WO2019054506A1 - フィブリルの製造方法 - Google Patents

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WO2019054506A1
WO2019054506A1 PCT/JP2018/034275 JP2018034275W WO2019054506A1 WO 2019054506 A1 WO2019054506 A1 WO 2019054506A1 JP 2018034275 W JP2018034275 W JP 2018034275W WO 2019054506 A1 WO2019054506 A1 WO 2019054506A1
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fibroin
amino acid
concentration
fibrils
solution
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裕生 上久保
有吾 林
健大 佐藤
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans

Definitions

  • the present invention relates to a method of producing fibrils.
  • Nanostructures using metal molecules are in practical use or in a state close to practical use, such as dye-sensitized solar cells (titanium oxide) and conductive inks (silver nanowires).
  • Nanostructures are also attracting attention in the field of biotechnology, and protein nanofibers are scaffold sheets for cells designed as desired for mechanical properties, biomolecular devices, cell engineering devices, regenerative medicine, tissue engineering, biosensors, etc. It is expected to be used as an actuator and as materials for lightweight and high strength materials, green nano hybrids, environmental purification materials, self-healing materials, filters, spinning, coatings, and high precision precision devices related to structure and physical property analysis.
  • Non-patent Document 1 protein nanofibers have not been put to practical use. If the length of the nanostructure can be controlled and made uniform, it becomes possible to produce a stable structure with controlled physical properties and functions, for example, strength, elongation, pore size, specific surface area, water retention, reaction site It can be used as a tool that can be controlled, and can also be used to build a model that predicts physical properties (Non-Patent Document 2). Thus, there is a need for a method of producing proteinaceous fibrils of uniform length.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing fibrils of uniform length comprising fibroin.
  • a method for producing fibrils which comprises the following steps (A) to (C): (A) Solubilizing fibroin containing a domain sequence represented by the formula [(A) n motif-REP] m using a solubilizing agent to obtain a solubilization solution, (B) forming a suspension containing fibrils by diluting the solubilization solution until the concentration of the solubilizer reaches a concentration at which the fibroin aggregates are generated, and maintaining the concentration; C) A step of recovering fibrils produced in the step (B).
  • (A) n motif represents an amino acid sequence composed of 4 to 27 amino acid residues, and (A) the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif is 65% or more.
  • REP represents an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 2 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may be identical to each other or different from each other.
  • the plurality of REPs may be identical amino acid sequences to each other or different amino acid sequences.
  • [2] The process according to [1], wherein the amount of fibroin in the aggregate produced in the step (B) is 0.1 to 10% by weight of the amount of fibroin used in the step (A).
  • step (C) is a step of centrifuging the suspension and collecting a supernatant.
  • step (C) is a step of centrifuging the suspension and collecting a supernatant.
  • solubilizer is a chaotropic agent.
  • the chaotropic agent is selected from the group consisting of urea, guanidinium hydrochloride, sodium iodide and perchlorate.
  • a method of producing fibrils of uniform length comprising fibroin can be provided.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the change of the structure of fibroin.
  • (A) shows fibroin solubilized by a solubilizer, and (b) shows fibroin in which columnar fibrils are formed.
  • BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS It is a schematic diagram of CD spectrum which shows the secondary structure of a general protein, and the relationship of a wavelength. It is a figure of UV spectrum of fibroin in each urea solution. 1 is 23 mg fibroin / ml 6 M urea solubilizing solution, 2 is a 2-fold dilution of 1, 3 is a 3-fold dilution of 1, 4 is a 4-fold dilution of 1 and 5 is a 5-fold dilution of 1.
  • FIG. 5 is a histogram of fibril length obtained from dilutions with fibroin concentrations of 1 mg / mL and 2.5 mg / mL. It is a figure of the histogram of the height of the fibril by SPM observation of 2 times dilution liquid.
  • the method for producing fibrils is characterized by including the following steps (A) to (C).
  • C A step of recovering fibrils produced in the step (B).
  • the fibroin according to the present invention is a protein comprising a domain sequence represented by the formula [(A) n motif-REP] m .
  • domain sequence refers to a crystal region specific to fibroin (typically corresponding to the (A) n motif of the amino acid sequence) and an amorphous region (typically the REP of the amino acid sequence).
  • the corresponding amino acid sequence is represented by the formula: [(A) n Motif-REP] m .
  • n motif is amino acid sequence composed of 4-27 amino acid residues, and (A) alanine residues to total amino acid residues in the n motif than 65% .
  • the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif is preferably 70% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 80% or more, and 85% or more More preferably, it is 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 100% (meaning it is composed of only alanine residues). It is preferable that at least seven (A) n motifs in the domain sequence are composed of only alanine residues.
  • the (A) n motif is (A) n (A represents an alanine residue, n is an integer of 4 to 27, preferably an integer of 4 to 20, more preferably It means having an amino acid sequence represented by 4) to 16).
  • REP represents an amino acid sequence composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • m represents an integer of 2 to 300.
  • the plurality of (A) n motifs may be identical to each other or different from each other.
  • the plurality of REPs may be identical amino acid sequences to each other or different amino acid sequences.
  • modified fibroin refers to fibroin whose domain sequence differs from that of naturally occurring fibroin.
  • modified fibroin is one having the amino acid sequence specified in the present invention, which is derived from naturally occurring fibroin and modified in its amino acid sequence (eg, in the amino acid sequence of cloned naturally occurring fibroin)
  • the amino acid sequence may be modified by substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues), or may be artificially designed and synthesized regardless of naturally occurring fibroin (For example, one having a desired amino acid sequence by chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence).
  • Substitutions, deletions, insertions and / or additions of amino acid residues can be carried out by methods known to those skilled in the art such as partial directed mutagenesis. Specifically, Nucleic Acid Res. 10, 6487 (1982), Methods in Enzymology, 100, 448 (1983) and the like.
  • Naturally occurring fibroin is a protein comprising a domain sequence represented by the formula [(A) n motif-REP] m .
  • the amino acid sequence may be added to the N-terminal side and / or the C-terminal side of the domain sequence, but when producing homogeneous fibrils, the amino acid sequence (N-terminal sequence and C-terminal sequence) on either one or both It is preferable that is not added.
  • Naturally occurring fibroin include fibroin produced by, for example, insects or spiders.
  • fibroin produced by insects include Bombyx mori (Bombyx mori), Quwaco (Bombyx mandarina), pemphigus (Antheraea yamamai), moth (Anteraea pernyi), moth (Eriogyna pyretorum), moth (Pilosamia Cynthia ricini) ), Silkworms produced by silkworms such as silkworms (Samia cynthia), cricketworms (Caligura japonica), tusser moths (Antheraea mylitta), and muga moths (Antheraea assama), hornets ejected by the larvae of the hornets (Vespa simillima xanthoptera) Silk protein is mentioned.
  • fibroin produced by insects include, for example, silkworm fibroin L chain (GenBank accession number M76430 (base sequence), AAA 27840.1 (amino acid sequence)) and the like.
