WO2019168109A1 - 検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液 - Google Patents

検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液 Download PDF

Info

Publication number
WO2019168109A1
WO2019168109A1 PCT/JP2019/007867 JP2019007867W WO2019168109A1 WO 2019168109 A1 WO2019168109 A1 WO 2019168109A1 JP 2019007867 W JP2019007867 W JP 2019007867W WO 2019168109 A1 WO2019168109 A1 WO 2019168109A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hemoglobin
acid
living body
haptoglobin
solution
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/007867
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
望 酒巻
田口　秀典
満 牧之段
未佑 山田
Original Assignee
栄研化学株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 栄研化学株式会社 filed Critical 栄研化学株式会社
Priority to US16/977,338 priority Critical patent/US20200407425A1/en
Priority to CN201980016412.5A priority patent/CN111788484A/zh
Priority to JP2020503617A priority patent/JP7237924B2/ja
Priority to AU2019227781A priority patent/AU2019227781A1/en
Priority to SG11202008338PA priority patent/SG11202008338PA/en
Priority to EP19761056.1A priority patent/EP3761030A4/en
Priority to KR1020207028304A priority patent/KR102678099B1/ko
Publication of WO2019168109A1 publication Critical patent/WO2019168109A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins

Definitions

  • the present invention includes a method for stabilizing a protein contained in a specimen derived from a living body, a stabilizing solution for stabilizing a protein contained in a specimen derived from a living body, and a specimen derived from a living body.
  • the present invention relates to a method and a kit for detecting a protein.
  • Detecting proteins contained in samples such as feces, urine, saliva, etc. is useful for the diagnosis of many diseases.
  • a fecal occult blood test that detects blood in a stool specimen can provide important information in the diagnosis of digestive organ diseases such as colorectal cancer.
  • an immunological measurement method is known in which detection is performed using an antibody against these proteins.
  • Specimens used for occult blood tests are usually collected by a subject in a storage container containing a storage solution and transported to a hospital or other laboratory. In many cases, it takes several days to transport a preservation solution (sample) containing a specimen, and since it is generally difficult to control the temperature during transportation, it is often exposed to unfavorable temperature conditions for storage. .
  • a preservation solution sample
  • proteins such as blood proteins contained in a sample are denatured due to temperature conditions during transportation, etc., or are decomposed or modified by bacteria or enzymes in the sample, the epitope or its nearby structure changes. However, the protein contained in these feces cannot be recognized, and accurate measurement by immunoassay cannot be performed.
  • hemoglobin is unstable in solution and is particularly susceptible to denaturation or degradation under high temperature conditions.
  • Examples of techniques for stabilizing hemoglobin in a preservation solution include a method of adding an antibacterial agent such as thimerosal or chlorhexidine (for example, Patent Document 1), a method of adding a protease inhibitor (for example, Patent Document 2), glycosidase A method of adding a type lytic enzyme (for example, Patent Document 3), a method of adding an enzymatic degradation product of hemoglobin (for example, Patent Document 4), a method of adding an organic acid such as malic acid (for example, Patent Document 5), Various methods such as a method of adding iminocarboxylic acid (for example, Patent Document 6) and a method of adding haloalkanesulfonic acid (for example, Patent Document 7) have been proposed.
  • haptoglobin is present in the blood of a wide range of animals and rapidly binds to hemoglobin to form a stable hemoglobin-haptoglobin complex (Hb-Hp complex).
  • Hb-Hp complex stable hemoglobin-haptoglobin complex
  • JP-A-63-271160 Japanese Patent Laid-Open No. 3-27959 JP-A 63-246667 JP-A-11-218533 JP 2003-14768 A JP 2009-097956 A Japanese Unexamined Patent Publication No. 2016-191580 Japanese Patent Laid-Open No. 10-132824 JP-A 63-246668
  • an object of the present invention is to provide a method for improving the stability of a protein contained in a specimen derived from a living body even under an unfavorable temperature condition in which decomposition or denaturation easily occurs.
  • a method for stabilizing a protein contained in a specimen derived from a living body A step of coexisting a protein contained in a specimen derived from the living body with an arylboronic acid, The method, wherein the protein contained in the specimen derived from the living body is at least one selected from the group consisting of hemoglobin, haptoglobin, and a hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the arylboronic acid is at least one selected from the group consisting of phenylboronic acid and derivatives thereof.
  • the arylboronic acid is at least one selected from the group consisting of phenylboronic acid, hydroxyphenylboronic acid, carboxyphenylboronic acid, aminophenylboronic acid and salts thereof, [1] [2] Method.
  • the step is a step of dispersing a protein contained in the specimen derived from the living body in a solution containing the aryl boronic acid, The method according to [1] to [3], wherein the concentration of the arylboronic acid in the solution is 0.1 mmol / L or more.
  • [5] The method according to [1] to [4], wherein the step is a step of allowing a protein contained in the specimen derived from the living body to coexist with the aryl boronic acid and the sugar.
  • the sugar is at least one selected from the group consisting of sugar alcohols, monosaccharides and disaccharides.
  • the sugar is at least one selected from the group consisting of sorbitol, glucose, mannitol, fructose, xylitol, erythritol, sucrose, trehalose, lactose, and maltose.
  • the step is a step of dispersing a protein contained in the specimen derived from the living body in a solution containing the arylboronic acid and the sugar, The method according to [5] to [7], wherein the concentration of the sugar in the solution is 5 mmol / L or more.
  • the specimen derived from the living body includes at least hemoglobin, The method according to [1] to [8], wherein the method includes a step of bringing the hemoglobin into contact with haptoglobin to form a complex of hemoglobin and haptoglobin.
  • the method according to [1] to [9] wherein the specimen derived from the living body is feces, saliva, or urine.
  • a solution for stabilizing a protein contained in a specimen derived from a living body Including arylboronic acid, A stabilizing solution, wherein the protein contained in the specimen derived from the living body is at least one selected from the group consisting of hemoglobin, haptoglobin, and hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the arylboronic acid is at least one selected from the group consisting of phenylboronic acid and derivatives thereof.
  • the stabilization solution according to [11] to [17] which is a solution for storing the specimen derived from the living body.
  • a method for detecting a protein in a specimen derived from a living body A step of adding a specimen derived from the living body to the stabilization solution described in [11] to [18] to obtain a sample containing the specimen; Detecting the protein in the sample by an immunological measurement method; With The method, wherein the protein in the specimen derived from the living body is at least one selected from the group consisting of hemoglobin, haptoglobin, and a hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the specimen derived from the living body includes at least hemoglobin, The method according to [19], wherein the hemoglobin in the sample forms a complex with haptoglobin.
  • the method according to [20], wherein the stabilizing solution is the stabilizing solution according to [16].
  • proteins such as blood proteins contained in a specimen derived from a living body can be stabilized.
  • the method for stabilizing a protein contained in a specimen derived from a living body includes a step of allowing a protein contained in a specimen derived from a living body to coexist with an arylboronic acid.
  • the protein contained in the specimen derived from the living body may be at least one selected from the group consisting of hemoglobin, haptoglobin, and hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the specimen derived from the living body containing the protein may be feces, saliva, or urine, and may be feces.
  • a method for allowing a protein contained in a specimen derived from a living body to coexist with an arylboronic acid is not particularly limited, but examples include a method of dispersing a protein contained in a specimen derived from a living body in a solution containing arylboronic acid. It is done.
  • “dispersion” includes dissolution and suspension.
  • a solution containing an arylboronic acid includes a storage solution for storing a specimen derived from a living body, a diluted solution for further diluting a sample in which the specimen is dispersed in the storage solution, and a kit for detecting a protein in the specimen. And the like in the reaction solution.
  • the stability of a protein contained in a specimen derived from a living body can be remarkably improved, so that a specimen storage solution can be suitably used.
  • the aryl boronic acid can be appropriately selected from known ones.
  • the arylboronic acid may be at least one selected from the group consisting of phenylboronic acid and derivatives thereof, and from the group consisting of phenylboronic acid, hydroxyphenylboronic acid, carboxyphenylboronic acid, aminophenylboronic acid and salts thereof.
  • It may be at least one selected from phenylboronic acid, 3-hydroxyphenylboronic acid, 2-carboxyphenylboronic acid, 3-carboxyphenylboronic acid, 4-carboxyphenylboronic acid, 3-aminophenylboronic acid and these It may be at least one selected from the group consisting of salts, particularly selected from the group consisting of phenylboronic acid, 3-hydroxyphenylboronic acid, 3-carboxyphenylboronic acid, 3-aminophenylboronic acid and salts thereof At least one It may be at.
  • the concentration of aryl boronic acid in the solution is preferably such that the lower limit is 0.1 mmol / L or more, 0.2 mmol / L or more, or 0.5 mmol / L or more.
  • the concentration of arylboronic acid in the solution is 100 mmol / L or less, 50 mmol / L or less, or 30 mmol / L or less.
  • the arylboronic acid concentration is too high, the apparent recovery rate may decrease when the protein contained in the specimen derived from the living body is measured by an immunoassay. This is considered that the stabilization effect of the protein contained in the specimen derived from the living body is not lowered, but the high concentration of arylboronic acid has an adverse effect on the immunological measurement.
  • the arylboronic acid concentration is less than or equal to the above upper limit, adverse effects on the immunological measurement method are suppressed, and measurement can be performed more accurately.
  • the arylboronic acid and the sugar form a complex, thereby forming a high concentration.
  • arylboronic acid can be contained in a solution (stabilizing solution) for stabilizing a protein contained in a specimen derived from a living body.
  • a solution stabilizing solution
  • the concentration of the arylboronic acid in the stabilization solution has a lower limit of 0.1 mmol / L or more, 0.2 mmol / L or more, or 0.5 mmol / L or more. It can be.
