CN107315053A - 一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法 - Google Patents

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孙亚飞
袁耀佐
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Abstract

本发明提供了一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，色谱柱为聚合物氨基柱，乙腈‑水为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30℃，电喷雾检测器；本方法可以同时分析乳糖中半乳糖、葡萄糖、乳果糖、蔗糖杂质，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，以乳糖色谱峰计算理论塔板数大于5000，拖尾因子小于1.2；此方法灵敏度高、重现性和分离效果好，操作简便、快捷、准确，适用于乳糖质量控制及有关物质研究。

Description

一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法
技术领域
本发明涉及一种乳糖中有关物质的定量检测，尤其涉及一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法。
背景技术
乳糖（lactose）是天然存在于动物乳液中的还原性二糖，人乳中含5%～8%，牛乳中含4%～5%，由一分子葡萄糖和一分子半乳糖所构成(图1)，有ɑ和β两型。
ɑ型 β型
在医药工业中，可用于药品的甜味剂和赋形剂，根据药品剂型需要可制成结晶乳糖、直压乳糖和预混乳糖辅料。乳糖含量及有关物质反映了产品质量和营养价值。因此，建立一个简便快速、灵敏准确的分析方法，对于区别乳糖优劣和控制产品工艺等都有重要的指导作用。
目前，国内外有关糖类检测方法的报道很多，大致分为两大类：一类是酶化学方法，该法准确度和专属性较差，同时酶的来源与纯化也存在较大问题。另一类是色谱法，主要包括气相色谱法(GC)、液质联用法、离子色谱-脉冲安培检测法、液相色谱示差检测法和液相色谱蒸发光散射检测法等。其中，气相色谱和液质联用法需要衍生处理，操作繁琐；离子色谱-脉冲安培检测器法，仪器使用成本较高,稳定性较差，色谱条件严格；蒸发光散射检测器液相色谱分析方法，发现也存在灵敏度低，重现性差，线性范围较窄，易产生基线漂移等问题。2015年版《中国药典》中乳糖含量和有关物质测定采用的是示差折光检测法，其灵敏度低、受环境影响波动较大、易出现基线不稳、色谱峰形较差、色谱柱使用寿命短等问题。
乳糖分子极性较大，结构中没有强生色官能团，紫外吸收较弱，无法采用常用的反相液相色谱-紫外检测器进行准确的定性与定量测定。查阅国外最新药典标准收载乳糖的的情况，发现仅欧洲和英国药典采用气相色谱法对其含量进行控制，且均未控制有关物质。电喷雾检测器是近年来发展起来的一种新型检测器，该检测器属于通用质量型检测器，与紫外检测器、示差折光检测器和蒸发光散射检测器相比，灵敏度高，重现性好，可直接分离测定单糖和二糖等低聚糖。目前尚未见采用高效液相色谱-电喷雾检测器（HPLC-CAD）法同时测定乳糖含量及有关物质的文献报道。
发明内容
本发明提供了一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，建立了测定乳糖有关物质的HPLC-CAD法，为乳糖的质量控制提供新的技术手段。
一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，具体分析方法如下：
（1）色谱条件设置：聚合物氨基柱，乙腈-水为流动相，流速0.5-1.5 mL/min，柱温20-50℃；电喷雾检测器，检测器雾化温度：30-45 ℃，幂率：1-1.2，采样频率：10-15 Hz，过滤常数：3-4 s；
（2）***适用性溶液制备：精密称取半乳糖、葡萄糖、乳果糖、蔗糖以及乳糖对照品各适量，置100mL量瓶中，混合均匀，加溶剂溶解并稀释至刻度，作为***适用性溶液；
（3）供试品溶液制备：取乳糖样品约100.0mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加水适量，超声、溶解后，用乙腈定容至刻度，摇匀，作为有关物质测定供试品溶液；所述供试品溶液的浓度为2.0 mg/mL；
（4）对照品溶液制备：精密量取供试品溶液1.0 mL，置100mL量瓶，加溶剂稀释定容至刻度，作为对照溶液；所述对照溶液的浓度为20.0 μg/mL；
（5）检测：精密量取经过步骤（2）制备的***适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度符合要求；再精密量取经过步骤（4）制备的对照溶液和经过步骤（3）制备的供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
（6）根据供试品溶液的色谱图中的峰值，按自身对照法计算。
优选的，所述聚合物氨基柱为Shodex Asahipak NH2P-50 4E，4.6×250 mm，5 µm。
优选的，所述步骤（1）中乙腈-水流动相的配比是乙腈：水=75:25。
优选的，所述步骤（2）中所述步骤（2）中乳糖的浓度为2.0mg/mL。
优选的，所述分析方法中杂质检测限（S/N=3）为小于10 ng，定量限（S/N=10）小于25 ng。
优选的，所述步骤（2）中溶剂为乙腈。
本方法还可用于乳糖含量的检测上，以及其他糖类含量和有关物质的检测上，如蔗糖、葡萄糖、甘露醇等。
本发明提供的一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，专属性强，灵敏度较高，受环境影响波动较小，色谱峰形较优。与现行药典标准收载的方法相比较，药典所用方法为示差检测器，色谱***稳定需至少2小时，而本发明采用CAD检测器，色谱***稳定只需0.5小时，缩短了样品检测时间；另外样品浓度较低，药典方法乳糖浓度为100mg/mL，而本发明乳糖浓度只需2mg/mL，进入色谱柱的量较小，对色谱柱使用寿命极为有利。
附图说明
图1是***适用性溶液的色谱分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。
实施例1
色谱条件：色谱柱为Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6×250 mm，5 µm）流动相为乙腈-水（75:25）；流速1.0 mL/min；柱温20 ℃；电喷雾检测器（雾化温度：30 ℃；幂率：1；采样频率：10 Hz；过滤常数：3s；溶剂：50%乙腈；进样量20 μL。
溶液的制备：
（1）***适用性溶液
在乳糖样品中加入适量已知杂质对照品(各杂质质量比均约相当于0.5%主成分浓度)，制成样品与杂质的混合溶液来考察方法的专属性。
分别精密称取半乳糖、葡萄糖、乳果糖、蔗糖和乳糖对照品适量，置100ml量瓶中，混合均匀，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为***适用性溶液；***适用性溶液的色谱分析图如图1所示。
