WO2018047792A1 - サイログロブリンの測定方法及び測定試薬 - Google Patents

サイログロブリンの測定方法及び測定試薬 Download PDF

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pretreatment
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thyroglobulin
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紘輔 山本
由之 北村
慎太郎 八木
克己 青柳
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富士レビオ株式会社
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    • G01N2800/046Thyroid disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring thyroglobulin and a measurement reagent.
  • Thyroglobulin is a glycoprotein having a molecular weight of 660,000 that is made only from thyroid follicular cells. Biosynthesized Tg is released into the follicular cavity. During this process, the iodine molecule is bound to the tyrosine group in the Tg molecule by the action of peroxidase, and thyroid hormone is synthesized. Tg in the follicular cavity is taken up again by the follicular cells and decomposed in the follicular cells, resulting in the release of thyroid hormone. This process is activated by the action of thyroid stimulating hormone (TSH).
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • Tg has a high organ specificity and is a very useful marker for thyroid diseases.
  • blood Tg is used as a marker for knowing the surgical evaluation of differentiated thyroid cancer and the presence or absence of postoperative recurrence or metastasis.
  • it is useful for the effect of treatment in Graves' disease, the index of remission, the determination and differentiation of congenital hypothyroidism, and therapeutic monitoring.
  • preoperative diagnosis of nodular goiter and the differentiation between benign thyroid disease and malignant tumors may be made in combination with image diagnosis.
  • TgAb anti-thyroglobulin antibody
  • An object of the present invention is to provide a method and a reagent for measuring thyroglobulin that can measure a more accurate amount of thyroglobulin by a single test without being affected by interference of an anti-thyroglobulin antibody.
  • the present inventors have determined that either or both of a surfactant and an acidifying agent are used before measuring the thyroglobulin in a biological sample before subjecting the biological sample to an immune reaction.
  • the present inventors have found that a more accurate thyroglobulin measurement value can be obtained without being affected by the anti-thyroglobulin antibody by passing through a pretreatment step of mixing with a pretreatment liquid containing the present invention.
  • the configuration of the present invention is as follows.
  • Immunoassay for thyroglobulin in a sample separated from a living body comprising a pretreatment step of mixing a sample separated from a living body and a pretreatment liquid containing either or both of a surfactant and an acidifying agent. How to measure.
  • the method according to (3), wherein the pretreatment step is performed under heating conditions.
  • a reagent for thyroglobulin immunoassay comprising a pretreatment solution containing either or both of a surfactant and an acidifying agent.
  • Tg thyroglobulin
  • concentration of “%” described in the present specification is a weight / volume (w / v) concentration display.
  • the thyroglobulin (Tg) measured in the present invention is Tg derived from any animal, but is preferably a mammal (eg, a primate such as a human, a monkey, or a chimpanzee; a rodent such as a mouse, a rat, or a rabbit) Pets such as dogs and cats; domestic animals such as pigs and cattle; working animals such as horses and sheep), more preferably Tg derived from primates, and particularly preferably Tg derived from humans. is there.
  • a mammal eg, a primate such as a human, a monkey, or a chimpanzee; a rodent such as a mouse, a rat, or a rabbit
  • Pets such as dogs and cats; domestic animals such as pigs and cattle; working animals such as horses and sheep
  • the method of the present invention is a method for measuring Tg present in a biological sample by an immune reaction in which the biological sample reacts with an antibody.
  • the biological sample is pretreated. It includes a pretreatment step by mixing with a liquid.
  • Tg can be released from autoantibodies (TgAb) or the like.
  • the pretreatment liquid may contain either a surfactant or an acidifying agent, or may contain both.
  • the pretreatment liquid contains either a surfactant or an acidifying agent.
  • the volume ratio of the biological sample to be mixed in the pretreatment step and the pretreatment liquid is preferably 1:10 to 10: 1, particularly 1: 5 to 5: 1, and more preferably 1: 3 to 3: 1.
  • the biological sample used in the present invention is not particularly limited as long as it can contain Tg.
  • Tg for example, serum, plasma, whole blood, urine, feces, oral mucosa, pharyngeal mucosa, intestinal mucosa and biopsy samples (examples) Thyroid needle aspiration (FNA) sample, intestinal tract sample, liver sample).
  • the biological sample is serum or plasma.
  • any of an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant can be used.
  • Anionic surfactants are preferred.
  • sodium dodecyl sulfate (SDS), N-lauroyl sarcosine, lithium dodecyl sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate, deoxycholic acid and the like can be preferably used, and SDS can be particularly preferably used.
  • the concentration of the surfactant needs to be sufficient to release Tg from TgAb or the like.
  • the concentration at the time of pretreatment of the admixture mixed with the biological sample is 0.1 to 12.5%, particularly 0.25 to 10%, and further 0.5 to 7.5%. It is preferable. By setting the SDS concentration to 0.1 to 10%, it is possible to sufficiently release Tg and hardly cause SDS precipitation or the like.
  • a cationic surfactant is used to reduce the influence of the anionic surfactant brought into the reaction system after the pretreatment.
  • a neutralizing solution containing one or a plurality of zwitterionic surfactants and nonionic surfactants may be added.
  • the acidifying agent contained in the pretreatment liquid hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid and the like can be suitably used.
  • the normality of the acid in the pretreatment liquid is preferably more than 0.05N and 0.5N or less, particularly 0.1N or more and 0.4N or less as the concentration during the pretreatment.
  • a cationic surfactant When using an acidifying agent for pretreatment, it is preferable to add a cationic surfactant so that precipitation does not occur when mixed with a biological sample.
  • a cationic surfactant having a single-chain alkyl group having 10 or more carbon atoms and a tertiary amine or quaternary ammonium salt in the same molecule is particularly preferable. .
  • surfactants examples include decyltrimethylammonium chloride, dodecyltrimethylammonium chloride, tetradecyltrimethylammonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride (C16TAC), decyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium bromide, tetradecyltrimethylammonium chloride.
  • examples include bromide, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), laurylpyridinium chloride, tetradecylpyridinium chloride, cetylpyridinium chloride and the like.
  • the addition amount of the cationic surfactant is preferably from 0.1% to 15%, more preferably from 0.5% to 10%, in terms of the concentration when mixed with the specimen.
  • the pretreatment liquid containing the acidifying agent may further contain other surfactants such as a nonionic surfactant in addition to the cationic surfactant. By adding another surfactant, it becomes possible to detect Tg with higher sensitivity.
  • a reducing agent may be further used.
  • the reducing agent include existing reducing agents such as 2- (diethylamino) ethanethiol hydrochloride (DEAET), tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP), dithiothreitol (DTT), 2-mercaptoethanol and the like. Any of them can be used, but DEAET and TCEP can be particularly preferably used for the reason of stability in a solution.
  • the concentration of the reducing agent is preferably 0.5 to 100 mM, particularly 1.0 to 50 mM, more preferably 2.0 to 20 mM as the final concentration of the admixture with the biological sample.
  • the pretreatment liquid may contain other protein denaturing agents such as urea and thiourea as necessary.
  • the concentration of the denaturing agent is preferably 0.1 M or more, more preferably 0.5 M or more and less than 4 M in terms of the concentration at the time of treatment.
  • any of monosaccharides, disaccharides, citric acid, and citrates, or a combination thereof may be added to the pretreatment liquid.
  • the pretreatment liquid may contain a chelating agent such as EDTA.
  • the biological sample and the pretreatment liquid are mixed and then further heated.
  • a surfactant used in the pretreatment liquid, it is preferable to heat in order to enhance the effect.
  • the heating temperature is preferably 35 to 95 ° C, particularly 50 to 90 ° C, and more preferably 70 to 85 ° C.
  • the heating time is preferably 1 minute or longer, particularly 3 minutes or longer, and further preferably 5 minutes or longer. There is no particular upper limit for the heating time, but a heating time of usually 60 minutes or less, particularly 30 minutes or less may be sufficient.
