WO2019202193A1 - Kit de detección de lactosa y procedimiento de detección mediante aplicación del mismo - Google Patents

Kit de detección de lactosa y procedimiento de detección mediante aplicación del mismo Download PDF

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WO2019202193A1
WO2019202193A1 PCT/ES2019/070264 ES2019070264W WO2019202193A1 WO 2019202193 A1 WO2019202193 A1 WO 2019202193A1 ES 2019070264 W ES2019070264 W ES 2019070264W WO 2019202193 A1 WO2019202193 A1 WO 2019202193A1
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lactose
solution
separation
sample
strip
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PCT/ES2019/070264
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Inventor
Florenci CUTRINA SABORIT
Original Assignee
Cutrina Saborit Florenci
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography

Definitions

  • the present invention corresponds to the technical field of the test of lactose detection, in particular a detection kit on surfaces, water and food, and the method of carrying it out.
  • Lactose is a sugar formed by the union of one molecule of glucose and another of galactose. It is present, in different proportions, in all mammalian milks (cow, goat, sheep) and, therefore, in many prepared foods, derivatives and additives.
  • Lactose intolerance is a digestive disorder caused by deficiency in e! Small intestine of an enzyme called lactose, which is responsible for the splitting of lactose into the two simple sugars that compose it. When this conversion does not occur, lactose malabsorption is generated, causing various symptoms such as abdominal pain or pain, bloating, diarrhea, constipation and / or vomiting.
  • lactose intolerance should follow a lactose-free or low-lactose diet (in: funeration of the degree of intolerance), which is why and, based on the scientific opinion of the European Security Authority Alimentaria (EFSA), on the maximum lactose contents in lactose intolerance and gaiactosemia, the Spanish Agency for Consumer Affairs, Food Safety Nutrition (AECOSAN) has adopted guidelines for lactose content for "Lactose-free" designations (Products with a lower lactose content of 3 ⁇ 40!%) "Low lactose content” (Products with a lower lactose content of 1%).
  • EFSA European Security Authority Alimentaria
  • the detection of lactose through biosensors is easy to use and it follows the specificity of detection of lactose in relation to other sugars that the sample may have, however, it presents as main drawbacks the price of the equipment and consumables and it limits of detection, which is above 1 QQ ppm, which is the limit currently set by law.
  • the enzymatic method relies on the enzymatic breakdown of ia lactose to analyze one of the two sugars that form, galactose. It is an effective method for the exact quantification of the amount of lactose that a sample has, however it presents difficulty in handling, in the calibration adjustments, in fas limitations that work with enzymes entails (it must be kept at freezing temperatures and refrigeration) and the need for a spectrophotometer, which has a high price that cannot be allowed by all companies: companies.
  • The: reference document RU2396S80C1 defines a: method of identification of carbohydrates, which implies the determination of the content: of giucósa, lactose, galactose, fructose and tagatose through chromatography in thin hood in Sórdfil plates.
  • the plates are pre-saturated with a solution of sodium dihydrophosphate (NaH2PG4): O ⁇ moi / mS and then dried.
  • a mycrojeringa is used to collect 0.001 cm3 of carbohydrate solution which is then deposited in the starting line on the chromatographic plate, dried in air and lowered to a solvent,
  • the solvent used is a mixture of acetone, alcohol Isopropyl and a solution of lactic acid ta chromatographic separation takes 80 to 80 minutes.
  • the solvent reaches the limit of elution, the plate is dried again at room temperature until complete evaporation of the solvent.
  • this document aims to identify the presence of carbohydrates in a sample, but at no time is the detection limit of the method determined. That is, not indicated euá! It is the minimum value of the substances that can be detected with this method, so that if lactose is not detected, it may be that it does not exist in the sample or that it exists in an amount that is not detected by this method and without However, it is above fas lOOppm in the : initial sample.
  • a data extracted from the document such as the amount of sample used of 1 microliters, indicates: that you are working with carbohydrate concentrations higher than the OOPpm that currently mark: the limit in the legislation.
  • the length that travels: the sample in the strips of visualization is high, assuming times that oscillate between 80 and 90 minutes, excessive in the practice, because they reduce productivity.
  • Another drawback is that it uses complicated handling reagents, because they are corrosive, carcinogenic or harmful. In addition, it adapts more to a laboratory method in which parameters have to be adjusted, impregnate plates ... and not a quick kit that can be used: by any company, in laboratories without large requirements of facilities and machine * to know these parameters quickly and easily *
  • the reference document CN1067Q6798A defines a method to determine the lactose content that involves dissolving the sample to be measured in water: deionized by ultrasound to obtain a mixed solution that is transferred to a volumetric flask and centrifuged. The dissolution and transfer process is repeated and the sample is replaced with a lactose standard to obtain a standard solution, using liquid chromatography to obtain the retention time and peak area of each substance,
  • Liquid chromatography for the separation of carbohydrates is effective: for a: wide range of samples * however there are important limitations : for use in the food industry.
  • the level of equipment / machinery necessary to carry out is a great inconvenience since more than 90% of the food business fabric are Small and medium businesses and many can afford the use of this type of techniques.
  • the technical level of the required personnel would be able to carry out this technique, once again the majority: of companies I do not know how to allow it. And finally , a large number of samples to be analyzed is required so that a laboratory could consider establishing such a technique.
  • This patent is also aimed at detecting lactose in: anima feeding! ⁇ mainly to leehonesj, the sensitivity limits being completely different than in food: human.
  • Reference document C 107315053A define a method of analysis again by liquid chromatography to detect the appropriate amount of galactose, glucose, lactulose, sucrose and lactose reference standard.
  • Reference document G 105723216A determines a method of quantifying galacto-oligosaccharide detection in a sample that involves reacting a sample comprising galactQ-ollgosaccharides and dextrirra with derivatization reagent, derivatizing dexyrin and galacto-oligo-accharides in the sample separating the Gaiacto-oligosaccharide component in the sample by high performance liquid chromatography using reverse phase 3QG column chromatography.
  • the reference document CN10746266QA presents a chromatography: of ionic Intercdmb ⁇ D that presents the same limitations as in the previous cases. This document focuses on the detection of galacio-oligosaccharides in baby food and powdered milk.
  • Reference document QM1 Q6645132A uses an enzymatic method that decomposes ia: lactose in its monpsaccharides to measure galactose by chromogenic method (with a series of reagents the presence of color galactose is achieved). It is completely oriented to human samples and it is a type of methods that are usually totally qualitative, that is to say they value the presence / absence but it is difficult to make a color change adjustment to assess the existence of a certain concentration.
  • JP200817G428A makes an improvement of the technique of high performance liquid chromatography for the detection of traces of sugars and alcohols derived therefrom.
  • the improvement consists in introducing a UV detector at the end of the chromatography and benzoillary column ios sugars / alcohols so that they absorb in UV ⁇ by themselves they do not). It has the same technical, personal, etc., limitations as in the previous documents,
  • Reference document JPS5651883A refers to a method for analyzing sugars, qualitatively and quantitatively by thin layer or paper chromatography, mainly in human samples (although it also names the food) and application of ultraviolet ray® after spraying the solution. . It is a method that is not considered as a: quick analysis kit and easy to use for people who do not expressly have high experience in thin hood chromatography.
  • reference document ES23S1733 is an industrial separation system of different components based on the serial use of different packed columns. It is not at any time to obtain a rapid lactose detection kit that can be used by food companies.
  • the lactose detection kit, on surfaces, water and food, on a sample obtained therefrom that is proposed here : comprises an extraction solution of the: lactose in the sample, where said extraction solution is contained in a container of extraction and presents an amount of lactose between 0 and 50 mg / i.
  • This extraction solution has 3 main melts that are to extract the lactose from the sample by dissolution in aqueous phase, precipitate and agglutinate the proteins and small peptides that the sample can contain to avoid interference in later parts, and adjust the sensitivity of the kit at a certain concentration based on the lactose content of the sample and the dilution applied thereto, through the addition of a small amount of lactose.
  • the kit also comprises a separation solution and a hermetic separation chamber for placement thereof, where the separation system is formed by a mixture containing at least one suitable solvent for the separation of sugars,
  • It also comprises a strip of lactose separation from other soluble compounds in the sample, by chromatography.
