CN116144562B - 一种链霉菌重组菌及其在利用虾壳生产几丁寡糖中的应用 - Google Patents

一种链霉菌重组菌及其在利用虾壳生产几丁寡糖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种链霉菌重组菌及其在利用虾壳生产几丁寡糖中的应用。本发明菌株是以链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT‑1为出发菌株，利用高效启动子scutP1对裂解性多糖单加氧酶LPMO和几丁质酶Chi19进行过表达。该菌株的几丁质酶酶活与出发菌株链霉菌SCUT‑1相比明显提高，该菌株的几丁质降解效率明显增强，可直接利用廉价的虾壳原料为唯一碳氮源进行发酵生产几丁寡糖，产量为出发菌株的2.60倍。本发明在几丁寡糖的生产中具有重大意义，对降低生产成本、提高产量具有重要价值。

Description

一种链霉菌重组菌及其在利用虾壳生产几丁寡糖中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程和生物工程技术领域，特别涉及一种链霉菌重组菌及其在利用虾壳生产几丁寡糖中的应用。
背景技术
几丁质又名甲壳素，是由N-乙酰葡萄糖胺通过β-(1,4)糖苷键连接形成的生物大分子，是地球上储量仅次于纤维素的天然高分子化合物。几丁质内部结构高度有序，糖链之间形成大量的氢键，使其结构坚固而不溶于水、稀酸、稀碱和常见的有机溶剂，致使其应用受到了严重限制。而几丁寡糖是几丁质水解后得到的水溶性寡聚化合物，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化等生物学效应，其应用前景和经济价值远高于几丁质。
几丁寡糖的生产目前主要包括酶解法和微生物发酵法两种方式。酶解法是利用几丁质酶制剂对几丁质进行水解得到几丁寡糖，其酶制剂可以通过对几丁质酶基因进行异源重组表达获得，或通过培养具有产几丁质酶能力的天然菌株制备。然而，无论是通过何种方式获得的几丁质酶制剂都普遍很低，在水解几丁质时加酶量巨大，使得利用几丁质酶制剂制备几丁寡糖的成本高昂，难以满足工业应用的需要。为了提高酶制剂的水解效率，可利用强酸试剂(如浓硫酸等)对几丁质进行预处理，通过破坏几丁质内部的氢键制备胶体几丁质，但是这种方式一方面增加了工艺复杂程度，另一方面也产生大量的含酸废水，造成了严重的二次污染。此外，酶解法制备几丁寡糖需要单独的酶制剂制备过程，不仅在制酶阶段需要额外投入菌株生长所需的碳氮源等原料，并且工艺较为繁琐，增加了生产的时间和经济成本。
微生物发酵法则是利用具有几丁质降解能力的微生物，以几丁质或含有几丁质的原料作为微生物生长所需的碳源和/或氮源对菌株进行发酵培养，在菌株生长过程中即可对底物进行水解进而获得几丁寡糖。相比于酶解法而言，这种方法无需单独的酶制剂制备过程，工艺更加简便，生产成本更低；并且一株微生物菌种大多可以表达分泌多种几丁质酶对底物进行协同降解，同时表达分泌裂解性多糖单加氧酶对几丁质进行破坏，无需将几丁质预处理为胶体几丁质，在进一步简化工艺流程的同时能有效减少废水污染，更加高效环保。然而，天然菌株的几丁质降解能力普遍较低，提高菌株的几丁质降解效率成为行业内亟待解决的问题。
虾壳是虾类水产品加工过程中产生的副产物，其中含有大约20％左右的几丁质，是生产几丁寡糖的廉价原料。但虾壳结构坚固，难以被直接利用，大多被直接作为废弃物丢弃，不仅完全无法创造任何经济和应用价值，还带来了严重的环境污染问题。目前，虾壳的原料价格仅为1000元/吨左右，而从中提取的几丁质价格就可达到5～10万元/吨，进一步转化为几丁寡糖的经济价值更是将大幅度提高。提高菌株的几丁质降解能力，利用虾壳为原料生产几丁寡糖，是实现廉价虾壳向高值几丁寡糖转化的关键。
因此，有必要获得新的可高效降解虾壳生产几丁寡糖的菌株。
发明内容
本发明的首要目的在于针对现有技术的不足，提供一种链霉菌重组菌；该链霉菌重组菌过表达裂解性多糖单加氧酶和GH19家族几丁质酶，提高菌株降解虾壳生产几丁寡糖效率。
本发明的另一目的在于提供所述链霉菌重组菌的构建方法。
本发明的再一目的在于提供所述链霉菌重组菌在利用虾壳生产几丁寡糖中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种链霉菌重组菌，含有重组载体；
所述重组载体含有启动子scutP1、裂解性多糖单加氧酶LPMO的编码基因和几丁质酶Chi19的编码基因。
所述的启动子scutP1的核酸序列为(亦如SEQ ID No.1所示)：
CGGCCCCTGAGCACGAAGTAGGCGCCGACGGCCAGCAGCAGCGCCAGCTGCGCCCAGGCCGCCAGGAGCACCAGTCCCCGGTCCGCCATCGTCCGCCCTCCGCCCTTGCCTCCGTGTGGGCGGCCGCCTACCCCGGCCCCCGCGTCCGGATGCGCGCGGCGGCCGGCAGGCACCCGTCCGGGTGTGCGGCCGGGCGGGGGGCCGTCCCGCCGGGCGGGGGCCGTCCCGCCGGGCGGGGCCCGGGTCCTACCACTCCGGGGCGTGGATTTTCGGACGTTTCCCGCCGGGCGAGGGGGTACGGCGCCCGCGGGCCCGGCCCCACCCCTATGCTTCTACATGTCTGTAGAAACAAGCGAGGGCGGTGCGGGCCTCCCCTGCCGTCCTGCGGGACGCGGTCGTCCGGCCCGGCCGGGCCCCGGCCCGCACCTCTCTCTTTCGCATTCGTCCCCGGAAGGACCGTC。
所述的裂解性多糖单加氧酶LPMO的编码基因的核酸序列为(亦如SEQ ID No.2所示)：
ATGCGCAGAAGACTCGGAGCAGCCGCGCTCGGCCTCGGCCTGCTCGGCACCACCCTCGCCGCGGCGGGCAGTGCCGTCGGCCACGGCTACACCAGCACCCCGCCCAGCCGTGCGGCCCTGTGCGCCCAGCGCGTCGTCACCGGCTGCGGCGACATCCAGTGGGAGCCGCAGAGCGTCGAGGGCCCCAAGGGCTTCCCGTCCGCGGGCCCCGCGGACGGCAGGATCTGCAGCGGGGGCAACACCCGCTTCGCCGAGCTCGACGACCCCCGGGGCGGGAACTGGCCCGCCACACAACTGACCGGCGGCCAGGGCTACGACTTCAAGTGGACCCTGACGGCCCGTCACGCCACCACCTCGTTCCGGTACTTCATCACCAGGGACGACTGGGACCCGACACGACCCCTGACCCGCGCGGACCTGGAACCGGAACCGTTCATGACCGTCCACTACGGCGGGCGGCAGCCGGAGGCCGTCGCCGTGCACCGGGGGACCGTGCCGACGCAGAAGACCGGCCGGCACCTGATCCTCGGGGTGTGGGACATCGCCGACACCCCGAACGCCTTCTACTCGTGCGCGGACGTGCGGTTCTGA。
