificante se transcribe bajo el "control" de las secuencias control (es decir, la RNA polimerasa que se une a la molécula de DNA en la secuencia control transcribe la secuencia codificante). La modificación de las secuencias que codifican la proteína quimérica particular de interés puede ser deseable para conseguir este final. Por ejemplo, en algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de manera que se pueda unir a las secuencias control con la orientación apropiada; es decir, mantener el marco de lectura. Las secuencias control y otras secuencias regulatorias pueden ser ligadas a la secuencia codificante antes que la inserción a un vector, así como los vectores de clonación antes descritos. Alternativamente, la secuencia codificante puede ser clonada directamente en un vector de expresión que contiene ya las secuencias control y un sitio de restricción apropiado.
En algunos casos, puede ser deseable añadir secuencias que causen la secreción del polipéptido a partir del organismo huésped, con la división subsiguiente de la señal secretora. Puede ser deseable producir mutantes o análogos de proteínas quiméricas de interés. Se pueden preparar mutantes o análogos por supresión de una porción de la secuencia que codifica la proteína, por inserción de una secuencia, y/o por sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia. Técnicas para modificar la secuencia nucleotídica, así como la mutagénesis de sitio dirigida, son bien conocidas por aquellos entendidos en la materia. Ver, p.ej., T. Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hibridization, supra.
Un número de vectores de expresión procariotas son bien conocidos en el campo. Ver, p.ej., Patente Estadounidense Nos. 4,440,859; 4,436,815; 4,431,740; 4,431,739; 4,428,941; 4,425,437; 4,418,149; 4,411,994; 4,366,246; 4,342,832; ver también Solicitudes de Patente del Reino Unido GB 2,121,054; GB 2,008,123; GB 2,007,675; y Solicitud de Patente Europea 103,395. Los vectores de expresión de la levadura también se conocen en el campo. Ver, p.ej., Patente Estadounidense Nos. 4,446,235; 4,443,539; 4,430,428; ver también solicitudes de Patente Europeas Nos. 103,409; 100,561; 96,491.
Dependiendo del sistema de expresión y huésped seleccionados, las proteínas de la presente invención se producen por crecimiento de células huésped transformadas por un vector de expresión descrito antes bajo condiciones en que se expresa la proteína de interés. La proteína quimérica luego se aisla a partir de células huésped y se purifica. Si el sistema de expresión secreta la proteína al medio de crecimiento, la proteína puede ser purificada directamente del medio. Si la proteína no se secreta, se aisla de los lisados celulares. La selección de las condiciones apropiadas para el crecimiento y métodos de recuperación están dentro del conocimiento de la materia.
Las proteínas quiméricas de la presente invención también pueden ser producidas por síntesis química, tales como por síntesis de péptidos en fase sólida, basada en las secuencias aminoacídicas determinadas. Aquellos entendidos en la materia conocen estos métodos. Ver, p.ej., J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254, para técnicas de síntesis en fase sólida; y M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, para síntesis clásica de solución.
Los sujetos pueden ser inmunizados contra la GnRH endógena por administración de composiciones vacuna que incluyen las presentes proteínas quiméricas leucotoxina-GnRH. Previo a la inmunización, se puede desear incrementar más la inmunogenicidad de una proteína quimérica particular. Esto se puede llevar a cabo de alguna de las varias maneras conocidas para aquellos entendidos en la materia. Por ejemplo, la proteína de fusión polipeptídica de leucotoxina-GnRH puede ser administrada unida a un transportador secundario. Por ejemplo, un fragmento puede ser conjugado con un transportador macromolecular. Los transportadores adecuados son generalmente largos, macromoléculas metabolizadas lentamente así como: proteínas; polisacáridos, así como sefarosa, agarosa, celulosa, cubiertas de celulosa y similares; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina, y similares; copolímeros de aminoácidos; y partículas inactivas de virus. Especialmente sustratos proteicos útiles son albúminas del suero, hemocianina de lapa, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, y otras proteínas bien conocidas por aquellos entendidos en la materia.
Los sustratos proteicos se pueden usar en su forma nativa o se puede modificar el contenido de su grupo funcional mediante, por ejemplo, succinilación de residuos de lisina o reacción con Cis-tiolactona. También se puede incorporar un grupo sulfhidrilo en el transportador (o polipéptidos de la GnRH seleccionados) mediante, por ejemplo, reacción de funciones amino con 2-iminotiolano o el éster N-hidroxisuccinimida de 3-(4-ditiopiridil)propionato. También pueden ser modificados transportadores adecuados para incorporar brazos espaciadores (tales como hexametilendiamina u otras moléculas bifuncionales de tamaño similar) para la unión de péptidos.
Otros transportadores adecuados para las proteínas quiméricas de la presente invención incluyen polipéptidos VP6 de rotavirus, o fragmentos funcionales de los mismos, como se describen en la Patente Estadounidense No. 5,071,651. También es útil un producto de fusión de una proteína viral y un inmunógeno leucotoxina-GnRH, donde el producto de fusión se hace por métodos descritos en la Patente Estadounidense No. 4,722,840. Aún otros transportadores adecuados incluyen células, así como linfocitos, puesto que la presentación de esta manera imita el modo natural de presentación en el sujeto, que da origen al estado inmunizado. Alternativamente, las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser acopladas a eritrocitos, preferiblemente los eritrocitos propios de los sujetos. Métodos para acoplar péptidos a proteínas o células son conocidos por aquellos entendidos en la materia.
Las proteínas quiméricas de la presente invención pueden ser administradas mediante un virus transportador que la exprese. Los virus transportadores que encontrarán uso aquí, pero no son limitados a, el virus de la varicela y otros pox virus, adenovirus, y herpes virus. A modo de ejemplo, pueden ser construidos como sigue, virus de varicela recombinantes que expresan las proteínas quiméricas nuevas. El DNA que codifica la proteína quimérica particular leucotoxina-GnRH primero se inserta en el vector apropiado de manera que sea adyacente a un promotor de varicela y flanqueando secuencias de DNA de varicela, así como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). Este vector se usa entonces para transfectar las células que se infectan simultáneamente con varicela. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor de la varicela más el gen que codifica la proteína quimérica instantánea en el genoma viral. El Tk recombinante resultante puede ser seleccionado por cultivo de células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y cogiendo calvas virales seleccionadas resistentes a la misma.
También es posible inmunizar un sujeto con las proteínas quiméricas presentes, tanto administrada sola, como mezclada con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Generalmente, las vacunas se preparan como inyectables, tanto soluciones líquidas como suspensiones; formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, también pueden ser preparados vehículos líquidos previos a inyección. La preparación también puede ser emulsionada o el principio activo encapsulado en vehículos liposomales. El principio activo inmunogénico con frecuencia se mezcla con vehículos que contienen excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Los vehículos adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampones de pH, o adyuvantes que potencian la efectividad de la vacuna. Los adyuvantes pueden incluir por ejemplo, dipéptidos muramilo, avridina, hidróxido de aluminio, aceites, saponinas y otras sustancias conocidas en el campo. Métodos actuales de preparación de estas formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, por aquellos entendidos en la materia. Ver, p.ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18ª edición, 1990. La composición o formulación a ser administrada contendrá, en cualquier caso, una cantidad de proteína adecuada para conseguir el estado inmunizado deseado en el sujeto a tratar.
Formulaciones adicionales de la vacuna que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones en aerosol, intranasal, oral, y formulaciones de liberación sostenida. Para supositorios, la composición del vehículo incluirá aglutinantes y transportadores tradicionales, tales como, glicoles polialcalinos, o triglicéridos. Estos supositorios pueden ser formados a partir de mezclas que contengan el principio activo en el rango de alrededor del 0,5% hasta alrededor de 10% (p/p), preferiblemente alrededor del 1% hasta alrededor del 2%. Vehículos orales incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, cantidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, magnesio, estearato, celulosa sacarina sódica, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones orales de la vacuna pueden ser tomadas en forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, o polvos, y contienen desde alrededor del 1% hasta alrededor del 30% del principio activo, preferiblemente alrededor del 2% hasta alrededor del 20%.
Formulaciones intranasales normalmente incluirán vehículos que ni causan irritación a la mucosa nasal ni distorsionan significativamente la función ciliar. El diluyente tal como agua, solución salina acuosa u otras sustancias conocidas pueden ser empleados en la invención en cuestión. Las formulaciones nasales también pueden contener conservantes tales como, pero no limitados a, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Un surfactante puede estar presente para potenciar la absorción de las proteínas en cuestión por la mucosa nasal.
Las formulaciones de liberación controlada o sostenida se hacen por incorporación de las proteínas quiméricas en transportadores o vehículos tales como, liposomas, polímeros impermeables no resorbibles tales como copolímeros de acetato de etilenvinilo y copolímeros de HitreK, polímeros inflamables tales como hidrogeles, o polímeros resorbibles tales como colágeno y contienen poliácidos o poliésteres tales como aquellos usados para hacer suturas resorbibles. Las proteínas quiméricas también pueden ser presentadas usando mini-bombas implantadas, bien conocidas en el campo.
Además, las proteínas quiméricas (o complejos de las mismas) pueden ser formuladas en composiciones de la vacuna de cualquier forma neutra o salina. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos activos) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Sales formadas a partir de grupos carboxilo libres también pueden ser derivados a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio, o hidróxidos férricos; y tales bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, etanol 2-etilamino, histidina, procaína, y similares.