  • the separation solution helps separate the lactose from other components of the sample and concentrate it in a very specific area of the strip, in the form of a band.
  • the kit also has a first containment container with a first visualization solution and at least one second containment container with a second visualization solution.
  • the first solution consists of at least P ⁇ anisaldehyde and the second solution is formed by a mixture of sulfuric acid and absolute eianol.
  • a sprayer is also provided for mixing the first and second visualization solutions Liste
  • the mixture of both vkualtzaoión solutions has the function of developing agent of the separation strips, so that it allows to visualize different spots corresponding to the different compounds of the analyzed sample. Due to the instability of the mixture, they are presented as two separate solutions that are mixed just in the moment prior to use.
  • the kit has a lactose pattern formed by a mixture of distilled water, lactose in a proportion greater than: 1 Sppm and a preservative.
  • This pattern has a first major function! consisting of the inferno quality control in each of the trials.
  • the use of the lactose pattern makes it possible to ensure that the separation and visualization phases have been carried out in an appropriate manner, thus eliminating the obtaining of false negatives:
  • the pattern has a second main function that resides in that it facilitates the visualization of the results, given that the stain left by the pattern on the separation strip allows us to know exactly the height at which the lactose stain should appear. of the sample in case it contains lactose. There are factors such as humidity, temperature, the sample itself ... that can vary slightly the final height of the spots so that e! Lactose pattern allows to focus in each case what the value to be obtained should be in case of the existence of lactose.
  • This report proposes to: turn a lactose detection procedure, on surfaces, water and food, by applying a detection kit as defined previously.
  • the first phase is the obtaining of a sample and the homogenization of the same.
  • the second phase is formed by the introduction of the separation solution inside the separation chamber and hermetically sealed chamber for a time between 15: 30m: in. It is important to preserve the separation solution inside the separation chamber for a time prior to its use, so that: the solvent mixture of the liquid phase saturates the gas phase of the chamber.
  • the third phase consists of placing an amount of 5 ml of the result of obtaining and homogenizing the sample, in a strip of separation, in the first indicative mark of the sample placement line, Likewise, as a fourth phase, the placement of an amount of 5 m ⁇ of the lactose pattern is carried out, on the same separation strip, on the second mark indicative of the sample placement line.
  • the fifth phase consists of a first drying of the separation strip at a temperature between 98 and 115 °, for a time between 30s and 10min.
  • the sixth phase of insertion of the separation strip into the separation chamber is closed and closed again :, for a time between 20 and 30 rri ⁇ n, where the separation strip is arranged with an angle of inclination and oriented such that the first side is in a lower position with respect to the second: it will be late!
  • Said separation strip must then be subjected to a seventh phase formed by a second drying at a temperature between 90 and 115 °, for a time between 30s and 1Qmin;
  • the eighth phase is the introduction of the total of the second vlsuailization solution contained in the second containment vessel, in a sprayer and, subsequently, the introduction of 0.1 ml of the total of the first visualization solution contained in the first containment vessel, over the previous one in the same sprayer and, agitated from the mixture.
  • the development phase of the separation strip is carried out for a time between 5 and 15 mln, at a temperature between 100 and 120 °, and a final phase of interpretation of the results.
  • This kit it is possible to carry out a control of the efficiency of cleaning on work surfaces and GiP systems, that is, on-site cleaning systems, without disassembling equipment: ni: pipes, in addition to validating the production chain by semi-laboratory analysis and produce finished and release finished product.
  • This kit is based on the principles of thin layer chromatography for the separation and detection of lactose in surfaces, water and food. Memas to extract lactose from the analysis matrix, separates the rriisma from other soluble components and visualizes the presence or absence. Give lactose in the sample.
  • the kit adjusts the sensitivity of the kit to a certain concentration of lactose, by adding a small amount of it.
  • the minimum value allowed to be able to consider a “lactose-free” sample is 180ppm according to the legislation, the kit adjusts to these values, but if the minimum value varies, the kit would be prepared. with upé appropriate sensitivity for the new value.
  • the proposed kit and its application procedure achieve not only the detection of the existence or absence of lactose, but also and as a significant advantage, it achieves the identification of the amount of lactose with a cut-off point at the limit legal , which is currently lOQppm,: to name a product "lactose".
  • a controlled drying is carried out at high temperatures, by means of a heater, oven or similar, so that on the one hand a faster process realization is achieved on the other a standardization of drying at the same performance conditions, which subsequently affects the results obtained.
  • this kit separates the possible: amount of lactose in the sample and does not act on other substances, so the separation process is faster and has a duration about 25-30 minutes, compared to 80-90 minutes of other processes.
  • the kit presents all the elements that are required for the detection of lactose, none of them being a harmful material that should be handled, with extreme caution, so it is a sep ⁇ lfo kit that can be used per person! that you don't necessarily have to have a special quantification for eito.
  • kits very effective, suitable for application: in different conditions of temperature and humidity, depending on where it is used, as the application of! pattern: lactose provides the measure in each case in particular according to the environmental and concrete conditions of the measurement. This is a relevant advantage over the method: standard thin layer chromatography, since having to maintain the same environmental conditions is always an important limitation.
  • Figure 1 shows a plan view of a lactose separation strip, for a preferred embodiment of the invention.
  • Figures 2 1 to 2.4.- Shows a plant view of lactose separation strips in which the results obtained respectively have been positive, negative, and two possible cases of invalid, for a preferred embodiment of the invention.
  • Figure 3.1 and 3.2 It shows elevation views and profile of the separation chamber in the phase of introduction of the separation strip into a lactose separation strip, for a preferred embodiment of the invention.
  • Figure 4. Shows a block diagram of! lactose detection procedure, on surfaces, waters and foods, by means of a kit as defined, for : a preferred embodiment of the invention.
  • the lactose detection kit on surfaces, water and food, on a sample obtained therefrom; presented here, it includes several elements that are detailed below.
  • the extraction solution comprises a lactose extraction solution from the sample, wherein said extraction solution is contained in an extraction vessel and has an amount of lactose comprised between 0 and SO mg / l.
  • said extraction solution is contained in an extraction vessel and has an amount of lactose comprised between 0 and SO mg / l.
  • it is necessary to provide a greater or lesser quantity of lactose then: if it presents 1 ÜOppm, when the amount is diluted it decreases and is more difficult to detect, since it can be below the minimum amount necessary for subsequent yisualization in the; separation strip (19), so that the lactose supply of the extraction solution allows detection to be possible.
  • the sample to be analyzed comes from a food.
  • the extraction solution comprises, in addition to lactose, distilled water, a preservative formed by benzoic acid and a deproteinization reagent formed by zinc acetate, sodium fungstate, sulfuric acid, phyoroacetic acid, peroric acid, ether or acetone.
  • the deproteinization reagent used is zinc acetate.
  • the detection kit also comprises a separation solution (17) and a sealed separation chamber (18;) for placement thereof.
  • This separation solution (17) is formed by a: mixture containing at least one solvent suitable for the separation of sugars.
  • the separation solution (17) is formed by a solvent which in particular is acetone and also comprises distilled water.
  • the solvent may be formed : by ethyl acetate, isopropanol, N-Bufanoi, phosphate lamp, methane !, chloroform, ammonium hydroxide, acetic acid and / or N-propanol
  • this kit also has a separation strip (19) of the lactose with respect to other compounds soluble in Ja : sample, by chromatography.
  • This separation strip (19) has a rectangular shape with a first and second sides ⁇ 19,1, 19.2) of shorter lengths.
  • the invention allows the separation strip (19) of the lactose to be composed of a silica gel croatatofolio: 60, but in other embodiments it may be composed of kieseiguhr cellulose, or a combination of silica gel and kieseiguhr,
  • the separation strip (19) of lactose has an impregnation of sodium acetate, but in other modes of: embodiment in which the composition of the separation strip is different, it may have an impregnation in sodium borate, boric acid or bisulfite of: sodium
  • the separation strip (19) of the lactose has on the first line (20) of placement of the sample, a first and a second mark (22, 23) indicative of the place of placement of the sample and lactose pattern, respectively, where both first g second marks (22, 23): indicative are: separated from each other.
  • the detection kit comprises a first containment container with a first visualization solution and at least a second containment container with a second visualization solution.
  • the first solution is formed at least by P-aisaidehyde, being in this embodiment formed only: by P-anisaidehtdo and, the second solution is formed by a mixture of sulfuric acid and absolute ethanol :.