所述的几丁质酶Chi19的编码基因的核酸序列为(亦如SEQ ID No.3所示)：
ATGTCAGGGAAGCGCATGGCGGCCTCTGCCGCCGCCGTGACCGCCGCCGTGGCCGTGGCGAGTGCACTGACGGTCTTCCTGCCCCTGCCCTCCGCCGCCGCGGCGGACTGCGCGGCGGCGTGGAGTTCCGCCACCGCCTACCAGGGCGGCGCGACCGTCTCGCACGGCGGCCGCAACTGGTCGGCGAAGTGGTGGACGCAGAACGAGACGCCCGGCGGGTCCTCCGGCGTGTGGGCGGACCGGGGAGCCTGCGGGACCACGTCCCCCGACCCCGACCCCGACCCCGATCCCTCGGGGTTCGTCGTCAGCGAGGCGCAGTTCGAGCAGATGTTCCCGAACCGGAGCGCCTTCTACACCTACAGCGGCCTGACCGCGGCGCTGAACGCGTACCCCGGCTTCACGAACACCGGCAGCGACACCGTCAGGAAGCAGGAGGCCGCGGCCTTCCTCGCCAACGTCAACCACGAGACGGGCGGGCTGGTCCACGTCGTCGAGCAGAACCGGGACAACTACCCGCACTACTGCGACAACAGCCTGCCCTACGGCTGCCCCGCCGGGCAGGCCGCCTACTACGGCCGCGGACCGATCCAGCTGAGCTGGAACTTCAACTACAAGGCGGCGGGTGACGCGCTCGGCCTCGACCTGCTGCGCGACCCGTACCTGGTGGAACGGGACTCGGCCGTGGCCTGGAAGACCGCCCTGTGGTACTGGAACACCCAGCGCGGCCCGGGCCGGATGACCCCGCACGACGCCATGGTCGGCGGCCACGGGTTCGGGGAGACGATACGCAGCATCAACGGCGCCCTGGAGTGCGACGGGAGGAATCCGGCCCAGGTGCAGAGCCGGATCGACTCCTACCAGCGGTTCACGCAGATCCTGGGCACCACTCCGGGCGGCAACCTCAGCTGCTGA。
上述链霉菌重组菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)以pSET152-ermE*质粒为模板通过PCR扩增得到pSET152质粒骨架；以链霉菌SCUT-1基因组DNA为模板通过PCR扩增得到scutP1启动子片段；
(2)将步骤(1)得到的pSET152质粒骨架与scutP1启动子片段通过无缝克隆连接，得到带有scutP1启动子的重组质粒pSET152-scutP1；
(3)以链霉菌SCUT-1基因组DNA为模板，通过PCR分别扩增得到裂解性多糖单加氧酶LPMO编码基因片段lpmo和几丁质酶Chi19编码基因片段chi19；
(4)通过NdeI限制性核酸内切酶对步骤(2)得到的重组质粒pSET152-scutP1进行酶切线性化；将线性化后的重组质粒pSET152-scutP1分别与步骤(3)得到的lpmo片段和chi19片段通过无缝克隆连接，获得重组质粒pSET152-scutP1-lpmo和重组质粒pSET152-scutP1-chi19；
(5)以步骤(4)得到的重组质粒pSET152-scutP1-chi19为模板，通过PCR扩增得到片段scutP1-chi19；通过NdeI限制性核酸内切酶对步骤(4)得到的重组质粒pSET152-scutP1-lpmo进行酶切线性化；将线性化后的重组质粒pSET152-scutP1-lpmo与片段scutP1-chi19通过无缝克隆连接，获得重组质粒pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19；
(6)将步骤(5)得到的重组质粒pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，再通过细菌接合的方式转入链霉菌SCUT-1，获得链霉菌重组菌。
步骤(1)中所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1为中国发明专利申请CN201910491700.8记载的链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1。
步骤(1)中所述的链霉菌SCUT-1基因组DNA的提取步骤如下：
将链霉菌SCUT-1接种至固体高氏1号培养基平板，培养至产生灰绿色孢子；链霉菌SCUT-1的孢子接种至种子液培养基，振荡培养，得到链霉菌SCUT-1种子液；取1mL链霉菌SCUT-1种子液，使用DNA快速抽提试剂盒提取基因组DNA。
所述的固体高氏1号培养基包括以下组分：20g/L可溶性淀粉、1g/L硝酸钾、0.5g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、0.5g/L氯化钠、0.01g/L七水硫酸亚铁和20g/L琼脂粉。
所述的固体高氏1号培养基还包括蒸馏水。
所述的种子培养基包括以下组分：10g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠和5g/L酵母提取物。
所述的种子培养基还包括蒸馏水。
所述的震荡培养的条件为30～45℃、150～250rpm震荡培养19～29h；优选为：37℃、220rpm震荡培养24h。
所述的DNA快速抽提试剂盒优选为土壤基因组DNA快速抽提试剂盒。
优选地，步骤(1)中PCR扩增得到pSET152质粒骨架用到的引物及引物序列如下所示：
pET152ProLineFw：5’-catatgttggggatcctctagaggatccg-3’；
pET152ProLineRv：5’-agtcgacctgcagcccaagc-3’。
优选地，步骤(1)中PCR扩增得到scutP1启动子片段用到的引物及引物序列如下所示：
scutP1-Fw：5’-gcttgggctgcaggtcgactCGGCCCCTGAGCACGAA-3’；
scutP1-Rv：5’-tagaggatccccaacatatgGACGGTCCTTCCGGG-3’。
优选地，步骤(3)中PCR扩增得到裂解性多糖单加氧酶LPMO编码基因片段lpmo用到的引物及引物序列如下所示：
lpmo-Fw：5’-cccggaaggaccgtccaATGCGCAGAAGACTCGGAG-3’；
lpmo-Rv：5’-ctagaggatccccaacatatgTCAGAACCGCACGTCCGC-3’。
优选地，步骤(3)中PCR扩增得到几丁质酶Chi19编码基因片段chi19用到的引物及引物序列如下所示：
chi19-Fw：5’-cccggaaggaccgtccaATGTCAGGGAAGCGCATGG-3’；
