WO2019101417A1 - Amylase und eine solche enthaltendes wasch- oder reinigungsmittel - Google Patents
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Definitions
- the invention is in the field of enzyme technology.
- the invention relates to amylases which can be used in particular with regard to the use in detergents and cleaning agents, all sufficiently similar amylases with a correspondingly similar sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and nucleic acids coding for them.
- the invention further relates to the preparation thereof and to processes for using these amylases, their use as such and compositions containing them, in particular washing and cleaning agents.
- Alpha-amylases are among the most technically important enzymes. Their use for detergents and cleaning agents is established industrially and they are typically contained in modern, powerful detergents and cleaners.
- An amylase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of the internal a (1-4) glycoside bonds of amylose but not the cleavage of terminal or a- (1-6) -glycoside bonds. Amylases are therefore a group of esterases (E.C. 3.2.1.1.). Amylases catalyze the cleavage of starch, glycogen, and other oligo- and polysaccharides that have an a (1-4) -glycoside bond.
- amylases act against starch residues in the laundry and catalyze their hydrolysis (endohydrolysis).
- Amylases with broad substrate spectra are used in particular where inhomogeneous raw materials or substrate mixtures have to be reacted, that is to say, for example, in detergents and cleaners, since contaminations may consist of differently structured starch molecules and oligosaccharides.
- the amylases used in the washing or cleaning agents known from the prior art are usually of microbial origin and are generally derived from bacteria or fungi, for example the genera Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus, Humicola, Trichoderma or Trichosporon, in particular Bacillus.
- Alpha-amylases are usually produced by biotechnological methods known per se by suitable microorganisms, for example by transgenic expression hosts of the genera Bacillus or by filamentous fungi.
- US 8512986 discloses amylase and its use in a starch liquefaction process in which starch is degraded into small oligo- and / or polysaccharide fragments.
- an amylase from Basidiomyceta in particular Pycnoporus sanguineus (Psan), or a sufficiently similar amylase (based on the sequence identity), is particularly suitable for use in detergents or cleaners because it has a broad spectrum of starch Substrates hydrolyzed under standard washing conditions.
- the invention therefore in a first aspect is an amylase comprising an amino acid sequence which has at least 80% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over its entire length, or variants thereof.
- the variants according to the invention are characterized in that they are obtainable from an amylase which has an amino acid sequence with at least 80% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over its entire length as the starting molecule by means of on or multiple conservative amino acid substitution.
- the variants according to the invention are characterized in that they are obtainable as starting molecule from an amylase which has an amino acid sequence with at least 80% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over its entire length Comprising a length of at least 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1, 512 or 513, fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis contiguous amino acids matches the parent molecule.
- Another object of the invention is a method for producing an amylase comprising providing a réellesamylase having at least 80% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over its entire length or variant of the starting spermase, wherein the Variant as defined above.
- An amylase within the meaning of the present patent application therefore comprises both the amylase as such and an amylase prepared by a process according to the invention. All statements on the amylase therefore relate both to the amylase as a substance and to the corresponding processes, in particular the production process of the amylase.
- a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is given in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
- nucleic acids, non-human host cells containing amylases or nucleic acids according to the invention are coding with the amylases according to the invention or the production process for amylases according to the invention for these amylases.
- the invention further relates to amylases comprising agents, in particular washing and cleaning agents, washing and cleaning processes, and uses defined by the amylases described herein, wherein the amylases used in this case at least 80% sequence identity with the in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 indicated amino acid sequence over the entire length or variants thereof are.
- the variants used here are characterized in that they are obtainable as starting molecule from an amylase which has an amino acid sequence with at least 80% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over its entire length. or multiple conservative amino acid substitution.
- the variants used are characterized in that they are obtainable as starting molecule from an amylase which has an amino acid sequence with at least 80% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over its entire length Comprising a length of at least 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1, 512 or 513, fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis contiguous amino acids matches the parent molecule.
- the present invention is based on the surprising finding of the inventors that an amylase according to the invention from Basidiomyceta, in particular Pycnoporus sanguineus, which comprises at least 80% identical amino acid sequence to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1, the hydrolysis of a broad spectrum of starch Substrates under standard washing conditions causes.
- Basidiomyceta in particular Pycnoporus sanguineus
- This is particularly surprising insofar as that hitherto for none of the amylases from Basidiomyceta, in particular Pycnoporus sanguineus, the use in detergents or cleaning agents has been described.
- amylases according to the invention have a high stability in detergents or cleaners, for example with respect to surfactants and / or bleaches and / or to temperature influences, and / or acidic or alkaline conditions and / or to pH changes and / or to denaturing or oxidizing agents and / or against proteolytic degradation and / or against a change in the redox ratios.
- performance-enhanced amylase variants are provided.
- Such advantageous embodiments of amylases according to the invention consequently enable improved wash results of starch-containing stains in a wide temperature range.
- An amylase of the invention has an enzymatic activity, that is, it is capable of hydrolysis of starch and oligosaccharides, especially in a washing or Cleaning supplies.
- An amylase of the invention is therefore an enzyme which catalyzes the hydrolysis of ⁇ - (1-4) -glycoside bonds in glycoside substrates and thereby is able to cleave starch or oligosaccharides.
- an amylase according to the invention is preferably a mature amylase, ie the catalytically active molecule without signal and / or propeptide (s). Unless otherwise stated, the sequences given refer to each mature (processed) enzymes.
- SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the mature protein
- SEQ ID NO: 2 indicates the sequence, including signal peptide.
- Amylase of the invention refers to amylases which are at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90, 5%, 91%, 91, 5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5% , 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2 %, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% sequence identity with that shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 indicated amino acid sequence over the entire length or variants thereof are.
- the variants are characterized by being obtainable from an amylase having the indicated sequence identity as the starting molecule by one or more conservative amino acid substitutions.
- the variants used are characterized in that they are obtainable from an amylase having the stated sequence identity as the starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and comprises an amino acid sequence which extends over a length of at least 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1, 512 or 513 contiguous amino acids matches the parent molecule.
- the amylase comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over at least 95% of its total length, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%. , 98%, 98.5%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.5%, 99.6% or 99.8%.
- the amylase is a free enzyme. This means that the amylase can act directly with all the components of an agent and, if the agent is a liquid agent, that the amylase is in direct contact with the solvent of the agent (eg water).
- the amylase of the invention may form an interaction complex with other molecules or contain an "envelope" in an agent.
- a single or multiple amylase molecules may be separated from the other components of an agent by a surrounding structure.
- a surrounding structure may arise from, but is not limited to, vesicles such as a micelle or a liposome.
- the surrounding structure may also be a virus particle, a bacterial cell or a eukaryotic cell.
- the amylase of the invention may be contained in Basidiomyceta cells expressing this amylase or in cell culture supernatants of such cells.
- sequence comparison is based on the BLAST algorithm established and commonly used in the prior art (see, for example, Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ (1990) "Basic local alignment search tool Biol. 215: 403-410, and Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J.
- the Clustal series see, for example, Chenna et al., 2003: Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs, Nucleic Acid Research 31, 3497-3500
- T-Coffee see, for example, Notredame et al (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments, J. Mol. Biol. 302, 205-217
- programs based on these programs or algorithms are also possible.
- alignment comparisons with the computer program Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, USA) with the default parameters, whose AlignX module for sequence comparisons is based on ClustalW.
- Such a comparison also allows a statement about the similarity of the compared sequences to each other. It is usually given in percent identity, that is, the proportion of identical nucleotides or amino acid residues at the same or in an alignment corresponding positions.
- the broader concept of homology involves conserved amino acid substitutions in the consideration of amino acid sequences, that is, amino acids with similar chemical activity, as these usually perform similar chemical activities within the protein. Therefore, the similarity of the sequences compared may also be stated as percent homology or percent similarity.
- Identity and / or homology information can be made about whole polypeptides or genes or only over individual regions. Homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are therefore defined by matches in the sequences. Such areas often have identical functions.
- nucleic acid or amino acid sequence can be small and comprise only a few nucleotides or amino acids. Often, such small regions exert essential functions for the overall activity of the protein. It may therefore be useful to relate sequence matches only to individual, possibly small areas. Unless otherwise stated However, identity or homology information in the present application but on the total length of the specified nucleic acid or amino acid sequence.
- an amino acid position of a numerically designated position in SEQ ID NO: 1 corresponds to the corresponding position being assigned to the numerically designated position in SEQ ID NO: 1 in an alignment as defined above.
- the amylase is characterized in that its purification performance is not significantly reduced compared to that of an amylase comprising an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequences given in SEQ ID NO: 1, i. has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% of the reference washing performance.
- the cleaning performance can be determined in a washing system containing a detergent in a dosage between 4.5 and 7.0 grams per liter of wash liquor and the amylase, wherein the amylases to be compared are used in the same concentration (based on active protein) and the cleaning performance a soiling on cotton is determined by measuring the degree of cleaning of the washed textiles.
- the washing process for 60 minutes at a temperature of 40 ° C and the water have a water hardness between 15.5 and 16.5 ° (German hardness).
- the concentration of the amylase in the detergent intended for this washing system is from 0.001 to 1% by weight, preferably from 0.001 to 0.1% by weight, and more preferably from 0.01 to 0.06% by weight on active, purified protein.
- a preferred liquid detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in weight percent): 7% alkylbenzenesulfonic acid, 9% anionic surfactants, 4% Na salts of C12-C18 fatty acids, 7% nonionic surfactants, 0, 7% phosphonates, 3.2% citric acid, 3.0% NaOH, 0.04% defoamer, 5.7% 1, 2-propanediol, 0.1% preservatives, 2% ethanol, 0.2% dye transfer Inhibitor, remainder demineralized water.
- the dosage of the liquid detergent is between 4.5 and 6.0 grams per liter of wash liquor, for example, 4.7, 4.9 or 5.9 grams per liter of wash liquor.
- the degree of whiteness, ie the brightening of the stains, as a measure of the cleaning performance is determined by optical measuring methods, preferably photometrically.
- a suitable device for this purpose is for example the spectrometer Minolta CM508d. Usually, those for the measurement previously calibrated with a white standard, preferably a supplied white standard.
- the activity-equivalent use of the respective amylase ensures that even if the ratio of active substance to total protein (the values of the specific activity) diverge, the respective enzymatic properties, for example the cleaning performance of certain soils, are compared. In general, a low specific activity can be compensated by adding a larger amount of protein.
- the amylase activity is determined in a customary manner, preferably by an optical measuring method, preferably a photometric method.
- the appropriate test involves the amylase-dependent cleavage of the substrate para-nitrophenyl maltoheptaoside. This is cleaved by the amylase into para-nitrophenyl oligosaccharide.
- the para-nitrophenyl oligosaccharide is in turn catalyzed by the enzymes glucoamylase and alpha-glucosidase to glucose and para-nitrophenol.
- the presence of para-nitrophenol can be measured using a photometer, e.g. of the Tecan Sunrise device and the XFLUOR software, are determined at 405 nm and thus allows a conclusion on the enzymatic activity of the amylase.
- the protein concentration can be determined by known methods, for example, the BCA method (bicinchoninic acid, 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method (AG Gornall, CS Bardawill and MM David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766). Determination of the active protein concentration in this regard may be achieved by titration of the active sites using a suitable irreversible inhibitor and determination of residual activity (see M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc., 88, 24 (1966), p -5913).