  • the first containment container of the first display solution comprises an amount between 2 and 3 mJ thereof, in this case being 2.5ml and, the second container of Containment of the second solution comprises a 1.8 ml ezeia of absolute ethane and 0.1 ml of sulfuric acid.
  • detection kit comprises a first containment container: and 25 second containment containers, so that it is valid to perform 25 detection tests.
  • the kit may contain different, valid quantities: for a different number of detection tests.
  • the kit also comprises a sprayer for the first and second mezeiado of the visualization solutions and a lactose pattern formed by a mixture of distilled water, lactose, in a proportion: greater than 15 pprn and a preservative.
  • a lactose standard with a concentration of 1 / GQppm thereof.
  • the preservative of the lactose standard is formed by benzoic acid.
  • This report also proposes a method of detecting lactose, on surfaces, water and food, through the application of a detection kit as defined previously,
  • This procedure presents a first phase consisting of obtaining and homogenizing (1) a sample.
  • said obtaining and homogenization phase (1) of the sample comprises a first stage of removal or crushing (2 ) of food.
  • said first phase comprises a second introduction stage (3) of a portion of the sample in an extraction vessel containing an extraction solution to then stir the container until homogenization of! set and, a third stage of filtering: (4) of the previous homogenized set, by means of a paper of! filter.
  • Rare elf the portion of the sample to be used is between 0.5 and 1g, because it is a solid food (AS). In this embodiment we take 0.5g,
  • the product to be analyzed is a liquid (AL) or semi-liquid food
  • the second and third stages are the same as in the case of solid foods (AS), and the sample portion to use is 2rn !.
  • the phase of obtaining and homogenization (1) of the sample comprises : a first stage of taking a swab (5.1), moistened (5.2) thereof with extraction solution and rubbing (5.3) of an area of the surface to be tested equivalent to 5em 8 and, a second and third stages equal to the previous cases, the sample portion being used to use one end of the swab.
  • the obtaining and homogenization phase (1) of the sample comprises a first taking stage: of a direct quantity (6) of the same and a second and third stages equal to the previous cases, the sample portion being 2 l
  • the second phase consists of the introduction (7) of the separation solution (17) into the separation chamber (18) and its sealing during a Fever between! 5 and 30min. In this preferred embodiment of the mention, a time of 2Qmin is maintained.
  • the fifth phase consists of a first drying (10) of the separation strip (19) at a temperature between 90 and 115 °, for a time between 3Qs and 10min.
  • drying is carried out by means of a heater at a temperature of 1ÜG3 ⁇ 4, for 45s.
  • the separation strip (19) must be positioned as shown in Figures 3.1 and 3.2, with an angle of inclination and oriented such that the first side (19.1) is in a lower position relative to the second side (1Q.2 ).
  • the separation strip is kept inside the separation chamber for a period of 26rnin.
  • the separation solution (17) ascends through the separation strip: (19), to the second line (21) at the end of the rise of the separation solution (17),
  • the seventh: phase consists of a second drying (12) at a temperature between: 90 and US 0 , for: a time between 30 seconds.
  • drying is carried out by means of a heater at a temperature of Q0 0 C, for 6min,
  • the amount of the second visualization solution contained in the second containment vessel has been indicated to be a mixture of 1.8 ml of absolute eta and 0.1 ml of sulfuric acid. This The amount contributed is the one necessary to carry out a test. Also, to this second solution, once. it is introduced into the sprayer, 0.1 ml of P-anisaidehyde is added, which is taken with a pipette of the total of the first solution: of visualizations contained in the first container.
  • the ninth spray phase (14) is carried out uniformly of the separation strip (19) with the mixture of the first and the second visualization solutions.
  • the ; separation strip (19) is sprayed until it is soaked and proceeds to an eleventh development phase (15) of the strip: separation for a time between 5 and 15 in, at a temperature between 100 and 120 °, In this preferred embodiment of the invention, the development takes place during: I Qffiin, a temperature: e 110 ° C.
  • the lactose spot (24) that appears on the separation strip (19) as eonse Lactose standard management, will show the height at the that a similar band (25) should appear for the sample, in the case that this sf presents lactose in a proportion equal to or greater than) limit: of the legislation, in this case 100ppm.
  • the rest of the spots (26) that appear on the vertical corresponding to the sample represent the different carbohydrates of the analyzed sample.

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Abstract

El kit ele detección de lactosa en superficies, aguas y alimentos comprende: una solución de extracción; una solución de separación (17'); una tira de separación (19) de la lactosa mediante cromatografía, con una primera línea (20) de colocación de la muestra, y una segunda línea (21): de fin: de subida de la solución; una primera y una segunda soluciones de vísualización; un pulverizador y; un patrón de lactosa. El procedimiento de detección de lactosa comprende; obtención y homogeneización (1) de muestra; introducción (7): de solución de separación (17) en cámara; colocación (8) de 5 pl del filtrado en una tira de separación (19); colocación (9) de 5 pl del patrón de lactosa; primer secado (10); introducción: (11) de tira, de separación (19) en cámara; segundo secado (12); introduccíón (13) soluciones de visualización en pulverizador; pulverización (14): de la tira de separación (19); revelado (15); e interpretación (16) de los resultados,.

Description

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Campo técnico e la invención
La présente invención corresponde al campo técnico cié Jos test cié detección de lactosa, en concreto a un kit de detección en superficies, aguas y alimentos y, el procedimiento de realización del mismo.
Antecedentes de la Invención
La lactosa es un azúcar formado por la unión de una molécula de glucosa y otra de galactosa. Se encuentra presente, ef¡ distintas proporciones, en todas las leches de los mamíferos (vaca, cabra, oveja) y, por tanto, en muchos alimentos preparados, derivados y aditivos.
La intolerancia a ja lactosa es un trastorno digestivo causado por la deficiencia en e! intestino delgado de una enzima denominada lactosa, que es la encargada del desdoblamiento de la lactosa en los dos azúcares simples que la componen. Cuando no se produce esta conversión se genera una malabsorción de la lactosa, provocando diversos síntomas co o dolor abdominal, distensión, diarrea, estreñimiento y/o vómitos.
Las personas: diagnosticadas con intolerancia a la lactosa deben seguir una dieta libre de lactosa o de bajo contenido en lactosa (en: funeión de! grado de intolerancia), motivo por el cual y, en base al dictamen científico de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), sobre los contenidos máximos de lactosa en la intolerancia a la lactosa y la gaiactosemia, la Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaría Nutrición (AECOSAN) ha adoptado orientaciones de contenido en lactosa para las denominaciones "Sin Lactosa" (Productos con un contenido inferior de lactosa del ¾0!%) “Bajo contenido en lactosa" (Productos con un contenido inferior de lactosa del 1%).
En la actualidad por tanto, existe una necesidad de comprobación de ¡os niveles de contenido en lactosa, tanto para los alimentos como para las superficies en los que se trata ios mismos y las aguas de limpieza de dichas superficies.
Estas comprobaciones deben resultar Jo más rápidas posible, para entorpecer lo mínimo el proceso productivo y, no deben resultar muy costosas, para que el precio no resulte un impedimento en la realización de estas comprobaciones por parte de las empresas.
: En el estado de la técnica existen kfis^r ., ermiten detectar proteínas de la leche a través de métodos relativamente rápidos corno ELISA. Esta gran familia de análisis está relacionada con mostrar ia contaminación de productos que contienen leche, pera no: tiene nada que ver con ía detección de lactosa, pues en estos Kits se busca evitar una reacción alérgica respecto a ¡as proteínas de la leche, que pueden estar presentes en productos con o sin lactosa, mientras que en la detección de la lactosa se busca evitar ios sintomas consecuencia de la intolerancia a este azúcar compuesto.
Existen distintas alternativas en el mercado respecto a la detección de lactosa en superficies, aguas y alimentos, corno por ejemplo ios biosensores y el método enzimátieo.
Asi pues, la detección de lactosa medíante biosensores resulta fácil de usar y co nsigue la especificidad de detección de la lactosa res pecio a oíros azúcares que puede tener ía muéstr No obstante, presenta como inconvenientes principales el precio de los equipos y consumibles y él limíte de detección, que se sitúa por encima de las 1 QQ ppm que es el ¡imite actualmente fijado por la legislación.