chi19-Rv：5’-ctagaggatccccaacatatgTCAGCAGCTGAGGTTGCCG-3’。
优选地，步骤(5)中PCR扩增得到片段scutP1-chi19用到的引物及引物序列如下所示：
scutP1-chi19-Fw：5’-acgtgcggttctgacaCGGCCCCTGAGCACGAAG-3’；
scutP1-chi19-Rv：5’-TCCTCTAGAGGATCCCCAACA-3’。
步骤(6)所述的转化的方法优选为电转化。
步骤(6)所述的细菌接合具体包括以下步骤：
S1：将转化后的将上述大肠杆菌接种至含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基中，培养。取培养后得到的菌液，离心，去除上清；用LB培养基重悬菌体，离心，去除上清，得到大肠杆菌菌体；
S2：取链霉菌SCUT-1孢子保藏液孵育后，与步骤S1收集的大肠杆菌菌体混合均匀后，涂布于固体MS培养基平板，培养；
S3：取出培养后的固体MS培养基平板；将安普霉素和萘啶酮酸水溶液均匀覆盖在固体MS培养基平板上；平板充分晾干后培养；待MS培养基平板上长出明显单菌落后，用挑取单菌落接种至含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基中，震荡培养。
步骤S1中所述的含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基包括以下组分：胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母提取物5g/L、安普霉素50mg/L、氯霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L。
步骤S1中所述的含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基还包括蒸馏水。
步骤S1中所述的培养的条件为：30～45℃、150～250rpm培养12～20h；优选为37℃、220rpm震荡培养16h。
步骤S1中所述的离心的条件优选为：6000×g离心2min。
步骤S1中所述的用LB培养基重悬菌体优选用2mL的LB培养基重悬。
步骤S2中所述的链霉菌SCUT-1孢子保藏液优选通过如下制备步骤制备：
将链霉菌SCUT-1接种至固体高氏1号培养基平板，培养至产生灰绿色孢子；将链霉菌SCUT-1孢子接种至孢子保藏培养基，于4℃保藏，得到链霉菌SCUT-1孢子保藏液。
所述的固体高氏1号培养基包括以下组分：20g/L可溶性淀粉、1g/L硝酸钾、0.5g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、0.5g/L氯化钠、0.01g/L七水硫酸亚铁和20g/L琼脂粉。
所述的固体高氏1号培养基还包括蒸馏水。
所述的培养至产生灰绿色孢子的培养条件为30～45℃培养5～7天；优选为37℃培养5～7天。
所述的孢子保藏培养基包括以下组分：16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物和5g/L氯化钠。
所述的孢子保藏培养基还包括蒸馏水。
步骤S2中所述的孵育的条件为40～60℃孵育5～15min；优选为：50℃孵育10min。
步骤S2中所述的固体MS培养基包括以下组分：20g/L甘露醇、20g/L黄豆粉、10mmol/L氯化镁和20g/L琼脂粉。
步骤S2中所述的固体MS培养基还包括蒸馏水。
步骤S2中所述的培养的条件为：20～40℃倒置培养12～20h；优选为：30℃倒置培养16h。
步骤S3中所述的安普霉素和萘啶酮酸水溶液的溶质由以下组分组成：安普霉素1mg/L和萘啶酮酸0.5mg/L；溶剂为蒸馏水。
步骤S3中所述的培养的条件为：30～45℃培养3～5天；优选为：37℃培养3～5天。
步骤S3中所述的含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基包括如下组分：:胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母提取物5g/L、安普霉素50mg/L和萘啶酮酸25mg/L。
步骤S3中所述的含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基还包括蒸馏水。
步骤S3中所述的震荡培养的条件为：30～45℃、150～250rpm震荡培养45～51h；优选为：37℃、220rpm震荡培养48h。
上述链霉菌重组菌在利用虾壳生产几丁寡糖中的应用。
所述的应用中，是以虾壳为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述发酵培养基中接种上述链霉菌重组菌进行发酵培养，即可通过所述的重组菌对虾壳中的几丁质组分进行降解得到几丁寡糖。
所述的应用优选包括如下步骤：
P1：将链霉菌重组菌接种于种子培养基中，通过培养得到链霉菌重组菌种子液。
P2：将步骤P1所得的链霉菌重组菌种子液接种于发酵培养基中，发酵，收集上清，得到几丁寡糖溶液。
步骤P1中所述的种子培养基包括以下组分：10.0g/L胰蛋白胨、10.0g/L氯化钠和5.0g/L酵母提取物。
步骤P1中所述的种子培养基还包括蒸馏水。
步骤P1中所述的培养条件为：30～45℃，150～250rpm，培养时间15～35h。优选为37℃，220rpm，培养时间24h。
步骤P2中所述的发酵培养基包括以下组分：100g/L干虾壳、0.5g/L无水硫酸镁、0.4g/L磷酸二氢钾、0.8g/L三水磷酸氢二钾和0.02g/L七水硫酸亚铁。
步骤P2中所述的发酵培养基还包括蒸馏水
步骤P2中所述的种子液的接种量为发酵培养基体积的1％。
步骤P2中所述的发酵培养条件为：30～45℃，150～250rpm，培养时间15～35h。优选为40℃，220rpm，培养时间72h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明使用出发菌株链霉菌SCUT-1内源性的高效启动子scutP1，通过基因工程技术构建了一株裂解性多糖单加氧酶LPMO和几丁质酶Chi19过表达的链霉菌重组菌，该菌株的几丁质酶酶活较出发菌株明显提高；
(2)本发明使用虾壳为唯一的碳源和氮源配制发酵培养基，利用链霉菌重组菌发酵培养即可得到富含几丁寡糖的发酵产物。原料廉价且来源广泛，可将大量废弃虾壳转化为高价值的几丁寡糖，变废为宝；
(3)本发明无需使用复杂的前处理工艺，无需单独的酶制剂制备过程、无需使用酸碱、有毒化学试剂，具有反应条件温和、工艺简便、成本低廉、绿色环保的优势；
(4)本发明方法获得的几丁寡糖产物可作为动物、植物营养添加剂等产品的优质原料。
附图说明
图1是重组载体pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19图。
图2是重组载体pSET152-ermE*-lpmo-ermE*-chi19图。