- Proteins can be grouped into groups of immunologically related proteins by reaction with an antiserum or antibody.
- the members of such a group are characterized by having the same antigenic determinant recognized by an antibody. They are therefore structurally so similar to each other that they are recognized by an antiserum or specific antibodies.
- a further subject of the invention therefore forms amylases, which are characterized in that they have at least one and increasingly preferably two, three or four matching antigenic determinants with an amylase according to the invention. Due to their immunological similarity, such amylases are structurally so similar to the amylases according to the invention that a similar function can also be assumed.
- Amylases according to the invention may, in comparison to the amylase described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, undergo further amino acid changes, in particular amino acid changes. Substitutions, insertions or deletions.
- Such amylases are, for example, further developed by targeted genetic modification, ie by mutagenesis methods, and optimized for specific applications or with regard to specific properties (for example with regard to their catalytic activity, stability, etc.).
- nucleic acids according to the invention can be introduced into recombination approaches and thus used to generate completely novel amylases or other polypeptides.
- the goal is to introduce into the known molecules targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions, for example, to improve the cleaning performance of enzymes of the invention.
- targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions
- the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and thereby their interactions with the substrate can be changed.
- the net charge of the enzymes can be changed in order to influence the substrate binding, in particular for use in detergents and cleaners.
- the stability of the amylase can be increased even further by one or more corresponding mutations, thereby improving its purification performance.
- Advantageous properties of individual mutations, e.g. individual substitutions can complement each other.
- An amylase which has already been optimized with regard to certain properties, for example with regard to its activity and / or its tolerance with regard to the substrate spectrum, can therefore be further developed within the scope of the invention.
- amino acid substitutions For the description of substitutions that concern exactly one amino acid position (amino acid substitutions), the following convention is used: first, the naturally occurring amino acid is designated in the form of the international one-letter code, followed by the associated sequence position and finally the inserted amino acid. Several exchanges within the same polypeptide chain are separated by slashes. For insertions, additional amino acids are named after the sequence position. In the case of deletions, the missing amino acid is replaced by a symbol, for example a star or a dash, or a D is specified in front of the corresponding position.
- R45Q describes the substitution of asparagine at position 45 by glutamine, N45AQ the insertion of alanine after the amino acid asparagine at position 45 and N45 * or DN45 the deletion of asparagine at position 45.
- This nomenclature is known to those skilled in the art of enzyme technology.
- Another object of the invention is therefore an amylase, which is characterized in that it is obtainable from an amylase as described above as the starting molecule by one or more conservative amino acid substitution.
- conservative amino acid substitution means the substitution of one amino acid residue for another amino acid residue, which substitution does not result in a change in polarity or charge at the position of the exchanged amino acid, e.g. B. the replacement of a non-polar Amino acid residue against another nonpolar amino acid residue.
- the amylase before and, for example, even after the conservative amino acid substitution may comprise an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over at least 80%, 81%, 82%, 83% over its entire length.
- the amylase is characterized in that it is obtainable from an amylase as described above as the starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and comprises an amino acid sequence having a length of at least 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1, 512 or 513 contiguous amino acids matches the parent molecule.
- the amylase before and, for example, even after fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis may comprise an amino acid sequence which is at least 80%, at least 80%, of the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over the entire length thereof.
- the enzymes retain their catalytic activity, i. their catalytic activity is at least equal to that of the starting enzyme, i. in a preferred embodiment, the catalytic activity is at least 80%, preferably at least 90% of the activity of the starting enzyme.
- Other substitutions can also show beneficial effects. Both single and multiple contiguous amino acids can be substituted for other amino acids.
- the further amino acid positions are defined here by an alignment of the amino acid sequence of an amylase according to the invention with the amino acid sequence of the amidase from Basidiomyceta, in particular Pycnoporus sanguineus, as indicated in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Furthermore, the assignment of the positions depends on the mature (mature) protein. This assignment is to be used in particular if the amino acid sequence of a Amylase according to the invention comprises a higher number of amino acid residues than the amylase from Basidiomyceta, in particular Pycnoporus sanguineus, according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Starting from the positions mentioned in the amino acid sequence of the amidase from Basidiomyceta, in particular Pycnoporus sanguineus, the change positions in an amylase according to the invention are those which are just assigned to these positions in an alignment.
- an amino acid exchange in a certain position of the amylase from Basidiomyceta, in particular Pycnoporus sanguineus, according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is accompanied by a change of an enzymatic parameter, for example with the increase of the K M value, and becomes corresponding change in the enzymatic parameter, ie, for example, also an increase in the K M value observed in an amylase variant according to the invention, the amino acid exchange was achieved by the same introduced amino acid, it is to be seen here a confirmation of the correct assignment.
- fragments of the amylase are defined as herein, in particular those according to SEQ ID NO: 1, which are shortened at the N- and / or C-terminus such that one or more amino acids of the amylase, for example 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9 or 10 are no longer included.
- truncated fragments variants can be used in various embodiments of the invention, which to the starting from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 truncated by (each) 1 to 10 N-terminal and / or C-terminal amino acids form over the total length should be at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91, 5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98% , 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99, 1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% , 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% are identical.
- amylases are also detected which have an amino acid sequence which comprises, via the amylase, an amino acid sequence which has at least 80%, preferably at least 95%, sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over its entire length or the variants described herein from this, without thereby losing or reducing the catalytic activity.
- amylases are those which have N- and / or C-terminal additional amino acids, for example, the signal peptide or fragments of the signal peptide, wherein the signal peptide or the fragments of the signal peptide arise in the production of the amylase.
- amylases are also detected which have an amino acid sequence which has an amino acid sequence which has at least 80%, preferably at least 95% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 or the variants thereof described herein, at the N Terminals are shortened such that the signal peptide or one or more amino acids of the signal peptide, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16 or 17, especially the N-terminal 17 amino acids, are no longer present.
- amylases with the signal peptide or fragments of the signal peptide can be used in various embodiments of the invention variants which are shortened by 1 to 17 N-terminal amino acids starting from the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2, over the total length at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91, 5% , 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98 %, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99, 1%, 99.2%, 99.3%, 99.4 %, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% are identical.
- a method according to the invention comprises a method for producing an amylase comprising the provision of an initial amylase which has at least 80%, preferably at least 95% sequence identity to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over its entire length or variant of Starting amylase, wherein the inventive method for producing the variant comprises, for example, one or more of the following process steps:
- amylase comprises an amino acid sequence of at least 487, 490, 495, 500 , 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1, 512 or 513 contiguous amino acids matches the parent molecule.
- the amylase or the amylase prepared by a process according to the invention is still at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 90.5%, 91%, 91, 5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9 %, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9 % identical to the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 over its entire length.
- Another object of the invention is a previously described amylase, which is additionally stabilized, in particular by one or more mutations, for example substitutions, or by coupling to a polymer.
- a polymer for example, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, ethylene glycol, a polysulftas, a polys, for example substitutions, or by coupling to a polymer.
- all stabilization options described in the prior art and / or appropriate considerations come into consideration. Preference is given to those stabilizations which are achieved by mutations of the enzyme itself, since such stabilizations do not require any further working steps following the recovery of the enzyme. Examples of sequence changes suitable for this purpose are mentioned above. Other suitable sequence changes are known from the prior art.
- Preferred embodiments are those in which the enzyme is stabilized in several ways, as several stabilizing mutations act additive or synergistic.
- Another object of the invention is an amylase as described above, which is characterized in that it has at least one chemical modification.
- An amylase with such a change is called a derivative, i. the amylase is derivatized.
- derivatives are understood as meaning those proteins whose pure amino acid chain has been chemically modified.
- derivatizations can be done, for example, in vivo by the host cell expressing the protein.
- couplings of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy.
- derivatizations can also be carried out in vitro, for example by the chemical transformation of a side chain of an amino acid or by covalent binding of another compound to the protein.
- the coupling of amines to carboxyl groups of an enzyme to alter the isoelectric point is possible.
- another compound may also be another protein that is bound to a protein of the invention via bifunctional chemical compounds, for example.
- Derivatizations may, for example, affect the substrate specificity or binding strength to the substrate or cause a temporary blockage of the enzymatic activity when the coupled substance is an inhibitor. This can be useful, for example, for the period of storage. Such modifications may further affect stability or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the protein and thus, for example, increase its skin compatibility. For example, couplings with macromolecular compounds, for example, polyethylene glycol, can improve the protein in terms of stability and / or skin tolerance.
- Derivatives of a protein according to the invention can also be understood in the broadest sense to mean preparations of these proteins.
- a protein may be associated with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms.
- a protein may also have been deliberately added to other substances, for example to increase its storage stability. Therefore, all preparations of a protein according to the invention are also according to the invention. This is also independent of whether or not it actually exhibits this enzymatic activity in a particular preparation. Because it may be desired that it has no or only low activity during storage, and unfolds its enzymatic function only at the time of use. This can be controlled, for example, via appropriate accompanying substances.
- the joint preparation of amylases with specific inhibitors is possible in this regard.
- amylases or amylase variants and / or derivatives described above particular preference is given in the context of the present invention to those whose catalytic activity and / or their substrate tolerance correspond to those of the amylase according to SEQ ID NO: 1, wherein the catalytic activity and the substrate tolerance are as described above be determined.
- a further subject of the invention is a nucleic acid which codes for an amylase according to the invention, as well as a vector containing such a nucleic acid, in particular a cloning vector or an expression vector.
- the nucleic acid is a nucleic acid according to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
- a particularly preferred vector according to the invention is a vector which comprises a nucleic acid according to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
- DNA or RNA molecules may be DNA or RNA molecules. They can be present as a single strand, as a single strand that is complementary to this single strand, or as a double strand. In particular in DNA molecules, the sequences of both complementary strands must be considered in all three possible reading frames. Furthermore, it should be noted that different codons, so base triplets, can code for the same amino acids, so that a particular amino acid sequence can be encoded by several different nucleic acids. Due to this degeneracy of the genetic code, all nucleic acid sequences are included in this subject of the invention which can encode any of the above-described amylases.
- nucleic acid sequences unequivocally since, despite the degeneracy of the genetic code, individual codons are assigned defined amino acids. Therefore, the person skilled in the art can easily determine nucleic acids coding for this amino acid sequence on the basis of an amino acid sequence.
- one or more codons may be replaced by synonymous codons.
- This aspect relates in particular to the heterologous expression of the enzymes according to the invention.
- each organism for example a host cell of a production strain, has a particular codon usage. Codon usage is understood to mean the translation of the genetic code into amino acids by the particular organism.
- Bottlenecks in protein biosynthesis can occur if the codons lying on the nucleic acid in the organism face a comparatively small number of loaded tRNA molecules. Although coding for the same amino acid, this results in a codon being translated less efficiently in the organism than a synonymous codon encoding the same amino acid. Due to the presence of a higher number of tRNA molecules for the synonymous codon, it can be more efficiently translated in the organism.
- a person skilled in the art can use well-known methods such as chemical synthesis or the polymerase chain reaction (PCR) in combination with molecular biological and / or proteinchemical standard methods, using known DNA and / or amino acid sequences, the corresponding nucleic acids to complete genes manufacture.