Para inmunizar un sujeto, una quimera seleccionada de la leucotoxina-GnRH se administra parenteralmente, normalmente por inyección intramuscular en un vehículo apropiado. Otros modos de administración, sin embargo, tales como inyección subcutánea, intravenosa y liberación intranasal, también son aceptables. Las formulaciones de la vacuna inyectables contendrán una cantidad efectiva del principio activo en un vehículo; la cantidad exacta que se determina rápidamente por un entendido en la materia. El principio activo generalmente está en un rango de alrededor del 1% hasta alrededor del 95% (p/p) de la composición, o superior o inferior si es apropiado. La cantidad de administración depende del animal a ser tratado, la capacidad del sistema inmune de los animales para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseado.
Con las formulaciones presentes de la vacuna, aproximadamente 1 \mug hasta 1mg, más generalmente 5 \mug hasta 200 \mug del polipéptido de la GnRH por mL de solución inyectada, debería ser adecuado para incrementar la respuesta inmunológica cuando se administra. En esta consideración, la proporción en la GnRH de leucotoxina en los antígenos de Leucotoxina-GnRH de las formulaciones de la vacuna en cuestión variará según la leucotoxina particular y porciones polipeptídicas de la GnRH seleccionados para construir aquellas moléculas. Más particularmente, en los polipéptidos de leucotoxina-GnRH usados para producir las formulaciones de la vacuna mediante la invención, habrá alrededor de 1 hasta 40% de GnRH, preferiblemente alrededor del 3 hasta el 30% y más preferiblemente alrededor del 7 hasta el 27% del polipéptido de la GnRH por molécula de fusión. Incrementos en el porcentaje de GnRH presente en los antígenos LKT-GnRH reducen la cantidad de antígeno total que deberán ser administrados a un sujeto con el fin de suprimir una respuesta efectiva de las células B a la GnRH. Las dosis efectivas se pueden establecer rápidamente por un entendido de la materia a través de ensayos rutinarios estableciendo las curvas dosis-respuesta. El sujeto se inmuniza por administración del polipéptido particular leucotoxina-GnRH en al menos una dosis, y preferiblemente dos dosis. Además, al animal se le pueden administrar tantas dosis como se requieran para mantener un estado de inmunidad.
Abajo hay ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solamente para proposiciones ilustrativas, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.
C. Materiales y métodos experimentales
Los enzimas se adquirieron a partir de fuentes comerciales, y se usaron de acuerdo con las direcciones de elaboración. Los filtros de radionucleótidos y nitrocelulosa también se adquirieron a partir de fuentes comerciales.
En la clonación de fragmentos de DNA, excepto donde se resalta, todas las manipulaciones del DNA se hicieron de acuerdo con procedimientos estándar. Ver Sambrook et al., supra. Enzimas de restricción, ligasa T_{4} DNA, E. coli, DNA polimerasa I, fragmento Klenow, y otros reactivos biológicos se adquirieron a partir de proveedores comerciales y se usaron de acuerdo con las direcciones de elaboración. Se separaron fragmentos de DNA de doble cadena en geles de agarosa.
Se prepararon bibliotecas de cDNA y genómicas por técnicas estándar en pUC13 y el bacteriófago lambda gt11, respectivamente. Ver DNA CLONING: Vols I y II, supra.
El biotipo A de P. haemolytica, serotipo 1 ("A1") cepa B122 se aisló del pulmón de becerro el cual murió de pasterurelosis pneumónica y se almacenó a -70ºC en sangre desfibrada. La propagación rutinaria se llevó a cabo en placas de agar sangre o en infusión de extractos de cerebro y corazón (Difco Laboratories, Detroit, MI) suplementado con 5% (v/v) de suero de caballo (Gibco Canada Ltd., Burlington, Canadá). Todos los cultivos se incubaron a 37ºC.
Ejemplo 1 Aislamiento del gen de la leucotoxina de P. haemolytica
Para aislar el gen de la leucotoxina, se construyeron bibliotecas de genes de P. haemolytica A1 (cepa B122) usando técnicas estándar. Ver, Lo et al., Infect. Immun., supra; DNA CLONING: Vols. I y II, supra; y Sambrook et al., supra. Se construyó una biblioteca genómica en el vector del plásmido pUC13 y se construyó una biblioteca de DNA en el bacteriófago lambda gtll. Los clones resultantes se usaron para transformar E.coli y colonias individuales que se combinaron y se cribaron para reaccionar con suero de un becerro que había sobrevivido a la infección de P. haemolytica y que había sido fomentado con un sobrenadante del cultivo concentrado de P. haemolytica para incrementar los niveles de anticuerpo anti-leucotoxina. Se cribaron colonias positivas por su capacidad de producir leucotoxina por incubación de lisados celulares con neutrófilos bovinos y subsiguientemente midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa del último.
Varias colonias positivas se identificaron y estos recombinantes se analizaron mapeando la endonucleasa de restricción. Un clon parecía ser idéntico al gen de la leucotoxina clonado previamente. Ver, Lo et al., Infect. Immun., supra. Para confirmar esto, se reclonaron fragmentos más pequeños y se compararon los mapas de restricción. Se determinó que aproximadamente 4 pares de quilobases de DNA había sido clonado. Progresivamente se aislaron clones más grandes llevando a cabo un paseo cromosómico (dirección 5' a 3') con el fin de aislar recombinantes de longitud completa que eran aproximadamente de 8 kb en longitud. El constructo final se llamó pAA114. Este constructo contenía la secuencia entera del gen de la leucotoxina.
lktA, un fragmento MaeI de la endonucleasa de restricción del pAA114 que contenía el gen entero de la leucotoxina, se trató con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I más nucleótidos trifosfatos y se ligaron en el sitio SmaI del vector de clonación pUC13. Este plásmido se llamó pAA179. A partir de esto, se hacen dos constructos de expresión en el vector pGH432:lacI basado en ptac digerido con SmaI. Uno, pAA342, consistía en el fragmento 5'-AhaIII del gen lktA mientras que el otro, pAA345, contenía el fragmento Mael entero descrito antes. El clon pAA342 expresó un péptido leucotoxina truncado a altos niveles mientras que el pAA345 expresó la leucotoxina de longitud completa a niveles muy bajos. Por consiguiente, el extremo 3' del gen lktA (fragmento Styl BamHI de pAA345) se ligó a pAA342 digerido por Styl BamHI, produciendo el plásmido pAA352. La estructura de pAA352 se muestra en la Figura 2 y la secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica prevista de la leucotoxina de P. haemolytica producida a partir del constructo pAA352 (a partir de ahora LKT 352) se muestra en la Figura 3.
Varias versiones truncadas del gen de la leucotoxina se expresaron a partir de pAA114. Estas formas truncadas se fusionaron con el gen de la B-galactosidasa (lacZ). Dos fragmentos, LTX1.1 y LTX3.2, a partir de una doble digestión con EcoRV Psti, se aislaron a partir del pAA114 como fragmentos de restricción purificados (1,0 kb y 2,1 kb, respectivamente). Estos fragmentos se clonaron en el vector de clonación pTZ18R que había sido digerido con HincII y Pst1. El vector resultante, se llamó pLTX3P. 1, se usó para transformar la cepa JM105 de E. coli. Las células transformadas se identificaron colocándolas en placas sobre un medio que contenía ampicilina más Xgal e IPTG. Las colonias azules indicaron la presencia del gen funcional lacZ. El DNA de las células transformadas se analizó por digestión con la endonucleasa de restricción y se encontró que contenía el extremo 5' del gen de la leucotoxina (lktc y lktA).
Un fragmento 5' EcoRV/Pst1 de la leucotoxina (de pLTX3P.1) se subclonó en el vector de clonación pBR325 que había sido digerido con EcoR1 y Pst1. El plásmido pBR325 también contenía el promotor de la leucotoxina nativa (obtenido del pLTX3P.1) y un supresor, gen lacZ de longitud completa. El constructo resultante se usó para transformar E. coli JM105 y se aislaron colonias azules del agar Xgal. El nuevo constructo se llamó pAA101 (ATCC No. 67883) y se representa en la Figura 10. La secuencia aminoacídica prevista de la leucotoxina P. haemolytica producida del constructo de pAA101 (a partir de ahora LKT 101) se representa en la Figura 11.
Ejemplo 2 Construcción de fusiones LKT-GnRH
Fusiones representativas LKT-GnRH se construyeron como sigue. Oligonucleótidos que contienen secuencias correspondientes a la copia simple de GnRH y GnRH como 4 repeticiones múltiples se construyeron en un Pharmacia Gene Assembler usando química estándar de fosforamidita. Las secuencias de estos nucleótidos se muestran en las Figuras 1A y 1B, los oligonucleótidos en cuestión se hibridaron y se ligaron en el vector pAA352 (ATCC No. 68283, y descrito antes), que habían sido digeridos con la endonucleasa de restricción BamHI. Este vector contiene el gen de la leucotoxina de P. haemolytica. El DNA ligado se usó para transformar la cepa MH3000 de E. coli. Los transformantes que contienen los insertos oligonucleotídicos se identificaron mapeando con enzimas de restricción.