图3是出发菌株链霉菌SCUT-1和重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19发酵虾壳生产几丁寡糖的产量对比图。
图4是出发菌株链霉菌SCUT-1和重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19发酵虾壳生产几丁寡糖时的几丁质酶酶活对比图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图说明对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1
裂解性多糖单加氧酶LPMO和几丁质酶Chi19过表达的链霉菌重组菌的构建
1.链霉菌SCUT-1的培养
将链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1取适量接种至固体高氏1号培养基平板(固体高氏1号培养基由以下组分组成：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、琼脂粉20g和蒸馏水1L)，于37℃培养5～7天至产生灰绿色孢子。所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT-1，保藏编号为GDMCC No：60612，该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，于中国发明专利申请CN201910491700.8中公开。
2.链霉菌SCUT-1基因组DNA的提取
(1)用接种环挑取步骤1得到的链霉菌SCUT-1的孢子接种至种子液培养基(所述的种子培养基由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g和蒸馏水1L)，于37℃，220rpm条件下震荡培养24h，得到链霉菌SCUT-1种子液。
(2)取1mL链霉菌SCUT-1种子液，使用土壤基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程股份有限公司)提取基因组DNA，提取步骤按该试剂盒说明书的标准程序进行实验操作。
3.链霉菌SCUT-1孢子保藏液的制备
用接种环挑取步骤1得到的链霉菌SCUT-1的孢子接种至孢子保藏培养基(所述的孢子保藏培养基由以下组分组成：胰蛋白胨16g、酵母提取物10g、氯化钠5g和蒸馏水1L)，于4℃静置保藏5～7天，得到SCUT-1孢子保藏液。
4.载体的构建
(1)重组载体pSET152-scutP1的构建
以pSET152-ermE*质粒(NTCC典型培养物保藏中心NTCC典型培养物保藏中心的pSET152质粒为带有启动子ermE*的pSET152-ermE*质粒)为模板，设计引物pET152ProLineFw(5’-catatgttggggatcctctagaggatccg-3’)和pET152ProLineRv(5’-agtcgacctgcagcccaagc-3’)，通过PCR扩增得到不含启动子ermE*的pSET152质粒骨架。
以链霉菌SCUT-1基因组DNA为模板，设计引物scutP1-Fw(5’-gcttgggctgcaggtcg actCGGCCCCTGAGCACGAA-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和scutP1-Rv(5’-tagaggatccccaacatatgGACGGTCCTTCCGGG-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增得到scutP1启动子片段。
将pSET152质粒骨架和scutP1启动子片段纯化回收后于50℃反应30min进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV-S1 TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表1所示：
表1.连接反应体系
将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板(含有安普霉素的LB培养基平板由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、琼脂粉20g和蒸馏水1L)上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152-scutP1。
(2)重组载体pSET152-scutP1-lpmo和pSET152-scutP1-chi19的构建
使用NdeI限制性核酸内切酶处理pSET152-scutP1质粒并纯化回收，获得pSET152-scutP1线性化载体。
以链霉菌SCUT-1基因组DNA为模板，设计引物lpmo-Fw(5’-cccggaaggaccgtccaATGCGCAGAAGACTCGGAG-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和lpmo-Rv(5’-ctagaggatccccaacatatgTCAGAACCGCACGTCCGC-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收得到lpmo片段。
以链霉菌SCUT-1基因组DNA为模板，设计引物chi19-Fw(5’-cccggaaggaccgtccaATGTCAGGGAAGCGCATGG-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和chi19-Rv(5’-ctagaggatccccaacatatgTCAGCAGCTGAGGTTGCCG-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收得到chi19片段。
将pSET152-scutP1线性化载体分别与lpmo片段和chi19片段进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV-S1 TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表2所示：
表2.连接反应体系
将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板(含有安普霉素的LB培养基平板由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、琼脂粉20g和蒸馏水1L)上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152-scutP1-lpmo和pSET152-scutP1-chi19。
