JP7007278B2 - サイログロブリンの測定方法及び測定試薬 - Google Patents

サイログロブリンの測定方法及び測定試薬 Download PDF

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Description

本発明は、サイログロブリンの測定方法及び測定試薬に関する。
サイログロブリン（Ｔｇ）は、甲状腺濾胞細胞のみでつくられる分子量６６万の糖蛋白である。生合成されたＴｇは濾胞腔へ放出される。この経過中に、ペルオキシダーゼの作用によってＴｇ分子中のチロシン基にヨード分子が結合して、甲状腺ホルモンの合成が行われる。濾胞腔のＴｇは再度濾胞細胞にとりこまれ、濾胞細胞内で分解され、甲状腺ホルモンの放出が起こる。またこの過程は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の働きにより活性化される。故に、正常時では、Ｔｇそのものの血中への放出はごくわずか起こるのみであり、Ｔｇの血中放出は甲状腺の何らかの異常を示す。よってＴｇは臓器特異性が高く甲状腺疾患にはきわめて有用なマーカーである。特に、血中Ｔｇは、甲状腺分化癌の手術評価、および術後再発や転移の有無を知るマーカーとして使用される。その他、バセドウ病での治療の効果、寛解の指標、先天性甲状腺機能低下症の病型の決定や鑑別、治療モニタリングなどにも有用である。また、画像診断との組合せにより結節性甲状腺腫の術前診断や良性の甲状腺疾患と悪性腫瘍とを鑑別する可能性も示唆されている。
しかし、被験者が抗サイログロブリン抗体（ＴｇＡｂ）陽性の場合、実際はＴｇ高値でも測定上の問題で低値になることがある。例えば、甲状腺癌では患者の２０～３０％がＴｇＡｂ陽性のため、Ｔｇ測定に際しては同時にＴｇＡｂを測定する必要があった。また、ＴｇＡｂ陽性の橋本病ではＴｇの量を正確に測定することは困難であり、同様にＴｇＡｂ陽性が観察される他の自己免疫性疾患（バセドウ病）でもＴｇの量が正確に測定出来ていないおそれがあった。
Ｓｐｅｎｃｅｒ ＣＡ， Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｍ ａｎｄ Ｋａｚａｒｏｓｙａｎ Ｍ： Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｇｏａｌｓ ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｓｓａｙｓ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ， ４２， １６４－１７３ （１９９６）
上記のようなＴｄＡｂ陽性の患者であっても、Ｔｇの量を正確に測ることが可能となれば、甲状腺疾患の治療モニタリングに広く利用できる可能性がある。本発明は、抗サイログロブリン抗体の干渉の影響を受けることなく、単独検査でより正確なサイログロブリン量を測定可能な、サイログロブリンの測定方法及び測定試薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、生体試料中のサイログロブリンの測定に際し、前記生体試料を免疫反応に供する前に、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液とを混和する前処理工程を介することで、抗サイログロブリン抗体の影響を受けず、より正確なサイログロブリン測定値が得られることを見出し、本発明を完成した。
本発明の構成は以下の通りである。
（１）生体から分離された試料と、酸性化剤又は陰イオン性界面活性剤を含む前処理液とを混和する前処理工程を含む、生体から分離された試料中のサイログロブリンをイムノアッセイにより測定する方法。
（２）前記前処理液が酸性化剤を含み、前処理工程における酸性化剤の終濃度が０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下である、（１）に記載の方法。
（３）前記陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム又はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである、（１）記載の方法。
（４）前記前処理工程が、加熱条件下で行われる、（１）～（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）酸性化剤又は陰イオン性界面活性剤を含む前処理液を備える、サイログロブリンのイムノアッセイ用試薬。
本発明によれば、抗サイログロブリン抗体（ＴｇＡｂ）を含有する生体試料中であっても、サイログロブリン（Ｔｇ）をＴｇＡｂから遊離させ、相互作用の影響を低減させることにより、試料に含まれるＴｇ量をより正確に測定し得る、Ｔｇの測定方法及び測定試薬を提供することができる。
酸性化前処理サンプルと未処理サンプルのＴｇ測定結果を比較したグラフである。 酸性化前処理サンプルと未処理サンプルのＴｇ測定結果を比較したグラフである。 酸性化前処理サンプルと未処理サンプルとでＴｇ測定結果に乖離が見られた血清検体について、酸性化したサンプルと未処理のサンプルとをゲル濾過カラムに供したクロマトグラフィーである。 酸性化前処理サンプルと未処理サンプルとでＴｇ測定結果に差異が見られなかった血清検体について、酸性化したサンプルと未処理のサンプルとをゲル濾過カラムに供したクロマトグラフィーである。 酸性化前処理液の酸濃度と、検体のＴｇ測定値との相関を示すグラフである。 ＳＤＳ前処理サンプルと未処理サンプルのＴｇ測定結果を比較したグラフである。 ＳＤＳ前処理サンプルと未処理サンプルのＴｇ測定結果を比較したグラフである。