  • reaction Step The biological sample mixture obtained in the above pretreatment step of the method of the present invention is then subjected to an immunoassay reaction step.
  • the biological sample mixed solution is mixed with a buffer solution, and the antigen in the mixed solution is reacted with an antibody against Tg.
  • Tg immunoassay itself, and any immunoassay capable of quantifying Tg can be employed.
  • the buffer examples include those based on MES buffer, phosphate buffer, Tris buffer, and carbonate buffer, and those based on phosphate buffer can be preferably used.
  • a pretreatment solution containing a surfactant in order to absorb unreacted surfactant, for example, BSA, polyvinylpyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA) dextran sulfate sodium, etc. It is preferable to use a buffer solution containing a water-soluble polymer at a final concentration of 0.01 to 10.0%, particularly 0.05 to 5.0% when mixed with the pretreated admixture.
  • the buffer which has the buffer capacity which contains an alkaline agent or can reduce the influence of the acid of a pre-processing liquid.
  • the mixing of the admixture and the buffer in the pretreatment step is preferably 1:10 to 10: 1, particularly 1: 5 to 5: 1, and more preferably 1: 3 to 3: 1 by volume.
  • the antibody against Tg used in the method of the present invention is an antibody that recognizes at least a part of the amino acid sequence of Tg as an epitope.
  • the antibody against Tg is not particularly limited, and any antibody that recognizes a known epitope can be used.
  • the antibody against Tg recognizes a Tg-specific epitope (particularly, a human Tg-specific epitope).
  • Antibody is an antibody that recognizes at least a part of the amino acid sequence of Tg as an epitope.
  • the antibody against Tg is not particularly limited, and any antibody that recognizes a known epitope can be used.
  • the antibody against Tg recognizes a Tg-specific epitope (particularly, a human Tg-specific epitope).
  • Antibody is an antibody that recognizes at least a part of the amino acid sequence of Tg as an epitope.
  • the antibody against Tg may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody against Tg may be any isotype of immunoglobulin (eg, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY).
  • the antibody against Tg may also be a full length antibody.
  • a full-length antibody refers to an antibody comprising a heavy chain and a light chain comprising a variable region and a constant region, respectively (eg, an antibody comprising two Fab portions and an Fc portion).
  • the antibody against Tg may also be an antibody fragment derived from such a full-length antibody.
  • the antibody fragment is a part of a full-length antibody, and examples thereof include constant region-deleted antibodies (eg, F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv).
  • the antibody against Tg may also be a modified antibody such as a single chain antibody.
  • Antibodies against Tg can be prepared using a conventionally known method.
  • an antibody against Tg can be prepared using the above epitope as an antigen.
  • many antibodies against Tg that recognize epitopes as described above are commercially available, such commercially available products can also be used.
  • the antibody against Tg may be immobilized on a solid phase.
  • an antibody immobilized on a solid phase may be simply referred to as an immobilized antibody.
  • the solid phase include a solid phase capable of containing or mounting a liquid phase (eg, a support such as a plate, a membrane, a test tube, and a container such as a well plate, a microchannel, a glass capillary, a nanopillar, and a monolith column). And a solid phase that can be suspended or dispersed in a liquid phase (eg, a solid phase carrier such as particles).
  • the solid phase material include glass, plastic, metal, and carbon.
  • the solid phase material a non-magnetic material or a magnetic material can be used, but a magnetic material is preferable from the viewpoint of easy operation.
  • the solid phase is preferably a solid phase carrier, more preferably a magnetic solid phase carrier, and even more preferably magnetic particles.
  • a method for immobilizing an antibody a conventionally known method can be used. Examples of such a method include a physical adsorption method, a covalent bonding method, a method using an affinity substance (eg, biotin, streptavidin), and an ion binding method.
  • the antibody against Tg is an antibody immobilized on a solid phase, preferably an antibody immobilized on a magnetic solid phase, more preferably immobilized on a magnetic particle. Antibody.
  • the mixed solution and the buffer solution in the pretreatment step may be mixed and then contacted with the immobilized antibody.
  • the antibody immobilized on the particles may be placed in the buffer in advance.
  • a particle liquid may be used, and the admixed liquid and the particle liquid may be mixed.
  • the reaction step may be performed only in the primary reaction step as in the immunoagglutination method or the competitive method, but a secondary reaction step may be provided as in the sandwich method.
  • the antibody against Tg may be labeled with a labeling substance.
  • an antibody labeled with a labeling substance may be simply referred to as a labeled antibody.
  • the labeling substance include enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase), affinity substances (eg, streptavidin, biotin), fluorescent substances or proteins (eg, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green) Fluorescent proteins, red fluorescent proteins), luminescent or light absorbing materials (eg, luciferin, aequorin, acridinium, ruthenium), radioactive materials (eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I).
  • the antibody used for the secondary reaction may be labeled with such a labeling substance.
  • the method of the present invention comprises another antibody against Tg that recognizes a different epitope from the antibody against Tg as the antibody used in the secondary reaction.
  • the details of the epitope recognized by such another antibody are the same as those described in detail for the above-mentioned antibody against Tg (however, when used in combination, the type of epitope differs).
  • the combination of an epitope recognized by an antibody against Tg and an epitope recognized by another antibody against Tg is not particularly limited. The use of such another antibody is preferable, for example, when the sandwich method is used.
  • Detection Step When a label is used for the primary antibody or the secondary antibody, detection is performed by a method suitable for the label used, for example, by adding an enzyme substrate when an enzyme label is used.
  • a method suitable for the label used for example, by adding an enzyme substrate when an enzyme label is used.
  • ALP alkaline phosphatase
  • a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) system using (AMPPD) as an enzyme substrate can be used.
  • the method of the present invention is an immunoassay using an antibody against Tg.
  • immunoassay examples include a direct competition method, an indirect competition method, and a sandwich method.
  • immunoassays include chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), chemiluminescent immunoassay (CLIA), immunoturbidimetric assay (TIA), enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competitive ELISA, indirect competitive ELISA, And sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), latex agglutination, fluorescence immunoassay (FIA), and immunochromatography.
  • CLIA chemiluminescent enzyme immunoassay
  • CLIA chemiluminescent immunoassay
  • TIA immunoturbidimetric assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • immunochromatography immunochromatography
  • an antibody against a target antigen to be measured (Tg in the present invention) is immobilized on a solid phase (as described above for the solid phase and the solid phase), and blocking treatment (serum) to prevent non-specific adsorption.
  • a test sample containing the target antigen in the present invention, a biological sample subjected to the pretreatment step as described above
  • a certain amount of labeled antigen The label is as described above
  • the label bound to the solid phase is quantified.
  • the amount of antigen in an unknown test sample can be measured by measuring the amount of labeling of the unknown test sample and applying the measured labeling amount to a calibration curve.
  • the direct competition method itself is well known in the art and is described, for example, in US Pat.
  • a target antigen (Tg in the present invention) is immobilized on a solid phase (the solid phase and the solid phase are as described above).
  • a test sample containing the target antigen in the present invention, a biological sample subjected to the pretreatment step as described above
  • a certain amount of anti-target antigen antibody are mixed, and the solid phase is mixed. React with the conjugated antigen.
  • the anti-target antigen antibody bound to the solid phase is quantified. This can be performed by reacting a labeled secondary antibody (labeled as described above) against the anti-target antigen antibody, and measuring the labeled amount after washing.
  • a standard curve is prepared by preparing antigen standard solutions of various known concentrations, immobilizing each of them on a solid phase and measuring the amount of label.
  • the amount of antigen in an unknown test sample can be measured by measuring the amount of labeling of the unknown test sample and applying the measured labeling amount to a calibration curve. It is also possible to use a labeled primary antibody without using a labeled secondary antibody.
  • the indirect competition method itself is well known in this field, and is described, for example, in US Pat.