(3)重组载体pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19C的构建
使用NdeI限制性核酸内切酶处理pSET152-scutP1-lpmo质粒并纯化回收，获得pSET152-scutP1-lpmo线性化载体。
以pSET152-scutP1-chi19质粒为模板，设计引物scutP1-chi19-Fw(5’-acgtgcgg ttctgacaCGGCCCCTGAGCACGAAG-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和scutP1-chi19-Rv(5’-TCCTCTAGAGGATCCCCAACA-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段，由于pSET152-scutP1-lpmo和pSET152-scutP1-chi19载体骨架部分相同，该引物扩增产物可直接充当无缝克隆的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收后得到scutP1-chi19片段。将pSET152-scutP1-lpmo线性化载体和scutP1-chi19片段进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV-S1 TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表3所示：
表3.连接反应体系
将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板(含有安普霉素的LB培养基平板由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、琼脂粉20g和蒸馏水1L)上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19，载体图谱如图1所示。
5.链霉菌重组菌的构建
将步骤4(3)得到的重组载体pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19电转化进入大肠杆菌ET12567/pUZ8002宿主中，获得大肠杆菌转化菌株ET/pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19。将上述大肠杆菌接种至含有安普霉素(Apramycin)、氯霉素(Chloramphenicol)和卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基(所述含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、氯霉素25mg、卡那霉素50mg和蒸馏水1L)中，于37℃，220rpm条件下震荡培养16h。取4mL培养后得到ET/pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19的菌液，于6000×g条件下离心2min，去除上清。用2mL新鲜的LB培养基重悬菌体，于6000×g条件下离心2min，去除上清，以去除培养物中的抗生素。
取100μL于4℃保存的步骤3制得的链霉菌SCUT-1的孢子保藏液，于50℃中孵育10min后，与收集的大肠杆菌转化菌株ET/pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19菌体混合均匀后，涂布于固体MS培养基平板(所述的固体MS培养基由以下组分组成：甘露醇20g、黄豆粉20g、氯化镁终浓度10mM、琼脂粉20g和蒸馏水1L)，并在30℃条件下倒置培养16h。
取出培养后的MS培养基平板。另取1mL含有安普霉素和萘啶酮酸的水溶液(所述含有安普霉素和萘啶酮酸的水溶液由以下组分组成：安普霉素1mg、萘啶酮酸0.5mg和无菌水1mL)均匀覆盖在MS培养基平板上。平板充分晾干后置于37℃条件下培养3～5天。待MS培养基平板上长出明显单菌落后，用接种针挑取单菌落至含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基中(所述含有安普霉素和萘啶酮酸的种子培养基由以下组分组成:胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg，萘啶酮酸25mg和蒸馏水1L)，于37℃，220rpm条件下震荡培养48h，取1mL培养得到的菌液，使用土壤基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程股份有限公司)提取基因组DNA，提取步骤按该试剂盒说明书的标准程序进行实验操作。使用通用引物M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和M13-48(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)，以所提取的基因组DNA为模板进行PCR验证，得到链霉菌重组菌，命名为SCUT-Olpmo-Ochi19。SCUT-Olpmo-Ochi19为大肠杆菌转化菌株ET/pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19与SCUT-1结合所得。
对比例1
步骤1、2和3与实施例1相同。
4.载体的构建
(1)重组载体pSET152-ermE*-lpmo和pSET152-ermE*-chi19的构建
使用NdeI限制性核酸内切酶处理pSET152-ermE*质粒(NTCC典型培养物保藏中心)并纯化回收，获得pSET152-ermE*线性化载体。
以链霉菌SCUT-1基因组DNA为模板，设计引物lpmo-E-Fw(5’-cgaccaaaggaggcgga catATGCGCAGAAGACTCGGA-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和lpmo-E-Rv(5’-tagaggatccccaacatatgTCAGAACCGCACGTCCGC-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收得到lpmo-E片段。
以链霉菌SCUT-1基因组DNA为模板，设计引物chi19-E-Fw(5’-cgaccaaaggaggcgg acatATGTCAGGGAAGCGCATGG-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和chi19-E-Rv(5’-tagaggatccccaacatatgTCAGCAGCTGAGGTTGCCG-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收得到chi19-E片段。