Por otra parte, el método enzimátieo se basa en la rotura enzimática de iá lactosa para analizar uno de los dos azúcares que ta forman, la galactosa. Es un método eficaz para la cuantificación exacta de la cantidad de lactosa que tiene una muestra, no obstante presenta dificultad en la manipulación, en ios ajustes de calibración, en fas limitaciones que supone el trabajo con enzimas (hay que conservar a temperaturas de congelación y refrigeración) y en la necesidad de disponer de un espectrofotómetro, que presenta un precio elevado que no pueden permitirse todas ias: empresas.
Pueden mencionarse los siguientes documentos de! estado de la técnica RÜ2398560CÍ , CN106706798A, CN107315053A, GN10523216Á, CN 107462660A, CN106645132A, JP2008170428A, JPS5651 dd3A y ES2381733.
El: documento de referencia RU2396S80C1, define un: método de identificación de hidratos de carbono, que implica ia determinación del contenido: de giucósa, lactosa, galactosa, fructosa y tagatosa a través de cromatografia en capá fina en placas Sórdfil.
Las placas se pre-saturan con una solución de dihidrofosfato de sodio (NaH2PG4): O^ moi/ mS y luego se secan. A continuación, se usa una mícrojeringa para recoger 0,001 cm3 de solución de carbohidrato qué luego se deposita en Ja linea de partida en ia placa cromatográfica, se seca en aire y se bajá á úrt disolvente, El disolvente utilizado es una mezcla de acetona, alcohol ísopropílico y una solución de ácido láctico ta separación cromatográfica tarda de 80 a 80 minutos. Cuando eí solvente alcanza el limite de elución, ia placa se seca nuevamente a temperatura ambiente hasta la evaporación completa del solvente.
En este documento, se utilizan dos ejemplos para demostrar que el método propuesto es mejor que otro método dé cromatografía, pero la comparación la realizan can distintas condiciones, pues para la comprobación dei método anterior utilizan una matriz alimentaria real, en concreto un yogurt, a la que aplican un proceso de eromatcig rafia de capa fina con distintos reactivos dé impregnación de placa, solventes, solución de revelado.., , mientras que: en la comprobación de! método propuesto en el documento utilizan una mezcla pura dé laboratorio de distintos carbohidratos. Dé éste modo, no se está realizando ambos métodos con igualdad de condiciones, dado que el comportamiento de una matriz rea! no es el mismo que el de u a matriz de laboratorio, pues existen múltiples: componentes en la matriz que pueden influir en e! resultado final.
Además, en este documento se pretende identificar la presencia de carbohidratos en una muestra, pero en ningún momento se determina el límite de detección dei método. Es decir, no se indica euá! es eí valor mínimo de las sustancias que es posible detectar con este método, de manera que en caso de no detectarse la lactosa, puede ser que no exista en la muestra o bien que exista en una cantidad que no resulta detectada por este método y sin embargo se encuentra por encima de fas lOOppm en la: muestra inicial. Es por tanto un procedimiento que no permite la detección de presencia o ausencia de tos carbohidratos en una concentración determinada, por lo que no resulta válido para el objeto de esta invención, que es poder determinar que la cantidad de lactosa de una muestra; es inferior o superior al valor mínimo permitido para poder considerar un alimento“sin lactosa’- o "con bajo contenido en lactosa'1.
Así mismo, un dato extraído del documento, como es la cantidad de muestra utilizada de 1 microlitres, indica: que está trabajando con concentraciones de carbohidratos superiores a las l OOppm que actualmente marcan: el límite en la legislación.
Además, al tratar de separar todos ios carbohidratos, la longitud que recorre: la muestra en las tiras de visuaíizacíón es elevada, suponiendo tiempos que osciian entre 80 y 90 minutos, excesivos en la prácuca, pues reducen la productividad.
En este método además dado que se presenta para mezclas ideales de laboratorio, no propone un pretratamíenío de la muestra consistente en la: extracción de la lactosa cíe la muestra por disolución, medíante precipitación de proteínas y péptídos. Resulta además un método que se dilata: excesivamente en el tiempo, debido aí secado a temperatura ambiente, Esto además resta estandarización al método, dado que cada analista puede considerar una placa seca tras un tiempo distinto de secado.
Otro inconveniente es que utiliza reactivos de manipulación complicada, por ser corrosivos, cancerígenos o nocivos. Además, se adapta más a un método de laboratorio en eí que hay que ajustar parámetros, impregnar placas... y no a un kit rápido que pueda utilizarse: por cualquier empresa, en laboratorios sin grandes requisitos de instalaciones y maquinarla* para conocer estos parámetros de un modo rápido ysencillo*
Ei documento de referencia CN1067Q6798A define un método para determinar ei contenido de lactosa que implica disolver la muestra que se va a medir en agua: désionizada por ultrasonidos para obtener una solución mixta que se transfiere a un matraz volumétrico y se centrifuga. Se repite él proceso de disolución y transferencia y se reemplaza la muestra con un estándar de lactosa para obtener una solución estándar, utilizando cromatografía liquida para obtener ei tiempo de retención y área pico de cada sustancia,
La cromatografía liquida para la separación de los carbohidratos se muestra efectiva: para un: amplio rango de muestras* sin embargo existen limitaciones importantes: para darte uso en la industria alimentaria. Por u lado el nivel de aparatos/rnáquinaria necesarios para llevaría a cabo (aplicación de ultrasonidos, ordenador dedicado, columna de cromatografía, centrífuga, etc...), suponen un gran Inconveniente dado que más de un 90% del tejido empresarial alimentario son pequeñas y medianas empresas y mu pocas pueden permitirse el uso de este tipo dé: técnicas. Por otro lado el nivel técnico del personal requerido piara poder llevar a cabo esta técnica, una vez más la mayoría: de empresas no sé lo pueden permitir. Y por ultimo,, se precisa un elevado número de muestras a analizar para que un laboratorio pudiera plantearse establecer una técnica de este tipo.
Esta patente, además, está orientada a detectar lactosa en: alimentación anima! {principalmente a leehonesj, siendo los límites de sensibilidad completamente distintos qué en alimentación: humana. El pretratamiento que debe realizarse a la muestra, mediante ultrasonidos,, centrífuga.. complica el instrumental.
El documento de referencia C 107315053A,:; define un método de análisis de nuevo mediante cromatografía líquida para detectar la cantidad apropiada de galactosa, glucosa, lactulosa, sacarosa y estándar de referencia de lactosa.
Presenta por tanto las mismas limitaciones técnicas, de personal, etc. ,, qué el documento anterior. Aunque en este caso el documento plantea un sistema de atomización para la detección de sustancias al final de la cromatografía líquida y está enfocado al control de la calidad de la lactos la investigación de sustancias relacionadas:.
El documento de referencia G 105723216A, determina un método de detección cuantificadón de galacto-óligosacándos en una muestra que implica hacer reacciona una muestra que comprende galactQ-ollgosacáridos y dextrirra con reactivo de derivatízacíón, derivatizar dexírina y galacto-olígosacáridos en la muestra separar el componente gaíacto- oligosacárido en ¡a muestra por cromatografía líquida de alta resolución usando fase reversa 3QG columna de cromatografía.
De nuevo el método presenta: las mismas limitaciones técnicas, de personal, etc... en este caso aún más debido a que: se utiliza HPLC, que es una técnica aún más avanzada que la cromatografía líquida, LC). Esta patente busca la detección de dos compuestos (galaeíG-oligosacáríefos} distintos a Ja lactosa, aunq ue uno es un deri vado de la misma.
El documento de referencia CN10746266QA, plantea una cromatografía: de IntercdmbíD iónico que presenta las mismas limitaciones que en los casos anteriores. Este documento se centra en la detección de galacío-oligosacáridos en alimentos para niños y teche en polvo.
El documento de referencia QM1 Q6645132A utiliza un método enzimático que descompone ia: lactosa en sus monpsacáridos para medir la galactosa por método cromogénico (con una serié de reactivos se consigue que la presencia de galactosa dé color). Está completamente orientado a muestras humanas y se trata de un tipo de métodos que suelen ser totalmente cualitativos, es decir que valoran la presencia/ausencia pero resulta difícil hacer un ajusfe de cambio de color para valorarla existencia de una concentración determinada.