- PCR polymerase chain reaction
- Such methods are for example from Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Laboratory Press.
- vectors are understood as consisting of nucleic acids which contain a nucleic acid according to the invention as a characteristic nucleic acid region. They can establish these in a species or cell line over several generations or cell divisions as a stable genetic element.
- Vectors especially when used in bacteria, are special plasmids, ie circular genetic elements.
- a nucleic acid according to the invention is cloned into a vector.
- the vectors include, for example, those whose origin are bacterial plasmids, viruses or bacteriophages, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements of various origins.
- With the further existing genetic Elements are able to establish vectors in the host cells concerned over several generations as stable units. They may be extrachromosomal as separate units or integrated into a chromosome or chromosomal DNA.
- Expression vectors comprise nucleic acid sequences which enable them to replicate in the host cells containing them, preferably microorganisms, particularly preferably bacteria, and to express a contained nucleic acid there.
- expression is influenced by the promoter (s) that regulate transcription.
- the expression may be effected by the natural promoter originally located in front of the nucleic acid to be expressed, but also by a promoter of the host cell provided on the expression vector or also by a modified or completely different promoter of another organism or another host cell.
- at least one promoter for the expression of a nucleic acid according to the invention is made available and used for its expression.
- expression vectors can be regulatable, for example by changing the culturing conditions or when a specific cell density of the host cells contained therein is reached or by addition of specific substances, in particular activators of gene expression.
- An example of such a substance is the galactose derivative isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG), which is used as an activator of the bacterial lactose operon (lac operon).
- IPTG galactose derivative isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
- lac operon lac operon
- a further subject of the invention is a non-human host cell which contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention, or which contains an amylase according to the invention, in particular one which secretes the amylase into the medium surrounding the host cell.
- a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention is transformed into a microorganism, which then represents a host cell according to the invention.
- individual components, ie nucleic acid parts or fragments of a nucleic acid according to the invention can be introduced into a host cell such that the resulting host cell contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention.
- This procedure is particularly suitable when the host cell already contains one or more constituents of a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention and the further constituents are then supplemented accordingly.
- Methods of transforming cells are well established in the art and well known to those skilled in the art. In principle, all cells, that is to say prokaryotic or eukaryotic cells, are suitable as host cells. Preference is given to those host cells which can be handled genetically advantageously, for example as regards the transformation with the nucleic acid or the vector and its stable establishment, for example unicellular fungi or bacteria. Furthermore, preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling.
- Preferred host cells according to the invention secrete the (transgenially) expressed protein into the medium surrounding the host cells.
- the amylases can be modified by the cells producing them after their production, for example, by attachment of sugar molecules, formylations, aminations, etc. Such post-translational modifications can functionally affect the amylase.
- Further preferred embodiments are those host cells which are regulatable in their activity due to genetic regulatory elements which are provided, for example, on the vector, but may also be present in these cells from the outset. For example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the culture conditions or when reaching a specific cell density, these can be excited for expression. This enables an economical production of the proteins according to the invention.
- An example of such a compound is IPTG as described above.
- Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells. Bacteria are characterized by short generation times and low demands on cultivation conditions. As a result, inexpensive cultivation methods or production methods can be established. In addition, the expert has a wealth of experience in bacteria in fermentation technology. For a specific production, gram-negative or gram-positive bacteria may be suitable for a wide variety of reasons to be determined experimentally in individual cases, such as nutrient sources, product formation rate, time requirement, etc.
- Gram-negative bacteria such as Escherichia coli
- Gram-negative bacteria can also be designed such that they eject the expressed proteins not only into the periplasmic space but into the medium surrounding the bacterium.
- gram-positive bacteria such as Bacilli or Actinomycetes or other representatives of Actinomycetales have no outer membrane, so that secreted proteins are released immediately into the medium surrounding the bacteria, usually the nutrient medium, from which the expressed proteins can be purified. They can be isolated directly from the medium or further processed.
- Gram-positive bacteria are related or identical to most of the organisms of origin for technically important enzymes and usually form even comparable enzymes, so they have a similar codon use and their protein synthesizer is naturally aligned accordingly.
- Host cells according to the invention may be altered in their requirements of the culture conditions, have different or additional selection markers or express other or additional proteins. In particular, it may also be those host cells which express several proteins or enzymes transgene.
- the present invention is applicable in principle to all microorganisms, in particular to all fermentable microorganisms, more preferably to those of the genus Bacillus and leads to the fact that can be produced by the use of such microorganisms proteins of the invention. Such microorganisms then represent host cells in the sense of the invention.
- the host cell is characterized in that it is a bacterium, preferably one selected from the group of the genera of Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas, more preferably one selected from the group consisting of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum , Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coeli
- the host cell may also be a eukaryotic cell, which is characterized by having a cell nucleus.
- a further subject of the invention therefore represents a host cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
- eukaryotic cells are capable of post-translationally modifying the protein formed. Examples thereof are fungi such as Actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces. This may be particularly advantageous, for example, if the proteins are to undergo specific modifications in the context of their synthesis that enable such systems.
- Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. Such oligosaccharide modifications may be desirable, for example, to lower the allergenicity of an expressed protein. Also, coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases, may be advantageous. Furthermore, for example, thermophilic fungal expression systems may be particularly suitable for the expression of temperature-resistant proteins or variants.
- the host cell is a basidiomycete cell.
- the host cells according to the invention are cultured and fermented in the usual way, for example in discontinuous or continuous systems.
- a inoculated suitable nutrient medium with the host cells and harvested the product after an experimentally determined period of time from the medium.
- Continuous fermentations are characterized by achieving a flow equilibrium, in which over a relatively long period of time cells partly die out but also regrow and at the same time the protein formed can be removed from the medium.
- Host cells according to the invention are preferably used to produce amylases according to the invention.
- Another object of the invention is therefore a process for preparing an amylase comprising
- This subject invention preferably comprises fermentation processes. Fermentation processes are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, for example the amylase according to the invention. All fermentation processes which are based on a corresponding process for preparing an amylase according to the invention represent embodiments of this subject matter of the invention.
- Fermentation processes which are characterized in that the fermentation is carried out via a feed strategy, come in particular into consideration.
- the media components consumed by the ongoing cultivation are fed.
- considerable increases can be achieved both in the cell density and in the cell mass or dry matter and / or in particular in the activity of the amylase of interest.
- the fermentation can also be designed so that undesired metabolic products are filtered out or neutralized by the addition of buffer or suitable counterions.
- the produced amylase can be harvested from the fermentation medium.
- Such a fermentation process is preferable to isolation of the amylase from the host cell, ie, product preparation from the cell mass (dry matter), but requires the provision of suitable host cells or one or more suitable secretion markers or mechanisms and / or transport systems for the host cells to provide Seize amylase in the fermentation medium.
- the isolation of the amylase from the host cell ie, a purification of the same from the cell mass, carried out, for example by precipitation with ammonium sulfate or ethanol, or by chromatographic purification. All of the above-described facts can be combined into processes to produce amylases of the invention.
- Another object of the invention is an agent characterized by containing an amylase as described herein.
- the amylase has thereby 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90.5%, 91%, 91, 5%, 92%, 92.5%, 93%, 93.5%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98% , 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% , 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% sequence identity with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 over its entire length or is a above-described variant thereof, which is obtainable starting from an above-described amylase as starting molecule and before and preferably also after
- This subject matter of the invention includes all conceivable types of detergents or cleaners, both concentrates and undiluted agents, for use on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing or cleaning.
- detergents for textiles, carpets, or natural fibers, for which the term detergent is used.
- washing and cleaning agents in the invention also include laundry aids, which are added to the actual detergent in the manual or machine textile laundry to achieve a further effect.
- laundry detergents and cleaners in the context of the invention also include textile pre-treatment and post-treatment agents, ie those agents with which the laundry item is brought into contact before the actual laundry, for example to dissolve stubborn soiling, and also agents which are in one of the actual Textile laundry downstream step to give the laundry further desirable properties such as comfortable grip, crease resistance or low static charge.
- textile pre-treatment and post-treatment agents ie those agents with which the laundry item is brought into contact before the actual laundry, for example to dissolve stubborn soiling
- agents which are in one of the actual Textile laundry downstream step to give the laundry further desirable properties such as comfortable grip, crease resistance or low static charge.
- the fabric softener i.a. calculated the fabric softener.
- the washing or cleaning agents according to the invention may contain, in addition to an amylase according to the invention, all known ingredients customary in such agents, preferably containing at least one further ingredient in the composition ,
- the agents according to the invention may in particular contain surfactants, builders, peroxygen compounds or bleach activators. They can also be water-miscible organic solvents, other enzymes, sequestering agents, electrolytes, pH regulators and / or other auxiliaries such as optical brighteners, grayness inhibitors, foam regulators and colorants and fragrances and combinations thereof.
- an amylase according to the invention with one or more further ingredients of the composition is advantageous, since in preferred embodiments according to the invention such an agent has an improved cleaning performance by virtue of resulting synergisms.
- an amylase according to the invention with a surfactant and / or a builder (builder) and / or a peroxygen compound and / or a bleach activator, such a synergism can be achieved.
- the agent is characterized in that it
- An agent of the invention advantageously contains the amylase in an amount of from 2 pg to 20 mg, preferably from 5 pg to 17.5 mg, more preferably from 20 pg to 15 mg and most preferably from 50 pg to 10 mg per g of the agent.
- the agent according to the invention may advantageously contain the amylase in an amount of from 0.00005 to 15% by weight, based on the active enzyme and the total weight of the composition, preferably from 0.0001 to 5% by weight and more preferably from 0.001 to 1 wt .-% included.
- amylase contained in the agent, and / or other ingredients of the agent may be enveloped with a substance impermeable to the enzyme at room temperature or in the absence of water, which becomes permeable to the enzyme under conditions of use of the agent.
- a substance impermeable to the enzyme at room temperature or in the absence of water, which becomes permeable to the enzyme under conditions of use of the agent.
- the washing or cleaning agent itself may be packaged in a container, preferably an air-permeable container, from which it is released shortly before use or during the washing process.
- the agent is characterized in that it
- (A) is in solid form, in particular as a free-flowing powder having a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l, or
- (b) is in pasty or liquid form, and / or
- (c) is in the form of a gel or pouch, and / or
- (d) is present as a one-component system, or
- compositions according to the invention include all solid, powdered, liquid, gelatinous or paste-like administration forms of compositions according to the invention, which if appropriate can also consist of several phases and can be present in compressed or uncompressed form.
- the agent can be present as a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l.
- the solid dosage forms of the composition also include extrudates, granules, tablets or pouches.
- the agent can also be liquid, gelatinous or pasty, for example in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
- the agent may be present as a one-component system. Such funds consist of one phase.
- an agent can also consist of several phases. Such an agent is therefore divided into several components.
- Detergents or cleaning agents according to the invention may contain exclusively an amylase. Alternatively, they may also contain other hydrolytic enzymes or other enzymes in a concentration effective for the effectiveness of the agent. A further embodiment of the invention thus represents agents which further comprise one or more further enzymes.
- enzymes which can be used as further enzymes are all enzymes which can display catalytic activity in the agent according to the invention, in particular a protease, lipase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, xyloglucanase, .beta.-glucosidase, pectinase, carrageenase, perhydrolase, Oxidase, oxidoreductase or other - distinguishable from the amylases of the invention - amylases, and mixtures thereof.
