WO2018143480A1 - 植物に物質を導入する方法 - Google Patents

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WO2018143480A1
WO2018143480A1 PCT/JP2018/004103 JP2018004103W WO2018143480A1 WO 2018143480 A1 WO2018143480 A1 WO 2018143480A1 JP 2018004103 W JP2018004103 W JP 2018004103W WO 2018143480 A1 WO2018143480 A1 WO 2018143480A1
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cells
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fertilized egg
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加藤　紀夫
雅子 市川
龍史 岡本
成美 古磯
隆敏 木羽
絵梨香 戸田
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日本たばこ産業株式会社
国立研究開発法人 理化学研究所
公立大学法人首都大学東京
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
    • A01H3/04—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria by treatment with chemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
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    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a substance into a plant.
  • Non-Patent Document 1 describes a method of producing a fertilized egg cell (in vitro fertilized egg) by electrofusion of corn egg cells and sperm cells and culturing them into a plant body.
  • Non-Patent Document 1 uses a mixture of plant tissue degrading enzymes with a high concentration for the separation of egg cells.
  • Non-Patent Document 2 describes a method of producing fertilized egg cells by electrofusion of male and female gametes of rice and culturing them into plants.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 three methods, electrical fusion (Non-Patent Documents 1 and 2), calcium ion fusion (Non-Patent Document 3), and polyethylene glycol fusion (Non-Patent Documents 4 and 5) have been reported.
  • electrical fusion Non-Patent Documents 1 and 2
  • calcium ion fusion Non-Patent Document 3
  • polyethylene glycol fusion Non-Patent Documents 4 and 5
  • These prior documents indicate that a plant can be derived from a fertilized egg cell artificially fused with a male and female gamete.
  • the point of gene transfer and transformation into fertilized egg cells is not described at all, and it has been completely unknown whether transformation can be performed using in vitro fertilized egg cells.
  • Non-patent document 6 After fertilization in seeds such as corn (Non-patent document 6), rice (Non-patent document 7), wheat (Non-patent document 8), barley (Non-patent documents 9 and 11), tobacco (Non-patent document 10), etc.
  • fertilized egg cells are extracted from bunches and ovules and cultured to produce plants.
  • Non-Patent Documents 6 and 11 relating to corn and barley describe that DNA was introduced into fertilized egg cells by the microinjection method.
  • the plant transformation method by the microinjection method for fertilized egg cells has been put into practical use has not been reported.
  • the microinjection method can introduce a gene into a cell having a cell wall, and it is not particularly necessary to remove the cell wall of a plant cell to be introduced by treatment with a plant tissue degrading enzyme or the like.
  • a plant tissue degrading enzyme or the like there is a drawback that only one cell can be handled by a single introduction operation, which is not suitable for medium to large-scale gene introduction experiments using a large number of plant cells.
  • Other methods for introducing genes into cells include the polyethylene glycol method (PEG method), the peptide method (Non-patent Document 12), the electroporation method, and the Agrobacterium method, in addition to the microinjection method.
  • the electroporation method, the peptide method, the PEG method, and particularly the PEG method are simpler than the microinjection method, and have an advantage that a large number of cells can be handled at one time.
  • plant cells have cell walls, tissues and cells are treated with plant tissue degrading enzymes such as cellulase, pectinase, protease, and hemicellulase, particularly when performing the PEG method or electroporation method. It is common to lyse cell walls and protoplast cells. For this reason, the above-described methods have so far been targeted on materials capable of obtaining protoplasts in large quantities such as leaves, cultured cells, and callus (Non-Patent Documents 13 and 14).
  • fertilized egg cells take time and effort to produce and isolate, and protoplasts cannot be obtained in large quantities.
  • the egg cells and sperm cells immediately before fertilization do not start differentiation unless they are subjected to fusion treatment such as electrical treatment or addition of calcium solution.
  • fusion treatment such as electrical treatment or addition of calcium solution.
  • fertilized egg cells obtained by such an in vitro fertilization system it is considered that some damage may have occurred in the cells by an artificial fertilization operation such as the aforementioned fusion treatment.
  • fertilized egg cells it was unclear how to remove the cell wall from the fertilized egg cell while maintaining cell activity so that cell division can continue and grow into a plant after cell wall removal. For these reasons, it is speculated that egg cells, sperm cells, and fertilized egg cells are not suitable for gene transfer, and there have been reports of cell transfer resulting from gene transfer using methods such as the PEG method. It wasn't.
  • the present invention aims to provide a method for introducing a substance into a plant and a plant into which a substance has been introduced by the method of the present invention.
  • Fertilized egg cells are inherently cells that have the ability to grow into plant bodies, and are therefore expected not to be affected by the culture efficiency caused by differences between species and varieties. If substances can be introduced into fertilized egg cells that are zygotes, or egg cells or sperm cells that are gametes, it is possible to carry out treatments such as transformation and genome editing on a wider variety of species and crops. Become. As a result of intensive studies, the present inventors have discovered a method capable of introducing a substance into a fertilized egg cell without performing a plant tissue degrading enzyme treatment. Furthermore, by combining the methods of culturing isolated fertilized egg cells, we found that substances can be introduced into fertilized egg cells without treatment with plant tissue degrading enzymes, induction of division, and transformation are possible. Invented the invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method of introducing a substance into a plant comprising introducing the substance into a plant germ cell in which cell wall formation is incomplete.
  • FIG. 1 is an optical micrograph of egg cells (upper) and sperm cells (lower) isolated from rice flowers.
  • FIG. 2 is a light micrograph of the process of fusion of the egg cell and sperm cell of FIG. 1 and the produced fertilized egg cell (in vitro fertilized egg cell).
  • FIG. 3 is a fluorescence micrograph of a rice fertilized egg cell that has started dividing after GFP nucleic acid introduction by the PEG method.
  • FIG. 3A shows the results of fluorescence observation (left) and bright field observation (right) 24 hours after gamete fusion.
  • FIG. 3B shows the results of fluorescence observation (left) and bright field observation (right) two days after gamete fusion.
  • FIG. 4 is a fluorescence and light micrograph of a cell mass derived from a rice fertilized egg cell into which GFP nucleic acid was introduced. Fluorescence observation (left) and bright field observation (right) were performed 18 days after the gamete fusion. Those in which fluorescence was continuously observed from the fertilized eggs (A) and those in which fluorescence was not detected were observed (B).
  • FIG. 5 is an optical micrograph of a shoot generated from a cell mass derived from a rice fertilized egg cell into which GFP nucleic acid was introduced.
  • FIG. 6 is a shoot-derived seedling body generated from the cell mass of FIG.
  • FIG. 7 is a view showing the amount of plasmid in a rice fertilized egg one day after the GFP plasmid introduction treatment.
  • FIG. 8 is a fluorescence micrograph (upper), an optical micrograph (lower), and a merge (middle) of a corn fertilized egg (in vitro) subjected to GFP nucleic acid introduction treatment and a cell mass derived from the fertilized egg cell.
  • FIG. 9 is a fluorescence micrograph (each upper row) and an optical micrograph (each lower row) of a cell mass derived from a fertilized egg derived from DsRed2 transformed rice and a DsRed2 transformed rice fertilized egg cell that has undergone genome editing nucleic acid introduction treatment.
  • a cell obtained by culturing a fertilized egg cell derived from a DsRed2 transformed rice produced by gamete fusion treatment (without introduction of a genome-edited nucleic acid) is A, and a genome-edited nucleic acid (plasmid) is added to a DsRed2 transformed rice fertilized egg cell produced by a gamete fusion treatment.
  • the cells cultured after DNA introduction are shown in B. It was shown that the fluorescence of DsRed2 was quenched in the DsRed2-transformed rice fertilized eggs subjected to the genome editing nucleic acid introduction treatment.
  • FIG 10 shows fluorescence micrographs (left and center) and optical micrographs (right) of rice eggs that have been subjected to two types of nucleic acid introduction treatments of GFP and DsRed2.
  • GFP fluorescence observation (left), RFP fluorescence observation (center), and bright field observation (right) were performed 24 hours after the nucleic acid introduction treatment.
  • the present invention relates to a method for introducing a substance into a plant.
  • the method of the present invention includes introducing a substance into a plant germ cell in which cell wall formation is incomplete.
  • the method comprises: (1-i) producing a fertilized egg cell by fusing a plant egg cell and a sperm cell; or (1-ii) isolating a fertilized egg cell from a tissue containing the fertilized egg cell of the plant.
  • obtaining fertilized egg cells (2) introducing a substance into the fertilized egg cell obtained, Including that.
  • the method comprises: (1) introducing a substance into one or both of a plant egg cell and a sperm cell; and (2) Fusing egg cells and sperm cells that have undergone step (1) to produce fertilized egg cells; Including that.
  • Plant The type of plant is not particularly limited. Either a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant may be used, and a monocotyledonous plant is preferable. More preferred are grasses, more preferred are corn, wheat, barley, rice, sorghum, rye and the like, and most preferred are corn, wheat and rice.
  • the method of the present invention is not limited, but can be used particularly for plants or varieties that are considered “difficult to culture”.
  • “Difficult culture” refers to difficult culture, specifically, for example, difficulty in culturing cells isolated from a plant, formation of callus due to treatment such as dedifferentiation, and reconversion from a callus to a plant. It means that differentiation is difficult.
  • Difficult to grow plants include, for example, soybeans, kidney beans, peppers, and the like.
  • Difficult to cultivate varieties mean cultivars that are difficult to cultivate compared to general research varieties of the same species (such as A188 for corn), for example, corn elite varieties derived from corn B73 and B73, Examples include wheat elite varieties (for example, AC Barrie and TAM), barley varieties other than GoldenPromise and Igri, sorghum 296B, C401, SA281, P890801, Pioneer 8505, and Tx430.
  • Plant Germ Cells The method of the present invention introduces substances into plant germ cells.
  • Germ cells are cells that play a role in transmitting genetic information to the next generation in reproduction, and are cells other than somatic cells among cells constituting multicellular organisms.
  • “germ cell” refers to an egg cell (also referred to as “egg” or “egg”), a sperm cell (also referred to as “sperm”), a gamete for sexual reproduction, and a gamete A zygote (also referred to as a “zygote”), which is a cell formed as a result of conjugation, includes a fertilized egg cell formed by fertilization in the case of plants.
  • Germ cells may be fertilized egg cells, egg cells, or sperm cells. Preferably it is a fertilized egg cell.
  • fertilized egg cells are preferably those produced and obtained by fusing them after isolating egg cells and sperm cells from the plant before pollination and fertilization.
  • the fertilized egg cell may be a fertilized egg cell isolated from a tissue containing a plant embryo sac, that is, a fertilized egg cell that has been pollinated and fertilized at the plant stage and isolated from the plant body.
  • the present invention is not limited to haploid sperm cells before fertilization, which are haploids for the purpose of introducing substances into plant cells for gene transfer / recombination transformation, genome editing, etc. It is more preferable to use fertilized egg cells that are polyploid and have a genome sequence determined than egg cells.
  • egg cell means a female gamete formed by meiosis of an embryo sac mother cell in a pistil.
  • the method for isolating the egg cell is not limited.
  • the ovary can be cut in a solution having an appropriate osmotic pressure, and the egg cell emerging from the cut surface can be isolated using a glass capillary under a microscope.
  • sperm cell means a male gamete formed by meiosis of a pollen mother cell in a stamen cage.
  • the method for isolating sperm cells is not limited. For example, when pollen collected from a cocoon is immersed in a solution having an appropriate osmotic pressure, pollen contents containing sperm cells are released from the pollen into the solution after a few minutes. Therefore, sperm cells can be isolated using a glass capillary under a microscope.
  • fertilizer means a cell in which a sperm cell and an egg cell are fused.
  • a germ cell of a plant is a sperm cell or egg cell isolated from a stamen or pistil, a fertilized egg cell fused with these isolated cells, or a fertilized egg cell isolated from a pistil Indicates.
  • a fertilized egg cell may be produced by fusing a plant egg cell and a sperm cell in vitro. That is, it is possible to first isolate egg cells and sperm cells from a plant body, and to produce fertilized egg cells in vitro by a known method such as electrofusion (also called gamete fusion).
  • the electrofusion method is a method in which two or more cells are fused in vitro by electrical stimulation.
  • fertilized egg cells can be produced by applying electric pulses to egg cells and sperm cells isolated in a solution having an appropriate osmotic pressure to induce cell fusion.
  • the lower limit of the DC voltage is preferably 10 kV or more, more preferably 11 kV or more, and 12 kV or more. Is more preferable.
  • the upper limit is preferably 17 kV or less, more preferably 16 kV or less, and even more preferably 15 kV or less.
  • the upper limit and the lower limit can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the lower limit of the distance between the electrodes is preferably 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, and more preferably 2.5 times or more the sum of the diameters of the egg cells and sperm cells to be fused. Is more preferable, and it is most preferable to make it 3 times or more.
  • the upper limit is preferably 6 times or less, more preferably 5 times or less, and further preferably 4 times or less. The upper limit and the lower limit can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a method for measuring the diameter of a cell there are a method of measuring a diameter using a microscopic eyepiece attached to a microscope, and a method of capturing an image taken with a microscope into a computer and measuring it with image analysis software.
  • the distance between electrodes can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the lower limit is preferably 80 ⁇ m or more, more preferably 90 ⁇ m or more, and even more preferably 100 ⁇ m or more.
  • the upper limit is preferably 240 ⁇ m or less, more preferably 220 ⁇ m or less, and even more preferably 200 ⁇ m or less.
  • the upper limit and the lower limit can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the osmotic pressure of the solution used for producing one fused cell by electrofusion of sperm cells and egg cells can be appropriately selected according to the type of plant used.
  • the lower limit 380mosmol / kg H 2 O or more rice more preferably, to 390mosmol / kg H 2 O or more, and even more preferably to a 400mosmol / kg H 2 O or more.
  • the upper limit 470mosmol / kg H 2 O or less more preferably, to less 460mosmol / kg H 2 O, still more preferably to less 450mosmol / kg H 2 O.
  • the 500mosmol / kg H 2 O or the lower limit and even more preferably to a 530mosmol / kg H 2 O or more. Further, it is preferable that less 700mosmol / kg H 2 O limit, it is more preferably not more than 680mosmol / kg H 2 O.
  • the upper limit and the lower limit can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • cell fusion methods such as calcium fusion method and PEG fusion method may be used for cell fusion of egg cells and sperm cells.
  • the “calcium fusion method” utilizes the property of the cell membrane that cell membrane fusion is likely to occur depending on the calcium concentration.
  • the “PEG fusion method” utilizes the fact that cells are bound by treating cells with polyethylene glycol (PEG), and the cells are fused when PEG is removed.
  • PEG polyethylene glycol
  • a fertilized egg cell may be produced in a plant body by a natural fertilization method, and the created fertilized egg cell may be obtained from the plant body.
  • a method for obtaining a fertilized egg cell using a natural fertilization method is, for example, a method of isolating a fertilized egg cell from a tissue including an embryo sac after exposing a stigma and attaching pollen to pollinate.
  • the ovary immediately after fertilization is taken out from the plant body after pollination, the ovary is cut in a solution with an appropriate osmotic pressure, and the fertilized egg cell that has emerged from the cut surface It can be isolated using a glass capillary or the like under a microscope.
  • the natural fertilization method may be artificial mating in which pollen is artificially attached to the stigma or natural mating.
  • the method for introducing a substance into the plant of the present invention includes “a step of introducing a substance into a plant germ cell in which cell wall formation is incomplete”.
  • a substance introduced into a plant refers to a substance having a size and properties that can be supplied into a target cell. It may be naturally occurring or artificially produced. Examples include various biomolecules and compounds. Examples of biomolecules include nucleic acids, proteins, peptides, polysaccharides, lipids, and organelles. In one embodiment, the substance is selected from the group consisting of nucleic acids, proteins and peptides.
  • the nucleic acid is not particularly limited, and may be RNA, DNA, a conjugate of both, or a mixture.
  • Preferred are circular DNA such as vectors, linear DNA, circular RNA or linear RNA.
  • the thing of arbitrary length according to the transformation method used can be used.
  • the length of the nucleic acid is preferably 100 kb or less, more preferably 50 kb or less. More preferably, it is 30 kb or less, Most preferably, it is 20 kb or less, Most preferably, it is 10 kb or less.
  • it may be a complex of nucleic acid and protein such as a chromosome.