  • an anti-target antigen antibody is immobilized on a solid phase (as described above for the solid phase and the solid phase), and after the blocking treatment, a test sample containing the target antigen (in the present invention, pretreatment as described above)
  • a test sample containing the target antigen in the present invention, pretreatment as described above
  • a standard curve is prepared by preparing antigen standard solutions of various known concentrations and measuring the amount of label immobilized on the solid phase for each.
  • the amount of antigen in an unknown test sample can be measured by measuring the amount of labeling of the unknown test sample and applying the measured labeling amount to a calibration curve.
  • the sandwich method itself is well known in the art and is described, for example, in US 20150309016 A1.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay method (CLEIA), chemiluminescent immunoassay (CLIA), enzyme immunoassay method (EIA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescent immunoassay (FIA) are the direct competitive method, indirect method described above.
  • the immunoassays are classified based on the type of label used when performing the competitive method, the sandwich method or the like.
  • the chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) is an immunoassay using an enzyme (for example, alkaline phosphatase described above) as a label and a substrate (for example, AMPPD described above) that generates a chemiluminescent compound as a substrate.
  • Enzyme immunoassay is an immunoassay that uses an enzyme (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase, etc.) as a label.
  • an enzyme eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase, etc.
  • a substrate for each enzyme a compound that can be quantified by measuring absorbance or the like is used.
  • ⁇ -galactosidase 1,2-phenylenediamine (OPD), 3,3'5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), etc.
  • OPD 1,2-phenylenediamine
  • TMB 3,3'5,5'-tetramethylbenzidine
  • p-nitrophenyl phosphate In the case of ⁇ -galactosidase, such as pNPP), MG: 4-methylumbelliferyl galactoside, NG: nitrophenyl galactoside, etc., and in the case of luciferase, luciferin and the like are used.
  • Radioimmunoassay is a method using a radioactive substance as a label.
  • radioactive substance examples include radioactive elements such as 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, and 125 I as described above.
  • Fluorescence immunoassay is a method using a fluorescent substance or fluorescent protein as a label, and examples of the fluorescent substance or fluorescent protein include fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green fluorescent protein, red fluorescent protein and the like as described above. . Immunoassays themselves using these labels are well known in the art and are described, for example, in US 8039223 B and US 20150309016 A1.
  • the immunoturbidimetric method is an immunoassay utilizing a phenomenon in which turbidity is increased by an antigen-antibody complex produced by an antigen-antibody reaction between a target antigen to be measured (Tg in the present invention) and an antibody against the antigen. It is. Various known concentrations of antigen are added to the anti-target antigen antibody solution, turbidity is measured for each, and a calibration curve is created. By measuring the turbidity of an unknown test sample in the same manner and applying the measured turbidity to a calibration curve, the amount of antigen in the unknown test sample can be measured.
  • the immunoturbidimetric method itself is well known and is described, for example, in US 20140186238 A1.
  • the latex agglutination method is similar to the immunoturbidimetric method, but is a method using a suspension of latex particles in which an anti-target antigen antibody is immobilized on the surface in place of the antibody solution in the immunoturbidimetric method.
  • Immunoturbidimetry and latex agglutination methods themselves are well known in the art and are described, for example, in US 820,398 B.
  • the immunochromatography method is a method in which the above-described sandwich method or competitive method is performed on a substrate (also referred to as a matrix or a strip) formed of a porous material such as filter paper, cellulose membrane, glass fiber, or nonwoven fabric.
  • a substrate also referred to as a matrix or a strip
  • a test sample containing the target antigen in the present invention, a living body subjected to the pretreatment step as described above Sample
  • the developing solution is flowed from the upstream side
  • the target antigen is moved to the detection zone, and is immobilized on the detection zone.
  • the target antigen in the test sample is detected by sandwiching the immobilized target antigen with a labeled secondary antibody and detecting the label immobilized in the detection zone.
  • a labeled zone containing the labeled secondary antibody upstream of the detection zone, the conjugate of the target antigen and the labeled secondary antibody is immobilized in the detection zone.
  • the label is an enzyme
  • a substrate zone including the enzyme substrate is also provided upstream of the detection zone.
  • the target antigen can be immobilized in the detection zone, and the target antigen in the test sample can compete with the target antigen immobilized in the detection zone.
  • the target antigen in the test sample can be detected or quantified.
  • Immunochromatographic methods themselves are well known in the art and are described, for example, in US Pat.
  • the Tg measuring reagent of the present invention is a measuring reagent capable of realizing the above-described Tg measuring method.
  • the measuring reagent of the present invention is characterized in that it contains a pretreatment solution containing either or both of a surfactant and an acidifying agent as a constituent component in addition to the configuration used in a normal immunoassay.
  • the reagent of the present invention contains each component in a form isolated from each other or in the form of a composition.
  • each component may be provided in a form housed in a different container (eg, tube, plate), but some of the components are in the form of a composition (eg, in the same solution). May be provided.
  • the reagent of the present invention may be provided in the form of a device. Specifically, all of the components may be provided in a form housed in the device. Alternatively, some of the components may be provided in a form housed in the device, and the rest may be provided in a form that is not housed in the device (eg, a form housed in a different container). In this case, components that are not contained in the device may be used by being injected into the device during measurement of the target substance.
  • the reagent of the present invention may have a configuration depending on the type of immunoassay to be employed.
  • the reagent of the present invention includes: i) pretreatment solution, ii) antibody against Tg, iii) buffer solution as an essential component, and iv) against Tg as an optional component. It may contain another antibody, v) a labeling substance, vi) a diluent, and optionally vii) a substrate that reacts with the labeling substance.
  • the components of ii) and iii) may be contained in the same solution.
  • the component iv) may be labeled with v) a labeling substance.
  • the antibody against Tg may be immobilized on magnetic particles.
  • the microwell plate was washed 3 times with PBS, and then a blocking solution (PBS containing 1.0% BSA, 3% sucrose, 0.05% ProClin® 300) was dispensed at 200 ⁇ L / well at room temperature. Incubation was for 2 hours. After removing the blocking solution, the plate was vacuum-dried to obtain an anti-Tg antibody plate.
  • a blocking solution PBS containing 1.0% BSA, 3% sucrose, 0.05% ProClin® 300
  • Purified human Tg (manufactured by BBI solutions) at a known concentration was diluted with TgAb-negative serum to prepare standard solutions of 0, 10, 50, 200, and 400 ng / mL. For each standard solution, an acidified pretreated sample and an untreated sample were prepared in the same manner as described above.
  • TgAb value of each specimen was measured using “Lumipulse (registered trademark) TgAb” (manufactured by Fujirebio).
  • Table 1 shows the measurement results of the acidification pretreated sample and untreated sample of each specimen and standard solution. Further, FIG. 1 shows the overall correlation between the measured values of the acidified pretreated specimen and the untreated specimen, and FIG. 2 shows the correlation of a region having a particularly low absorbance. In particular, untreated specimens with high TgAb values tended to show absorbances below 0 ng / mL, but the absorbance increased with pretreatment. It was suggested that measurement was possible for specimens that could not measure Tg until now.
  • Example 2 Gel Filtration Test of Acidification Pretreatment Sample>
  • the measured value increased by the pretreatment No. No. 6 and No. in which the measured value was not changed by the pretreatment.
  • untreated samples and acidified pretreated samples were prepared and subjected to gel filtration chromatography.
  • the untreated sample was prepared by mixing 100 ⁇ L of each specimen with 300 ⁇ L of the neutralizing solution.
  • the acidification pretreatment sample was prepared by mixing 100 ⁇ L of each specimen and 100 ⁇ L of the acidification pretreatment solution and heating at 37 ° C. for 6 minutes, and then adding 200 ⁇ L of a buffer solution. These samples were filtered through a 0.45 ⁇ m pore filter, and 250 ⁇ L was passed through a gel filtration column.
  • a protein molecular weight marker manufactured by GE, including thyroglobulin was subjected to gel filtration under the same conditions, and UV absorption was measured.
  • thyroglobulin formed a complex with TgAb or the like to form a polymer, and the reactivity in the Tg measurement system was lowered, whereas Tg was removed from the complex by the acidification pretreatment. It was suggested that it was liberated and the reactivity in the Tg measurement system was also improved.