将pSET152-ermE*线性化载体分别与lpmo-E片段和chi19-E片段进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV-S1 TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表4所示：
表4.连接反应体系
将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板(含有安普霉素的LB培养基平板由以下组分组成：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，安普霉素50mg，琼脂粉20g，蒸馏水1L)上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152-ermE*-lpmo和pSET152-ermE*-chi19。
(2)重组载体pSET152-ermE*-lpmo-ermE*-chi19的构建
以pSET152-ermE*-lpmo为模板，设计引物SETlpmoLineFw(5’-catatgttggggatcctctagaggatccg-3’)和SETlpmoLineRv(5’-tcagaaccgcacgtccgc-3’)，通过PCR扩增并纯化回收，获得pSET152-ermE*-lpmo线性化载体。
以pSET152-ermE*-chi19质粒为模板，设计引物ermE*-chi19-Fw(5’-gcggacgtgc ggttctgaCTAGTATGCATGCGAGTG-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和ermE*-chi19-Rv(5’-TCCTCTAGAGGATCCCCAACA-3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收后得到ermE*-chi19片段。将pSET152-ermE*-lpmo线性化载体和ermE*-chi19片段进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV-S1TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表5所示：
表5.连接反应体系
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将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152-ermE*-lpmo-ermE*-chi19，载体图谱如图2所示。
5.链霉菌重组菌的构建
将步骤4(2)所得的重组载体pSET152-ermE*-lpmo-ermE*-chi19电转化进入大肠杆菌ET12567/pUZ8002宿主中，获得大肠杆菌转化菌株ET/pSET152-ermE*-lpmo-ermE*-chi19。将上述大肠杆菌接种至含有安普霉素(Apramycin)、氯霉素(Chloramphenicol)、卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基(所述含有安普霉素、氯霉素、卡那霉素的LB培养基由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、氯霉素25mg、卡那霉素50mg和蒸馏水1L)中，于37℃，220rpm条件下震荡培养16h。取4mL培养后得到的ET/pSET152-ermE*-lpmo-ermE*-chi19菌液，于6000×g条件下离心2min，去除上清。用2mL新鲜的LB培养基重悬菌体，于6000×g条件下离心2min，去除上清，以去除培养物中的抗生素。
取100μL于4℃保存的步骤3制得的链霉菌SCUT-1的孢子保藏液，于50℃中孵育10min后，与收集的大肠杆菌ET/pSET152-ermE*-lpmo-ermE*-chi19菌体混合均匀后，涂布于固体MS培养基平板(所述的固体MS培养基由以下组分组成：甘露醇20g、黄豆粉20g、氯化镁0.9521g、琼脂粉20g和蒸馏水1L)，并在30℃条件下倒置培养16h。
取出培养后的MS培养基平板。另取1mL含有安普霉素和萘啶酮酸的水溶液(所述含有安普霉素和萘啶酮酸的水溶液由以下组分组成：安普霉素1mg、萘啶酮酸0.5mg和蒸馏水1mL)均匀覆盖在MS培养基平板上。平板充分晾干后置于37℃条件下培养3～5天。待MS培养基平板上长出明显单菌落后，用接种针挑取单菌落至含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基中(所述含有安普霉素和萘啶酮酸的种子培养基由以下组分组成:胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、萘啶酮酸25mg和蒸馏水1L)，于37℃，220rpm条件下震荡培养48h，取1mL培养得到的菌液，使用土壤基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程股份有限公司)提取基因组DNA，提取步骤按该试剂盒说明书的标准程序进行实验操作。使用通用引物M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和M13-48(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)，以所提取的基因组DNA为模板进行PCR验证，得到链霉菌重组菌，命名为SCUT-Elpmo-Echi19。SCUT-Elpmo-Echi19为大肠杆菌转化菌株ET/pSET152-ermE*-lpmo-ermE*-chi19与链霉菌SCUT-1接合所得。
实施例2
链霉菌重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19和SCUT-Elpmo-Echi19利用虾壳生产几丁寡糖的能力评估
(1)将出发菌株链霉菌SCUT-1、实施例1中所得的重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19和对比例1所得的重组菌SCUT-Elpmo-Echi19分别接种于种子液培养基(所述种子培养基由以下组分组成:胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g和蒸馏水1L)，于37℃，220rpm条件下震荡培养24h，得到链霉菌SCUT-1种子液、重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19种子液和重组菌SCUT-Elpmo-Echi19种子液。