- each further enzyme is in an amount of from 1 x 10 7 to 3 wt%, from 0.00001 to 1 wt%, from 0.00005 to 0.5 wt%, from 0.0001 to 0, 1 wt .-% and particularly preferably from 0.0001 to 0.05 wt .-% in inventive Contain agents based on active protein.
- the enzymes show synergistic cleaning performance against certain stains or stains, ie the enzymes contained in the middle composition mutually support each other in their cleaning performance.
- the enzymes to be used may also be formulated together with accompanying substances, for example from the fermentation.
- the enzymes are preferably used as enzyme liquid formulation (s).
- the enzymes are usually not provided in the form of the pure protein, but rather in the form of stabilized, storable and transportable preparations.
- Such prefabricated preparations include, for example, the solid preparations obtained by granulation, extrusion or lyophilization or, especially in the case of liquid or gel-form detergents, solutions of the enzymes, advantageously as concentrated as possible, low in water and / or added with stabilizers or further auxiliaries.
- the enzymes may be encapsulated for both the solid and liquid dosage forms, for example by spray-drying or extruding the enzyme solution together with a preferably natural polymer or in the form of capsules, for example those in which the enzymes are entrapped as in a solidified gel or in those of the core-shell type, in which an enzyme-containing core is coated with a water, air and / or chemical impermeable protective layer.
- further active ingredients for example stabilizers, emulsifiers, pigments, bleaches or dyes, may additionally be applied.
- Such capsules are applied by methods known per se, for example by Scblini or roll granulation or in fluid-bed processes.
- such granules for example by applying polymeric film-forming agent, low in dust and storage stable due to the coating.
- water-soluble films Such a film allows the release of the enzymes after contact with water.
- water-soluble refers to a film structure that is preferably completely water-soluble. However, even films that are substantially water-soluble but have relatively small amounts of a material in the film structure that is not water-soluble; Slides with materials only at relative high water temperatures or only in limited pH conditions are water-soluble; and films including a relatively thin layer of water-insoluble material, all included in the term "water-soluble”.
- a film consists of (fully or partially hydrolyzed) polyvinyl alcohol (PVA).
- the film may also contain, solely or in addition to the PVA, acid / acrylate copolymers, preferably methacrylic acid / ethyl acrylate copolymer, such as that available from Beiland as GBC 2580 and 2600; Styrene-maleic anhydride copolymer (SMA) (available as Scripset (trade name) from Monsanto); Ethylene-acrylic acid copolymer (EAA) or metal salt neutralized ethylene-methacrylic acid copolymer (EMAA), known as ionomer (available from du Pont), wherein the acid content of EAA or EMAA is at least about 20 mole%; Polyether block amide copolymer; Polyhydroxyvaleric acid (available as Biopol (trade name) resins from Imperial Chemical Industries); polyethylene oxide; water-soluble polyester or copolyester; Polyethyloxazoline (PEOX 200 from Dow); and water-soluble polyurethane.
- acid / acrylate copolymers
- a further subject of the invention is a process for the cleaning of textiles or hard surfaces, which is characterized in that in at least one process step, an inventive agent is applied, or that in at least one process step, an amylase of the invention is catalytically active, in particular such that the amylase in an amount of from 40 pg to 4 g, preferably from 50 pg to 3 g, more preferably from 100 pg to 2 g and most preferably from 200 pg to 1 g is used.
- the method described above is characterized in that the amylase is used at a temperature of 0 to 100 ° C, preferably 0 to 60 ° C, more preferably 20 to 45 ° C and most preferably at 40 ° C.
- Methods for cleaning textiles are generally distinguished by the fact that various cleaning-active substances are applied to the items to be cleaned and washed off after the contact time, or that the items to be cleaned are otherwise treated with a detergent or a solution or dilution of this product.
- All conceivable washing or cleaning processes can be enriched in at least one of the process steps by the use of a washing or cleaning agent or an amylase according to the invention and then constitute embodiments of the present invention.
- All facts, objects and embodiments which are suitable for amylases according to the invention and they containing agents are described, are also applicable to this subject of the invention. Therefore, reference is made at this point expressly to the disclosure in the appropriate place with the statement that this disclosure also applies to the above inventive method.
- amylases according to the invention naturally already have a hydrolytic activity and also unfold them in media which otherwise have no cleaning power, as for example in bare buffer, a single and / or the sole step of such a method can consist in the fact that, if desired, the only cleaning-active component is an inventive Amylase is brought into contact with the soiling, preferably in a buffer solution or in water. This represents a further embodiment of this subject of the invention.
- Alternative embodiments of this subject matter of the invention are also processes for the treatment of textile raw materials or for textile care, in which an amylase according to the invention becomes active in at least one process step.
- methods for textile raw materials, fibers or textiles with natural components are preferred, and especially for those with wool or silk.
- the present invention relates to the use of an amylase according to the invention or an amylase obtainable by a process according to the invention in a washing or cleaning agent for removing starch-containing stains.
- the present invention relates to the use of an amylase according to the invention or an amylase obtainable by a process according to the invention or an amylase as used in the agents of the invention in a washing or cleaning agent for removing starch-containing stains. All aspects, objects and embodiments described for amylase and agents containing it are also applicable to this subject of the invention. Examples
- the sequence found differs significantly from the sequences of amylases previously used in detergents and cleaners. This opens up many possibilities for increasing the genetic and biochemical diversity in the field of amylases used in cleaning agents.
- the fungus was cultured in a solid SNL medium.
- mycule-infected medium cubes of about 1 cm 2 surface were excised and placed in a new medium.
- a medium cube infected with mycelium was switched to a modified SNL medium with 1% (w / v) potato starch as the sole carbon source.
- the culturing strategy was switched to enzyme screening. For this, 125 ml of liquid, starch-modified SNL medium was poured into sterilized, 300 ml Erlenmeyer flasks without lid.
- the mycelium cube has served as an inoculum.
- the liquid cultures were stirred continuously at 24 ° C and 150 rpm for 5 days.
- the separation of the concentrated culture was carried out by ion exchange chromatography. Due to the generally acidic plc of the glycoside hydrolases, a weak anion exchange column (1 ml DEAE) was used for cleaning performance (GE Healthcare, Chalfont St Gilles, GBR). The fractions were analyzed for amylase performance.
- a modified para-nitrophenyl maltoheptaoside was used whose terminal glucose unit was blocked by a benzylidene group. From this molecule is released by the amylase para-nitrophenyl oligosaccharide, which in turn is converted by the enzymes glucoamylase and alpha-glucosidase to glucose and para-nitrophenol. Thus, the amount of released para-nitrophenol is proportional to the activity of the amylase.
- the measurement is carried out, for example, using the Quick-Start® test kit from Abbott (Abbott Park, Illinois, USA). The increase in absorbance (405 nm) in the test mixture was determined at 37 ° C. for 3 minutes compared with a photometric control value (blank value). The calibration was carried out on an enzyme standard with known activity. The evaluation was carried out by determining the absorption difference dE (405 nm) per min against the enzyme concentration of the standard.
- a wash test was performed on the purified wild-type supernatant from Pycnoporus sanguineus containing the described amylase.
- Enzyme concentration 0.18 TAU / ml (determination of amylase activity with benzylidene-blocked para-nitrophenol-maltoheptaoside); this corresponds to the amount of amylase usually used in detergents.
- Sample 2 detergent plus Pycnoporus sanguineus amylase (according to SEQ ID NO: 1) The results are shown in Table 1.
- the matrix used contained no optical brighteners, perfumes, dyes or enzymes.
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Abstract
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie. Die Erfindung betrifft Amylasen, die insbesondere im Hinblick auf den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verwendet werden können, alle hinreichend ähnlichen Amylasen mit einer entsprechend ähnlichen Sequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 und für sie codierende Nukleinsäuren. Die Erfindung betrifft ferner deren Herstellung sowie Verfahren zur Verwendung dieser Amylasen, deren Verwendung als solche sowie diese enthaltende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel.
Description
Amylase und eine solche enthaltendes Wasch- oder Reinigungsmittel
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie. Die Erfindung betrifft Amylasen, die insbesondere im Hinblick auf den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verwendet werden können, alle hinreichend ähnlichen Amylasen mit einer entsprechend ähnlichen Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 und für sie codierende Nukleinsäuren. Die Erfindung betrifft ferner deren Herstellung sowie Verfahren zur Verwendung dieser Amylasen, deren Verwendung als solche sowie diese enthaltende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel.
Alpha-Amylasen gehören zu den technisch bedeutenden Enzymen. Ihr Einsatz für Wasch- und Reinigungsmittel ist industriell etabliert und sie sind typischerweise in modernen, leistungsfähigen Wasch- und Reinigungsmitteln enthalten. Eine Amylase ist ein Enzym, das die Hydrolyse der inneren a-(1 -4)-Glykosidbindungen der Amylose, nicht jedoch die Spaltung von terminalen oder a-(1-6)- Glykosidbindungen, katalysiert. Amylasen stellen daher eine Gruppe der Esterasen dar (E.C. 3.2.1.1.). Amylasen katalysieren die Spaltung von Stärke, Glycogen und von anderen Oligo- und Polysacchariden, die eine a-(1-4)-Glykosidbindung besitzen. Insofern wirken Amylasen gegen Stärkerückstände in der Wäsche und katalysieren deren Hydrolyse (Endohydrolyse). Amylasen mit breiten Substratspektren werden insbesondere dort verwendet, wo inhomogene Rohstoffe oder Substratgemische umgesetzt werden müssen, also beispielsweise in Wasch- und Reinigungsmitteln, da Verschmutzungen aus unterschiedlich aufgebauten Stärkemolekülen und Oligosacchariden bestehen können. Die in den aus dem Stand der Technik bekannten Wasch- oder Reinigungsmitteln eingesetzten Amylasen sind üblicherweise mikrobiellen Ursprungs und stammen in der Regel aus Bakterien oder Pilzen, beispielsweise der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, Micrococcus, Humicola, Trichoderma oder Trichosporon, insbesondere Bacillus. Alpha-Amylasen werden üblicherweise nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Pilze.
Das Patent US 8512986 offenbart Amylase und deren Verwendung in einem Stärkeverflüssigungsverfahren, bei dem Stärke zu kleinen Oligo- und/oder Polysaccharidfragmenten abgebaut wird.
Auch die amerikanischen Patentanmeldungen US 7407677 B2 und US 8852912 B2 offenbaren spezifische Amylasen und deren Fragmente zur Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln.
Nichtsdestotrotz besteht weiterhin Bedarf für Amylase-Varianten, die veränderte biochemische Eigenschaften besitzen und dadurch eine verbesserte Leistung in industriellen Anwendungen bereitstellen.
Überraschenderweise wurde jetzt festgestellt, dass eine Amylase aus Basidiomyceta, insbesondere Pycnoporus sanguineus (Psan), oder eine hierzu hinreichend ähnliche Amylase (bezogen auf die Sequenzidentität), besonders für den Einsatz in Wasch- oder Reinigungsmitteln geeignet ist, da sie ein breites Spektrum an Stärke-Substraten unter Standard-Waschbedingungen hydrolisiert.