  • Example 3 acidifying agent The optimum concentration of the acidifying agent used for the acidification pretreatment was examined.
  • the TgAb was positive and the influence (interference) of the TgAb on the Tg measurement value was relatively weak. 13, no. 16 specimens, TgAb positive and TgAb interference was relatively strong. 19, no. 44 specimens and TgAb negative No. 25, no.
  • a total of 6 samples of 30 samples, each containing 50 ⁇ L, except hydrochloric acid 2N, 1N, 0.8N, 0.6N, 0.4N, 0.2N, 0.1N, 0.05N, 0.025N, 0N was mixed with 50 ⁇ L of the acidification pretreatment solution prepared in the same manner as the acidification pretreatment solution of Example 1, and heated at 37 ° C. for 6 minutes. Subsequently, 100 microliters of sodium hydroxide solution equal to the said hydrochloric acid was added and neutralized. To the solution after neutralization, 200 ⁇ L of the same secondary reaction solution as in Example 1 was added to obtain a pre-acidification sample. About each acidification pre-processing sample, it used for the ELISA method similar to Example 1, and obtained the absorbance data of 450 nm / 630 nm.
  • the absorbance data of each sample is shown in Table 2 and FIG.
  • the absorbance decreased as the acidifying agent concentration in the pretreatment liquid increased. This is considered to be due to the fact that Tg denaturation occurred due to the influence of acid and that the antigen-antibody reaction was inhibited due to the influence of the salt produced during neutralization.
  • the absorbance was lower in the region where the acidifying agent concentration was high, but the absorbance was lower than that without the acidifying agent when the acidifying agent concentration was 0.1 N. Was up.
  • the absorbance was the same as that of other samples having a small effect of TgAb, and the absorbance decreased similarly to the other samples as the acidification concentration increased.
  • the acidifying agent concentration exceeded 0.5 N
  • the absorbance decreased to the vicinity of the blank, and Tg measurement became difficult as a whole.
  • the acidifying agent in the acidification pretreatment liquid has a pretreatment concentration of more than 0.05 N and not more than 0.5 N. In particular, it has been found that it is preferable to set it to 0.1 N or more and 0.4 N or less.
  • SDS pretreatment effect confirmation test (ELISA method)> About 51 serum samples of patients with thyroid-related diseases, 50 ⁇ L of each sample was mixed with 100 ⁇ L of SDS pretreatment solution (347 mM SDS, 2 mM EDTA2Na, 10 mM Tris-HCl, pH 7.2), and the mixture was mixed at 80 ° C. with shaking at 1000 rpm. Heated for minutes. Next, the mixture was diluted 4-fold with a neutralizing solution (1.2% C16TAC, 4% CHAPS, 2.9% Tween20 (trade name)), incubated at room temperature for 30 minutes, and then 15 minutes at 15 ° C. and 12000 rpm.
  • SDS pretreatment solution 347 mM SDS, 2 mM EDTA2Na, 10 mM Tris-HCl, pH 7.2
  • each of the SDS pretreated sample and the untreated specimen were mixed with 100 ⁇ L of a buffer solution (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA2Na, 6.0% BSA, 0.05% ProClin300 (registered trademark), pH 7.2), 150 ⁇ L each was dispensed onto an anti-Tg antibody plate prepared in the same manner as in Example 1. Incubated for 2 hours at room temperature.
  • a buffer solution 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA2Na, 6.0% BSA, 0.05% ProClin300 (registered trademark), pH 7.2
  • biotinylated anti-Tg antibody 5E6 (manufactured by AbD Serotec) was added to the secondary reaction solution (24 mM potassium dihydrogen phosphate, 76 mM hydrogen phosphate).
  • a TMB substrate solution manufactured by Nacalai Tesque
  • a TMB substrate solution manufactured by Nacalai Tesque
  • the reaction was stopped by dispensing 100 ⁇ L / well of 1N sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm / 630 nm of each well was measured.
  • the Tg measurement value of each specimen was calculated based on a calibration curve prepared using the acidification pretreatment standard solution and the untreated standard solution, respectively. All specimens showing an absorbance lower than the 0 ng / mL standard solution were set to 0 ng / mL.
  • the TgAb value of each specimen was measured with Lumipulse (registered trademark) TgAb (Fujirebio).
  • Table 3 shows the measurement results of the SDS pretreated sample and the untreated sample of each specimen and standard solution. Further, FIG. 6 shows the overall correlation between the measured values of the acidified pretreated specimen and the untreated specimen, and FIG. 7 shows the correlation in a particularly low absorbance region. In particular, many untreated samples with a high TgAb value showed an absorbance near 0 ng / mL, but these absorbances were increased by pretreatment, suggesting that the false low value was improved.