  • Nucleases such as Cas9 nuclease for genome editing proteins such as modifying enzymes and antibodies can also be introduced.
  • the size of the protein is preferably, but not limited to, a molecular weight of 300 kDa or less, more preferably 200 kDa or less, and even more preferably 150 kDa or less.
  • Peptide is a general term for molecules in which various amino acids are linked in an order by amide bonds (also referred to as “peptide bonds”), and is generally shorter than proteins.
  • amide bonds also referred to as “peptide bonds”
  • 50a. a. It is as follows.
  • Polysaccharide is a general term for materials in which two or more monosaccharide molecules are polymerized by glycosidic bonds. For example, it exhibits different properties from monosaccharides as structural units such as starch.
  • starch amylopectin
  • glycogen cellulose
  • chitin agarose
  • carrageenan heparin
  • hyaluronic acid pectin
  • pectin xyloglican
  • glucomannan and the like are included.
  • Lipid is a general term for substances that are insoluble in water and isolated from living organisms. Defined by solubility, not specific chemical or structural properties. The biochemical definition is “a molecule that exists or is derived from a living organism having a long-chain fatty acid or hydrocarbon chain”.
  • Organelle is a general term for structures having a particularly differentiated form and function within a cell, and is sometimes called an organelle or organelle.
  • One embodiment includes a structure surrounded by a biological membrane such as a nucleus, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, endosome, lysosome, mitochondrion, chloroplast, and peroxisome.
  • a cytoskeleton, and a structure composed of a super complex of non-membrane proteins such as centriole, flagella and cilia are also included.
  • nucleolus, ribosome, etc. may be included.
  • nucleic acids and compounds other than biomolecules can also be included in the “substance”.
  • Two or more kinds of nucleic acids, proteins, peptides, polysaccharides, lipids, and the like, or metal ions and compounds may be introduced in combination.
  • the nucleic acid may be two or more types of DNA or RNA, or a combination of DNA and RNA.
  • Different species of substances such as nucleic acids and proteins may be introduced simultaneously or as a complex.
  • the carrier refers to a medium (carrier) for supplying a foreign substance into cells.
  • examples thereof include liposomes, particles (eg, gold, tungsten) and inorganic substances (eg, silicon compounds), whiskers, alginate beads, and viral substances (eg, coat proteins).
  • examples thereof include proteins such as fibronectin, peptides, chelate compounds (for example, EDTA), and inorganic microstructures (for example, nanostructured silica).
  • the method for introducing a substance into a plant is not particularly limited as long as it is a known method capable of introducing a desired substance into a plant, and can be appropriately selected according to the type of plant.
  • physicochemical methods such as polyethylene glycol method (PEG method), electroporation method, particle gun method, microinjection method, whisker method, or biological methods such as Agrobacterium method ( The indirect introduction method of DNA) can be preferably used.
  • the direct introduction method is preferable, and the PEG method or electroporation method is more preferable.
  • the PEG method is a method in which polyethylene glycol (PEG) is allowed to act on protoplasts to incorporate substances such as DNA into plant cells, but the mechanism of this substance incorporation is not yet well understood.
  • PEG polyethylene glycol
  • the PEG method can be performed according to a known protocol as described in Non-Patent Document 13, for example. Without limitation, the PEG concentration can be 10% to 30%.
  • the electroporation method is a method in which a minute hole is made in a cell membrane by applying an electric pulse to the cell suspension, and the DNA in the cell suspension is sent into the cell.
  • a minute hole is made in a cell membrane by applying an electric pulse to the cell suspension, and the DNA in the cell suspension is sent into the cell.
  • protoplasts obtained by decomposing and removing cell walls.
  • the introduction of the substance by the electroporation method can be performed according to a known protocol, and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the plant material to be used. For example, the following conditions can be mentioned.
  • the operation of applying an electric pulse to cells by the electroporation method is performed in an electrode container such as a cuvette electrode.
  • the electrodes are made of metal such as platinum, gold, and aluminum, for example, and the distance between the electrodes can be appropriately selected by those skilled in the art from, for example, about 0.5 mm, about 1 mm, about 2 mm, about 4 mm, and about 10 mm.
  • the lower limit per 1 mm between the electrodes is, for example, 5 V or more, 10 V or more, 20 V or more, 30 V or more, 40 V or more, 50 V or more
  • the upper limit of the voltage is, for example, 5000 V or less, 1000 V or less, 500 V or less, Those skilled in the art can appropriately select from 100 V or less.
  • the voltage may be a single pulse or a plurality of pulses. In the case of multiple times, for example, the voltage can be applied as a pulse such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 times.
  • the interval between each pulse is about 0.5 to about 500 msec, preferably about 5 to about 250 msec, more preferably about 10 to about 150 msec, and even more preferably about 40 to 120 msec. Further, after applying a plurality of pulses at these intervals, a pulse having the same level or a different voltage may be applied again after 1 sec to 10 sec, 2 sec to 8 sec, and 3 sec to 5 sec. Furthermore, when dividing
  • the lower limit of the time of each pulse may be selected from 0.01 msec or more, 0.1 msec or more, 1 msec or more, and the upper limit may be selected from 15 msec or less, 10 msec or less, 5 msec or less, or 3 msec or less. Good.
  • the solution used for the electroporation method may be one that has been used for the electroporation method conventionally performed for plants.
  • solutions containing inorganic salts such as KCl, NaCl, and CaCl 2 with PBS, HEPES, and MES as buffers, and organic salts such as potassium aspartate, calcium gluconate, and potassium glutamate were included.
  • a solution Moreover, the solution currently used when performing the electroporation method with respect to the cell and tissue of an animal can also be used.
  • Opti-MEM medium manufactured by Thermo Fisher Scientific. The osmotic pressure of the solution can be appropriately selected according to the type of plant used.
  • the lower limit 380mosmol / kg H 2 O or more rice more preferably, to 390mosmol / kg H 2 O or more, and even more preferably to a 400mosmol / kg H 2 O or more.
  • the upper limit 470mosmol / kg H 2 O or less more preferably, to less 460mosmol / kg H 2 O, still more preferably to less 450mosmol / kg H 2 O.
  • the 500mosmol / kg H 2 O or the lower limit and even more preferably to a 530mosmol / kg H 2 O or more.
  • less 700mosmol / kg H 2 O limit it is more preferably not more than 680mosmol / kg H 2 O.
  • the concentration of the substance to be introduced is not limited to this, but is 1 ng / ⁇ L to 2000 ng / ⁇ L, preferably 10 ng / ⁇ L to 1000 ng / ⁇ L, more preferably 20 ng / ⁇ L to 500 ng / ⁇ L.
  • PEG method and electroporation method two or more kinds of substances such as DNA are dissolved in a suspension, and PEG addition or electric pulse is applied in the presence of plant cells to introduce or co-transform multiple kinds of substances. It can be performed.
  • the introduction of the substance may be such that, for example, a nucleic acid is introduced into a cell, and the nucleic acid is incorporated into the genome and stably retained, such as gRNA and Cas9 protein during genome editing.
  • a nucleic acid is introduced into a cell, and the nucleic acid is incorporated into the genome and stably retained, such as gRNA and Cas9 protein during genome editing.
  • it may be a temporary introduction that is not constantly and stably maintained in the cell but is maintained only for a certain period of time.
  • Plant germ cells with incomplete cell wall formation In the method for introducing a substance into the plant of the present invention, a substance selected from the group consisting of nucleic acids, proteins and peptides is introduced into "plant germ cells with incomplete cell wall formation". To do.
  • the present invention requires the use of "plant germ cells with incomplete cell wall formation" so that the plant germ cells are not treated with plant tissue-degrading enzymes prior to the introduction of substances.
  • One of the characteristics is that there is no.
  • Plant tissue degrading enzyme is a general term for enzymes that degrade by acting directly or indirectly on pectin, cellulose, hemicellulose, other matrix polysaccharides, phospholipids, proteins, etc. around plant tissues and cells.
  • pectinase, cellulase, protease, hemicellulase and the like and mixtures thereof can be mentioned.
  • the treatment of plant cells with these plant tissue degrading enzymes may adversely affect cell viability and may be one of the causes of difficulty in plant tissue culture.
  • treatment with an isolated plant germ cell by a plant tissue degrading enzyme includes a treatment for treating a plant germ cell for the purpose of protoplasting for gene introduction, such as PEG method, It is desirable not to include a treatment (usually using an enzyme solution having a very low concentration) which is performed only for the purpose of isolating plant germ cells from tissues including embryo sac such as ovary.
  • a treatment usually using an enzyme solution having a very low concentration
  • Embodiments that simply use very low concentration enzyme solutions for the isolation of plant germ cells are included in the present invention.
  • a plant tissue-degrading enzyme is added to the ovule or pearl core, sperm cells are fused with the isolated egg cells, and fertilized egg cells are obtained.
  • the plant tissue-degrading enzyme is treated only for the purpose of introducing the substance into fertilized egg cells isolated by the poration method or for the purpose of isolating fertilized egg cells produced in the plant body by natural fertilization method from the ovule or pearl core.
  • the case where a substance is introduced into an isolated fertilized egg cell by the PEG method or the electroporation method after the fertilized egg cell is isolated is included in the present invention.
  • Cells with incomplete cell wall formation are not cells in which almost all cells other than protoplasmic communication are surrounded by cell walls, such as plant somatic cells, but part or all of the cells are surrounded by cell walls. Not a cell.
  • Plant germ cells with incomplete cell wall formation include gametes for sexual reproduction, including egg cells and sperm cells.
  • it includes a fertilized egg cell formed by fertilization, in which cell wall formation has not started, or cell wall formation has started but has not yet been completed, and is incomplete.
  • it is a fertilized egg cell in which cell wall formation is incomplete.
  • Calcoflor is a non-specific fluorescent dye that binds to cellulose and chitin contained in cell walls of plant cells, fungi and the like. Excitation is 300 to 440 nm (maximum 355 nm), and the maximum fluorescence of cellulose in 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 is 433 nm.
  • the fluorescence luminance can be measured using a confocal laser scanning microscope, and the integrated luminance can be obtained by performing image analysis of the fluorescence intensity.
  • Cell wall formation rate is not limited to, for example, the ratio of luminance when compared to the luminance of a cell in which cell wall formation of a plant cell is completely completed and the whole cell is covered with the cell wall. Can be expressed. “Incomplete cell wall formation” means, but not limited to, the cell wall formation rate is preferably 80% or less, more preferably 70% or less, even more preferably 65% or less, even more preferably 63% or less, It means particularly preferably 60% or less, particularly preferably 50% or less, and most preferably 30% or less.
  • fertilized egg cells can be used as plant germ cells.
  • An egg cell has a cell wall in a state different from that of a normal somatic cell before fertilization, and a complete cell wall is formed only when an egg cell and a sperm cell are fused.
  • the substance introduction operation is preferably performed immediately after fertilization and before the completion of cell wall formation.
  • Non-patent Documents 15 and 16 the formation of cell walls begins about 20 minutes after fertilization (Non-patent Documents 15 and 16), and since the formation is completed in about 2 hours, within 2 hours (120 minutes) It is preferable to introduce substances into.
  • a fertilized egg cell produced in a plant by natural fertilization is isolated from an ovule or the like, it is preferable to perform a substance introduction operation immediately after the isolation of the fertilized egg cell.
  • fertilized egg cells are produced in a plant by natural fertilization, unlike in the case of fusion of isolated egg cells and sperm cells, fertilization is actually performed in the plant after the pollen tube is attached to the stigma. It takes time for egg cells to form. Therefore, in this case, as a method for obtaining a fertilized egg cell immediately after fertilization, it is preferable to specify a time zone from pollination to fertilization and to extract the fertilized egg cell in the specified time zone after fertilization. For example, it is possible to estimate the time from pollination to fertilization by performing fluorescence observation using a staining solution such as aniline blue over time at the elongation rate of pollen tubes pollinated in advance. In view of the time from pollination to fertilization estimated as described above (time until formation of a fertilized egg), it is preferable to perform the substance introduction operation in a time period until the formation of the cell wall of the fertilized egg cell is completed.
  • the time until cell wall formation of fertilized egg cells is completed varies depending on the plant variety.
  • a substance is introduced into “cells in which cell wall formation is incomplete”, that is, cells before completion of cell wall formation of fertilized egg cells.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the time from fertilized egg cell acquisition to completion of substance introduction according to the type of plant variety.
  • rice and corn after obtaining a fertilized egg cell by fusion treatment of an isolated egg cell and sperm cell, without limitation, within 180 minutes, preferably within 150 minutes, more preferably within 120 minutes, and even more preferably 60 minutes. It is preferable to introduce the substance within 5 minutes, more preferably within 20 minutes. Particularly in corn, it is within 120 minutes, preferably within 60 minutes, more preferably within 20 minutes after obtaining fertilized egg cells.
  • the substance introduction is performed within 120 minutes, more preferably within 60 minutes.
  • a fertilized egg cell may be produced by introducing a substance into one or both of the egg cell and the sperm cell before joining the egg cell and the sperm cell, and then fusing the egg cell and the sperm cell.
  • the substance is introduced into the egg cell.
  • the fertilized egg cell into which the substance has been introduced is further called or embryo-like. It may comprise soaking (also referred to as embryonic cell mass); and re-differentiating the callus- or embryoid-like tissue with a regeneration medium.
  • the callus or embryoid body formation step and the redifferentiation step are not particularly limited, and a known method for regenerating a plant body from a fertilized egg cell can be used.
  • the substance-introduced fertilized egg cell is cultured to form an embryoid body or a callus.
  • the process of inducing fertilized egg cells to divide and proliferate to form callus or embryoid bodies is not particularly limited because the optimum conditions differ depending on the plant, but the nurse culture method with the addition of Feeder cells is preferred. For example, it can be performed as follows. Pretreatment: Substance-introduced fertilized egg cells are washed in mannitol droplets (450 mosmol / kg H 2 O) and sterilized. Cultivation in liquid medium: The fertilized egg cells into which the substance has been introduced are transferred to the medium, left to stand overnight, and then gently cultured with shaking.
  • the shaking speed is preferably 30 to 50 rpm, more preferably 35 to 45 rpm.
  • the culture temperature is preferably 24 to 28 ° C, more preferably 25 to 27 ° C. Cultivation is preferably performed in the dark.
  • feeder cells to the medium and perform co-culture (nurse culture method). This culture period is preferably 4 to 14 days, and more preferably 5 to 10 days.
  • Medium Liquid MS medium (T. Murashige et al., Physiol. Plant., 15, 473 (1962)) and B5 medium (OL) supplemented with auxin such as 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and naphthalene acetic acid.
  • Gamborg et al Experimental Cell Research, 50, 151-158 (1968)
  • N6 medium Chou et al., Sci. Sinica, 18, 659-668 (1975) and the like.
  • auxins such as indole-3-acetic acid, 2,4-D and dicamba are added to the medium.
  • the auxin concentration is 0.1 to 3.0 mg / L, preferably 0.1 to 0.3 mg / L, and more preferably 0.15 to 0.25 mg / L.
  • Feeder cells Known feeder cells can be used. For example, rice floating cell culture (Line Oc, manufactured by Riken BioResource Center), maize nurse cells (Mol et al., 1993), non-morphogenic cell suspension (Kranz et al. 1991), etc. Is mentioned.
  • a spherical embryoid body having a diameter of about 50 to 200 ⁇ m is formed 4 to 14 days after the start of culture.
  • the regeneration process can also be performed according to a known regeneration process.
  • it can be performed as follows as an example.
  • Culture Spherical embryoid bodies are transferred to the medium without added feeder cells and further cultured for about 10 to 14 days. Thereafter, the cells are cultured in an arbitrary medium to which no auxin is added, for example, MS medium, to form plants.
  • the culture is preferably performed by irradiating light, the light, for example, preferably 50 ⁇ 180 ⁇ mol / m 2 ⁇ sec , more preferably 70 ⁇ 150 ⁇ mol / m 2 ⁇ sec .
  • Medium For example, MS medium, B5 medium, N6 medium, and a solid medium using agarose, agar, gellan gum, gellite and the like.
  • Substance-introduced plant The present invention further includes a substance-introduced plant obtained by the method of the present invention. Prior to the present invention, it was difficult or impossible to obtain a substance-introduced plant particularly for plants and varieties that were considered “difficult to culture”. According to the present invention, it is possible to efficiently obtain a substance-introduced plant for such plants and varieties by a simple method.