  • the concentration of the arylboronic acid in the stabilizing solution can have an upper limit of 20 mmol / L or less, 10 mmol / L or less, or 5 mmol / L or less.
  • the step can be a step of allowing a protein contained in a specimen derived from a living body to coexist with a sugar together with the arylboronic acid.
  • the coexistence with a sugar can further enhance the stability of the protein contained in the specimen derived from the living body.
  • Examples of a method for allowing a protein contained in a specimen derived from a living body to coexist with a sugar include a method of further containing a sugar in a solution containing the arylboronic acid.
  • the sugar can be appropriately selected from known ones, for example, sugar alcohols such as sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol; monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, galactose; two sugars such as sucrose, trehalose, lactose, maltose, etc. Sugar; oligosaccharide; and the like.
  • sugar alcohols such as sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol
  • monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, galactose
  • two sugars such as sucrose, trehalose, lactose, maltose, etc.
  • Sugar oligosaccharide; and the like.
  • the sugar may be at least one selected from the group consisting of sugar alcohols, monosaccharides and disaccharides, and is selected from the group consisting of sorbitol, glucose, mannitol, fructose, xylitol, erythritol, sucrose, trehalose, lactose, and maltose It may be at least one, and may be at least one selected from the group consisting of sorbitol, mannitol, fructose, and sucrose.
  • sugars that form aldehyde groups or ketone groups in solution, such as glucose and fructose
  • a sugar that does not react with the protein is preferable because it modifies the protein by reacting with the protein (Maillard reaction) to produce a brown substance (melanoidin).
  • Maillard reaction modifies the protein by reacting with the protein (Maillard reaction) to produce a brown substance (melanoidin).
  • non-reducing sugar that does not react with a protein.
  • the non-reducing sugar may be at least one selected from the group consisting of sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, trehalose, sucrose, and lactose, and may be at least one selected from the group consisting of sorbitol, mannitol, and sucrose.
  • the lower limit of the sugar concentration is preferably 5 mmol / L or more, 10 mmol / L or more, or 25 mmol / L or more.
  • the upper limit of the sugar concentration may be 1000 mmol / L or less, 500 mmol / L or less, or 100 mmol / L or less for sugar alcohols and monosaccharides, and 500 mmol / L or less, 250 mmol / L or less for disaccharides, or It may be 100 mmol / L or less. If the sugar concentration is not more than the above upper limit, the viscosity of the stabilizing solution does not become too high, and it is difficult to cause a measurement problem.
  • the stabilizing solution for storing the protein contained in the specimen derived from the living body may be a buffer solution having a pH of 5 to 10, preferably 6 to 8, such as 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES). ), Hydroxyethylpiperazine-2-ethanesulfonic acid (HEPES), piperazine-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) and other good buffer solutions, phosphate buffer solution, Tris buffer solution Alternatively, a glycine buffer may be used.
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid
  • HPES Hydroxyethylpiperazine-2-ethanesulfonic acid
  • PPES piperazine-bis (2-ethanesulfonic acid
  • the stabilizing solution may further contain additives such as antibacterial agents, pH adjusters, salts for controlling ionic strength, surfactants, aggregation promoters, known stabilizers used during storage of proteins, and the like.
  • Antibacterial agents include sodium azide, antibiotics, and lytic enzymes.
  • Additives include known substances known to have protein stabilizing effects such as amino acids such as histidine and lysine, albumin, protease inhibitors, and chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). .
  • the stability of a protein contained in a specimen derived from a living body can be enhanced by the action of an arylboronic acid or by the synergistic action of an arylboronic acid and a sugar.
  • a more specific aspect of the present embodiment may include a step of forming a hemoglobin-haptoglobin complex by bringing a specimen derived from a living body containing at least hemoglobin into contact with haptoglobin.
  • the specimen derived from a living body containing hemoglobin may be feces, saliva, or urine, and may be feces.
  • the stool there are particularly many bacteria and enzymes that cause degradation and modification of hemoglobin. Therefore, the method of this embodiment is particularly useful.
  • a specimen derived from a living body containing hemoglobin and haptoglobin may be brought into contact in any way, but it is preferable to add a specimen derived from a living body containing hemoglobin to the storage solution containing haptoglobin.
  • Hemoglobin contained in a specimen derived from a living body reacts quickly with haptoglobin in the preservation solution to form a hemoglobin-haptoglobin complex. Then, the hemoglobin-haptoglobin complex can be stably stored by storing the storage solution to which the specimen derived from the living body is added as it is.
  • hemoglobin In the formation of a complex of hemoglobin and haptoglobin, hemoglobin dissociates from a tetramer ( ⁇ 2 ⁇ 2) in which two ⁇ chains and ⁇ chains are associated with each other into two dimers ( ⁇ ). It does not fall under “decomposition” or “denaturation” in this specification.
  • the stabilization solution for stabilizing a protein contained in a specimen derived from a living body containing hemoglobin includes arylboronic acid or the above-described stabilization solution containing arylboronic acid and a sugar, and haptoglobin. It is preferable to further add.
  • the concentration of haptoglobin in the stabilizing solution depends on the amount of the specimen derived from the living body, for example, 0.05 unit / L to 50 unit / L, 0.1 unit / L to 10 unit / L, or 0.2 units / L to 2 units / L.
  • one unit represents the amount of haptoglobin that binds to 1 mg of hemoglobin.
  • the haptoglobin concentration in the above range is a concentration sufficient to convert all hemoglobin in a specimen derived from a living body into a hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the concentration of the arylboronic acid in the stabilizing solution has a lower limit of 0.1 mmol / L or more, 0.2 mmol / L or more, 0.5 mmol / L or more. 1 mmol / L or more, or 5 mmol / L or more.
  • the arylboronic acid concentration is equal to or higher than the above lower limit, the stabilization effect of hemoglobin contained in the specimen derived from the living body by the arylboronic acid is combined with the stabilization effect of haptoglobin to become more remarkable.
  • the concentration of the arylboronic acid in the stabilizing solution can be an upper limit of 100 mmol / L or less, 50 mmol / L or less, or 30 mmol / L or less.
  • the arylboronic acid concentration is less than or equal to the above upper limit, adverse effects on immunological measurement methods are suppressed, and more accurate measurement is possible.
  • hemoglobin contained in a specimen derived from a living body can be stably stored in the form of a hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the method for detecting a protein contained in a specimen derived from a living body includes adding the specimen derived from a living body to the above-described stabilizing solution for stabilizing the protein. And a step of obtaining a sample containing a specimen derived from a living body, and a step of detecting a protein in the sample by an immunological measurement method.
  • a kit for detecting a protein contained in a specimen derived from a living body provided by another embodiment of the present invention includes the above-described stabilizing solution and a protein contained in a specimen derived from a living body. And a reagent containing an antibody that recognizes.
  • the protein contained in the specimen derived from the living body may be at least one selected from hemoglobin, haptoglobin, and hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the stabilization solution used in the present embodiment includes a storage solution for storing a specimen derived from a living body, a diluted solution for further diluting a sample in which the specimen is dispersed in the storage solution, and detecting a protein in the specimen.
  • a reaction solution in a kit or the like for example, a reaction solution in a kit or the like.
  • a solution for mixing with a sample and adjusting a measurement environment is included.
  • the immunological measurement method is a method using an antibody against a protein contained in a specimen derived from a living body, and a known immunological measurement method can be used.
  • the immunological measurement method may be, for example, an immunoaggregation method such as a latex agglutination method or a colloidal gold agglutination method, an immunochromatography method, or an ELISA method.
  • antibodies to proteins contained in specimens derived from living organisms which may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, and can recognize proteins contained in specimens derived from living organisms. It may be a fragment of an antibody against the protein contained in the specimen.
  • An antibody against a protein contained in a specimen derived from a living body may be any antibody that recognizes a protein to be measured, and may be an anti-hemoglobin antibody, an anti-haptoglobin antibody, or an anti-hemoglobin-haptoglobin complex antibody. These antibodies can be produced by a conventional method.
  • the detection of a protein, for example, hemoglobin, contained in a specimen derived from a living body can be performed as follows. First, a sample is added to a container containing a storage solution to prepare a sample. The specimen may be stored in the container for an arbitrary time, or a storage solution containing the specimen may be filtered to obtain a sample. Subsequently, hemoglobin in the sample is detected by an immunoassay method such as a latex agglutination method. More specifically, a reagent containing latex particles having an anti-hemoglobin antibody supported on the surface is added to the sample.
  • an immunoassay method such as a latex agglutination method. More specifically, a reagent containing latex particles having an anti-hemoglobin antibody supported on the surface is added to the sample.
  • the sample Before adding the reagent containing latex particles, the sample may be diluted with a diluent, or a reaction solution may be added.
  • the stabilizing solution containing the arylboronic acid may be any of a storage solution, a diluent, and a reaction solution. It is particularly preferred if the storage solution is the stabilizing solution described above, in which case the diluent and / or the reaction solution may or may not contain an aryl boronic acid.
  • hemoglobin forms a complex with haptoglobin in the specimen, while other hemoglobin exists as free hemoglobin.
  • the anti-hemoglobin antibody used for the detection of hemoglobin can recognize the released hemoglobin epitope as well as the hemoglobin epitope in the hemoglobin-haptoglobin complex, and does not cross-react with haptoglobin. Is preferred.