Gegenstand der Erfindung ist daher in einem ersten Aspekt eine Amylase umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, oder Varianten davon. Die erfindungsgemäßen Varianten sind dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Amylase, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution. Alternativ oder ergänzend sind die erfindungsgemäßen Varianten dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Amylase, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1 , 512 oder 513 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Amylase umfassend das Bereitstellen einer Ausgangsamylase, die mindestens 80% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist oder Variante der Ausgangsamylase, wobei die Variante wie vorstehend definiert sind.
Eine Amylase im Sinne der vorliegenden Patentanmeldung umfasst daher sowohl die Amylase als solche als auch eine mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Amylase. Alle Ausführungen zur Amylase beziehen sich daher sowohl auf die Amylase als Stoff wie auch auf die entsprechenden Verfahren, insbesondere Herstellungsverfahren der Amylase. Eine zur Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 korrespondierende Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 angegeben.
Als weitere Erfindungsgegenstände sind mit den erfindungsgemäßen Amylasen beziehungsweise den Herstellungsverfahren für erfindungsgemäße Amylasen für diese Amylasen codierende
Nukleinsäuren, erfindungsgemäße Amylasen oder Nukleinsäuren enthaltende nicht menschliche Wirtszellen verbunden.
Die Erfindung betrifft ferner Amylasen umfassende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren, und über die hierin beschriebenen Amylasen definierte Verwendungen, wobei die hierbei eingesetzten Amylasen mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen oder Varianten davon sind. Die hier eingesetzten Varianten sind dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Amylase, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution. Alternativ oder ergänzend sind die eingesetzten Varianten dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Amylase, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1 , 512 oder 513 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass eine erfindungsgemäße Amylase aus Basidiomyceta, insbesondere Pycnoporus sanguineus, die eine zu der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 80% identische Aminosäuresequenz umfasst, die Hydrolyse eines breiten Spektrums an Stärke-Substraten unter Standard-Waschbedingungen bewirkt. Das ist insbesondere insoweit überraschend, als dass bisher für keine der Amylasen aus Basidiomyceta, insbesondere Pycnoporus sanguineus, die Verwendung in Wasch- oder Reinigungsmitteln beschrieben wurde.
Die erfindungsgemäßen Amylasen verfügen über eine hohe Stabilität in Wasch- oder Reinigungsmitteln, beispielsweise gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder gegenüber Temperatureinflüssen, und/oder gegenüber sauren oder alkalischen Bedingungen und/oder gegenüber pH-Wert-Änderungen und/oder gegenüber denaturierenden oder oxidierenden Agentien und/oder gegenüber proteolytischem Abbau und/oder gegenüber einer Veränderung der Redox- Verhältnisse. Mit besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden folglich leistungsverbesserte Amylase-Varianten bereitgestellt. Solche vorteilhaften Ausführungsformen erfindungsgemäßer Amylasen ermöglichen folglich verbesserte Waschergebnisse an stärkehaltigen Anschmutzungen in einem weiten Temperaturbereich.
Eine erfindungsgemäße Amylase weist eine enzymatische Aktivität auf, das heißt, sie ist zur Hydrolyse von Stärke und Oligosacchariden befähigt, insbesondere in einem Wasch- oder
Reinigungsmittel. Eine erfindungsgemäße Amylase ist daher ein Enzym, welches die Hydrolyse von a-(1 -4)-Glykosidbindungen in Glykosid-Substraten katalysiert und dadurch in der Lage ist, Stärke oder Oligosaccharide zu spalten. Ferner handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen Amylase vorzugsweise um eine reife (mature) Amylase, d.h. um das katalytisch aktive Molekül ohne Signalund/oder Propeptid(e). Soweit nicht anders angegeben beziehen sich auch die angegebenen Sequenzen auf jeweils reife (prozessierte) Enzyme. Wie hierin verwendet ist SEQ ID NO:1 die Aminosäuresequenz des maturen Proteins, SEQ ID NO:2 gibt die Sequenz inklusive Signalpeptid an.
„Erfindungsgemäße Amylase“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Amylasen die mindestens 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen oder Varianten davon sind. Die Varianten sind dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Amylase mit der angegebenen Sequenzidentität als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution. Alternativ oder ergänzend sind die eingesetzten Varianten dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Amylase mit der angegebenen Sequenzidentität als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1 , 512 oder 513 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Amylase eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,8%, 99,0%, 99,2%, 99,4%, 99,5%, 99,6% oder 99,8% identisch ist.
In weiteren verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist die Amylase ein frei vorliegendes Enzym. Dies bedeutet, dass die Amylase mit allen Komponenten eines Mittels direkt agieren kann und, falls es sich bei dem Mittel um ein Flüssigmittel handelt, dass die Amylase direkt mit dem Lösungsmittel des erfindungsgemäßen Mittels (z.B. Wasser) in Kontakt steht. In anderen Ausführungsformen kann die erfindungsgemäße Amylase in einem Mittel einen Interaktionskomplex mit anderen Molekülen bilden oder eine„Umhüllung“ enthalten. Hierbei kann ein einzelnes oder mehrere Amylase Moleküle durch eine sie umgebende Struktur von den anderen Bestandteilen eines Mittels getrennt sein. Eine solche trennende Struktur kann entstehen durch, ist allerdings nicht beschränkt auf, Vesikel, wie etwa eine Micelle oder ein Liposom. Die umgebende Struktur kann aber auch ein Viruspartikel, eine bakterielle Zelle oder eine eukaryotische Zelle sein. In verschiedenen
Ausführungsformen kann die erfindungsgemäße Amylase in Zellen von Basidiomyceta, die diese Amylase exprimieren, oder in Zellkulturüberständen solcher Zellen enthalten sein.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500), T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren. Ferner möglich sind Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer- Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenz-Übereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen
sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet die Angabe, dass eine Aminosäureposition einer numerisch bezeichneten Position in SEQ ID NO: 1 entspricht daher, dass die entsprechende Position der numerisch bezeichneten Position in SEQ ID NO: 1 in einem wie oben definierten Alignment zugeordnet ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Amylase dadurch gekennzeichnet, dass ihre Reinigungsleistung gegenüber derjenigen einer Amylase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenzen entspricht, nicht signifikant verringert ist, d.h. mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% der Referenzwaschleistung besitzt. Die Reinigungsleistung kann in einem Waschsystem bestimmt werden, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Amylase enthält, wobei die zu vergleichenden Amylasen konzentrationsgleich (bezogen auf aktives Protein) eingesetzt sind und die Reinigungsleistung gegenüber einer Anschmutzung auf Baumwolle bestimmt wird durch Messung des Reinigungsgrades der gewaschenen Textilien. Beispielsweise kann der Waschvorgang für 60 Minuten bei einer Temperatur von 40°C erfolgen und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° (deutsche Härte) aufweisen. Die Konzentration der Amylase in dem für dieses Waschsystem bestimmten Waschmittel beträgt von 0,001 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise von 0,001 bis 0, 1 Gew.-%, und noch bevorzugter von 0,01 bis 0,06 Gew.-%, bezogen auf aktives, gereinigtes Protein.
Ein bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 7% Alkylbenzolsulfonsäure, 9% anionische Tenside, 4% Na- Salze von C12-C18 Fettsäuren, 7% nicht-ionische Tenside, 0,7% Phosphonate, 3,2% Zitronensäure, 3,0% NaOH, 0,04% Entschäumer, 5,7% 1 ,2-Propandiol, 0, 1 % Konservierungsstoffe, 2% Ethanol, 0,2% Farbstoff-Transfer-Inhibitor, Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 6,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,7, 4,9 oder 5,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 7,5 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 7,5 und pH 9.
Im Rahmen der Erfindung erfolgt die Bestimmung die Reinigungsleistung bei 40°C unter Verwendung eines flüssigen Waschmittels wie vorstehend angegeben, wobei der Waschvorgang vorzugsweise für 60 Minuten erfolgt.
Der Weißheitsgrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, als Maß für die Reinigungsleistung wird mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung
eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.
Durch den aktivitätsgleichen Einsatz der jeweiligen Amylase wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften, also beispielsweise die Reinigungsleistung an bestimmten Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann.
Die Amylaseaktivität wird in fachüblicher Weise bestimmt, und zwar vorzugsweise durch ein optisches Messverfahren, bevorzugt ein photometrisches Verfahren. Der hierfür geeignete Test umfasst die Amylase-abhängige Spaltung des Substrats para-Nitrophenyl-Maltoheptaosid. Dieses wird durch die Amylase in para-Nitrophenyl-Oligosaccharid gespalten. Das para-Nitrophenyl- Oligosaccharid wird wiederum durch die Enzyme Glucoamylase und alpha-Glucosidase zu Glucose und para-Nitrophenol katalysiert. Die Anwesenheit von para-Nitrophenol kann unter Verwendung eines Photometers, z.B. des Tecan Sunrise Geräts und der XFLUOR Software, bei 405 nm ermittelt werden und ermöglicht somit einen Rückschluss auf die enzymatische Aktivität der Amylase.
Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2‘-Bichinolyl-4,4‘-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751 -766) bestimmt werden. Die Bestimmung der Aktivproteinkonzentration kann diesbezüglich über eine Titration der aktiven Zentren unter Verwendung eines geeigneten irreversiblen Inhibitors und Bestimmung der Restaktivität (vgl. M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), S. 5890-5913) erfolgen.
Proteine können über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefasst werden. Die Angehörigen einer solchen Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen. Sie sind daher einander strukturell so ähnlich, dass sie von einem Antiserum oder bestimmten Antikörpern erkannt werden. Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher Amylasen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene Determinanten mit einer erfindungsgemäßen Amylase aufweisen. Solche Amylasen sind auf Grund ihrer immunologischen Übereinstimmungen den erfindungsgemäßen Amylasen strukturell so ähnlich, dass auch von einer gleichartigen Funktion auszugehen ist.
Erfindungsgemäße Amylasen können im Vergleich zu der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 beschriebenen Amylase weitere Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure-
Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen, aufweisen. Solche Amylasen sind beispielsweise durch gezielte genetische Veränderung, d.h. durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, Stabilität, usw.) optimiert. Ferner können erfindungsgemäße Nukleinsäuren in Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Amylasen oder anderer Polypeptide genutzt werden.
Das Ziel ist es, in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen einzuführen, um beispielsweise die Reinigungsleistung von erfindungsgemäßen Enzymen zu verbessern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So kann beispielsweise die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen die Stabilität der Amylase noch weiter erhöht und dadurch ihre Reinigungsleistung verbessert werden. Vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Substitutionen, können sich ergänzen. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Amylase, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Aktivität und/oder ihrer Toleranz in Bezug auf das Substratspektrum, kann daher im Rahmen der Erfindung zusätzlich weiterentwickelt sein.
Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt oder vor der entsprechenden Position ein D angegeben. Beispielsweise beschreibt R45Q die Substitution von Asparagin an Position 45 durch Glutamin, N45AQ die Insertion von Alanin nach der Aminosäure Asparagin an Position 45 und N45* oder DN45 die Deletion von Asparagin an Position 45. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine Amylase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer Amylase wie vorstehend beschrieben als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution. Der Begriff "konservative Aminosäuresubstitution" bedeutet den Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z. B. der Austausch eines unpolaren
Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, l=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T. Dabei kann die Amylase vor und beispielsweise auch nach der konservativen Aminosäuresubstitution eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99, 1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% identisch ist.