(2)将链霉菌SCUT-1种子液、重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19种子液和重组菌SCUT-Elpmo-Echi19种子液分别按发酵培养基体积的1％的接种量接种至发酵培养基(所述发酵培养基由以下成分组成：虾壳100g、无水硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.4g、三水磷酸氢二钾0.8g、七水硫酸亚铁0.02g和蒸馏水1L)，于40℃，220rpm条件下震荡培养72h。将培养物于12000×g，4℃条件下离心5min，分别收集各个菌的上清发酵液进行几丁寡糖含量和几丁质酶酶活测定。
(3)几丁寡糖含量的测定，具体步骤如下：
取80μL步骤(2)得到的上清发酵液于离心管中，加入10μL的10％蜗牛酶溶液(所述10％蜗牛酶溶液由以下组分组成：蜗牛酶干粉100g，蒸馏水1L)(蜗牛酶干粉购自生工生物工程股份有限公司)(此步骤是通过蜗牛酶处理，将几丁寡糖全部转化为β-N-乙酰葡萄糖胺，以提高测定的准确性)，混匀后于37℃反应1h。向离心管中加入40μL的A液，100℃水浴5min。将离心管于12000×g条件下离心3min，取70μL上清于另一干净的离心管中，加入300μL的B液，混匀后于37℃下反应20min。取200μL反应液，用96孔酶标板，在酶标仪585nm波长处测定吸光值。将所测得OD585代入标准曲线，计算得到几丁寡糖的含量。标准曲线是将β-N-乙酰葡萄糖胺粉末溶解于蒸馏水中，配制成0、12.5、25、37.5、50、62.5、75、87.5、100μg/mL的标准溶液，采用与待测样品相同的测定方法进行构建。
A液的制备步骤如下：称取5g四硼酸钠粉末，用80mL热水(85℃)溶解，定容至100mL。
B液的制备步骤如下：称取1g对二甲氨基苯甲醛，加入15mL乙酸溶解，加入1.25mL浓盐酸(6M)，混匀后定容至100mL。
出发菌株链霉菌SCUT-1、实施例1得到的重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19和对比例1得到的重组菌SCUT-Elpmo-Echi19发酵虾壳生产几丁寡糖的产量对比如图3所示。测定结果表明，链霉菌SCUT-1几丁寡糖的产量为0.726g/L；重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19几丁寡糖的产量为1.89g/L，是出发菌株的2.60倍；重组菌SCUT-Elpmo-Echi19几丁寡糖的产量为0.813g/L，是出发菌株的1.12倍。
(4)几丁质酶酶活的测定，具体步骤如下：
取60μL步骤(2)得到的上清发酵液于离心管中，并另取60μL高温灭活(沸水浴10min)的上清发酵液于另一离心管中作为对照组。向两根离心管中分别加入40μL的2％胶体几丁质溶液，再分别加入120μL的pH7.0磷酸盐缓冲液，混匀后于40℃反应1h。通过沸水浴5min终止反应，得到反应液。将离心管于12000×g条件下离心3min，取80μL反应液上清于另一干净离心管中，通过实施例2步骤(3)中所述方法测定上清中的几丁寡糖含量。以单位时间内、单位体积发酵液水解胶体几丁质所能释放的可溶性几丁寡糖含量计算得到几丁质酶酶活。
出发菌株链霉菌SCUT-1、实施例1得到的重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19和对比例1得到的重组菌SCUT-Elpmo-Echi19发酵虾壳生产几丁寡糖时的几丁质酶酶活对比如图4所示。测定结果表明，重组菌SCUT-Olpmo-Ochi19的几丁质酶酶活是链霉菌SCUT-1的3.28倍；重组菌SCUT-Elpmo-Echi19的几丁质酶酶活是链霉菌SCUT-1的1.44倍。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种链霉菌重组菌，其特征在于：
含有重组载体；所述重组载体含有启动子scutP1、裂解性多糖单加氧酶LPMO的编码基因和几丁质酶Chi19的编码基因；
所述的启动子scutP1的核酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述的裂解性多糖单加氧酶LPMO的编码基因的核酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述的几丁质酶Chi19的编码基因的核酸序列如SEQ ID No.3所示；
链霉菌重组菌的宿主菌为链霉菌（Streptomyces sp.）SCUT-1；
所述的链霉菌（Streptomyces sp.）SCUT-1，保藏编号为GDMCC No：60612，该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心。
2.权利要求1所述的链霉菌重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以pSET152-ermE*质粒为模板通过PCR扩增得到pSET152质粒骨架；以链霉菌SCUT-1基因组DNA为模板通过PCR扩增得到scutP1启动子片段；
（2）将步骤（1）得到的pSET152质粒骨架与scutP1启动子片段通过无缝克隆连接，得到带有scutP1启动子的重组质粒pSET152-scutP1；
（3）以链霉菌SCUT-1基因组DNA为模板，通过PCR分别扩增得到裂解性多糖单加氧酶LPMO编码基因片段lpmo和几丁质酶Chi19编码基因片段chi19；
（4）通过NdeI限制性核酸内切酶对步骤（2）得到的重组质粒pSET152-scutP1进行酶切线性化；将线性化后的重组质粒pSET152-scutP1分别与步骤（3）得到的lpmo片段和chi19片段通过无缝克隆连接，获得重组质粒pSET152-scutP1-lpmo和重组质粒pSET152-scutP1-chi19；
（5）以步骤（4）得到的重组质粒pSET152-scutP1-chi19为模板，通过PCR扩增得到片段scutP1-chi19；通过NdeI限制性核酸内切酶对步骤（4）得到的重组质粒pSET152-scutP1-lpmo进行酶切线性化；将线性化后的重组质粒pSET152-scutP1-lpmo与片段scutP1-chi19通过无缝克隆连接，获得重组质粒pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19；
（6）将步骤（5）得到的重组质粒pSET152-scutP1-lpmo-scutP1-chi19转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，再通过细菌接合的方式转入链霉菌SCUT-1，获得链霉菌重组菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：
步骤（1）中PCR扩增得到pSET152质粒骨架用到的引物如下所示：
pET152ProLineFw： 5’-catatgttggggatcctctagaggatccg-3’；
pET152ProLineRv： 5’-agtcgacctgcagcccaagc-3’；