Una secuencia repetida en tándem de 8 copias de GnRH se preparó por hibridación de oligonucleótidos de las cuatro copias de GnRH y su ligación en un vector que había sido digerido con la endonucleasa de restricción BamHI. Los oligómeros se diseñaron para deshabilitar el sitio BamHI corriente arriba cuando se insertó y para asegurar que la inserción de copias adicionales del oligómero sería orientada en el marco de lectura más próximo. La secuencia del oligonucleótido en cuestión se muestra en la Figura 1B. El DNA plásmido de la cepa MH3000 de E. coli se aisló y se usó para transformar la cepa JM105. Los plásmidos recombinantes se designaron pCB113 (LKT352:4 copias de GnRH, ATCC No. Acceso 69749) y pCBI 12 (LKT 352:8 copias de GnRH). El plásmido recombinante pCB113 se muestra en la Figura 4, el plásmido pCB112 es idéntico a pCB113 excepto que la secuencia múltiple de GnRH (correspondiente al oligómero de la Figura 1 B) se insertó dos veces como se ha descrito antes. La secuencia nucleotídica de la fusión recombinante de LKT-GnRH de pCB113 se muestra en la Figura 5. La secuencia nucleotídica de la fusión recombinante LKT-GnRH de pCB112 es idéntica excepto que la secuencia de GnRH de copia múltiple se insertó dos veces.
Ejemplo 3 Construcción del péptido transportador de LKT
Un versión acortada del péptido recombinante de la leucotoxina se construyó a partir del gen recombinante presente en el plásmido pAA352 (como se ha descrito antes). El gen acortado de la LKT se produjo por deleción de un fragmento de DNA interno de aproximadamente 1300 pb en longitud a partir del gen recombinante de la LKT como sigue.
El plásmido pCB113, (ATCC No. Acceso 69749) que incluye el polipéptido de la LKT 352 fusionado a cuatro copias del polipéptido de la GnRH, se digirió con el enzima de restricción BstB1 (New England Biolabs). El plásmido linearizado resultante luego se digirió con nucleasa de poroto-mung (Pharmacia) para eliminar el terminal de cadena simple proyectado por la digestión con BstB1. El DNA romo luego se digirió con el enzima de restricción Nae1 (New England Biolabs), y el DNA digerido DNA se cargó sobre un gel de agarosa 1% donde los fragmentos de DNA se separaron por electroforesis. Un fragmento largo de DNA de aproximadamente 6190pb se aisló y se purificó a partir de gel de agarosa usando un Gene Clean Kit (Bio 101), y el fragmento purificado se dejó ligar a sí mismo usando la ligasa de DNA T4 del bacteriófago (Pharmacia). La mezcla de ligación resultante se usó para transformar células de E. coli JM 105 competentes, y se identificaron clones positivos por su capacidad para producir una proteína agregada que tiene un peso molecular de aproximadamente 57 KDa. El plásmido recombinante formado así se designó pCB111, (ATCC No. Acceso 69748), y produce un polipéptido más corto de leucotoxina (aquí después referido como LKT 111) fusionado a cuatro copias del polipéptido de la GnRH. La estructura de pCB111 se muestra en la Figura 6. El plásmido pCB114 es idéntico al pCB111 excepto que la secuencia de copias múltiples de la GnRH (correspondiente al oligómero de la Figura 1B) se insertó dos veces. La secuencia nucleotídica de la fusión recombinante LKT-GnRH de pCB111 se muestra en la Figura 7, la secuencia nucleotídica de la fusión recombinante LKT-GnRH de pCB114 es idéntica excepto que la secuencia de copias múltiples de la GnRH se insertó dos veces.
La secuencia nucleotídica del punto de fusión de la ligación de los clones en cuestión han sido confirmados por secuenciación con un kit de secuenciación de la polimerasa del bacteriófago T7 (Pharmacia). Las secuencias nucleotídicas de estos puntos de fusión se muestran en la Figura 8.
Ejemplo 4 Construcción de una fusión LKT-GnRH que tiene multímeros de 8 copias de la GnRH Amino Terminales y Carboxilo Terminales
Una molécula recombinante de la fusión de LKT-GnRH que tiene dos multímeros de las 8 copias de GnRH, uno dispuesto en el N'-terminal de LKT 111 y el otro dispuesto en el C'-terminal de la LKT 111, se construyó a partir de la secuencia de fusión LKT-GnRH obtenida a partir del plásmido pCB114 por ligación de la secuencia de copias múltiples de la GnRH (correspondiente al oligómero de la Figura 1B) dos veces en el extremo 5' de la secuencia codificante de la LKT111. Una molécula sintética de ácido nucleico que tiene la siguiente secuencia nucleotídica: 5'-ATGGCTACTGTTATAGATCGATCT-3' se ligó en el extremo 5' de las secuencias de GnRh de copias múltiples. La molécula sintética de ácido nucleico codifica una secuencia de ocho aminoácidos (Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser). La molécula recombinante resultante en consecuencia contiene con el orden dado en la dirección 5' a 3': la molécula de ácido nucleico sintético; una secuencia nucleotídica que codifica un primer multímero de 8 copias de GnRH; una secuencia de nucleotídica que codifica el péptido acortado de la LKT (LKT 111); y una secuencia nucleotídica que codifica un segundo multímero de 8 copias de GnRH.
La molécula recombinante se circularizó, y la molécula resultante se usó para transformar las células competentes de E.coli JM105. Se identificaron clones positivos por su habilidad para producir una proteína agregada que tiene un peso molecular de aproximadamente 74 KDa. El plásmido recombinante así formado se designó pCB122 el cual produce el polipéptido de la LKT111 hasta el polipéptido de 16 copias de la GnRH. La secuencia nucleotídica de la fusión recombinante LKT-GnRH de pCB122 se muestra en las Figuras 9-1 hasta 9-6.
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Ejemplo 5 Purificación de las fusiones de LKT-antígenos
Las fusiones recombinantes LKT-GnRH de los Ejemplos 2, 3 y 4 se purificaron usando el procedimiento siguiente. Para cada fusión, de cinco a diez colonias de las cepas transformadas de E. coli se inocularon en 10 mL de caldo TB suplementado con 100 microgramos/mL de ampicilina y se incubó a 37ºC durante 6 horas en un agitador G10, 220 rpm. Cuatro mL de este cultivo se diluyó en cada uno de los dos frascos Fernbach que contienen 400 mL de extracto de TB + ampicilina y se incubó durante la noche como se ha descrito antes. Las células se recuperaron por centrifugación durante 10 minutos a 4.000 rpm en botellas de polipropileno, volumen de 500 mL, usando un rotor Sorvall GS3. El pellet se resuspendió en un volumen equivalente de extracto de TB que contiene ampicilina que había sido precalentado hasta 37ºC (esto es, 2 x 400 ml), y las células se incubaron durante 2 horas como se ha descrito antes.
3,2 mL de isopropil-B,D-tiogalactopiranósido (IPTG, Gibco/BRL), 500 mM en agua (concentración final= 4 mM), se añadió a cada cultivo con el fin de inducir la síntesis de las proteínas de fusión recombinantes. Los cultivos se incubaron durante dos horas. Las células se cultivaron por centrifugación como se ha descrito antes, se resuspendieron en 30 mL de 50 mM Tris-hidrocloruro, 25% (p/v) sacarosa, pH 8,0, y se congelaron a -70ºC. Las células congeladas se descongelaron a temperatura ambiente después de 60 minutos a -70ºC, y se añadieron 5 mL de lisozima (Sigma, 20 mg/mL en 250 mM Tris-HCl, pH 8,0). La mezcla se pasó por el vórtex a alta velocidad durante 10 segundos y luego se colocó sobre hielo durante 15 minutos. Las células entonces se añadieron a 500 mL de tampón de lisis en un vaso de 1000 mL y se mezclaron por agitación con una pipeta de 2 mL. El vaso que contiene la suspensión celular lisada se colocó sobre hielo y se sonicó durante un total de 2,5 minutos (5-30 segundos de explosiones con 1 minuto de enfriamiento cada una) con un sonicador Braun, sonda larga, empezando a 100 vatios de potencia. Volúmenes equivalentes de la solución se colocaron en tubos de centrifugación Teflon SS34 y se centrifugaron durante 20 minutos a 10.000 rpm en un rotor Sorvall SS34. Los pellets se resuspendieron en un total de 100 mL de agua estéril doble destilada agitando a alta velocidad de vórtex, y se repitió el paso de centrifugación. Los sobrenadantes se descartaron y los pellets se combinaron en 20 mL de 10 mM Tris-HCl,150 mM NaCl, pH 8,0 (solución salina tamponada con Tris) y la suspensión se congeló durante la noche a -20ºC.
La suspensión recombinante se descongeló a temperatura ambiente y se añadió a 100 mL de Guanidina HCl 8M (Sigma) en solución salina tamponada con Tris y se mezcló vigorosamente. Una barra de agitación magnética se colocó en la botella y la muestra solubilizada se mezcló a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución se transfirió a un frasco Erlenmeyer de 2000 mL y se añadieron rápidamente 1200 mL de solución salina tamponada con Tris. Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas adicionales. Se colocaron alícuotas de 500 mL en bolsas de diálisis (Spectrum, 63,7 mm de diámetro, límite 6.000-8.000 PM, #132670, de Fisher scientific) y éstas se colocaron en vasos de 4.000 mL conteniendo 3.500 mL de solución salina tamponada con Tris + 0,5 M de Guanidina HCl. Los vasos se colocaron en una habitación a 4ºC en un agitador magnético durante la noche después que el tampón de diálisis se colocara con solución salina tamponada con Tris + 0,1 M de Guanidina HCl y la diálisis continuó durante 12 horas. El tampón luego se reemplazó con solución salina tamponada con Tris + 0,05 M Guanidina HCl y la diálisis continuó durante la noche. El tampón se reemplazó con solución salina tamponada con Tris (sin guanidina), y se realizó diálisis continuada durante 12 horas. Esto se repitió tres veces más. La solución final se purificó en una botella de rodillo de plástico de 2000 mL (Corning) y se añadieron 13 mL de 100 mM PMSF (en etanol) para inhibir la actividad proteasa. La solución se almacenó a -20ºC en alícuotas de 100 mL.