  • the substance-introduced plant obtained by the method of the present invention includes not only a plant into which nucleic acids such as plasmids and gene sequence fragments, proteins and peptides for genome editing etc. are introduced and retained in the plant, but also substances
  • transgenic plants obtained by introduction of genes plants whose genome has been edited by introduction of substances related to genome editing such as Cas9 and guide RNA, and their progenies, clones, and the like are included.
  • Example 1 Isolation of Rice Egg Cells and Sperm Cells
  • egg cells and sperm cells were isolated from rice flowers (FIG. 1).
  • Isolation of egg cells was performed as follows. Unflowered flowers obtained from rice spikes were disassembled to collect ovary, and the ovary was placed in a 3.5 cm plastic petri dish containing 3 mL of 6% mannitol solution (370 mosmol / kg H 2 O). . The ovary from which the stigma was removed was submerged in 3 mL of 6% mannitol solution (370 mosmol / kg H 2 O) in a new 3.5 cm plastic petri dish, and a laser blade (Feather Safety Razor Co., FA-10) was placed at the bottom of the petri dish. ) To cut the lower part of the ovary.
  • the egg cells emerging from the cut portion were confirmed by microscopic observation, and the egg cells were isolated with a microcapillary. Approximately 10 to 15 egg cells were obtained from 30 to 40 ovaries. The diameter of each egg cell was 40-50 ⁇ m. Isolated egg cells migrated into droplets on a cover glass using a microcapillary.
  • the droplet on a cover glass was created with the following method. 1) The cover glass (20 mm ⁇ 40 mm) is dipped in a 1,1,1-trichloroethane solution containing 2% dichloromethylsilane and dried; 2) Put 0.2-0.3 mL of mineral oil (Embryo Culture-tested Grade, Sigma Aldrich, 1001279270) on the center of the cover glass; and 3) Insert 1 to 2 ⁇ L of 6% mannitol solution (370 mosmol / kg H 2 O) into the mineral oil with a micropipette.
  • Sperm cells were isolated as follows. Unflowered flowers obtained from rice spikes were disassembled and buds were collected and placed in a 3.5 cm plastic petri dish containing 3 mL of 6% mannitol solution (370 mosmol / kg H 2 O). After the cocoon was submerged in the mannitol solution, pollen was dispersed in the mannitol solution by breaking down the cocoon with tweezers. After a few minutes, the pollen burst and the contents containing sperm cells were released into the mannitol solution. The diameter of each sperm cell was 8-10 ⁇ m. The sperm cells were transferred into droplets on a cover glass using a microcapillary.
  • Example 2 Production of Rice Fertilized Egg Cells by Gamete Fusion
  • fertilized egg cells of rice were produced in vitro by gamete fusion by electrofusion (FIG. 2).
  • the sperm cells and egg cells isolated by the method shown in Example 1 were moved one by one into the droplets on the cover glass. Thereafter, the cells were arranged on an electrode (Neppagene CUY5100-100Ti) under alternating current (1 MHz, 0.4 kV / cm, Neppagene ECFG21). A mannitol solution (520 mosmol / kg H 2 O) of a half amount to an equal amount of the droplet was added to the droplet with a microcapillary. After that, by applying a DC pulse (50 ⁇ s, 12-15 kV / cm, distance between electrodes 50-150 ⁇ m), the gametes were fused and fertilized egg cells were produced.
  • a DC pulse 50 ⁇ s, 12-15 kV / cm, distance between electrodes 50-150 ⁇ m
  • nucleic acid was introduced into the in vitro fertilized egg cells of rice produced in Example 2.
  • the fertilized egg cell produced in Example 2 was treated according to this example so that the introduction of the substance was completed at 120 minutes after the gamete fusion treatment.
  • the produced fertilized egg cell is transferred to a droplet (about 2 ⁇ L) of MMG solution (15 mM MgCl 2 , 4 mM MES (pH 5.7), 450 mosmol / kg H 2 O mannitol), and then introduced into MMG, 35S promoter: :
  • the plasmid was prepared as described in Non-Patent Document 17. Next, add droplets containing fertilized egg cells and PEG solution (12.5 mL mannitol solution (450 mosmol / kg H 2 O), add 7.5 g PEG4000, 2.5 mL 1M calcium chloride, and make 25 mg with distilled water. Preparation) droplets (about 2 ⁇ L) were mixed and stirred with a glass capillary 30 to 50 times.
  • Example 4 Rice Fertilized Egg Cell Culture
  • rice fertilized egg cells into which nucleic acid was introduced in Example 3 were cultured.
  • the medium for fertilized cells is a modified N6Z medium (Kumlehn J. et al. (1998) Plant 205: 327-333) with the following modifications: 2 g / L CHU (N6) basal salt mixture ( Sigma Aldrich), 0.025 mg / L Na 2 MoO 4 .2H 2 O, 0.025 mg / L CoCl 2 .6H 2 O, 0.025 mg / L CuSO 4 .5H 2 O, 0.01 mg / L Retinol 0.01 mg / L calciferol, 0.01 mg / L biotin, 1 mg / L thiamine ⁇ H 2 O, 1 mg / L nicotinic acid, 1 mg / L pyridoxine ⁇ HCl, 1 mg / L choline chloride, 1 mg / L Ca-pantothene Acid, 0.2 mg
  • the osmotic pressure was prepared by adjusting to 450 mosmol / kg H 2 O with glucose (pH 5.7).
  • the prepared medium for fertilized cells (0.2 mL) was placed in a 12 mm diameter Millicell CM insert (Millipore) and placed in a 3.5 cm plastic petri dish containing 2 mL of medium.
  • 40-60 ⁇ L of rice floating cell culture (Line Oc, manufactured by Riken BioResource Center) was added to the petri dish as feeder cells.
  • the fertilized egg cell into which nucleic acid was introduced was put into a fresh mannitol droplet (450 mosmol / kg H 2 O), and then transferred onto a membrane in a CM insert containing a medium for fertilized cells. .
  • Nucleic acid-introduced fertilized egg cells were allowed to stand at 26 ° C. in the dark for 1 day and then observed with a fluorescence microscope to confirm the expression status of the introduced nucleic acid and the cell division status with or without GFP fluorescence. The result is shown in FIG. 3A. Nucleic acid introduction was confirmed because GFP-induced luminescence was observed in the fertilized egg cells introduced with nucleic acid. Furthermore, when these fertilized egg cells were observed after shaking culture for 2 days, division into early embryos was confirmed, and furthermore, luminescence by GFP in the early embryo cells could be observed (FIG. 3B). Thus, it was confirmed that the nucleic acid introduced into the fertilized egg cell was retained even in the cell group of embryonic cell mass.
  • Example 5 Differentiation Induction by Culture of Rice Embryonic Cell Mass
  • differentiation induction by culturing the rice embryonic cell mass obtained in Example 4 was performed.
  • differentiation induction medium 1 modified MS medium; MS salt, MS vitamin, 100 mg / L myo-inositol, 2 g / L casamino acid, 30 g / L sucrose , 30 g / L sorbitol, 0.2 mg / L l-naphthalene acetic acid (NAA), 1 mg / L kinetin and 0.3% Gelrite. Culturing was performed at 30 ° C. with continuous light irradiation. 10 days after transplantation, shoots differentiated (FIG. 5).
  • the embryonic cell mass obtained by differentiating shoots was transferred to differentiation induction medium 2 (modified MS medium; MS salt, MS vitamin, 100 mg / L myo-inositol, 30 g / L sucrose and 0.3% Gelrite). Culturing was performed at 30 ° C. with continuous light irradiation. Seedlings were obtained 7 days after transplantation (FIG. 6). In addition, the said young plant body was re-differentiated according to the description of the nonpatent literature 18.
  • differentiation induction medium 2 modified MS medium; MS salt, MS vitamin, 100 mg / L myo-inositol, 30 g / L sucrose and 0.3% Gelrite.
  • Example 6 Relationship between time after fusion and substance introduction efficiency
  • the stage of a fertilized egg in which substance introduction was possible by the PEG method without enzyme treatment was examined.
  • the stage of the fertilized egg was determined using the elapsed time after electrofusion as an index.
  • the fertilized egg cell in which the introduction of the nucleic acid was confirmed was then cultured under the conditions of Example 4 to confirm division into an early embryo. The results are shown in Table 1. From the results, no difference was observed in the introduction efficiency between substance introduction at 5-20 minutes and 120 minutes after gamete fusion.
  • the substance introduction should be by the PEG method, not by the effect of electrofusion at the time of fertilized egg cell preparation. Is understood. After 240 minutes, the introduction of the nucleic acid was confirmed with low efficiency, but the fertilized egg was not split.
  • Example 7 Measurement of degree of cell wall formation
  • the degree of cell wall formation of fertilized egg cells of rice was measured.
  • Example 2 As described in Example 2, a fertilized egg cell at 2 hours after electrofusion and a fertilized egg cell 20 hours after electrical induction, which is presumed to be in a stage where the cell wall is sufficiently developed, are stained with 0.005% calcoflor.
  • the fluorescence brightness was measured using a confocal laser scanning microscope.
  • the fluorescence luminance due to calcoflor detected from the cell wall 2 hours after fertilization is about 63% compared to the fertilized egg cells after 20 hours.
  • Example 8 Estimation of Relative Plasmid Amount in Nucleic Acid Introduced Rice Fertilized Egg Cell
  • a plasmid nucleic acid was introduced into a rice fertilized egg cell, and the relative plasmid amount in the cell was estimated.
  • Example 1-3 rice fertilized egg cells were produced by electrofusion of gametes, and nucleic acid was introduced by PEG method.
  • a plasmid containing 35S promoter :: signal sequence :: GFP :: endoplasmic reticulum residual signal (HDEL) :: nostarminator (plasmid DNA for GFP expression, about 6,000 bp) 10 minutes-1 hour after electrofusion treatment )
  • HDEL endoplasmic reticulum residual signal
  • nostarminator plasmid DNA for GFP expression, about 6,000 bp
  • each fertilized egg cell was transferred into 10 ⁇ L of a quantitative PCR solution one by one using a microcapillary.
  • LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche Applied Science) is used as a quantitative PCR solution, and a primer is a specific primer (5′-TCTAGATAGGTGGAGCAGAGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATGGATG 3 ′) was used.
  • the PCR reaction cycle was performed at 94 ° C.
  • Example 9 Isolation of Corn Egg Cells and Sperm Cells
  • corn egg cells and sperm cells were isolated. Isolation of egg and sperm cells is described in Kranz E. et al. and Loerz H. et al. (Nonpatent literature 1) was performed as follows with reference.
  • the ears of corn (variety: A188) grown in a greenhouse and pouched before flowering were tested at a suitable time for mating.
  • the rosacea slice containing the embryo sac was excised and added to a 1.5 mL enzyme solution in a 3.5 cm plastic petri dish and allowed to stand at room temperature.
  • As the enzyme solution 0.33% cellulase (manufactured by Worthington), 0.1% macerozyme R10 (manufactured by Yakult Honsha), 0.017% pectriase Y23 (manufactured by Shengshin Pharmaceutical Co., Ltd.), 10% mannitol solution (650 mosmol / kg H used was added to the 2 O).
  • egg cells were isolated using two glass needles.
  • the ovum slice was fixed with one glass needle so as not to move, and the egg cell was isolated by scraping the tissue in the region where the egg cell was presumed to exist with the other glass needle.
  • the estimation of the area where the egg cell is located was performed based on the position of the embryo sac observed in the cervical slice.
  • the isolated egg cells migrated into mannitol droplets on the cover glass using a glass capillary.
  • the mannitol droplet on the cover glass was prepared according to Example 1, and the operation was performed so that the enzyme solution from which the egg cell was isolated was not mixed in the mannitol droplet as much as possible.
  • Sperm cells were isolated as follows. Pollen was collected from a corn (variety: B73) ear in a 3.5 cm plastic petri dish, and 3 mL of 10% mannitol solution (650 mosmol / kg H 2 O) was added thereto. After about 3-5 minutes, pollen burst into the mannitol solution, and the pollen content containing sperm cells was released into the mannitol solution. The diameter of each sperm cell was 10 ⁇ m. The sperm cells were transferred into mannitol droplets on a cover glass using a glass capillary.
  • Example 10 Production of a corn fertilized egg by gamete fusion
  • a corn fertilized egg cell was produced in vitro by gamete fusion by electrofusion.
  • the sperm cells and egg cells isolated by the method shown in Examples 8 and 9 were moved one by one into the droplets on the cover glass. Thereafter, the cells were arranged on an electrode (Neppagene CUY5100-100Ti) under alternating current (1 MHz, 0.4 kV / cm, Neppagene ECFG21). Thereafter, by applying a DC pulse (50 ⁇ s, 12-15 kV / cm, distance between electrodes 50-100 ⁇ m), the male and female gametes were fused to produce fertilized egg cells.
  • a DC pulse 50 ⁇ s, 12-15 kV / cm, distance between electrodes 50-100 ⁇ m
  • nucleic acid was introduced into the in vitro fertilized egg cell of corn produced in Example 10.
  • the fertilized egg cells produced in Example 10 were processed according to this example so that the introduction of the substance was completed 30-90 minutes after the gamete fusion process.
  • the produced fertilized egg cell is transferred to a droplet (about 2 ⁇ L) of an MMG solution (15 mM MgCl 2 , 4 mM MES (pH 5.7), 650 mosmol / kg H 2 O mannitol), and then further introduced into MMG.
  • 35S promoter :: signal sequence :: GFP :: endoplasmic reticulum residual signal (HDEL) :: plasmid containing nosterinator (plasmid DNA for GFP expression, about 6,000 bp) was added to 160 ng / ⁇ L.
  • the plasmid was prepared as described in Non-Patent Document 17. Next, 7.5 g of PEG 4000 and 2.5 mL of 1 M calcium chloride are added to the PEG solution (12.5 mL mannitol solution (650 mosmol / kg H 2 O)) containing the fertilized egg cells and the PEG solution. Droplets (about 2 ⁇ L adjusted to 25 mg) were mixed and stirred 30-50 times with a glass capillary.
  • the fertilized egg cell subjected to the nucleic acid introduction treatment is introduced into a fresh 10% mannitol droplet (650 mosmol / kg H 2 O) using a washed and sterilized microcapillary, and then a CM insert containing a medium for fertilized cells. Transferred onto the inner membrane.
  • Nucleic acid-introduced fertilized egg cells were allowed to stand at 26 ° C. for 1 day in the dark, and then continued with shaking culture. The cultured cells were observed with an inverted fluorescence microscope, and the expression status of the introduced nucleic acid and the cell division status were confirmed by the presence or absence of GFP fluorescence. In the fertilized egg cells subjected to the nucleic acid introduction treatment, luminescence by GFP was surely observed, so that nucleic acid introduction could be confirmed. Further, when these nucleic acid-introduced fertilized egg cells were cultured after shaking for 6 days, division into early embryos was confirmed, and furthermore, luminescence by GFP in the early embryo cells could be observed (FIG. 8). Thus, it was confirmed that the nucleic acid introduced into the fertilized egg cell was stably retained even in the cell group of the maize embryonic cell mass.
  • the medium for fertilized cells was prepared as follows: NH 4 NO 3 in the MS medium was modified to 165 mg / L, and the organic composition was as follows. 1 mg / L nicotinic acid, 10 mg / L thiamine ⁇ HCl, 1 mg / L pyridoxine ⁇ HCl, 0.025 mg / L, 750 mg / L glutamine, 150 mg / L proline, 100 mg / L asparagine, 100 mg / L myo-inositol. 2 mg / L 2,4-D was added to them, and the osmotic pressure was adjusted to 650 mosmol / kg H 2 O with glucose (pH 5.7).
  • the prepared medium for fertilized cells was placed in a Millicell CM insert (manufactured by Millipore) having a diameter of 12 mm and placed in a 3.5 cm plastic petri dish containing 2 mL of the medium. Furthermore, 40-60 ⁇ L of rice floating cell culture (Line Oc, manufactured by Riken BioResource Center) was added as a feeder cell to the petri dish to obtain a medium for fertilized cells.
  • Example 12 Measurement of cell wall formation degree of rice fertilized egg cells obtained by natural fertilization method
  • cell wall formation degree of fertilized egg cells obtained by natural fertilization method artificial mating
  • the fertilized egg cells stained with calcoflor for 10 minutes were photographed by installing a filter CFW-LP01-Clinical on a Zeiss microscope AxioObserver A1.
