WO2018134129A1 - Mikroskop und verfahren zum mikroskopieren einer probe - Google Patents

Mikroskop und verfahren zum mikroskopieren einer probe Download PDF

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WO2018134129A1
WO2018134129A1 PCT/EP2018/050730 EP2018050730W WO2018134129A1 WO 2018134129 A1 WO2018134129 A1 WO 2018134129A1 EP 2018050730 W EP2018050730 W EP 2018050730W WO 2018134129 A1 WO2018134129 A1 WO 2018134129A1
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microscope
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PCT/EP2018/050730
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Alexander Gaiduk
Dominik Stehr
Johannes Winterot
Volker Pusch
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Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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Publication date
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    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • G06V20/695—Preprocessing, e.g. image segmentation

Definitions

  • the present invention initially relates to a method for
  • Microscopy of a sample with a microscope which includes a lens and an image sensor for converting one of the
  • Invention a microscope for microscopy of a sample.
  • the microscope can be used for confocal microscopy, for laser-assisted microscopy, for conventional microscopy or for analytical microscopy.
  • US Pat. No. 7,345,816 B2 discloses an optical microscope which comprises a mirror with a controllably variable reflecting surface. By changing the surface of the mirror, images can be taken from different focal positions.
  • US 7,269,344 B2 shows an optical device with an imaging optical system having deformable mirrors and a digital zoom function.
  • the electronic magnification should be changeable with high image sharpness.
  • MALS Mirror Array Lens System
  • Product includes u. a. a LED ring light, a
  • Focusing can be changed with a frequency of up to 10 kHz.
  • Object stage motions and image sizes are controlled such that a first set of contiguous image slices can be generated to provide an enlarged overall view of the sample
  • the overall view of the sample is displayed for a user to interactively select a region of interest. Accordingly, the area is scanned with a higher optical resolution and a second set
  • EP 1 918 751 A1 teaches a microscope which is intended to enable the acquisition of three-dimensional images and high-resolution images with different focus positions.
  • DE 10 2013 208 415 A1 shows a method for 3D high-resolution localization microscopy, which is intended to image a sample in a depth direction and transversely to high resolution. Fluorescence emitters are repeatedly used in the sample
  • the object of the present invention is to micro-copy a sample
  • the above object is achieved by a method according to the appended claim 1 and by a microscope according to the attached independent claim 13.
  • the method according to the invention is used for the microscopy of a
  • Sample with a microscope especially with a digital microscope.
  • the digital microscope is preferably an electronic image conversion, wherein the recorded image processed in the form of digital data and brought to display on an electronic image display device.
  • the microscope comprises an objective and an image sensor for converting an image imaged directly or indirectly from the objective onto the image sensor.
  • An image sensor side field of view of the microscope is through
  • the section includes the entire image sensor.
  • the section is defined by those pixels of the image sensor that are within the section, with some or all of the pixels
  • the section is thus defined by a place and a surface.
  • the field of view is also referred to as field-of-view in English and is in particular characterized by an image sensor-side opening angle of the microscope
  • the field of view of the microscope is changeable, so that the image sensor side opening angle changeable, d. H. is adjustable.
  • the lens for itself can be a solid
  • the image sensor side field of view is defined by an at least two-dimensional extent, wherein a
  • three-dimensional extent can be defined so that not only the field of view, but also a viewing volume on the microscope is variable.
  • an initial image of at least a portion of the sample is taken with the microscope.
  • the picture includes at least the
  • Microscope selected a first image sensor side field of view. Ie. a first portion of the image sensor is selected and read out.
  • the first field of view may also be given within a first view volume which is selected.
  • the initial image can be two-dimensional or three-dimensional. Three-dimensional images cover every point in the room
  • intensity values and / or color values can be specified for each point in space in an orthogonal coordinate system with X, Y and Z axes.
  • Illusion are also referred to as pseudo-three-dimensional or as 2, 5-dimensional images or representations.
  • the initial image is analyzed to include at least two differing partially image-forming image sensor-side
  • the analysis can be done manually or automatically.
  • the partial area imaging fields of view are determined, so that several sections of the image sensor are detected which are suitable for taking the microscopic images of the several partial areas of the sample.
  • a partial area of the initial image is displayed. It is preferred for each of Subareas each determines a partial area imaging field of view, so that each of the subareas with an individually suitable partial area imaging field of view efficient
  • Fields of view differ in their position relative to the image sensor in an x and / or y direction.
  • Subarea-imaging fields of view can also be given in each case within sub-area-reflecting view volumes, which are selected. Accordingly, the
  • They also preferably differ in their position in the z-direction which is perpendicular to the x-direction and y-direction.
  • the microscopic images of the several partial regions of the sample are recorded with the microscope, for which in each case the previously determined partial region-imaging field of view is selected on the microscope, i. H. that the respectively predetermined section of the image sensor is selected and read out.
  • imaging fields of view can be adapted microscopically, so that the microscopy of the entire sample can be done quickly, without compromising the quality of the microscopic images to accept have to.
  • the subregions of the specimen can, depending on the richness of detail of the individual subregions, be adapted with partially visible imaging fields and resolutions
  • partial area imaging fields of view also preferably each adapted the resolution in the third dimension.
  • the method according to the invention can be used for rapid acquisition of two-dimensional and / or three-dimensional microscopic images of large samples.
  • the method is preferably used for in-line testing in the electronics industry, in particle analysis, non-metallic inclusions, in additive manufacturing, in the pharmaceutical industry and in the manufacture of medical devices.
  • the initial image and the images of the subregions are preferably recorded with the exactly one objective, so that the lens during the implementation of the invention
  • the image recording device can be formed, for example, by an overview camera or by a camera for two- or three-dimensional images.
  • the initial image is taken as an overview image of the sample.
  • the overview image preferably shows at least one main region of the sample which
  • An overview image particularly preferably shows the entire sample.
  • the first field of view is chosen as an overview imaging field of view that is larger than all partial area imaging fields of view.
  • the microscopic images of the subregions are, if necessary, with a finer one
  • the finer resolution can be formed in the x, y and / or z direction.
  • the resolution in the z-direction can be reduced by larger steps in the z-direction, so that the recording of the overview image is faster.
  • the initial image can be changed with another optical
  • Image pickup device such as a
  • the method according to the invention preferably analyzes the individual subregions imaged in the initial overview image in order in each case to have at least two or three resolutions necessary for microscoping the respective subarea
  • the lower the required resolution the larger the respective partial area imaging can be Field of view or vision volume are selected to efficiently record the respective image, for which in particular not all the pixels of the image sensor in the selected section are read out or in each case several pixels in the selected section are read together or a sub-scan of the
  • this is preferably carried out recursively.
  • at least one of the microscopic images of the subregions is analyzed to determine at least one subfield imaging field of view for taking microscopic images of at least a plurality of subregions of the sample.
  • Subfield area imaging fields of view are preferably smaller than the respective partial area imaging field of view. Microscopic images of the several subregions of the sample are taken with the microscope, for each of which previously
  • the microscopic images of the subregions are rendered at a finer resolution in one or more
  • the initial image is captured as a microscopic image of a first of the portions of the sample.
  • the first field of view is selected as a partial area imaging field of view.
  • the partial area imaging fields of view for taking the microscopic images of the further partial areas of the sample are thus selected on the basis of the analysis of the image of the first partial area of the sample.
  • an analysis of the individual microscopic images of the other can be added Subsections are made to the individual
  • the initial image and / or at least several of the images of the subregions are preferred with an extended one
  • the extended depth of field is also known as Extended Depth of Field.
  • the respective image with the extended depth of field can be two- or
  • the initial image or the microscopic image with the extended depth of field it is preferred to record a plurality of individual images with different z positions. The individual images then become the initial image or the microscopic image
  • Microscopic images are preferably additionally recorded with depth information, so that they are preferably three-dimensional images. To take the initial image or the microscopic one
  • an actuator is preferably placed on an active optical element of the microscope.
  • a mechanical actuator can be designed to deform or displace the active optical element, which may be formed by a flexible lens, a lens controllable by mechanical vibrations, a liquid lens or a diffractive lens for measuring a depth information of the sample.
  • the actuator is controlled by a microsystem for mechanically moving
  • the actuator is preferably a focus actuator and / or an aberration actuator.
  • the actuator is preferably operated at a frequency of at least 1 kHz and more preferably of at least 10 kHz.
  • the optical detector in an advantageous embodiment, the optical detector
  • Micro mirrors designed to accommodate an extended depth of field.
  • the above-described "MALS module” from SD Optics Inc. can be used as an optical actuator
  • a MALS module can be designed, for example, as a Fresnel lens, as described, for example, in WO 2005/119331 A1
  • the Fresnel lens focal length can be changed in a very fast way, and this fast change in focal length allows a very fast adjustment of the image to be imaged
  • Such a sequence of images taken in different focal planes is also called a focus stack. From a focus stack, an image with extended depth of field can be detected.
  • the microscopic images of the subregions can also be described as tiles. The inventive method is thus suitable for microscopy of large samples such as a printed circuit board. The recorded microscopic
  • Images of the subregions are preferably combined to form an overall image of the sample.
  • a partial area imaging field of view is determined for each of the partial areas and used to record the corresponding image.
  • Subareas determined and used an adapted partial area imaging field of view with adapted resolution.
  • Adjusted images of the subregions of the sample are determined as a result of the analysis of the initial image and when recording the
  • the further parameters of the microscope preferably comprise a two- or three-dimensional resolution of the respective
  • Depth of field the option of depth information and / or parameters for setting the actuator of the active optical element. Accordingly, the analysis of the initial image continues to be a two- or three-dimensional
  • the microscopic images of the multiple subregions are each with the previously determined two- or three-dimensional resolution, with the previously determined visual volume, with the previously determined contrast, with the previously determined parameters for aberration control with the previously determined parameters for setting the actuator with a extended depth of field and / or recorded with depth information.
  • the partial area imaging fields of view preferably each have a sample-side opening angle of at most 140 °.
  • the overview imaging field of view preferably has a sample-side opening angle of at least 1 ° and more preferably at least 5 °.
  • the partial area imaging fields of view have, based on the sample, an edge length or a diameter of preferably at most 5 mm, more preferably at most 2 mm.