  • the anti-hemoglobin antibody recognizes hemoglobin, and latex particles carrying the antibody aggregate. The change in turbidity due to aggregation is measured, and the hemoglobin concentration in the sample is determined by a calibration curve created using a calibrator containing hemoglobin of known concentration.
  • the concentration of hemoglobin in the sample can be obtained from a calibration curve created based on the concentration of hemoglobin in the calibrator.
  • the hemoglobin can be detected, for example, as follows. First, a sample is added to a container containing a storage solution to prepare a sample. The specimen may be stored in the container for an arbitrary time, or the storage solution containing the specimen may be filtered to obtain a sample. Subsequently, hemoglobin in the sample is detected by an immunoassay method such as a latex agglutination method. More specifically, a reagent containing latex particles having an anti-hemoglobin antibody supported on the surface is added to the sample. Before adding the reagent containing latex particles, the sample may be diluted with a diluent, or a reaction solution may be added.
  • an immunoassay method such as a latex agglutination method. More specifically, a reagent containing latex particles having an anti-hemoglobin antibody supported on the surface is added to the sample. Before adding the reagent containing latex particles, the sample may be diluted with a diluent, or
  • the stabilizing solution containing arylboronic acid and haptoglobin may be any of a storage solution, a diluent, and a reaction solution. It is particularly preferred if the storage solution is a stabilizing solution comprising arylboronic acid and haptoglobin, in which case the diluent and / or reaction solution may or may not contain haptoglobin, and further, arylboronic acid May or may not be included.
  • hemoglobin when hemoglobin is present in the specimen, hemoglobin reacts with haptoglobin contained in the stabilization solution to form a hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the stabilized solution (sample) containing the sample may contain hemoglobin that has not formed a complex with haptoglobin. It is preferred that all hemoglobin forms a complex with haptoglobin.
  • the anti-hemoglobin antibody is preferably capable of recognizing an epitope of hemoglobin in the hemoglobin-haptoglobin complex and does not cross-react with haptoglobin. When hemoglobin is present in the sample, the anti-hemoglobin antibody recognizes hemoglobin (including hemoglobin complexed with haptoglobin), and latex particles carrying the antibody aggregate.
  • the change in turbidity due to aggregation is measured, and the hemoglobin concentration in the sample is determined by a calibration curve created using a calibrator containing a hemoglobin-haptoglobin complex with a known hemoglobin concentration.
  • concentration of the hemoglobin-haptoglobin complex in the sample can be obtained from a calibration curve created based on the concentration of the hemoglobin-haptoglobin complex of the calibrator.
  • Example 1 Prepare stock solution with 40 mmol / L HEPES (pH 6.8), 0.1% BSA, 0.1% NaN 3 , 1 unit / L haptoglobin, and 0-100 mmol / L phenylboronic acid did.
  • a sample obtained by adding the stool specimen to which hemoglobin was added to the storage solution so that the stool concentration was 0.5% was stored at 37 ° C. for 0, 7, 14, and 21 days.
  • the stool specimen was added with an amount of hemoglobin such that the hemoglobin concentration in the sample was about 300 ⁇ g / L.
  • a sample not containing the stool specimen in which hemoglobin was added to the storage solution so that the hemoglobin concentration in the sample was 300 ⁇ g / L was similarly stored.
  • the hemoglobin (Hb) concentration ( ⁇ g / L) in the stored sample was measured by a latex agglutination method.
  • the concentration of hemoglobin is “OC-hemodia (registered trademark) Auto III“ Eiken ”” (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) as a measuring reagent and “OC-sensor DIANA” (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) as a measuring device And measured.
  • the measurement reagent includes latex particles carrying an anti-human hemoglobin rabbit polyclonal antibody.
  • the recovery rate (%) relative to the hemoglobin concentration immediately after the stool specimen was added to the preservation solution was calculated.
  • the results are shown in Table 1.
  • the recovery rate of hemoglobin in the sample is improved by adding phenylboronic acid at a concentration of 0.5 mmol / L or more in any sample of stool 1, stool 2 and stool 3 did.
  • the recovery rate of hemoglobin was improved depending on the phenylboronic acid concentration.
  • the recovery rate was maximum at a phenylboronic acid concentration of 15 mmol / L, and the apparent recovery rate was reduced at an addition of 50 mmol / L or more.
  • phenylboronic acid stabilizes hemoglobin in samples containing feces. Since the hemoglobin in the sample exists as a hemoglobin-haptoglobin complex bound to the haptoglobin contained in the preservation solution, the above results indicate that phenylboronic acid has stabilized the hemoglobin-haptoglobin complex. .
  • Example 2 instead of phenylboronic acid in the stock solution of Example 1, 2-carboxyphenylboronic acid (2-CPBA), 3-carboxyphenylboronic acid (3-CPBA), 4-carboxyphenylboronic acid (4-CPBA), A stock solution was prepared by adding 15 mmol / L each of 3-hydroxyphenylboronic acid (3-HPBA) and 3-aminophenylboronic acid (3-APBA) and tested in the same manner as in Example 1. As a comparative example, a stock solution with no aryl boronic acid added was prepared and tested in the same manner. The results are shown in Table 2.
  • Example 3 The preservation
  • sugar sorbitol, sucrose, trehalose, glucose, fructose, or mannitol. Or a stock solution with no added sugar was prepared and tested as in Example 1. As a comparative example, a stock solution without the addition of phenylboronic acid and sugar was prepared and tested in the same manner. The results are shown in Table 3.
  • sorbitol sucrose, trehalose, glucose, fructose, or mannitol
  • the effects of sorbitol and mannitol were remarkable.
  • sorbitol showed no reduction in the recovery rate in the stool specimen (stool 1).
  • Example 4 A stock solution in which 100 mmol / L of sorbitol, sucrose, trehalose, glucose, fructose, or mannitol was added to the stock solution of Example 1 without phenylboronic acid was prepared and tested in the same manner as in Example 1. For comparison, the same test was performed without adding these sugars. The results are shown in Table 4. As is apparent from Table 4, even when sorbitol, sucrose, trehalose, glucose, or fructose is added to a storage solution that does not contain phenylboronic acid, the recovery rate of hemoglobin in the sample containing the stool specimen is not improved. This result shows that sugars such as sorbitol, sucrose, trehalose, glucose, or fructose alone do not stabilize hemoglobin in samples containing feces, and both phenylboronic acid and sugar must be present Is shown.
  • Example 5 Preparation of a storage solution in which phenylboronic acid in the storage solution of Example 1 was fixed at 15 mmol / L and 10 to 500 mmol / L sorbitol or 10 to 250 mmol / L sucrose was added, or a storage solution to which no sugar was added was prepared. Then, the same test as in Example 1 was performed. As a comparative example, a stock solution without the addition of phenylboronic acid and sugar was prepared and tested in the same manner. The results are shown in Table 5.
  • Example 6 Instead of phenylboronic acid in the stock solution of Example 1, 3-carboxyphenylboronic acid (3-CPBA), 3-hydroxyphenylboronic acid (3-HPBA) and 3-aminophenylboronic acid (3-APBA) were used. 15 mmol / L of each was added, and 100 mmol / L of a stock solution with sorbitol, sucrose, or mannitol added was prepared and tested as in Example 1. As a comparative example, a stock solution with no aryl boronic acid added was prepared and tested in the same manner. The results are shown in Table 6.
  • Example 7 The storage solution of Example 1 was adjusted to 0 to 50 mmol / L of phenylboronic acid, and a storage solution containing 100 mmol / L of sorbitol or mannitol was prepared and tested in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 7. As is apparent from Table 7, in the preservation solution to which sugar was added, no apparent reduction in the recovery rate was observed even when 50 mmol / L of phenylboronic acid was added. The reason for this is that although aryl boronic acid has the property of inhibiting the immunoaggregation reaction (at high concentration), the presence of high concentration of aryl boronic acid adversely affects the immunoassay and apparent recovery rate.
  • the arylboronic acid and the saccharide form a complex, thereby suppressing the adverse effects of the high concentration of arylboronic acid on the immunoassay method. It is considered to be done.
  • Example 8 A stock solution was prepared with the addition of 40 mmol / L HEPES (pH 6.8), 0.1% BSA, 0.1% NaN 3 , and 0-2.5 mmol / L phenylboronic acid. Instead of phenylboronic acid, 3-carboxyphenylboronic acid (3-CPBA), 3-hydroxyphenylboronic acid (3-HPBA), and 3-aminophenylboronic acid (3-APBA) were each added at 0.5 mmol / The stock solutions added in L were prepared together. Samples obtained by adding the stool specimen to which hemoglobin was added to the stock solution so that the stool concentration was 0.5% were stored at 37 ° C. for 0, 16, 38, and 62 hours.
  • the stool specimen was added with an amount of hemoglobin such that the hemoglobin concentration in the sample was about 300 ⁇ g / L.
  • a sample not containing the stool specimen in which hemoglobin was added to the storage solution so that the hemoglobin concentration in the sample was 300 ⁇ g / L was similarly stored.
  • the hemoglobin (Hb) concentration ( ⁇ g / L) in the stored sample was measured by the latex agglutination method using the same measuring reagent and measuring apparatus as in Example 1.
  • Example 9 The concentration of phenylboronic acid in the stock solution of Example 8 was fixed at 0.5 mmol / L, and 10 to 250 mmol / L sorbitol or sucrose, or 50 to 100 mmol / L trehalose, glucose, fructose or mannitol was further added. A stock solution was prepared and tested as in Example 8. In addition, a stock solution in which phenylboronic acid was added but no sugar was added, and as a comparative example, a stock solution in which phenylboronic acid and sugar were not added were prepared and tested in the same manner. The results are shown in Tables 9A and 9B.
  • the concentration of phenylboronic acid in the stock solution of Example 8 was fixed at 0.5 mmol / L, and instead of phenylboronic acid, 3-carboxyphenylboronic acid (3-CPBA), 3-hydroxyphenylboronic acid (3 -HPBA) and 3-aminophenylboronic acid (3-APBA) were added in an amount of 0.5 mmol / L, and a stock solution containing 100 mmol / L sorbitol or sucrose was prepared and tested as in Example 8. . As a comparative example, a stock solution with no aryl boronic acid added was prepared and tested in the same manner. The results are shown in Table 10.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、蛋白質を安定化する方法であって、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、アリールボロン酸と共存させる工程を含み、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質が、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、方法を提供する。本発明によれば、生体に由来する検体中に含まれる血液蛋白質等の蛋白質を安定化することができる。本発明はさらに、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための安定化溶液、ならびに生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を検出するための方法およびキットを提供する。