Para confirmar que las proteínas de fusión habían sido aisladas, las alícuotas de cada preparación se diluyeron 20 veces más en agua doblemente destilada, se mezclaron con un volumen equivalente de tampón de la muestra SDS-PACE, se colocaron en un baño de agua hirviendo durante cinco minutos y corrieron a través de geles de poliacrilamida al 12%. Los controles de leucotoxina recombinante también se hicieron correr.
Todas las proteínas de fusión se expresaron a altos niveles como cuerpos de inclusión. Los pesos moleculares previstos basados en las secuencias de DNA de las proteínas de fusión fueron de 104.869 (LKT 352::4 copias de GnRH, de pCB113); 110.392 (LKT 352::8 copias de GnRH, de pCB112); 57.542 (LKT 111::4 copias de GnRH, de pCB111); 63.241 (LKT 111::8 copias de GnRH de pCB114); y 73.886 (8 copias de GnRH::LKT111::8 copias de GnRH de pCB122). El peso molecular previsto de la molécula de LKT 352 era de 99.338, y el peso molecular previsto de la molécula recombinante LKT 111 era de 51.843.
Ejemplo 6 Actividad Inmunológica In Vivo de la fusión LKT-GnRH
Para probar la capacidad de la fusión LKT-GnRH para inducir una respuesta inmunológica anti-GnRH in vivo, y para comparar esta respuesta a otros conjugados transportadores de la GnRH, se realizó el siguiente ensayo de vacunación. Se usaron tres grupos de 8 cerdos machos, aproximadamente de 8 semanas de edad (35-50 kg) que fueron Libres de Patógenos Específicos. Los animales se mantuvieron en una instalación de mínima enfermedad y se vacunaron los días 0 y 21 del ensayo con las siguientes formulaciones:
Grupo 1 - - placebo que consistía en sales formuladas con adyuvante Emulsigen Plus que contiene 15 mg de bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) (2 ml);
Grupo 2 - - LKT 352-GnRH (250 \mug LKT, preparado como se describe en los ejemplos previos) formulado con el mismo adyuvante (2 ml);
Grupo 3 - - VP6-GnRH, 0,5 \mug VP6 y 5 \mug GnRH, formulado con el mismo adyuvante (2 ml). La preparación de VP6 se hizo como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,071,651, usando el péptido de unión descrito aquí.
Se tomaron muestras de sangre los días 0, 21 y 35, se dejan coagular, se centrifugaron a 1500 g, y el suero se eliminó. Se midieron cantidades de anticuerpo del suero contra la GnRH usando el procedimiento RIA de Silversides et al., J. Reprod. Immunol. (1985) 7:171-184.
Los resultados de este ensayo indicaron que solamente aquellos animales inmunizados con la formulación de LKT 352-GnRH producían cantidades significativas contra GnRH (cantidades >1:70). Ni el placebo ni los grupos VP6-GnRH producían cantidades anti-GnRH. Previamente, fueron necesarias vacunaciones múltiples con dosis de GnRH de más de 100 \mug, conjugadas a otras proteínas transportadoras, para inducir cantidades de anti-hormona. Estos resultados indican que el sistema de transporte de LKT-GnRH proporciona un inmunógeno en gran medida mejorado en cuanto a sistemas de transporte.
Ejemplo 7 Efecto Inmunológico In Vivo de Repeticiones múltiples en Tándem de la GnRH Ligada a LKT
Para probar la capacidad de las proteínas de fusión recombinantes LKT-GnRH que contienen repeticiones múltiples del polipéptido de la GnRH para inducir una respuesta inmunológica anti-GnRH in vivo, se realizó el siguiente ensayo de vacunación. Cultivos de E.coli que contienen los plásmidos pCB113 y pCB175 (que tienen 4 y 8 copias de GnRH ligada a la LKT 352, respectivamente) y un plásmido que tiene 1 copia de GnRH ligada a la LKT 352 se prepararon como se ha descrito antes. Las vacunas de cada uno de los cultivos anteriores se formularon para contener el equivalente de 5 \mug de GnRH en 0,2 mL de Emulsigen Plus. A tres grupos de 10 ratones hembra a parte se les dieron inyecciones subcutáneas 23 días y se recogieron muestras de sangre los días 23, 35 y 44 después de la inyección primaria. Se midieron cantidades de anticuerpos del suero contra la GnRH a diluciones finales de 1:100 y 1:1000 usando un procedimiento estándar de radioinmunoensayo. Si menos del 5% de la GnRH yodada se enlazó, el anticuerpo parecía ser indetectable. Así las cantidades de anticuerpo que se obtuvieron se resumen en la Tabla 1.
Los resultados de este estudio indican que dosis equivalentes de la GnRH presentada como repeticiones múltiples en tándem (GnRH de cuatro u ocho copias) dieron una mejora dramática en la producción de anticuerpos sobre la GnRH de copia simple. (ya que se midió por unión a la GnRH yodada nativa). Además, los resultados anteriores indican que una proteína de fusión que comprende una repetición en tándem de las cuatro copias de GnRH ligada a la LKT 352 representa una forma de antígeno inmunogénico efectivo de GnRH, aunque la inmunogenicidad puede estar influenciada por la dosis o las especies en cuestión.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1
Ejemplo 8 Actividad Inmunológica in vivo y Efecto biológico de las fusiones LKT 352::GnRH y LKT 111::GnRH
Para comprobar la capacidad de las proteínas de fusión que comprenden múltiples repeticiones en tándem de la GnRH (ligadas a la LKT 352 o LKT 111) para producir una respuesta inmunológica anti-GnRH in vivo y para manifestar un efecto biológico in vivo, se realizó el siguiente ensayo de vacunación. Cultivos de E. coli que contienen plásmidos pCB113 y pCB111 (4 copias de GnRH ligada a LKT 352 o LKT 111, respectivamente) se prepararon como se ha descrito antes. Vacunas de cada uno de los cultivos anteriores se formularon para contener el equivalente de 5 \mug de GnRH en 0,2 mL de adyuvante VSA-3, (un adyuvante modificado de Emulsigen Plus), con una vacuna control que comprende 0,2 mL del adyuvante también siendo preparada. A tres grupos de 5 ratones Swiss hembra se les administró dos inyecciones subcutáneas 21 días aparte, con las inyecciones iniciales (día 0) dadas a las 5-6 semanas de edad. El día 49 los sujetos se sacrificaron.
La actividad inmunológica de las fusiones GnRH-LKT en cuestión se ensayó midiendo las cantidades de anticuerpo anti-GnRH usando un procedimiento de radioinmunoensayo a una dilución sérica 1:1000. El efecto biológico de las fusiones GnRH-LKT se cuantificó por radioinmunoensayo de los niveles de testosterona en suero con una sensibilidad de 25 pg/ml, y el tejido testicular se pesó y se examinó histológicamente. Los resultados de este ensayo están resumidos en la Tabla 2.
En el ensayo, todos los animales en cuestión inyectados con antígenos GnRH:LKT tenían niveles de anticuerpo rápidamente detectables. Sin embargo, la fusión LKT 111::GnRH (del plásmido pCB111) mostró inmunogenicidad superior como se indicó por uniformidad de respuesta y cantidad. La testosterona en suero (producida por las células testiculares de Leidig) se secretan de manera pulsátil, y por lo tanto, se esperan valores bajos y variabilidad extrema de los niveles en suero en los animales normales en cuestión. Mediante el ensayo, el grupo control (recibiendo inyecciones de la vacuna adyuvante de 0,2 mL) tenía niveles de testosterona en suero normales, mientras que los dos grupos de sujetos tratados tenían la testosterona en suero esencialmente indetectable.
Además mediante el ensayo, la evaluación histológica del tejido testicular reveló la variación de los grados de atrofia de las células de Leidig, el diámetro reducido del túbulo seminífero e interrupción de la espermatogénesis en los sujetos tratados; sin embargo, el peso testicular quedó cerca del normal en animales tratados -incluso en la presencia de altas cantidades de anticuerpos anti-GnRH- aunque había una evidencia clara de regresión testicular en 2 de los 5 sujetos que reciben las fusiones LKT 111::4 copias de GnRH.
Por lo tanto, estos resultados muestran que las copias múltiples de la GnRH ligada a LKT 352 o LKT 111 comprenden inmunógenos potentes; y además, se indica que la vacunación con las proteínas de fusión en cuestión provoca la producción de anticuerpos que son capaces de neutralizar la GnRH endógena in vivo, y que se observa un efecto biológico concomitante in vivo en los animales en cuestión que reciben tales vacunaciones.
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(Tabla pasa a página siguiente)
2
Ejemplo 9 Actividad Inmunológica in vivo de las fusiones LKT::GnRH en sujetos porcinos
Para probar la capacidad de las proteínas de fusión que comprenden múltiples repeticiones en tándem de la GnRH (ligada a LKT 352 o LKT 111) para producir una respuesta inmunológica anti-GnRH in vivo en sujetos porcinos, se realizó el siguiente ensayo de vacunación. Cultivos de E.coli que contienen los plásmidos pCB113, pCB111, pCB175 y pCB114 (LTK 352::4 copias de GnRH, LKT111::4 copias de GnRH, LKT 352::8 copias de GnRH, y LKT 111::8 copias de GnRH, respectivamente) se prepararon como se ha descrito antes. Las vacunas de cada uno de los cultivos anteriores se formularon para contener el equivalente de 50 \mug de GnRH y se administraron con el adyuvante VSA-3
en un volumen de 2,0 mL. Cuatro grupos de 5 machos y 5 hembras de cerdos destetados, de 35 días de edad (el día 0), se les inyectó el día 0 y se les reinyectó el día 21 del ensayo. Se recogieron muestras de sangre los días 0, 21 y 35, con cantidades de anticuerpo anti-GnRH medidas a una dilución final de 1:1000 usando un procedimiento de radioinmunoensayo estándar. Los resultados del ensayo se resumen en la Tabla 3.