（2）供试品溶液
取乳糖样品约100.0mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加水适量，超声、溶解，用乙腈定容至刻度，摇匀，作为有关物质测定供试品溶液（2.0 mg/mL）。
（3）对照溶液
精密量取供试品溶液1.0 mL，置100mL量瓶，加溶剂稀释定容至刻度，作为对照溶液（20.0 μg/mL）。
精密量取***适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度应符合要求；再精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的2倍。根据供试品溶液的色谱图中的峰值，有关物质的量按自身对照法计算。
实施例2
色谱条件：色谱柱为Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6×250 mm，5 µm）流动相为乙腈-水（75:25）；流速1.5mL/min；柱温45 ℃；电喷雾检测器（雾化温度：35 ℃；幂率：1.15；采样频率：12Hz；过滤常数：3.6 s；溶剂：50%乙腈；进样量20 μL。
溶液的制备：
（1）***适用性溶液
在乳糖样品中加入适量已知杂质对照品(各杂质质量比均约相当于0.5%主成分浓度)，制成样品与杂质的混合溶液来考察方法的专属性。
分别精密称取半乳糖、葡萄糖、乳果糖、蔗糖和乳糖对照品适量，置100ml量瓶中，混合均匀，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为***适用性溶液；***适用性溶液的色谱分析图如图1所示。
（2）供试品溶液
取乳糖样品约100.0mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加水适量，超声、溶解，用乙腈定容至刻度，摇匀，作为有关物质测定供试品溶液（2.0 mg/mL）。
（3）对照溶液
精密量取供试品溶液1.0 mL，置100mL量瓶，加溶剂稀释定容至刻度，作为对照溶液（20.0 μg/mL）。
精密量取***适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度应符合要求；再精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的2倍。根据供试品溶液的色谱图中的峰值，有关物质的量按自身对照法计算。
实施例3
色谱条件：色谱柱为Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6×250 mm，5 µm）流动相为乙腈-水（75:25）；流速0.5mL/min；柱温50℃；电喷雾检测器（雾化温度：45 ℃；幂率：1.2；采样频率：15 Hz；过滤常数：4 s；溶剂：50%乙腈；进样量20 μL。
溶液的制备：
（1）***适用性溶液
在乳糖样品中加入适量已知杂质对照品(各杂质质量比均约相当于0.5%主成分浓度)，制成样品与杂质的混合溶液来考察方法的专属性。
分别精密称取半乳糖、葡萄糖、乳果糖、蔗糖和乳糖对照品适量，置100ml量瓶中，混合均匀，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为***适用性溶液；***适用性溶液的色谱分析图如图1所示。
（2）供试品溶液
取乳糖样品约100.0mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加水适量，超声、溶解，用乙腈定容至刻度，摇匀，作为有关物质测定供试品溶液（2.0 mg/mL）。
（3）对照溶液
精密量取供试品溶液1.0 mL，置100mL量瓶，加溶剂稀释定容至刻度，作为对照溶液（20.0 μg/mL）。
精密量取***适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度应符合要求；再精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的2倍。根据供试品溶液的色谱图中的峰值，有关物质的量按自身对照法计算。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，其特征在于，具体分析方法如下：
（1）色谱条件设置：聚合物氨基柱，乙腈-水为流动相，流速0.5-1.5 mL/min，柱温20-50℃；电喷雾检测器，检测器雾化温度：30-45 ℃，幂率：1-1.2，采样频率：10-15 Hz，过滤常数：3-4 s；
（2）***适用性溶液制备：分别精密称取半乳糖、葡萄糖、乳果糖、蔗糖以及乳糖对照品各适量，置100mL量瓶中，混合均匀，加溶剂溶解并稀释至刻度，作为***适用性溶液；
（3）供试品溶液制备：取乳糖样品约100.0mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加水适量，超声、溶解后，用乙腈定容至刻度，摇匀，作为有关物质测定供试品溶液；所述供试品溶液的浓度为2.0 mg/mL；
（4）对照品溶液制备：精密量取供试品溶液1.0 mL，置100mL量瓶，加溶剂稀释定容至刻度，作为对照溶液；所述对照溶液的浓度为20.0 μg/mL；
（5）检测：精密量取经过步骤（2）制备的***适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度符合要求；再精密量取经过步骤（4）制备的对照溶液和经过步骤（3）制备的供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
（6）根据供试品溶液的色谱图中的峰值，按自身对照法计算。
2. 根据权利要求1所述一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，其特征在于：所述聚合物氨基柱为Shodex Asahipak NH2P-50 4E，4.6×250 mm，5 µm。
3.根据权利要求1所述一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，其特征在于：所述步骤（1）中乙腈-水流动相的配比是乙腈：水=75:25。
4.根据权利要求1所述一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，其特征在于：所述步骤（2）中乳糖的浓度为2.0mg/mL。
5.根据权利要求1所述一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，其特征在于：所述分析方法中杂质检测限小于10 ng，定量限小于25 ng。
6.根据权利要求1所述一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法，其特征在于：所述步骤（2）中溶剂为乙腈。
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