  • the overview imaging field of view has a reference to the sample
  • the microscopic images of the subregions are preferably recorded in each case with a resolution of at least 500 line pairs / mm.
  • the microscopic images of the subregions are preferably taken in each case with a resolution of at least 0.3 ym based on the sample.
  • the initial Overview image is preferred with a resolution of
  • the initial overview image is further preferably recorded with a resolution of at most 10 ym based on the sample.
  • the sample is preferably illuminated during the acquisition of the initial image and during the acquisition of the microscopic images, for which purpose preferably visible light, UV radiation and / or IR radiation is used.
  • the microscope according to the invention is preferably digital and initially comprises an objective for the enlarged optical
  • Imaging a sample in an image plane Through the lens, an image with an optical resolution in the image plane can be displayed.
  • the optical resolution is through the
  • the objective includes optical components for increased optical imaging of the sample in the image plane.
  • the optical components are in particular formed by optical lenses and possibly also by one or more mirrors, diaphragms and filters.
  • the microscope further comprises an image sensor for converting the lens directly or indirectly on the
  • Image sensor imaged image into an electrical signal is variable by selecting a portion of the image sensor.
  • the microscope further comprises an electronic
  • Control unit for controlling the image sensor.
  • the control unit preferably further serves to control one of the image data of the Image sensor processing image processing unit.
  • Control unit is for carrying out the invention
  • control unit is preferably configured to carry out preferred embodiments of the method according to the invention.
  • microscope preferably also has features that are associated with the method according to the invention and its preferred
  • the method according to the invention also preferably has features that are associated with the microscope according to the invention and its preferred
  • the lens has a maximum
  • Lens has a fixed magnification factor, this also represents the maximum magnification factor.
  • the maximum magnification factor is at most 30. In further preferred embodiments of the microscope, the maximum
  • the objective has a numerical aperture which is preferably at least 0.01.
  • the numerical aperture is more preferably at least 0.1.
  • the maximum image resolution of the image sensor is preferably defined by a pixel pitch.
  • the pixel pitch is the distance between two immediately adjacent pixels.
  • the pixel pitch is the quotient of the extent of the image sensor in one its directions of extension by the number of pixels in this direction of extent.
  • the pixel pitch is
  • the quotient of the width of the image sensor by the number of pixels in a row of the matrix is, for example, the quotient of the height of the pixel
  • Image sensor by the number of pixels in a column of the matrix.
  • the pixel pitch of the image sensor is at most 6 ym. In other preferred embodiments of the microscope is the
  • Pixel pitch of the image sensor at most 4 ym.
  • the pixel pitch of the image sensor is more preferably 2.0 ym, 1.8 ym, 1.6 ym, 1.4 ym, 1.2 ym, 1.0 ym, 0.8 ym or 0.6 ym.
  • Image sensor is preferably at least 1,000, while at the same time the number of pixels in a row of
  • matrix-shaped image sensor is also at least 1,000.
  • the number of pixels of the image sensor is at least 5 million. In further preferred embodiments of the microscope, the number of pixels of the image sensor is at least 8 million. In other preferred embodiments of the microscope, the number of pixels of the image sensor is at least 20 million. In other preferred embodiments of the microscope, the number of pixels of the image sensor is at least 50 million. For further preferred
  • the number of pixels of the image sensor is at least 100 million.
  • the microscope according to the invention preferably comprises a
  • Actuator of an active optical element with which in particular the focus is adjustable.
  • the actuator of the active optical element is a
  • control unit is preferably also designed to control the actuator.
  • Fig. 1 the recording of an overview image
  • FIG. 1 illustrates the recording of an overview image Ol of a sample 02 (shown in FIG. 2) and several
  • the overview image 01 has a low resolution of 250 line pairs / mm and was recorded with a large field of view, which is equal to the sample 02
  • Has depth information it can be characterized as two-dimensional.
  • Sample 02 (shown in FIG. 2). This subregion of the sample 02 is already shown in the overview image 01. Since the partial area is large, the first microscopic image 04 was taken with a large field of view, which is 2.4 mm -2.4 mm in relation to the sample 02. The first
  • Microscopic image 04 was taken with a high resolution of 1,000 line pairs per mm, so that small details are reproduced.
  • the resolution in the z direction is 4.5 ym. Since the subregion is large, the acquisition of the first microscopic image 04 required a longer period of time, so that it was taken at a low speed of 10 frames / sec. Since the first microscopic image 04 in the In the embodiment shown, if it has no depth information, it can be characterized as two-dimensional.
  • Sample 02 (shown in FIG. 2). This subregion of the sample 02 is already shown in the overview image 01. Since the
  • Partial area is small, the second microscopic image 06 was recorded with a small field of view, which is based on the sample 02 equal to 0.6 mm x 0.6 mm in size.
  • the second microscopic image 06 was taken with a high resolution of 1000 line pairs per mm, so that small details are reproduced.
  • the resolution in the z direction is 4.5 ym. Since the partial area is small, the taking of the second microscopic image 06 required a small period of time, so that it was taken at a high speed of, for example, 30 fps. Since the second microscopic image 06 in the embodiment shown no
  • Has depth information it can be considered two-dimensional
  • microscopic images 03 three-dimensionally image a small portion of the sample 02 (shown in FIG. 2). This
  • the third microscopic image 07 was taken with a small field of view and a small visual volume, which is 0.6 mm -0.6 mm ⁇ 0.45 mm in relation to the sample 02.
  • the third microscopic image 07 was taken with a high resolution of
  • Has depth information it can be characterized as three-dimensional.
  • Sample 02 (shown in FIG. 2) is three-dimensional and mosaic-like. These subregions of the sample 02 are already in
  • the fourth microscopic image 08 was taken with a high resolution of 1,000 line pairs per mm for both sections, so that small details are reproduced.
  • the resolution in the z-direction is 4.5 ym for each of the two small ones
  • Subareas, where the resolution in the z-direction can also vary between the small subregions. While for the first small portion no enlargement of the
  • microscopic images 03 forms a medium sized
  • a small maximum magnification factor of at most 40 and a large numerical aperture are chosen to be a large maximum
  • a small maximum magnification factor of at most 40 and a large numerical aperture are chosen to obtain a large maximum field of view and to minimize the necessary changes in magnification due to the large and rapid variation in focusing when three-dimensional
  • a small pixel pitch is chosen for the image conversion that is small enough so that the chosen numerical aperture and magnification are not subsampled.
  • Image conversion uses a large number of pixels, so the field of view is large.
  • the inventively achievable fast image conversion is synchronized with a varying focus. It can be two-dimensional microscopic
  • three-dimensional microscopic images 03 can be made by a focus variation of> 10 kHz at a velocity of 1 volume / s from a spatial subregion of size
  • Resolution in the x, y and z directions is 5 ym, 5 ym and 170 ym.
  • the spatial resolution in the x, y and z directions is 0.8 ym, 0.9 ym and 170 ym.
  • the spatial resolution in the x, y and z directions is 0.1 ym, 0.1 ym and 0.9 ym.
  • FIG. 2 shows a first preferred embodiment of a digital microscope according to the invention with three alternatively usable options 11, 12, 13 for measuring a digital microscope
  • option 11 is introduced into the beam path. This option 11 can be replaced by one of options 12 or 13. With the digital
  • the sample 02 can be microscoped.
  • the digital microscope includes a transmitted light illumination 14, a
  • the respective option 11; 12; 13 can by a first
  • Coarse Focusing 18 to be postponed.
  • the sample 02 may be replaced by a second
  • the digital microscope further comprises a lens 20 and an image sensor 21, which is arranged differently in the three options 11, 12, 13.
  • the three options 11, 12, 13 differ in particular in the realization of the measurement of a depth information of the sample 02.
  • In the first option 11 is a microsystem 22 with
  • microsystem 22 for measuring a depth information of the sample 02, wherein the microsystem 22 is disposed with the movable micromirrors via a beam splitter 23 back-reflecting.
  • the microsystem 22 also serves for rapid fine focusing including correction of
  • the microsystem 22 is arranged with the movable micromirrors reflecting at an angle of 45 °. Again, the microsystem 22 also serves for rapid fine focusing including correction of aberration.
  • an active optical element 24, such as a mechanical vibration-controllable lens, a liquid lens or a diffractive lens is used to measure a
  • the active optical element 24 also serves for fast fine focusing including a correction of the aberration.
  • a lens 26 is optionally arranged in each case.
  • Speed of the measurement can be increased by a factor between 2 and 100.
  • FIG. 3 shows a second preferred embodiment of the digital microscope according to the invention with three alternatively usable options 31, 32, 33 for the coaxial illumination 17 of the sample 02.
  • the first option 31 for the coaxial illumination 17 is in use.
  • the other options 32, 33 to the coaxial illumination 17 can be introduced instead of the first option 31 in the beam path of the microscope.
  • the microscope again comprises the objective 20 and one of the three diagrammatically illustrated in FIG. 2 and explained above
  • Coaxial illumination 17 each includes a light source 34 and an optional lens 36, which may alternatively be, for example, a mechanical vibration-controllable lens, a liquid lens, or a diffractive lens.
  • the light source 34 may alternatively be, for example, a mechanical vibration-controllable lens, a liquid lens, or a diffractive lens.
  • Coaxial illumination 17 is a microsystem 37 with mechanically movable micromirrors via a beam splitter 38
  • the options 32; 33 allow lighting with the possibility of controlling the
  • the control of the aberration can be made lighting path and / or detection path-specific. This control can be done dynamically or statically depending on the time or on the z-position.
  • the options 31, 32, 33 can be further optical elements
  • Vibrations controllable lens, a liquid lens or a diffractive lens include, whereby, for example, a Intensity, a phase and / or polarization of the light to be generated are controllable.
  • the three options 31, 32, 33 for the coaxial illumination 17 of the sample 02 can alternatively also be designed for transmitted light illumination or for ring illumination.
  • Fig. 4 shows a third and a four preferred
  • Embodiment of the digital microscope according to the invention which in turn the lens 20, the coaxial illumination 17th
  • Focusing elements 41 are optional, a
  • Beam splitter 43 arranged back-reflective to act as an actuator for adjusting the focus.