Mediante el ensayo, no se detectó ningún anticuerpo anti-GnRH en los sujetos antes de la inmunización, pero fueron rápidamente detectados en la mayoría de sujetos cerca del día 35 (un sujeto del grupo en tratamiento 4 murió debido a una infección no relacionada con el tratamiento). Los resultados en este ensayo indican que las proteínas de fusión que comprenden múltiples repeticiones de GnRH ligada al polipéptido transportador de la LKT 352 o LKT 111 forman útiles inmunógenos en sujetos porcinos. Basado en los pesos moleculares previstos del decapéptido GnRH (1.200), el polipéptido LTK111 (52.000) y el polipéptido de LKT 352 (100.000), los porcentajes de la GnRH en las fusiones del antígeno LKT-GnRH son como sigue: 4,9% (LKT 352::4 copias de GnRH); 8,5% (LKT 111::4 copias de GnRH); 9,3% (LKT 352::8 copias de GnRH) y 15,7% (LKT 111::8 copias de GnRH). Por lo tanto, los resultados prácticos obtenidos de este modo indican que usando fusiones LKT-GnRH que comprenden el transportador polipeptídico de la LKT 111, la cantidad global del antígeno (LKT-GnRH) administrada al sujeto fue dividida en dos (comparado con las composiciones de la vacunación usando el sistema transportador de la LTK352) para obtener una respuesta equivalente anti-GnRH
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3
Ejemplo 10 Evaluación de la eficiencia de la vacuna de inmunocastración de LKT 111::8 copias de GnRH
Para evaluar la eficacia y utilidad comercial de una formulación de vacuna que contiene la proteína de fusión LKT 111::8 copias de GnRH, se llevó a cabo el siguiente ensayo de vacunación. Un cultivo de E. coli que contiene el plásmido pCB114 (LKT 111;:8 copias de GnRH) se preparó como se ha descrito antes. Se preparó una formulación de vacuna del cultivo anterior que contenía el equivalente de 50 \mug GnRH. La formulación de vacuna se administró en adyuvante VSA-3 a 2,0 mL de volumen final. Se estabilizaron tres grupos de tratamiento, con 30 cerdos macho (verracos) cada uno. Los tres grupos consistentes de 30 capones (verracos castrados quirúrgicamente antes de la madurez sexual), 30 verracos control y 30 inmunocastrados (verracos castrados mediante vacunación con el inmunógeno GnRH). En el destete (día 21), los animales del grupo de capones y verracos control fueron inyectados con placebo (adyuvante VSA-3 solo), mientras que el grupo de inmunocastrados fue inyectado con la formulación de vacuna descrita antes. Cuando los animales alcanzaron un peso predeterminado de alrededor 3 semanas antes del sacrificio, al grupo de inmunocastrados se le dio una dosis supletoria de la vacuna, mientras que los grupos de capones y verracos control se les volvieron a dar inyecciones de placebo. Las medidas incluyen títulos de anticuerpos en suero para GnRH, niveles de testosterona en sangre, características de las carcasas, comportamiento animal, eficiencia de nutrición, tasa de ganancia de peso, y niveles de glándula salival y niveles de androstenona en grasa corporal (como medida de mancha del verraco).
(a) Título de anticuerpos en suero Anti-GnRH
La actividad inmunológica de la formulación de vacuna de fusión 8 copias de GnRH-LKT se ensayó midiendo los títulos de anticuerpo antiGnRH usando un procedimiento estándar de radioinmunoensayo a una dilución 1:5000 del suero. Una comparación de títulos de anticuerpo en suero en los tres grupos experimentales se proporciona en la Figura 12. Tal como se puede ver, los títulos de anticuerpo anti-GnRH aumentan dramáticamente en los verracos inmunocastrados (vacunados) y se mantienen en niveles significativamente en exceso de la cantidad mínima necesaria para producir un efecto biológico (aproximadamente 10 a 20% de unión en la Figura 12) durante 20 días tras la vacunación.
(b) Efecto Biológico de la Vacuna de Inmunocastración sobre el tamaño de las glándulas sexuales
El efecto biológico de la formulación de vacuna de 8 copias de GnRH-LKT se determinó mediante comparación del peso y medición de las glándulas sexuales de los verracos control y los verracos inmunocastrados (vacunados), así como ensayando y comparando niveles de testosterona en suero en aquellos dos grupos experimentales. En particular, las glándulas bulbouretrales y los testículos de los animales fueron pesados y medidos. Los resultados se describen más adelante en la Tabla 4. Tal como se puede ver, el peso medio de las glándulas bulbouretrales en los animales vacunados se redujo aproximadamente un 32% en relación a los animales control. Además, el peso medio de los testículos en los animales vacunados se redujo aproximadamente un 25% en relación a los animales control. Estos resultados son consistentes con la producción reducida de testosterona de los testículos en los animales vacunados.
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TABLA 4
Glándula bulbouretral Testículos
Tratamiento Nº de Peso medio % de control Longitud % control Peso medio % control
animales (g) media (cm) (g)
Verracos control 22 60,5 \pm 3,5* 11,4 \pm 21 263 \pm 10,9
Verracos 27 41,3 \pm 5,2 68,3 9,5 \pm 47 83,3 198 \pm 11,3 75,3
inmunocastrados
* indica \pm errores estándar 
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Los niveles medios de testosterona en suero en los tres grupos experimentales se determinó usando un radioinmunoensayo estándar de niveles de testosterona en suero con una sensibilidad de 25 pg/mL. Los ensayos de condujeron en el Día 0, Día 7, Día 14, y Día 21 tras las inmunizaciones supletorias (y vacunaciones placebo en los grupos de vecerros control y de capones). Los resultados de los ensayos se describen en la Figura 13. Como se puede ver, los niveles de testosterona en suero en los animales vacunados disminuyeron tras la vacunación, mientras que los niveles en los verracos control aumentaron.
(c) Composición de las carcasas
Los aspectos comerciales de la composición de la carcasa de los animales de cada grupo experimental se evaluó tras el sacrificio de los animales. En particular, se determinó el peso medio de los animales y el contenido de grasa, se tomaron las medias de las mediciones del ojo lomo, y se determinó el peso medio de los jamones cortados y del lomo. Los resultados de las evaluaciones de las carcasas se comunican en la Tabla 5. Tal como se puede ver, los datos de la carcasa muestran que los verracos control y los inmunocastrados (animales vacunados) poseen unas composiciones de carcasa muy similares, mientras que los capones poseen de forma apreciable más grasa corporal, menos magro. Además, el patrón de crecimiento de los capones alcanza un plateau en los últimos 24 días de vida (resultados no mostrados). Estos datos de las carcasas son consistentes con el objetivo de tener las composiciones de carcasas de los animales inmunocastrados imitan a las de los verracos control en todo menos en los últimos días del periodo de crecimiento.
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TABLA 5
Datos de Carcasa
Capones Verracos Control Inmunocastrados
Peso muerto (kg) 110,5 115,2 115,4
Grasa (mm) 19,1 15,7 15,3
Ojo lomo (cm^{2}) 41,5 44,5 44,2
Corte primario (kg) 27,3 28,4 28,2
Jamón cortado (kg) 7,70 8,23 8,11
Lomo cortado (kg) 7,38 7,79 7,65
(d) Conversión de alimentos
La eficiencia de conversión de alimentos de los animales de cada uno de los grupos experimentales se midió durante el periodo de destete hasta el sacrificio. En particular, la eficiencia media de conversión de alimentos se expresó como la relación de Kg de alimento:Kg peso ganado en los animales. Los resultados se muestran en la Figura 14. Tal como se puede ver, la conversión de alimentos en los verracos control y los inmunocastrados (animales vacunados) fue de alrededor de un 10% más eficiente que la conversión de alimentos en los capones.
(e) Niveles del componente de mancha en becerros
La capacidad de la formulación de vacuna de fusión 8 copias de GnRH-LKT para reducir la mancha de becerros en animales vacunados se evaluó ensayando los niveles de androstenona (un componente de la mancha de vecerros) en grasa y glándulas salivales de animales de cada uno de los grupos experimentales. Los niveles de androstenona se cuantificaron mediante un método químico estándar sobre la grasa y glándulas salivales de especímenes obtenidos de cada grupo. Los resultados se comunican en la Tabla 6, Tal como se puede ver, los verracos control poseen de forma apreciable mayores concentraciones de androstenona en relación a los capones y los inmunocastrados animales vacunados).
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TABLA 6
Capones Verracos Control Inmunocastrados
Androstenona en grasa 0,14 \mug/g 0,44 \mug/g 0,26 \mug/g*
Androstenona salivar 33,76 \mug/g 40,46 \mug/g 30,18 \mug/g
*p inferior a 0,01
Todos los resultados anteriores indican que la formulación de vacuna de inmunocastración que contiene las moléculas de fusión cortas LKT::8 copias de GnRH proporcionan una alternativa comercialmente viable a los métodos de castración quirúrgicos.