  • the shooting conditions were an exposure time of 25 msec and a white balance of 3200K.
  • the calcoflor fluorescence brightness per cell was measured using image analysis software ZEN2.
  • the results are shown in Table 2. Fertilized egg cells after 3 hours of mating had a cell wall formation rate of 38%, 52 hours after 5 hours, and 84% after 8.5 hours.
  • Example 13 Introduction of Nucleic Acid by Electroporation Method into Rice Fertilized Egg Cells Obtained by Natural Fertilization
  • GFP nucleic acid was introduced into rice fertilized egg cells obtained by artificial mating using electroporation.
  • Example 12 rice was artificially crossed and fertilized egg cells were isolated.
  • a linear chain consisting of a base sequence encoding a maize ubiquitin promoter :: maize ubiquitin intron :: GFP :: nostarminator so that the time until the introduction of the DNA fragment is 4 hours after mating in the isolated fertilized egg cell
  • the DNA fragment was introduced.
  • An Opti-MEM medium containing the DNA fragment at a concentration of 100 ng / ⁇ L and adjusted to an osmotic pressure of 450 mOsmol / kg H 2 O using mannitol was mixed with fertilized egg cells.
  • Electroporation was performed using NEPA21 manufactured by Nepagene. The electroporation was performed using an electrode with a width of 1 mm, and a voltage of 30 V was processed four times with a pulse width of 2.0 msec and a pulse interval of 50 msec.
  • Fertilized egg cells subjected to nucleic acid introduction treatment by electroporation were cultured according to the method described in Example 4. About the callus formed from the embryonic cell mass, introduction
  • DNA fragments were surely introduced into fertilized egg cells introduced with nucleic acid by electroporation.
  • callus derived from a fertilized egg in which introduction of this DNA fragment was confirmed was cultured according to the method described in Example 5 and differentiation induction was performed, redifferentiated individuals could be obtained.
  • nucleic acids and proteins were introduced into rice fertilized eggs. Specifically, genome editing experiments were performed using fertilized egg cells obtained by fusing egg cells derived from rice into which nucleic acid encoding DsRed2 (Clontech) was introduced and sperm cells derived from wild-type rice.
  • egg cells were isolated from the produced DsRed2 transformed rice and sperm cells were isolated from wild type rice (variety: Yukihikari), and fertilized egg cells were obtained by electrofusion. Plasmid DNA or Cas9 protein complex was introduced into the fertilized egg cells obtained according to Example 3.
  • the plasmid DNA and Cas9 protein complex to be introduced were prepared as follows.
  • tRNA1-tRNA-gRNA2 was amplified using the primer set shown in Table 3 to prepare a tRNA-gRNA unit.
  • the rice U6 snRNA promoter By introducing the prepared tRNA-gRNA unit into the BsaI site of the multiplex CRISPR / Cas9 vector using the golden gate cloning method, the rice U6 snRNA promoter :: tRNA-gRNA unit containing an All-in-one CRISPR / Cas9 vector plasmid Created.
  • Cas9 protein complex to be introduced: SgRNA was synthesize
  • the obtained Cas9 protein complex or the aforementioned plasmid DNA adjusted to 80-320 ng / ⁇ L was added to 10 ⁇ L of MMG on a cover glass, respectively, and introduced into rice fertilized egg cells according to Example 3.
  • the plasmid DNA-introduced fertilized egg or Cas9 protein complex-introduced fertilized egg cell thus obtained was cultured according to Example 4, and the fluorescence of DsRed2 was observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 9 shows a fluorescent microscope and a light microscope photograph of the plasmid DNA-introduced fertilized egg. From the results, it was confirmed that the fluorescence of DsRed2 was quenched in accordance with the culture in both the plasmid DNA and the fertilized egg introduced with the Cas9 protein complex.
  • the obtained plasmid DNA-introduced fertilized egg cells were induced to differentiate according to Example 5 to obtain redifferentiated individuals.
  • DNA was extracted from the leaves of the obtained redifferentiated individuals, and the gene sequence encoding DsRed2 was confirmed using the PCR method and sequence analysis. As a result, it was confirmed that a part of the gene sequence encoding DsRed2 possessed by the redifferentiated individuals was included. Deletions and nucleic acid insertions were observed, indicating that the genome was edited.
  • Example 15 Simultaneous Introduction of Multiple Nucleic Acids into Rice Egg Cells
  • Rice egg cells were isolated according to Example 1.
  • the isolated egg cell is transferred to a droplet (about 2 ⁇ L) of the MMG solution, and then introduced into the MMG, 35S promoter :: signal sequence :: GFP :: endoplasmic reticulum residual signal (HDEL) :: contains nosterinator
  • 35S promoter signal sequence :: GFP :: endoplasmic reticulum residual signal (HDEL) :: contains nosterinator
  • the plasmid Non-patent Document 17
  • the ubiquitin promoter :: ubiquitin intron :: gene sequence encoding DsRed2 :: transferred to a droplet to which a plasmid containing a nosterinator was added.
  • Example 3 the egg cell and the droplet containing the two kinds of plasmids and the droplet of the PEG solution (about 2 ⁇ L) were mixed and stirred with a glass capillary 30 to 50 times, whereby the nucleic acid by the PEG method for the egg cell was obtained.
  • the introduction process was performed.
  • the egg cells subjected to the nucleic acid introduction treatment were observed with a fluorescence microscope 12-16 hours after the introduction treatment, and the expression status of the introduced nucleic acid was confirmed by the presence or absence of fluorescence of GFP and DsRed2.
  • the result is shown in FIG. Since both GFP (FIG. 10: left) and DsRed2 (FIG. 10: center) luminescence were observed in the same egg cell, two kinds of nucleic acids can be simultaneously introduced into the egg cell by the method of the present invention. It was confirmed that there was.
  • the present invention it is possible to introduce, transform, and culture a substance without performing plant tissue degrading enzyme treatment on cells.
  • the transformant or genome-edited individual can be easily and stably reproducibly. Can be obtained.

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Abstract

本発明は、植物に物質を導入する方法に関する。 本発明の方法は、細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞に対し、物質を導入することを含む。

Description

植物に物質を導入する方法
　本発明は植物に物質を導入する方法に関する。
　植物、特に単子葉植物への遺伝子組換え技術は、１９９０年代にアグロバクテリウムを利用した方法がイネ、トウモロコシで開発されたことを契機に急速に利用が普及した。現在までに様々な形質転換方法が開発されてきている。しかしながら、それらの多くは、植物組織の脱分化と再分化を経由することが必要であるが故に、種や品種間で形質転換の効率が大きく異なることが知られている。種や品種によっては形質転換の効率が低く、再現性をもって形質転換植物を得ることができない。例えば、トウモロコシにおいて育種上非常に重要な系統であるＢ７３では、効率よく形質転換植物が得られる一般的な形質転換法はいまだ開発されていない。
　また、近年効率的にゲノム編集を行うことが可能になりつつあるが、これも作物種、品種ごとに組織培養の容易性が異なる点が、ゲノム編集効率に大きな影響を与えるため、実用化の妨げとなっている。
　一方、１９９０年代に、植物体から精細胞と卵細胞を単離し、それらを人工的に融合させる人工受精（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ受精）が試みられ、植物体の作出に成功している。非特許文献１には、トウモロコシの卵細胞及び精細胞を電気融合して受精卵細胞（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ受精卵）を作出し、それを植物体にまで培養する方法が記載されている。非特許文献１では卵細胞の分離に高濃度の植物組織分解酵素の混合物を用いている。また、非特許文献２には、イネの雌雄配偶子の電気融合により、受精卵細胞を作出し、それを植物体にまで培養する方法が記載されている。植物の人工授精（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ受精系）は、受粉前の花からの配偶子細胞（卵細胞及び精細胞）の単離、単離した細胞の融合（受精）、融合細胞（受精卵）の培養の３つのステップからなる。成功例として代表的なものは、トウモロコシ（非特許文献１）及びイネ（非特許文献２）であり、コムギ、タバコでも数例の報告がある。一般的に、卵細胞は、受粉前の子房を切断すること、あるいは、セルラーゼやペクチナーゼ等の植物組織分解酵素で処理した子房又は胚珠を顕微鏡下で分解することで得られ、精細胞は適当な浸透圧溶液中で花粉をバーストさせることで得られる。次に、それら雌雄の配偶子をガラスキャピラリーで融合用ドロップに移す。配偶子細胞の融合法については、電気的融合（非特許文献１、２）、カルシウムイオンによる融合（非特許文献３）、ポリエチレングリコール融合（非特許文献４、５）の３種の方法が報告されている。しかしながら、受精卵細胞が胚へと成長して植物体にまで再生することが報告されているのは、電気的融合により作出した受精卵細胞についてのみである（非特許文献１、２）。これら先行文献には、人工的に雌雄配偶子を融合させた受精卵細胞から植物体の誘導が可能であることが示されている。しかしながら、受精卵細胞への遺伝子導入や形質転換といった点は全く記載されておらず、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ受精卵細胞を用いて形質転換が行えるかどうかは全く不明であった。
　トウモロコシ（非特許文献６）、イネ（非特許文献７）、コムギ（非特許文献８）、オオムギ（非特許文献９、１１）、タバコ（非特許文献１０）などの種において、受精後の子房や胚珠から受精卵細胞をとりだして培養し、植物体を作出した例も知られている。トウモロコシ、オオムギに関する非特許文献６、１１は、受精卵細胞にＤＮＡをマイクロインジェクション法により導入したことを記載している。しかしながら、受精卵細胞を対象としたマイクロインジェクション法による植物形質転換法が実用化された事実は報告されていない。また、そのほかの方法による遺伝子導入については全く知見がない。
　マイクロインジェクション法は細胞壁を有する細胞にも遺伝子導入が可能であり、導入対象の植物細胞の細胞壁を植物組織分解酵素処理等により除去する必要は特にない。しかし、一回の導入操作で一細胞しか扱えないという欠点があり、多数の植物細胞を用いた中~大規模な遺伝子導入実験には不向きである。また、顕微鏡下での複雑な操作を要し、熟練した技術を必要とするため、実用化は困難であった。他に細胞に遺伝子を導入する方法としては、マイクロインジェクション法以外にポリエチレングリコール法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ法）、ペプチド法（非特許文献１２）、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法などがある。エレクトロポレーション法、ペプチド法やＰＥＧ法、特にＰＥＧ法は、マイクロインジェクション法に比べ手法が簡便であり、一回に多数の細胞を扱える利点がある。しかしながら、植物の細胞は細胞壁を有していることから、特にＰＥＧ法やエレクトロポレーション法を行う際には、セルラーゼやペクチナーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼなどの植物組織分解酵素で組織及び細胞を処理、細胞壁を溶解し、細胞をプロトプラスト化するのが一般的である。このことから、これまで上記の方法では葉、培養細胞、カルスなどの大量にプロトプラストを得ることができる材料が対象となっている（非特許文献１３、１４）。