  • the fibroins produced by the spiders include, for example, spiders belonging to the genus Araneus such as spider spiders, spider spiders, spider spiders, blue spider spiders, and spider spiders, spider spiders (genus Neoscona) such as spider spiders, spider spiders, spider spiders and spiders , Spiders belonging to the genus Pronus (Pronus), such as Torino Fundamas, spiders belonging to the genus Torino Fundama (Cyrtarachne) such as Torino Fundamas, and Otorino Fundames, such as spiders such as Togegumo and Tibusegumo Spiders belonging to the genus Gasteracantha, spiders belonging to the genus Ordgarius, such as the spiders belonging to the genus Gasteracantha and those belonging to the genus Ordgarius A spider belonging to the genus Angiope (Argiope), a spider belonging to the genus Angiope, a spider
  • fibroin produced by spiders include, for example, fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (base sequence)), fibroin- 4 (adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (base sequence)), dragline silk protein spidroin 1 (derived from Nephila clavipes) (genbank accession number AAC 04504 (amino acid sequence), U37520 (base sequence)), major angu11ate spidroin 1 [La rodectus hesperus] (GenBank Accession No.
  • ABR68856 amino acid sequence
  • EF 595246 base sequence
  • dragline silk protein spidroin 2 [from Nephila clavata] (GenBank Accession No. AAL 32472 (amino acid sequence), AF 44 1 245 (base sequence)), major anpullate spidroin 1 [from Euprosthenops australis] (GenBank accession numbers CAJ00428 (amino acid sequence), AJ 973 155 (base sequence)), and major ampullate spidroin 2 [Euprosthenops australis] (GenB nk accession number CAM 32249.1 (amino acid sequence), AM 490169 (base sequence)), minor ampullate silk protein 1 [Nephila clavipes] (GenBank accession number AAC 14589.
  • Naturally derived fibroin further include fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • spidroin, ampullate, fibroin, “silk and polypeptide”, or “silk and protein” are described as keywords among sequences including INV as DIVISION among sequence information registered in NCBI GenBank.
  • the sequence can be confirmed by extracting a specified product string from CDS, and a described sequence of a specific string from SOURCE to TISSUE TYPE.
  • a specific sequence of fibroin is a partial sequence derived from ADF-3 (Araneus diadematus Fibroin-3), which constitutes a dragline of Araneus diadematus shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, There may be mentioned fibroin comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • fibril refers to a fibrous material having a diameter of 1 nm to 100 nm and a length greater than the diameter, for example, a length of 10 times or more of the diameter. Fibrils are sometimes referred to as nanofibers or nanorods.
  • the fibrils composed of fibroin mean fibrils in which the component of the fibrous material is fibroin.
  • the fibrils composed of fibroin are preferably cylindrical fibrils as shown in FIG. 1 (b).
  • the length of the fibrils depends on the number m of repeats of the domain sequence represented by the formula: [(A) n Motif-REP] m , and fibrils longer as m becomes larger can be obtained.
  • the length of fibrils can be lengthened depending on the molecular weight and concentration of fibroin, but may be, for example, 30-150 nm for a dose of about 50 kDa and a concentration of about 1 mg / ml, a concentration of about 2.5 mg / ml It may be 50 to 250 nm in ml.
  • the diameter (height) of the fibrils may be, for example, 2 to 5 nm. According to the invention, fibrils of uniform length are obtained.
  • “uniform” means that 70% is included in the range of ⁇ 50% with respect to the length showing the maximum value on the histogram.
  • the step (A) is a step of solubilizing fibroin containing [(A) n motif-REP] m domain sequence using a solubilizing agent to obtain a solubilization solution.
  • a solubilizing agent can be used as long as it can solubilize fibroin, but a chaotropic agent (hereinafter also referred to as "chaotrope agent”) is preferable.
  • chaotropic agent include urea, guanidinium hydrochloride (GuHCl), guanidine thiocyanate (GTC), sodium iodide (NaI), perchlorate and the like, with preference given to urea and guanidinium hydrochloride.
  • Fibroin can be solubilized, for example, by dissolving it in water or a buffer containing a solubilizing agent.
  • a buffer for example, Tris-HCl buffer (trishydroxymethylaminomethane and hydrochloric acid), phosphate buffer (phosphate and sodium phosphate), acetate buffer (acetic acid and sodium acetate), citrate buffer (citrate) And sodium citrate), borate buffer, MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) buffer, Pipes (piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)) buffer, MOPS (3-morpholinopropane sulfone) Examples include acid) buffer, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethane sulfonic acid) buffer, tricine buffer and CAPS (3-cyclohexylaminopropane sulfonic acid) buffer.
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperaz
  • the form of fibroin to be solubilized may be powder or liquid.
  • urea As a dissolution method in the case of using urea as a solubilizing agent, for example, the following methods can be mentioned. 200 to 300 ⁇ l of urea buffer (6 to 8 M urea, 10 mM Tris HCl, pH 7.0) is added to 3 to 7 mg of fibroin powder sample and shaken (1800 rpm) for 5 minutes to dissolve fibroin. Sonication (20-30%, 10 seconds, 4-5 times, interval 5-10 minutes) may be performed to completely dissolve fibroin. Whether fibroin is completely dissolved in the buffer containing the solubilizing agent can be confirmed by ultraviolet / visible absorption measurement described later, or the like.
  • the step (A) may further include filtering the obtained solubilized solution. It is preferable to use what removed the impurity by filter filtration, when performing the below-mentioned solubility and structural analysis.
  • filter filtration for example, filtration using a filter (Ultrafree-MC-GV, Durapore PVDF 0.22 ⁇ m) can be mentioned.
  • the concentration of the solubilizer means the concentration of the solubilizer in the solubilization solution obtained by dissolving fibroin.
  • the dilution of the solubilization solution can be carried out by diluting the prepared solubilization solution with water or buffer containing no solubilizer.
  • the buffer for example, those described above can be used, and it is preferable to carry out dilution using a Tris buffer. Dilution of the solubilization solution reduces the concentration of solubilizer.
  • a method of diluting the solubilization solution there can be mentioned, for example, a method of gradually diluting, for example, a method of dialysis, and a method of serially diluting 2 times, 3 times, 4 times and 5 times.
  • dilution solution The solution in which the concentration of the solubilizer in the solubilization solution is reduced by dilution is hereinafter also referred to as "dilution solution".
  • the solubilizing solution is diluted to reduce the concentration of the solubilizing agent to a concentration at which fibroin aggregates are produced (hereinafter also referred to as "equilibrium concentration"). Aggregates are formed. A suspension is formed by the formation of the aggregates.
  • the structure of fibroin present in the solubilization part of the suspension is changed to form fibrils of uniform length. It is presumed that this is because the dissolution and aggregation of fibroin are in an equilibrium state by maintaining a concentration at which all fibroins do not aggregate, thereby efficiently obtaining fibrils of uniform length.
  • the state in which the dissolution and aggregation are in equilibrium means that the fibroin molecule moves to a solution or moves to an aggregate. The state of dissolution of fibroin and structural changes can be confirmed by analysis according to the method described later.
  • Whether aggregates of fibroin are formed can be confirmed visually, but can also be confirmed by measuring the protein (fibroin) content of the supernatant and the precipitate fraction described later.