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Abstract

要約 抗サイログロブリン抗体の干渉の影響を受けることなく、単独検査でより正確なサイログロブリン量を測定可能な、サイログロブリンの測定方法及び測定試薬が開示されている。サイログロブリンの測定方法は、生体から分離された試料と、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液とを混和する前処理工程を含み、生体から分離された試料中のサイログロブリンをイムノアッセイにより測定する。サイログロブリンのイムノアッセイ用試薬は、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液を備える。

Description

サイログロブリンの測定方法及び測定試薬
 本発明は、サイログロブリンの測定方法及び測定試薬に関する。
 サイログロブリン(Tg)は、甲状腺濾胞細胞のみでつくられる分子量66万の糖蛋白である。生合成されたTgは濾胞腔へ放出される。この経過中に、ペルオキシダーゼの作用によってTg分子中のチロシン基にヨード分子が結合して、甲状腺ホルモンの合成が行われる。濾胞腔のTgは再度濾胞細胞にとりこまれ、濾胞細胞内で分解され、甲状腺ホルモンの放出が起こる。またこの過程は、甲状腺刺激ホルモン(TSH)の働きにより活性化される。故に、正常時では、Tgそのものの血中への放出はごくわずか起こるのみであり、Tgの血中放出は甲状腺の何らかの異常を示す。よってTgは臓器特異性が高く甲状腺疾患にはきわめて有用なマーカーである。特に、血中Tgは、甲状腺分化癌の手術評価、および術後再発や転移の有無を知るマーカーとして使用される。その他、バセドウ病での治療の効果、寛解の指標、先天性甲状腺機能低下症の病型の決定や鑑別、治療モニタリングなどにも有用である。また、画像診断との組合せにより結節性甲状腺腫の術前診断や良性の甲状腺疾患と悪性腫瘍とを鑑別する可能性も示唆されている。
 しかし、被験者が抗サイログロブリン抗体(TgAb)陽性の場合、実際はTg高値でも測定上の問題で低値になることがある。例えば、甲状腺癌では患者の20~30%がTgAb陽性のため、Tg測定に際しては同時にTgAbを測定する必要があった。また、TgAb陽性の橋本病ではTgの量を正確に測定することは困難であり、同様にTgAb陽性が観察される他の自己免疫性疾患(バセドウ病)でもTgの量が正確に測定出来ていないおそれがあった。
Spencer CA, Takeuchi M and Kazarosyan M: Current status and performance goals for serum thyroglobulin assays., Clin Chem, 42, 164-173 (1996)
 上記のようなTdAb陽性の患者であっても、Tgの量を正確に測ることが可能となれば、甲状腺疾患の治療モニタリングに広く利用できる可能性がある。本発明は、抗サイログロブリン抗体の干渉の影響を受けることなく、単独検査でより正確なサイログロブリン量を測定可能な、サイログロブリンの測定方法及び測定試薬を提供することを目的とする。
 本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、生体試料中のサイログロブリンの測定に際し、前記生体試料を免疫反応に供する前に、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液とを混和する前処理工程を介することで、抗サイログロブリン抗体の影響を受けず、より正確なサイログロブリン測定値が得られることを見出し、本発明を完成した。
 本発明の構成は以下の通りである。
(1)生体から分離された試料と、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液とを混和する前処理工程を含む、生体から分離された試料中のサイログロブリンをイムノアッセイにより測定する方法。
(2)前記前処理液が酸性化剤を含み、前処理工程における酸性化剤の終濃度が0.05N超0.5N以下である、(1)に記載の方法。
(3)前記前処理液が界面活性剤を含み、該界面活性剤が陰イオン性界面活性剤である、(1)に記載の方法。
(4)前記前処理工程が、加熱条件下で行われる、(3)に記載の方法。
(5)界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液を備える、サイログロブリンのイムノアッセイ用試薬。
 本発明によれば、抗サイログロブリン抗体(TgAb)を含有する生体試料中であっても、サイログロブリン(Tg)をTgAbから遊離させ、相互作用の影響を低減させることにより、試料に含まれるTg量をより正確に測定し得る、Tgの測定方法及び測定試薬を提供することができる。
酸性化前処理サンプルと未処理サンプルのTg測定結果を比較したグラフである。 酸性化前処理サンプルと未処理サンプルのTg測定結果を比較したグラフである。 酸性化前処理サンプルと未処理サンプルとでTg測定結果に乖離が見られた血清検体について、酸性化したサンプルと未処理のサンプルとをゲル濾過カラムに供したクロマトグラフィーである。 酸性化前処理サンプルと未処理サンプルとでTg測定結果に差異が見られなかった血清検体について、酸性化したサンプルと未処理のサンプルとをゲル濾過カラムに供したクロマトグラフィーである。 酸性化前処理液の酸濃度と、検体のTg測定値との相関を示すグラフである。 SDS前処理サンプルと未処理サンプルのTg測定結果を比較したグラフである。 SDS前処理サンプルと未処理サンプルのTg測定結果を比較したグラフである。
 本明細書中で記載される「%」の濃度は、特に記載のない限り、重量/体積(w/v)の濃度表示である。
<サイログロブリンの測定方法>
 本発明で測定されるサイログロブリン(Tg)は、任意の動物由来のTgであるが、好ましくは、哺乳動物(例、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類;マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類;イヌ、ネコ等の愛玩動物;ブタ、ウシ等の家畜;ウマ、ヒツジ等の使役動物)由来のTgであり、より好ましくは霊長類由来のTgであり、特に好ましくは、ヒト由来のTgである。
1.前処理工程
 本発明の方法は、生体試料と抗体とを反応させる免疫反応により生体試料中に存在するTgを測定する方法であるが、免疫反応(反応工程)の前に、生体試料と前処理液とを混和することによる前処理工程を含むことを特徴とする。前処理工程により、Tgを自己抗体(TgAb)等から遊離させた状態とすることができる。前処理液は、界面活性剤及び酸性化剤のいずれかを含んでいてもよく、両方を含んでいてもよい。好ましくは、前処理液は、界面活性剤又は酸性化剤のいずれかを含む。
 前記前処理工程において混和する生体試料と前処理液の体積比は、1:10~10:1、特に1:5~5:1、さらに1:3~3:1とすることが好ましい。本発明で用いられる生体試料は、Tgを含有し得る試料であれば特に限定されず、例えば、血清、血漿、全血、尿、便、口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜および生検試料(例、甲状腺穿刺吸引細胞診(Fine needle aspiration:FNA)試料、腸管試料、肝臓試料)が挙げられる。好ましくは、生体試料は、血清または血漿である。
 前記前処理液に含まれる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤のいずれも使用可能であるが、特に陰イオン性界面活性剤が好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、N-ラウロイルサルコシン、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、デオキシコール酸などを好適に使用でき、特にSDSを好適に使用できる。界面活性剤の濃度は、TgをTgAb等から遊離させるために十分な濃度であることを要する。SDSを使用する場合は、生体試料と混和した混和液の前処理時の濃度として、0.1~12.5%、特に0.25~10%、さらに0.5~7.5%とすることが好ましい。SDSの濃度を0.1~10%とすることで、Tgを十分に遊離させるとともに、SDSの析出等を生じにくい、という効果を奏する。
 前処理液に含まれる主要な界面活性剤を陰イオン性界面活性剤とする場合、前処理後に、反応系に持ち込まれる陰イオン界面活性剤の影響を軽減するために、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を単独または複数含む中和液を添加してもよい。
 前記前処理液に含まれる酸性化剤としては、塩酸、硫酸、酢酸等を好適に使用できる。酸性化剤を使用する場合、前処理液の酸の規定度は、前処理時の濃度として、0.05N超0.5N以下、特に0.1N以上0.4N以下とすることが好ましい。酸の規定度を0.05N超0.5N以下とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。
 前処理に酸性化剤を用いる場合、生体試料との混和時に沈澱が生じないよう、陽イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。陽イオン性界面活性剤としては、特に炭素数10個以上の一本鎖アルキル基と、第3級アミンまたは第4級アンモニウム塩を同分子中に有している陽イオン性界面活性剤が好ましい。このような界面活性剤の例としては、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド(C16TAC)、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(CTAB)、ラウリルピリジニウムクロライド、テトラデシルピリジニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド等が挙げられる。陽イオン界面活性剤の添加量は、検体との混和時の濃度で0.1%以上15%以下が好ましく、さらに、0.5%~10%が好ましい。