　一方、葉、培養細胞、カルスなどと異なり、受精卵細胞は、作出や単離に手間がかかり、大量にプロトプラストを得られない。また、受精直前の卵細胞や精細胞は電気処理やカルシウム溶液添加など融合処理をしなければ分化を開始しない。またそのようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ受精系で得られた受精卵細胞については、前記の融合処理のような人工的受精操作により細胞に何らかの損傷が発生している可能性が考えられている。さらに、受精卵細胞については、細胞壁除去後に細胞***を継続し植物体に成長できるような細胞活性を維持した状態で、細胞壁を受精卵細胞から除去する方法が不明であった。このような事情から、卵細胞、精細胞や受精卵細胞については遺伝子を導入する対象として相応しくないと推察されており、ＰＥＧ法等の方法により遺伝子導入を行い、細胞***にまで至らせた報告はなされていなかった。
特開２０１６−６３７８５（特許文献１）
Ｋｒａｎｚ　Ｅ．　ａｎｄ　Ｌｏｅｒｚ　Ｈ．，　（１９９３），　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　５：７３９−７４６． Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００７），Ｐｌａｎｔａ　２２６：５８１−５８９． Ｆａｕｒｅ，　Ｊ．Ｅ．　ｅｔ　ｅｌ．，　（１９９４），Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６３：１５９８−１６００． Ｓｕｎ，　Ｍ．Ｘ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９５），Ａｃｔａ　Ｂｏｔ　Ｓｉｎ　３６：４８９−４９３． Ｔｉａｎ，　Ｈ．Ｑ．　ａｎｄ　Ｒｕｓｓｅｌｌ，　Ｓ．Ｄ．　（１９９７），　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　１６：６５７−６６１． Ｌｅｄｕｃ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９６），　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１７７：　１９０−２０３． Ｚｈａｎｇ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，（１９９９），　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１９：１２８−１３２． Ｋｕｍｌｅｈｎ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９７），Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１６：　６６３−６６７． Ｈｏｌｍ，　Ｐ．Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４），　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　６：　５３１−５４３． Ｙｕｃｈｉ，　Ｈ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２００４），　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　４９：　８１０−８１４． Ｈｏｌｍ，　Ｐ．Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０００），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　９：　２１−３２． Ｌａｋｓｍａｎａｎ，　Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，　（２０１２），　Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　１４，１０−１６． Ｙｏｏ，　Ｓ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００７），　Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ　２：　１５６５−１５７２． Ｚｈａｉ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００９），　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１４９：　６４２−６５２． Ｋｒａｎｚ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９５），　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　８：　９−２３． Ｔｏｄａ，　Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１６），Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１７１：　２０６−２１４． Ｋｏｉｓｏ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　（２０１７），　Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｒｅｃｔ　１：ｅ０００１０ Ｈｉｅｉ，　Ｙ．　ａｎｄ　Ｋｏｍａｒｉ，　Ｔ．，（２００８）．Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　３：８２４−８３４．
　本発明は、植物に物質を導入する方法、本発明の方法によって物質が導入された植物を提供することを目的とする。
　受精卵細胞は本来、植物体へと成長する能力を保有した細胞であり、それゆえ、種、品種間差によって生じる培養効率の影響を受けないことが期待される。接合子である受精卵細胞、あるいは、配偶子である卵細胞又は精細胞を対象に物質の導入を行えれば、現状より幅広い種、作物に例えば形質転換、ゲノム編集などの処理を行うことが可能になる。本発明者らは鋭意検討の結果、植物組織分解酵素処理を行うことなく受精卵細胞に対し物質を導入可能である方法を発見した。さらに、単離した受精卵細胞を培養する方法を組み合わせることにより、植物組織分解酵素処理を行うことなく受精卵細胞に対し物質を導入し、***を誘導し、形質転換が可能であることを見出し、本発明を想到した。
　限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
　［態様１］
　細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞に物質を導入する、ことを含む、植物に物質を導入する方法。
　［態様２］
　物質の導入の前に、単離した植物生殖細胞に対し植物組織分解酵素による処理を行わない、態様１に記載の方法。
　［態様３］
　細胞壁形成率が６５％以下である、態様１又は２に記載の方法。
　［態様４］
　植物生殖細胞が、受精卵細胞である、態様１に記載の方法。
　［態様５］
　（１−ｉ）植物の卵細胞と精細胞とを融合して受精卵細胞を作出する、あるいは
　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離する、
ことにより、受精卵細胞を取得し、
　（２）得られた受精卵細胞に物質を導入する、
ことを含む、態様１−４のいずれか１項に記載の方法。
　［態様６］
　（１−ｉ）の卵細胞と精細胞との融合を電気融合により行う、態様５に記載の方法。
　［態様７］
　受精卵細胞の取得から、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、態様５又は６に記載の方法。
　［態様８］
　受精卵細胞の取得から、６０分以内に工程（２）の物質導入を行う、態様５又は６に記載の方法。
　［態様９］
　（１−ｉ）の卵細胞と精細胞との融合を自然受精法により行う、態様５に記載の方法。
　［態様１０］
　受精卵細胞の取得から、３６０分以内に工程（２）の物質導入を行う、態様５又は９に記載の方法。
　［態様１１］
　受精卵細胞の取得から、２４０分以内に工程（２）の物質導入を行う、態様５又は９に記載の方法。
　［態様１２］
　（１）植物の卵細胞及び精細胞のいずれか若しくは両方に物質を導入する、そして、
　（２）工程（１）を経た卵細胞と精細胞とを融合して受精卵細胞を作出する、
ことを含む、態様１−４のいずれか１項に記載の方法。
　［態様１３］
　（１）の卵細胞と精細胞との融合を電気融合または自然受精法により行う、態様１２に記載の方法。
　［態様１４］
　物質導入が、ＰＥＧ法又はエレクトロポレーション法を用いて行われる、態様１−１３のいずれか１項に記載の方法。
　［態様１５］
　植物が、単子葉植物である、態様１−１４のいずれか１項に記載の方法。
　［態様１６］
　植物が、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ及びソルガムからなる群から選択される、態様１５に記載の方法。
　［態様１７］
　態様１−１６のいずれか１項に記載の方法で得られた、物質導入植物。
　従来、電気融合処理等によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで作成した受精卵細胞では、ＰＥＧ法による形質転換は適さない、と思われていた。本発明では、「細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞」を利用することにより、細胞に対する植物組織分解酵素処理を行わずに、物質の導入、形質転換及び培養を行うことができる。本発明により、従来培養が困難等の理由で形質転換が困難であったため有用形質を付与することできなかった植物体であっても、安定して再現性良く形質転換体を得ることが可能となる。
図１は、イネ花から単離した卵細胞（上段）及び精細胞（下段）の光学顕微鏡写真である。 図２は、図１の卵細胞及び精細胞の融合の過程と、作出された受精卵細胞（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ受精卵細胞）の光学顕微鏡写真である。 図３は、ＰＥＧ法によるＧＦＰ核酸導入後、***を開始したイネ受精卵細胞の蛍光顕微鏡写真である。図３Ａは、配偶子融合の２４時間後に蛍光観察（左）及び明視野観察（右）を行ったものである。図３Ｂは、配偶子融合の２日後に蛍光観察（左）及び明視野観察（右）を行ったものである。 図４は、ＧＦＰ核酸導入を行ったイネ受精卵細胞由来の細胞塊の蛍光及び光学顕微鏡写真である。配偶子融合後、１８日後に蛍光観察（左）及び明視野観察（右）を行った。受精卵から蛍光が継続して観察されるのものと（Ａ）、蛍光が検出されなくなるものが観察された（Ｂ）。 図５は、ＧＦＰ核酸導入を行ったイネ受精卵細胞由来の細胞塊から発生したシュートの光学顕微鏡写真である。 図６は、図５の細胞塊から発生したシュート由来の幼植物体である。 図７は、ＧＦＰプラスミド導入処理１日後のイネ受精卵におけるプラスミド量を示した図である。核酸導入処理を行ったものをＰＥＧ処理＋として表し、蛍光顕微鏡による観察にてＧＦＰの蛍光が認められたものをＧＦＰシグナル＋として表した。 図８は、ＧＦＰ核酸導入処理を行ったトウモロコシ受精卵（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）及び当該受精卵細胞由来の細胞塊の蛍光顕微鏡写真（上段）、光学顕微鏡写真（下段）及びそのマージ（中段）である。 図９は、ＤｓＲｅｄ２形質転換イネ由来受精卵及びゲノム編集核酸導入処理を行ったＤｓＲｅｄ２形質転換イネ受精卵細胞由来の細胞塊の蛍光顕微鏡写真（各上段）及び光学顕微鏡写真（各下段）である。配偶子融合処理を行い作出したＤｓＲｅｄ２形質転換イネ由来受精卵細胞を培養した細胞（ゲノム編集核酸導入無し）をＡに、配偶子融合処理を行い作出したＤｓＲｅｄ２形質転換イネ受精卵細胞にゲノム編集核酸（プラスミドＤＮＡ）導入処理を行い、培養した細胞をＢに示す。ゲノム編集核酸導入処理を行ったＤｓＲｅｄ２形質転換イネ受精卵では、ＤｓＲｅｄ２の蛍光が消光したことが示された。 図１０は、ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ２の２種類の核酸導入処理を行ったイネ卵細胞の蛍光顕微鏡写真（左及び中央）及び光学顕微鏡写真（右）である。核酸導入処理の２４時間後にＧＦＰ蛍光観察（左）、ＲＦＰ蛍光観察（中央）および明視野観察（右）を行った。
　本発明は、植物に物質を導入する方法に関する。
　本発明の方法は、細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞に物質を導入する、ことを含む。
　一態様において、当該方法は、
　（１−ｉ）植物の卵細胞と精細胞とを融合して受精卵細胞を作出する、あるいは
　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離する、
ことにより、受精卵細胞を取得し、
　（２）得られた受精卵細胞に物質を導入する、
ことを含む。
　一態様において、当該方法は、
　（１）植物の卵細胞及び精細胞のいずれか若しくは両方に物質を導入する、そして、
　（２）工程（１）を経た卵細胞と精細胞とを融合して受精卵細胞を作出する、
ことを含む。
　植物
　植物の種類は特に限定されるものではない。双子葉植物及び単子葉植物のいずれでもよく、好ましくは単子葉植物である。さらに好ましくは、イネ科植物であり、より好ましくは、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、ライムギ等であり、最も好ましくは、トウモロコシ、コムギ、イネである。
　本発明の方法は、限定されるわけではないが、特に、「難培養」とされる植物あるいは品種に用いることが可能である。「難培養」とは、培養が困難、具体的には、例えば、植物体から単離された細胞の培養が困難、脱分化等の処理によるカルスの形成や、カルスからの植物体への再分化が困難である、ことを意味する。
　一般的に双子葉植物よりも単子葉植物の方が培養困難だが、「難培養」の植物は、例えば、大豆、インゲンマメ、トウガラシ等を含む。難培養品種とは、同じ種の一般的な研究用品種（トウモロコシならＡ１８８など）と比べ、培養が困難である品種を意味する、例えば、トウモロコシのＢ７３及びＢ７３を由来に持つトウモロコシのエリート品種、コムギのエリート品種（例えばＡＣ　ＢａｒｒｉｅやＴＡＭなど）、オオムギのＧｏｌｄｅｎＰｒｏｍｉｓｅとＩｇｒｉ以外の品種、ソルガムの２９６Ｂ、Ｃ４０１、ＳＡ２８１、Ｐ８９８０１２、Ｐｉｏｎｅｅｒ　８５０５、Ｔｘ４３０以外の品種などが挙げられる。
　植物生殖細胞
　本発明の方法は、植物の生殖細胞に物質を導入する。
　生殖細胞は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞で、多細胞生物を構成する細胞のうち、体細胞以外の細胞をいう。本明細書において、「生殖細胞」は、卵細胞（「卵」、「卵子」ともいう）、精細胞（「***」ともいう）を含む、有性生殖のための配偶子、並びに、配偶子の接合の結果によって出来た細胞である接合子（「接合体」ともいう）、植物の場合は、受精によって形成される受精卵細胞を含む。
　生殖細胞は、受精卵細胞、卵細胞、精細胞のいずれであってもよい。好ましくは受精卵細胞である。非限定的に、受精卵細胞は、あるいは、受粉・受精前の植物体から卵細胞及び精細胞を単離したのち、それらを融合させて作出及び取得したものが好ましい。あるいは、受精卵細胞は、植物の胚嚢を含む組織から単離される受精した卵細胞である、即ち、植物体の段階で受粉・受精させ、該植物体から単離した受精卵細胞、であってもよい。なお、非限定的に、本発明は遺伝子導入・組換えによる形質転換、ゲノム編集などのための植物細胞への物質導入、特に遺伝子導入を目的とするため、半数体である受精前の精細胞及び卵細胞より、倍数体でありゲノム配列が決定した受精卵細胞を用いるほうが好ましい。
　本明細書において「卵細胞」とは、雌ずいの中において、胚嚢母細胞の減数***により形成される雌性配偶子を意味する。卵細胞の単離方法は限定されないが、例えば、適切な浸透圧の溶液中において子房を切断し、その切断面から出てきた卵細胞を顕微鏡下においてガラスキャピラリーを用いて単離することができる。
　本明細書において「精細胞」とは、雄ずいの葯の中において、花粉母細胞の減数***により形成される雄性配偶子を意味する。精細胞の単離方法は限定されないが、例えば、適切な浸透圧の溶液に葯から採取した花粉を浸すと、数分後には、花粉から精細胞を含む花粉内容物が溶液中に放出されるので、顕微鏡下においてガラスキャピラリーを用いて精細胞を単離することができる。
　本明細書において「受精卵細胞」とは、精細胞と卵細胞とが融合した細胞を意味する。
　なお、本明細書において植物の生殖細胞は、雄ずい又は雌ずいから単離された精細胞又は卵細胞、それら単離された細胞を融合させた受精卵細胞、若しくは雌ずいから単離された受精卵細胞を示す。
　受精卵細胞の取得方法
　本発明の一態様において、植物の卵細胞と精細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで融合して受精卵細胞を作出してもよい。即ち、植物体より先ず卵細胞と精細胞を単離し、電気融合法等の公知の方法により、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで受精卵細胞を作出することが可能である（配偶子融合ともいう）。
　電気融合法は、電気刺激により２種又は２種以上の細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで融合する方法である。具体的には、本明細書においては、適切な浸透圧の溶液中において単離した卵細胞及び精細胞に、電気パルスを加えることで細胞融合を引き起こし、受精卵細胞を作出することができる。
　電気融合により細胞融合を行う場合、電圧、電極間距離等の条件は、植物の種類又は細胞の大きさ等に応じて当業者が適宜決めることができる。例えば、特開２０１６−６３７８５（特許文献１）に記載の条件を適用することができる。
　精細胞と卵細胞とを電気融合により１つの融合細胞（受精卵細胞）を作製する際、直流電圧は、下限を１０ｋＶ以上にすることが好ましく、１１ｋＶ以上にすることがより好ましく、１２ｋＶ以上にすることがさらに好ましい。また、上限を１７ｋＶ以下にすることが好ましく、１６ｋＶ以下にすることがより好ましく、１５ｋＶ以下にすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
　また、電極間距離は、下限を、融合させる卵細胞と精細胞の直径の和の１．５倍以上にすることが好ましく、２倍以上にすることがより好ましく、２．５倍以上にすることがさらに好ましく、３倍以上にすることが最も好ましい。また、上限を６倍以下にすることが好ましく、５倍以下にすることがより好ましく、４倍以下にすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。細胞の直径を測定する方法としては、顕微鏡に装着した測微接眼レンズを用いて直径を測定する方法や、顕微鏡で撮影した画像をコンピュータに取り込み、画像解析ソフトウェアで測定する方法がある。
　さらに、電極間距離は、当業者が適宜選択することができる。例えば、下限を８０μｍ以上とすることが好ましく、９０μｍ以上とすることがより好ましく、１００μｍ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を２４０μｍ以下とすることが好ましく、２２０μｍ以下とすることがより好ましく、２００μｍ以下とすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