  • the diluted solution can be centrifuged (20 ° C., 14500 rpm, 30 minutes) using a centrifuge (KUBOTA 3740, manufactured by Kubota Mfg. Co., Ltd.), and the presence or absence of a precipitate can be confirmed.
  • KUBOTA 3740 manufactured by Kubota Mfg. Co., Ltd.
  • the diluted solution is suspended can be confirmed visually, but can also be confirmed, for example, by measuring the absorbance of the diluted solution.
  • the absorbance of the supernatant after centrifugation of the diluted solution is measured, and the amount of protein present in the supernatant is the amount of protein present in the solubilized solution before dilution and If the concentration is reduced by 10% or more, or the absorbance of the solution in which the precipitate is dissolved is measured, the amount of protein present in the solution in which the precipitate is dissolved is 10% of the amount of protein present in the solubilized solution before dilution In the case of the above, it can be judged that the diluted solution is suspended, that is, an aggregate is formed.
  • the concentration at which the aggregates form can be maintained by stopping the dilution, for example by settling.
  • the time for maintaining the concentration at which precipitation occurs may be, for example, 1 hour or more and 120 hours or less.
  • the lower limit of the time to maintain the concentration at which the aggregates form may be, for example, 1 hour, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours or 72 hours.
  • concentration which an aggregate produces you may be 120 hours, 96 hours, 72 hours, 48 hours, and 24 hours, for example.
  • fibroins are partially in contact with each other (portion shown by a circle of broken line in FIG. 1A).
  • fibroin involved in the present invention is self-assembled upon gradual dilution to form cylindrical fibrils as shown in FIG. 1 (b).
  • FIG. 1 (b) In order to increase the fibril productivity, it is preferable to bring as much fibroin as possible to FIG. 1 (b) from the state of FIG. 1 (a).
  • industrial-level production it can be confirmed by the formation state of aggregates as one of the indexes.
  • concentration of solubilizer By maintaining the concentration of solubilizer at a stage where the amount of aggregates formed is small, more fibrils can be obtained.
  • the fibrils can be obtained in a high yield by maintaining the amount of aggregates with a higher concentration of dilution solution and forming less fibrils, but in view of the time until the acquisition, solubilization of a preferable concentration in industrial production
  • the solution may be set.
  • Fibrils can be obtained more efficiently by suppressing the amount of aggregate formation to 10% by weight or less of the total amount of fibroin in the aggregate (A). That is, the amount of fibroin in the aggregate is 0.1 to 10% by weight, preferably 0.1 to 8% by weight, and more preferably 0.1 to 6% by weight of the total amount of fibroin used in step (A). is there.
  • the concentration in the equilibrium state may be determined based on the formation of aggregates depending on the fibroin used, for example, 1.5 to 10.0 times, based on the concentration of the solubilizer in the solubilization solution. It can be diluted 8-fold to 8.0-fold or 2.0-fold to 6.0-fold.
  • concentration of urea in the diluent is 1.5 to 4.5 M, preferably 2.
  • a concentration of 0 to 4.0 M, more preferably 2.5 to 3.5 M can be raised.
  • Step (C) is a step of recovering fibrils produced in step (B).
  • the step (C) can be a step of centrifuging the suspension containing fibrils generated in the step (B) and recovering the supernatant containing fibrils.
  • conditions for centrifugation KUBOTA 3740, manufactured by Kubota Mfg. Co., Ltd.
  • conditions for centrifugation KUBOTA 3740, manufactured by Kubota Mfg. Co., Ltd.
  • conditions for centrifugation KUBOTA 3740, manufactured by Kubota Mfg. Co., Ltd.
  • the occurrence of precipitation can be confirmed by measuring the protein (fibroin) content of the supernatant and the precipitate fraction.
  • the protein content of the precipitate fraction can be determined by resolubilizing the precipitate fraction using a solubilizer and measuring with NanoDrop®.
  • ATR-FTIR Total reflection attenuation-secondary structure evaluation by Fourier transform infrared spectroscopy
  • ATR-FTIR measurement can be performed using FTIR-6100 (manufactured by JASCO Corporation), ATR PRO ONE (manufactured by JASCO Corporation) or the like.
  • the measurement conditions may be performed according to the manual attached to the device.
  • FTIR-6100 manufactured by JASCO Corporation
  • ATR PRO ONE manufactured by JASCO Corporation
  • the measurement conditions may be performed according to the manual attached to the device.
  • ThT is added to the fibroin solubilization solution, and the fluorescence intensity is measured.
  • the addition amount of ThT may be 0.05 to 0.2 mg / ml.
  • spectral measurements can be made.
  • the fluorometer include JASCO FP-8200 (manufactured by JASCO Corporation) and the like. The measurement may be performed according to the manual attached to the device.
  • a plate reader can follow the change in fluorescence intensity over time.
  • a plate reader for example, SYNERGY HTX (manufactured by Biotech Co., Ltd.) or the like can be used. The measurement may be performed according to the manual attached to the device. Based on the formation of unidirectional ⁇ -sheet structure by solubilizing fibroin with urea and diluting undiluted solubilization solution (hereinafter also referred to as “fibroin urea solubilization stock solution”) to an appropriate concentration An increase in the fluorescence intensity of Thioflavin T can be confirmed by a fluorometer. In addition, it can be traced by the plate reader that the ⁇ sheet structure aligned in one direction is formed over time. Furthermore, this analysis can also determine optimal dilution conditions.
  • Example 1 To 5.1 mg of fibroin powder sample, add 222 ⁇ l of urea buffer (6 M urea, 10 mM tris HCl, pH 7.0), shake for 5 minutes (1800 rpm), then sonicate (20%, 10 seconds, 4 times, interval 10 minutes) Done to completely solubilize fibroin.
  • the solubilized solution was filtered using a filter (Ultrafree-MC-GV, Durapore PVDF 0.22 ⁇ m) to remove impurities. At that time, 50 ⁇ l was flowed so as not to clog the filter.
  • the UV-visible absorption of the filter-filtered solubilization solution was measured with NanoDrop®.
  • the solubilization solution exhibited an ultraviolet-visible absorption spectrum with a maximum at 280 nm, and no significant scattering was observed, confirming that fibroin was completely dissolved (spectrum 1 in FIG. 3).
  • fibroin having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 it is suitable to prepare 2-3 times diluted solubilizing solution, ie maintaining a concentration of 2-3 M urea, for uniform length fibrils was confirmed by structural analysis of The protein content in the precipitate of the 2-3 fold diluted solubilization solution was 7-9% of the total protein content (see FIG. 4).
  • FIG. 6 shows a difference CD spectrum (dotted line) of the urea solubilized stock solution (solid line) of FIG. 5 and a 2-fold diluted solution. As shown in FIG. 6, from the fact that a CD spectrum showing a negative maximum around 220 nm was obtained, it was estimated that fibroin in the 2-fold diluted solution forms a ⁇ -sheet structure.