 酸性化剤を含む前処理液には、上記陽イオン性界面活性剤に加えて、さらに非イオン性界面活性剤等の他の界面活性剤が含まれていてもよい。他の界面活性剤の添加により、さらに高感度にTgを検出することが可能となる。
 前処理液には、さらに還元剤が使用されてもよい。還元剤としては、2-(ジエチルアミノ)エタンチオール塩酸塩(DEAET)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)、ジチオトレイトール(DTT)、2-メルカプトエタノール等の既存の還元剤をいずれも使用可能であるが、溶液中での安定性の理由で、DEAET、TCEPを特に好適に使用できる。還元剤の濃度としては、生体試料との混和液の終濃度として0.5~100mM、特に1.0~50mM、さらに2.0~20mMとすることが好ましい。
 前処理液には、必要に応じて、尿素、チオ尿素等、他のタンパク変性剤が含まれていてもよい。変性剤の濃度は、処理時濃度で0.1M以上が好ましく、さらに0.5M以上4M未満が好ましい。また、前処理液には、処理効果を増強させるために、単糖類、二糖類、クエン酸、及びクエン酸塩類のいずれか、またはこれらを組合せて添加してもよい。さらに、前処理液には、EDTA等のキレート剤が含まれていてもよい。
 前処理工程は、生体試料と前処理液を混和した後、さらに加熱することが好ましい。特に、前処理液に界面活性剤を使用する場合には、その効果を高めるために加熱をすることが好ましい。加熱温度は35~95℃、特に50~90℃、さらに70~85℃とすることが好ましい。また、加熱時間は、1分以上、特に3分以上、さらに5分以上とすることが好ましい。加熱時間の上限は特に存在しないが、通常、60分以下、特には30分以下の加熱時間でよい。
2.反応工程
 本発明の方法の上記前処理工程で得られた生体試料混和液は、次いでイムノアッセイの反応工程に供される。反応工程においては、生体試料混和液を緩衝液と混合させ、混合液中の抗原をTgに対する抗体と反応させる。なお、Tgのイムノアッセイ自体は種々の方法が周知であり、Tgを定量可能ないずれのイムノアッセイをも採用することができる。
 前記緩衝液としては、例えば、MES緩衝液、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、炭酸緩衝液をベースとしたものが挙げられ、特にリン酸緩衝液をベースとしたものを好適に使用できる。前処理液として界面活性剤を含有するものを使用した場合には、未反応の界面活性剤を吸収するために、例えば、BSA、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリビニルアルコール(PVA)デキストラン硫酸ナトリウム等の水溶性高分子を前処理後の混和液と混合した際の終濃度で0.01~10.0%、特に0.05~5.0%程度含む緩衝液を使用することが好ましい。また、前処理液として酸性化剤を含有するものを使用した場合には、アルカリ剤を含むか、前処理液の酸の影響を緩和し得る緩衝能を有する緩衝液を使用することが好ましい。前処理工程の混和液と緩衝液との混合は、体積比で、1:10~10:1、特に1:5~5:1、さらに1:3~3:1とすることが好ましい。
 本発明の方法で使用されるTgに対する抗体は、Tgのアミノ酸配列の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗体である。Tgに対する抗体は、特に限定されず、既知のエピトープを認識する抗体をいずれも使用することができるが、好ましくは、Tgに対する抗体は、Tg特異的エピトープ(特に、ヒトTg特異的エピトープ)を認識する抗体である。
 Tgに対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。Tgに対する抗体は、免疫グロブリン(例、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY)のいずれのアイソタイプであってもよい。Tgに対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体(例、2つのFab部分およびFc部分を含む抗体)をいう。Tgに対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体(例、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv)が挙げられる。Tgに対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。
 Tgに対する抗体は、従前公知の方法を用いて作製することができる。例えば、Tgに対する抗体は、上記のエピトープを抗原として用いて作製することができる。また、上述したようなエピトープを認識するTgに対する多数の抗体が市販されているので、このような市販品を使用することもできる。
 Tgに対する抗体は、固相に固相化されていてもよい。本明細書において、固相に固相化された抗体を、単に固相化抗体ということがある。固相としては、例えば、液相を収容または搭載可能な固相(例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、及びウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器)、ならびに液相中に懸濁または分散可能な固相(例、粒子等の固相担体)が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、及びカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、又は磁性材料を用いることができるが、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。固相は、好ましくは固相担体であり、より好ましくは磁性固相担体であり、さらにより好ましくは磁性粒子である。抗体の固相化方法としては、従前公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質(例、ビオチン、ストレプトアビジン)を利用する方法、及びイオン結合法が挙げられる。特定の実施形態では、Tgに対する抗体は、固相に固相化された抗体であり、好ましくは、磁性の固相に固相化された抗体であり、より好ましくは、磁性粒子に固相化された抗体である。
 反応工程は、前処理工程の混和液と緩衝液とを混合した後、固相化した抗体に接触させてもよく、また、緩衝液中に例えば粒子上に固相化した抗体を予め入れて粒子液とし、前記混和液と粒子液とを混合させてもよい。反応工程は、例えば免疫凝集法や競合法のように一次反応工程のみで実施してもよいが、サンドイッチ法のように二次反応工程を設けてもよい。なお、二次反応工程を設ける場合、一次反応工程と二次反応工程の間に、未反応成分を除去するための洗浄工程を設けてもよい。
 Tgに対する抗体は、標識物質で標識化されていてもよい。本明細書において、標識物質で標識化された抗体を、単に標識化抗体ということがある。標識物質としては、例えば、酵素(例、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ)、親和性物質(例、ストレプトアビジン、ビオチン)、蛍光物質またはタンパク質(例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質)、発光又は吸光物質(例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウム、ルテニウム)、放射性物質(例、H、14C、32P、35S、125I)が挙げられる。また、本発明の方法では二次反応を設ける場合、二次反応に用いる抗体としては、このような標識物質で標識化されていてもよい。
 特定の実施形態では、本発明の方法は、二次反応に用いる抗体として、Tgに対する抗体と異なるエピトープを認識するTgに対する別の抗体を含む。このような別の抗体が認識するエピトープの詳細は、上述したTgに対する抗体について詳述したエピトープと同様である(但し、併用される場合、エピトープの種類は異なる)。Tgに対する抗体により認識されるエピトープと、Tgに対する別の抗体により認識されるエピトープとの組合せは、特に限定されない。このような別の抗体の使用は、例えば、サンドイッチ法が利用される場合に好ましい。
3. 検出工程
 一次抗体又は二次抗体に標識を用いた場合、使用する標識に適した方法、例えば酵素標識を用いた場合は酵素の基質を添加することによって、検出する。例えば、アルカリホスファターゼ(ALP)を標識抗体として用いた場合は、3-(2’-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-(3’-ホスホリルオキシ)フェニル-1,2-ジオキセタン・2ナトリウム塩(AMPPD)を酵素基質として用いた化学発光酵素イムノアッセイ法(CLEIA)の系とすることができる。
 本発明の方法は、Tgに対する抗体を使用するイムノアッセイである。このようなイムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光酵素イムノアッセイ法(CLEIA)、化学発光イムノアッセイ(CLIA)、免疫比濁法(TIA)、酵素イムノアッセイ法(EIA)(例、直接競合ELISA、間接競合ELISA、及びサンドイッチELISA)、放射イムノアッセイ(RIA)、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ(FIA)、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。これらのイムノアッセイ自体は周知であり、ここで詳しく述べる必要はないが、それぞれ簡単に説明する。
 直接競合法は、測定すべき標的抗原(本発明ではTg)に対する抗体を固相に固相化し(固相及び固相化については上記のとおり)、非特異吸着を防ぐためのブロッキング処理(血清アルブミン等のタンパク質溶液で固相を処理)後、この抗体と、前記標的抗原を含む被検試料(本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料)と、一定量の標識した抗原(標識は上記のとおり)とを反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。被検試料中の抗原と標識抗原とが、抗体に対して競合的に結合するので、被検試料中の抗原量が多いほど、固相に結合する標識の量が少なくなる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化されて標識量(標識の性質に応じて、吸光度、発光強度、蛍光強度等、以下同じ)を測定して、抗原濃度を横軸、標識量を縦軸にとった検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。直接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 20150166678 A1に記載されている。