Ejemplo 11 Comparación de la Actividad Inmunogénica in Vivo de Moléculas de Fusión con uno o dos Multímeros GnRH
Para poder comparar la capacidad de las proteínas de fusión LKT-GnRH comprendiendo tanto un multímero de GnRH sencillo (que contiene 8 repeticiones en tándem de GnRH), o dos multímeros de GnRH (ambos conteniendo 8 repeticiones en tándem de GnRH), para evocar una respuesta inmunológica anti-GnRH in vivo, se llevaron a cabo varios ensayos de vacunación.
Cultivos de E. coli que contienen los plásmidos pCB114 (una 8 copias de GnRH multímero, ligado al C'-terminal de LKT 111), y pCB122 (cos 8 copias de GnRH multímeros; una ligada al N'-terminal de LKT 111 y el otro ligado al C'-terminal de LKT 111) se prepararon como se ha descrito antes. Las vacunas derivadas de los cultivos que contiene el plásmido pCBI14 fueron formulados para contener 160 \mug de las moléculas de fusión (25 \mug total de GnRH) en un volumen final de 2 mL del adyuvante VSA-3. Las vacunas derivadas de cultivos que contienen el plásmido pCB122 fueron formulados para contener 185 \mug de las moléculas de fusión (50 \mug total de GnRH) en un volumen final de 2 mL del adyuvante VSA-3, de esta forma, la cantidad de la molécula vehículo de LKT se mantuvo constante (135 \mug total de LKT por formulación) en ambas preparaciones. Las formulaciones de vacuna se usaron en los siguientes ensayos de vacunación.
(a) Título de Anticuerpo Anti-GnRH y Actividad Funcional de las Moléculas de Anticuerpo Anti-GnRH
Se llevó a cabo una comparación entre los títulos de anticuerpo anti-GnRH evocados por las dos formulaciones de vacuna experimentales, en donde también fue evaluada la capacidad de los anticuerpos evocados para bloquear el efecto de GnRH producida endógenamente. En particular, tres grupos de cerdos macho se establecieron como sigue: 50 animales fueron inyectados con la composición de vacuna de multímero GnRH sencilla (las fusiones LKT 111::8 copias de GnRH obtenida de pCB114), 10 animales fueron inyectados con la composición de vacuna de multímero GnRH plural (fusiones de 8 copias de GnRH::LKT 111::8 copias de GnRH obtenidas de pCB122), y 10 animales control fueron inyectados con 2 mL del adyuvante VSA-3 solo.
Las vacunaciones se llevaron a cabo al destete (21 días de edad), y los animales fueron revacunados 30 días después. Se tomaron muestras de sangre a los 14 y 28 después de la revacunación. El suero se obtuvo y fue ensayado para los niveles de suero y título de anticuerpo anti-GnRH de Hormona Luteinizante (LH). Los títulos de anticuerpo anti-GnRH en suero se determinaron a una dilución final en suero de 1:5000 usando GnRH yodado en un radioinmunoensayo estándar. Los niveles en suero de LH fueron ensayados usando LH porcina como referente estándar en un radioinmunoensayo estándar. Los resultados de los ensayos, dados como media de valores \pm errores estándar, son comunicados en la Tabla 7. Tal como se puede ver mediante los datos descritos en la Tabla 7, títulos de anticuerpo anti-GnRH fueron superiores en animales inyectados con la composición de vacuna multímero GnRH plural (8 copias de GnRH::LKT 111::8 copias de GnRH) que los vistos con los animales que reciben la vacuna multímero GnRH simple (LKT 111::8 copias de GnRH). Además, los animales que reciben la vacuna multímero GnRH plural poseen menores niveles de LH en suero. Esta reducción en suero de LH refleja la capacidad de los anticuerpos anti-GnRH producidos en los animales inmunizados para bloquear el efecto de la GnRH producida endógenamente. Finalmente, el 100% de los animales que recibieron vacuna multímero GnRH plural respondieron a la vacuna produciendo anticuerpos anti-GnRH, mientras que el 90-92% de los animales que recibieron los multímeros GnRH simples
respondieron.
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TABLA 7
Anticuerpos GnRH al día LH en suero al día
Día tras la revacunación 14 28 14
Tratamientos 1 (control) 0,5 \pm ,3 0,5 \pm 3 1,16 \pm ,22
Tratamiento 2 LKT 111::8 44,6 \pm 4,1 37,2 \pm 4,1 0,13 \pm ,04
copias de GnRH 160 \mug (25 \mug)
Tratamiento 3 8 copias de 60,5 \pm 6,9 51,8 \pm 7,5 ,06 \pm ,02
GnRH::LKT 11::8 copias de
GnRH 185 \mug (50 \mug GnRH) 
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(b) Comparación de Títulos Anti-GnRH y Estimación del Efecto del Aumento de las Dosis de Vacuna
La inmunogenicidad de las dos formulaciones de vacuna el antígeno multímero sencillo de 8 copias de GnRH y el antígeno multímero plural 16 copias de GnRH) fue evaluado de nuevo como sigue. Fueron establecidos dos grupos experimentales de 20 cerdos macho. Los animales del primer grupo fueron vacunados en el desteto (21 días de edad) con 160 \mug de la preparación del antígeno multímero sencillo, y entonces se revacunaron 33 días después con la misma dosis. Los animales del segundo grupo se vacunaron en el destete (21 días de edad) con 185 \mug de la preparación de antígeno multímero plural y también se revacunaron 33 días después. Se recogió la sangre 8, 14, y 24 días después de las inyecciones de revacunación, y se ensayó el suero para moléculas de anticuerpo anti-GnRH a una dilución final de 1:5000 usando radioinmunoensayo estándar como se ha descrito previamente. Los resultados se representan en la Figura 15. Tal como se puede ver, la respuesta del anticuerpo a la vacuna de multímero plural (8 copia GnRH::LKT 111::8 copias de GnRH) fue más alta (P<,001) que para la vacuna de multímero sencillo (LKT 111::8 copias de GnRH. Refiriéndose aun a la Figura 15, la línea horizontal en el 20% sobre el eje I representa una cantidad de anticuerpo que, en ensayos previos no descritos aquí, se han mostrado para suprimir la secreción de LH en animales vacunados. Otra vez, el 100% de los animales que reciben la vacuna de multímero de GnRH plural respondieron (produjeron anticuerpos anti-GnRH), mientras que aproximadamente de los animales que recibían la vacuna del multímero sencillo respondieron el 90-92%.
Con el fin de determinar si la inmunogenicidad observada con la vacuna del multímero plural de la GnRH se debe a la dosis incrementada del antígeno de GnRH (p.ej., 50 \mug de GnRH en la vacuna [8 copias de GnRH::LKT 111::8 copias de GnRH], comparado con los 25 \mug de la GnRH en la vacuna [LKT 111::8 copias de GnRH]), se llevó a cabo el siguiente estudio. Tres grupos de 20 cerdos cada uno se vacunaron en el destete (21 días de edad) y se revacunaron aproximadamente 30 días más tarde con la composición de la vacuna del multímero de la GnRH sencillo (fusión LKT 111::8 copias de GnRH obtenida de pCB114) con las siguientes dosis: 50 \mug, 150 \mug y 450 \mug de la proteína de fusión, respectivamente. La sangre se recogió a los 14, 28 y 64 días después de la inyección de revacunación. El suero se ensayó para los anticuerpos anti-GnRH a una dilución final de 1:5000 como se ha descrito antes. Los resultados se describen en la Tabla 8. Como se puede ver, no se obtuvo un incremento apreciable en las cantidades de anticuerpo anti-GnRH en respuesta a la vacunación con dosis incrementadas de la composición de la vacuna de multímero de GnRH sencillo. Esto indica que la inmunogenicidad incrementada observada con la vacuna del multímero plural de la GnRH (fusión 8 copias de GnRH::LKT 111::8 copias de GnRH obtenida a partir del pCB122) no se debe a la concentración incrementada de antígeno GnRH; sino que la inmunogenicidad incrementada más bien se debe a la estructura tridimensional de la molécula de fusión LKT-GnRH, o en la presentación física del antígeno GnRH a células productoras de anticuerpo.
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TABLA 8
Dosis (\mug) LKT 111::8 copias de GnRH % de unión a dilución 1:5000 el día después de la revacunación
Día 14 Día 28 Día 64
50 \mug 60,9 \pm 4,8 50,7 \pm 5,8 22,0 \pm 4,7
150 \mug 59,0 \pm 4,9 46,0 \pm 4,9 16,8 \pm 3,6
450 \mug 62,6 \pm 4,0 56,5 \pm 4,7 22,8 \pm 4,8 
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Ejemplo 12 Estudio dosis respuesta con moléculas de fusión LKT-GnRH que tienen dos multímeros de GnRH
Con el fin de determinar las dosis óptimas de las vacunas formadas a partir de las proteínas de fusión LKT-GnRH que comprenden dos multímeros de GnRH (los dos que contienen 8 repeticiones en tándem de GnRH), se llevó a cabo el siguiente estudio dosis respuesta in vivo.
Los cultivos de E.coli que contienen el plásmido pCB122 (dos multímeros de 8 copias de GnRH, uno unido al N'-terminal de LKT 111 y el otro unido al C'-terminal de LKT 111) se prepararon como se ha descrito antes. Siete vacunas derivadas de los cultivos que contienen el plásmido pCB122 se formularon a las dosis siguientes de proteína de fusión total: 0 \mug (control); 1 \mug; 5 \mug; 10 \mug; 20 \mug; 40 \mug; y 80 \mug, cada uno en un volumen final de 1 mL de adyuvante VSA-3.