  • a focus actuator 44 is used to adjust the focus.
  • Another optional lens 46 may be disposed in front of the image sensor 21. 5 shows a flowchart of a preferred embodiment of the method according to the invention. In this embodiment, a microscopic image of a first
  • the parameters include the field of view / viewing volume to be selected, but also, for example
  • the initial image may also be a two-dimensional image with low resolution and a large field of view, a three-dimensional image with low resolution in three dimensions and a large viewing volume.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Mikroskopieren einer Probe mit einem Mikroskop, welches ein Objektiv und einen Bildsensor zum Wandeln eines von dem Objektiv auf den Bildsensor abgebildeten Bildes umfasst. Ein Sichtfeld des Mikroskops ist durch Auswahl eines Abschnittes des Bildsensors veränderbar. Bei einem Schritt des Verfahrens wird ein initiales Bild (01) zumindest eines Teilbereiches der Probe mit dem Mikroskop aufgenommen, wofür ein erstes Sichtfeld am Mikroskop gewählt wird. Das initiale Bild (01) wird analysiert, um zumindest zwei sich unterscheidende teilbereichsabbildende Sichtfelder zu ermitteln, wobei durch jedes der teilbereichsabbildenden Sichtfelder ein Teilbereich des initialen Bildes (01) abgebildet wird. Es werden Bilder (03) der Teilbereiche der Probe für jedes der ermittelten teilbereichsabbildenden Sichtfelder aufgenommen. Im Weiteren betrifft die Erfindung ein Mikroskop zum Mikroskopieren einer Probe.

Description

Mikroskop und Verfahren zum Mikroskopieren einer Probe
Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Verfahren zum
Mikroskopieren einer Probe mit einem Mikroskop, welches ein Objektiv und einen Bildsensor zum Wandeln eines von dem
Objektiv unmittelbar oder mittelbar auf den Bildsensor
abgebildeten Bildes umfasst. Im Weiteren betrifft die
Erfindung ein Mikroskop zum Mikroskopieren einer Probe.
Die DE 197 33 193 AI zeigt ein Mikroskop mit adaptiver Optik. Bei diesem Mikroskop ist zwischen einem Objektiv und einer Tubuslinse ein transmittierender Wellenfrontmodulator
angeordnet. Das Mikroskop kann für eine konfokale Mikroskopie, für eine lasergestützte Mikroskopie, für eine konventionelle Mikroskopie oder für eine analytische Mikroskopie verwendet werden . Aus der US 7,345,816 B2 ist ein optisches Mikroskop bekannt, welches einen Spiegel mit einer steuerbar veränderlichen reflektierenden Oberfläche umfasst. Durch eine Veränderung der Oberfläche des Spiegels können Bilder aus unterschiedlichen fokalen Positionen aufgenommen werden.
Die US 7,269,344 B2 zeigt eine optische Vorrichtung mit einem abbildenden optischen System, welches verformbare Spiegel und eine digitale Zoom-Funktion besitzt. Hierdurch soll die elektronische Vergrößerung bei hoher Bildschärfe veränderbar sein.
Das Produkt „3D Microscope" des Herstellers SD Optics dient der schnellen Erzeugung von makroskopischen und mikroskopischen Bildern, welche eine erweiterte Schärfentiefe (EDoF - Extended Depth of Field) besitzen. Zur Realisierung der EDoF-Funktionalität dient ein als MALS-Modul bezeichnetes Spiegel-Array-Linsensystem. MALS steht für Mirror Array Lens System. Details dieses Systems sind beispielsweise in der
WO 2005/119331 AI oder WO 2007/134264 A2 offenbart. Das
Produkt umfasst u. a. eine LED-Ringbeleuchtung, eine
Koaxialbeleuchtung, eine Durchlichtbeleuchtung, einen
Kreuztisch, Objektive mit 5-, 10-, 20- und 50-facher
Vergrößerung und eine schnelle automatische Fokussierung. Die
Fokussierung kann mit einer Frequenz von bis zu 10 kHz verändert werden.
DE 698 38 297 T2 zeigt ein Verfahren zum Erfassen und
Wiederherstellen von vergrößerten Probebildern durch ein rechnergesteuertes Mikroskop. Bei der Aufnahme eines ersten Satzes digitalisierter Bilder von einer Probe werden
Objekttischbewegungen und Bildgrößen so gesteuert, dass ein erster Satz zusammenhängender Bildscheiben erzeugt werden kann, um eine vergrößerte Gesamtansicht der Probe zu
ermöglichen. Die Gesamtansicht der Probe wird angezeigt, damit ein Benutzer ein ihn interessierendes Gebiet interaktiv auswählen kann. Entsprechend wird das Gebiet mit einer höheren optischen Auflösung gescannt und ein zweiter Satz
digitalisierter Bilder erzeugt.
Aus der US 2006/0140462 AI ist ein Verfahren zur konfokalen Aufnahme bekannt, bei welchem ein örtlich gezieltes Auslesen von CMOS-Bildsensoren in interessierenden Regionen erfolgt.
Die EP 1 918 751 AI lehrt ein Mikroskop, welches die Aufnahme dreidimensionaler Bilder und hochauflösender Bilder mit verschiedenen Fokuspositionen ermöglichen soll. Die DE 10 2013 208 415 AI zeigt ein Verfahren zur 3D- hochauflösenden Lokalisierungsmikroskopie, die eine Probe in einer Tiefenrichtung und quer dazu hochauflösend abbilden soll. In der Probe werden wiederholt Fluoreszenzemitter zur
Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt. Mit zwei Detektoren wird ein Einzelbild in Form von simultanen Einzelbildpaaren desselben Fluoreszenzzustandes der Probe aus zwei
verschiedenen Fokusebenen, die in Tiefenrichtung um einen Abstand beabstandet sind, aufgenommen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht ausgehend vom Stand der Technik darin, das Mikrokopieren einer Probe
flexibel und schnell vornehmen zu können.
Die genannte Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß dem beigefügten Anspruch 1 sowie durch ein Mikroskop gemäß dem beigefügten nebengeordneten Anspruch 13. Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Mikroskopieren einer
Probe mit einem Mikroskop, insbesondere mit einem digitalen Mikroskop. In dem digitalen Mikroskop erfolgt bevorzugt eine elektronische Bildwandlung, wobei das aufgenommene Bild in Form von digitalen Daten weiterverarbeitet und zur Anzeige auf einer elektronischen Bildwiedergabeeinrichtung gebracht wird.
Das Mikroskop umfasst ein Objektiv und einen Bildsensor zum Wandeln eines von dem Objektiv auf den Bildsensor unmittelbar oder mittelbar abgebildeten Bildes. Ein bildsensorseitiges Sichtfeld des Mikroskops ist durch
Auswahl eines Abschnittes des Bildsensors variierbar. Folglich wird zum Erzielen eines bestimmten Sichtfeldes des Mikroskops ein bestimmter Abschnitt des Bildsensors ausgewählt und ausgelesen. Für ein kleines Sichtfeld wird nur ein kleiner Abschnitt benötigt. Für ein maximales Sichtfeld umfasst der Abschnitt den gesamten Bildsensor. Der Abschnitt ist durch diejenigen Pixel des Bildsensors definiert, die sich innerhalb des Abschnittes befinden, wobei einige oder alle Pixel
gruppiert sein können. Der Abschnitt ist also durch einen Ort und eine Fläche definiert. Das Sichtfeld wird englisch auch als Field-of-View bezeichnet und ist insbesondere durch einen bildsensorseitigen Öffnungswinkel des Mikroskops
charakterisiert. Das Sichtfeld des Mikroskops ist veränderbar, sodass der bildsensorseitige Öffnungswinkel veränderbar, d. h. einstellbar ist. Das Objektiv für sich kann ein festes
Sichtfeld aufweisen. Das bildsensorseitige Sichtfeld ist durch eine zumindest zweidimensionale Ausdehnung definiert, wobei auch eine
dreidimensionale Ausdehnung definiert sein kann, sodass nicht lediglich das Sichtfeld, sondern auch ein Sichtvolumen am Mikroskop variierbar ist.
In einem Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein initiales Bild zumindest eines Teilbereiches der Probe mit dem Mikroskop aufgenommen. Das Bild umfasst zumindest den
genannten Teilbereich, einen Hauptbereich der Probe oder die gesamte Probe. Zur Aufnahme des initialen Bildes wird am
Mikroskop ein erstes bildsensorseitiges Sichtfeld gewählt. D. h. ein erster Abschnitt des Bildsensors wird ausgewählt und ausgelesen. Das erste Sichtfeld kann auch innerhalb eines ersten Sichtvolumens gegeben sein, welches ausgewählt wird. Das initiale Bild kann zweidimensional oder dreidimensional sein . Dreidimensionale Bilder umfassen für jeden Punkt im Raum
Informationen über das darzustellende Objekt. Beispielsweise können in einem orthogonalen Koordinatensystem mit X-, Y- und Z-Achse für jeden Punkt im Raum Intensitätswerte und oder Farbwerte angegeben werden.
Es gibt auch Bilder, in denen beispielsweise für jedes Paar von X- und Y-Koordinaten nur ein Z-Wert bekannt ist. Dies ist beispielsweise der Fall, wenn nur die Form der Oberfläche eines dreidimensionalen Körpers bekannt ist. Es können auch zu den X- und Y-Koordinaten eines Punktes als „dritte Dimension" Intensitätswerte gewählt werden. Diese und weitere Fälle, die die Darstellung von Bildern mit einer dreidimensionalen
Illusion ermöglichen, werden auch als pseudo-dreidimensionale oder als 2 , 5-dimensional Bilder bzw. Darstellungen bezeichnet.
Im Folgenden werden Bilder die eine dreidimensionale
Darstellung oder die die Darstellung von Bildern mit einer dreidimensionalen Illusion ermöglichen gemeinsam als
dreidimensionale Bilder bezeichnet.