  • ATR-FTIR Total reflection attenuation-secondary structure evaluation by Fourier transform infrared spectroscopy
  • FTIR-6100 JASCO Corporation
  • ATR PRO ONE JASCO Corporation
  • the prism used for the measurement of ATR was a diamond, and the incident angle was 45 °.
  • ATR measurement was performed under the following conditions. Number of integrations: background-512, sample-128 Decomposition: 4 cm -1 , Interferometer Speed: 4 mm / sec, Detector: MCT Sensitivity: ⁇ 1, Filter: 10 kHz, Measurement range: 700-7800 cm -1 Aperture: 1.8 mm, apodization: cosine Interval measurement: 5 minutes, interval: 100 seconds Sample mounting amount: 9 ⁇ l
  • ThT The fluorescent dye thioflavin T (ThT), which strongly reacts to the ⁇ -sheet structure, was used for analysis by fluorescence intensity spectrum.
  • JASCO FP-8200 JASCO Corporation
  • SYNERGY HTX Biotech Corporation
  • the measurement by a fluorometer was performed under the following conditions. Measuring range 440 to 600 nm Excitation wavelength 450 nm Measurement concentration 0.1 mg / ml Scan speed Medium Number of measurements 3 times for each sample
  • Image analysis was performed using ImageJ software to measure the length and diameter. As a result, a histogram regarding the length of the formed nanofibers is shown in FIG. From this histogram, it was found that the length of the formed nanofibers was an integral multiple of about 50 nm, and nanofibers having different repetition numbers were formed. Furthermore, when the histogram of the length of the nanofiber obtained from the dilution liquid in which fibroin concentration differs is compared (FIG. 12), it has confirmed that the one where fibroin concentration is large has become large [repetition number]. Image analysis was performed using software attached to SPM-9700, and height (diameter) was measured. As a result, the height of the formed nanofibers was uniformly about 3 nm (FIG. 13).
  • the produced nanofiber has a cylindrical structure with uniform length and diameter as a basic unit.
  • the length and diameter of the nanofibers as the basic unit can be adjusted by the arrangement and molecular weight of fibroin used.
  • Natural cotton, silk, wool and the like are aggregates of nanostructures controlled with high precision. On the other hand, it is expected to artificially produce fibroin having a highly controlled structure according to the present invention on an industrial scale. In addition, fibrils produced by the present invention are also expected to be applied to cell sheets, biomolecular devices, filters, spinning, cosmetics and the like.

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Abstract

（Ａ）式［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロインを、可溶化剤を用いて可溶化して、可溶化溶液を得る工程、（Ｂ）前記可溶化剤の濃度が前記フィブロインの凝集体が生じる濃度になるまで前記可溶化溶液を希釈し、その濃度を維持することで、フィブリルを含む懸濁液を生成する工程、及び（Ｃ）（Ｂ）工程において生成したフィブリルを回収する工程を含むフィブリルの製造方法。

Description

フィブリルの製造方法
　本発明は、フィブリルの製造方法に関する。
　金属分子を用いたナノ構造体は、色素増感太陽電池（酸化チタン）、導電インク（銀ナノワイヤー）等実用化されているあるいは実用化に近い状況にある。
　バイオテクノロジー分野においてもナノ構造体は注目されており、タンパク質ナノファイバーは、機械特性を望んだとおりにデザインした細胞の足場シート、生体分子デバイス、細胞工学デバイス、再生医療・組織工学、バイオセンサー・アクチュエーターとしての利用並びに軽量・高強度材料、グリーンナノハイブリッド、環境浄化材料、自己修復材料、フィルタ、紡糸、コーティング、構造・物性解析関連の高精度精密機器等の材料として期待されている。
　しかしながら、タンパク質ナノファイバーは実用化には至っていない（非特許文献１）。ナノ構造体の長さをコントロールして揃えることができれば、物性や機能を制御した安定な構造体の作製が可能になり、例えば、強度、伸度、ポアサイズ、比表面積、水分保持率、反応場の量など制御でき、物性を予測するモデルの構築にも使えるツールとなり得る（非特許文献２）。したがって、均一な長さのタンパク質性のフィブリルを製造する方法が求められている。
Ｌ．　Ｗａｎｇ，　Ｙ．　Ｓｕｎ，　Ｚ．　Ｌｉ，　Ａ．　Ｗｕ，　ａｎｄ　Ｇ．　Ｗｅｉ，　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　（Ｂａｓｅｌ）．，　ｖｏｌ．　９，　ｎｏ．　１，　２０１６"Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｏｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ　ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ" ＲＳＣ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　２０１３　ｖｏｌ．３　ｐ．１３２５１
　本発明は、フィブロインからなる均一な長さのフィブリルの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］　以下（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む、フィブリルの製造方法。