Description

検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液
　本発明は、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための安定化溶液、ならびに生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を検出するための方法およびキットに関する。
　糞便、尿、唾液等の検体中に含まれる蛋白質の検出は、多くの疾患の診断に有用である。例えば糞便検体中の血液を検出する便潜血検査により、大腸癌をはじめとする消化器疾患の診断における重要な情報を得ることができる。糞便等の検体中に含まれる、ヘモグロビンやハプトグロビン、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体等の血液蛋白質などを検出する方法として、これらの蛋白質に対する抗体を用いて検出する免疫学的測定方法が知られている。
　潜血検査に用いる検体は、通常、被験者自身が保存溶液の入った保存容器に採取し、病院等の検査機関に輸送される。多くの場合、検体を含有する保存溶液（試料）の輸送には数日間を要し、輸送中の温度の管理は一般的に困難なために、保存上好ましくない温度条件にさらされることも多い。検体中に含まれる血液蛋白質等の蛋白質が、輸送時の温度条件等によって変性したり、検体中の細菌や酵素によって分解または修飾されたりすることで、エピトープまたはその近傍の構造が変化すると、抗体がこれらの糞便中に含まれる蛋白質を認識できなくなり、免疫学的測定法による正確な測定ができなくなる。特にヘモグロビンは溶液中で不安定であり、高温条件下では特に変性または分解しやすい。
　保存溶液中のヘモグロビンを安定化する技術としては、例えば、チメロサール、クロルヘキシジン等の抗菌剤を添加する方法（例えば、特許文献１）、プロテアーゼ阻害物質を添加する方法（例えば、特許文献２）、グリコシダーゼ型溶菌酵素を添加する方法（例えば、特許文献３）、ヘモグロビンの酵素分解産物を添加する方法（例えば、特許文献４）、リンゴ酸等の有機酸を添加する方法（例えば、特許文献５）、イミノカルボン酸を添加する方法（例えば、特許文献６）、ハロアルカンスルホン酸を添加する方法（例えば、特許文献７）等の様々な方法が提案されている。
　さらに、ヘモグロビンを安定化するために、ハプトグロビンを添加する方法も知られている（例えば、特許文献８）。ハプトグロビンは、幅広い動物の血液中に存在し、ヘモグロビンと速やかに結合し、安定なヘモグロビン－ハプトグロビン複合体（Ｈｂ－Ｈｐ複合体）を形成することが知られている。糞便等の検体を保存する保存溶液等にあらかじめハプトグロビンを添加しておくことで、糞便等の検体を加えた際に、生体に由来する検体に含まれるヘモグロビンを、安定なヘモグロビン－ハプトグロビン複合体にすることができる。
　しかしながら、ヘモグロビンは非常に不安定であることから、これらのヘモグロビンの安定化方法であっても、その変性あるいは分解を十分に防ぐには至っていない。そのため、便潜血を検出する方法として、ヘモグロビンよりも安定性にすぐれたトランスフェリンを測定する方法も知られている（例えば、特許文献９）が、血液中のトランスフェリンは、ヘモグロビンの１／６０程度しか存在しないため、感度が低いという問題がある。
特開昭６３－２７１１６０号公報 特開平３－２７９８５９号公報 特開昭６３－２４６６６７号公報 特開平１１－２１８５３３号公報 特開２００３－１４７６８号公報 特開２００９－０９７９５６号公報 特開２０１６－１９１５８０号公報 特開平１０－１３２８２４号公報 特開昭６３－２４６６６８号公報
　糞便、尿、唾液等の生体由来の検体、特に糞便中には、ヘモグロビン等の蛋白質の分解や修飾を引き起こす細菌や酵素が多く存在するため、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体のような比較的安定性の高い蛋白質であっても、分解や修飾されてしまう場合があった。
　そこで、本発明は、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、分解や変性等の起こりやすい好ましくない温度条件においても安定性を高める方法を提供することを目的とする。
〔１〕　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法であって、
　前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、アリールボロン酸と共存させる工程を含み、
　前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質が、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、方法。
〔２〕　アリールボロン酸が、フェニルボロン酸およびその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕　アリールボロン酸が、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニルボロン酸、カルボキシフェニルボロン酸、アミノフェニルボロン酸およびこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種である、〔１〕〔２〕に記載の方法。
〔４〕　前記工程は、前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、前記アリールボロン酸を含む溶液中に分散させる工程であり、
　前記アリールボロン酸の前記溶液中の濃度が、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、〔１〕～〔３〕に記載の方法。
〔５〕　前記工程は、前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、前記アリールボロン酸および糖と共存させる工程である、〔１〕～〔４〕に記載の方法。
〔６〕　前記糖が、糖アルコール、単糖および二糖からなる群から選ばれる少なくとも一種である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕　前記糖が、ソルビトール、グルコース、マンニトール、フルクトース、キシリトール、エリトリトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、およびマルトースからなる群から選ばれる少なくとも一種である、〔５〕〔６〕に記載の方法。
〔８〕　前記工程は、前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、前記アリールボロン酸および前記糖を含む溶液中に分散させる工程であり、
　前記糖の前記溶液中の濃度が、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、〔５〕～〔７〕に記載の方法。
〔９〕　前記生体に由来する検体は、ヘモグロビンを少なくとも含み、
　前記方法は、当該ヘモグロビンと、ハプトグロビンとを接触させ、ヘモグロビンとハプトグロビンとの複合体を形成させる工程を含む、〔１〕～〔８〕に記載の方法。
〔１０〕　前記生体に由来する検体が、糞便、唾液、または尿である、〔１〕～〔９〕に記載の方法。
〔１１〕　生体に由来する検体に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液であって、
　アリールボロン酸を含み、
　前記生体に由来する検体に含まれる蛋白質が、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、安定化溶液。
〔１２〕　前記アリールボロン酸が、フェニルボロン酸およびその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、〔１１〕に記載の安定化溶液。
〔１３〕　前記アリールボロン酸が、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニルボロン酸、カルボキシフェニルボロン酸、アミノフェニルボロン酸およびこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種である、〔１１〕〔１２〕に記載の安定化溶液。
〔１４〕　糖を含む、〔１１〕～〔１３〕に記載の安定化溶液。
〔１５〕　糖が、ソルビトール、グルコース、マンニトール、フルクトース、キシリトール、エリトリトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、およびマルトースからなる群から選ばれる少なくとも一種である、〔１４〕に記載の安定化溶液。
〔１６〕　ハプトグロビンを含む、〔１１〕～〔１５〕に記載の安定化溶液。
〔１７〕　前記検体が糞便、唾液、または尿である、〔１１〕～〔１６〕に記載の安定化溶液。
〔１８〕　前記生体に由来する検体を保存するための溶液である、〔１１〕～〔１７〕に記載の安定化溶液。
〔１９〕　生体に由来する検体中の蛋白質を検出する方法であって、
　〔１１〕～〔１８〕に記載の安定化溶液に、前記生体に由来する検体を添加して当該検体を含有する試料を得る工程と、
　試料中の前記蛋白質を免疫学的測定方法により検出する工程と、
を備え、
　前記生体に由来する検体中の蛋白質が、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、方法。
〔２０〕　前記生体に由来する検体は、ヘモグロビンを少なくとも含み、
　前記試料中の前記ヘモグロビンはハプトグロビンと複合体を形成している、〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕　前記安定化溶液は、〔１６〕に記載の安定化溶液である、〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を検出するためのキットであって、
　〔１１〕～〔１８〕に記載の安定化溶液と、
　前記蛋白質を認識する抗体を含む試薬と、
を含み、
　前記蛋白質が、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、キット。
　本発明によれば、生体に由来する検体中に含まれる血液蛋白質等の蛋白質を安定化することができる。いいかえれば、本発明によれば、生体に由来する検体中に含まれる血液蛋白質等の蛋白質の変性、分解や修飾を防ぐことができる。よって、本発明によれば、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を免疫学的測定方法により正確に測定することが可能となる。
　以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
〔生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の安定化方法，蛋白質の安定化溶液〕
　本発明の一実施形態に係る、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の安定化方法は、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、アリールボロン酸と共存させる工程を含む。本実施形態において、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質は、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種であってよい。
　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、アリールボロン酸と共存させることにより、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の安定性を高めることができる。蛋白質を含む生体に由来する検体は、糞便、唾液、または尿であってよく、糞便であってよい。
　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、アリールボロン酸と共存させる方法は特に限定されないが、アリールボロン酸を含む溶液中に、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を分散させる方法が挙げられる。ここで、「分散」には溶解および懸濁が含まれる。
　アリールボロン酸を含む溶液としては、生体に由来する検体を保存するための保存溶液、検体を保存溶液に分散させた試料をさらに希釈するための希釈溶液、検体中の蛋白質を検出するためのキット等における反応溶液などが挙げられる。特に、本実施形態によれば、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の安定性を顕著に向上させることができるため、検体の保存溶液を好適に用いることができる。
　アリールボロン酸は、公知のものから適宜選択することができる。アリールボロン酸は、フェニルボロン酸およびその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種であってよく、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニルボロン酸、カルボキシフェニルボロン酸、アミノフェニルボロン酸およびこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であってよく、フェニルボロン酸、３－ヒドロキシフェニルボロン酸、２－カルボキシフェニルボロン酸、３－カルボキシフェニルボロン酸、４－カルボキシフェニルボロン酸、３－アミノフェニルボロン酸およびこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であってよく、特に、フェニルボロン酸、３－ヒドロキシフェニルボロン酸、３－カルボキシフェニルボロン酸、３－アミノフェニルボロン酸およびこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種であってよい。
　上記溶液中のアリールボロン酸の濃度は、下限値が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、または０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましい。アリールボロン酸の濃度が上記下限値以上であると、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の安定化効果がより優れたものとなる。
　また、上記溶液中のアリールボロン酸の濃度は、上限値が１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、または３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。アリールボロン酸の濃度が高くなりすぎると、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を免疫学的測定法にて測定したときに、見かけ上の回収率が低下することがある。これは、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の安定化効果が下がるのではなく、高濃度のアリールボロン酸が免疫学的測定に悪影響を与えているものと考えられる。しかし、アリールボロン酸の濃度が上記上限値以下であると、免疫学的測定法への悪影響が抑えられ、より正確に測定することができる。
　ただし、溶液中に高濃度のアリールボロン酸が含まれる場合であっても、後述する高濃度の糖と共存する場合には、アリールボロン酸と糖とが複合体を形成することで、高濃度のアリールボロン酸による免疫学的測定方法への悪影響が抑制される。そのため、高濃度の糖と共存する場合には、アリールボロン酸の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌ程度、さらには１００ｍｍｏｌ／Ｌ程度であっても、免疫学的測定法による正確な測定が確保される。