In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das initiale Bild analysiert, um mindestens zwei sich unterscheidende teilbereichsabbildende bildsensorseitige
Sichtfelder zum Aufnehmen von mikroskopischen Bildern von zumindest mehreren Teilbereichen der Probe zu ermitteln. Das Analysieren kann manuell oder automatisch erfolgen. Durch das Analysieren werden die teilbereichsabbildenden Sichtfelder ermittelt, sodass mehrere Abschnitte des Bildsensors ermittelt werden, die geeignet sind, die mikroskopischen Bilder der mehreren Teilbereiche der Probe aufzunehmen. Durch jedes der teilbereichsabbildenden Sichtfelder wird ein Teilbereich des initialen Bildes abgebildet. Bevorzugt wird für jeden der Teilbereiche jeweils ein teilbereichsabbildendes Sichtfeld bestimmt, sodass jeder der Teilbereiche mit einem individuell geeigneten teilbereichsabbildenden Sichtfeld effizient
mikroskopiert werden kann. Die teilbereichsabbildenden
Sichtfelder unterscheiden sich in ihrer Position bezogen auf den Bildsensor in einer x- und/oder y-Richtung. Die
teilbereichsabbildenden Sichtfelder unterscheiden sich
bevorzugt auch in ihrer Größe und/oder Auflösung. Die
teilbereichsabbildenden Sichtfelder können auch jeweils innerhalb von teilbereichsabbildenden Sichtvolumina gegeben sein, welche ausgewählt werden. Entsprechend sind die
zugehörigen mikroskopischen Bilder nicht lediglich
zweidimensional, sondern können auch dreidimensional sein. Die teilbereichsabbildenden Sichtfelder bzw. Sichtvolumina
unterscheiden sich bevorzugt auch in ihrer Position in der zur x-Richtung und y-Richtung senkrechten z-Richtung. Die
teilbereichsabbildenden Sichtfelder bzw. Sichtvolumina
unterscheiden sich bevorzugt auch in ihrer Größe in der z- Richtung und/oder Auflösung in der z-Richtung.
In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die mikroskopischen Bilder der mehreren Teilbereiche der Probe mit dem Mikroskop aufgenommen, wofür jeweils das zuvor bestimmte teilbereichsabbildende Sichtfeld am Mikroskop gewählt wird, d. h. dass der jeweils zuvor bestimmte Abschnitt des Bildsensors ausgewählt und ausgelesen wird.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass durch das Bestimmen der
teilbereichsabbildenden Sichtfelder die Teilbereiche angepasst mikroskopiert werden können, sodass das Mikroskopieren der gesamten Probe schnell erfolgen kann, ohne Beeinträchtigungen der Qualität der mikroskopischen Bilder in Kauf nehmen zu müssen. Insbesondere können die Teilbereiche der Probe je nach Detailreichtum der einzelnen Teilbereiche mit angepassten teilbereichsabbildenden Sichtfeldern und Auflösungen
mikroskopiert werden. Insofern die Teilbereiche
dreidimensional aufgenommen werden, so wird bei den
teilbereichsabbildenden Sichtfeldern bevorzugt auch jeweils die Auflösung in der dritten Dimension angepasst.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur schnellen Aufnahme zwei- und/oder dreidimensionaler mikroskopischer Bilder von großen Proben verwendet werden. Somit wird das Verfahren bevorzugt zur Inline-Prüfung in der Elektronikindustrie, in der Partikelanalyse, von nicht-metallischen Einschlüssen, in der generativen Fertigung, in der Pharmaindustrie und bei der Herstellung medizinischer Geräte angewendet.
Das initiale Bild und die Bilder der Teilbereiche werden bevorzugt mit dem genau einen Objektiv aufgenommen, sodass das Objektiv während der Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens nicht gewechselt wird. Alternativ kann das initiale
Bild mit einem anderen Objektiv oder mit einer anderen
optischen Bildaufnahmeeinrichtung des Mikroskops aufgenommen werden. Die Bildaufnahmeeinrichtung kann beispielsweise durch eine Übersichtskamera oder durch eine Kamera für zwei- oder dreidimensionale Bilder gebildet sein.
Bei einer ersten bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens wird das initiale Bild als ein Überblicksbild der Probe aufgenommen. Das Überblicksbild zeigt bevorzugt zumindest einen Hauptbereich der Probe, der
bevorzugt zumindest die Hälfte der Probe umfasst. Das
Überblicksbild zeigt besonders bevorzugt die gesamte Probe. Zum Aufnehmen des Überblicksbildes wird das erste Sichtfeld als ein überblickabbildendes Sichtfeld gewählt, welches größer als alle teilbereichsabbildenden Sichtfelder ist. Das
überblickabbildende Sichtfeld weist einen großen
probenseitigen Öffnungswinkel auf. Die mikroskopischen Bilder der Teilbereiche werden falls notwendig mit einer feineren
Auflösung als das initiale Überblicksbild aufgenommen. Die feinere Auflösung kann in der x-, y- und/oder z-Richtung ausgebildet sein. Bei der Aufnahme des Überblicksbildes mit der gröberen Auflösung werden nicht alle Pixel des Bildsensors im ausgewählten Abschnitt ausgelesen, sondern beispielsweise nur jedes dritte Pixel, oder die Pixel werden gruppiert. Auch kann beispielweise die Auflösung in der z-Richtung durch größere Schritte in die z-Richtung verringert werden, sodass die Aufnahme des Überblicksbildes schneller erfolgt.
Alternativ kann das initiale Bild mit einer anderen optischen
Bildaufnahmeeinrichtung, wie beispielsweise eine
Übersichtskamera, aufgenommen werden.
Bei der ersten bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens werden beim Analysieren des initialen Überblicksbild bevorzugt die einzelnen im initialen Überblicksbild abgebildeten Teilbereiche analysiert, um jeweils eine zum Mikroskopieren des jeweiligen Teilbereiches notwendige Auflösung in zumindest zwei oder in drei
Dimensionen zu bestimmen. Hierzu werden die im Überblicksbild abgebildeten Teilbereiche bevorzugt hinsichtlich ihres
Detailreichtums analysiert. Je detailreicher der jeweilige Teilbereich ist, desto höher ist die notwendige Auflösung zum Aufnehmen des mikroskopischen Bildes dieses Teilbereiches. Das Auswählen der einzelnen teilbereichsabbildenden Sichtfelder erfolgt entsprechend der zuvor bestimmten jeweiligen
notwendigen Auflösung. Je niedriger die notwendige Auflösung ist, desto größer kann das jeweilige teilbereichsabbildende Sichtfeld bzw. Sichtvolumen gewählt werden, um das jeweilige Bild effizient aufzunehmen, wofür insbesondere nicht alle Pixel des Bildsensors im ausgewählten Abschnitt ausgelesen werden oder jeweils mehrere Pixel im ausgewählten Abschnitt zusammengefasst ausgelesen werden oder eine Unterabtastung der
Pixel im ausgewählten Abschnitt erfolgt.
Bei der ersten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird dieses bevorzugt rekursiv durchgeführt. Hierfür wird zumindest eines der mikroskopischen Bilder der Teilbereiche analysiert, um mindestens ein subteilbereichsabbildendes Sichtfeld zum Aufnehmen von mikroskopischen Bildern von zumindest mehreren Subteilbereichen der Probe zu bestimmen. Die
subteilbereichsabbildenden Sichtfelder sind bevorzugt kleiner als das jeweilige teilbereichsabbildende Sichtfeld. Es werden mikroskopische Bilder der mehreren Subteilbereiche der Probe mit dem Mikroskop aufgenommen, wofür jeweils das zuvor
bestimmte subteilbereichsabbildende Sichtfeld am Mikroskop gewählt wird. Die mikroskopischen Bilder der Subteilbereiche werden mit einer feineren Auflösung in einer oder mehreren
Dimensionen als der jeweilige Teilbereich aufgenommen. Es erfolgt bevorzugt eine rekursive Fortsetzung für
Subsubteilbereiche usw. Bei einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird das initiale Bild als ein mikroskopisches Bild eines ersten der Teilbereiche der Probe aufgenommen. Hierfür wird das erste Sichtfeld als ein teilbereichsabbildendes Sichtfeld gewählt. Die teilbereichsabbildenden Sichtfelder zum Aufnehmen der mikroskopischen Bilder der weiteren Teilbereiche der Probe werden somit ausgehend von der Analyse des Bildes des ersten Teilbereiches der Probe gewählt. Ergänzend kann jeweils eine Analyse der einzelnen mikroskopischen Bilder der weiteren Teilbereiche erfolgen, um die einzelnen
teilbereichsabbildenden Sichtfelder zum Aufnehmen der
mikroskopischen Bilder der jeweils folgenden weiteren
Teilbereiche der Probe zu wählen. Es können mikroskopische Bilder für sämtliche Teilbereiche der Probe aufgenommen werden oder es können mikroskopische Bilder für nur einige der
Teilbereiche der Probe aufgenommen werden.
Nachfolgend werden weitere bevorzugte Merkmale für die oben beschriebene erste und zweite bevorzugte Ausführungsform angegeben .