本明細書中で記載される「％」の濃度は、特に記載のない限り、重量／体積（ｗ／ｖ）の濃度表示である。
＜サイログロブリンの測定方法＞
本発明で測定されるサイログロブリン（Ｔｇ）は、任意の動物由来のＴｇであるが、好ましくは、哺乳動物（例、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；イヌ、ネコ等の愛玩動物；ブタ、ウシ等の家畜；ウマ、ヒツジ等の使役動物）由来のＴｇであり、より好ましくは霊長類由来のＴｇであり、特に好ましくは、ヒト由来のＴｇである。
１．前処理工程
本発明の方法は、生体試料と抗体とを反応させる免疫反応により生体試料中に存在するＴｇを測定する方法であるが、免疫反応（反応工程）の前に、生体試料と前処理液とを混和することによる前処理工程を含むことを特徴とする。前処理工程により、Ｔｇを自己抗体（ＴｇＡｂ）等から遊離させた状態とすることができる。前処理液は、界面活性剤及び酸性化剤のいずれかを含んでいてもよく、両方を含んでいてもよい。好ましくは、前処理液は、界面活性剤又は酸性化剤のいずれかを含む。
前記前処理工程において混和する生体試料と前処理液の体積比は、１：１０～１０：１、特に１：５～５：１、さらに１：３～３：１とすることが好ましい。本発明で用いられる生体試料は、Ｔｇを含有し得る試料であれば特に限定されず、例えば、血清、血漿、全血、尿、便、口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜および生検試料（例、甲状腺穿刺吸引細胞診（Ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ：ＦＮＡ）試料、腸管試料、肝臓試料）が挙げられる。好ましくは、生体試料は、血清または血漿である。
前記前処理液に含まれる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤のいずれも使用可能であるが、特に陰イオン性界面活性剤が好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ-ラウロイルサルコシン、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、デオキシコール酸などを好適に使用でき、特にＳＤＳを好適に使用できる。界面活性剤の濃度は、ＴｇをＴｇＡｂ等から遊離させるために十分な濃度であることを要する。ＳＤＳを使用する場合は、生体試料と混和した混和液の前処理時の濃度として、０．１～１２．５％、特に０．２５～１０％、さらに０．５～７．５％とすることが好ましい。ＳＤＳの濃度を０．１～１０％とすることで、Ｔｇを十分に遊離させるとともに、ＳＤＳの析出等を生じにくい、という効果を奏する。
前処理液に含まれる主要な界面活性剤を陰イオン性界面活性剤とする場合、前処理後に、反応系に持ち込まれる陰イオン界面活性剤の影響を軽減するために、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を単独または複数含む中和液を添加してもよい。
前記前処理液に含まれる酸性化剤としては、塩酸、硫酸、酢酸等を好適に使用できる。酸性化剤を使用する場合、前処理液の酸の規定度は、前処理時の濃度として、０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下、特に０．１Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。酸の規定度を０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。
前処理に酸性化剤を用いる場合、生体試料との混和時に沈澱が生じないよう、陽イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。陽イオン性界面活性剤としては、特に炭素数１０個以上の一本鎖アルキル基と、第３級アミンまたは第４級アンモニウム塩を同分子中に有している陽イオン性界面活性剤が好ましい。このような界面活性剤の例としては、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（Ｃ１６ＴＡＣ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、ラウリルピリジニウムクロライド、テトラデシルピリジニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド等が挙げられる。陽イオン界面活性剤の添加量は、検体との混和時の濃度で０．１％以上１５%以下が好ましく、さらに、０．５％～１０％が好ましい。
酸性化剤を含む前処理液には、上記陽イオン性界面活性剤に加えて、さらに非イオン性界面活性剤等の他の界面活性剤が含まれていてもよい。他の界面活性剤の添加により、さらに高感度にＴｇを検出することが可能となる。