（Ａ）式［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロインを、可溶化剤を用いて可溶化して、可溶化溶液を得る工程、
（Ｂ）上記可溶化剤の濃度が上記フィブロインの凝集体が生じる濃度になるまで前記可溶化溶液を希釈し、その濃度を維持することで、フィブリルを含む懸濁液を生成する工程、及び
（Ｃ）（Ｂ）工程において生成したフィブリルを回収する工程。
［式中、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が６５％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは２～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
［２］　上記（Ｂ）工程で生じる凝集体中のフィブロイン量が、上記（Ａ）工程で用いたフィブロイン量の０．１～１０重量％である、上記［１］記載の製造方法。
［３］　上記（Ｃ）工程が、上記懸濁液を遠心分離し、上清を回収する工程である、上記［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］　可溶化剤がカオトロピック剤である上記［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］　カオトロピック剤が尿素、塩酸グアニジウム、ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸塩からなる群より選ばれる、上記［４］記載の製造方法。
　本発明によれば、フィブロインからなる均一な長さのフィブリルの製造する方法を提供することができる。
フィブロインの構造の変化を示す模式図である。（ａ）は可溶化剤により可溶化したフィブロインを示し、（ｂ）は円柱状のフィブリルを形成したフィブロインを示す。 一般的なタンパク質の二次構造と波長の関係を示すＣＤスペクトルの模式図である。 各尿素溶液中におけるフィブロインのＵＶスペクトルの図である。１は２３ｍｇフィブロイン／ｍｌ　６Ｍ尿素可溶化溶液、２は１の２倍希釈液、３は１の３倍希釈液、４は１の４倍希釈液、５は１の５倍希釈液を示す。 各尿素溶液中における上清及び沈殿画分に含まれるタンパク質量を示す図である。上清に含まれるタンパク質量を斜線で、沈殿に含まれるタンパク質量を黒塗りで示す。 尿素可溶化原液（実線）及び２倍希釈液（破線）におけるフィブロインのＣＤスペクトルの図である。 図５の尿素可溶化原液（実線）及び２倍希釈液（破線）の差ＣＤスペクトルの図である。 尿素可溶化原液（実線）及び２倍希釈液（破線）におけるフィブロインのＩＲスペクトルの図である。 各尿素溶液中における溶液に添加したチオフラビンＴに由来する蛍光スペクトルの図である。実線は尿素可溶化原液、一点鎖線は２倍希釈液の希釈直後、破線は２倍希釈液の希釈１日後、二点鎖線は２倍希釈液の希釈８日後の蛍光スペクトルを示す。 ２倍希釈液における溶液に添加したチオフラビンＴに由来する蛍光強度の経時的変化を示す図である。各時間において観測された蛍光強度を破線で、フィッティング曲線を実線で示す。 ２倍希釈液の走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）による観察結果の図である。 ２倍希釈液のＳＰＭ観察によるフィブリルの長さのヒストグラムの図である。 フィブロイン濃度が１ｍｇ／ｍＬ及び２．５ｍｇ／ｍＬの希釈液から得られたフィブリルの長さのヒストグラムの図である。 ２倍希釈液のＳＰＭ観察によるフィブリルの高さのヒストグラムの図である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　一実施形態に係るフィブリルの製造方法は、具体的には以下の（Ａ）～（Ｃ）の工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）式［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロインを、可溶化剤を用いて可溶化し、可溶化溶液を得る工程、
（Ｂ）上記可溶化剤の濃度を凝集体が生じる濃度に希釈し、その濃度を維持することで、フィブリルを含む懸濁液を生成する工程、
（Ｃ）（Ｂ）工程において生成したフィブリルを回収する工程。
［フィブロイン］
　本発明に係るフィブロインは、式［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。
　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列を意味する。
　ここで、（Ａ）ｎモチーフが４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であり、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が６５％以上であればよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は、７０％以上であることが好ましく、７５％以上であることがより好ましく、８０％以上が更に好ましく、８５％以上であることが更に好ましく、９０％以上であることが更により好ましく、９５％以上であることが特に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が特により好ましい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されることが好ましい。アラニン残基のみで構成されるとは、（Ａ）ｎモチーフが、（Ａ）ｎ（Ａはアラニン残基を示し、ｎは４～２７の整数、好ましくは４～２０の整数、より好ましくは４～１６の整数を示す。）で表されるアミノ酸配列を有することを意味する。
　ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは２～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　式［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質であれば、天然由来のフィブロインであっても、改変フィブロインであってもよい。
　本明細書において「改変フィブロイン」とは、そのドメイン配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインを意味する。「改変フィブロイン」は、本発明で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインに依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列中の１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
　アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
　天然由来のフィブロインは、式［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。ドメイン配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側にアミノ酸配列が付加されていてもよいが、均一なフィブリルを製造する上では、いずれか一方又は両方にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されないものが好ましい。
　天然由来のフィブロインとしては、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））等が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質等が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｇｕ１１ａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロイン等を挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　フィブロインの具体的な配列としては、配列番号１に示されるニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の牽引糸を構成しているＡＤＦ－３（Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ　Ｆｉｂｒｏｉｎ－３）由来の部分配列、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むフィブロイン等を挙げることができる。
［フィブリル］