Alternativ oder ergänzend ist die Amylase dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Amylase wie vorstehend beschrieben als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1 , 512 oder 513 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt. Dabei kann die Amylase vor und beispielsweise auch nach der Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99, 1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% identisch ist.
So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne dass dadurch die katalytische Aktivität verloren oder vermindert wird. Ferner kann durch derartige Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese beispielsweise auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Vorteilhafterweise behalten die Enzyme auch nach der Mutagenese ihre katalytische Aktivität, d.h. ihre katalytische Aktivität entspricht mindestens derjenigen des Ausgangsenzyms, d.h. in einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die katalytische Aktivität mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90% der Aktivität des Ausgangsenzyms. Auch weitere Substitutionen können vorteilhafte Wirkungen zeigen. Sowohl einzelne wie auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren können gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.
Die weiteren Aminosäurepositionen werden hierbei durch ein Alignment der Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Amylase mit der Aminosäuresequenz der Amylase aus Basidiomyceta, insbesondere Pycnoporus sanguineus, wie sie in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegeben ist, definiert. Weiterhin richtet sich die Zuordnung der Positionen nach dem reifen (maturen) Protein. Diese Zuordnung ist insbesondere auch anzuwenden, wenn die Aminosäuresequenz einer
erfindungsgemäßen Amylase eine höhere Zahl von Aminosäureresten umfasst als die Amylase aus Basidiomyceta, insbesondere Pycnoporus sanguineus, gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2. Ausgehend von den genannten Positionen in der Aminosäuresequenz der Amylase aus Basidiomyceta, insbesondere Pycnoporus sanguineus, sind die Veränderungspositionen in einer erfindungsgemäßen Amylase diejenigen, die eben diesen Positionen in einem Alignment zugeordnet sind.
Eine weitere Bestätigung der korrekten Zuordnung der zu verändernden Aminosäuren, d.h. insbesondere deren funktionelle Entsprechung, können Vergleichsversuche liefern, wonach die beiden auf der Basis eines Alignments einander zugeordneten Positionen in beiden miteinander verglichenen Amylasen auf die gleiche Weise verändert werden und beobachtet wird, ob bei beiden die enzymatische Aktivität auf gleiche Weise verändert wird. Geht beispielsweise ein Aminosäureaustausch in einer bestimmten Position der Amylase aus Basidiomyceta, insbesondere Pycnoporus sanguineus, gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 mit einer Veränderung eines enzymatischen Parameters einher, beispielsweise mit der Erhöhung des KM-Wertes, und wird eine entsprechende Veränderung des enzymatischen Parameters, beispielsweise also ebenfalls eine Erhöhung des KM-Wertes, in einer erfindungsgemäßen Amylase-Variante beobachtet, deren Aminosäureaustausch durch dieselbe eingeführte Aminosäure erreicht wurde, so ist hierin eine Bestätigung der korrekten Zuordnung zu sehen.
Insbesondere werden erfindungsgemäß auch Fragmente der Amylase wie hierin definiert, insbesondere solche gemäß SEQ ID NO: 1 , die am N- und/oder C-Terminus derart verkürzt sind, dass ein oder mehrere Aminosäuren der Amylase, beispielsweise 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 nicht länger enthalten sind, erfasst. Auch von diesen verkürzten Fragmenten können in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung Varianten verwendet werden, die zu der ausgehend von der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz um (jeweils) 1 bis 10 N- terminale und/oder C-terminale Aminosäuren verkürzten Form, über die Gesamtlänge zu mindestens 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99, 1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% identisch sind.
Beispielsweise werden erfindungsgemäß auch Amylasen erfasst, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die über die Amylase umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 95% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist bzw. den hierin beschriebenen Varianten davon, hinausgeht, ohne dass dadurch die katalytische Aktivität verloren oder vermindert wird. Vorzugsweise sind derartige Amylasen solche, die N- und/oder C-terminal zusätzliche Aminosäuren,
beispielsweise das Signal-Peptid oder Fragmente des Signal-Peptids aufweisen, wobei das Signal- Peptid oder die Fragmente des Signal-Peptids bei der Herstellung der Amylase entstehen.
Erfindungsgemäß werden auch Amylasen erfasst, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die gegenüber einer Amylase umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 95% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist bzw. den hierin beschriebenen Varianten davon, am N-Terminus derart verkürzt sind, dass das Signalpeptid oder ein oder mehrere Aminosäuren des Signalpeptids, beispielsweise 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16 oder 17, insbesondere die N-terminalen 17 Aminosäuren, nicht länger enthalten sind. Auch von diesen Amylasen mit dem Signal-Peptid oder Fragmenten des Signal-Peptids können in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung Varianten verwendet werden, die zu der ausgehend von der in SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz um 1 bis 17 N-terminale Aminosäuren verkürzten Form, über die Gesamtlänge zu mindestens 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99, 1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% identisch sind.
Alle genannten Sachverhalte sind auch auf die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Amylase anwendbar.
Demnach umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren ein Verfahren zur Herstellung einer Amylase umfassend das Bereitstellen einer Ausgangsamylase, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist oder Variante der Ausgangsamylase, wobei das erfindungsgemäßes Verfahren zum Herstellen der Variante beispielsweise einen oder mehrere der folgenden Verfahrensschritte umfasst:
a) Einbringen einer ein- oder mehrfachen konservativen Aminosäuresubstitution in eine Ausgangs-Amylase gemäß SEQ ID NO: 1 oder SED ID NO:2;
b) Veränderung der in SEQ ID NO: 1 oder SED ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese derart, dass die Amylase eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1 , 512 oder 513 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
Sämtliche Ausführungsformen gelten auch für die erfindungsgemäßen Verfahren.
In weiteren Ausgestaltungen der Erfindung ist die Amylase beziehungsweise die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Amylase noch mindestens zu 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%,
95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% identisch zu der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Amylase, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch eine oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch Kopplung an ein Polymer. Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität länger anhält und damit die Reinigungsleistung verbessert wird. Grundsätzlich kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten in Betracht. Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Mutationen des Enzyms selbst erreicht werden, da solche Stabilisierungen im Anschluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte erfordern. Beispiele für hierfür geeignete Sequenzveränderungen sind vorstehend genannt. Weitere geeignete Sequenzveränderungen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Möglichkeiten der Stabilisierung sind beispielsweise:
Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf oder an der Oberfläche des Proteins bewirken;
Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Enzym auf mehrere Arten stabilisiert wird, da mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Amylase wie vorstehend beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist. Eine Amylase mit einer solchen Veränderung wird als Derivat bezeichnet, d.h. die Amylase ist derivatisiert.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung demnach solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise in vivo durch die Wirtszelle erfolgen, die das Protein exprimiert. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. Derivatisierungen können aber auch in vitro durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich. Eine solche andere Verbindung kann auch ein weiteres Protein sein, das beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an ein erfindungsgemäßes Protein gebunden wird. Ebenso ist unter
Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, oder auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Derivatisierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Derartige Modifikationen können ferner die Stabilität oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können ferner auch dazu dienen, die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen, beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität und/oder Hautverträglichkeit verbessern.
Unter Derivaten eines erfindungsgemäßen Proteins können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Amylasen mit spezifischen Inhibitoren ist diesbezüglich möglich.
Betreffend alle vorstehend beschriebenen Amylasen beziehungsweise Amylasevarianten und/oder Derivate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung diejenigen besonders bevorzugt, deren katalytische Aktivität und/oder deren Substrattoleranz derjenigen der Amylase gemäß SEQ ID NO: 1 entspricht, wobei die katalytische Aktivität und die Substrattoleranz wie vorstehend beschrieben bestimmt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Amylase codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4. Entsprechend ist ein besonders bevorzugter erfindungsgemäßer Vektor ein Vektor, der eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 umfasst.
Hierbei kann es sich um DNA- oder RNA-Moleküle handeln. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere
bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann. Auf Grund dieser Degeneriertheit des genetischen Codes sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesen Erfindungsgegenstand eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Amylasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codon(s) durch synonyme Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Verwendung. Unter Codon- Verwendung wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition Cold Spring Laboratory Press bekannt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zelllinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bakteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen
Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachromosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom oder chromosomale DNA integrieren.
Expressionsvektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons) verwendet wird. Im Gegensatz zu Expressionsvektoren wird die enthaltene Nukleinsäure in Klonierungsvektoren nicht exprimiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die eine erfindungsgemäße Amylase beinhaltet, insbesondere eine, die die Amylase in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d.h. Nukleinsäure-Teile oder -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte
Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium. Ferner können die Amylasen von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationalenModifikationen können die Amylase funktionell beeinflussen.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryotische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren oder Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.
Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Verwendung verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist.
Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren.
Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine hersteilen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.
Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryotische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz zu prokaryotischen Zellen sind eukaryotische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryotische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Wirtszelle eine Basidiomyceten- Ze Ile.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in üblicher Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein
geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann.
Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße Amylasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Amylase umfassend
a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, und
b) Isolieren der Amylase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der erfindungsgemäßen Amylase. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Amylase beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse beziehungsweise Trockenmasse und/oder insbesondere in der Aktivität der interessierenden Amylase erreicht werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.
Die hergestellte Amylase kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation der Amylase aus der Wirtszelle, d.h. einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern oder -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen die Amylase in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Amylase aus der Wirtszelle, d.h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder durch chromatographische Reinigung.
Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Amylasen herzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Amylase wie hierin beschrieben enthält. Die Amylase weist dabei 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% oder 99,9% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge auf oder ist eine wie oben beschriebene Variante davon, die ausgehend von einer vorstehend beschriebenen Amylase als Ausgangsmolekül erhältlich ist und vor und vorzugsweise auch nach der Variation die angegebene Sequenzidentität mit SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 aufweist. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel.
Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche beziehungsweise -reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder, für die die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet wird, also neben manuellen und maschinellen Geschirrspülmitteln beispielsweise auch Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. Zu den Wasch- und Reinigungsmitteln im Rahmen der Erfindung zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Wasch- und Reinigungsmittel im Rahmen der Erfindung auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können neben einer erfindungsgemäßen Amylase alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Tenside, Builder (Gerüststoffe), Persauerstoffverbindungen oder Bleichaktivatoren enthalten. Ferner können sie wassermischbare
organische Lösungsmittel, weitere Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und/oder weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.
Insbesondere eine Kombination einer erfindungsgemäßen Amylase mit einem oder mehreren weiteren Inhaltsstoff(en) des Mittels ist vorteilhaft, da ein solches Mittel in bevorzugten erfindungsgemäßen Ausgestaltungen eine verbesserte Reinigungsleistung durch sich ergebende Synergismen aufweist. Insbesondere durch die Kombination einer erfindungsgemäßen Amylase mit einem Tensid und/oder einem Builder (Gerüststoff) und/oder einer Persauerstoffverbindung und/oder einem Bleichaktivator kann ein solcher Synergismus erreicht werden.