前処理液には、さらに還元剤が使用されてもよい。還元剤としては、２－（ジエチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（ＤＥＡＥＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール等の既存の還元剤をいずれも使用可能であるが、溶液中での安定性の理由で、ＤＥＡＥＴ、ＴＣＥＰを特に好適に使用できる。還元剤の濃度としては、生体試料との混和液の終濃度として０．５～１００ｍＭ、特に１．０～５０ｍＭ、さらに２．０～２０ｍＭとすることが好ましい。
前処理液には、必要に応じて、尿素、チオ尿素等、他のタンパク変性剤が含まれていてもよい。変性剤の濃度は、処理時濃度で０．１Ｍ以上が好ましく、さらに０．５Ｍ以上４Ｍ未満が好ましい。また、前処理液には、処理効果を増強させるために、単糖類、二糖類、クエン酸、及びクエン酸塩類のいずれか、またはこれらを組合せて添加してもよい。さらに、前処理液には、ＥＤＴＡ等のキレート剤が含まれていてもよい。
前処理工程は、生体試料と前処理液を混和した後、さらに加熱することが好ましい。特に、前処理液に界面活性剤を使用する場合には、その効果を高めるために加熱をすることが好ましい。加熱温度は３５～９５℃、特に５０～９０℃、さらに７０～８５℃とすることが好ましい。また、加熱時間は、１分以上、特に３分以上、さらに５分以上とすることが好ましい。加熱時間の上限は特に存在しないが、通常、６０分以下、特には３０分以下の加熱時間でよい。
２．反応工程
本発明の方法の上記前処理工程で得られた生体試料混和液は、次いでイムノアッセイの反応工程に供される。反応工程においては、生体試料混和液を緩衝液と混合させ、混合液中の抗原をＴｇに対する抗体と反応させる。なお、Ｔｇのイムノアッセイ自体は種々の方法が周知であり、Ｔｇを定量可能ないずれのイムノアッセイをも採用することができる。
前記緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液をベースとしたものが挙げられ、特にリン酸緩衝液をベースとしたものを好適に使用できる。前処理液として界面活性剤を含有するものを使用した場合には、未反応の界面活性剤を吸収するために、例えば、ＢＳＡ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）デキストラン硫酸ナトリウム等の水溶性高分子を前処理後の混和液と混合した際の終濃度で０．０１～１０．０％、特に０．０５～５．０％程度含む緩衝液を使用することが好ましい。また、前処理液として酸性化剤を含有するものを使用した場合には、アルカリ剤を含むか、前処理液の酸の影響を緩和し得る緩衝能を有する緩衝液を使用することが好ましい。前処理工程の混和液と緩衝液との混合は、体積比で、１：１０～１０：１、特に１：５～５：１、さらに１：３～３：１とすることが好ましい。
本発明の方法で使用されるＴｇに対する抗体は、Ｔｇのアミノ酸配列の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗体である。Ｔｇに対する抗体は、特に限定されず、既知のエピトープを認識する抗体をいずれも使用することができるが、好ましくは、Ｔｇに対する抗体は、Ｔｇ特異的エピトープ（特に、ヒトＴｇ特異的エピトープ）を認識する抗体である。
Ｔｇに対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。Ｔｇに対する抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。Ｔｇに対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。Ｔｇに対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。Ｔｇに対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。
Ｔｇに対する抗体は、従前公知の方法を用いて作製することができる。例えば、Ｔｇに対する抗体は、上記のエピトープを抗原として用いて作製することができる。また、上述したようなエピトープを認識するＴｇに対する多数の抗体が市販されているので、このような市販品を使用することもできる。
Ｔｇに対する抗体は、固相に固相化されていてもよい。本明細書において、固相に固相化された抗体を、単に固相化抗体ということがある。固相としては、例えば、液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、及びウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）、ならびに液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子等の固相担体）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、及びカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、又は磁性材料を用いることができるが、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。固相は、好ましくは固相担体であり、より好ましくは磁性固相担体であり、さらにより好ましくは磁性粒子である。抗体の固相化方法としては、従前公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、及びイオン結合法が挙げられる。特定の実施形態では、Ｔｇに対する抗体は、固相に固相化された抗体であり、好ましくは、磁性の固相に固相化された抗体であり、より好ましくは、磁性粒子に固相化された抗体である。