El· documento dé referencia JP200817G428A realiza una mejora de la técnica de cromatografía líquida de alta eficacia para ia detección de trazas de azucares y alcoholes derivados de ios mismos. La mejora consiste en introducir un detector UV al final de la columna de cromatografía y benzoilar ios azúcares/alcoholes para que absorban en UV {por sí solos no lo hacen). Presenta las mismas limitaciones técnicas, personal, etc,,, que en ios documénfos anteriores,
E! documento de referencia JPS5651883A se refiere a un método para analizar azúcares, cualitativa y cuantitativamente mediante cromatografía de capa fina o de papel, principal mente en muestras humanas (aunque también nombra los alimentos) y Ja aplicación de rayo® ultravioleta tras la pulverización de ia disolución. Resulta un método que no está planteado como un: kit rápido de análisis y de fácil uso para gente que no tenga expresamente lina elevada experiencia en cromatografía de capá fina.
Finalmente, el documento de referencia ES23S1733 es un sistema de separación industrial de distintos componentes basándose en él uso en serie de distintas columnas empaquetadas. No se trata en ningún momento de obtener un kit de detección rápida de la lactosa que pueda utilizarse por empresas alimentarias.
No existe por tanto en el estado de la técnica un proceso que pueda: plantear la detección de la lactosa en superficies, aguas y alimentos mediante un ensayo rápido y sencillo que pueda presentarse como un ít rápido de detección, apto para Ja aplicación por cualquier empresa del sector sin que sea necesaria la especialízací6n de los operarios. Descripción de la invención
El Kit de detección de lactosa, en superficies, aguas y alimentos, sobre una muestra obtenida de los mismos que aquí se propone: comprende una solución de extracción de la: lactosa de la muestra, dónele dicha solución de extracción está contenida en un recipiente de extracción y presenta una cantidad de lactosa comprendida entre 0 y 50 mg/i.
Esta solución de extracción tiene 3 fundones principales que son extraer la lactosa de la muestra por disolución en fase acuosa, precipitar y aglutinar las proteínas y pépficios de pequeño tamaño que pueda contener la muestra para evitar interferencias en partes posteriores, y ajustar la sensibilidad del kit a una concentración determinada en función del contenido de lactosa de la muestra y la dilución aplicada a la misma, a través de la adición de una pequeña cantidad de lactosa.
Esta cantidad de lactosa que se aporta a la muestra permite aumentar la sensibilidad del método, consiguiendo detectar cantidades muy reducidas que permitan conocer la existencia de lactosa a partir de los niveles determinados por la legislación, que exceden de ia permitido en alimentos que se puedan considerar libres dé lactosa, Sin este aporté:, serla imposible ¡a detección de lactosa en las cantidades de trabajó utilizadas con esta técnica, dado que la muestra está diluida y no se permitiría: la detección.
El kit comprende además una solución de separación y una cámara de separación hermética para la colocación de la misma, donde la scjíueión de separación está formada por una mezcla que contiene ai menos un disolvente apto párá la separación de azúcares,
Asi mismo comprende una tira de separación de ia lactosa respecto a otros compuestos solubles en la muestra, mediante cromatografía.
la solución de separación ayuda a separar la lactosa de otros componentes de ta muestra y concentrarla en una zona muy determinada de ia tira de separación, en forma de banda.
El kit presenta además un primer recipiente de contención con una primera solución de visuatización y al menos un segundó recipiente de contención con una segunda solución de visualizaeión. La primera solución está formada por al menos P~ anísaldehido y la segunda solución está formada por una mezcla ele ácido sulfúrico y eíanol absoluto.
Se aporta igualmente un pulverizador para el mezclado de la primera y la segunda soluciones de visualizada».
Así pues, la mezcla de ambas soluciones de vkualtzaoión tiene la función de agente de revelado de las tiras de separación, de manera que permite visualizar distintas manchas correspondientes a los distintos compuestos de la muestra analizada. Debido a fa inestabilidad de la mezcla, se presentan como dos soluciones por separado que se mezclan justo en el momento previo a su uso.
Finalmente, eí kit presenta un patrón de lactosa formado por una mezcla de agua destilada, lactosa en una proporción mayor a: 1 Sppm y un conservante.
Este patrón tiene una primera función principa! consistente en el control de calidad inferno en cada uno de los ensayos. Así pues, el usó del patrón de lactosa permite asegurar que las fases de separación y visuaíización se han realizado de: forma adecuada, eliminando de este modo la obtención de falsos negativos:.
Asi mismo, el patrón presenta una segunda función principal que reside en que facilita la visuaíización de los resultados, dado que la mancha que deja el patrón en la tira de separación, permite saber exactamente la altura a ¡a que debe aparecer la mancha de lactosa de la muestra en casó de que contenga lactosa. Existen factores como la humedad, ia temperatura, ¡a propia muestra... que pueden hacer variar ligeramente la altura final de ¡as manchas por lo que e! patrón de lactosa permite centrar en cada caso cuál debe ser el valor a obtener en caso de la existencia de lactosa.
En esta memoria se propone a: su vez un procedimiento de detección de lactosa, en superficies, aguas y alimentos, mediante la aplicación de un kit de detección como el definido previamente.
Así pues, la primera fase es la obtención de una muestra y la homogeneízación de la: misma.
La segunda fase esta formada por ia Introducción de la solución de separación en el interior de la cámara de separación y cierre hermético de la misma durante un tiempo comprendido entre 15: y 30m:in. Es importante cotoeár la solución de separación en el interior de la cámara de separación durante un tiempo previamente a su uso, para: que la mezcla de disolventes de la fase líquida sature la fase gaseosa de la cámara.
A continuación, ¡a tercera fase consiste en la colocación de una cantidad de 5 mI dei resultado de la obtención y homogeneízación de la muestra, en una tira de separación, en ia primera marca indicativa de ia linea de colocación de la muestra, Igualmente, como una cuarta fase, se realiza la colocación de una cantidad de 5 mί del patrón de lactosa, en la misma tira de separación, en la segunda marca indicativa de la línea de colocación de la muestra.
La quinta fase consiste en un primer secado de la tira de separación a una temperatura comprendida entre 98 y 115°, durante un tiempo comprendido entre 30s y lOmin.
A continuación, se realiza la sexta fase de introducción de la tira de separación en el interior de la cámara de separación y cerrado de la misma de nuevo:, durante un tiempo comprendido entre 20 y 30 rriín, donde la tira de separación queda dispuesta con un ángulo de inclinación y orientada tal que el primer lateral está en una posición inferior respecto al segundo: latera!.
Dicha tira de separación debe someterse a continuación a una séptima fase formada por un segundo secado a una temperatura comprendida entré 90 y 115°, durante un tiempo comprendido entre 30s y 1Qmin;
La octava fase es la introducción del total de la segunda solución de vlsuaílzacíón contenida e el segundo recipiente de contención, en un pulverizador y, seguidamente introducción de 0,1 mi del total de ia primera solución de visuaíización contenida en el primer recipiente de contención, sobre la anterior en el mismo pulverizador y, ag itado de la mezcla.
Una vez preparada la mezcla de ambas primera y segunda soluciones de visuaíización, se lleva a cabo la pulverización cíe forma uniforme de la tira de separación con la misma.
Finalmente, sé realiza tina fase de revelado de la tira de separación durante un tiempo comprendido entre 5 y 15 mln, a una temperatura de entre 100 y 120° y, una última fase de interpretación de ios resultados.
Con el kit de detección de lactosa y ei procedimiento de detección mediante aplicación dei mismo que aguí se pro one: se obtiene una mejora significativa del estado de ia técnica.
Esto es asi pues se consigue un modo de detección de la lactosa tanto en alimentos como en aguas y superficies, rápido y dé fácil uso, que permite la: presentación del mismo en un kit que puede ser utilizado por personas que no precisan de una especíaíización para ello.
Con este kit es posible realizar un control de la eficacia de ia limpieza en superficies de trabajo y sistemas GiP, es decir, sistemas de limpieza in situ, sin desmontar equipos: ni: tuberías, además de validar la cadena de producción por análisis de semieiáborados y producid terminado y liberar producto terminado. Este kit se fundamenta en ios principios de la cromatografía de capa fina para la separación y detección de lactosa en superficies, aguas y alimentos Memas de extraer ja lactosa de la matriz de análisis, separa ia rriisma de Otros componentes solubles y visualiza ia presencia o ausencia dé la lactosa en la muestra.