　本実施形態のより具体的な一態様として、アリールボロン酸は、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液（安定化溶液）に含有させることができる。例えば、安定化溶液が後述するハプトグロビンを含まない場合、アリールボロン酸の安定化溶液中の濃度は、下限値が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、または０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上とすることができる。また、アリールボロン酸の安定化溶液中の濃度は、上限値が２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、または５ｍｍｏｌ／Ｌ以下とすることができる。
　上記工程は、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、上記アリールボロン酸とともに、さらに糖と共存させる工程とすることができる。アリールボロン酸に加え、さらに糖と共存させることにより、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の安定性をさらに高めることができる。生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、糖と共存させる方法は、例えば、上記アリールボロン酸を含む溶液に、糖をさらに含有させる方法が挙げられる。
　糖は、公知のものから適宜選択することができ、例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール等の糖アルコール；グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース等の単糖；スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース等の二糖；オリゴ糖；などが挙げられる。
　糖は、糖アルコール、単糖および二糖からなる群から選ばれる少なくとも一種であってよく、ソルビトール、グルコース、マンニトール、フルクトース、キシリトール、エリトリトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、およびマルトースからなる群から選ばれる少なくとも一種であってよく、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、およびスクロースからなる群から選ばれる少なくとも一種であってよい。
　しかしながら、グルコースやフルクトース等の、溶液中でアルデヒド基やケトン基を形成する糖（還元糖）は、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質やこれら蛋白質の安定化剤として溶液に添加されるアルブミン等と反応して（メイラード反応）蛋白質を修飾し、褐色物質（メラノイジン）を生成するため、蛋白質と反応しない糖が好ましい。生体に由来する検体中に含まれる蛋白質のエピトープまたはその近傍が還元糖により修飾され構造が変化すると、抗体によっては、これらの生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を認識できなくなり、免疫学的測定法による正確な測定ができなくなることがある。そのため、本実施形態のより具体的な一態様としては、蛋白質と反応しない非還元糖を用いることがより好ましい。非還元糖は、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、トレハロース、スクロース、およびラクトースからなる群から選ばれる少なくとも一種であってよく、ソルビトール、マンニトールおよびスクロースからなる群から選ばれる少なくとも一種であってよい。
　糖の濃度は、下限値が５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、または２５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましい。糖の濃度が上記下限値以上であると、アリールボロン酸と相乗的に作用し、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の安定化効果がより一層優れたものとなる。
　糖の濃度の上限値は、糖アルコールおよび単糖では、１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、または１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよく、二糖では、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、または１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。糖の濃度が上記上限値以下であると、安定化溶液の粘度が高くなりすぎないため測定に支障が生じ難い。
　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を保存するための安定化溶液は、ｐＨを５～１０、好ましくは６～８にたもてる緩衝液であればよく、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ヒドロキシエチルピペラジン－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）等のグッド緩衝液を含む緩衝液であってよく、リン酸緩衝液、トリス緩衝液またはグリシン緩衝液であってもよい。
　安定化溶液は、抗菌剤、ｐＨ調整剤、イオン強度を調節するために塩類、界面活性剤、凝集促進剤、蛋白質の保存時に使用される公知の安定化剤等の添加剤をさらに含んでもよい。抗菌剤は、アジ化ナトリウム、抗生物質、溶菌酵素を含む。添加剤としては、ヒスチジン、リジン等のアミノ酸、アルブミン、プロテアーゼ阻害剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤など、蛋白質を安定化する作用を持つことが知られている公知の物質が含まれる。
　上述の安定化方法又は安定化溶液によれば、アリールボロン酸の作用により、またはアリールボロン酸と糖との相乗作用により、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の安定性を高めることができる。いいかえれば、上記の安定化方法又は安定化溶液によれば、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の変性、分解または修飾を防ぐことができ、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質のエピトープ及びその周辺部位の構造を維持することができる。そのため、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を免疫学的測定方法により検出する場合、検出の正確性の向上が期待できる。
　本実施形態のより具体的な一態様は、ヘモグロビンを少なくとも含む生体に由来する検体を、ハプトグロビンと接触させることにより、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成させる工程を含んでもよい。この場合において、ヘモグロビンを含む生体に由来する検体は、糞便、唾液、または尿であってよく、糞便であってよい。糞便中には、ヘモグロビンの分解や修飾を引き起こす細菌や酵素が特に多く存在するため、本実施形態の方法が特に有用である。
　ヘモグロビンを含む生体に由来する検体とハプトグロビンとはどのように接触させてもよいが、ハプトグロビンを含む前記保存溶液中に、ヘモグロビンを含む生体に由来する検体を添加するのが好ましい。生体に由来する検体中に含まれるヘモグロビンは、保存溶液中のハプトグロビンと速やかに反応し、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成する。そして、生体に由来する検体を添加した保存溶液をそのまま保存することで、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を安定的に保存することができる。なお、ヘモグロビンとハプトグロビンとの複合体形成では、ヘモグロビンは、α鎖とβ鎖が二つずつ会合した４量体（α２β２）から二つの２量体（αβ）に乖離するが、この現象は、本明細書における「分解」または「変性」には該当しない。
　本実施形態に係る、ヘモグロビンを含む生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための安定化溶液は、アリールボロン酸、またはアリールボロン酸および糖を含む上述の安定化溶液に、ハプトグロビンをさらに添加したものであることが好ましい。安定化溶液中のハプトグロビンの濃度は、生体に由来する検体の量にもよるが、例えば、０．０５単位／Ｌ～５０単位／Ｌ、０．１単位／Ｌ～１０単位／Ｌ、または、０．２単位／Ｌ～２単位／Ｌである。ここで、１単位は、１ｍｇのヘモグロビンに結合するハプトグロビンの量を表す。上記範囲のハプトグロビン濃度は、生体に由来する検体中の全てのヘモグロビンを、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体にするのに十分な濃度である。
　ここで、安定化溶液が後述するハプトグロビンを含む場合、上記アリールボロン酸の安定化溶液中の濃度は、下限値が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、または５ｍｍｏｌ／Ｌ以上とすることができる。アリールボロン酸の濃度が上記下限値以上であると、生体に由来する検体中に含まれるヘモグロビンのアリールボロン酸による安定化効果が、ハプトグロビンによる安定化効果と相まって、より顕著なものとなる。
　また、アリールボロン酸の安定化溶液中の濃度は、上限値が１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、または３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下とすることができる。アリールボロン酸の濃度が上記上限値以下であると、免疫学的測定法への悪影響が抑えられ、より正確な測定が可能となる。
　上述の一態様に係る安定化方法または安定化溶液によれば、生体に由来する検体中に含まれるヘモグロビンを、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の形で、安定的に保存することができる。いいかえれば、上述の安定化方法または安定化溶液によれば、生体に由来する検体中に含まれるヘモグロビンの変性、分解または修飾を防ぐことができ、ヘモグロビンのエピトープおよびその周辺部位の構造を保持することができる。したがって、生体に由来する検体中に含まれるヘモグロビンを免疫学的測定方法により測定する場合、検出の正確性の向上が期待できる。
〔生体に由来する検体中に含まれる蛋白質の検出方法，検出キット〕
　本発明の一実施形態により提供される、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を検出する方法は、当該蛋白質を安定化させるための上述の安定化溶液に生体に由来する検体を添加して、生体に由来する検体を含む試料を得る工程と、試料中の蛋白質を免疫学的測定方法により検出する工程と、を備える。
　また、本発明の他の一実施形態により提供される、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を検出するためのキットは、上述の安定化溶液と、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を認識する抗体を含む試薬と、を含む。
　上記検出方法または検出キットにおいて、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質は、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体から選ばれる少なくとも一種であってよい。
　本実施形態で用いられる安定化溶液としては、生体に由来する検体を保存するための保存溶液、検体を保存溶液に分散させた試料をさらに希釈するための希釈溶液、検体中の蛋白質を検出するためのキット等における反応溶液などが挙げられる。キット等における反応溶液としては、後述する免疫学的測定方法における抗体を含有する溶液のほか、試料と混合し測定環境を調整するための溶液などが含まれる。
　免疫学的測定方法は、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質に対する抗体を利用する方法であり、公知の免疫学的測定手法を使用することができる。免疫学的測定方法は、例えば、ラテックス凝集法や金コロイド凝集法等の免疫凝集法、イムノクロマトグラフ法、またはＥＬＩＳＡ法であってよい。
　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質に対する抗体に制限はなく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を認識可能な、生体に由来する検体中に含まれる蛋白質に対する抗体の断片であってもよい。
　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質に対する抗体は、測定対象となる蛋白質を認識するものであればよく、抗ヘモグロビン抗体、抗ハプトグロビン抗体、抗ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体抗体であってよい。これらの抗体は、常法により製造することができる。
　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質、例えばヘモグロビンの検出は、一例として、次のように行うことができる。まず、保存溶液の入った容器に検体を添加し、試料とする。容器内で検体を任意の時間保存してもよく、また検体を含有する保存溶液をろ過して試料としてもよい。次いで、試料中のヘモグロビンを、免疫学的測定方法、例えばラテックス凝集法により検出する。より具体的には、抗ヘモグロビン抗体を表面に担持させたラテックス粒子を含む試薬を、試料に加える。ラテックス粒子を含む試薬を加える前に、試料を希釈液により希釈してもよく、また反応溶液を添加してもよい。本態様において、アリールボロン酸を含む上述した安定化溶液は、保存溶液、希釈液、反応溶液のいずれであってもよい。保存溶液が、上述した安定化溶液であると、特に好ましく、この場合において、希釈液および／または反応溶液は、アリールボロン酸を含んでも含まなくてもよい。
　ヘモグロビンは、生体に由来する検体中において、検体中のハプトグロビンと複合体を形成しているものもあれば、遊離したヘモグロビンとして存在しているものもある。そのため、ヘモグロビンの検出に用いる抗ヘモグロビン抗体は、遊離したヘモグロビンのエピトープを認識可能であるとともに、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体におけるヘモグロビンのエピトープをも認識可能であり、かつ、ハプトグロビンと交差反応を起こさないことが好ましい。
　試料中にヘモグロビンが存在する場合、抗ヘモグロビン抗体がヘモグロビンを認識し、抗体を担持しているラテックス粒子が凝集する。凝集による濁度の変化を測定し、濃度既知のヘモグロビンを含むキャリブレータを用いて作成した検量線により、試料中のヘモグロビン濃度を求める。また、キャリブレータのヘモグロビンの濃度に基づいて作成した検量線により、試料中のヘモグロビンの濃度を求めることもできる。