　精細胞と卵細胞を電気融合して１つの融合細胞を作製する際に用いる溶液の浸透圧は、用いる植物の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、イネでは下限を３８０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることが好ましく、３９０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることがより好ましく、４００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を４７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることが好ましく、４６０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることがより好ましく、４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることがさらに好ましい。トウモロコシでは、下限を５００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることが好ましく、５３０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を７００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることが好ましく、６８０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることがさらに好ましい。上限と下限は、当業者がそれぞれ適宜選択することができる。
　あるいは、卵細胞と精細胞の細胞融合には、カルシウム融合法、ＰＥＧ融合法等の他の公知の細胞融合方法を用いてもよい。「カルシウム融合法」は、カルシウム濃度依存的に細胞膜の融合が生じやすくなる、という細胞膜の性質を利用するものである。「ＰＥＧ融合法」は、細胞をポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）で処理することによって細胞膜が結合し、ＰＥＧを取り除くと細胞が融合することを利用するものである。
　あるいは、自然受精法により植物体において受精卵細胞を作出し、作成された受精卵細胞を植物体から取得してもよい。自然受精法を用いた受精卵細胞の取得方法は、例えば、柱頭を露出させ、花粉を付着させ受粉させたのち、胚嚢を含む組織から受精卵細胞を単離する方法である。植物体からの受精卵細胞の単離は、受粉後の植物体から受精直後の子房を取り出し、適切な浸透圧の溶液中においてその子房を切断し、その切断面から出て来た受精卵細胞を顕微鏡下においてガラスキャピラリー等を用いて単離することができる。あるいは、酵素溶液で子房又は胚珠を一定時間処理した後に、例えば、ガラス針等を用いて顕微鏡下において珠心等の組織を解剖し摘出、単離することもできる。なお、本明細書において自然受精法とは、人工的に柱頭に花粉を付着させる人工交配であってもよいし、自然交配であってもよい。
　物質の導入
　本発明の植物に物質を導入する方法は、「細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞に物質を導入する、工程」を含む。
　本発明において、植物に導入される物質は、標的とする細胞内に供給可能なサイズ及び性状の物質をいう。天然に存在するものであってもよく、或いは人為的に製造されたものであってもよい。例としては種々の生体分子や、化合物が挙げられる。生体分子としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、多糖、脂質、細胞小器官などが挙げられる。一態様として、物質は、核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される。
　核酸は特に限定されず、ＲＮＡ、ＤＮＡ、両者の結合体、混合物であってもよい。好ましくはベクターのような環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、環状ＲＮＡ又は直鎖ＲＮＡである。使用される形質転換方法に応じた任意の長さのものを使用可能である。例えば、核酸の長さは、好ましくは１００ｋｂ以下、より好ましくは、５０ｋｂ以下である。さらに好ましくは３０ｋｂ以下、特に好ましくは２０ｋｂ以下、もっとも好ましくは１０ｋｂ以下である。また、染色体のような核酸及びタンパク質の複合体であってもよい。
　ゲノム編集のためのＣａｓ９ヌクレアーゼ等ヌクレアーゼや、修飾酵素、抗体等のタンパク質も導入しうる。タンパク質の大きさは、非限定的に、好ましくは分子量３００ｋＤａ以下、より好ましくは２００ｋＤａ以下、さらに好ましくは１５０ｋＤａ以下である。
　ペプチドは、決まった順番で様々なアミノ酸が、アミド結合（「ペプチド結合」ともいう）つながった分子の総称で、一般にタンパク質よりも長さが短い。好ましくは、１００ａ．ａ．以下、より好ましくは、５０ａ．ａ．以下である。
　「多糖」は、グリコシド結合によって単糖分子が２個以上重合した物資の総称である。例えば、でんぷんなどのように構成単位となる単糖とは異なる性質を示すようになる。例えば、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、グリコーゲン、セルロース、キチン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログリカン、グルコマンナンなどが含まれる。
　「脂質」は、生物から単離される水に溶けない物質の総称である。特定の化学的、構造的性質ではなく、溶解度によって、定義される。生化学的定義では、「長鎖脂肪酸あるいは炭化水素鎖を有する、生物体内存在するまたは生物由来の分子」である。（ｉ）アルコールと脂肪酸のみがエステル結合してできる、単純脂質（アシルグリセロール、セラミド等）、（ｉｉ）分子中にリン酸や糖を含む脂質で、一般にスフィンゴシン若しくはグリセリンが骨格となる、複合脂質（リン脂質、糖脂質、リポタンパク質等）、並びに、（ｉｉｉ）単純脂質や複合脂質から、加水分解によって誘導される疎水性化合物である、誘導脂質（脂肪酸、テンペノイド、ステロイド、カロテノイド等）、などが含まれる。
　「細胞小器官」は、細胞の内部で特に分化した形態や機能を有する構造の総称で、細胞内器官、オルガネラ、と呼ばれることもある。一態様として、核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム等の生体膜に囲まれた構造体が含まれる。さらに、細胞骨格や、中心小体、鞭毛、繊毛といった非膜系のタンパク質の超複合体からなる構造体も含まれる。さらにまた、核小体、リボソーム等も含まれうる。
　生体分子以外の金属イオンや化合物なども、「物質」に含まれうる。２種類以上の核酸、タンパク質、ペプチド、多糖及び脂質等や、金属イオンや化合物等の物質を組み合わせて導入してもよい。例えば、核酸は、２種類以上のＤＮＡ又はＲＮＡでも、ＤＮＡとＲＮＡの組み合わせでもよい。核酸とタンパク質など異なる種の物質を同時に、または複合体として導入してもよい。
　また、導入する物質の性状に応じて導入用の担体に担持または含有させて供給してもよい。ここで担体とは外来物質を細胞内に供給するための媒体（運搬体）をいう。例えば、リポソーム、金属（金、タングステン等）や無機物（例えばシリコン化合物）から成る粒子やウィスカー、アルギン酸ビーズ、ウイルス性物質（例えばコートタンパク質）が挙げられる。また、細胞への物質導入を促進する物質を同時に供給してもよい。例えば、フィブロネクチンなどのタンパク質、ペプチド、キレート化合物（例えばＥＤＴＡ）、無機微小構造物（例えばナノ構造シリカ）が挙げられる。
　物質を植物に導入する方法は、植物に所望の物質を導入することのできる公知の方法ならば特に限定されず、植物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法などの物理化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）あるいはアグロバクテリウム法などの生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）を好ましく用いることができる。好ましくは直接導入法、さらに好ましくはＰＥＧ法又はエレクトロポレーション法である。
　ＰＥＧ法とは、プロトプラストにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を作用させて、ＤＮＡ等物質を植物細胞内部に取り込ませる方法であるが、この物質取り込みの仕組みはまだ良く分かっていない。ＰＥＧ法については、例えば、非特許文献１３などに記載されているように、公知のプロトコールに従って実施することができる。非限定的にＰＥＧ濃度は、１０％~３０％とすることができる。
　エレクトロポレーション法は、細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、細胞懸濁液中のＤＮＡを細胞内部に送り込む方法である。なお、植物細胞を材料とする場合には、細胞壁を分解除去したプロトプラストを用いるのが一般的である。エレクトロポレーション法による物質の導入については、公知のプロトコールに従って実施することができ、使用する植物材料によって当業者が適宜選択することが可能であるが、例えば以下のような条件が挙げられる。
　エレクトロポレーション法による細胞への電気パルスを与える操作は、キュベット電極等の電極容器内で行われる。電極は、例えば白金、金、アルミニウム等の金属からなり、電極間距離は、例えば、約０．５ｍｍ、約１ｍｍ、約２ｍｍ、約４ｍｍ、約１０ｍｍから当業者が適宜選択することができる。
　電圧については、電極間距離１ｍｍ当たりの下限として、例えば、５Ｖ以上、１０Ｖ以上、２０Ｖ以上、３０Ｖ以上、４０Ｖ以上、５０Ｖ以上から、電圧の上限は、例えば、５０００Ｖ以下、１０００Ｖ以下、５００Ｖ以下、１００Ｖ以下から当業者が適宜選択することができる。電圧は、単回のパルスでも、複数回のパルスでもよい。複数回の場合は、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回等のパルスとして電圧をかけることができる。各パルス間の間隔は、約０．５ないし約５００ｍｓｅｃ、好ましくは約５ないし約２５０ｍｓｅｃ、より好ましくは約１０ないし約１５０ｍｓｅｃ、さらに好ましくは約４０ないし１２０ｍｓｅｃである。また、これらの間隔で複数回のパルスをかけた後、１ｓｅｃないし１０ｓｅｃ、２ｓｅｃないし８ｓｅｃ、３ｓｅｃないし５ｓｅｃ後に、再度同程度、または電圧の異なるパルスをかけてもよい。さらに、複数のパルスに分けてかける場合、各パルスの大きさは同じであっても、異なっていてもよい。なお、各パルスの時間の下限は、０．０１ｍｓｅｃ以上、０．１ｍｓｅｃ以上、１ｍｓｅｃ以上から選択してもよく、そしてその上限は、１５ｍｓｅｃ以下、１０ｍｓｅｃ以下、５ｍｓｅｃ以下、３ｍｓｅｃ以下から選択してもよい。
　エレクトロポレーション法に用いる溶液は、従来から植物を対象として行われていたエレクトロポレーション法に用いられていたものであってもよい。例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳを緩衝剤としたＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２などの無機塩が含まれた溶液や、アスパラギン酸カリウム塩、グルコン酸カルシウム塩、グルタミン酸カリウム塩などの有機塩が含まれた溶液が挙げられる。また、動物の細胞や組織に対してエレクトロポレーション法を行う際に用いられている溶液も使用できる。例えば、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地などである。溶液の浸透圧は、用いる植物の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、イネでは下限を３８０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることが好ましく、３９０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることがより好ましく、４００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を４７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることが好ましく、４６０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることがより好ましく、４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることがさらに好ましい。トウモロコシでは、下限を５００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることが好ましく、５３０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以上とすることがさらに好ましい。また、上限を７００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることが好ましく、６８０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ以下とすることがさらに好ましい。
　導入する物質の濃度はこれに限定されるわけではないが、１ｎｇ／μＬから２０００ｎｇ／μＬ、好ましくは１０ｎｇ／μＬから１０００ｎｇ／μＬ、より好ましくは２０ｎｇ／μＬから５００ｎｇ／μＬである。
　ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法では、２種類以上のＤＮＡ等物質を懸濁液中に溶解し、植物細胞存在下でＰＥＧ添加又は電気パルスをかけることにより、複数種類の物質の導入または共形質転換を行うことができる。
　なお、物質の導入については、例えば核酸を細胞に導入し、その核酸がゲノムに組み込まれ安定的に保持されるような導入であってもよく、ゲノム編集の際のｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質のように、細胞内にて恒常的、安定的に保持がされず、ある一時期においてのみ保持されるような、一時的な導入であってもよい。
　細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞
　本発明の植物に物質を導入する方法において、「細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞」に核酸、タンパク質及びペプチドからなる群から選択される物質を導入する。
　本発明は、「細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞」を利用することにより、物質の導入の前に、単離した植物生殖細胞に対し植物組織分解酵素による処理を行わない、行う必要がない、ということを特徴の１つとする。
　植物組織分解酵素とは、植物組織及び細胞周辺のペクチン、セルロース、ヘミセルロース、そのほかのマトリックス多糖、リン脂質、タンパク質等に直接あるいは間接的に作用して分解する酵素の総称である。例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ類等及びそれらの混合物が挙げられる。しかし、それら植物組織分解酵素による植物細胞の処理は、細胞の生存率に悪影響を与える場合があり、植物組織培養の困難性の原因の一つとなることがあった。本発明において、植物細胞に対する植物組織分解酵素処理を行わずに、培養、物質の導入及び形質転換を行うことが可能となったことにより、従来培養が困難等の理由で形質転換が困難であったため有用形質を付与することできなかった植物体であっても、安定して再現性良く形質転換体を得ることが可能である。
　なお、本明細書において、「単離した植物生殖細胞に対する植物組織分解酵素による処理」とは、植物生殖細胞をＰＥＧ法など遺伝子導入等のためのプロトプラスト化処理を目的に行う処理を含み、単に、子房など胚嚢を含む組織から植物生殖細胞を単離することのみを目的に行う処理（通常は、非常に低い濃度の酵素溶液を用いる）は含まないことが望ましい。単に、植物生殖細胞の単離のために非常に低い濃度の酵素溶液を用いるような態様は、本発明に含まれる。具体的には、卵細胞の単離のために、胚珠や珠心に植物組織分解酵素を添加する処理を行い、単離した卵細胞に精細胞を融合させ受精卵細胞を得たあと、ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法により物質を単離した受精卵細胞に導入するような場合や、自然受精法により植物体内において作出した受精卵細胞を胚珠や珠心から単離する目的のみのために植物組織分解酵素を処理し、受精卵細胞を単離したあと、ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法により物質を単離した受精卵細胞に導入するような場合については、本発明に含まれる。
　「細胞壁形成が不完全である細胞」とは、植物体細胞のように原形質連絡以外の細胞のほぼすべてが細胞壁で囲まれている細胞ではなく、細胞の一部あるいは全部が細胞壁に囲まれていない細胞である。細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞は、卵細胞、精細胞を含む、有性生殖のための配偶子を含む。あるいは、受精によって形成される受精卵細胞であって、細胞壁形成が開始していない、あるいは、細胞壁形成が開始しているがまだ完了しておらず、不完全である状態の受精卵細胞を含む。好ましくは、細胞壁形成が不完全である受精卵細胞である。
　植物生殖細胞の細胞壁形成は、例えば、カルコフロールによるセルロース染色、アニリンブルー染色等の公知の方法で確認することができる。カルコフロールは、植物細胞、真菌等の細胞壁に含まれるセルロースやキチンと結合する非特異的蛍光染料である。励起は３００~４４０ｎｍ（最大３５５ｎｍ）であり、０．１Ｍ　リン酸緩衝液　ｐＨ７．０中のセルロースの最大蛍光は、４３３ｎｍである。非限定的に、例えば、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて蛍光輝度を測定することができ、また蛍光強度の画像解析を行い、積算輝度を求めることができる。
　「細胞壁形成率」とは、非限定的に、例えば、植物細胞の細胞壁形成が完全に終了し、細胞全体が細胞壁で覆われている状態の細胞の輝度と比較した場合の、輝度の比率で表現することができる。「細胞壁形成が不完全である」とは、非限定的に、細胞壁形成率が、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは６５％以下、さらにより好ましくは６３％以下、特に好ましくは６０％以下、特にさらに好ましくは５０％以下、最も好ましくは３０％以下である、ことを意味する。
　本発明の一態様において、植物生殖細胞として受精卵細胞を用いることができる。その場合、（１−ｉ）植物の卵細胞と精細胞とを融合して受精卵細胞を作出する、あるいは、（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離する、ことにより、受精卵細胞を取得した後に、（２）得られた受精卵細胞に物質を導入する。
　卵細胞は、受精前は通常の体細胞とは異なる状態の細胞壁を有し、卵細胞と精細胞とが融合するとはじめて完全な細胞壁が形成される。細胞壁が形成されると物質導入処理を行うために細胞壁を除去する必要がある。よって、物質導入操作は、受精後速やかに、細胞壁の形成完了前に行うことが好ましい。例えば、トウモロコシおよびイネにおいては、受精から２０分程度で細胞壁の形成が始まり（非特許文献１５、１６）、約２時間程度でその形成が完了するとされているため、２時間（１２０分）以内に物質導入を行うことが好ましい。また、自然受精法により植物体内で作出した受精卵細胞を胚珠等から単離する場合も、受精卵細胞の単離後速やかに物質導入操作を行うことが好ましい。
　但し、自然受精法により植物体内で受精卵細胞を作出する場合は、単離卵細胞と精細胞の融合の場合とは異なり、花粉管が柱頭に付着してから実際に植物体内で受精が行われ受精卵細胞が形成されるまでに時間がかかる。よってこの場合、受精直後の受精卵細胞を得る方法として、受粉から受精までの時間帯を特定し、受精後その特定した時間帯に受精卵細胞を摘出することが好ましい。例えば、事前に受粉した花粉の花粉管の伸長速度を継時的にアニリンブルー等の染色液を用いた蛍光観察を行えば、受粉から受精までの時間を推定することが可能である。そのようにして推定した受粉から受精まで時間（受精卵形成までの時間）を鑑みた上で、当該受精卵細胞の細胞壁の形成が完了するまでの時間帯において物質導入操作を行うことが好ましい。