反応工程は、前処理工程の混和液と緩衝液とを混合した後、固相化した抗体に接触させてもよく、また、緩衝液中に例えば粒子上に固相化した抗体を予め入れて粒子液とし、前記混和液と粒子液とを混合させてもよい。反応工程は、例えば免疫凝集法や競合法のように一次反応工程のみで実施してもよいが、サンドイッチ法のように二次反応工程を設けてもよい。なお、二次反応工程を設ける場合、一次反応工程と二次反応工程の間に、未反応成分を除去するための洗浄工程を設けてもよい。
Ｔｇに対する抗体は、標識物質で標識化されていてもよい。本明細書において、標識物質で標識化された抗体を、単に標識化抗体ということがある。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光又は吸光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウム、ルテニウム）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法では二次反応を設ける場合、二次反応に用いる抗体としては、このような標識物質で標識化されていてもよい。
特定の実施形態では、本発明の方法は、二次反応に用いる抗体として、Ｔｇに対する抗体と異なるエピトープを認識するＴｇに対する別の抗体を含む。このような別の抗体が認識するエピトープの詳細は、上述したＴｇに対する抗体について詳述したエピトープと同様である（但し、併用される場合、エピトープの種類は異なる）。Ｔｇに対する抗体により認識されるエピトープと、Ｔｇに対する別の抗体により認識されるエピトープとの組合せは、特に限定されない。このような別の抗体の使用は、例えば、サンドイッチ法が利用される場合に好ましい。
３． 検出工程
一次抗体又は二次抗体に標識を用いた場合、使用する標識に適した方法、例えば酵素標識を用いた場合は酵素の基質を添加することによって、検出する。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を標識抗体として用いた場合は、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を酵素基質として用いた化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）の系とすることができる。
本発明の方法は、Ｔｇに対する抗体を使用するイムノアッセイである。このようなイムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。これらのイムノアッセイ自体は周知であり、ここで詳しく述べる必要はないが、それぞれ簡単に説明する。
直接競合法は、測定すべき標的抗原（本発明ではＴｇ）に対する抗体を固相に固相化し（固相及び固相化については上記のとおり）、非特異吸着を防ぐためのブロッキング処理（血清アルブミン等のタンパク質溶液で固相を処理）後、この抗体と、前記標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料）と、一定量の標識した抗原（標識は上記のとおり）とを反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。被検試料中の抗原と標識抗原とが、抗体に対して競合的に結合するので、被検試料中の抗原量が多いほど、固相に結合する標識の量が少なくなる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化されて標識量（標識の性質に応じて、吸光度、発光強度、蛍光強度等、以下同じ）を測定して、抗原濃度を横軸、標識量を縦軸にとった検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。直接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 20150166678 A1に記載されている。
間接競合法では、標的抗原（本発明ではＴｇ）を固相に固相化する（固相及び固相化については上記のとおり）。次いで、固相のブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料）と、一定量の抗標的抗原抗体とを混合し、前記固相化抗原と反応させる。洗浄後、固相に結合された前記抗標的抗原抗体を定量する。これは、前記抗標的抗原抗体に対する標識した二次抗体（標識は上記のとおり）を反応させ、洗浄後、標識量を測定することにより行うことができる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化されて標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。なお、標識二次抗体を用いずに、標識した一次抗体を用いることも可能である。間接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、上記したUS 20150166678 A1に記載されている。