Gracias a ia aplicación de una: solución de extracción, es posible ajustar la sensibilidad del kit a una concentración determinada de lactosa, mediante la adición de una pequeña cantidad de la misma. De este modo, dado que en !á actualidad el valor mínimo permitido para poder considerar una muestra“sin lactosa" es, de 180ppm según ia legislación, el kit se ajusta a estos valores, pero si ei valor mínimo variara, él kit se prepararía con upé sensibilidad apropiada para el nuevo valor.
De este modo ei kit propuesto y el procedimiento de aplicación del mismo consiguen no sólo la detección de ja existencia o no de lactosa, sino que además y como ventaja significativa, consigue la identificación dé ia cantidad de lactosa con un punto de corte ciaro ai límite legal,, que actualmente es lOQppm,: para poder nombrar un producto "sin lactosa”.
En la aplicación del kit para ia detección de: la lactosa, se realiza un secado controlado y a elevadas temperaturas, mediante un calentador, horno o similar, de manera que por un lado se consigue una mayor rapidez de realización del proceso por otro se logra una estandarización del secado ai unas mismas condiciones de realización, lo que repercute posteriormente en los resultados obtenidos.
En b referente a ia velocidad del proceso de separación, mediante este kit se separa la posible: cantidad de lactosa existente en ia muestra y no se actúa sobre el resto de sustancias, por lo que el proceso de separación es más rápido y tiene una duración de unos 25-30 minutos, frente a ios 80-90 minutos dé otros procesos.
Ademas, ei kit presenta todos ios elementos que se precisan para la detección de ia lactosa, no siendo ninguno de ellos un material nocivo que deba, manipularse cori extrema precaución, por lo que es un kit sepcílfo que puede ser utilizado por persona! que no necesariamente deba tener una especial cuaiificación para eito.
Los elementos que: contiene ño suponen un coste muy elevado, por lo que este kit resulta accesible para todas las empresas que precisen de una detección de presencia de lactosa y pueden aplicarlo ellos mismos, sin necesidad dé recurrir a empresa externas, por lo que se consigue un coste reducido y mayor rapidez,
Además, e; proceso se realiza siguiendo unas pautas sobre ios elementos aportados en el kit, sin necesidad de impregnar y/o cortar placas, preparar reactivos, ajustar parámetros cómo ia dilución,.. , por io qué resulta más sencillo y apto para poder aplicarlo sn la propia empresa, sin necesidad de mandar tas muestras a un laboratorio. Por tanto, es un kit: muy efecfjvo, apto para aplicarse: en condiciones dispares de temperatura y humedad, según el lugar en que se emplee, pues la aplicación de! patrón: de lactosa aporta la medida en cada casó en concreto según las condiciones ambientales y concretas de la medición. Esto resulta una ventaja relevante respecto al método : de cromatografía de capa fina estándar, dado que el tener q;ue mantener siempre unas mismas condiciones ambientales resulta una importante limitación.
Así mismo es capaz de detectar la presencia o ausencia de lactosa con la necesaria: sensibilidad para determinar si la cantidad existente está en una proporción que supera un límite legislativo.
Breve descripción de ios dibujos
Con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características dei inventó, de acuerdó con un ejemplo preferente de realización práctica dei mismo:, se aporta como parte integrante de dicha descripción, una serle de dibujos donde, con carácter ilustrativo y no i imitativo se ha represen tado lo siguiente;
La Figura 1.- Muestra una vista en planta de una tira de separación de la lactosa, para un modo de realización preferente de la invención.
Las Figuras 2:1 a 2.4.- Muestra una vísta en planta de tiras de separación de la lactosa en las que ios resultados obtenidos respectivamente, han sido positivo, negativo, y dos posibles caso de no válido, para un modo de realización preferente de la invención.
La Figura 3,1 y 3.2. ~ Muestra unas vistas éu alzado y perfil de la cámara de separación en la fase de introducción de la tira de separación en el interior de una tira de separación de ia lactosa, para un modo de realización preferente de la invención.
La Figura 4.- Muestra un diagrama de bloques de! procedimiento de detección de lactosa, en superficies, aguas y aiimenios, mediante un kit como el definido,: para: un modo de realización preferente de la invención.
Descripción detallada de un modo de realización preferente de la invención
A la vista ele las figuras aportadas, puede observarse cómo en un modo de realización preferente de ia invención, el kit de detección de lactosa, en superficies, aguas y alimentos, sobre una muestra obtenida de los mismos; que aquí se presenta, comprende varios elementos que se detallan a continuación.
Así pues, comprende una solución de extracción de la lactosa de la muestra, donde dicha solución de extracción está contenida en un recipiente de extracción y presenta una cantidad de lactosa comprendida entre 0 y SO mg/l. En función de la dilución utilizada y dei tipo de muestra es necesario aportar una mayor o menor cantidad de lactosa, pues: sí presenta 1 ÜOppm, al diluirse la cantidad disminuye y es más difícil de detectar, ya que puede situarse por debajo de la cantidad mínima necesaria para la yisualización posterior en la; tira de separación (19), per lo que el aporte de lactosa de la solución de extracción permite que sí sea posible la detección.
En este modo de realización preferente de la invención, se realiza una dilución de
1/5, por ¡o que sí el producto presentara una cantidad menor o igual a tas 1 OOppm de lactosa, la muestra diluida presentaría 2í)ppm, Así pues, la solució de extracción va a presentar en este caso 20mg/l de lactosa, para que la concentración: en la muestra ascienda a 40ppm en caso de que realmente: exista presencia de lactosa, y este valor ya es detectadle medíante este método de detección.
En este modo de realización preferente de la invención, se considera que la muestra a analiza proviene de un alimento. Así pues, la solución dé extracción comprende además de la lactosa, agua destilada, un conservante formado por ácido benzoico y un reactivo de desproteinízación formado por acetato de zinc, fungstato de sodio, ácido sulfúrico, ácido fridoroacéfíco, ácido perdórico, éter o acetona.
En este modo de realización preferente de la invención, el reactivó de desproteinizacíon utilizado es acetato de zinc.
Eí kit de detección comprende también una solución de separación (17) y una cámara cíe separación (18;) hermética para la colocación de ia misma. Esta solución de separación (17) está formada por una: mezcla que contiene al menos un disolvente apto para ia separación de azúcares.
En esté modo de realización preferente de la invención, la solución de separación (17) está formada por un disolvente que en concreto es acetona y comprende además agua destilada.
En otros modos de realización, el disolvente puede estar formado: por acetato de etilo, isopropanol, N-Bufanoí, lampón de fosfato, metano!, cloroformo, hidróxido de amonio, ácido acético y/o N-propanol
Como se muestra en ia Figura 1, este kit cuenta además don una tira de separación (19) de la lactosa respecto a otros compuestos solubles en Ja: muestra, mediante cromatografía. Esta tira de separación (19) presenta forma rectangular con un primer y segundo laterales {19,1 , 19.2) opuestos de menor longitud.
De forma paralela a ambos primer y segundo laterales (19;1 , 19.2) presenta una primera linea (20) de colocación de la muestra próxima al primer lateral (19.1) y tina segunda línea (21) de fin de la subida de la solución de separación (17), próxima al segu ndo lateral (19.2). En este modo de realización preferente deja invención, ja tira de separación (19) de la lactosa está compuesta por un croraatofolio de gél de sílice: 60, pero en otros modos de realización puede estar compuesta de celulosa de kieseiguhr, o de una combinación de gel de sílice y kieseiguhr,
Asi mismo, eri este modo de realización preferente de |a invención, la tira de separación (19) de ta lactosa presenta una impregnación de acetato de sodio, pero en otros modos de: realización en los que la composición de l tira dé separación sea diferente, puede presentar una impregnación en borato de sodio, ácido bórico o bisulfito de: sodio
Gomo puede observarse en la Figura 1 , la tira de separación (19) de ia lactosa presenta sobré ta primera línea (20) de colocación de ia muestra, una primera y una segunda marcas (22, 23) indicativas dei lugar dé colocación de la muestra y del patrón de lactosa, respectivamente, donde ambas primera g segunda marcas (22, 23): indicativas están: separadas entre sí.