Vorteilhafte Inhaltsstoffe erfindungsgemäßer Mittel sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO 2009/121725, dort beginnend auf Seite 5, vorletzter Absatz, und endend auf Seite 13 nach dem zweiten Absatz. Auf diese Offenbarung wird ausdrücklich Bezug genommen und der dortige Offenbarungsgehalt in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es
(a) 1 bis 85 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 65 Gew.-%, Tenside enthält; und/oder
(b) 0 bis 45 Gew.-%, vorzugsweise 0, 1 bis 15 Gew.-%, Builder (Gerüststoffe) enthält; und/oder
(c) 0,0005 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 0,001 bis 5 Gew.-%, Protease enthält; und/oder
(d) 0,0005 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 0,001 bis 5 Gew.-%, Lipase enthält; und/oder
(e) 0,00005 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 0,0001 bis 5 Gew.-%, Mannanase enthält; und/oder
(f) 0,00005 bis 15 Gew.-%, vorzugsweise 0,0001 bis 5 Gew.-%, Cellulase/Pektatlyase enthält; und/oder
(g) 0,00005 bis 15 g/Waschladung, vorzugsweise 0,0001 bis 5 g/Waschladung, Xanthanlyase enthält; und/oder
(h) 0,00005 bis 15 g/Waschladung, vorzugsweise 0,00005 bis 15 g/Waschladung, Endoglucanase, die fähig ist Xanthan zu verdauen, enthält.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält die Amylase vorteilhafterweise in einer Menge von 2 pg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 pg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 pg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 pg bis 10 mg pro g des Mittels. Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Mittel die Amylase vorteilhafterweise in einer Menge von 0,00005 bis 15 Gew.-% bezogen auf das aktive Enzym und das Gesamtgewicht des Mittels, vorzugsweise von 0,0001 bis 5 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,001 bis 1 Gew.-% enthalten. Ferner kann die in dem Mittel enthaltene Amylase, und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels, mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Amylase mit einer bei Raumtemperatur
oder bei Abwesenheit von Wasser für die Amylase undurchlässigen Substanz umhüllt ist. Weiterhin kann auch das Wasch- oder Reinigungsmittel selbst in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es
(a) in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder
(b) in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt, und/oder
(c) in gelförmiger oder dosierbeutelförmiger (Pouches) Form vorliegt, und/oder
(d) als Einkomponentensystem vorliegt, oder
(e) in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.
Diese Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen erfindungsgemäßer Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Zu den festen Darreichungsformen des Mittels zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches. Alternativ kann das Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein, beispielsweise in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Weiterhin kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in mehrere Komponenten aufgeteilt.
Erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel können ausschließlich eine Amylase enthalten. Alternativ können sie auch weitere hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Protease, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xyloglucanase, ß-Glucosidase, Pektinase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder andere - von den erfindungsgemäßen Amylasen unterscheidbare - Amylasen, sowie deren Gemische. Weitere Enzyme sind in dem Mittel vorteilhafterweise jeweils in einer Menge von 1 x 10 8 bis 5 Gew.-% bezogen auf aktives Protein enthalten. Zunehmend bevorzugt ist jedes weitere Enzym in einer Menge von 1 x 10 7 bis 3 Gew.-%, von 0,00001 bis 1 Gew.-%, von 0,00005 bis 0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0, 1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% in erfindungsgemäßen
Mitteln enthalten, bezogen auf aktives Protein. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Reinigungsleistungen gegenüber bestimmten Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Ganz besonders bevorzugt liegt ein solcher Synergismus vor zwischen der erfindungsgemäß enthaltenen Amylase und einem weiteren Enzym eines erfindungsgemäßen Mittels, darunter insbesondere zwischen der genannten Amylase und einer Lipase und/oder einer Protease und/oder einer Mannanase und/oder einer Cellulase und/oder einer Pektinase. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.
In den hierin beschriebenen Reinigungsmitteln können die einzusetzenden Enzyme ferner zusammen mit Begleitstoffen, etwa aus der Fermentation, konfektioniert sein. In flüssigen Formulierungen werden die Enzyme bevorzugt als Enzymflüssigformulierung(en) eingesetzt.
Die Enzyme werden in der Regel nicht in Form des reinen Proteins, sondern vielmehr in Form stabilisierter, lager- und transportfähiger Zubereitungen bereitgestellt. Zu diesen vorkonfektionierten Zubereitungen zählen beispielsweise die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelförmigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren oder weiteren Hilfsmitteln versetzt.
Alternativ können die Enzyme sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, beispielsweise solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale-Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalienundurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Schüttei- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed-Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, beispielsweise durch Aufbringen polymerer Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil.
Die Enzyme können auch in wasserlösliche Filme eingebracht werden. Ein derartiger Film ermöglicht die Freisetzung der Enzyme nach Kontakt mit Wasser. Wie hier verwendet, bezieht sich „wasserlöslich“ auf eine Filmstruktur, die vorzugsweise vollständig wasserlöslich ist. Jedoch sind auch Filme, die im Wesentlichen wasserlöslich sind, aber relativ kleine Mengen eines Materials in der Filmstruktur aufweisen, welches nicht wasserlöslich ist; Folien mit Materialien, die nur bei relativ
hohen Wassertemperaturen oder nur unter eingeschränkten pH-Bedingungen wasserlöslich sind; und Folien, die eine relativ dünne Schicht aus wasserunlöslichem Material einschließen, alle in der Bezeichnung„wasserlöslich“ mit eingeschlossen. Bevorzugt besteht ein solcher Film aus (vollständig oder teilweise hydrolysiertem) Polyvinylalkohol (PVA). Der Film kann aber auch ausschließlich oder zusätzlich zum PVA enthalten Säure/Acrylat-Copolymere, vorzugsweise Methacrylsäure/Ethylacrylat-Copolymer, wie das von Beiland als GBC 2580 und 2600 erhältliche; Styrol-Maleinsäureanhydrid-Copolymer (SMA) (verfügbar als Scripset (Handelsname) von Monsanto); Ethylen-Acrylsäure-Copolymer (EAA) oder durch Metallsalz neutralisiertes Ethylen- Methacrylsäure-Copolymer (EMAA), bekannt als lonomer (verfügbar von du Pont), bei welchem der Säuregehalt von EAA oder EMAA mindestens etwa 20 Mol-% beträgt; Polyether-Blockamid- Copolymer; Polyhydroxyvalerinsäure (verfügbar als Biopol (Handelsname)-Harze von Imperial Chemical Industries); Polyethylenoxid; wasserlöslichen Polyester oder Copolyester; Polyethyloxazolin (PEOX 200 von Dow); und wasserlösliches Polyurethan ein.
Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme zusammen zu konfektionieren, so dass ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet wird, oder dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Amylase katalytisch aktiv wird, insbesondere derart, dass die Amylase in einer Menge von 40 pg bis 4 g, vorzugsweise von 50 pg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 pg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 pg bis 1 g eingesetzt wird.
In verschieden Ausführungsformen zeichnet sich das oben beschriebene Verfahren dadurch aus, dass die Amylase bei einer Temperatur von 0 bis 100°C, bevorzugt 0 bis 60°C, weiter bevorzugt 20 bis 45°C und am meisten bevorzugt bei 40°C eingesetzt wird.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren bevorzugt sind. Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung oder Verdünnung dieses Mittels behandelt wird. Entsprechendes gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, insbesondere von harten Oberflächen. Alle denkbaren Wasch- oder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittels oder einer erfindungsgemäßen Amylase bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Amylasen und sie
enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt.
Da erfindungsgemäße Amylasen natürlicherweise bereits eine hydrolytische Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner und/oder der einzige Schritt eines solchen Verfahrens darin bestehen, dass gewünschtenfalls als einzige reinigungsaktive Komponente eine erfindungsgemäße Amylase mit der Anschmutzung in Kontakt gebracht wird, bevorzugt in einer Pufferlösung oder in Wasser. Dies stellt eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Amylase aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer erfindungsgemäßen Amylase oder einer nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Amylase in einem Wasch- oder Reinigungsmittel zur Entfernung von stärkehaltigen Anschmutzungen.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Amylase und sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf die beschriebenen Verfahren und Verwendungen anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verwendungen und Verfahren gilt.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer erfindungsgemäßen Amylase oder einer nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Amylase oder einer wie in den beschriebenen Mitteln der Erfindung eingesetzten Amylase in einem Wasch- oder Reinigungsmittel zur Entfernung von stärkehaltigen Anschmutzungen. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Amylase und sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar.
Beispiele
Beispiel 1 : Identifizierung der Amylase
Es wurde in Basidiomyceten nach Stärke abbauenden Enzymen gescreent. Dabei wurde ein Wildtyp Enzym, annotiert als Amylase aus Pycnoporus sanguineus (Psan) entdeckt. Diese Amylase zeigte auf verschiedenen stärkehaltigen Textilien eine gute Waschleistung.
Die aufgefundene Sequenz unterscheidet sich signifikant von den Sequenzen aus Amylasen, die bislang in Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt wurden. Sie eröffnet dadurch viele Möglichkeiten, die genetische und biochemische Vielfalt im Bereich der in Reinigungsmitteln eingesetzten Amylasen zu erhöhen.
Beispiel 2: Screening nach Amylase mit Waschleistunq:
Kultivierung und Konzentration
Der Pilz wurde in einem festen SNL Medium kultiviert. Damit sich der Pilz fortpflanzt, wurden mit Myzel infizierte Mediumwürfel von ungefähr 1 cm2 Oberfläche ausgeschnitten und in ein neues Medium eingesetzt. Nachdem das Pilzwachstum in dem SNL Medium festgestellt wurde, wurde ein mit Myzel infizierter Mediumwürfel in ein modifiziertes SNL Medium mit 1 % (w/v) Kartoffelstärke als einzige Kohlenstoffquelle umgestellt. Wenn der Pilz in dem modifizierten Medium ausreichend gewachsen war, wurde die Kultivierungsstrategie zum Enzymscreening gewechselt. Dafür wurde 125 ml von flüssigem, mit Stärke modifiziertem SNL Medium in sterilisierte, 300 ml Erlenmeyerkolben ohne Deckel eingeschenkt. Der Myzel-Würfel hat als Inokulum gedient. Die flüssigen Kulturen wurden ununterbrochen bei 24°C und 150 rpm für 5 Tage gerührt.
Um die Enzymkonzentration zu erhöhen wurde der gefilterte (0,25 pm) Kulturüberstand mittels Centricons® Plus-70, Cut-Off 10 kD (Merck Milipore, Darmstadt) Membranen, konzentriert. lonenaustauschchromatoqraphie und Aktivitätsassav (IEX)
Die Trennung der konzentrierten Kultur wurde mittels lonenaustauschchromatographie durchgeführt. Aufgrund der im Allgemeinen säuerlichen pls der Glykosid-Hydrolasen wurde eine schwache Anionenaustauschersäule (1 ml DEAE) für die Reinigungsleistung verwendet (GE Healthcare, Chalfont St Gilles, GBR). Die Fraktionen wurden auf Amylase-Leistung analysiert.
Um die Amylase-aktiven Fraktionen zu identifizieren wurde 100 pl einer wässrigen Lösung mit 1 % (w/v) analytischer Stärke (gemäß Zulkowsky) in das Reaktionsabteil einer 96-Well Platte eingeführt. In einem zweiten Schritt wurde 50 pl FPLC-Fraktion hinzugefügt und für 45 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 100 mI DNSA-Lösung beendet und die 96- Well Platte wurde auf 80°C für 30 Minuten aufgewärmt. Schließlich wurde die farbmetrische Messung mit einem Photometer bei 450 nm durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit einer Kalibrierungskurve
von D-Maltose verglichen. Aktive Fraktionen wurden gepoolt und für das Waschtest getestet (Beispiel 4).