サンドイッチ法は、固相に抗標的抗原抗体を固相化し（固相及び固相化については上記のとおり）、ブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料）を反応させ、洗浄後、標的抗原に対する標識した二次抗体（標識は上記のとおり）を反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化された標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。サンドイッチ法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 20150309016 A1に記載されている。
上記した各種イムノアッセイのうち、化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、上記した直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等を行う際に用いる標識の種類に基づいて分類したイムノアッセイである。化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、上記したアルカリフォスファターゼ）を用い、基質として化学発光性化合物を生じる基質（例えば、上記したＡＭＰＰＤ）を用いて、イムノアッセイである。酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、上記したペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等）を用いるイムノアッセイである。各酵素の基質としては、吸光度測定等により定量可能な化合物が用いられる。例えば、ペルオキシダーゼの場合には、1,2-フェニレンジアミン(OPD)や3,3'5,5'-テトラメチルベンチジン(TMB)等、アルカリフォスファターゼの場合には、p-ニトロフェニルフォスフェート(pNPP)等、β－ガラクトシダーゼの場合には、MG：4-メチルウンベリフェリルガラクトシド、NG：ニトロフェニルガラクトシド等、ルシフェラーゼの場合には、ルシフェリン等が用いられる。放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）は、標識として放射性物質を用いる方法であり、放射性物質としては、上記のとおり３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等の放射性元素が挙げられる。蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、標識として蛍光物質または蛍光タンパク質を用いる方法であり、蛍光物質または蛍光タンパク質としては、上記のとおりフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質等が挙げられる。これらの標識を用いるイムノアッセイ自体はこの分野において周知であり、例えば、US 8039223 BやUS 20150309016 A1に記載されている。
免疫比濁法（ＴＩＡ）は、測定すべき標的抗原（本発明ではＴg）と、該抗原に対する抗体との抗原抗体反応により生成された抗原抗体複合物により濁度が増大する現象を利用したイムノアッセイである。抗標的抗原抗体溶液に、種々の既知濃度の抗原を添加し、それぞれ濁度を測定し、検量線を作成する。未知の被検試料について、同様に濁度を測定し、測定された濁度を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。免疫比濁法自体は周知であり、例えば、US 20140186238 A1に記載されている。ラテックス凝集法は、免疫比濁法と類似しているが、免疫比濁法における抗体溶液に代えて、表面に抗標的抗原抗体を固定化したラテックス粒子の浮遊液を用いる方法である。免疫比濁法及びラテックス凝集法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 820,398 Bに記載されている。
イムノクロマトグラフィー法は、ろ紙、セルロースメンブレン、ガラス繊維、不織布等の多孔性材料で形成された基体（マトリックスやストリップとも呼ばれる）上で上記したサンドイッチ法や競合法を行う方法である。例えば、サンドイッチ法によるイムノクロマトグラフィー法の場合、抗標的抗原抗体を固定化した検出ゾーンを上記基体上に設け、標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料）を基体に添加し、上流側から展開液を流して標的抗原を検出ゾーンまで移動させ、検出ゾーンに固定化させる。固定化された標的抗原を、標識した二次抗体でサンドイッチして、検出ゾーンに固定化された標識を検出することにより、被検試料中の標的抗原を検出する。標識二次抗体を含む標識ゾーンを検出ゾーンよりも上流側に形成しておくことにより、標的抗原と標識二次抗体との結合体が検出ゾーンに固定化される。標識が酵素の場合には、酵素の基質を含めた基質ゾーンも検出ゾーンよりも上流側に設けられる。競合法の場合には、例えば、検出ゾーンに標的抗原を固定化しておき、被検試料中の標的抗原と、検出ゾーンに固定化された標的抗原とを競合させることができる。検出ゾーンよりも上流側に標識抗体ゾーンを設けておき、被検試料中の標的抗原と標識抗体を反応させ、未反応の標識抗体を検出ゾーンに固定化して標識を検出又は定量することにより、被検試料中の標的抗原を検出又は定量することができる。イムノクロマトグラフィー法自体は、この分野において周知であり、例えばUS 6210898 Bに記載されている。