 間接競合法では、標的抗原(本発明ではTg)を固相に固相化する(固相及び固相化については上記のとおり)。次いで、固相のブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料(本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料)と、一定量の抗標的抗原抗体とを混合し、前記固相化抗原と反応させる。洗浄後、固相に結合された前記抗標的抗原抗体を定量する。これは、前記抗標的抗原抗体に対する標識した二次抗体(標識は上記のとおり)を反応させ、洗浄後、標識量を測定することにより行うことができる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化されて標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。なお、標識二次抗体を用いずに、標識した一次抗体を用いることも可能である。間接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、上記したUS 20150166678 A1に記載されている。
 サンドイッチ法は、固相に抗標的抗原抗体を固相化し(固相及び固相化については上記のとおり)、ブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料(本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料)を反応させ、洗浄後、標的抗原に対する標識した二次抗体(標識は上記のとおり)を反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化された標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。サンドイッチ法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 20150309016 A1に記載されている。
 上記した各種イムノアッセイのうち、化学発光酵素イムノアッセイ法(CLEIA)、化学発光イムノアッセイ(CLIA)、酵素イムノアッセイ法(EIA)、放射イムノアッセイ(RIA)、蛍光イムノアッセイ(FIA)は、上記した直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等を行う際に用いる標識の種類に基づいて分類したイムノアッセイである。化学発光酵素イムノアッセイ法(CLEIA)は、標識として酵素(例えば、上記したアルカリフォスファターゼ)を用い、基質として化学発光性化合物を生じる基質(例えば、上記したAMPPD)を用いて、イムノアッセイである。酵素イムノアッセイ法(EIA)は、標識として酵素(例えば、上記したペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等)を用いるイムノアッセイである。各酵素の基質としては、吸光度測定等により定量可能な化合物が用いられる。例えば、ペルオキシダーゼの場合には、1,2-フェニレンジアミン(OPD)や3,3'5,5'-テトラメチルベンチジン(TMB)等、アルカリフォスファターゼの場合には、p-ニトロフェニルフォスフェート(pNPP)等、β-ガラクトシダーゼの場合には、MG:4-メチルウンベリフェリルガラクトシド、NG:ニトロフェニルガラクトシド等、ルシフェラーゼの場合には、ルシフェリン等が用いられる。放射イムノアッセイ(RIA)は、標識として放射性物質を用いる方法であり、放射性物質としては、上記のとおりH、14C、32P、35S、125I等の放射性元素が挙げられる。蛍光イムノアッセイ(FIA)は、標識として蛍光物質または蛍光タンパク質を用いる方法であり、蛍光物質または蛍光タンパク質としては、上記のとおりフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質等が挙げられる。これらの標識を用いるイムノアッセイ自体はこの分野において周知であり、例えば、US 8039223 BやUS 20150309016 A1に記載されている。
 免疫比濁法(TIA)は、測定すべき標的抗原(本発明ではTg)と、該抗原に対する抗体との抗原抗体反応により生成された抗原抗体複合物により濁度が増大する現象を利用したイムノアッセイである。抗標的抗原抗体溶液に、種々の既知濃度の抗原を添加し、それぞれ濁度を測定し、検量線を作成する。未知の被検試料について、同様に濁度を測定し、測定された濁度を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。免疫比濁法自体は周知であり、例えば、US 20140186238 A1に記載されている。ラテックス凝集法は、免疫比濁法と類似しているが、免疫比濁法における抗体溶液に代えて、表面に抗標的抗原抗体を固定化したラテックス粒子の浮遊液を用いる方法である。免疫比濁法及びラテックス凝集法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 820,398 Bに記載されている。
 イムノクロマトグラフィー法は、ろ紙、セルロースメンブレン、ガラス繊維、不織布等の多孔性材料で形成された基体(マトリックスやストリップとも呼ばれる)上で上記したサンドイッチ法や競合法を行う方法である。例えば、サンドイッチ法によるイムノクロマトグラフィー法の場合、抗標的抗原抗体を固定化した検出ゾーンを上記基体上に設け、標的抗原を含む被検試料(本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料)を基体に添加し、上流側から展開液を流して標的抗原を検出ゾーンまで移動させ、検出ゾーンに固定化させる。固定化された標的抗原を、標識した二次抗体でサンドイッチして、検出ゾーンに固定化された標識を検出することにより、被検試料中の標的抗原を検出する。標識二次抗体を含む標識ゾーンを検出ゾーンよりも上流側に形成しておくことにより、標的抗原と標識二次抗体との結合体が検出ゾーンに固定化される。標識が酵素の場合には、酵素の基質を含めた基質ゾーンも検出ゾーンよりも上流側に設けられる。競合法の場合には、例えば、検出ゾーンに標的抗原を固定化しておき、被検試料中の標的抗原と、検出ゾーンに固定化された標的抗原とを競合させることができる。検出ゾーンよりも上流側に標識抗体ゾーンを設けておき、被検試料中の標的抗原と標識抗体を反応させ、未反応の標識抗体を検出ゾーンに固定化して標識を検出又は定量することにより、被検試料中の標的抗原を検出又は定量することができる。イムノクロマトグラフィー法自体は、この分野において周知であり、例えばUS 6210898 Bに記載されている。
<Tgの測定試薬>
 本発明のTgの測定試薬は、上述のTgの測定方法を実現し得る測定試薬である。本発明の測定試薬は、通常のイムノアッセイに使用される構成に加え、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液を構成成分として含むことを特徴とする。
 本発明の試薬は、互いに隔離された形態または組成物の形態において各構成成分を含む。具体的には、各構成成分はそれぞれ異なる容器(例、チューブ、プレート)に収容された形態で提供されてもよいが、一部の構成成分が組成物の形態(例、同一溶液中)で提供されてもよい。あるいは、本発明の試薬は、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態(例、異なる容器に収容された形態)で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
 好ましい実施形態では、本発明の試薬は、採用されるべきイムノアッセイの種類に応じた構成を有していてもよい。例えば、サンドイッチ法が採用される場合、本発明の試薬は、必須の構成成分として、i)前処理液、ii)Tgに対する抗体、iii)緩衝液、並びに任意の構成成分として、iv)Tgに対する別の抗体、v)標識物質、vi)希釈液、及び、必要に応じて、vii)標識物質と反応する基質を含んでいてもよい。ii)及びiii)の構成成分は、同一溶液に含まれていてもよい。iv)の構成成分は、v)標識物質で標識化されていてもよい。好ましくは、Tgに対する抗体は、磁性粒子に固相化されていてもよい。
 <実施例1 酸性化前処理の効果確認試験(ELISA法)>
(1)抗サイログロブリン抗体プレートの作製
 ポリスチレン製96穴マイクロウェルプレート(Nunc社製)に抗Tgマウス抗体5F9(AbD Serotec社製)を5μg/mL含む抗体希釈液(0.1M 炭酸水素ナトリウム、0.1M 塩化ナトリウム、pH9.6)を100μL/ウェル分注し、4℃で一晩インキュベーションを行った。マイクロウェルプレートをPBSで3回洗浄し、次いで、ブロッキング液(1.0% BSA、3% スクロース、0.05% ProClin(登録商標)300を含むPBS)を200μL/ウェル分注し、室温で2時間インキュベーションを行った。ブロッキング液を除去した後、プレートを真空乾燥させ、抗Tg抗体プレートとした。
(2)検体前処理
 甲状腺関連疾患の患者血清検体45例について、各50μLを酸性化前処理液(2.5M 尿素、0.42M 塩酸、0.08M クエン酸水和物、2.5% マルトース、10.0%  CTAB、4.9% TritonX-100(商品名))50μLと混和し、37℃で6分間加温した。次いで、緩衝液(500mM Tris-HCl、200mM NaCl、EDTA3Na、10.0% BSA、50μg/mL マウスIgG、pH9.2)を100μL加え、酸性化前処理サンプルとした。
 同検体について、別途各50μLを、酸性化前処理液50μLと緩衝液100μLを混合した混合液(中和液)150μLに添加し、未処理サンプルとした。
 既知濃度の精製ヒトTg(BBI solutions社製)をTgAb陰性血清で希釈し、0、10、50、200、400ng/mLの標準液を調製した。各標準液についても、上記と同様の方法で酸性化前処理サンプルと未処理サンプルを調製した。