　上記安定化溶液がハプトグロビンを含む場合においては、ヘモグロビンの検出は、例えば、次のように行うことができる。まず、保存溶液の入った容器に検体を添加し、試料とする。容器内で検体を任意の時間保存してもよく、また、検体を含有する保存溶液をろ過して試料としてもよい。次いで、試料中のヘモグロビンを、免疫学的測定方法、例えばラテックス凝集法により検出する。より具体的には、抗ヘモグロビン抗体を表面に担持させたラテックス粒子を含む試薬を、試料に加える。ラテックス粒子を含む試薬を加える前に、試料を希釈液により希釈してもよく、また反応溶液を添加してもよい。
　本態様において、アリールボロン酸およびハプトグロビンを含む安定化溶液は、保存溶液、希釈液、反応溶液のいずれであってもよい。
　保存溶液が、アリールボロン酸およびハプトグロビンを含む安定化溶液であると、特に好ましく、この場合において、希釈液および／または反応溶液は、ハプトグロビンを含んでも含まなくてもよく、さらには、アリールボロン酸を含んでも含まなくてもよい。
　本態様においては、検体中にヘモグロビンが存在する場合、ヘモグロビンは、安定化溶液に含まれるハプトグロビンと反応し、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成する。検体中の全てのヘモグロビンが複合体を形成する必要はなく、検体を含有する安定化溶液（試料）には、ハプトグロビンと複合体を形成していないヘモグロビンが存在してもよいが、検体中の全てのヘモグロビンがハプトグロビンと複合体を形成していることが好ましい。
　抗ヘモグロビン抗体は、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体におけるヘモグロビンのエピトープを認識可能であり、かつ、ハプトグロビンと交差反応を起こさないことが好ましい。
　試料中にヘモグロビンが存在する場合、抗ヘモグロビン抗体がヘモグロビン（ハプトグロビンと複合体を形成したヘモグロビンを含む）を認識し、抗体を担持しているラテックス粒子が凝集する。凝集による濁度の変化を測定し、ヘモグロビン濃度既知のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含むキャリブレータを用いて作成した検量線により、試料中のヘモグロビン濃度を求める。また、キャリブレータのヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の濃度に基づいて作成した検量線により、試料中のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の濃度を求めることもできる。
　以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。
　実施例１
　４０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、０．１％のＢＳＡ、０．１％のＮａＮ３、１単位／Ｌのハプトグロビン、および０～１００ｍｍｏｌ／Ｌのフェニルボロン酸を添加した保存溶液を調製した。ヘモグロビンを添加した糞便検体を、糞便濃度が０．５％となるように保存溶液に加えた試料を、３７℃で、０、７、１４および２１日保存した。なお、糞便検体には、試料中のヘモグロビン濃度が約３００μｇ／Ｌとなる量のヘモグロビンを添加した。ヘモグロビンを添加した糞便検体に代えて、試料中のヘモグロビン濃度が３００μｇ／Ｌとなるようにヘモグロビンを保存溶液に添加した、糞便検体を含まない試料を、同様に保存した。保存した試料中のヘモグロビン（Ｈｂ）濃度（μｇ／Ｌ）を、ラテックス凝集法により測定した。
　ヘモグロビンの濃度は、測定試薬として「ＯＣ－ヘモディア（登録商標）オートＩＩＩ‘栄研’」（栄研化学株式会社製）、測定装置として「ＯＣ－センサーＤＩＡＮＡ」（栄研化学株式会社製）を用いて測定した。上記測定試薬は、抗ヒトヘモグロビンウサギポリクローナル抗体を担持させたラテックス粒子を含む。
　測定したヘモグロビンの濃度から、糞便検体を保存溶液に加えた直後のヘモグロビン濃度（すなわち、糞便検体を加えてから０日後の濃度）に対する回収率（％）を算出した。結果を表１に示す。表１から明らかなように、糞便１、糞便２および糞便３のいずれの試料においても、フェニルボロン酸を０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で添加することにより、試料中のヘモグロビンの回収率が向上した。ヘモグロビンの回収率はフェニルボロン酸濃度に依存して向上し、フェニルボロン酸濃度１５ｍｍｏｌ／Ｌで最大となり、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の添加では見かけ上の回収率が低下した。糞便検体を含まない試料においては、フェニルボロン酸の添加による回収率の向上は見られない。これらの結果は、フェニルボロン酸が、糞便を含む試料中のヘモグロビンを安定化することを示している。なお、試料中のヘモグロビンは、保存溶液中に含まれるハプトグロビンと結合したヘモグロビン－ハプトグロビン複合体として存在するため、上記結果は、フェニルボロン酸が、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を安定化したことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例２
　実施例１の保存溶液のフェニルボロン酸に替えて、２－カルボキシフェニルボロン酸（２－ＣＰＢＡ）、３－カルボキシフェニルボロン酸（３－ＣＰＢＡ）、４－カルボキシフェニルボロン酸（４－ＣＰＢＡ）、３－ヒドロキシフェニルボロン酸（３－ＨＰＢＡ）および３－アミノフェニルボロン酸（３－ＡＰＢＡ）をそれぞれ１５ｍｍｏｌ／Ｌずつ添加した保存溶液を調製し、実施例１と同様に試験した。比較例として、アリールボロン酸を添加しない保存溶液を調製して、同様に試験した。結果を表２に示す。表２から明らかなように、他のアリールボロン酸を用いた場合であっても、アリールボロン酸を添加しない比較例と比べて、糞便１、糞便２および糞便３のいずれの糞便検体においても、試料中のヘモグロビンの回収率が向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例３
　実施例１の保存溶液のフェニルボロン酸の濃度を１５ｍｍｏｌ／Ｌに固定して、５０ｍｍｏｌ／Ｌもしくは１００ｍｍｏｌ／Ｌの糖（ソルビトール、スクロース、トレハロース、グルコース、フルクトース、またはマンニトール）をさらに添加した保存溶液、または糖を添加しない保存溶液を調製し、実施例１と同様に試験した。比較例として、フェニルボロン酸および糖を添加しない保存溶液を調製して、同様に試験した。結果を表３に示す。表３から明らかなように、フェニルボロン酸に、ソルビトール、マンニトール、スクロース、またはフルクトースをさらに添加した場合、糞便１、糞便２および糞便３のいずれの糞便検体においても、試料中のヘモグロビンの回収率がさらに向上し、特にソルビトールおよびマンニトールで顕著に回収率が向上した。しかし、トレハロース、またはグルコースでは、回収率の向上が見られない糞便検体（糞便３）も認められた。これらの結果は、フェニルボロン酸に、糖をさらに添加することで、糞便を含む試料中のヘモグロビンの安定性を、さらに向上することができるが、添加する糖の種類により、効果に差異があることを示している。ソルビトール、スクロース、トレハロース、グルコース、フルトース、またはマンニトールの中では、ソルビトールおよびマンニトールの効果が顕著であり、特にソルビトールは糞便検体（糞便１）において回収率の低下がまったく見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例４
　フェニルボロン酸を含まない実施例１の保存溶液に、１００ｍｍｏｌ／Ｌの、ソルビトール、スクロース、トレハロース、グルコース、フルクトース、またはマンニトールを添加した保存溶液を調製し、実施例１と同様に試験した。比較のため、これらの糖を添加しないで、同様に試験した。結果を表４に示す。表４から明らかなように、フェニルボロン酸を含まない保存溶液に、ソルビトール、スクロース、トレハロース、グルコース、またはフルクトースを添加しても、糞便検体を含む試料中のヘモグロビンの回収率は向上しない。この結果は、ソルビトール、スクロース、トレハロース、グルコース、またはフルクトース等の糖単独では、糞便を含む試料中のヘモグロビンを安定化しないことを示しており、フェニルボロン酸と糖がともに存在する必要があることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例５
　実施例１の保存溶液のフェニルボロン酸を１５ｍｍｏｌ／Ｌに固定して、１０～５００ｍｍｏｌ／Ｌのソルビトール、もしくは１０～２５０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロースを添加した保存溶液、または糖を添加しない保存溶液を調製し、実施例１と同様に試験した。比較例として、フェニルボロン酸および糖を添加しない保存溶液を調製して、同様に試験した。結果を表５に示す。表５から明らかなように、糞便１、糞便２および糞便３のいずれの試料においても、ソルビトール、またはスクロースの添加濃度に依存して、糞便を含む試料中のヘモグロビンの回収率は向上し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ以上の添加で一定化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例６
　実施例１の保存溶液のフェニルボロン酸に替えて、３－カルボキシフェニルボロン酸（３－ＣＰＢＡ）、３－ヒドロキシフェニルボロン酸（３－ＨＰＢＡ）および３－アミノフェニルボロン酸（３－ＡＰＢＡ）をそれぞれ１５ｍｍｏｌ／Ｌずつ添加し、１００ｍｍｏｌ／Ｌの、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールを添加した保存溶液を調製し、実施例１と同様に試験した。比較例として、アリールボロン酸を添加しない保存溶液を調製して、同様に試験した。結果を表６に示す。表６から明らかなように、他のアリールボロン酸を用いた場合であっても、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールをさらに添加した場合、糞便１、糞便２および糞便３のいずれの糞便検体においても、試料中のヘモグロビンの回収率がさらに向上し、糞便を含む試料中のヘモグロビンの安定性を相乗的に高めることできると認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　実施例７
　実施例１の保存溶液のフェニルボロン酸を０～５０ｍｍｏｌ／Ｌとし、１００ｍｍｏｌ／Ｌの、ソルビトール、またはマンニトールを添加した保存溶液を調製し、実施例１と同様に試験した。結果を表７に示す。表７から明らかなように、糖を添加した保存溶液においては、フェニルボロン酸を５０ｍｍｏｌ／Ｌ添加しても見かけ上の回収率の低下が見られない。この理由は、アリールボロン酸は（高濃度において）免疫凝集反応を阻害する性質を有しているものの、高濃度のアリールボロン酸が存在すると免疫学的測定方法に悪影響を与え見かけ上の回収率が低下する一方で、さらに高濃度の糖が共存する場合には、アリールボロン酸と糖とが複合体を形成することで、高濃度のアリールボロン酸による免疫学的測定方法への悪影響が抑制されるものと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　実施例８
　４０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、０．１％のＢＳＡ、０．１％のＮａＮ３、および０～２．５ｍｍｏｌ／Ｌのフェニルボロン酸を添加した保存溶液を調製した。また、フェニルボロン酸に替えて、３－カルボキシフェニルボロン酸（３－ＣＰＢＡ）、３－ヒドロキシフェニルボロン酸（３－ＨＰＢＡ）および３－アミノフェニルボロン酸（３－ＡＰＢＡ）をそれぞれ０．５ｍｍｏｌ／Ｌずつ添加した保存溶液を合わせて調製した。ヘモグロビンを添加した糞便検体を、糞便濃度が０．５％となるように保存溶液に加えた試料を、３７℃で、０、１６、３８および６２時間保存した。なお、糞便検体には、試料中のヘモグロビン濃度が約３００μｇ／Ｌとなる量のヘモグロビンを添加した。ヘモグロビンを添加した糞便検体に代えて、試料中のヘモグロビン濃度が３００μｇ／Ｌとなるようにヘモグロビンを保存溶液に添加した、糞便検体を含まない試料を、同様に保存した。保存した試料中のヘモグロビン（Ｈｂ）濃度（μｇ／Ｌ）を、実施例１と同じ測定試薬および測定装置を用い、ラテックス凝集法により測定した。
　本実施例では、保存溶液にハプトグロビンが含まれていないため、実施例１～７と比べるとヘモグロビンは早く分解してしまうが、アリールボロン酸によるヘモグロビンの安定化効果は、本実施例においても認められた。すなわち、表８から明らかなように、糞便１、糞便２および糞便３のいずれの試料においても、アリールボロン酸を０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で添加することにより、試料中のヘモグロビンの回収率が向上した。なお、実施例１～７と異なり保存溶液中にハプトグロビンが含まれていないため、試料中のヘモグロビンの大半はハプトグロビンと複合体を形成せずに存在していると認められる。そのため、上記結果は、アリールボロン酸が、ハプトグロビンと複合体を形成していないヘモグロビンについても安定化したことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例９
　実施例８の保存溶液のフェニルボロン酸の濃度を０．５ｍｍｏｌ／Ｌに固定して、１０～２５０ｍｍｏｌ／Ｌのソルビトールもしくはスクロース、または５０～１００ｍｍｏｌ／Ｌのトレハロース、グルコース、フルクトースもしくはマンニトールをさらに添加した保存溶液を調製し、実施例８と同様に試験した。また、フェニルボロン酸を添加し糖を添加しない保存溶液、さらに比較例として、フェニルボロン酸および糖を添加しない保存溶液を調製して、同様に試験した。結果を表９Ａおよび９Ｂに示す。表９Ａおよび９Ｂから明らかなように、ハプトグロビンを含まない保存溶液であっても、フェニルボロン酸に、ソルビトール、スクロース、トレハロース、グルコース、フルクトースまたはマンニトールをさらに添加した場合、糞便１、糞便２および糞便３のいずれの糞便検体においても、試料中のヘモグロビンの回収率がさらに向上した。また、フェニルボロン酸を含まない保存溶液に糖を添加しても、糞便検体を含む試料中のヘモグロビンの回収率は向上しない。これらの結果は、ハプトグロビンを含まない保存溶液であっても、実施例２～７と同様にフェニルボロン酸と各種糖との相乗効果が得られることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　実施例８の保存溶液のフェニルボロン酸の濃度を０．５ｍｍｏｌ／Ｌに固定し、またフェニルボロン酸に替えて、３－カルボキシフェニルボロン酸（３－ＣＰＢＡ）、３－ヒドロキシフェニルボロン酸（３－ＨＰＢＡ）および３－アミノフェニルボロン酸（３－ＡＰＢＡ）をそれぞれ０．５ｍｍｏｌ／Ｌずつ添加し、１００ｍｍｏｌ／Ｌのソルビトールまたはスクロースを添加した保存溶液を調製し、実施例８と同様に試験した。比較例として、アリールボロン酸を添加しない保存溶液を調製して、同様に試験した。結果を表１０に示す。表１０から明らかなように、ハプトグロビンを含まない保存溶液であっても、各種のアリールボロン酸と糖との併用により試料中のヘモグロビンの回収率がさらに向上し、糞便を含む試料中のヘモグロビンの安定性を相乗的に高めることできると認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011