＜Ｔｇの測定試薬＞
本発明のＴｇの測定試薬は、上述のＴｇの測定方法を実現し得る測定試薬である。本発明の測定試薬は、通常のイムノアッセイに使用される構成に加え、界面活性剤及び酸性化剤のいずれか又は両方を含む前処理液を構成成分として含むことを特徴とする。
本発明の試薬は、互いに隔離された形態または組成物の形態において各構成成分を含む。具体的には、各構成成分はそれぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよいが、一部の構成成分が組成物の形態（例、同一溶液中）で提供されてもよい。あるいは、本発明の試薬は、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
好ましい実施形態では、本発明の試薬は、採用されるべきイムノアッセイの種類に応じた構成を有していてもよい。例えば、サンドイッチ法が採用される場合、本発明の試薬は、必須の構成成分として、ｉ）前処理液、ｉｉ）Ｔｇに対する抗体、ｉｉｉ）緩衝液、並びに任意の構成成分として、ｉｖ）Ｔｇに対する別の抗体、ｖ）標識物質、ｖｉ）希釈液、及び、必要に応じて、ｖｉｉ）標識物質と反応する基質を含んでいてもよい。ｉｉ）及びｉｉｉ）の構成成分は、同一溶液に含まれていてもよい。ｉｖ）の構成成分は、ｖ）標識物質で標識化されていてもよい。好ましくは、Ｔｇに対する抗体は、磁性粒子に固相化されていてもよい。
＜実施例１ 酸性化前処理の効果確認試験（ＥＬＩＳＡ法）＞
（１）抗サイログロブリン抗体プレートの作製
ポリスチレン製９６穴マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に抗Ｔｇマウス抗体５Ｆ９（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を５μｇ／ｍＬ含む抗体希釈液（０．１Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ９．６）を１００μＬ／ウェル分注し、４℃で一晩インキュベーションを行った。マイクロウェルプレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ブロッキング液（１．０％ ＢＳＡ、３％ スクロース、０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル分注し、室温で２時間インキュベーションを行った。ブロッキング液を除去した後、プレートを真空乾燥させ、抗Ｔｇ抗体プレートとした。
（２）検体前処理
甲状腺関連疾患の患者血清検体４５例について、各５０μＬを酸性化前処理液（２．５Ｍ 尿素、０．４２Ｍ 塩酸、０．０８Ｍ クエン酸水和物、２．５％ マルトース、１０．０％ ＣＴＡＢ、４．９％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（商品名））５０μＬと混和し、３７℃で６分間加温した。次いで、緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ３Ｎａ、１０．０％ ＢＳＡ、５０μｇ／ｍＬ マウスＩｇＧ、ｐＨ９．２）を１００μＬ加え、酸性化前処理サンプルとした。
同検体について、別途各５０μＬを、酸性化前処理液５０μＬと緩衝液１００μＬを混合した混合液（中和液）１５０μＬに添加し、未処理サンプルとした。
既知濃度の精製ヒトＴｇ（ＢＢＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）をＴｇＡｂ陰性血清で希釈し、０、１０、５０、２００、４００ｎｇ／ｍＬの標準液を調製した。各標準液についても、上記と同様の方法で酸性化前処理サンプルと未処理サンプルを調製した。
（３）検体中のＴｇ測定
各酸性化前処理サンプルと各未処理サンプルを、抗Ｔｇ抗体プレートに１５０μＬずつ分注し、室温で１時間インキュベーションした（一次反応）。洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で５回洗浄した後、ビオチン化抗Ｔｇ抗体５Ｅ６（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を二次反応液（２４ｍＭ リン酸二水素カリウム、７６ｍＭ リン酸水素二カリウム、１．０％ ＢＳＡ、１．０％ ＰＶＰ、０．０５％ カゼインナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００（登録商標）、ｐＨ７．０）で２μｇ／ｍＬに希釈した二次抗体液を１００μＬ／ウェル分注し、室温で１時間反応させた（二次反応）。洗浄液で５回洗浄した後、二次反応液で１００００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ロシュ社製）液を１００μ／ウェル分注し、室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄した後、ＴＭＢ基質液（ナカライテスク社製）を１００μＬ／ウェル分注し、室温で１５分間暗所に静置した。１Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル分注して反応を停止させ、各ウェルの４５０ｎｍ／６３０ｎｍの吸光度を測定した。各検体のＴｇ測定値は、酸性化前処理標準液、未処理標準液をそれぞれ使用して作成した検量線に基づいて算出した。０ｎｇ／ｍＬの標準液よりも低い吸光度を示す検体は全て０ｎｇ／ｍＬとした。