步骤（1）中PCR扩增得到scutP1启动子片段用到的引物如下所示：
scutP1-Fw：
5’-gcttgggctgcaggtcgactCGGCCCCTGAGCACGAA-3’；
scutP1-Rv：
5’-tagaggatccccaacatatgGACGGTCCTTCCGGG-3’；
步骤（3）中PCR扩增得到裂解性多糖单加氧酶LPMO编码基因片段lpmo用到的引物如下所示：
lpmo-Fw：
5’-cccggaaggaccgtccaATGCGCAGAAGACTCGGAG-3’；
lpmo-Rv：
5’-ctagaggatccccaacatatgTCAGAACCGCACGTCCGC-3’；
步骤（3）中PCR扩增得到几丁质酶Chi19编码基因片段chi19用到的引物如下所示：
chi19-Fw：
5’-cccggaaggaccgtccaATGTCAGGGAAGCGCATGG-3’；
chi19-Rv：
5’-ctagaggatccccaacatatgTCAGCAGCTGAGGTTGCCG-3’；
步骤（5）中PCR扩增得到片段scutP1-chi19用到的引物如下所示：
scutP1-chi19-Fw：
5’-acgtgcggttctgacaCGGCCCCTGAGCACGAAG-3’；
scutP1-chi19-Rv：
5’-TCCTCTAGAGGATCCCCAACA-3’。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：
步骤（6）所述的转化的方法为电转化；
步骤（6）所述的细菌接合具体包括以下步骤：
S1：将转化后的上述大肠杆菌接种至含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基中，培养；取培养后得到的菌液，离心，去除上清；用LB培养基重悬菌体，离心，去除上清，得到大肠杆菌菌体；
S2：取链霉菌SCUT-1孢子保藏液孵育后，与步骤S1收集的大肠杆菌菌体混合均匀后，涂布于固体MS培养基平板，培养；
S3：取出培养后的固体MS培养基平板；将安普霉素和萘啶酮酸水溶液均匀覆盖在固体MS培养基平板上；平板充分晾干后培养；待MS培养基平板上长出明显单菌落后，用挑取单菌落接种至加入了安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基中，震荡培养；
步骤S2中所述的链霉菌SCUT-1 孢子保藏液通过如下制备步骤制备：
将链霉菌SCUT-1接种至固体高氏1号培养基平板，培养至产生灰绿色孢子；将链霉菌SCUT-1孢子接种至孢子保藏培养基，震荡培养，得到链霉菌SCUT-1菌液。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：
步骤S1中所述的含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基包括以下组分：胰蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、酵母提取物5 g/L、安普霉素50 mg/L、氯霉素25 mg/L和卡那霉素50 mg/L；
步骤S1中所述的培养的条件为：30~45℃、150~250 rpm培养12~20 h
步骤S2中所述的孵育的条件为40~60℃孵育5~15 min；
步骤S2中所述的固体MS培养基包括以下组分：20 g/L甘露醇、20 g/L黄豆粉、10 mmol/L 氯化镁和20 g/L琼脂粉；
步骤S2中所述的培养的条件为：20~40℃倒置培养12~20 h；
步骤S3中所述的安普霉素和萘啶酮酸水溶液的溶质由以下组分组成：安普霉素1 mg/L和萘啶酮酸0.5 mg/L；溶剂为蒸馏水；
步骤S3中所述的培养的条件为：30~45℃培养3~5天；
步骤S3中所述的含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基包括如下组分：:胰蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、酵母提取物5 g/L、安普霉素50 mg/L和萘啶酮酸25 mg/L；
步骤S3中所述的震荡培养的条件为：30~45℃、150~250 rpm震荡培养45~51 h。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：
所述的固体高氏1号培养基包括以下组分：20 g/L可溶性淀粉、1 g/L硝酸钾、0.5 g/L磷酸氢二钾、0.5 g/L七水硫酸镁、0.5 g/L氯化钠、0.01 g/L七水硫酸亚铁和20 g/L琼脂粉；
所述的培养至产生灰绿色孢子的培养条件为30~45℃培养5~7天；
所述的孢子保藏培养基包括以下组分：16 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，5 g/L氯化钠。
7.权利要求1所述的链霉菌重组菌在利用虾壳生产几丁寡糖中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
以虾壳为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述发酵培养基中接种权利要求1所述的链霉菌重组菌进行发酵培养，通过所述的重组菌对虾壳中的几丁质组分进行降解得到几丁寡糖。
9.根据权利要求7或8任一项所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：
P1：将链霉菌重组菌接种于种子培养基中，通过培养得到链霉菌重组菌种子液；
P2：将步骤P1所得的链霉菌重组菌种子液接种于发酵培养基中，发酵，收集上清，得到几丁寡糖溶液；
步骤P1中所述的种子培养基包括以下组分：10.0 g/L胰蛋白胨、10.0 g/L氯化钠和5.0g/L酵母提取物；
步骤P2中所述的发酵培养基包括以下组分：100 g/L干虾壳、0.5 g/L无水硫酸镁、0.4g/L磷酸二氢钾、0.8 g/L三水磷酸氢二钾和0.02 g/L七水硫酸亚铁。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于：
步骤P1中所述的培养条件为：30~45℃，150~250 rpm，培养时间15~35 h；
步骤P2中所述的种子液的接种量为发酵培养基体积的1%；
步骤P2中所述的发酵培养条件为：30~45℃，150~250 rpm，培养时间15~35 h。
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Streptomyces sp. SCUT-3 chromosome, complete genome.GenBank: CP046907.1.2020,参见核苷酸序列及相关信息. *

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