El kit de detección comprende un primer recipiente de contención con una primera solución de vísuaíización y ai menos un segundo recipiente de contención con una segunda solución de visuali áción.
La primera solución está formada ai menos por P-añisaidehido, siendo en este modo de realización formada únicamente: por P-anisaidehtdo y, la segunda solución está formada por una mezcla de ácido sulfúrico y etanol absoluto:.
Así pues, en este modo de realización preferente de la invención, el primer recipiente de contención do la primera solución de visualización comprende una cantidad entre 2 y 3 mJ de la misma, siendo en este caso de 2,5ml y, el segundo recipiente de contención de ia segunda solución comprende üna ezeia de 1,8ml de etanoi absoluto y 0,1 mi de ácido sulfúrico.
En: este modo de realización preferente de la invención e! kit de detección comprende un primer recipiente de contención: y 25 segundos recipientes de contención, para que resulte válido para realizar 25 test de detección. En otros modos de realización, ei kit puede contener otras cantidades distintas, válidas: para un número diferente de test de detección.
El kit comprende además un pulverizador para el mezeiado dé ia primera y la segunda soluciones de visualización y un patrón de lactosa formado por una mezcla de agua destilada, lactosa , en una proporción: mayor a 15pprn y un conservante. Én este modo de realización preferente dé la Invención se considera un patrón de lactosa con una concentración de 1/GQppm de la misma. En este modo de realización preferente de la: invención, el conservante del patrón ele lactosa está formado por ácido benzoico.
En esta memoria se propone así mismo, un procedimiento de detección de lactosa, en superficies, aguas y alimentos, medíante la aplicación de un kit de detección como el definido previamente,
Este procedimiento presenta una primera fase consistente en ia obtención y homogeneización (1) de úna muestra.
En este modo de realización preferente de ta invención, en el que se ha considerado que la detección de lactosa de realiza sobre un alimento, dicha fase de obtención y homogeneización (1) de ia muestra comprende una primera etapa de removido ó /triturado (2) de alimento.
Así mismo, dicha primera fase comprende una segunda etapa de introducción (3) de una porción dé la muestra en un recipiente de extracción que contiene una solución de extracción para agitar luego el recipiente hasta obtener la homogeneización de! conjunto y, una tercera etapa de filtrado: (4) del conjunto homogeneizado anterior, mediante un papel de! filtro. Rara elfo la porción de la muestra que se debe utilizar es de entré 0,5 y 1g, por tratarse de un alimento sólido (AS). En este modo de realización tomamos 0,5g,
En otro modo de realización preferente de la invención, en el que el producto a analizar sea un alimento líquido (AL) o semilíqusdo, la segunda y tercera etapas son iguales que para el caso dé alimentos sólidos (AS), y la porción de muestra a utilizar es de 2rn!.
En otro modo de realización, en e! que el producto a analizar sea una superficie (S), la fase dé obtención y homogeneización (1) de la muestra comprende: una primera etapa de toma de un hisopo (5.1), humedecido (5.2) del mismo con solución de extracción y frotado (5.3) de un área de la superficie a testar equivalente a 5em8 y, una segunda y tercera etapas iguales a los casos anteriores, siendo la porción de muestra a utilizar un extremo del hisopo.
En otro modo de realización preferente, en é¡ que el producto a analizar sea aguas (A) de limpieza, la fase de obtención y hómogeneizacián (1) de ia muestra comprende una primera etapa de toma: de una cantidad directa (6) de las mismas y una segunda y tercera etapas iguales a los casos anteriores, siendo la porción de muestra 2 l
La segunda fase consiste en a introducción (7) de la solución de separación (17) en el interior dé la cámara de separación (18) y cierre hermético de la misma durante un fíempo comprendido entre !5 y 30min. En este modo dé realización preferente de ia ¡mención, se mantiene un tiempo de 2Qmin.
A continuación, se realiza una tercera fase de colocación (8) de una cantidad de 5 m! del resultado de la obtención: y Homogeneización de la muestra, en una: tira de separación (19), en la primera marca (22) indicativa del Sugar de colocación: de la: muestra, seguida de una cuarta fase dé colocación (9) de una cantidad de 5 mI del patrón de lactosa, en la misma tira de separación (19), en la segunda marca (23} indicativa del lugar de colocación del patrón de lactosa.
La quinta fase consiste en un primer secado (10) de la tira de separación (19) a una: temperatura compren ida éntre 90 y 115°, durante un tiempo comprendido entre 3Qs y 10min. En este modo de realización preferente de la invención, el secado $e realiza mediante un calentador a una temperatura de 1ÜG¾, durante 45s.
Y, una vez seca la tira de separación (19) con las muestras,: de realiza la sexta fase de introducción (11) de la misma en el interior de la cámara de separación (18) y cerrado de la cámara de: nuevo, durante un tiempo comprendido entre 20 y 30 rain. La tira ée separación (19) se debe situar tal y como se muestra en las Figuras 3.1 y 3.2, con un ángulo de inclinación y orientada tal que el primer lateral (19.1) está en una posición inferior respecto ai segunda lateral (1Q.2). En este modo de realización preferente de la invención, la tira: de separación se mantiene en el interior de la cámara de separación un tiempo de 26rnin.
En esta fase, se produce la ascensión de la solución de separación (17) por la tira de separación: (19), hasta la segunda linea (21) de fin de la subida de la solución de separación (17),
A: continuación, la séptima: fase consiste en un segundo secado (12) a una temperatura comprendida: entre 90 y US0, durante: un tiempo comprendido entre 30s lOmin. En este modo de realización preferente de ja invención el secado se realiza mediante un calentador a una temperatura de Q00C, durante 6min,
Con latirá de separación (19} ya seca, se realiza una octava fase de introducción (13) del tota! de la segunda solución de visualizacíón contenida en el segundo recipiente de contención, en un pulverizador y seguidamente Introducción de 0,1 m| del total de la primera solución de visuaítzación contenida en el primer recipiente de contención, sobre la anterior en ai mismo pulverizador y, agitado dé la mezcla.
En este modo de realización preferente de la invención, la cantidad de la segunda solución de visualizacíón contenida en el segundo recipiente de contención se ha indicado que es una mezcla de 1 ,8ml de eta ói absoluto y 0,1ml de ácido sulfúrico. Esta cantidad aportada es la necesaria para ia realización de un test Así mismo, a esta segunda solución, una vez. se introduce en el pulverizador, se le añade 0,1 mí de P-anísaidehido, que se, toma con una pipeta del total de primera solución: de visuaiizacións contenida en el primer recipiente.
Gon esta mezcla de soluciones: dé visuatízación, se realiza la novena fase de pulverización (14) de forma uniforme de ia tira de separación (19) con la mezcla de ia primera y la segunda soluciones de visuatízación.
La; tira de separación (19) se pulveriza hasta que queda empapada y se procede a una undécima fase de revelado (15) de la tira: de separación durante un tiempo comprendido entré 5 y 15 in, a una temperatura de entre 100 y 120°, En este modo derealización preferente de la invención, el revelado tiene lugar durante: I Qffiin, una temperatura : e 110°C .
Dado que en ia tira de separación (19) siempre se deposita muestra y patrón de lactosa, la mancha de lactosa (24) que aparece en la tira de separación (19) como eonseGuencia del patrón dé lactosa, va a mostrar ia altura a la que debe aparecer una banda (25) parecida para ia muestra, en el caso en que esta sf presente lactosa en una proporción igual o superior a) límite: de la legislación, en este caso 100ppm.
La ultima fase es la de interpretación (16) de los resultados.
Asi pues, puede ocurrir que el resultado obtenido de una muestra sea el que aparece en ia Figura 2.1 En este caso, como puede observarse, en dicha Figura 2,1 , en la vertical de ia muestra aparece una banda (25): a la misma altura qué la mancha de lactosa (24) correspondiente ai patrón de lactosa, po lo que el resultado obtenido es positivo y puede afirmarse que la muestra contiene una concentración igual o superior a IGOppm de lactosa.
El resto de manchas (26) que aparece sobre la vertical correspondiente a ia muestra, representan a ios distintos carbohidratos de la muestra analizada.