　本発明において、フィブリルとは、直径が１ｎｍから１００ｎｍ、長さが直径に比べて大きいものであって、例えば、長さが直径の１０倍以上の繊維状物質を意味する。フィブリルは、ナノファイバーあるいはナノロッドと称されることもある。フィブロインからなるフィブリルとは、繊維状物質の構成成分がフィブロインであるフィブリルを意味する。フィブロインからなるフィブリルは、図１（ｂ）に示されるような円柱状のフィブリルであることが好ましい。フィブリルの長さは式：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列の繰り返し数ｍに依存しており、ｍが大きくなる程長いフィブリルを得ることができる。フィブリルの長さは、フィブロインの分子量及び濃度に依存して長くすることができるが、例えば、分量約５０ｋＤａで濃度が約１ｍｇ／ｍｌでは３０～１５０ｎｍであってよく、濃度が約２．５ｍｇ／ｍｌでは５０～２５０ｎｍであってよい。フィブリルの直径（高さ）は、例えば２～５ｎｍであってよい。本発明によれば、均一な長さのフィブリルが得られる。ここで均一とは、ヒストグラム上で極大値を示す長さに対して±５０％の範囲に７０％が含まれることを意味する。
［（Ａ）工程］
　（Ａ）工程は、［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍドメイン配列を含むフィブロインを、可溶化剤を用いて可溶化して、可溶化溶液を得る工程である。
　可溶化剤としては、フィブロインを可溶化できるものであればいずれも用いることができるが、カオトロピック剤（以下「カオトロープ剤」ともいう）が好ましい。カオトロープ剤としては、尿素、塩酸グアニジウム（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧＴＣ）、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、過塩素酸塩等をあげることができ、尿素、塩酸グアニジウムが好ましい。
　フィブロインは、例えば、可溶化剤を含む水又はバッファーに溶解させることで可溶化することができる。バッファーとしては、例えば、トリス塩酸緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン及び塩酸）、リン酸緩衝液（リン酸及びリン酸ナトリウム）、酢酸緩衝液（酢酸及び酢酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸及びクエン酸ナトリウム)、ホウ酸緩衝液、ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液、Ｐｉｐｅｓ（ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸））緩衝液、ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、トリシン緩衝液及びＣＡＰＳ（３－シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸）緩衝液等が挙げられる。本明細書においてフィブロインを溶解させた溶液を「可溶化溶液」ともいう。
　可溶化させるフィブロインの形態は、粉末状であってもよく、液状であってもよい。
　可溶化剤として尿素を用いた場合の溶解方法としては、例えば、以下の方法をあげることができる。フィブロインの粉末試料３～７ｍｇに尿素バッファー（６～８Ｍ尿素、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、ｐＨ７．０）を２００～３００μｌ加え、５分間振とう（１８００ｒｐｍ）させてフィブロインを溶解する。フィブロインを完全に溶解させるために超音波処理（２０～３０％、１０秒、４～５回、インターバル５～１０分）を行ってもよい。フィブロインが可溶化剤を含むバッファーに完全に溶解しているかは、後述する紫外・可視吸収測定等により確認することができる。
　（Ａ）工程は、さらに得られた可溶化溶液をフィルタ濾過することを含んでもよい。後述の溶解度、構造解析を行う上で、フィルタ濾過により不純物を取り除いたものを用いることが好ましい。フィルタ濾過としては、例えばフィルタ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ－ＧＶ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ　ＰＶＤＦ　０．２２μｍ）を用いた濾過を挙げることができる。フィルタ濾過は、用いるフィルタの濾過性能及び可溶化溶液の性質等に合わせて可溶化溶液の流量を適宜調節し、フィルタが目詰まりしないように、少しずつ、可溶化溶液を流すことが好ましい。例えば、上記フィルタを用いた場合、ピペット操作により可溶化溶液を５０μｌ以下の量ずつ流すことが好ましい。
［（Ｂ）工程］
　（Ｂ）工程は、前記可溶化剤の濃度が前記フィブロインの凝集体が生じる濃度になるまで前記可溶化溶液を希釈し、その濃度を維持することで、フィブリルを含む懸濁液を生成する工程である。
　可溶化剤の濃度とは、フィブロインを溶解して得られた可溶化溶液における可溶化剤の濃度を意味する。可溶化溶液の希釈は、調製した可溶化溶液を、可溶化剤を含まない水又はバッファーを用いて希釈することで行うことができる。バッファーとしては、例えば、上述したものを用いることができ、トリス緩衝液を用いて希釈することで行うことが好ましい。可溶化溶液を希釈することにより、可溶化剤の濃度が低下する。可溶化溶液を希釈する方法としては、徐々に希釈する方法、例えば、透析による方法、２倍、３倍、４倍、５倍と段階的に希釈する方法等をあげることができる。適切な可溶化剤の濃度に低下した段階で、その濃度を維持することが好ましいため、希釈する方法としては段階希釈が好ましい。可溶化溶液における可溶化剤の濃度を希釈により低下させた溶液を、以下「希釈液」ともいう。
　希釈後、良く撹拌、もしくは振とうさせることが好ましく、例えば、１８００ｒｐｍ、５分間の条件で振とうさせる等の条件をあげることができる。また、必要に応じて更に一日静置してもよい。
　可溶化剤によりフィブロインを可溶化した後、可溶化溶液を希釈し、可溶化剤の濃度をフィブロインの凝集体が生じる濃度（以下、「平衡状態の濃度」ともいう）まで低下させると、フィブロインの凝集体が形成される。この凝集体が形成されることにより懸濁液となる。可溶化溶液の希釈を停止し、可溶化剤の濃度を維持することで、懸濁液の可溶化部に存在するフィブロインの構造が変化し、均一な長さのフィブリルを形成する。これは、すべてのフィブロインが凝集しない濃度を維持することにより、フィブロインの溶解と凝集が平衡状態となることで、均一な長さのフィブリルが効率的に得られるためと推測される。ここで溶解と凝集が平衡状態になるとは、フィブロイン分子が溶液に移動したり凝集体に移動したりする状態を意味する。フィブロインの溶解の状況、構造の変化は、後述の方法で解析することにより確認することができる。
　フィブロインの凝集体が形成されているかは、目視により確認することもできるが、後述する上清及び沈殿画分のタンパク質（フィブロイン）含量を測定すること等により確認することもできる。例えば、希釈液を遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７４０、株式会社久保田製作所製）を用いて遠心分離（２０℃、１４５００ｒｐｍで３０分）し、沈殿の存在の有無により確認することができる。また、上述のように、希釈液の懸濁は、フィブロインの凝集体の形成によるものであるため、凝集体が生じる濃度は、希釈液が懸濁する濃度とすることもできる。希釈液が懸濁しているかは、目視により確認することもできるが、例えば、希釈液の吸光度を測定することにより確認することもできる。吸光度を測定することにより確認する方法としては、例えば、希釈液の遠心分離後の上清の吸光度を測定し、上清に存在するタンパク質量が、希釈前の可溶化溶液に存在するタンパク質量と比較して１０％以上減少している場合、もしくは沈殿を溶解した溶液の吸光度を測定し、沈殿を溶解した溶液に存在するタンパク質量が、希釈前の可溶化溶液に存在するタンパク質量の１０％以上である場合には、希釈液が懸濁している、すなわち凝集体が形成していると判断することができる。凝集体が生じる濃度は、希釈を停止し、例えば、静置することで維持することができる。沈殿が生じる濃度を維持する時間は、例えば、１時間以上１２０時間以下であってよい。凝集体が生じる濃度を維持する時間の下限値は、例えば、１時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間又は７２時間であってよい。また、凝集体が生じる濃度を維持する時間の上限値としては、例えば、１２０時間、９６時間、７２時間、４８時間及び２４時間であってよい。
　図１に示すように、完全に可溶化している状態では立体構造を形成しておらず、部分的にフィブロイン同士が接触（図１（ａ）破線による丸で示した箇所）しているに過ぎないが、本発明に関わるフィブロインは、徐々に希釈することにより自己組織化し、図１（ｂ）に示すような円柱状のフィブリルを形成する。