Beispiels 3: Aktivitätsassav für Amylase
Für die Bestimmung der amylolytischen Aktivität von erfindungsgemäßen Amylasen wurde ein modifiziertes para-Nitrophenyl-Maltoheptaosid verwendet, dessen terminale Glucose-Einheit durch eine Benzylidengruppe blockiert wurde. Aus diesem Molekül wird durch die Amylase para- Nitrophenyl-Oligosaccharid freigesetzt, das wiederum mit Hilfe der Enzyme Glucoamylase und alpha-Glucosidase zu Glucose und para-Nitrophenol umgesetzt wird. Somit ist die Menge des freigesetzten para-Nitrophenol proportional zur Aktivität der Amylase. Die Messung erfolgt beispielsweise unter Zuhilfenahme des Quick-Start® Test-Kits der Firma Abbott (Abbott Park, Illinois, USA). Der Anstieg der Absorption (405 nm) im Testansatz wurde bei 37°C über 3 min gegenüber einem photometrischen Kontrollwert (Blindwert) ermittelt. Die Kalibrierung erfolgte auf einen Enzymstandard mit bekannter Aktivität. Die Auswertung erfolgte durch die Ermittlung der Absorptionsdifferenz dE (405 nm) pro min gegen die Enzymkonzentration des Standards.
Beispiel 4: Waschtest und Ergebnisse
Ein Waschtest wurde durchgeführt mit dem aufgereinigten Wildtyp Überstand aus Pycnoporus sanguineus, in dem die beschriebene Amylase vorliegt.
Bedingungen: 40°C, 16°dH Wasser, 1 h;
Enzymkonzentration: 0, 18 TAU/ml (Bestimmung der Amylase Aktivität mit Benzyliden blockiertem para-Nitrophenol-Maltoheptaosid); dies entspricht der üblicherweise in Waschmittel eingesetzten Amylase Menge.
Anschmutzungen:
1. C-S-27 Kartoffelstärke von CFT (Center of Test materials, Vlaardingen, the Netherlands)
2. 10R Stärke/Ruß von Wfk (Wfk-Testgewebe GmbH, Brüggen)
Ausgestanztes Gewebe (Durchmesser = 10 mm) in Mikrotiterplatte vorlegen, Waschlauge auf 40°C vortemperieren, Endkonzentration 4,7 g/L;
Lauge und Enzym auf die Anschmutzung geben, für 1 h bei 40°C und 600 rpm inkubieren; anschließend die Anschmutzung mehrmals mit klarem Wasser spülen, trocken lassen und mit einem Farbmessgerät die Helligkeit bestimmen.
Je heller das Gewebe wird, desto besser ist die Reinigungsleistung. Gemessen wird hier der L-Wert = Helligkeit, je höher desto heller.
Es wird mit einem gängigen Flüssigwaschmittel ohne Enzyme gewaschen (Siehe Tabelle 2).
Probe 1 : nur Waschmittel als Benchmark (Vergleichsreferenz)
Probe 2: Waschmittel plus Amylase aus Pycnoporus sanguineus (gemäß SEQ ID NO: 1 )
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Es wird deutlich, dass die Amylase auf beiden Anschmutzungen eine verbesserte Leistung des Waschmittels bewirkt zeigt. Als Negativkontrolle wurde der abgekochte, aufgereinigte Überstand aus Pycnoporus sanguineus (99°C für 30 min) mitgewaschen, wobei dieser keine Waschleistung zeigt (nicht gezeigt).
Tabelle 2: Verwendete Waschmittelmatrix
Die verwendete Matrix enthielt keine optischen Aufheller, Parfüms, Farbstoffe oder Enzyme.
Dosierung: 4,58 g/L
Claims
1. Amylase umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 95% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, oder Varianten davon, wobei diese Varianten dadurch gekennzeichnet sind, dass
(a) die Varianten aus der Amylase, die mindestens 95% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution; und/oder
(b) die Varianten aus der Amylase, die mindestens 95% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfassen, die über eine Länge von mindestens 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1 , 512 oder 513 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
2. Verfahren zur Herstellung einer Amylase nach Anspruch 1 umfassend das Bereitstellen einer Ausgangs-Amylase, die mindestens 95% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, ferner umfassend einen oder beide der folgenden Verfahrensschritte:
(a) Einbringen einer ein- oder mehrfachen konservativen Aminosäuresubstitution in die Ausgangs-Amylase;
(b) Veränderung der Aminosäuresequenz der Ausgangs-Amylase durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese derart, dass die veränderte Amylase eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1 , 512 oder 513 zusammenhängenden Aminosäuren mit der Ausgangs-Amylase übereinstimmt.
4. Nukleinsäure kodierend für eine Amylase nach Anspruch 1 oder kodierend für eine nach einem Verfahren der Ansprüche 2 oder 3 erhaltene Amylase.
5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 4, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.
6. Nicht menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 4 oder einen Vektor nach Anspruch 5 beinhaltet, oder die eine Amylase nach Anspruch 1 beinhaltet, oder die eine nach
einem Verfahren der Ansprüche 2 oder 3 erhaltene Amylase beinhaltet, insbesondere eine, die die Amylase in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert.
7. Verfahren zur Herstellung einer Amylase umfassend
a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 6; und
b) Isolieren der Amylase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
8. Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Amylase, umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, oder Varianten davon, wobei diese Varianten dadurch gekennzeichnet sind, dass
(a) die Varianten aus der Amylase, die mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution; und/oder
(b) die Varianten aus der Amylase, die mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfassen, die über eine Länge von mindestens 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1 , 512 oder 513 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt;
enthält, wobei die Amylase insbesondere in einer Menge bis zu 1 Gew.-% bezogen auf aktives Protein in dem Mittel enthalten ist.
9. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach Anspruch 8 angewendet wird, oder dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine Amylase nach Anspruch 1 oder eine nach einem Verfahren der Ansprüche 2 oder 3 erhaltene Amylase katalytisch aktiv wird.
10. Verwendung einer Amylase umfassend eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, oder Varianten davon, wobei diese Varianten dadurch gekennzeichnet sind, dass
(a) die Varianten aus der Amylase, die mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution; und/oder
(b) die Varianten aus der Amylase, die mindestens 80% Sequenzidentität mit der in SEQ ID N0: 1 oder SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist, als Ausgangsmolekül erhältlich sind durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfassen, die über eine Länge von mindestens 487, 490, 495, 500, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 51 1 , 512 oder 513 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt;
in einem Wasch- oder Reinigungsmittel zur Entfernung von stärkehaltigen Anschmutzungen.
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---|---|
DE (1) | DE102017220757A1 (de) |
WO (1) | WO2019101417A1 (de) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7407677B2 (en) | 2001-02-21 | 2008-08-05 | Verenium Corporation | Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof |
WO2009121725A1 (de) | 2008-04-02 | 2009-10-08 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch- und reinigungsmittel enthaltend proteasen aus xanthomonas |
WO2011066576A1 (en) * | 2009-11-30 | 2011-06-03 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
US8512986B2 (en) | 2004-12-22 | 2013-08-20 | Novozymes A/S | Enzymes for starch processing |
US8852912B2 (en) | 2009-04-01 | 2014-10-07 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods comprising alpha-amylase variants with altered properties |
EP3159394A1 (de) * | 2015-10-20 | 2017-04-26 | The Procter and Gamble Company | Verfahren zur beseitigung von flecken durch behandlung von geweben mit stärke und amylase |
-
2017
- 2017-11-21 DE DE102017220757.4A patent/DE102017220757A1/de not_active Withdrawn
-
2018
- 2018-10-10 WO PCT/EP2018/077535 patent/WO2019101417A1/de active Application Filing
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7407677B2 (en) | 2001-02-21 | 2008-08-05 | Verenium Corporation | Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof |
US8512986B2 (en) | 2004-12-22 | 2013-08-20 | Novozymes A/S | Enzymes for starch processing |
WO2009121725A1 (de) | 2008-04-02 | 2009-10-08 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch- und reinigungsmittel enthaltend proteasen aus xanthomonas |
US8852912B2 (en) | 2009-04-01 | 2014-10-07 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods comprising alpha-amylase variants with altered properties |
WO2011066576A1 (en) * | 2009-11-30 | 2011-06-03 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
EP3159394A1 (de) * | 2015-10-20 | 2017-04-26 | The Procter and Gamble Company | Verfahren zur beseitigung von flecken durch behandlung von geweben mit stärke und amylase |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
A. G. GORNALL; C. S. BARDAWILL; M.M. DAVID, J. BIOL. CHEM., vol. 177, 1948, pages 751 - 766 |
ALTSCHUL, S.F.; GISH, W.; MILLER, W.; MYERS, E.W.; LIPMAN, D.J.: "Basic local alignment search tool", J. MOL. BIOL., vol. 215, 1990, pages 403 - 410, XP002949123, DOI: doi:10.1006/jmbi.1990.9999 |
ALTSCHUL, STEPHAN F.; THOMAS L. MADDEN; ALEJANDRO A. SCHAFFER; JINGHUI ZHANG; HHENG ZHANG; WEBB MILLER; DAVID J. LIPMAN: "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402, XP002905950, DOI: doi:10.1093/nar/25.17.3389 |
CHENNA ET AL.: "Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs", NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 31, 2003, pages 3497 - 3500, XP002316493, DOI: doi:10.1093/nar/gkg500 |
DATABASE UniProt [online] 30 August 2017 (2017-08-30), "SubName: Full=Glycoside hydrolase family 13 protein {ECO:0000313|EMBL:OSC98372.1};", XP002787166, retrieved from EBI accession no. UNIPROT:A0A1Y2ID35 Database accession no. A0A1Y2ID35 * |
DE ALMEIDA SIQUEIRA ET AL: "Pycnoporus sanguineus: a novel source of alpha-amylase", MYCOLOGICAL RESEARCH, ELSEVIER, GB, vol. 101, no. 2, 1 February 1997 (1997-02-01), pages 188 - 190, XP022451880, ISSN: 0953-7562, DOI: 10.1017/S0953756296002547 * |
M. BENDER ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 88, no. 24, 1966, pages 5890 - 5913 |
NOTREDAME ET AL.: "T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments", J. MOL. BIOL., vol. 302, 2000, pages 205 - 217, XP004469125, DOI: doi:10.1006/jmbi.2000.4042 |
PAULA MONTEIRO DE SOUZA ET AL: "Application of microbial alpha-amylase in industry - A review", BRAZILIAN JOURNAL OF MICROBIOLOGY, SOCIEDADE BRASILEIRA DE MICROBIOLOGIA,BRAZILIAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, BR, vol. 41, no. 4, 1 December 2010 (2010-12-01), pages 850 - 861, XP002689559, ISSN: 1517-8382, DOI: 10.1590/S1517-83822010000400004 * |
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T.: "Molecular cloning: a laboratory manual", 2001, COLD SPRING LABORATORY PRESS |
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