　受精卵細胞の細胞壁形成が完了するまでの時間は、植物品種によって異なる。本発明の方法においては、「細胞壁形成が不完全である細胞」、即ち、受精卵細胞の細胞壁形成が完了する前の細胞に物質を導入する。当業者は、受精卵細胞取得から物質導入完了までの時間を、植物品種の種類に応じて適宜決定することができる。例えばイネ、トウモロコシでは、単離した卵細胞及び精細胞の融合処理による受精卵細胞取得後、非限定的に、１８０分以内、好ましくは、１５０分以内、より好ましくは１２０分以内、さらに好ましくは６０分以内、より好ましくは２０分以内に、物質導入を行うことが好ましい。特にトウモロコシでは、受精卵細胞取得後、１２０分以内、好ましくは６０分以内、より好ましくは２０分以内である。
　また、例えばイネ、トウモロコシでは、自然受精法による受粉（交配）処理後、非限定的に、６時間以内、５時間以内、４時間以内、好ましくは３６０分以内、２４０分以内、１８０分以内、さらに好ましくは１２０分以内、より好ましくは６０分以内に、物質導入を行う。
　あるいは、卵細胞と精細胞の接合を行う前に、卵細胞及び精細胞のいずれか若しくは両方に物質を導入し、その後、卵細胞と精細胞とを融合して受精卵細胞を作出してもよい。好ましくは、卵細胞に物質を導入する。
　カルス又は胚様体（胚的細胞塊）化・再分化
　本発明の、植物に物質を導入する方法は、物質を導入する工程の後に、さらに、物質を導入した受精卵細胞をカルス化又は胚様体（胚的細胞塊ともいう）化し；そして、上記カルス化又は胚様体化した組織を再分化培地で再分化させる、ことを含んでもよい。
　カルス化又は胚様体化工程、及び、再分化工程は特に限定されず、受精卵細胞から植物体を再生するための公知の方法を利用することが可能である。
　カルス化又は胚様体化工程において、得られた物質導入受精卵細胞を培養して、胚様体又はカルスを形成させる。受精卵細胞を***誘導し細胞増殖させ、カルス又は胚様体を形成させる工程は、植物によって最適条件が異なるため特に限定されないが、Ｆｅｅｄｅｒ細胞を加えた、ナースカルチャー法が好ましい。例えば、次のように行うことができる。
　前処理：物質導入受精卵細胞を、マンニトール液滴（４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）の中に入れて洗浄し、無菌化を行う。
　液体培地での培養：培地に物質導入受精卵細胞を移し、一晩静置した後、穏やかに振とう培養する。振とう速度は、３０~５０ｒｐｍが好ましく、３５~４５ｒｐｍがより好ましい。培養の温度は、２４~２８℃が好ましく、２５~２７℃がより好ましい。培養は暗下で行うことが好ましい。この時、培地にはフィーダー細胞を加え共培養（ナースカルチャー法）を行うことが好ましい。この培養期間は、４~１４日が好ましく、５~１０日がより好ましい。
　培地：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸などのオーキシンを添加した、液体のＭＳ培地（Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ．，１５，４７３（１９６２））、Ｂ５培地（Ｏ．Ｌ．Ｇａｍｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｌ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５０，１５１−１５８（１９６８））、Ｎ６培地（Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉ．　Ｓｉｎｉｃａ，１８，６５９−６６８（１９７５））等である。
　培地にはインドール−３−酢酸、２，４−Ｄやダイカンバ等のオーキシン類が添加されることが好ましい。オーキシンの添加濃度は、０．１~３．０ｍｇ／Ｌが挙げられるが、０．１~０．３ｍｇ／Ｌが好ましく、０．１５~０．２５ｍｇ／Ｌがより好ましい。
　フィーダー細胞：公知のフィーダー細胞を用いることが可能である。例えば、イネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ　Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）や、トウモロコシのナース細胞（Ｍｏｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）、非形態形成型細胞培養物（ｎｏｎｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ：Ｋｒａｎｚ　ｅｔ　ａｌ．１９９１）などが挙げられる。
　この工程によって、培養開始から４~１４日後、直径５０~２００μｍ程度の球状の胚様体が形成される。
　再分化工程も公知の再分化工程に従い実施することができる。例えば、一例として、以下のように行うことが可能である。
　培養：球状の胚様体を、フィーダー細胞を加えていない前記培地に移し、さらに１０~１４日程度培養する。その後、オーキシンを添加しない任意の培地、例えばＭＳ培地に入れて培養し植物体を形成させる。この際、培養は光を照射して行うことが好ましく、光は、例えば、５０~１８０μｍｏｌ／ｍ２・ｓｅｃが好ましく、７０~１５０μｍｏｌ／ｍ２・ｓｅｃがより好ましい。
　培地：例えばＭＳ培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地であって、アガロース、寒天やゲランガム、ゲルライト等を使用した固体培地などが挙げられる。
　物質導入植物
　本発明はさらに、本発明の方法によって得られた、物質導入植物も含む。なお、本発明以前は、特に「難培養」とされる植物や品種について、物質導入植物を得ることは困難あるいは不可能であった。本発明により、このような植物、品種についても簡便な方法で効率良く物質導入植物を得ることが可能になる。
　また、本発明の方法によって得られた物質導入植物とは、プラスミドや遺伝子配列断片などの核酸、ゲノム編集などのためのタンパク質、ペプチドが導入され植物内に保持されている植物だけではなく、物質、特に遺伝子の導入により得られた形質転換植物や、Ｃａｓ９やガイドＲＮＡ等ゲノム編集関連物質の導入によりゲノム編集された植物、及びそれらの後代、クローン等を含む。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　実施例１　イネの卵細胞及び精細胞の単離
　本実施例において、イネの花からの卵細胞及び精細胞の単離を行った（図１）。
　卵細胞の単離は以下のように行った。イネの穂から得た未開花の花を解体して子房を採取し、３ｍＬの６％マンニトール溶液（３７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）が入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの中に子房を入れた。新しい３．５ｃｍプラスチックシャーレ中の３ｍＬの６％マンニトール溶液（３７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）に柱頭を除去した子房を沈めて、シャーレの底でレーザーブレード（フェザー安全カミソリ（株）、ＦＡ−１０）により子房の下部を切断した。顕微鏡観察により切断部から出てくる卵細胞を確認し、ミクロキャピラリーで卵細胞を単離した。３０~４０個の子房からおよそ１０~１５個の卵細胞が得られた。各卵細胞の直径は４０~５０μｍであった。単離した卵細胞は、ミクロキャピラリーを用いカバーグラス上の液滴中に移動した。
　なお、カバーグラス上の液滴は以下の方法で作成した。
　１）カバーガラス（２０ｍｍＸ４０ｍｍ）の周囲を、２％ジクロロメチルシランを含む１，１，１−トリクロロエタン溶液に浸し、乾燥させる；
　２）当該カバーガラス中央部分に０．２−０．３ｍＬのミネラルオイル（Ｅｍｂｒｙｏ　Ｃｕｌｔｕｒｅ−ｔｅｓｔｅｄ　Ｇｒａｄｅ，シグマアルドリッチ社製、１００１２７９２７０）を載せる；そして、
　３）当該ミネラルオイル内に１~２μＬの６％マンニトール液（３７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）をマイクロピペットで挿入する。
　精細胞の単離は以下のように行った。イネの穂から得た未開花の花を解体して葯を採取し、３ｍＬの６％マンニトール溶液（３７０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）が入った３．５ｃｍプラスチックシャーレに入れた。葯をマンニトール溶液に沈めたのち、ピンセットで葯を分解することにより、花粉がマンニトール溶液に散在させた。数分後、花粉がバーストし、精細胞を含む内容物がマンニトール溶液中に放出された。各精細胞の直径は８~１０μｍであった。この精細胞を、ミクロキャピラリーを用いてカバーグラス上の液滴中に移動した。
　実施例２　配偶子融合によるイネ受精卵細胞の作出
　本実施例では、電気融合による配偶子融合にて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでイネの受精卵細胞（イネのｉｎ　ｖｉｔｒｏ受精卵細胞）を作出した（図２）。
　カバーグラス上の液滴中に、実施例１に示した方法により単離した精細胞と卵細胞を１個ずつ移動した。その後、それら細胞を電極（ネッパジーン（株）ＣＵＹ５１００−１００Ｔｉ）上に、交流下（１ＭＨｚ、０．４ｋＶ／ｃｍ、ネッパジーン（株）ＥＣＦＧ２１）で並べた。当該液滴中に、液滴の半量~等量のマンニトール溶液（５２０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）をミクロキャピラリーで加えた。その後、ＤＣパルス（５０μｓ、１２−１５ｋＶ／ｃｍ、電極間距離５０−１５０μｍ）をかけることで、配偶子を融合させ、受精卵細胞を作出した。
　実施例３　イネ受精卵細胞への核酸導入
　本実施例では、実施例２で作出したイネのｉｎ　ｖｉｔｒｏ受精卵細胞に核酸を導入した。
　実施例２で作出した受精卵細胞を、配偶子融合処理から１２０分時点で物質の導入が完了するように、本実施例に沿って処理を行った。作出した受精卵細胞をＭＭＧ溶液（１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、４ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ　マンニトール）の液滴（約２μＬ）に移動し、その後ＭＭＧに導入する塩基配列、３５Ｓプロモーター：：シグナル配列：：ＧＦＰ：：小胞体残留シグナル（ＨＤＥＬ）：：ノスターミネーターを含むプラスミド（ＧＦＰ発現用のプラスミドＤＮＡ、約６，０００ｂｐ）を加えた液滴に移動した。なお、当該プラスミドは非特許文献１７の記載に従って調整した。次に受精卵細胞を含む液滴とＰＥＧ溶液（１２．５ｍＬ　マンニトール溶液（４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）に、７．５ｇのＰＥＧ４０００、２．５ｍＬの１Ｍ塩化カルシウムを加え蒸留水で２５ｍｇになるように調整）の液滴（約２μＬ）を混ぜ、ガラスキャピラリーで３０~５０回撹拌した。
　実施例４　イネ受精卵細胞の培養
　本実施例では、実施例３で核酸を導入したイネ受精卵細胞を培養した。
　実施例３で得た核酸導入受精卵細胞を培養するため、受精細胞用培地を用意した。受精細胞用培地は、改変型Ｎ６Ｚ培地（Ｋｕｍｌｅｈｎ　Ｊ．ｅｔ．ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔａ　２０５：３２７−３３３）に以下の改変を加えたものである；２ｇ／Ｌ　ＣＨＵ（Ｎ６）　ｂａｓａｌ　ｓａｌｔ　ｍｉｘｔｕｒｅ（シグマアルドリッチ社製）、０．０２５ｍｇ／Ｌ　Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／Ｌ　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０２５ｍｇ／Ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｍｇ／Ｌ　レチノール、０．０１ｍｇ／Ｌ　カルシフェロール、０．０１ｍｇ／Ｌ　ビオチン、１ｍｇ／Ｌ　チアミン・Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／Ｌ　ニコチン酸、１ｍｇ／Ｌ　ピリドキシン・ＨＣｌ、１ｍｇ／Ｌ　塩化コリン、１ｍｇ／Ｌ　Ｃａ−パントテン酸、０．２ｍｇ／Ｌ　リボフラビン、０．２ｍｇ／Ｌ　２，４−Ｄ、０．０２ｍｇ／Ｌ　コバラミン、０．０２ｍｇ／Ｌ　ｐ−アミノ安息香酸、０．４ｍｇ／Ｌ　葉酸、２ｍｇ／Ｌ　アスコルビン酸、４０ｍｇ／Ｌ　リンゴ酸、４０ｍｇ／Ｌ　クエン酸、４０ｍｇ／Ｌ　フマル酸、２０ｍｇ／Ｌ　Ｎａ−ピルビン酸、１，０００ｍｇ／Ｌ　グルタミン、及び２５０ｍｇ／Ｌ　カゼイン加水分解物、１００ｍｇ／Ｌ　ミオイノシトール。浸透圧はグルコースで４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏに調整（ｐＨ５．７）し作成した。作成した受精細胞用培地（０．２ｍＬ）を直径１２ｍｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＣＭインサート（ミリポア社製）内に入れ、２ｍＬの培地の入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの中に入れた。さらに、４０−６０μＬのイネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ　Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）をフィーダー細胞としてシャーレに加えた。
　洗浄・滅菌したミクロキャピラリーを用い、核酸導入受精卵細胞を新鮮なマンニトール液滴（４５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）中に投入し、その後、受精細胞用培地の入ったＣＭインサート内のメンブレン上に移した。
　核酸導入受精卵細胞は、暗所に２６℃で１日間静置したのち、蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰの蛍光の有無で導入した核酸の発現状況及び細胞の***状況を確認した。その結果を図３Ａに示す。核酸導入受精卵細胞には、確かにＧＦＰによる発光が観察されたため、核酸導入が確認できた。さらに、それら受精卵細胞を２日間振盪培養したのちに観察したところ、初期胚への***が確認され、さらには初期胚細胞中のＧＦＰによる発光も観察できた（図３Ｂ）。これにより、胚的細胞塊の細胞群においても、受精卵細胞に導入した核酸が保持されていることが確認できた。
　それら初期胚を、さらに暗所約１６日間振盪培養し、胚的細胞塊を得た。この際、培養開始後５~７日後に、培養液からフィーダー細胞を除いた。培養１８日後の胚的細胞塊を観察したところ、ＧＦＰによる発光が検出される細胞塊（図４Ａ）と、蛍光が検出されなくなった細胞塊（図４Ｂ）が観察された。これにより、受精卵から細胞塊のステージまでＧＦＰの発現が続く場合と、受精卵から初期胚のステージで一過的にＧＦＰが発現される場合の２通りのケースがあることは示された。また、１週間以上培養を継続した胚的細胞塊においても蛍光が観察されたことから、受精卵に導入した核酸により形質転換され安定的に蛍光タンパク質が生産されていることが確認された。以上の結果より、本発明の方法によって、遺伝子が植物に導入され、一過的又は安定的に発現可能であることが示された。
　実施例５　イネ胚的細胞塊の培養による分化誘導
　本実施例では、実施例４で得られたイネ胚的細胞塊の培養による分化誘導を行った。
　実施例４で得られたイネ胚的細胞塊について、分化誘導培地１（改変したＭＳ培地；ＭＳ塩、ＭＳビタミン、１００ｍｇ／Ｌ　ミオイノシトール、２ｇ／Ｌ　カサミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）、３０ｇ／Ｌ　スクロース、３０ｇ／Ｌ　ソルビトール、０．２ｍｇ／Ｌ　ｌ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、１ｍｇ／Ｌ　カイネチン及び０．３％　Ｇｅｌｒｉｔｅ）に移した。培養は３０℃で持続的に光照射しながら行った。移植１０日後にはシュートが分化した（図５）。さらに、シュートを分化させた胚的細胞塊を分化誘導培地２（改変したＭＳ培地；ＭＳ塩、ＭＳビタミン、１００ｍｇ／Ｌ　ミオイノシトール、３０ｇ／Ｌ　スクロース及び０．３％　Ｇｅｌｒｉｔｅ）に移した。培養は３０℃で持続的に光照射しながら行った。移植７日後には幼植物体が得られた（図６）。なお、当該幼植物体は、非特許文献１８の記載に従って再分化させた。
　実施例６　融合後の時間と物質導入効率の関係
　本実施例では、酵素処理なしでＰＥＧ法により物質導入が可能な受精卵のステージについて調べた。受精卵のステージは、電気融合後の経過時間を指標とした。実施例１及び２に従い電気融合を用いて作出したイネ受精卵細胞について、所定の時間経過後、実施例３で用いたＧＦＰ発現用のプラスミドＤＮＡを導入し、実施例４のとおり核酸導入を確認した。核酸の導入が確認された受精卵細胞について、その後実施例４の条件で培養を継続し、初期胚への***を確認した。その結果を表１に示す。結果より、配偶子融合後５−２０分と１２０分時点での物質導入では導入効率に差が認められなかった。配偶子融合後５−２０分と１２０分の時点で物質導入効率に差がなかったことから、物質導入は、受精卵細胞作成時の電気融合の影響によるものではなく、ＰＥＧ法によるものであることが理解される。なお、２４０分経過後では核酸の導入は低効率で確認されたが、受精卵の***には至らなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例７　細胞壁形成度の測定
　本実施例では、イネ受精卵細胞の細胞壁形成度の測定を行った。
　実施例２に記載したように、電気融合後２時間経過時の受精卵細胞及び細胞壁が十分に発達したステージにあると推察される電気誘導後２０時間後の受精卵細胞に０．００５％カルコフロール染色を行い、共焦点レーザー走査顕微鏡を用い、蛍光輝度を測定した。それぞれ３細胞について画像解析を行い積算輝度を求め比較したところ、受精後２時間後の細胞壁から検出されたカルコフロールによる蛍光輝度は、２０時間後の受精卵細胞と比較し、６３％程度であるこをが確認された。
　実施例８　核酸導入処理イネ受精卵細胞中における相対的プラスミド量の推定
　本実施例では、イネ受精卵細胞にプラスミド核酸を導入し、細胞中における相対的プラスミド量を推定した。
　実施例１−３に従い、配偶子の電気融合によりイネ受精卵細胞を作出し、ＰＥＧ法による核酸導入を行った。ただし、電気融合処理から１０分−１時間後に、３５Ｓプロモーター：：シグナル配列：：ＧＦＰ：：小胞体残留シグナル（ＨＤＥＬ）：：ノスターミネーターを含むプラスミド（ＧＦＰ発現用のプラスミドＤＮＡ、約６，０００ｂｐ）ＤＮＡを用い、融合処理から１２０分までに物質の導入が完了するように処理を行った。その後、実施例４に従い当該受精卵細胞を培養し、蛍光顕微鏡でＧＦＰ由来の蛍光を観察したのち、ミクロキャピラリーを用いて各受精卵細胞を一個ずつ１０μＬの定量ＰＣＲ溶液中に移した。この際、定量ＰＣＲ溶液としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　Ｍａｓｔｅｒ　（Ｒｏｃｈｅ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を、プライマーはプラスミド中のＳＰ−ＧＦＰ−ＥＲを増幅する特異的プライマー（５’−ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’、５’−ＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧ−３’）を用いた。ＰＣＲ反応サイクルは９４℃１０秒、５５℃１０秒、７２℃１０秒で行い、遺伝子導入処理をしていない受精卵細胞を対照として、受精卵細胞内の相対的プラスミド量を推定した。その結果を図７に示す。