　フィブリルの生産性をあげるためには、図１（ａ）の状態から、できるだけ多くのフィブロインを図１（ｂ）にもっていくことが好ましい。工業レベルの製造においては、その指標の一つとして凝集体の形成状況で確認することができる。生成される凝集体が少ない段階における可溶化剤の濃度を維持することにより、より多くのフィブリルを取得できる。より高濃度の希釈液で、より少ない凝集体量で維持し、フィブリルを形成させることにより、フィブリルを高収率で取得できるが、取得までの時間を考慮し、工業生産において好ましい濃度の可溶化溶液を設定すればよい。
　凝集体の生成量を、凝集体中のフィブロイン量が（Ａ）工程で用いたフィブロインの全量の１０重量％以下に抑えることにより、より効率良くフィブリルを取得できる。即ち、凝集体中のフィブロイン量が（Ａ）工程で用いたフィブロインの全量の、０．１～１０重量％、好ましくは０．１～８重量％、更に好ましくは０．１～６重量％である。
　平衡状態の濃度は、用いるフィブロインに応じて凝集体の形成に基づき決定すればよいが、例えば、可溶化溶液における可溶化剤の濃度を基準として、１．５倍～１０．０倍、１．８倍～８．０倍又は２．０倍～６．０倍に希釈することができる。より具体的な例として、配列番号１のアミノ酸配列を有するフィブロインに対して、可溶化剤として尿素を用いた場合、希釈液における尿素の濃度として、１．５～４．５Ｍ、好ましくは２．０～４．０Ｍ、更に好ましくは２．５～３．５Ｍの濃度をあげることができる。
［（Ｃ）工程］
　（Ｃ）工程は、（Ｂ）工程において生成したフィブリルを回収する工程である。
　フィブリルを回収する方法は、遠心分離、ドラムフィルタやプレスフィルタ等のフィルタろ過等、一般的な方法が挙げられる。遠心分離により凝集体を含む沈殿と、懸濁液の可溶化部に存在するフィブリルを含む上清に分離することができる。したがって、（Ｃ）工程を、（Ｂ）工程において生成したフィブリルを含む懸濁液を遠心分離し、フィブリルを含む上清を回収する工程とすることもできる。凝集体を沈殿として遠心分離する場合の、遠心分離の条件としては、例えば、２０℃、１４５００ｒｐｍの条件で、３０分間、遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ　３７４０、株式会社久保田製作所製）する条件をあげることができる。
［フィブロインの可溶化溶液及び希釈液の解析］
（１）紫外・可視吸収測定による溶解の状況の評価
　フィブロインの溶解の状況及びタンパク質（フィブロイン）濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）による紫外・可視吸収スペクトルを測定することにより確認することができる。フィブロインの紫外・可視吸収スペクトルは、２８０ｎｍを極大とする吸収スペクトルを示し、完全に溶解している場合には顕著な散乱は見られない。
　沈殿の発生状況は、上清及び沈殿画分のタンパク質（フィブロイン）含量を測定することにより確認することができる。沈殿画分のタンパク質含量は、沈殿画分を可溶化剤を用いて再溶解させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）で測定することにより求めることができる。
（２）ＣＤスペクトルによる二次構造評価
　可溶化溶液の希釈によるフィブロインの構造変化は、ＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒ　Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）スペクトルにより確認することができる。完全なアルファへリックス構造をとる場合、２０８ｎｍと２２２ｎｍに負の極大、１９３ｎｍに正の極大を示す。完全なβシート構造をとる場合、２１８ｎｍ付近に負の極大、１９５ｎｍ付近に正の極大を示す。完全なランダムコイル構造をとる場合、２１７ｎｍ付近に正の極大、１９５ｎｍ付近に負の極大を示す（図２）。フィブロインがフィブリルを形成していれば、βシート構造を確認することができる。
（３）全反射減衰－フーリエ変換赤外分光法（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）による二次構造評価
　ＡＴＲ－ＦＴＩＲで測定した場合、アミロイド繊維がβシート構造が一方向に並んだ構造（クロスβシート構造、ポリアラニン結晶構造）にシフトすると、シフトに依存した特有のＩＲスペクトル変化が見られる。同様のＩＲスペクトル変化が見られるか確認することにより、フィブロイン可溶化溶液中のフィブロインがβシート構造が一方向に並んだ構造をとっているか確認することができる。
　ＡＴＲ－ＦＴＩＲ測定は、ＦＴＩＲ－６１００（日本分光株式会社製）、ＡＴＲ　ＰＲＯ　ＯＮＥ（日本分光株式会社製）等を用いて行うことができる。測定条件は機器付属のマニュアルに準じて行えばよい。フィブロインがフィブリルを形成する場合、アミロイド繊維に見られる、βシート構造が一方向に並んだ特徴的な構造に基づくＩＲスペクトルシフトを確認することができる。
（４）チオフラビンＴ（ＴｈＴ）染色による蛍光強度測定
　βシート構造に強く反応する蛍光色素チオフラビンＴ(ＴｈＴ)を用い、蛍光強度による解析を、蛍光光度計及びプレートリーダーで行うことにより、フィブロイン可溶化溶液中のフィブロインのβシート構造の形成状況を確認することができる。
　フィブロイン可溶化溶液に、ＴｈＴを添加し、蛍光強度を測定する。ＴｈＴの添加量は０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌであればよい。
　蛍光光度計により、スペクトル測定を行うことができる。蛍光光度計としては、例えば、ＪＡＳＣＯ　ＦＰ－８２００（日本分光株式会社製）等が挙げられる。測定は機器付属のマニュアルに準じて行えばよい。
　プレートリーダーにより、蛍光強度の経時変化を追うことができる。プレートリーダーとしては、例えば、ＳＹＮＥＲＧＹ　ＨＴＸ（バイオテック株式会社製）等を用いて行うことができる。測定は機器付属のマニュアルに準じて行えばよい。フィブロインを尿素により可溶化し、希釈していない可溶化溶液（以下、「フィブロイン尿素可溶化原液」ともいう）を適当な濃度まで希釈することにより、一方向に並んだβシート構造の形成に基づくチオフラビンＴの蛍光強度の上昇を蛍光光度計により確認することができる。また、この一方向に並んだβシート構造が経時的に形成されることをプレートリーダーで追うことができる。さらに、この解析により最適な希釈条件を決定することもできる。
（５）顕微鏡による形態観察及び解析
　フィブロイン尿素可溶化原液又は尿素を希釈した希釈液中に形成されたフィブリルは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）を用いて観察することができる。観察は機器付属のマニュアルに準じて行えばよい。ＩｍａｇｅＪソフト等の解析ソフトを利用することにより、フィブリルの長さ、直径の計測解析ができる。
［実施例１］
　フィブロインの粉末試料５．１ｍｇに尿素バッファー（６Ｍ尿素、１０ｍＭｔｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．０）を２２２μｌ加え、５分間振とう（１８００ｒｐｍ）後、ソニケーション（２０％、１０秒、４回、インターバル１０分）を行い、フィブロインを完全に可溶化させた。当該可溶化溶液を、フィルタ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ－ＧＶ、ＤｕｒａｐｏｒｅＰＶＤＦ０．２２μｍ）を用いて濾過し、不純物を取り除いた。その際、フィルタが目詰まりしないように、５０μｌずつ流した。フィルタ濾過をした可溶化溶液の紫外・可視吸収を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）で測定した。可溶化溶液は、２８０ｎｍを極大とする紫外・可視吸収スペクトルを示し、顕著な散乱は見られなかったことから、フィブロインが完全に溶解していることが確認された（図３のスペクトル１）。
　当該可溶化溶液に、尿素を含まないトリス緩衝液を２００μｌ加え、１８００ｒｐｍ、５分間振とうし、２倍希釈を得た。同様に更に２００μｌ加え３倍希釈、４倍希釈、５倍希釈液を調製した。
　これら希釈液を、遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ３７４０、株式会社久保田製作所製）を用いて遠心（１４５００ｒｐｍ、３０分、２０℃）し、これら上清に対して、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）で紫外・可視吸収スペクトルを測定した。結果を図３に、スペクトル２～５として示す。調製した全ての溶液及び遠心分離後の沈殿についてタンパク質量を測定した。結果を図４に示す。尿素濃度の低下に伴い、沈殿したフィブロインの量は増加し、特に、１．５Ｍ尿素可溶化溶液（４倍希釈液）以下の条件では、比較的多くの沈殿物の増加が確認された。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するフィブロインでは２～３倍に希釈した可溶化溶液、即ち２～３Ｍ尿素濃度で維持することが長さの揃ったフィブリルの調製には適していることを以下の構造解析により確認した。２～３倍に希釈した可溶化溶液の沈殿中のタンパク質含量は全蛋白含量の７～９％であった（図４参照）。