Siete grupos experimentales de 20 animales cada uno se ensamblaron y se vacunaron con las formulaciones de vacuna antes descritas. Se tomó una muestra de sangre el día 35 tras la vacuna y se midieron títulos de anticuerpo anti-GnRH a una dilución final de 1:100 en un radioinmunoensayo estándar como se ha descrito anteriormente. Los resultados del ensayo están expuestos en la Tabla 9. Los títulos están expresados como un porcentaje de unión como se ha dicho anteriormente. Tal y como se observa, estadísticamente 0 \mug de la proteína de fusión era diferente de todos los otros valores. La dosis de 1 \mug de proteína de fusión era menor (p < 0,009) que los demás valores obtenidos de los grupos que recibían el antígeno proteico. La dosis de 5 \mug era menos que la dosis de 20 \mug (p < 0,06), sin embargo, todos los valores para dosis por encima de 10 \mug de proteína de fusión total eran estadísticamente similares. Estos datos muestran que la dosificación óptima de la vacuna derivada de la proteína de fusión del plásmido pCB122 (8 copias de GnRH::LKT 111::8 copias de GnRH) es de aproximadamente 20-40 \mug de proteína de fusión.
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TABLA 9
Dosis (\mug) 8 copias de GnRH:: LKT 111::8 copias de GnRH
0 1 5 10 20 40 80
Título x 2,6 20,5 47,9 52,0 59,6 62,0 64,6
Sx \pm ,6 5,0 5,8 4,6 4,4 3,4 3,6 
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Ejemplo 13 Inmunización GnRH de ratas hembra
Para poder evaluar los efectos biológicos de la inmunización GnRH de los sujetos hembra se llevó a cabo el siguiente estudio
Los cultivos de E. coli que contienen el plásmido pCB122 (dos multímeros de 8 copias de GnRH, uno ligado al N'-terminal del LKT 111 y el otro ligado al C'-terminal del LKT 111) se prepararon como se ha descrito anteriormente. Se formuló una vacuna derivada de los cultivos para que contuviera 185 \mug de las moléculas de fusión (50 \mug totales de GnRH) en un volumen final de 1 ml de adyuvante VSA-3. La formulación se usó luego en el siguiente ensayo de vacunación para evaluar el efecto de la inmunización GnRH sobre el peso ovárico, el peso uterino, y la concentración de estrógeno en suero en sujetos hembra.
Se ensambló dos grupos de hembras de rata Sprague Dawley, 10 animales por grupo. Al grupo de control (Grupo 1) se le administró una inyección de placebo (únicamente adyuvante VSA-3) en el día 0 del ensayo. Los animales del segundo grupo recibieron una única inyección de la formulación de vacuna GnRH/LKT. Los títulos de anticuerpo anti-GnRH se monitorizaron tras el tratamiento y los animales del Grupo 2 mostraron un aumentó en el título 21 días después de la inyección hasta alcanzar los niveles máximos aproximadamente el día 50 del estudio, tras lo cual los niveles descendieron gradualmente hasta que los animales fueron sacrificados el día 224 de ensayo.
Se determinó y registró el peso ovárico, el peso uterino, y los niveles de estradiol en suero. Los resultados de estas medidas pueden observarse en la Figura 16. Tal como se puede ver, los pesos ováricos de los animales tratados (inmunizados con la formulación de vacuna GnRH-LKT) se redujeron de forma dramática con relación a los animales de control. Un examen histológico del tejido reveló la ausencia de folículos en el tejido ovárico. Los pesos uterinos también se redujeron en los animales tratados. El peso uterino proporciona un buen reflejo de las concentraciones de estrógeno en suero, y está relacionado con la secreción esteroidea gonadal. Además, los niveles de estradiol en suero también se redujeron en los animales tratados hasta aproximadamente 20 pg/ml, mientras que el estradiol en suero era de aproximadamente 50 pg/ml en los animales de control. Puesto que el estrógeno deriva de los ovarios, se esperaba que el estradiol en suero se redujera en los animales tratados. Estos resultados demuestran que las inmunizaciones GnRH/LKT de la presente invención son efectivas para controlar la función ovárica, lo que indica una alternativa viable al procedimiento de ovariectomía o el tratamiento con antagonistas de GnRH.
Ejemplo 14 Inmunocastración de sujetos machos porcinos utilizando la fusión de moléculas LKT-GnRH con dos multímeros GnRH
Para determinar la capacidad de las composiciones de vacuna formadas con proteínas de fusión LKT-GnRH con dos multímeros GnRH (ambas contienen 8 repeticiones en tándem de GnRH) para reducir la androstenona en la grasa, se llevó a cabo el siguiente estudio.
Se preparó, tal como se ha descrito anteriormente, cultivos de E. coli que contenían el plásmido pCB122 (dos multímeros de 8 copias de GnRH, uno ligado al N'-terminal de LKT 111 y el otro ligado al C'-terminal del LKT 111. Las composiciones de vacuna derivadas de los cultivos se prepararon también como se ha descrito. Se formaron cuatro grupos experimentales de sujetos porcinos macho de la siguiente manera: Grupo 1, compuesto por 6 capones (animales macho castrados quirúrgicamente a los pocos días de edad); Grupo 2, compuesto por 7 verracos (machos que permanecen intactos durante el estudio); Grupo 3, compuesto por 6 sujetos castrados más tarde (machos que permanecen intactos hasta aproximadamente los 135 días de edad, tiempo en el que se anestesia a los animales y se les castra quirúrgicamente); y Grupo 4, compuesto por 10 machos intactos que fueron inmunizados con la composición de vacuna GnRH en el momento del destete (21 días de edad) y a los 135 días aproximadamente de edad.
Tras 42 días, el estudio se completó y se sacrificó a los animales. Los niveles de androstenona en grasa (un componente marcado del verraco) en la grasa de especimenes de animales de cada grupo experimental se cuantificaron mediante metodologías químicas estándar. Los resultados pueden observarse en la Figura 17. Tal como se puede ver en dicha figura, la androstenona en grasa resultó similar en los capones (Grupo 1), los posteriormente castrados (Grupo 3) e inmunocastrados (Grupo 4, tratados con la vacuna LKT-GnRH), y los tres grupos tenían niveles de androstenona en grasa menores con relación a los verracos del Grupo 2.
Se determinaron varios aspectos de la composición de la carcasa en los animales experimentales. Concretamente el peso de la carcasa, mediciones de la grasa posterior, el peso testicular (cuando sea apropiado) y se determinó la longitud de la glándula bulbouretral (BU) en cada grupo. Las medias de las medidas pueden observarse en la Tabla 10. La glándula BU depende de la testosterona para mantener su forma y función.
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TABLA 10
Grupo de tratamiento Peso de la carcasa Fac posterior Peso testicular Longitud de BU
(kg) (mm) (g) (cm)
LKT-GnRH (n=10) 90,4 24,5 (18-32) 261 (145-480) 9,6 (8,0-11,0)
Castrados tardíos (n=6) 88,8 24,3 (18-32) - - - - - - 10,1 (8,8-12,1)
Verracos (n=7) 90,3 18,3 (15-26) 641 (450-800) 14,2 (11,9-16,5)
Capones (n=6) 83,6 28,0 (22-36) - - - - - - - - - - - - 
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Tal como se puede ver en la Tabla 10, tanto el peso testicular como la longitud de la glándula BU se redujeron significativamente en los animales inmunocastrados del Grupo j4 con relación a los verracos no tratados del Grupo 2, lo que indica que la composición de la vacuna LKT-GnRH era eficaz para reducir los niveles y/o efectos de la testosterona en suero en los animales vacunados.
Ejemplo 15 Predicción de los epítopes de células T en las moléculas recombinantes de LKT 352 y LKT 111
Con el fin de predecir los epítopes potenciales de células T en las secuencias polipeptídicas de leucotoxina empleadas en las quimeras LKT-GnRH de la presente invención, el método propuesto por Margalit y colaboradores (Margalit et al., J. Immuno. (1987) 138:2213) se realizó sobre la secuencia aminoacídica que corresponde a los números 1 hasta 199 de la molécula de LKT como se representa en la Tabla 11. Mediante el método en cuestión, la secuencia aminoacídica de la secuencia polipeptídica de leucotoxina se comparó con otras secuencias conocidas para inducir una respuesta de célula T y con patrones de tipos de aminoácidos que se cree que se requieren para un epítope de célula T. Los resultados de la comparación se representan en la Tabla 11.
Como se puede ver por los resultados predictivos así obtenidos, hay muchas secuencias cortas en el péptido leucotoxina que se identifican como epítopes potenciales de células T usando el criterio sugerido por Margalit et al (supra). Más particularmente, se identificaron 9 secuencias que tenían una secuencia (Cargada/Gly-Hidrofóbico-Hidrofóbico-Polar/Gly) (indicada como patrón "1" en la Tabla 11), y se identificaron 3 secuencias que tenían una secuencia (Cargada/Gly-Hidrofóbico-Hidrofóbico-Hidrofóbico/Pro-Polar/Gly) (indicada como patrón "2" en la Tabla 11). Por acoplamiento de estos datos con la actividad in vivo anti-GnRH producida por los dos sistemas de transporte de LKT 352 y LKT 111 en los Ejemplos 7 y 8 anteriores, se indica que los epítopes críticos de las células T son retenidos en la molécula acortada de LKT 111, y que aquellos epítopes probablemente están contenidos en la región N-terminal de las moléculas LKT 352 y LKT 111.