Das initiale Bild und/oder zumindest mehrere der Bilder der Teilbereiche werden bevorzugt mit einer erweiterten
Schärfentiefe aufgenommen. Die erweiterte Schärfentiefe wird auch als Extended Depth of Field bezeichnet. Das jeweilige Bild mit der erweiterten Schärfentiefe kann zwei- oder
dreidimensional sein. Zur Aufnahme des initialen Bildes bzw. des mikroskopischen Bildes mit der erweiterten Schärfentiefe werden bevorzugt mehrere Einzelbilder mit unterschiedlichen z-Positionen aufgenommen. Die Einzelbilder werden anschließend zu dem initialen Bild bzw. zu dem mikroskopischen Bild
überblendet . Das initiale Bild und/oder zumindest mehrere der
mikroskopischen Bilder werden bevorzugt zusätzlich mit einer Tiefeninformation aufgenommen, sodass es sich bevorzugt um dreidimensionale Bilder handelt. Zum Aufnehmen des initialen Bildes bzw. der mikroskopischen
Bilder mit einer erweiterten Schärfentiefe bzw. zusätzlich mit einer Tiefeninformation wird bevorzugt ein Aktuator an einem aktiven optischen Element des Mikroskops gestellt. Der mechanische Aktuator kann beispielsweise dazu ausgebildet sein, das aktive optische Element, welches durch eine flexible Linse, eine durch mechanische Schwingungen steuerbare Linse, eine flüssige Linse oder eine diffraktive Linse zur Messung einer Tiefeninformation der Probe gebildet sein kann, zu verformen bzw. zu verschieben. Bevorzugt ist der Aktuator durch ein Mikrosystem zum mechanischen Bewegen von
Mikrospiegeln und/oder Mikrolinsen gebildet. Bei dem Aktuator handelt es sich bevorzugt um einen Fokusaktuator und/oder um einen Aberrationsaktuator . Der Aktuator wird bevorzugt mit einer Frequenz von mindestens 1 kHz und weiter bevorzugt von mindestens 10 kHz betrieben.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist der optische
Aktuator als ein Mikrosystem mit mechanisch beweglichen
Mikrospiegeln zur Aufnahme einer erweiterten Schärfentiefe ausgebildet. In dieser Ausführungsform kann beispielsweise das oben beschriebene „MALS-Modul" der Firma SD Optics Inc. als optischer Aktuator Verwendung finden. Ein MALS-Modul kann beispielsweise als Fresnel-Linse ausgebildet sein, wie dies beispielsweise in der WO 2005/119331 AI beschrieben ist. Diese Fresnel-Linse wird aus einer Vielzahl von Mikrospiegeln gebildet. Durch eine Veränderung der Lage der Mikrospiegel kann auf sehr schnelle Weise die Brennweite der Fresnel-Linse verändert werden. Diese schnelle Veränderung der Brennweite erlaubt eine sehr schnelle Einstellung der abzubildenden
Fokusebene. So wird es ermöglicht, in kurzer Zeit eine
Vielzahl von Aufnahmen in benachbarten Fokusebenen
aufzunehmen. Eine derartige Folge von Bildern, welche in unterschiedlichen Fokusebenen aufgenommen wurden, wird auch als Fokus-Stapel bezeichnet. Aus einem Fokus-Stapel kann ein Bild mit erweiterter Schärfentiefe ermittelt werden. Die mikroskopischen Bilder der Teilbereiche sind auch als Kacheln zu bezeichnen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit zur Mikroskopie großer Proben wie beispielsweise eine Leiterplatte geeignet. Die aufgenommenen mikroskopischen
Bilder der Teilbereiche werden bevorzugt zu einem Gesamtbild der Probe zusammengefügt.
Bevorzugt wird jeweils ein teilbereichsabbildendes Sichtfeld für jeden der Teilbereiche bestimmt und zur Aufnahme des entsprechenden Bildes verwendet. Somit wird für jeden der
Teilbereiche ein angepasstes teilbereichsabbildendes Sichtfeld mit angepasster Auflösung bestimmt und verwendet.
Besonders bevorzugt werden neben dem Sichtfeld weitere
Parameter des Mikroskops zur Aufnahme der mikroskopischen
Bilder der Teilbereiche der Probe angepasst. Die weiteren Parameter des Mikroskops werden im Ergebnis der Analyse des initialen Bildes bestimmt und beim Aufnehmen der
mikroskopischen Bilder der Teilbereiche am Mikroskop gewählt. Die weiteren Parameter des Mikroskops umfassen bevorzugt eine zwei- oder dreidimensionale Auflösung des jeweils
aufzunehmenden mikroskopischen Bildes, ein Sichtvolumen zum Aufnehmen des jeweils aufzunehmenden dreidimensionalen
mikroskopischen Bildes, einen Kontrast zum Aufnehmen des jeweils aufzunehmenden mikroskopischen Bildes, Parameter zur
Aberrationssteuerung, die Option einer erweiterten
Schärfentiefe, die Option einer Tiefeninformation und/oder Parameter zum Stellen des Aktuators des aktiven optischen Elementes. Entsprechend erfolgt das Analysieren des initialen Bildes, um weiterhin eine zwei- oder dreidimensionale
Auflösung der aufzunehmenden mikroskopischen Bilder zu
bestimmen, ein Sichtvolumen zum Aufnehmen der
dreidimensionalen mikroskopischen Bilder zu bestimmen, einen Kontrast zum Aufnehmen der mikroskopischen Bilder zu bestimmen, Parameter zur Aberrationssteuerung zu bestimmen, Parameter zum Stellen des Aktuators des aktiven optischen Elementes zu bestimmen und/oder um zu entscheiden, ob die mikroskopischen Bilder jeweils mit einer erweiterten
Schärfentiefe und/oder mit einer Tiefeninformation aufgenommen werden. Anschließend werden die mikroskopischen Bilder der mehreren Teilbereiche jeweils mit der zuvor bestimmten zwei- oder dreidimensionalen Auflösung, mit dem zuvor bestimmten Sichtvolumen, mit dem zuvor bestimmten Kontrast, mit den zuvor bestimmen Parametern zur Aberrationssteuerung mit den zuvor bestimmen Parametern zum Stellen des Aktuators, mit einer erweiterten Schärfentiefe und/oder mit einer Tiefeninformation aufgenommen .
Die teilbereichsabbildenden Sichtfelder weisen bevorzugt jeweils einen probenseitigen Öffnungswinkel von höchstens 140° auf. Das überblickabbildende Sichtfeld weist bevorzugt einen probenseitigen Öffnungswinkel von mindestens 1° und weiter bevorzugt mindestens 5° auf.
Die teilbereichsabbildenden Sichtfelder weisen bezogen auf die Probe eine Kantenlänge oder einen Durchmesser von bevorzugt höchstens 5 mm, weiter bevorzugt höchstens 2 mm auf. Das überblickabbildende Sichtfeld weist bezogen auf die Probe eine
Kantenlänge oder einen Durchmesser von bevorzugt mehr als 5 mm auf .
Die mikroskopischen Bilder der Teilbereiche werden bevorzugt jeweils mit einer Auflösung von mindestens 500 Linienpaaren/mm aufgenommen. Die mikroskopischen Bilder der Teilbereiche werden bevorzugt jeweils mit einer Auflösung von mindestens 0,3 ym bezogen auf die Probe aufgenommen. Das initiale Überblicksbild wird bevorzugt mit einer Auflösung von
höchstens 400 Linienpaaren/mm aufgenommen. Das initiale
Überblicksbild wird bevorzugt mit einer Auflösung von
höchstens 2 ym bezogen auf die Probe aufgenommen. Das initiale Überblicksbild wird weiter bevorzugt mit einer Auflösung von höchstens 10 ym bezogen auf die Probe aufgenommen.
Die Probe wird während der Aufnahme des initialen Bildes und während der Aufnahme der mikroskopischen Bilder bevorzugt beleuchtet, wofür bevorzugt sichtbares Licht, UV-Strahlung und/oder IR-Strahlung verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Mikroskop ist bevorzugt digital und umfasst zunächst ein Objektiv zum vergrößerten optischen
Abbilden einer Probe in einer Bildebene. Durch das Objektiv ist ein Bild mit einer optischen Auflösung in der Bildebene darstellbar. Die optische Auflösung ist durch die
physikalischen Vorgänge und die Eigenschaften des Objektivs bestimmt. Das Objektiv umfasst optische Komponenten zum vergrößerten optischen Abbilden der Probe in der Bildebene.
Die optischen Komponenten sind insbesondere durch optische Linsen und ggf. auch durch eine oder mehrere Spiegel, Blenden und Filter gebildet. Das Mikroskop umfasst weiterhin einen Bildsensor zum Wandeln des von dem Objektiv unmittelbar oder mittelbar auf den
Bildsensor abgebildeten Bildes in ein elektrisches Signal. Ein bildsensorseitiges Sichtfeld des Mikroskops ist durch Auswahl eines Abschnittes des Bildsensors variierbar.
Das Mikroskop umfasst weiterhin eine elektronische
Steuereinheit zum Steuern des Bildsensors. Die Steuereinheit dient bevorzugt weiterhin zum Steuern einer die Bilddaten des Bildsensors verarbeitenden Bildverarbeitungseinheit. Die
Steuereinheit ist zur Ausführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens konfiguriert. Die Steuereinheit ist bevorzugt zur Ausführung bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens konfiguriert. Im Übrigen weist das Mikroskop bevorzugt auch Merkmale auf, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dessen bevorzugten
Ausführungsformen angegeben sind. Auch das erfindungsgemäße Verfahren weist bevorzugt Merkmale auf, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop und dessen bevorzugten
Ausführungsformen angegeben sind.
Bevorzugt weist das Objektiv einen maximalen
Vergrößerungsfaktor von höchstens 40 auf. Insofern das
Objektiv einen festen Vergrößerungsfaktor aufweist, so stellt dieser auch den maximalen Vergrößerungsfaktor dar. Bei bevorzugten Ausführungsformen des Mikroskops ist der maximale Vergrößerungsfaktor höchstens 30. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen des Mikroskops ist der maximale
Vergrößerungsfaktor höchstens 20. Bei weiteren bevorzugten
Ausführungsformen des Mikroskops ist der maximale
Vergrößerungsfaktor höchstens 10. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen des Mikroskops ist der maximale
Vergrößerungsfaktor höchstens 5.
Das Objektiv weist eine numerische Apertur auf, die bevorzugt mindestens 0,01 beträgt. Die numerische Apertur beträgt weiter bevorzugt mindestens 0,1. Die maximale Bildauflösung des Bildsensors ist bevorzugt durch einen Pixelabstand definiert. Der Pixelabstand ist der Abstand zweier unmittelbar benachbarter Pixel. Der Pixelabstand ist der Quotient aus der Ausdehnung des Bildsensors in einer seiner Erstreckungsrichtungen durch die Anzahl der Pixel in dieser Erstreckungsrichtung . Der Pixelabstand ist
beispielsweise der Quotient aus der Breite des Bildsensors durch die Anzahl der Pixel in einer Zeile der Matrix. Der Pixelabstand ist beispielsweise der Quotient aus der Höhe des
Bildsensors durch die Anzahl der Pixel in einer Spalte der Matrix .