［ＣＤスペクトルによる二次構造評価］
　６Ｍ　尿素可溶化溶液（尿素可溶化原液）及び顕著な沈殿物が生じていない３Ｍ　尿素可溶化（２倍希釈液）中におけるフィブロインの二次構造を、ＪＡＳＣＯ　Ｊ－７２５（日本分光株式会社製）を用いて、ＣＤ測定により評価した。
　ＣＤの測定は以下の条件で行った。
　　測定範囲：２５０～１９５ｎｍ、感度：ｓｔａｎｄａｒｄ
　　走査速度：２０ｎｍ／分、レスポンス：４秒
　　積算回数：４バンド幅：１．０ｎｍ
　　測定濃度：０．２ｍｇ／ｍｌ
　結果を図５に示す。タンパク質が完全なランダムコイル構造をとると、２２０ｎｍ付近の平均残基モル楕円率（θ）は０に近い値を示すことが知られていることから、尿素可溶化原液及び２倍希釈液においてフィブロインは何らかの２次構造を形成していることが確認された。特に、２倍希釈液ではこの領域にさらに大きなＣＤシグナルが観測された。
　図６に、図５の尿素可溶化原液（実線）と２倍希釈液の差ＣＤスペクトル（破線）を示す。図６に示したように、２２０ｎｍ付近に負の極大を示すＣＤスペクトルが得られたことから、２倍希釈液中のフィブロインはβシート構造を形成していると推定された。
［全反射減衰－フーリエ変換赤外分光法（ＡＴＲ－ＦＴＩＲ）による二次構造評価］
　２倍希釈液中のフィブロインがβシート構造を形成していると推定されたため、ＡＴＲ－ＦＴＩＲ測定により更なる解析を行った。
　ＡＴＲ－ＦＴＩＲ測定には、ＦＴＩＲ－６１００（日本分光）、ＡＴＲ　ＰＲＯ　ＯＮＥ（日本分光）を用いた。ＡＴＲの測定に用いたプリズムはダイヤモンドで、入射角は４５°とした。
以下の条件でＡＴＲ測定を行った。
　　積算回数：バックグラウンド－５１２、サンプル－１２８
　　分解：４　ｃｍ－１、干渉計速度：４ｍｍ／秒、検出器：ＭＣＴ
　　感度：×１、フィルタ：１０ｋＨｚ、測定範囲：７００－７８００ｃｍ－１
　　アパーチャー：１．８ｍｍ、アポタイゼーション：ｃｏｓｉｎｅ
　　インターバル測定：５分、インターバル：１００秒
　　サンプルマウント量：９μｌ
　サンプルをＡＴＲセル上に載せてから１５分後にインターバル測定を開始し、３回測定した。結果を図７に示す。尿素濃度の低下に伴い、アミドI領域（１７００～１６００ｃｍ－１：ペプチド結合内のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される赤外吸収）の吸光度の増大及び１４５２ｃｍ－１から１４５７ｃｍ－１への高波数側へのシフトが確認された（図７の破線）。このような変化に類似した変化として、アミロイド繊維などに見られる一方向にβシート構造が並んだ構造（クロスβシート構造、ポリアラニン結晶構造）が形成する際に観測されることが知られている。したがって、今回の尿素濃度の低下に伴う構造変化により、フィブロインがβシート構造が一方向に並んだ構造をとる可能性が示唆された。
［ＴｈＴ染色による蛍光強度測定］
　βシート構造に強く反応する蛍光色素チオフラビンＴ(ＴｈＴ)を用い、蛍光強度スペクトルによる解析を行った。蛍光光度計による測定には、ＪＡＳＣＯ　ＦＰ－８２００（日本分光株式会社）を、プレートリーダーによる測定には、ＳＹＮＥＲＧＹ　ＨＴＸ（バイオテック株式会社）を用いた。測定には、フィブロイン可溶化溶液に、ＴｈＴを０．１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したものを用いた。
　蛍光光度計による測定は、下記条件で行った。
　　測定範囲４４０～６００ｎｍ
　　励起波長４５０ｎｍ
　　測定濃度０．１ｍｇ／ｍｌ
　　スキャンスピード　Ｍｅｄｉｕｍ
　　測定回数　試料ごとに３回
　結果を図８に示す。尿素可溶化原液（実線）と比較し、２倍希釈液（一点鎖線、破線、二点鎖線）では蛍光強度が上昇した。蛍光強度の上昇は希釈直後（一点鎖線）から希釈一日後（破線）おいても見られたが、希釈８日後（二点鎖線）は希釈一日後（破線）と同程度の蛍光強度であり、増加は見られなかった。
　以上の結果より、一方向に並んだβシート構造は、尿素可溶化原液を２倍希釈することにより増加し、１日経過で更に増加していたことが確認された。
　２倍希釈液におけるこの一方向に並んだβシート構造の経時変化を、プレートリーダーによる測定で解析した。測定は下記条件で行った。
　　（ｋｉｎｅｔｉｃ）Ｒｕｎ：９６ｈ、インターバル１５分、振とう１５秒
　　Ｒｅａｄ１：（ｂｏｔｔｏｍ）４４０／３０、５００／２７
　　Ｒｅａｄ２：ＵＶ６００
　　プレート：４８ｆｌａｔ　ｂｏｔｔｏｍ　Ｎｕｃｌｏｎ
　　測定濃度１０ｍｇ／ｍｌ
　結果を図９に示す。蛍光強度は経時的に上昇しており、一成分の指数関数でフィッティングすると、時定数ｔａｕ＝７．９時間の反応を示すことがわかった。即ち、一方向に並んだβシート構造が時間経過とともに形成され、１日弱でプラトーに達した。
［走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）による解析］
　２倍希釈液と同じ濃度の尿素を含有する尿素緩衝液を添加して、２倍希釈液中のフィブロイン濃度１ｍｇ／ｍＬ及び２．５ｍｇ／ｍＬの希釈溶液について、フィブロインを０．０２ｍｇ／ｍＬになるように調製し、ＳＰＭで解析した。調製した試料をマイカ基盤にキャストし、ＳＰＭ（ＳＰＭ－９７００、島津製作所）でナノファイバーの形態を観察した。ＳＰＭによりフィブロインが、アミロイド線維や絹糸と同様に、フィブリルを形成していることが確認できた（図１０）。
　ＩｍａｇｅＪソフトを用い、画像解析を行い、長さと直径を計測した。その結果、形成されたナノファイバーの長さに関するヒストグラムを図１１に示す。このヒストグラムから、形成されたナノファイバーの長さは約５０ｎｍの整数倍であり、繰り返し数が異なるナノファイバーが形成していることがわかった。さらにフィブロイン濃度が異なる希釈液から得られたナノファイバーの長さのヒストグラムを比較すると（図１２）、フィブロイン濃度が大きい方が、繰り返し数が大きくなっていることが確認できた。ＳＰＭ－９７００付属のソフトウェアを用い、画像解析を行い、高さ（直径）を計測した結果、形成されたナノファイバーの高さは一様に約３ｎｍであった（図１３）。
　以上、生成されたナノファイバーは、長さ、及び直径が均一な円柱状構造を基本単位とすることが確認された。基本単位となるナノファイバーの長さや直径は使用するフィブロインの配列や分子量によって調整可能である。また、形成時のフィブロイン濃度や形成時間を調整することによって基本単位となるナノファイバーの繰り返し数が異なるナノファイバーを調整することが可能である。
　天然の綿、絹、羊毛等は高精度に制御されたナノ構造の集合体である。一方、本発明により高度に制御された構造をとるフィブロインを人工的に工業規模で製造することが期待される。また、本発明により製造されるフィブリルは、細胞シート、生体分子デバイス、フィルタ、紡糸、化粧品等への応用も期待される。

Claims (5)

  1. 　以下（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む、フィブリルの製造方法。
    （Ａ）式［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロインを、可溶化剤を用いて可溶化して、可溶化溶液を得る工程、
    （Ｂ）前記可溶化剤の濃度が前記フィブロインの凝集体が生じる濃度になるまで前記可溶化溶液を希釈し、その濃度を維持することで、フィブリルを含む懸濁液を生成する工程、及び
    （Ｃ）（Ｂ）工程において生成したフィブリルを回収する工程。
    ［式中、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が６５％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは２～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。］
  2. 　前記（Ｂ）工程で生じる凝集体中のフィブロイン量が、前記（Ａ）工程で用いたフィブロイン量の０．１～１０重量％である、請求項１記載の製造方法。
  3. 　前記（Ｃ）工程が、前記懸濁液を遠心分離し、上清を回収する工程である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　可溶化剤がカオトロピック剤である請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　カオトロピック剤が尿素、塩酸グアニジウム、ヨウ化ナトリウム及び過塩素酸塩からなる群より選ばれる、請求項４記載の製造方法。
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