Puede ocurrir igualmente que el resultado obtenido sea el que aparece en la Figura 2,2, en cuyo: caso, se observa qüe en ia vertical de la muestra no aparece ninguna banda a la misma altura que la mancha de lactosa (24; correspondiente al patrón de lactosa, por lo que puede afirmarse que no existe en la muestra: una concentración de lactosa que alcance las IGGppm.
Así mismo, pueden: ocurrir otros dos casos representados en las Figuras 2.3 2.4, En ambas Figuras se observa que existe una ausencia de manchas en la verilea! del patrón de lactosa, que en la Figura 2,4 además se suma a una ausencia de manchas también en la vertical de íá muestra. En ambos casos el resultado no es válido, pues significa que el test no se ha desarrollado de forma adecuada y por tanto debe ser invalidado este resultado.
La forma de realización descrita constituye únicamente un ejemplo de la presente invención, por tanto, los detalles, términos y frases específicos utilizados en la presente memoria no se han de considerar corno limitativos, sino qué han dé entenderse únicamente como una base para las reivindicaciones y como una base representativa que: proporcione una descripción comprensible así como la información suficiente ai experto en la materia: para aplicar la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Kit de detección de lactosa, en superficies, aguas y alimentos, sobre una muestra obtenida de los mismos, caracterizado por que comprende
- una solución dé extracción de la iactosa de la muestra, donde dicha solución de extracción está contenida e un recipiente de extracción y presenta una cantidad de lactosa comprendida entre 0 y 50 mg/i;
- una solución de separación (IT) y una cámara de separación (18) hermética para ia colocación de !a misma, donde la solución de separación (17) está formada por una mezcla que contiene al: menos Un disoivente apto para ia separación de azúcares;
- una tira de separación (fSJ de ia lactosa respecto a otros compuestas solubles en la muestra, mediante cromatografía;
- un primer recipiente de contención con una primera solución de vísualización y a! menos un segundo recipiente de contención con una segunda solución de vísualización, donde la primera solución está formada ai menos por P-anisaldehido y la segunda solución está formada por una mezcla de ácido sulfúrico y eíanol absoluto;
- un pulverizador para el mezclado de ia primera la segunda solucione de vísuaiízación, y;
~ un patrón de lactosa formado por una mezcla de agua destilada, lactosa en una proporción de mayor a 15ppm y un conservante,
2. Kit de defección de iactosa, según ia reivindicación 1 , caracterizado por que la solución de extracción comprende además agua: destilada, un conservante formado por ácido benzoico y un reactivo de desproíeinizaeíón formado por acetato de zinc, tungsíaío de sodio, ácido sulfúrico, ácido tricioroacétioo, ácido percióri co, éter o aGétoná. 3 Kit: de detección de lactosa, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el al menos un disolvente de la solución de separación (17 está formado por acetato do etilo, isopropariol, hbBuíanoi, acetona, lampón de fosfato, metano!, cloroformo, hídróxido de amonio, ácido acético y/o N-propanol
4. Kit de detección de lactosa, según la reivindicación 3, caracterizado por que la solución de separación (17) comprende: agua destilada,
5. Kit de detección de lactosa, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que ia tira de separación (19) de ia lactosa presenta forma rectangular con un primer y segundo laterales (19,1 , 19 2) opuestos de menor longitud:, una primera línea (20) de colocación de la muestra próxima ai primer lateral (19.1) y paralela al mismo, y una segunda linea {21} de fin de ia subida de la solución de separación {17} próxima al segundo lateral (1S.2) y paralela ai mismo,
6. Kit ele detección de jactóse, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que ia tira de separación {19} de la lactosa está compuesta por un fí cromatofofio de gei de sílice 60, de celulosa, de kieselguhr, o de una combinación de gei de sílice y kieselguhr.
7, Kit de detección de lactosa, según ia reivindicación 6, caracterizado por que la tira de separación {19} de la lactosa presenta una impregnación de acetato de sodio, borato dé sodio, ácido bórico o bisulfito de sodio. 0 8 Kit de detección de lactosa, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la tira de separación (19) de la lactosa presenta sobre ía primera línea (20} de colocación de la muestra, una primera y una segunda marcas (22, 23) indicativas: del lugar de colocación de la muestra y del patrón de lactosa respéctivamente, donde dichas primera y segunda marcas {22, 23) indicativas están5 Separadas entre sí,
9. Kit de detección dé lactosa, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores:, caracterizado por que el primer recipiente de contención de la primera solución de vísuaÜzación comprende una cantidad entré 2 y 3 mi cié ía misma y el segundo recipiente de contención: de ia segunda solución comprende una mezcla de 1,8mi de etáriol0 absoluto y 0,1 mi de ácido sulfúrico.
10. Kit de detección de lactosa:, según cualquiera de las reivindicaciones: anteriores, caracterizado por que el conservante del patrón de lactos está formado por ácido benzoico.
1 1 Procedimiento de detección de lactosa, en superficies, aguas y alimentos,5 mediante la aplicación de un kit de detección como él definido en las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que comprende las fases
obtención y homageneízación (1 ) de una muestra;
- introducción (7) de ía solución de separación (17) en el interior de ia cámara de separación (18) y cierre hermético déla misma durante un tiempo comprendido entre 150 y 30min; - colocación (8} de una cantidad de S mΐ del resultado de la obtención y hornogeneizaejóri, en una tira de separación (19), en la primera marca (22) indicativa de la primera linea (21 );
- colocación (9) dé una cantidad de 5 pl de! patrón de lactosa, en la misma tira de separación (19), en la segunda marca (23) indicativa de la segunda línea (21 );
primer secado (10 de la tira de separación (19) a una temperatura comprendida entre 90 y 115°, durante un tiempo comprendido entre 30s y 10mín;
- introducción (1 1 ) de la tira de separación (19) en el Interior de la cámara de separación (18) y cerrado de ia misma de nuevo, durante un tiempo comprendido entre 20 y 30 min, donde la tira de separación (19) queda dispuesta; con un ángulo de inclinación y orientada tal que el primer lateral (19.1) está en una posición inferior respecto al segundo latera! {19.2);
- segundo secado (12) a una temperatura comprendida entre 90; y 1 15°, durante: un tiempo comprendido entre 30s y 10mín;
- introducción (13) del total de la segunda solución de yísualización; contenida en el segundó recipiente de contención en un puíverizador y seguidamente: introducción de 0,1 mi de la primera solución de visualización sobre la anterior en el mismo pulverizador y agitado de ia mezcla;;
- pulverización (14) de forma: uniforme de la tira de separación (19). con la mezcla de la primera: y la segunda soluciones de y isualizacsón ;
- revelado (i 5) de la tira de separación (19) durante un tiempo comprendido entre 5 y 15 mín;, a una temperatura dé entre 100 y 120°;
- interpreta cíón (16) de ios résu liados ,
12. Procedimiento de defección de lactosa, según ia reivindicación 11 , caracterizado por que en; el caso en que el producto a analizar está formado por alimentos líquidos o sóhdos (AL, AS), la fase de obtención y homogeneizacion (1 ) de la muestra comprende una primera etapa dé removido o triturado (2) del alimento.
13. Procedí miento de detección de lactosa, según la reivindicación 1 1 , caracterizado por que en el caso de superficies (S), la fase de obtención y homógeneización (1) de la muestra comprende una primera etapa de loma de un hísopo^S.1);, humedecido (5.2} dé| mismo con solución de extracción y frotado (5,3) de: un área de ia superficie a testar equivaliente a Scnrv
14, Procedimiento de detección de lactosa, según ia reivindicación 11 , caracterizado por que en el caso de aguas (A), la fase de obtención y homogeneización (1) de ia muestra: eornprende una primera etapa de toma (8) de una cantidad: directa de las mismas.
15. Procedimiento de detección de: lactosa, según: cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado por que la fase de obtención y homogeneización (1) de ia muestra comprende una segunda etapa de introducción y dilución (3) de una porción de ia muestra en un recipiente de extracción que contiene una solución de extracción, y agitar el recipiente hasta obtener la homogeneización del conjunto y una tercera etapa de filtrado (4): del conjunto homógeneizado anterior, mediante t papel del filtro, donde la porción de la muestra: está formada por un extremo de! hisopo en el caso de superficies (S). entre 0.5 y 1g en el caso de alimentos sólidos (AS) o por 2m! sn e! caso de aguas
(A) o alimentos líquidos (AL) o semiliquidos respectivamente.
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