　図７に示された通り、蛍光顕微鏡でＧＦＰ由来の蛍光が観察された細胞のみならず、蛍光が観察されない細胞においても、核酸導入がなされている個体があることが確認できた。また、ＧＦＰ由来の蛍光が観察された個体においては、ＧＦＰ蛍光強度と導入されたプラスミドの量には正の相関関係があることが示された。
　実施例９　トウモロコシ卵細胞及び精細胞の単離
　本実施例では、トウモロコシの卵細胞及び精細胞の単離を行った。卵細胞及び精細胞の単離は、Ｋｒａｎｚ　Ｅ．　ａｎｄ　Ｌｏｅｒｚ　Ｈ．（非特許文献１）を参考に以下のように行った。
　温室内で育成し、開花前に袋がけしたトウモロコシ（品種：Ａ１８８）の交配適期の雌穂を供試した。採取した雌穂の胚珠から、胚嚢を含む珠心切片を摘出し、３．５ｃｍプラスチックシャーレ中の１．５ｍＬ酵素溶液に加え室温で静置した。酵素溶液としては、０．３３％セルラーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）、０．１％マセロザイムＲ１０（ヤクルト本社製）、０．０１７％ペクトリアーゼＹ２３（盛進製薬製）を１０％マンニトール溶液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）に添加したものを用いた。
　２０−３０分の酵素処理後、２本のガラス針を用い卵細胞の単離を行った。片方のガラス針で珠心切片を固定し動かないようにし、もう一方のガラス針で、卵細胞が存在すると推定される領域の組織を掻き出すことにより卵細胞を単離した。卵細胞が位置する領域の推定は、珠心切片内に観察される胚嚢の位置に基づき行われた。単離した卵細胞は、ガラスキャピラリーを用いカバーグラス上のマンニトール液滴中に移動した。なお、カバーグラス上のマンニトール液滴は実施例１に従って作成し、卵細胞を単離した酵素液がマンニトール液滴に可能な限り混入しないように操作を行った。
　精細胞の単離は以下のように行った。トウモロコシ（品種：Ｂ７３）の雄穂から花粉を３．５ｃｍプラスチックシャーレに採取し、そこに３ｍＬの１０％マンニトール溶液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）を加えた。約３−５分後、マンニトール溶液中に花粉がバーストし、精細胞を含む花粉内容物がマンニトール溶液中に放出された。各精細胞の直径は１０μｍであった。この精細胞を、ガラスキャピラリーを用いて、カバーグラス上のマンニトール液滴中に移動した。
　実施例１０　配偶子融合によるトウモロコシ受精卵の作出
　本実施例では、電気融合による配偶子融合にて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでトウモロコシの受精卵細胞を作出した。
　カバーグラス上の液滴中に、実施例８および９に示した方法により単離した精細胞と卵細胞を１個ずつ移動した。その後、それら細胞を電極（ネッパジーン（株）ＣＵＹ５１００−１００Ｔｉ）上に、交流下（１ＭＨｚ、０．４ｋＶ／ｃｍ、ネッパジーン（株）ＥＣＦＧ２１）で並べた。その後、ＤＣパルス（５０μｓ、１２−１５ｋＶ／ｃｍ、電極間距離５０−１００μｍ）をかけることで、雌雄配偶子を融合させ、受精卵細胞を作出した。
　実施例１１　トウモロコシ受精卵への核酸導入
　本実施例では、実施例１０で作出したトウモロコシのｉｎ　ｖｉｔｒｏ受精卵細胞に核酸を導入した。
　実施例１０で作出した受精卵細胞を、配偶子融合処理から３０−９０分時点で物質の導入が完了するように、本実施例に沿って処理を行った。作出した受精卵細胞をＭＭＧ溶液（１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、４ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ　マンニトール）の液滴（約２μＬ）に移動し、その後さらに、ＭＭＧに対し、導入する塩基配列である３５Ｓプロモーター：：シグナル配列：：ＧＦＰ：：小胞体残留シグナル（ＨＤＥＬ）：：ノスターミネーターを含むプラスミド（ＧＦＰ発現用のプラスミドＤＮＡ、約６，０００ｂｐ）を１６０ｎｇ／μＬになるように加えた、核酸導入用液滴に移動した。なお、当該プラスミドは非特許文献１７の記載に従って調整した。次に受精卵細胞を含んだ当該核酸導入用液滴とＰＥＧ溶液（１２．５ｍＬ　マンニトール溶液（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）に、７．５ｇのＰＥＧ４０００、２．５ｍＬの１Ｍ塩化カルシウムを加え蒸留水で２５ｍｇになるように調整）の液滴（約２μＬ）を混ぜ、ガラスキャピラリーで３０~５０回撹拌した。
　核酸導入処理を行った受精卵細胞について、洗浄・滅菌したミクロキャピラリーを用い、新鮮な１０％マンニトール液滴（６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏ）中に投入し、その後、受精細胞用培地の入ったＣＭインサート内のメンブレン上に移した。
　核酸導入受精卵細胞は、暗所に２６℃で１日間静置した後、振盪培養を継続した。培養後の細胞を、倒立式蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰの蛍光の有無で導入した核酸の発現状況及び細胞の***状況を確認した。核酸導入処理を行った受精卵細胞は、確かにＧＦＰによる発光が観察されたため、核酸導入が確認できた。さらに、それら核酸導入受精卵細胞を６日間振盪培養したのちに観察したところ、初期胚への***が確認され、さらには初期胚細胞中のＧＦＰによる発光も観察できた（図８）。これにより、トウモロコシの胚的細胞塊の細胞群においても、受精卵細胞に導入した核酸が安定して保持されていることが確認できた。
　なお、受精細胞用培地は、以下のとおり作成した；
　ＭＳ培地のＮＨ４ＮＯ３を１６５ｍｇ／Ｌに改変し、有機物組成は以下の通りとした。１ｍｇ／Ｌ　ニコチン酸、１０ｍｇ／Ｌ　チアミン・ＨＣｌ、１ｍｇ／Ｌ　ピリドキシン・ＨＣｌ、０．０２５ｍｇ／Ｌ、７５０ｍｇ／Ｌ　グルタミン、１５０ｍｇ／Ｌ　プロリン、１００ｍｇ／Ｌ　アスパラギン、１００ｍｇ／Ｌ　ミオイノシトール。それらに２ｍｇ／Ｌ　２，４−Ｄを加え、浸透圧はグルコースで６５０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏに調整（ｐＨ５．７）し作成した。作成した受精細胞用培地を直径１２ｍｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ　ＣＭインサート（ミリポア社製）内に入れ、２ｍＬの培地の入った３．５ｃｍプラスチックシャーレの中に入れた。さらに、４０~６０μＬのイネ浮遊細胞培養物（Ｌｉｎｅ　Ｏｃ、理研バイオリソースセンター製）をフィーダー細胞としてシャーレに加え、受精細胞用培地とした。
　実施例１２　自然受精法によって得られたイネ受精卵細胞の細胞壁形成度の測定
　本実施例では、自然受精法（人工交配）によって得られた受精卵細胞の細胞壁形成度の測定を行った。
　昼温２８℃前後、夜温２３℃前後の温度帯であり、湿度が４０−９０％の環境で栽培されているイネ品種ゆきひかりを人工交配した。人工交配は、開花直前のイネの小花を指でつまむことによって行った。単離作業開始までの９０分間、同環境で栽培した。受精卵細胞の単離は、実施例２に記載の卵細胞の単離と同様の操作によって行った。人工交配後３時間、５時間、８．５時間、２０時間の受精卵の細胞壁を０．００５％カルコフロールによって染色した。この間、受精卵細胞は２３℃前後の温度帯で取り扱った。１０分間カルコフロール染色した受精卵細胞を、Ｚｅｉｓｓ社製顕微鏡　ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ　Ａ１にフィルターＣＦＷ−ＬＰ０１−Ｃｌｉｎｉｃａｌを設置して撮影をした。撮影条件は、露出時間を２５　ｍｓｅｃ、ホワイトバランスを３２００Ｋとした。１細胞当たりのカルコフロール蛍光輝度を、画像解析ソフトＺＥＮ２を用いて測定した。細胞壁が十分に発達したステージであると推察される交配２０時間後の受精卵の蛍光輝度を１００％とした際の、交配数時間後の受精卵の蛍光輝度の割合を細胞壁形成度とした。その結果を表２に示す。交配３時間後の受精卵細胞は３８％、５時間後は５２％、８．５時間後は８４％の細胞壁形成度であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１３　自然受精法によって得られたイネ受精卵細胞へのエレクトロポレーション法による核酸導入
　本実施例では、人工交配によって得たイネ受精卵細胞へエレクトロポレーションを用いてＧＦＰ核酸を導入した。
　実施例１２に従いイネを人工交配し、受精卵細胞を単離した。単離した受精卵細胞に対し、ＤＮＡ断片の導入完了までの時間が交配後４時間となるように、トウモロコシユビキチンプロモーター：：トウモロコシユビキチンイントロン：：ＧＦＰ：：ノスターミネーターをコードする塩基配列からなる直鎖のＤＮＡ断片を導入した。当該ＤＮＡ断片を１００ｎｇ／μＬの濃度で含みマンニトールを用いて浸透圧を４５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ　Ｈ２Ｏに調整したＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と受精卵細胞を混合した。ネッパジーン製ＮＥＰＡ２１を用いて、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの条件は、１ｍｍ幅の電極を用い、電圧３０Ｖをパルス幅２．０ｍｓｅｃ、パルス間隔５０ｍｓｅｃで４回処理した。
　エレクトロポレーション法による核酸導入処理を行った受精卵細胞を、実施例４に記載の方法に従い培養した。胚的細胞塊から形成されたカルスについて、培養４２日目にＰＣＲ法及び増幅断片のシーケンスにより、ＧＦＰの導入を確認した。この際、ＰＣＲプライマーはＧＦＰを増幅する特異的プライマー（５’−ａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇ−３’、および５’−ｃｃａｔｇａｔａｔａｇａｃｇｔｔｇｔｇｇｃｔｇ−３’）を用いた。ＰＣＲ反応によって得られたＤＮＡ断片をシークエンス解析したところ、このＰＣＲ産物の塩基配列はＧＦＰ配列と一致していた。
　その結果より、エレクトロポレーション法による核酸導入受精卵細胞について、確かにＤＮＡ断片（ＧＦＰ）が導入されていることが示された。なお、このＤＮＡ断片の導入が確認された受精卵由来のカルスを実施例５に記載の方法に従って培養し、分化誘導を行ったところ、再分化個体を得ることができた。
　実施例１４　イネ受精卵細胞への核酸及びタンパク質の導入
　本実施例では、イネ受精卵への核酸及びタンパク質の導入を行った。具体的には、ＤｓＲｅｄ２（クロンテック）をコードする核酸を導入したイネから由来する卵細胞と野生型イネ由来の精細胞を融合させて得られた受精卵細胞を用い、ゲノム編集実験を行った。
　ＤｓＲｅｄ２をコードする遺伝子を導入したイネは以下のとおり作出した；トウモロコシユビキチンプロモーター：：ＤｓＲｅｄ２をコードする遺伝子配列：：ノスターミネーター：：ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター及びホスフィノスリシン耐性マーカー遺伝子を含むｐＬＣ４１プラスミド（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＬＣ２１５６９８）を調整し、Ｈｉｅｉ　ａｎｄ　Ｋｏｍａｒｉ　（非特許文献１８）に従ってイネ（品種：ゆきひかり）に形質転換し、ＤｓＲｅｄ２形質転換イネを作出した。
　実施例１及び２に従い、作出したＤｓＲｅｄ２形質転換イネから卵細胞を、野生型イネ（品種：ゆきひかり）から精細胞を単離し、電気融合により受精卵細胞を得た。得られた受精卵細胞に対し、実施例３に従ってプラスミドＤＮＡ又はＣａｓ９タンパク質複合体を導入した。なお、導入するプラスミドＤＮＡ及びＣａｓ９タンパク質複合体は以下のとおり作成した。
　導入するプラスミドＤＮＡの作成：
　ｔＲＮＡ１−ｔＲＮＡ−ｇＲＮＡ２を表３に示すプライマーセットを用いて増幅し、ｔＲＮＡ−ｇＲＮＡユニットを作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　作成したｔＲＮＡ−ｇＲＮＡユニットを、ゴールデンゲートクローニング法を用いてｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターのＢｓａＩサイトに導入することで、イネＵ６ｓｎＲＮＡプロモーター：：ｔＲＮＡ−ｇＲＮＡユニットを含むＡｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクタープラスミドを作成した。
　導入するＣａｓ９タンパク質複合体の作成：
　ＧｅｎｅＡｒｔ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｇＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用い、ｓｇＲＮＡを合成した。使用したプライマーセットを表３に示す。２~３μｇのｓｇＲＮＡと、１μｇのＣａｓ９タンパク質（核酸局在化シグナルタグを有するＧｅｎｅＡｒｔ　Ｐｌａｔｉｎｕｍ　Ｃａｓ９；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を、１．５~２．１μＬのＣａｓ９タンパク質保存バッファ（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．６ｍＭ　ＴＣＥＰ，　５０％　グリセロール）に加え、インキュベーションすることで、Ｃａｓ９タンパク質複合体を得た。
　プラスミドＤＮＡ又はＣａｓ９タンパク質の導入：
　得られたＣａｓ９タンパク質複合体、または８０−３２０ｎｇ／μＬになるように調整した前述のプラスミドＤＮＡを、それぞれカバーグラス上の１０μＬのＭＭＧに添加し、実施例３に従ってイネ受精卵細胞に導入した。そのようにして得られたプラスミドＤＮＡ導入受精卵又はＣａｓ９タンパク質複合体導入受精卵細胞を、実施例４に従い培養し、蛍光顕微鏡でＤｓＲｅｄ２の蛍光を観察した。プラスミドＤＮＡ導入受精卵の蛍光顕微鏡及び光学顕微鏡写真を図９に示す。その結果より、プラスミドＤＮＡ及びＣａｓ９タンパク質複合体導入受精卵のどちらにおいても、培養に従いＤｓＲｅｄ２の蛍光が消光することが確認された。
　プラスミドＤＮＡ導入処理を行っていない受精卵（図９Ａ）では、配偶子融合処理直後（図９Ａ：０日）から胚的細胞塊の細胞群（図９Ａ：７日）まで、すべての細胞においてＤｓＲｅｄ２の発現が認められた。それに対し、プラスミドＤＮＡ導入受精卵（図９Ｂ）では、配偶子融合処理及び核酸導入処理直後（図９Ｂ：０日）では認められたＤｓＲｅｄ２の発光が、培養日数に従い認めらなくなった（図９Ｂ：７日）。これは、プラスミドＤＮＡ導入に従い、形質転換イネのゲノムにおけるＤｓＲｅｄ２をコードする遺伝子配列が編集された結果、消光したためである。
　さらに、得られたプラスミドＤＮＡ導入受精卵細胞を実施例５に従い分化誘導し、再分化個体を得た。得られた再分化個体の葉からＤＮＡを抽出し、ＤｓＲｅｄ２をコードする遺伝子配列についてＰＣＲ法及びシークエンス解析を用いて確認したところ、確かに再分化個体が有するＤｓＲｅｄ２をコードする遺伝子配列の一部に、欠失や核酸の挿入が認められ、ゲノム編集されていることが示された。
　なお、Ｃａｓ９タンパク質複合体導入受精卵細胞においても同様の結果が得られたため、Ｃａｓ９タンパク質複合体の導入によっても同様に、形質転換イネのＤｓＲｅｄ２遺伝子配列がゲノム編集されたことが示された。
　この結果より、本発明の方法により受精卵細胞に核酸プラスミドだけではなく、Ｃａｓ９タンパク質のような物質をも導入することが可能であり、さらに本発明の方法によりゲノム編集を行うことが可能であることが明らかになった。
　実施例１５　イネの卵細胞への複数種の核酸の同時導入
　実施例１に従ってイネの卵細胞を単離した。単離した卵細胞をＭＭＧ溶液の液滴（約２μＬ）に移動し、その後ＭＭＧに導入する塩基配列、３５Ｓプロモーター：：シグナル配列：：ＧＦＰ：：小胞体残留シグナル（ＨＤＥＬ）：：ノスターミネーターを含むプラスミド（非特許文献１７）およびユビキチンプロモーター：：ユビキチンイントロン：：ＤｓＲｅｄ２をコードする遺伝子配列：：ノスターミネーターを含むプラスミドを加えた液滴に移動した。次に、実施例３に従い、卵細胞及び前記２種類のプラスミドを含む液滴とＰＥＧ溶液の液滴（約２μＬ）を混ぜ、ガラスキャピラリーで３０~５０回撹拌することで、卵細胞に対するＰＥＧ法による核酸導入処理を行った。
　核酸導入処理を行った卵細胞は、導入処理から１２−１６時間後に蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ２の蛍光の有無で導入した核酸の発現状況を確認した。その結果を図１０に示す。同一の卵細胞内に、ＧＦＰ（図１０：左）とＤｓＲｅｄ２（図１０：中央）による発光が両方とも観察されたため、本発明の方法により、卵細胞に対しても２種の核酸を同時導入可能であることが確認できた。
　本発明により、細胞に対する植物組織分解酵素処理を行わずとも、物質の導入、形質転換及び培養を行うことが可能となった。これにより、従来培養が困難等の理由で形質転換が困難であったため有用形質を付与することできなかった植物体であっても、簡便に、安定して再現性良く形質転換体やゲノム編集個体を得ることが可能となる。

Claims (17)

  1. 　細胞壁形成が不完全である植物生殖細胞に物質を導入することを含む、植物に物質を導入する方法。
  2. 　物質の導入の前に、単離した植物生殖細胞に対し植物組織分解酵素による処理を行わない、請求項１に記載の方法。
  3. 　細胞壁形成率が６５％以下である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　植物生殖細胞が、受精卵細胞である、請求項１に記載の方法。
  5. 　（１−ｉ）植物の卵細胞と精細胞とを融合して受精卵細胞を作出する、あるいは
    　（１−ｉｉ）植物の受精卵細胞を含む組織から受精卵細胞を単離する、
    ことにより、受精卵細胞を取得し、
    　（２）得られた受精卵細胞に、物質を導入する、
    ことを含む、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　（１−ｉ）の卵細胞と精細胞との融合を電気融合により行う、請求項５に記載の方法。
  7. 　受精卵細胞の取得から、１２０分以内に工程（２）の物質導入を行う、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 　受精卵細胞の取得から、６０分以内に工程（２）の物質導入を行う、請求項５又は６に記載の方法。
  9. 　（１−ｉ）の卵細胞と精細胞との融合を自然受精法により行う、請求項５に記載の方法。
  10. 　受精卵細胞の取得から、３６０分以内に工程（２）の物質導入を行う、請求項５又は９に記載の方法。
  11. 　受精卵細胞の取得から、２４０分以内に工程（２）の物質導入を行う、請求項５又は９に記載の方法。
  12. 　（１）植物の卵細胞及び精細胞のいずれか若しくは両方に物質を導入する、そして、
    　（２）工程（１）を経た卵細胞と精細胞とを融合して受精卵細胞を作出する、
    ことを含む、請求項１−４のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　（１）の卵細胞と精細胞との融合を電気融合又は自然受精法により行う、請求項１２に記載の方法。
  14. 　物質導入が、ＰＥＧ法又はエレクトロポレーション法を用いて行われる、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　植物が、単子葉植物である、請求項１−１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　植物が、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ及びソルガムからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 　請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法で得られた、物質導入植物。
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