Claims (22)

  1. 　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法であって、
    　前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、アリールボロン酸と共存させる工程を含み、
    　前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質が、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、方法。
  2. 　アリールボロン酸が、フェニルボロン酸およびその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１に記載の方法。
  3. 　アリールボロン酸が、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニルボロン酸、カルボキシフェニルボロン酸、アミノフェニルボロン酸およびこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記工程は、前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、前記アリールボロン酸を含む溶液中に分散させる工程であり、
    　前記アリールボロン酸の前記溶液中の濃度が、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記工程は、前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、前記アリールボロン酸および糖と共存させる工程である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記糖が、糖アルコール、単糖および二糖からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記糖が、ソルビトール、グルコース、マンニトール、フルクトース、キシリトール、エリトリトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、およびマルトースからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 　前記工程は、前記生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を、前記アリールボロン酸および前記糖を含む溶液中に分散させる工程であり、
    　前記糖の前記溶液中の濃度が、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記生体に由来する検体は、ヘモグロビンを少なくとも含み、
    　前記方法は、当該ヘモグロビンと、ハプトグロビンとを接触させ、ヘモグロビンとハプトグロビンとの複合体を形成させる工程を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記生体に由来する検体が、糞便、唾液、または尿である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　生体に由来する検体に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液であって、
    　アリールボロン酸を含み、
    　前記生体に由来する検体に含まれる蛋白質が、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、安定化溶液。
  12. 　前記アリールボロン酸が、フェニルボロン酸およびその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１１に記載の安定化溶液。
  13. 　前記アリールボロン酸が、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニルボロン酸、カルボキシフェニルボロン酸、アミノフェニルボロン酸およびこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１１または１２に記載の安定化溶液。
  14. 　糖を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の安定化溶液。
  15. 　糖が、ソルビトール、グルコース、マンニトール、フルクトース、キシリトール、エリトリトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、およびマルトースからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１４に記載の安定化溶液。
  16. 　ハプトグロビンを含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の安定化溶液。
  17. 　前記検体が糞便、唾液、または尿である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の安定化溶液。
  18. 　前記生体に由来する検体を保存するための溶液である、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の安定化溶液。
  19. 　生体に由来する検体中の蛋白質を検出する方法であって、
    　請求項１１～１８のいずれか一項に記載の安定化溶液に、前記生体に由来する検体を添加して当該検体を含有する試料を得る工程と、
    　試料中の前記蛋白質を免疫学的測定方法により検出する工程と、
    を備え、
    　前記生体に由来する検体中の蛋白質が、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、方法。
  20. 　前記生体に由来する検体は、ヘモグロビンを少なくとも含み、
    　前記試料中の前記ヘモグロビンはハプトグロビンと複合体を形成している、請求項１９に記載の方法。
  21. 　前記安定化溶液は、請求項１６に記載の安定化溶液である、請求項２０に記載の方法。
  22. 　生体に由来する検体中に含まれる蛋白質を検出するためのキットであって、
    　請求項１１～１８のいずれか一項に記載の安定化溶液と、
    　前記蛋白質を認識する抗体を含む試薬と、
    を含み、
    　前記蛋白質が、ヘモグロビン、ハプトグロビン、およびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一種である、キット。
PCT/JP2019/007867 2018-03-02 2019-02-28 検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液 WO2019168109A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/977,338 US20200407425A1 (en) 2018-03-02 2019-02-28 Method of stabilizing protein contained in specimen and solution for stabilizing protein contained in specimen
CN201980016412.5A CN111788484A (zh) 2018-03-02 2019-02-28 稳定样本中所含蛋白质的方法、用于稳定样本中所含蛋白质的溶液
JP2020503617A JP7237924B2 (ja) 2018-03-02 2019-02-28 検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液
AU2019227781A AU2019227781A1 (en) 2018-03-02 2019-02-28 Method for stabilizing protein contained in sample and solution for stabilizing protein contained in sample
SG11202008338PA SG11202008338PA (en) 2018-03-02 2019-02-28 Method of stabilizing protein contained in specimen and solution for stabilizing protein contained in specimen
EP19761056.1A EP3761030A4 (en) 2018-03-02 2019-02-28 METHOD FOR STABILIZING PROTEIN IN A SAMPLE AND SOLUTION FOR STABILIZING PROTEIN IN A SAMPLE
KR1020207028304A KR102678099B1 (ko) 2018-03-02 2019-02-28 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키는 방법, 검체 중에 포함된 단백질을 안정화시키기 위한 용액