(3)検体中のTg測定
 各酸性化前処理サンプルと各未処理サンプルを、抗Tg抗体プレートに150μLずつ分注し、室温で1時間インキュベーションした(一次反応)。洗浄液(0.05% Tween20/PBS)で5回洗浄した後、ビオチン化抗Tg抗体5E6(AbD Serotec社製)を二次反応液(24mM リン酸二水素カリウム、76mM リン酸水素二カリウム、1.0% BSA、1.0% PVP、0.05% カゼインナトリウム、0.05% Tween20、0.05% 塩化ナトリウム、20mM EDTA2Na、0.1% ProClin300(登録商標)、pH7.0)で2μg/mLに希釈した二次抗体液を100μL/ウェル分注し、室温で1時間反応させた(二次反応)。洗浄液で5回洗浄した後、二次反応液で10000倍に希釈したHRP標識ストレプトアビジン(ロシュ社製)液を100μ/ウェル分注し、室温で30分間反応させた。洗浄液で5回洗浄した後、TMB基質液(ナカライテスク社製)を100μL/ウェル分注し、室温で15分間暗所に静置した。1N硫酸を100μL/ウェル分注して反応を停止させ、各ウェルの450nm/630nmの吸光度を測定した。各検体のTg測定値は、酸性化前処理標準液、未処理標準液をそれぞれ使用して作成した検量線に基づいて算出した。0ng/mLの標準液よりも低い吸光度を示す検体は全て0ng/mLとした。
 別途、各検体のTgAb値を「ルミパルス(登録商標)TgAb」(富士レビオ社製)を用いて測定した。
(4)結果
 各検体及び標準液の酸性化前処理サンプルと未処理サンプルの測定結果を表1に示す。また、酸性化前処理検体と未処理検体の測定値の全体の相関性を図1に、特に吸光度の低い領域の相関性を図2に示す。特にTgAb高値の未処理検体で0ng/mLを下回る吸光度を示す傾向があったが、前処理により吸光度が上昇した。これまでTgの測定ができなかった検体について、測定が可能になったことが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
<実施例2 酸性化前処理検体のゲル濾過試験>
 実施例1で前処理により測定値が増加したNo.6の検体と、前処理によって測定値に変化がなかったNo.13の検体について、未処理サンプル、酸性化前処理サンプルを調製し、ゲル濾過クロマログラフィーを行った。
 未処理サンプルは、各検体100μLを中和液300μLと混合して調製した。酸性化前処理サンプルは、各検体100μLと酸性化前処理液100μLとを混和して37℃で6分間加温した後、緩衝液200μLを添加して調製した。これらのサンプルを0.45μm孔のフィルターでろ過した後、250μLをゲル濾過カラムに通した。
分離条件
  カラム:Superose6 10/30(商品名)
  分離緩衝液:PBS, 0.08% CHAPS, 0.05% Tween20(商品名), 1mM EDTA2Na, pH7.4
  流速:0.5mL/分
  回収範囲:4mL~24mL(0.5mL/画分)
回収した各画分について、再度の前処理は行わず、実施例1と同様のELISA法でTg測定を行った。
併せて、タンパク分子量マーカー(GE社製、サイログロブリンを含む)についても同じ条件でゲル濾過に供し、UV吸収を測定した。
 No.6の検体の各画分の測定結果を図3に、No.13の検体の各画分の測定結果を図4に示す。No.6の検体について、未処理サンプルについては、Tgより高分子の領域で微量のTg測定値のピークが現れたのに対して、酸性化前処理サンプルは、Tgと同じ分子量の領域でTg測定値のピークが現れた。一方、No.13の検体では、未処理サンプルも酸性化前処理サンプルもTgと同じ分子量の領域にTg測定値のピークが現れた。酸性化処理サンプルは、酸の影響でシグナルが低下したと考えられる。これらの結果より、前処理により測定値が増加したNo.6の検体の未処理サンプルでは、サイログロブリンがTgAb等と複合体を形成して高分子化し、Tg測定系での反応性が低下していたのに対し、酸性化前処理によりTgが複合体から遊離し、Tg測定系での反応性も向上したことが示唆された。
<実施例3 酸性化剤の至適濃度>
 酸性化前処理に用いる酸性化剤の至適濃度を検討した。TgAb陽性で、Tg測定値へのTgAbの影響(干渉)が比較的弱かったNo.13、No.16の検体、TgAb陽性でTgAbの干渉が比較的強かったNo.19、No.44の検体、及びTgAb陰性のNo.25、No.30の検体の計6検体について、各50μLを、塩酸を2N、1N、0.8N、0.6N、0.4N、0.2N、0.1N、0.05N、0.025N、0N含む以外は実施例1の酸性化前処理液と同様に調製した酸性化前処理液50μLと混和し、37℃で6分間加温した。次いで、上記塩酸と等量の水酸化ナトリウム溶液を100μL加えて中和した。中和後の溶液に実施例1と同様の二次反応液200μLを添加し、酸性化前処理サンプルとした。各酸性化前処理サンプルについて、実施例1と同様のELISA法に供して、450nm/630nmの吸光度データを得た。
 各サンプルの吸光度データを表2及び図5に示す。TgAb陰性の検体及びTgAbの競合の弱い検体では、前処理液の酸性化剤濃度が高くなるにしたがって、吸光度が下がる傾向が見られた。これは、酸の影響でTgの変性が生じたことと、中和時に生じた塩の影響で抗原抗体反応が阻害されたことが要因と考えられる。しかし、TgAbの競合の強い2検体については、酸性化剤の濃度の高い領域では吸光度が低くなったものの、酸性化剤濃度が0.1Nの条件下では、酸性化剤のない状態よりも吸光度が上がっていた。また、酸性化剤濃度が0.05Nを超える条件下では、TgAbの影響の小さい他検体と同等の吸光度を示し、かつ酸性化濃度の上昇とともに他検体と同様の吸光度の低下を示した。一方、酸性化剤濃度が0.5Nを超えると吸光度がブランク付近まで低下してしまい、全体としてTg測定が困難となった。
 以上より、TgAbの干渉の強い検体を他検体と同様に測定することを可能とするためには、酸性化前処理液の酸性化剤は、前処理時濃度で0.05N超0,5N以下、特に0.1N以上0,4N以下とすることが好適であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 <実施例4 SDS前処理の効果確認試験(ELISA法)>
 甲状腺関連疾患の患者血清検体51例について、各50μLをSDS前処理液(347mM SDS、2mM EDTA2Na、10mM Tris-HCl、pH7.2)100μLと混和し、1000rpmの振とう条件下で80℃で5分間加熱した。次いで、中和液(1.2% C16TAC、4% CHAPS、2.9% Tween20(商品名))で4倍希釈し、室温で30分間インキュベーションした後、15℃、12000rpmの条件下で15分間遠心分離し、得られた上清をSDS前処理サンプルとした。同時に、同じ検体について、前処理液に代えてPBS100μLを使用したことと、加熱を行わないこと以外は、上記SDS前処理と同様の処理を行い、得られたサンプルを未処理サンプルとした。既知濃度の精製ヒトTg(BBI solutions社製)をTgAb陰性血清で希釈し、0、6、30、60、300、600、2400、4800ng/mLの標準液を調製した。各標準液についても、上記と同様の方法でSDS前処理サンプルと未処理サンプルを調製した。
 SDS前処理サンプル及び未処理検体各100μLを緩衝液(50mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA2Na、6.0% BSA、0.05% ProClin300(登録商標)、pH7.2)100μLとそれぞれ混合した後、実施例1と同様の方法で調製した抗Tg抗体プレートに150μLずつ分注した。室温で2時間インキュベーションした。洗浄液(0.05% Tween20(商品名)/PBS)で5回洗浄した後、ビオチン化抗Tg抗体5E6(AbD Serotec社製)を二次反応液(24mM リン酸二水素カリウム、76mM リン酸水素二カリウム、1.0% BSA、1.0% PVP、0.05% カゼインナトリウム、0.05% Tween20(商品名)、0.05% 塩化ナトリウム、20mM EDTA2Na、0.1% ProClin300(登録商標)、pH7.0)で2μg/mLに希釈した二次抗体液を100μL/ウェル分注し、室温で1時間反応させた(二次反応)。洗浄液で5回洗浄した後、二次反応液で10000倍に希釈したHRP標識ストレプトアビジン(ロシュ社製)液を100μL/ウェル分注し、室温で30分間反応させた。洗浄液で5回洗浄した後、TMB基質液(ナカライテスク社製)を100μL/ウェル分注し、室温で15分間暗所に静置した。1N硫酸を100μL/ウェル分注して反応を停止させ、各ウェルの450nm/630nmの吸光度を測定した。各検体のTg測定値は、酸性化前処理標準液、未処理標準液をそれぞれ使用して作成した検量線に基づいて算出した。0ng/mLの標準液よりも低い吸光度を示す検体は全て0ng/mLとした。
 別途、各検体のTgAb値をルミパルス(登録商標)TgAb(富士レビオ社製)で測定した。
 各検体及び標準液のSDS前処理サンプルと未処理サンプルの測定結果を表3に示す。また、酸性化前処理検体と未処理検体の測定値の全体の相関性を図6に、特に吸光度の低い領域の相関性を図7に示す。特にTgAb高値の未処理検体で0ng/mL付近の吸光度を示す検体が多かったが、前処理によりこれらの吸光度が上昇し、偽低値が改善されていることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (5)

  1.  生体から分離された試料と、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液とを混和する前処理工程を含む、生体から分離された試料中のサイログロブリンをイムノアッセイにより測定する方法。
  2.  前記前処理液が酸性化剤を含み、前処理工程における酸性化剤の終濃度が0.05N超0.5N以下である、請求項1に記載の方法。
  3.  前記前処理液が界面活性剤を含み、該界面活性剤が陰イオン性界面活性剤である、請求項1に記載の方法。
  4.  前記前処理工程が、加熱条件下で行われる、請求項3に記載の方法。
  5.  界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液を備える、サイログロブリンのイムノアッセイ用試薬。
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