別途、各検体のＴｇＡｂ値を「ルミパルス（登録商標）ＴｇＡｂ」（富士レビオ社製）を用いて測定した。
（４）結果
各検体及び標準液の酸性化前処理サンプルと未処理サンプルの測定結果を表１に示す。また、酸性化前処理検体と未処理検体の測定値の全体の相関性を図１に、特に吸光度の低い領域の相関性を図２に示す。特にＴｇＡｂ高値の未処理検体で０ｎｇ／ｍＬを下回る吸光度を示す傾向があったが、前処理により吸光度が上昇した。これまでＴｇの測定ができなかった検体について、測定が可能になったことが示唆された。
Figure 0007007278000001
Figure 0007007278000002
＜実施例２ 酸性化前処理検体のゲル濾過試験＞
実施例１で前処理により測定値が増加したＮｏ．６の検体と、前処理によって測定値に変化がなかったＮｏ．１３の検体について、未処理サンプル、酸性化前処理サンプルを調製し、ゲル濾過クロマログラフィーを行った。
未処理サンプルは、各検体１００μＬを中和液３００μＬと混合して調製した。酸性化前処理サンプルは、各検体１００μＬと酸性化前処理液１００μＬとを混和して３７℃で６分間加温した後、緩衝液２００μＬを添加して調製した。これらのサンプルを０．４５μｍ孔のフィルターでろ過した後、２５０μＬをゲル濾過カラムに通した。
分離条件
カラム：Superose6 10/30（商品名）
分離緩衝液：PBS, 0.08% CHAPS, 0.05% Tween20（商品名）, 1mM EDTA2Na, pH7.4
流速：0.5mL/分
回収範囲：4mL～24mL（0.5mL／画分）
回収した各画分について、再度の前処理は行わず、実施例１と同様のＥＬＩＳＡ法でＴｇ測定を行った。
併せて、タンパク分子量マーカー（ＧＥ社製、サイログロブリンを含む）についても同じ条件でゲル濾過に供し、ＵＶ吸収を測定した。
Ｎｏ．６の検体の各画分の測定結果を図３に、Ｎｏ．１３の検体の各画分の測定結果を図４に示す。Ｎｏ．６の検体について、未処理サンプルについては、Ｔｇより高分子の領域で微量のＴｇ測定値のピークが現れたのに対して、酸性化前処理サンプルは、Ｔｇと同じ分子量の領域でＴｇ測定値のピークが現れた。一方、Ｎｏ．１３の検体では、未処理サンプルも酸性化前処理サンプルもＴｇと同じ分子量の領域にＴｇ測定値のピークが現れた。酸性化処理サンプルは、酸の影響でシグナルが低下したと考えられる。これらの結果より、前処理により測定値が増加したＮｏ．６の検体の未処理サンプルでは、サイログロブリンがＴｇＡｂ等と複合体を形成して高分子化し、Ｔｇ測定系での反応性が低下していたのに対し、酸性化前処理によりＴｇが複合体から遊離し、Ｔｇ測定系での反応性も向上したことが示唆された。
＜実施例３ 酸性化剤の至適濃度＞
酸性化前処理に用いる酸性化剤の至適濃度を検討した。ＴｇＡｂ陽性で、Ｔｇ測定値へのＴｇＡｂの影響（干渉）が比較的弱かったＮｏ．１３、Ｎｏ．１６の検体、ＴｇＡｂ陽性でＴｇＡｂの干渉が比較的強かったＮｏ．１９、Ｎｏ．４４の検体、及びＴｇＡｂ陰性のＮｏ．２５、Ｎｏ．３０の検体の計６検体について、各５０μＬを、塩酸を２Ｎ、１Ｎ、０．８Ｎ、０．６Ｎ、０．４Ｎ、０．２Ｎ、０．１Ｎ、０．０５Ｎ、０．０２５Ｎ、０Ｎ含む以外は実施例１の酸性化前処理液と同様に調製した酸性化前処理液５０μＬと混和し、３７℃で６分間加温した。次いで、上記塩酸と等量の水酸化ナトリウム溶液を１００μＬ加えて中和した。中和後の溶液に実施例１と同様の二次反応液２００μＬを添加し、酸性化前処理サンプルとした。各酸性化前処理サンプルについて、実施例１と同様のＥＬＩＳＡ法に供して、４５０ｎｍ／６３０ｎｍの吸光度データを得た。
各サンプルの吸光度データを表２及び図５に示す。ＴｇＡｂ陰性の検体及びＴｇＡｂの競合の弱い検体では、前処理液の酸性化剤濃度が高くなるにしたがって、吸光度が下がる傾向が見られた。これは、酸の影響でＴｇの変性が生じたことと、中和時に生じた塩の影響で抗原抗体反応が阻害されたことが要因と考えられる。しかし、ＴｇＡｂの競合の強い２検体については、酸性化剤の濃度の高い領域では吸光度が低くなったものの、酸性化剤濃度が０．１Ｎの条件下では、酸性化剤のない状態よりも吸光度が上がっていた。また、酸性化剤濃度が０．０５Ｎを超える条件下では、ＴｇＡｂの影響の小さい他検体と同等の吸光度を示し、かつ酸性化濃度の上昇とともに他検体と同様の吸光度の低下を示した。一方、酸性化剤濃度が０．５Ｎを超えると吸光度がブランク付近まで低下してしまい、全体としてＴｇ測定が困難となった。
以上より、ＴｇＡｂの干渉の強い検体を他検体と同様に測定することを可能とするためには、酸性化前処理液の酸性化剤は、前処理時濃度で０．０５Ｎ超０，５Ｎ以下、特に０．１Ｎ以上０，４Ｎ以下とすることが好適であることが分かった。
Figure 0007007278000003