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018037227 2018-03-02
JP2018-037227 2018-03-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019168109A1 true WO2019168109A1 (ja) 2019-09-06

Family

ID=67805478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/007867 WO2019168109A1 (ja) 2018-03-02 2019-02-28 検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20200407425A1 (ja)
EP (1) EP3761030A4 (ja)
JP (1) JP7237924B2 (ja)
KR (1) KR102678099B1 (ja)
CN (1) CN111788484A (ja)
AU (1) AU2019227781A1 (ja)
SG (1) SG11202008338PA (ja)
TW (1) TWI787473B (ja)
WO (1) WO2019168109A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4280882A2 (en) * 2021-01-21 2023-11-29 Jp Laboratories, Inc. Materials and methods for extending shelf-life of foods

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63246667A (ja) 1987-03-31 1988-10-13 Kyoto Ikagaku Kenkyusho:Kk 糞便中のヘモグロビンの検出方法
JPS63246668A (ja) 1987-03-31 1988-10-13 Kyoto Ikagaku Kenkyusho:Kk 糞便中の潜血検出方法
JPS63271160A (ja) 1987-02-04 1988-11-09 インターナシヨナル・イムノアツセイ・ラボラトリース・インコーポレーテツド 糞便試料のイムノアツセイの組成物および方法
JPH03279859A (ja) 1990-03-28 1991-12-11 Nitto Denko Corp ヒトヘモグロビンの検出方法
JPH08262020A (ja) * 1995-03-17 1996-10-11 Wako Pure Chem Ind Ltd ヒトヘモグロビンの安定化方法
JPH09224942A (ja) * 1996-02-28 1997-09-02 Nippon Shoji Kk ヒトヘモグロビンの安定化方法
JPH10132824A (ja) 1996-10-28 1998-05-22 Eiken Chem Co Ltd ヘモグロビンの安定化方法
JPH11218533A (ja) 1998-01-30 1999-08-10 Eiken Chem Co Ltd ヘモグロビン試料の安定化
JP2000206117A (ja) * 1999-01-14 2000-07-28 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd ヒトヘモグロビンの安定化方法
JP2000258420A (ja) * 1999-03-05 2000-09-22 Azwell Inc 溶液中のヒトヘモグロビンの安定化方法および安定化溶液
JP2003014768A (ja) 2001-06-29 2003-01-15 Eiken Chem Co Ltd ヘムタンパク質の安定化方法および保存溶液
JP2009097956A (ja) 2007-10-16 2009-05-07 Eiken Chem Co Ltd ヘムタンパク質の安定化方法及び保存溶液
WO2011058958A1 (ja) * 2009-11-10 2011-05-19 富士レビオ株式会社 ヘムタンパク質の安定化用組成物及びそれを用いたヘムタンパク質の安定化方法
JP2016191580A (ja) 2015-03-31 2016-11-10 栄研化学株式会社 ヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63243756A (ja) * 1987-03-31 1988-10-11 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd 潜血を検査するための糞便試料の保存方法
CA1312825C (en) * 1988-01-27 1993-01-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Prevention or interruption of panic states with an imidazobenzodiazepine
AU769123B2 (en) 1998-09-22 2004-01-15 Ortho-Clinical Diagnostics Stabilisation of peroxidases
GB2353797A (en) * 1999-09-01 2001-03-07 Ortho Clinical Diagnostics Stabilisation of peroxidases
US20110174621A1 (en) * 2010-01-19 2011-07-21 Satoshi Yonehara Method for Analyzing Sample by Electrophoresis and Use of the Same
WO2017146647A1 (en) * 2016-02-22 2017-08-31 Agency For Science, Technology And Research Method for detecting an analyte using surface enhanced raman spectroscopy

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63271160A (ja) 1987-02-04 1988-11-09 インターナシヨナル・イムノアツセイ・ラボラトリース・インコーポレーテツド 糞便試料のイムノアツセイの組成物および方法
JPS63246667A (ja) 1987-03-31 1988-10-13 Kyoto Ikagaku Kenkyusho:Kk 糞便中のヘモグロビンの検出方法
JPS63246668A (ja) 1987-03-31 1988-10-13 Kyoto Ikagaku Kenkyusho:Kk 糞便中の潜血検出方法
JPH03279859A (ja) 1990-03-28 1991-12-11 Nitto Denko Corp ヒトヘモグロビンの検出方法
JPH08262020A (ja) * 1995-03-17 1996-10-11 Wako Pure Chem Ind Ltd ヒトヘモグロビンの安定化方法
JPH09224942A (ja) * 1996-02-28 1997-09-02 Nippon Shoji Kk ヒトヘモグロビンの安定化方法
JPH10132824A (ja) 1996-10-28 1998-05-22 Eiken Chem Co Ltd ヘモグロビンの安定化方法
JPH11218533A (ja) 1998-01-30 1999-08-10 Eiken Chem Co Ltd ヘモグロビン試料の安定化
JP2000206117A (ja) * 1999-01-14 2000-07-28 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd ヒトヘモグロビンの安定化方法
JP2000258420A (ja) * 1999-03-05 2000-09-22 Azwell Inc 溶液中のヒトヘモグロビンの安定化方法および安定化溶液
JP2003014768A (ja) 2001-06-29 2003-01-15 Eiken Chem Co Ltd ヘムタンパク質の安定化方法および保存溶液
JP2009097956A (ja) 2007-10-16 2009-05-07 Eiken Chem Co Ltd ヘムタンパク質の安定化方法及び保存溶液
WO2011058958A1 (ja) * 2009-11-10 2011-05-19 富士レビオ株式会社 ヘムタンパク質の安定化用組成物及びそれを用いたヘムタンパク質の安定化方法
JP2016191580A (ja) 2015-03-31 2016-11-10 栄研化学株式会社 ヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3761030A4
SUZUKI, YOICHI ET AL.: "Stabilization technology of enzyme in liquid laundry detergent and the possibility of compound enzyme combination by it", SYMPOSIUM ON CLEANING, vol. 41, 8 October 2009 (2009-10-08), pages 101 - 102, XP009523591 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3761030A4 (en) 2022-03-02
KR20200128122A (ko) 2020-11-11
SG11202008338PA (en) 2020-09-29
TWI787473B (zh) 2022-12-21
CN111788484A (zh) 2020-10-16
JPWO2019168109A1 (ja) 2021-02-25
EP3761030A1 (en) 2021-01-06
TW201939037A (zh) 2019-10-01
AU2019227781A1 (en) 2020-09-17
US20200407425A1 (en) 2020-12-31
JP7237924B2 (ja) 2023-03-13
KR102678099B1 (ko) 2024-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8445719B2 (en) Method of stabilizing heme protein and storage solution therefor
EP2299270A1 (en) Method for stabilizing microparticles having reactive substance bound thereto, and reagent containing the microparticles
JP7508494B2 (ja) ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法
JP7237924B2 (ja) 検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液
JP4261665B2 (ja) 溶液中のヒトヘモグロビンの安定化方法および安定化溶液
US11668704B2 (en) Degradation preventing means for immunoassay reagent containing insoluble carrier particles
TWI841542B (zh) 將血紅素與血紅素結合球蛋白之複合體安定化之方法、及用以保存含有血紅素之檢體之保存溶液
JP4798600B2 (ja) フルクトシルペプチドオキシダ−ゼの安定化方法
WO2019107414A1 (ja) ヘモグロビンとハプトグロビンとの複合体を安定化する方法、及びヘモグロビンを含む検体を保存するための保存溶液
CN109975555B (zh) 一种提高c反应蛋白试剂盒热稳定性的试剂、方法以及高热稳定性c反应蛋白试剂盒
JPH09224942A (ja) ヒトヘモグロビンの安定化方法
EP3531130A1 (en) Immunoassay method and assay reagent
JP2000221190A (ja) 尿中蛋白の安定化方法、安定化剤およびこれを応用した免疫学的測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19761056

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020503617

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019227781

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20190228

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20207028304

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019761056

Country of ref document: EP

Effective date: 20201002