Bei bevorzugten Ausführungsformen des Mikroskops beträgt der Pixelabstand des Bildsensors höchstens 6 ym. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen des Mikroskops beträgt der
Pixelabstand des Bildsensors höchstens 4 ym. Der Pixelabstand des Bildsensors beträgt besonders bevorzugt 2,0 ym, 1,8 ym, 1,6 ym, 1,4 ym, 1,2 ym, 1,0 ym, 0,8 ym oder 0,6 ym.
Die Anzahl der Pixel in einer Spalte des matrixförmigen
Bildsensors beträgt bevorzugt mindestens 1.000, während gleichzeitig die Anzahl der Pixel in einer Zeile des
matrixförmigen Bildsensors ebenfalls mindestens 1.000 beträgt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen des Mikroskops beträgt die Anzahl der Pixel des Bildsensors mindestens 5 Millionen. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen des Mikroskops beträgt die Anzahl der Pixel des Bildsensors mindestens 8 Millionen. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen des Mikroskops beträgt die Anzahl der Pixel des Bildsensors mindestens 20 Millionen. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen des Mikroskops beträgt die Anzahl der Pixel des Bildsensors mindestens 50 Millionen. Bei weiteren bevorzugten
Ausführungsformen des Mikroskops beträgt die Anzahl der Pixel des Bildsensors mindestens 100 Millionen. Das erfindungsgemäße Mikroskop umfasst bevorzugt einen
Aktuator eines aktiven optischen Elementes, mit welchem insbesondere die Fokussierung verstellbar ist. Bevorzugt ist der Aktuator des aktiven optischen Elementes durch ein
Mikrosystem zum mechanischen Bewegen von Mikrospiegeln
und/oder Mikrolinsen gebildet. Die Steuereinheit ist bevorzugt auch zum Steuern des Aktuators ausgebildet.
Weitere Einzelheiten und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter
Ausführungsformen der Erfindung, unter Bezugnahme auf die Zeichnung. Es zeigen:
Fig. 1: die Aufnahme eines Überblicksbildes und
mikroskopischer Bilder von Teilbereichen gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ;
Fig. 2: eine erste bevorzugte Ausführungsform eines
erfindungsgemäßen digitalen Mikroskops mit drei Optionen zur Messung einer Tiefeninformation; eine zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen digitalen Mikroskops mit drei Optionen zur Beleuchtung; eine dritte und eine viere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen digitalen Mikroskops; und einen Ablaufplan einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Fig. 1 veranschaulicht die Aufnahme eines Überblicksbildes Ol einer Probe 02 (gezeigt in Fig. 2) und mehrerer
mikroskopischer Bilder 03 von Teilbereichen der Probe 02 gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens .
Das Überblicksbild 01 weist eine geringe Auflösung von 250 Linienpaaren/mm auf und wurde mit einem großen Sichtfeld aufgenommen, welches bezogen auf die Probe 02 gleich
3,6 mm -3,6 mm groß ist. Die Auflösung in die z-Richtung beträgt 100 ym. Da das Überblicksbild 01 die gesamte Probe 02 (gezeigt in Fig. 2) abbildet, erforderte seine Aufnahme einen längeren Zeitraum, sodass es mit einer geringen
Geschwindigkeit von 10 Bildern/s aufgenommen wurde. Da das Überblicksbild 01 in der gezeigten Ausführungsform keine
Tiefeninformation besitzt, kann es als zweidimensional charakterisiert werden.
Ein erstes mikroskopisches Bild 04 der mehreren
mikroskopischen Bilder 03 bildet einen großen Teilbereich der
Probe 02 (gezeigt in Fig. 2) ab. Dieser Teilbereich der Probe 02 ist im bereits im Überblicksbild 01 abgebildet. Da der Teilbereich groß ist, wurde das erste mikroskopische Bild 04 mit einem großen Sichtfeld aufgenommen, welches bezogen auf die Probe 02 gleich 2,4 mm -2,4 mm groß ist. Das erste
mikroskopische Bild 04 wurde mit einer hohen Auflösung von 1.000 Linienpaaren je mm aufgenommen, sodass kleine Details wiedergegeben werden. Die Auflösung in die z-Richtung beträgt 4,5 ym. Da der Teilbereich groß ist, erforderte die Aufnahme des ersten mikroskopischen Bildes 04 einen längeren Zeitraum, sodass es mit einer geringen Geschwindigkeit von 10 Bildern/s aufgenommen wurde. Da das erste mikroskopische Bild 04 in der gezeigten Ausführungsform keine Tiefeninformation besitzt, kann es als zweidimensional charakterisiert werden.
Ein zweites mikroskopisches Bild 06 der mehreren
mikroskopischen Bilder 03 bildet einen kleinen Teilbereich der
Probe 02 (gezeigt in Fig. 2) ab. Dieser Teilbereich der Probe 02 ist bereits im Überblicksbild 01 abgebildet. Da der
Teilbereich klein ist, wurde das zweite mikroskopische Bild 06 mit einem kleinen Sichtfeld aufgenommen, welches bezogen auf die Probe 02 gleich 0,6 mm · 0,6 mm groß ist. Das zweite mikroskopische Bild 06 wurde mit einer hohen Auflösung von 1.000 Linienpaaren je mm aufgenommen, sodass kleine Details wiedergegeben werden. Die Auflösung in die z-Richtung beträgt 4,5 ym. Da der Teilbereich klein ist, erforderte die Aufnahme des zweiten mikroskopischen Bildes 06 einen kleinen Zeitraum, sodass es mit einer hohen Geschwindigkeit von beispielsweise 30 Bildern/s aufgenommen wurde. Da das zweite mikroskopische Bild 06 in der gezeigten Ausführungsform keine
Tiefeninformation besitzt, kann es als zweidimensional
charakterisiert werden.
Ein drittes mikroskopisches Bild 07 der mehreren
mikroskopischen Bilder 03 bildet einen kleinen Teilbereich der Probe 02 (gezeigt in Fig. 2) dreidimensional ab. Dieser
Teilbereich der Probe 02 ist bereits im Überblicksbild 01 abgebildet. Da der Teilbereich klein ist, wurde das dritte mikroskopische Bild 07 mit einem kleinen Sichtfeld und einem kleinen Sichtvolumen aufgenommen, welches bezogen auf die Probe 02 gleich 0,6 mm -0,6 mm · 0,45 mm groß ist. Das dritte mikroskopische Bild 07 wurde mit einer hohen Auflösung von
1.000 Linienpaaren je mm aufgenommen, sodass kleine Details wiedergegeben werden. Die Auflösung in die z-Richtung beträgt 4,5 ym. Es erfolgte keine Vergrößerung des Sichtfeldes in die z-Richtung. Da der Teilbereich klein ist, erforderte die
Aufnahme des dritten mikroskopischen Bildes 07 einen kleinen Zeitraum, sodass es mit einer hohen Geschwindigkeit von mehr als 1 Volumen/s aufgenommen wurde. Da das dritte
mikroskopische Bild 07 in der gezeigten Ausführungsform eine
Tiefeninformation besitzt, kann es als dreidimensional charakterisiert werden.
Ein viertes mikroskopisches Bild 08 der mehreren
mikroskopischen Bilder 03 bildet zwei kleine Teilbereiche der
Probe 02 (gezeigt in Fig. 2) dreidimensional und mosaikartig ab. Diese Teilbereiche der Probe 02 sind bereits im
Überblicksbild 01 abgebildet. Die zwei kleinen Teilbereiche wurden mit größeren Sichtfeldern aufgenommen, welche bezogen auf die Probe 02 gleich 0,6 mm -0,6 mm · 0,45 mm bzw. gleich
0,6 mm -0,6 mm · 0,6 mm groß sind. Das vierte mikroskopische Bild 08 wurde mit einer hohen Auflösung von jeweils 1.000 Linienpaaren je mm für beide Teilbereiche aufgenommen, sodass kleine Details wiedergegeben werden. Die Auflösung in die z-Richtung beträgt jeweils 4,5 ym für die beiden kleinen
Teilbereiche, wobei die Auflösung in die z-Richtung auch zwischen den kleinen Teilbereichen variieren kann. Während für den ersten kleinen Teilbereich keine Vergrößerung des
Sichtfeldes in die z-Richtung erfolgt, wird für den zweiten kleinen Teilbereich eine Vergrößerung des Sichtfeldes in die z-Richtung vorgenommen. Da mehrere Teilbereiche abgebildet werden, erforderte die Aufnahme des vierten mikroskopischen Bildes 08 einen größeren Zeitraum, sodass es mit einer kleinen Geschwindigkeit von jeweils weniger als 1 Volumen/s für die beiden kleinen Teilbereiche aufgenommen wird. Da das vierte mikroskopische Bild 08 in der gezeigten Ausführungsform eine Tiefeninformation besitzt, kann es als dreidimensional charakterisiert werden. Ein fünftes mikroskopisches Bild 09 der mehreren
mikroskopischen Bilder 03 bildet einen mittelgroßen
Teilbereich der Probe 02 (gezeigt in Fig. 2) dreidimensional ab. Dieser Teilbereich der Probe 02 ist bereits im
Überblicksbild 01 abgebildet. Da der Teilbereich mittelgroß ist, wurde das fünfte mikroskopische Bild 09 mit einem
größeren Sichtfeld aufgenommen, welches bezogen auf die Probe 02 gleich 1,2 mm · 1,2 mm · 1 mm groß ist. Das fünfte
mikroskopische Bild 09 wird mit einer geringen Auflösung von
500 Linienpaaren je mm aufgenommen, sodass diese Aufnahme nur einen kleinen Zeitraum erdordert, was zu einer hohen
Geschwindigkeit der Aufnahme von mehr als 1 Volumen/s führt. Die Auflösung in die z-Richtung beträgt 45 ym. Es erfolgt eine Vergrößerung des Sichtfeldes in die z-Richtung. Da das fünfte mikroskopische Bild 09 in der gezeigten Ausführungsform eine Tiefeninformation besitzt, kann es als dreidimensional
charakterisiert werden. Die verschiedenen Charakteristika der Aufnahmen des
Überblicksbildes 01, des ersten mikroskopischen Bildes 04, des zweiten mikroskopischen Bildes 06, des dritten mikroskopischen Bildes 07, des vierten mikroskopischen Bildes 08 und des fünften mikroskopischen Bildes 09 sind vergleichend in Tabelle 1 dargestellt.