＜実施例４ ＳＤＳ前処理の効果確認試験（ＥＬＩＳＡ法）＞
甲状腺関連疾患の患者血清検体５１例について、各５０μＬをＳＤＳ前処理液（３４７ｍＭ ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２）１００μＬと混和し、１０００ｒｐｍの振とう条件下で８０℃で５分間加熱した。次いで、中和液（１．２％ Ｃ１６ＴＡＣ、４％ ＣＨＡＰＳ、２．９％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））で４倍希釈し、室温で３０分間インキュベーションした後、１５℃、１２０００ｒｐｍの条件下で１５分間遠心分離し、得られた上清をＳＤＳ前処理サンプルとした。同時に、同じ検体について、前処理液に代えてＰＢＳ１００μＬを使用したことと、加熱を行わないこと以外は、上記ＳＤＳ前処理と同様の処理を行い、得られたサンプルを未処理サンプルとした。既知濃度の精製ヒトＴｇ（ＢＢＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）をＴｇＡｂ陰性血清で希釈し、０、６、３０、６０、３００、６００、２４００、４８００ｎｇ／ｍＬの標準液を調製した。各標準液についても、上記と同様の方法でＳＤＳ前処理サンプルと未処理サンプルを調製した。
ＳＤＳ前処理サンプル及び未処理検体各１００μＬを緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、６．０％ ＢＳＡ、０．０５％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００（登録商標）、ｐＨ７．２）１００μＬとそれぞれ混合した後、実施例１と同様の方法で調製した抗Ｔｇ抗体プレートに１５０μＬずつ分注した。室温で２時間インキュベーションした。洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）／ＰＢＳ）で５回洗浄した後、ビオチン化抗Ｔｇ抗体５Ｅ６（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を二次反応液（２４ｍＭ リン酸二水素カリウム、７６ｍＭ リン酸水素二カリウム、１．０％ ＢＳＡ、１．０％ ＰＶＰ、０．０５％ カゼインナトリウム、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、０．０５％ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００（登録商標）、ｐＨ７．０）で２μｇ／ｍＬに希釈した二次抗体液を１００μＬ／ウェル分注し、室温で１時間反応させた（二次反応）。洗浄液で５回洗浄した後、二次反応液で１００００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ロシュ社製）液を１００μＬ／ウェル分注し、室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄した後、ＴＭＢ基質液（ナカライテスク社製）を１００μＬ／ウェル分注し、室温で１５分間暗所に静置した。１Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル分注して反応を停止させ、各ウェルの４５０ｎｍ／６３０ｎｍの吸光度を測定した。各検体のＴｇ測定値は、酸性化前処理標準液、未処理標準液をそれぞれ使用して作成した検量線に基づいて算出した。０ｎｇ／ｍＬの標準液よりも低い吸光度を示す検体は全て０ｎｇ／ｍＬとした。
別途、各検体のＴｇＡｂ値をルミパルス（登録商標）ＴｇＡｂ（富士レビオ社製）で測定した。
各検体及び標準液のＳＤＳ前処理サンプルと未処理サンプルの測定結果を表３に示す。また、酸性化前処理検体と未処理検体の測定値の全体の相関性を図６に、特に吸光度の低い領域の相関性を図７に示す。特にＴｇＡｂ高値の未処理検体で０ｎｇ／ｍＬ付近の吸光度を示す検体が多かったが、前処理によりこれらの吸光度が上昇し、偽低値が改善されていることが示唆された。
Figure 0007007278000004
Figure 0007007278000005

Claims (5)

  1. 生体から分離された試料と、酸性化剤又は陰イオン性界面活性剤を含む前処理液とを混和する前処理工程を含む、生体から分離された試料中のサイログロブリンをイムノアッセイにより測定する方法。
  2. 前記前処理液が酸性化剤を含み、前処理工程における酸性化剤の終濃度が０．０５Ｎ超０．５Ｎ以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記陰イオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム又はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである、請求項１記載の方法。
  4. 前記前処理工程が、加熱条件下で行われる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 酸性化剤又は陰イオン性界面活性剤を含む前処理液を備える、サイログロブリンのイムノアッセイ用試薬。
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