TABLA 11
Patrones de la secuencia de LKT correspondientes a los epítopes de células
Secuencias aminoacídicas que muestra el Patrón "1":
GTID (aa's 27-30)
GITG (aa's 66-69)
GVIS (aa's 69-72)
HVAN (aa's 85-88)
KIVE (aa's 93-96)
DLAG (aa's 152-155)
KVLS (aa's 162-165)
DAFE (aa's 171-174)
KLVQ (aa's 183-186)
GIID (aa's 192-195)
Secuencias aminoacídicas que muestra el Patrón "2":
RYLAN (aa's 114-118)
KFLLN (aa's 124-128)
KAYVD (aa's 167-171)
Ejemplo 16 Predicción de la estructura física de las proteínas de fusión LKT-GnRH obtenidas a partir del pCB122
Con el fin de predecir la estructura física de los epítopes de células B de las moléculas de fusión 8 copias de GnRH::LKT 111::8 copias de GnRH obtenidas a partir del constructo del pCB122, se analizó la secuencia aminoacídica del pCB122 (representada en las Figuras 9-1 hasta 9-6) usando métodos descritos previamente para determinar la estructura física de la proteína. Rost et al. (1993) J. Mol. Biol. 232;584-599, Rost et al, (1994)Proteins 19:55-72, y Rost et al. (1994) Proteins 20:216-226. En particular, la predicción se realizó por un sistema de redes neuronales donde los datos de entrada consistían en un alineamiento de secuencia múltiple. El análisis de redes se realizó usando el programa MaxHom (Sander et al. (1991) Proteins 9:56-68, donde el ensayo de la accesibilidad del solvente del residuo se tomó del Kabsch et al. (1983) Biopolymers 22:2577-2637. El análisis de la red neuronal evaluó cada aminoácido en la secuencia del pCB122, y se predijo si el residuo estaría presente como un lazo, hélice o estructura expuesta. En la predicción, se predijo que las 8 copias de la GnRH en el aminoácido terminal de la molécula pCB122 existían mayormente como estructura lazo, mientras que las 8 copias de la GnRH en el carboxilo terminal tienen una mezcla de estructuras predichas (lazo, hélice y residuo expuesto).
Estos datos sugieren que la inmunogenicidad potenciada observada en las moléculas de fusión 8 copias de
GnRH::LKT 111::8 copias de GnRH obtenidas del constructo del pCB122 puede estar relacionada con las diferentes estructuras tridimensionales de los antígenos GnRH en la molécula.
D. Aplicabilidad industrial
Las quimeras leucotoxina-GnRH de la presente invención son de uso en proporcionar inmunógenos que, cuando se administran a un huésped vertebrado, sirve para inmunizar al huésped contra la GnRH endógena, que a su vez actúa para inhibir la función reproductiva o capacidad del huésped.
A pesar de los usos específicos ejemplificados en esta especificación, las nuevas moléculas quiméricas reveladas aquí proporcionan una manera de obtener proteínas de fusión que comprenden más de un polipéptido GnRH, teniendo lugar en cualquiera de las repeticiones múltiples o en tándem, que se fusionan a epítopes inmunogénicos suministrados por la porción polipeptídica de leucotoxina de la molécula (y en algunos casos por secuencias peptídicas espaciadoras que tienen lugar entre las secuencias de GnRH seleccionadas). Las proteínas quiméricas en cuestión construidas mediante la presente invención proporcionan inmunogenicidad potenciada para las secuencias peptídicas fusionadas de la GnRH, dejando un huésped vertebrado inmunizado para soportar una respuesta inmune efectiva hacia GnRH endógena; efectuando una interrupción en la síntesis y liberación de las dos hormonas gonadotrópicas, la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante de folículos (FSH) y dejando al huésped temporalmente estéril. De esta manera, los nuevos constructos de leucotoxina-GnRH pueden ser empleados en vacunas de inmunosterilización para proporcionar una alternativa a los procedimientos de esterilización invasivos actualmente practicados en el mantenimiento de animales domésticos y de granja. Las moléculas de fusión leucotoxina-GnRH también pueden usarse para reducir la incidencia de tumores mamarios en sujetos mamíferos usando vacunas que contengan aquellas moléculas para bloquear las funciones ováricas tales como la producción de las hormonas ováricas estrógenos y progesterona. En gran medida de la misma manera, sujetos caninos y felinos inmunológicamente esterilizados no desarrollarán piometra (infección del útero), puesto que los animales inmunizados no producirán progesterona la cual predispone a esta condición.
Otros usos contemplados de las moléculas de fusión instantánea incluyen la población control, por ejemplo la interrupción de las capacidades de reproducción en poblaciones de roedores salvajes. En esta consideración, las moléculas de fusión LKT-GnRH se pueden usar como una alternativa a las medidas de control de población actualmente practicadas, como el envenenamiento y similares. Los productos de fusión de la invención instantánea pueden ser administrados en constructos que tienen ambos componentes de liberación lento y rápido. De esta manera, puede evitarse la necesidad de múltiples vacunaciones. Ya que la secuencia aminoacídica de GnRH está altamente conservada entre especies, se puede producir un producto vacuna de fusión sencillo leucotoxina-GnRH que presentará amplia efectividad cruzada entre especies.
Así, varias proteínas quiméricas que comprenden la leucotoxina fusionada a polipéptidos GnRH seleccionados han sido reveladas. Aunque realizaciones preferidas de la invención en cuestión se han descrito en detalle, se entiende que se pueden hacer variaciones obvias sin salir del espíritu y el alcance de la invención como se ha definido en las reivindicaciones adjuntas.
Depósito de cepas útiles en la práctica de la invención
Un depósito de cultivos biológicamente puros de las siguientes cepas se hicieron con la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. El número de acceso indicado se asignó después de testar la viabilidad con éxito, y después de pagar las cuotas requeridas. El depósito se hizo bajo las provisiones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de proceso de Patente y sus regulaciones (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de los cultivos viables durante un periodo de treinta (30) años desde la fecha de depósito y al menos cinco (5) años después de la mayoría de peticiones recientes para el abastecimiento de una muestra del depósito por el depositario. Los organismos se harán disponibles por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, que asegura la disponibilidad permanente y no restringida de los cultivos a quien lo determine el Comisionado de Patentes y marcas registradas Estadounidense para ser titulado de acuerdo con 35 USC \NAK122 y las reglas del Comisionado siguiendo las mismas (incluyendo 37 CFR \NAK1,12). Bajo la concesión de una patente, todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los cultivos depositados serán irrevocablemente eliminadas.
Estos depósitos son proporcionados meramente como conveniencia a aquellos entendidos en la materia y no son una admisión que un depósito sea requerido bajo 35 USC \NAK112. Las secuencias de ácidos nucleicos de estos plásmidos, así como las secuencias aminoacídicas de los polipéptidos codificados así, se incorporan así por referencia y se controlan en el caso de algún conflicto en ésta descripción. Es necesaria una licencia para hacer, uso, o vender los materiales depositados, y tal licencia no se concede aquí.
Nº. cepa Fecha depósito Nº. ATCC
P. haemolytica serotipo 1 B122 1 Febrero, 1989 53863
pAA101 en E. coli JM105 1 Febrero, 1989 67883
pAA352 en E. coli W1485 30 marzo, 1990 68283
pCB113 en E. coli JM105 1 Febrero, 1995 69749
pCB111 en E. coli JM105 1 Febrero, 1995 69748

Claims (11)

1. Una proteína quimérica que comprende un polipéptido leucotoxina fusionado con el primero y segundo multímero, en donde el C-terminal del primer multímero se fusiona con el N-terminal del polipéptido leucotoxina y el N-terminal del segundo multímero se fusiona con el C-terminal del polipéptido leucotoxina, y además en donde cada uno de dichos multímeros comprende más de un polipéptido GnRH seleccionado, en donde dicha proteína quimérica comprende la secuencia aminoacídica representada en las Figuras 9-1 hasta 9-6, o una secuencia aminoacídica en donde al menos el 90% de los aminoácidos coincide con la longitud definida de la molécula representada en las Figuras 9-1 a 9-6 y dicha secuencia aminoacídica es funcionalmente equivalente a la misma.
2. La proteína quimérica de la reivindicación 1 en donde la proteína consiste en la secuencia aminoacídica representada en las Figuras 9-1 hasta 9-6.
3. Una composición de vacuna que comprende la proteína quimérica de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. Un constructo de DNA que codifica una proteína quimérica que comprende la secuencia aminoacídica de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, dicho constructo de DNA comprende:
una primera secuencia nucleotídica que codifica el primer multímero de GnRH; y
una segunda secuencia nucleotídica que codifica el segundo multímero de GnRH;
en donde dicha primera y segunda secuencias nucleotídicas están operativamente unidas por una tercera secuencia que codifica un polipéptido leucotoxina.
5. Un cassette de expresión que comprende:
(a) el constructo de DNA de la reivindicación 4; y
(b) secuencias control que dirigen la transcripción de dicho constructo por lo que dicho constructo puede ser transcrito y traducido en una célula huésped.
6. Una célula huésped transformada con el cassette de expresión de la reivindicación 5.
7. Un método de producción de un polipéptido recombinante que comprende:
(a) proporcionar una población de células huésped de acuerdo con la reivindicación 6; y
(b) cultivar dicha población de células bajo condiciones por las que el polipéptido codificado por dicho cassette de expresión se exprese.
8. Una proteína quimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 3 para el uso en esterilización inmunológica de un sujeto vertebrado.
9. El uso de una proteína quimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 3 para la elaboración de un medicamento para esterilizar inmunológicamente un sujeto vertebrado.
10. Una proteína quimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 3 para el uso en la reducción de la incidencia de tumores mamarios en un sujeto mamífero.
11. El uso de una proteína quimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 3 para la elaboración de un medicamento para la reducción de la incidencia de tumores mamarios en un sujeto mamífero.
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