Bild 2D Be¬ Auf¬ Ge¬ Sichtfeld Auf¬ Ver-
/ schrei¬ lösung schwinlö¬ grö .
3D bung digkeit sung in z in z
Über2D Einzel , 250 10 Bil3,6 -3,6 100 - blicks- großer lp/mm der/s mm2 ym bild Ol Bereich
erstes 2D Einzel 1.000 10 Bil2,4 -2,4 4,5 - mikrosko¬ lp/mm der/s mm2 ym pisches
Bild 04
zweites 2D Einzel 1.000 30 Bil0,6 -0,6 4,5 - mikrosko¬ lp/mm der/s mm2 ym pisches
Bild 06
drittes 3D Einzel 1.000 > 1 Vo¬ 0,6 -0,6 · 4,5 Nein mikrosko¬ lp/mm lumen/s 0,45 ym pisches mm3
Bild 07
viertes 3D zusam1.000 < 1 Vo¬ 0,6 -0,6 · 4,5 Nein mikrosko¬ menge¬ lp/mm lumen/s 0,45 mm3 ym pisches setztes
1.000 < 1 Vo¬ 0,6 -0,6 · 4,5 Ja Bild 08 Mosaik
lp/mm lumen/s 0 , 6 mm3 ym fünftes 3D Einzel 500 > 1 Vo¬ 1,2 -1,2 · 45 Ja mikrosko¬ lp/mm lumen/s 1 mm3 ym pisches
Bild 09
Tabelle 1.
Zur Aufnahme der Überblicksbildes 01 und der mikroskopischen Bilder 03 erfolgt erfindungsgemäß eine geeignete Auswahl eines kleinen maximalen Vergrößerungsfaktors von höchstens 40, eines großen maximalen Sichtfeldes, einer schnellen mechanischen Fokussierung, einer Bildwandlung mit einem kleinen
Pixelabstand und einer großen Anzahl an Pixeln, einer
schnellen Übertragung der durch die Bildwandlung erhaltenen Daten und der zu mikroskopierenden Teilbereiche zur Erhöhung der Geschwindigkeit der Bildwandlung.
Gemäß einem ersten erfindungsgemäßen Beispiel werden ein kleiner maximaler Vergrößerungsfaktor von höchstens 40 und eine große numerische Apertur gewählt, um ein großes maximales
Sichtfeld und eine feine optische Auflösung zu erhalten, um insbesondere zweidimensionale mikroskopische Bilder 03
aufzunehmen . Gemäß einem zweiten erfindungsgemäßen Beispiel werden ein kleiner maximaler Vergrößerungsfaktor von höchstens 40 und eine große numerische Apertur gewählt, um ein großes maximales Sichtfeld zu erhalten und um die notwendigen Veränderungen der Vergrößerung infolge der großen und schnellen Variation der Fokussierung zu minimieren, wenn dreidimensionale
mikroskopische Bilder 03 aufzunehmen sind.
Gemäß einem dritten erfindungsgemäßen Beispiel wird für die Bildwandlung ein kleiner Pixelabstand gewählt, der klein genug ist, dass es bei der gewählten numerischen Apertur und der gewählten Vergrößerung nicht zu einer Unterabtastung kommt. Für die Bildwandlung wird eine große Pixelanzahl verwendet, sodass das Sichtfeld groß ist. Die erfindungsgemäß erzielbare schnelle Bildwandlung wird mit einer variierenden Fokussierung synchronisiert. Es können zweidimensionale mikroskopische
Bilder 03 durch eine Bildwandlung mit einer Pixelanzahl von 42 Millionen und einer Zeilenzahl von 1080 mit einer
Bildwiederholrate von mehr als 60 Hz erhalten werden. Es können dreidimensionale mikroskopische Bilder 03 durch eine Fokusvariation von > 10 kHz bei einer Geschwindigkeit von 1 Volumen/s von einem räumlichen Teilbereich der Größe
10 mm · 10 mm · 10 mm erhalten werden, wobei die räumliche
Auflösung in x-, y- und z-Richtung 5 ym, 5 ym und 170 ym beträgt. Für einen räumlichen Teilbereich der Größe
6 mm · 5 mm · 7 mm beträgt die räumliche Auflösung in x-, y- und z-Richtung 0,8 ym, 0,9 ym und 170 ym. Für einen räumlichen Teilbereich der Größe 180 ym · 130 ym · 36 ym beträgt die räumliche Auflösung in x-, y- und z-Richtung 0,1 ym, 0,1 ym und 0 , 9 ym.
Fig. 2 zeigt eine erste bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen digitalen Mikroskops mit drei alternativ einsetzbaren Optionen 11, 12, 13 zur Messung einer
Tiefeninformation. Je nach Ausgestaltung des Mikroskops wird eine der Optionen 11, 12 oder 13 in den Strahlengang
eingebracht. In der Darstellung in Fig. 2 ist Option 11 in den Strahlengang eingebracht. Diese Option 11 kann durch eine der Optionen 12 oder 13 ersetzt werden. Mit dem digitalen
Mikroskop kann die Probe 02 mikroskopiert werden. Das digitale Mikroskop umfasst eine Durchlichtbeleuchtung 14, eine
Ringbeleuchtung 16 und eine Koaxialbeleuchtung 17, die
alternativ oder gemeinsam zum Beleuchten der Probe 02 dienen. Die jeweilige Option 11; 12; 13 kann durch eine erste
Grobfokussierung 18 verschoben werden. Alternativ oder ergänzend dazu kann die Probe 02 durch eine zweite
Grobfokussierung 19 verschoben werden. Das digitale Mikroskop umfasst weiterhin ein Objektiv 20 und einen Bildsensor 21, welcher bei den drei Optionen 11, 12, 13 unterschiedlich angeordnet ist. Die drei Optionen 11, 12, 13 unterscheiden sich insbesondere in der Realisierung der Messung einer Tiefeninformation der Probe 02. Bei der ersten Option 11 dient ein Mikrosystem 22 mit
beweglichen Mikrospiegeln zur Messung einer Tiefeninformation der Probe 02, wobei das Mikrosystem 22 mit den beweglichen Mikrospiegeln über einen Strahlteiler 23 rückreflektierend angeordnet ist. Das Mikrosystem 22 dient zudem zur schnellen Feinfokussierung einschließlich einer Korrektur der
Aberration. Bei der zweiten Option 12 ist das Mikrosystem 22 mit den beweglichen Mikrospiegeln in einem Winkel von 45° reflektierend angeordnet. Auch hier dient das Mikrosystem 22 zudem zur schnellen Feinfokussierung einschließlich einer Korrektur der Aberration. Bei der dritten Option 13 dient ein aktives optisches Element 24, wie beispielsweise eine durch mechanische Schwingungen steuerbare Linse, eine flüssige Linse oder eine diffraktive Linse zur Messung einer
Tiefeninformation der Probe 02. Das aktive optische Element 24 dient zudem zur schnellen Feinfokussierung einschließlich einer Korrektur der Aberration. Vor dem Bildsensor 21 ist optional jeweils eine Linse 26 angeordnet. Jede der drei
Optionen 11, 12, 13 ermöglicht eine dreidimensionale und eine zweidimensionale mikroskopische Aufnahme der Probe 02. Durch das oben beschriebene erfindungsgemäße Verfahren kann die
Geschwindigkeit der Messung um einen Faktor zwischen 2 und 100 erhöht werden.
Fig. 3 zeigt eine zweite bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen digitalen Mikroskops mit drei alternativ einsetzbaren Optionen 31, 32, 33 zur Koaxialbeleuchtung 17 der Probe 02. In der Darstellung in Fig. 3 ist die erste Option 31 zur Koaxialbeleuchtung 17 im Einsatz. Die weiteren Optionen 32, 33 zur Koaxialbeleuchtung 17 können anstelle der ersten Option 31 in den Strahlengang des Mikroskops eingebracht werden. Das Mikroskop umfasst wiederum das Objektiv 20 und eine der drei in Fig. 2 schematisch dargestellten und oben erläuterten
Optionen 11, 12, 13. Eine der Optionen 11, 12, 13 wird an der
Stelle des in Fig. 3 dargestellten Quadrats derart in den Strahlengang eingebracht, dass die o. g. beschriebene Funktion erzielt wird. Die drei Optionen 31, 32, 33 zur
Koaxialbeleuchtung 17 umfassen jeweils eine Lichtquelle 34 und eine optionale Linse 36, die alternativ beispielsweise eine durch mechanische Schwingungen steuerbare Linse, eine flüssige Linse oder eine diffraktive Linse sein kann. Die Lichtquelle
34 kann zum Aussenden von kohärenten, inkohärenten,
kontinuierlichen, pulsierenden oder stroboskopartigen Licht ausgebildet sein. Bei der zweiten Option 32 zur
Koaxialbeleuchtung 17 ist ein Mikrosystem 37 mit mechanisch beweglichen Mikrospiegeln über einen Strahlteiler 38
rückreflektierend angeordnet. Bei der dritten Option 33 zur Koaxialbeleuchtung 17 ist das Mikrosystem 37 mit den
beweglichen Mikrospiegeln in einem Winkel von 45°
reflektierend angeordnet. Die Optionen 32; 33 ermöglichen eine Beleuchtung mit der Möglichkeit einer Steuerung der
Fokussierung und der Aberration. Die Steuerung der Aberration kann beleuchtungspfad- und/oder detektions-pfadspezifisch vorgenommen werden. Diese Steuerung kann in Abhängigkeit von der Zeit oder von der z-Position dynamisch oder statisch vorgenommen werden.
Die Optionen 31, 32, 33 können weitere optische Elemente
(nicht gezeigt) , wie beispielsweise eine durch mechanische
Schwingungen steuerbare Linse, eine flüssige Linse oder eine diffraktive Linse umfassen, wodurch beispielweise eine Intensität, eine Phase und/oder eine Polarisation des zu erzeugenden Lichtes steuerbar sind.
Die drei Optionen 31, 32, 33 zur Koaxialbeleuchtung 17 der Probe 02 können alternativ auch zur Durchlichtbeleuchtung oder zur Ringbeleuchtung ausgebildet sein.
Fig. 4 zeigt eine dritte und eine viere bevorzugte
Ausführungsform des erfindungsgemäßen digitalen Mikroskops, welche wiederum das Objektiv 20, die Koaxialbeleuchtung 17
(gezeigt in Fig. 2) und den Bildsensor 21 umfassen, wobei der Bildsensor 21 abnehmbar ist. Strahlformende und/oder
fokussierende Elemente 41 dienen optional dazu, einen
Lichtstrahldurchmesser an einen fokussierten Bereich
anzupassen.
Bei der links dargestellten dritten Ausführungsform ist ein Mikrosystem 42 mit beweglichen Mikrospiegeln über einen
Strahlteiler 43 rückreflektierend angeordnet, um als Aktuator zum Verstellen der Fokussierung zu fungieren. Bei der rechts dargestellten vierten Ausführungsform dient ein Fokusaktuator 44 zum Verstellen der Fokussierung. Eine weitere optionale Linse 46 kann vor dem Bildsensor 21 angeordnet sein. Fig.5 zeigt einen Ablaufplan einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bei dieser Ausführungsform wird zu Beginn ein mikroskopisches Bild eines ersten
Teilbereiches einer Probe aufgenommen. Es handelt sich um ein initiales Bild. Es wird bei dieser Ausführungsform als
zweidimensionales Bild mit einer maximalen zweidimensionalen
Auflösung aufgenommen werden. Soll die Probe dreidimensional aufgenommen werden, so wird anschließend ein dreidimensionales Bild der Probe mit geringer zweidimensionaler Auflösung aufgenommen. Ausgehend davon werden weitere Teilbereiche analysiert, um Parameter für zweidimensionale und
dreidimensionale mikroskopische Bilder von weiteren
Teilbereichen zu bestimmen. Die Parameter umfassen das zu wählende Sichtfeld/Sichtvolumen, aber auch beispielsweise
Kontrast, Parameter zum Stellen eines Aktuators eines aktiven optischen Elementes 22, 24, 42; 44 (gezeigt in Fig. 2 und 4) und/oder eine Option zum Aufnehmen einer erweiterten
Schärfentiefe. Die zuvor getätigte Aufnahme wird anschließend mit einem anderen Kontrast wiederholt. Ausgehend davon werden die weiteren Teilbereiche erneut analysiert, um Parameter für zweidimensionale und dreidimensionale mikroskopische Bilder von weiteren Teilbereichen zu bestimmen. Diese Parameter werden mit den zuvor ermittelten Parametern hinsichtlich ihrer Korrelation analysiert, um die Parameter endgültig
auszuwählen. Im nächsten Schritt werden Informationen über Subteilbereiche im jeweiligen Teilbereich ermittelt.
Schließlich wird ein mikroskopisches Bild eines weiteren
Teilbereiches mit den zuvor festgelegten Parametern
aufgenommen. Soll die Probe generell nur zweidimensional aufgenommen werden, so werden mikroskopische Bilder der weiteren Teilbereiche nach Aufnahme des initialen Bildes aufgenommen, ohne dreidimensionale Bilder aufzunehmen und zu analysieren .
Alternativ zu der dargestellten Ausführungsform kann das initiale Bild auch ein zweidimensionales Bild mit geringer Auflösung und einem großen Sichtfeld, ein dreidimensionales Bild mit geringer Auflösung in drei Dimensionen und einem großen Sichtvolumen sein. Bezugszeichenliste
Ol Überblicksbild
02 Probe
03 mikroskopische Bilder
04 erstes mikroskopisches Bild
05
06 zweites mikroskopisches Bild
07 drittes mikroskopisches Bild
08 viertes mikroskopisches Bild
09 fünftes mikroskopisches Bild
10
11 erste Option
12 zweite Option
13 dritte Option
14 Durchlichtbeleuchtung
15
16 Ringbeleuchtung
17 Koaxialbeleuchtung
18 erste Grobfokussierung
19 zweite Grobfokussierung
20 Objektiv
21 Bildsensor
22 Mikrosystem mit beweglichen Mikrospiegeln
23 Strahlteiler
24 aktives optisches Element
25
26 Linse
27
28
29 erste Option
zweite Option
dritte Option
Lichtquelle Linse
Mikrosystem mit beweglichen Mikrospiegeln
Strahlteiler
strahlformende und/oder fokussierende Elemente
Mikrosystem mit mechanisch beweglichen Mikrospiegeln Strahlteiler
Fokusaktuator Linse

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Mikroskopieren einer Probe (02) mit einem
Mikroskop, welches ein Objektiv (20) und einen Bildsensor
(21) umfasst, wobei ein bildsensorseitiges Sichtfeld des Mikroskops durch Auswahl eines Abschnittes des Bildsensors
(21) veränderbar ist; wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst :
Aufnehmen eines initialen Bildes (01) zumindest eines Teilbereiches der Probe (02) mit dem Mikroskop, wofür ein erstes Sichtfeld am Mikroskop gewählt wird;
Ermitteln von zumindest zwei sich unterscheidenden teilbereichsabbildenden Sichtfeldern durch Analysieren des initialen Bildes (01), wobei durch jedes der teilbereichsabbildenden Sichtfelder ein Teilbereich des initialen Bildes (01) abgebildet wird; und
Aufnehmen von Bildern (03) der Teilbereiche der Probe (02) für jedes der ermittelten teilbereichsabbildenden Sichtfelder .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass durch das Analysieren des initialen Bildes (01) eine
Auflösung der aufzunehmenden mikroskopischen Bilder (03), ein Sichtvolumen zum Aufnehmen der mikroskopischen Bilder (03), ein Kontrast zum Aufnehmen der mikroskopischen Bilder (03), Parameter zur Aberrationssteuerung und/oder Parameter zum Stellen eines Aktuators eines aktiven optischen
Elementes (22, 24, 42; 44) ermittelt werden und/oder eine Option zum Aufnehmen einer erweiterten Schärfentiefe oder eine Option zum Aufnehmen einer Tiefeninformation
ausgewählt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Sichtfeld größer als das mindestens eine teilbereichsabbildende Sichtfeld ist, wobei die
mikroskopischen Bilder (03) der Teilbereiche mit einer feineren Auflösung als das initiale Bild (01) aufgenommen werden .
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das initiale Bild als ein Überblicksbild (01) der Probe (02) aufgenommen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass :
beim Analysieren des initialen Bildes (01) die einzelnen im initialen Bild (01) abgebildeten Teilbereiche analysiert werden, um jeweils eine zum Mikroskopieren des jeweiligen Teilbereiches notwendige Auflösung zu bestimmen; und dass
das Auswählen der einzelnen teilbereichsabbildenden Sichtfelder entsprechend der zuvor bestimmten jeweiligen notwendigen Auflösung erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, dass es folgende weitere Schritte umfasst: - Analysieren von zumindest einem der mikroskopischen
Bilder (03) der Teilbereiche, um mindestens ein
subteilbereichsabbildendes Sichtfeld zum Aufnehmen von mikroskopischen Bildern von zumindest mehreren
Subteilbereichen der Probe (02) zu bestimmen, wobei das mindestens eine subteilbereichsabbildende Sichtfeld kleiner als das teilbereichsabbildende Sichtfeld ist; und - Aufnehmen von mikroskopischen Bildern (03) der mehreren Subteilbereiche der Probe (02) für jeweils das zuvor bestimmte subteilbereichsabbildende Sichtfeld, wobei die mikroskopischen Bilder (03) der Subteilbereiche mit einer feineren Auflösung als der jeweilige Teilbereich aufgenommen werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das initiale Bild als ein mikroskopisches Bild (03) eines ersten Teilbereichs der Probe (02) aufgenommen wird, wofür das erste Sichtfeld als ein teilbereichsabbildendes
Sichtfeld gewählt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die teilbereichsabbildenden Sichtfelder zum Aufnehmen der mikroskopischen Bilder (03) der nach dem ersten Teilbereich folgenden weiteren Teilbereiche der Probe (02) ausgehend von der Analyse des Bildes des ersten Teilbereiches der Probe (02) gewählt werden, wobei die einzelnen
mikroskopischen Bilder (03) der weiteren Teilbereiche jeweils analysiert werden, um die einzelnen
teilbereichsabbildenden Sichtfelder zum Aufnehmen der mikroskopischen Bilder (03) der jeweils darauf folgenden weiteren Teilbereiche der Probe (02) zu wählen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, dass das initiale Bild und/oder zumindest mehrere der mikroskopischen Bilder mit einer erweiterten Schärfentiefe aufgenommen werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zum Aufnehmen des initialen Bildes und/oder der mikroskopischen Bilder mit der erweiterten Schärfentiefe jeweils mehrere Einzelbilder mit unterschiedlichen z-Positionen aufgenommen werden .
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass zur schnellen Aufnahme eines
Fokusstapels ein optischer Aktuator zum Einsatz kommt, welcher als ein Mikrosystem (22; 37; 42) mit mechanisch beweglichen Mikrospiegeln ausgebildet ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, dass das initiale Bild und/oder zumindest mehrere der mikroskopischen Bilder (07, 08, 09) zusätzlich mit einer Tiefeninformation aufgenommen werden.
13. Mikroskop zum Mikroskopieren einer Probe (02); umfassend:
ein Objektiv (20) zum vergrößerten optischen Abbilden der Probe ( 02 ) ;
einen Bildsensor (21) zum Wandeln des abgebildeten Bildes in ein elektrisches Signal, wobei ein
bildsensorseitiges Sichtfeld des Mikroskops durch Auswahl eines Abschnittes des Bildsensors (21)
variierbar ist; und
eine elektronische Steuereinheit zum Steuern des Bildsensors (21), wobei die Steuereinheit zur Ausführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 konfiguriert ist.
14. Mikroskop nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektiv (20) einen maximalen Vergrößerungsfaktor von höchstens 40 besitzt. Mikroskop nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es einen optischen Aktuator aufweist, welcher als ein Mikrosystem (22; 37; 42) mit mechanisch beweglichen
Mikrospiegeln zur Aufnahme einer erweiterten Schärfentiefe ausgebildet ist.
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