JP2024002311A - Ｃ－ペプチドの測定方法及びそのための試薬 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｃ－ペプチドの濃度が低い、低値検体においても、精度良くＣ－ペプチドを測定することができる、Ｃ－ペプチドの測定方法及び測定試薬を提供すること。【解決手段】生体から分離された試料中のＣ－ペプチドの測定方法は、生体から分離された試料と、アルカリ性物質又は酸性化剤のいずれかを含む前処理液とを混和する前処理工程を含む。Ｃ－ペプチド測定用試薬は、酸性化剤又はアルカリ性物質のいずれかを含む前処理液を備える。【選択図】なし

Description

本発明は、Ｃ－ペプチドの測定方法及びそのための試薬に関する。

ヒトＣ－ペプチドは31個のアミノ酸からなるペプチドであり、インスリン前駆物質であるプロインスリンの構成成分である。Ｃ－ペプチドはプロインスリンが切断されインスリンが血中へ放出される際に、分解産物として同時に放出されるポリペプチドである。ヒトプロインスリンは、86アミノ酸からなるポリペプチドで、主として1～30番目のインスリンB鎖、33～63番目のＣ－ペプチド、66～86番目のインスリンA鎖で構成され、Ｃ－ペプチドとインスリンは31、32番目のArg、64番目Lys、65番目Argを経てそれぞれ結合している。Ｃ－ペプチドはインスリンが放出されると同時に血中に放出されるので、インスリンの分泌動態の指標としての役割を果たし、血中Ｃ－ペプチドの動態は糖尿病患者等の内因性インスリンの分泌能を調べるために重要な指標となり得る。

プロインスリンとの交叉反応性が低く、再現性が高く、かつ高感度でヒトＣ－ペプチドを測定し得る方法が報告されている（非特許文献１）。

Annals of Laboratory Medicine 2018;38: pp.530-537

従来の方法でもヒトＣ－ペプチドを高感度に測定することが可能である。発明者らは、更に高感度なＣ－ペプチドの測定系を構築するため、従来の方法の定量下限（ＬＯＱ）よりも低濃度でＣ－ペプチドを含む検体を用いた測定系の構築を検討したところ、I型糖尿病患者の、特に低濃度のＣ－ペプチドを含む検体（低値検体）において、従来の方法では、Ｃ－ペプチドの濃度が正確に測定できない検体が存在することが判明した。

本発明は、低値検体においても、精度良くＣ－ペプチドを測定可能な、Ｃ－ペプチドの測定方法及び測定試薬を提供することを目的とする。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、試料中のＣ－ペプチドを測定する前に、アルカリ性物質又は酸性化剤のいずれかを含む前処理液と試料を混和することにより、低値検体においても、精度良くＣ－ペプチドを測定することが可能になることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1) 生体から分離された試料と、アルカリ性物質又は酸性化剤のいずれかを含む前処理液とを混和する前処理工程を含む、生体から分離された試料中のＣ－ペプチドの測定方法。
(2) 前記試料中のＣ－ペプチドをイムノアッセイにより測定する、(1)に記載の方法。
(3) 前記前処理液がアルカリ性物質を含み、前処理工程が０．０１Ｎ以上１Ｎ以下のアルカリ濃度の条件下で行われる、(1)または(2)に記載の方法。
(4) 前記前処理液が酸性化剤を含み、前処理工程が０．０１Ｎ以上１Ｎ以下の酸濃度の条件下で行われる、(1)または(2)に記載の方法。
(5) 前記前処理液が界面活性剤を含む、(1)～(4)のいずれか１項に記載の方法。
(6) 前記前処理液がアルカリ性物質と界面活性剤を含み、該界面活性剤が陰イオン性界面活性剤である、(5)に記載の方法。
(7) 前記陰イオン性界面活性剤がＳＤＳ又はＮＬＳである、(6)に記載の方法。
(8) 前記前処理液が酸性化剤と界面活性剤を含み、該界面活性剤が陽イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、又は両イオン性界面活性剤である、(5)に記載の方法。
(9) 前記前処理液が尿素を含む、(8)に記載の方法。
(10) 酸性化剤又はアルカリ性物質のいずれかを含む前処理液を備える、Ｃ－ペプチド測定用試薬。

本発明によれば、低値検体においても、精度良くＣ－ペプチドを測定することが可能になる。

本明細書中で記載される「％」の濃度は、特に記載のない限り、重量／体積（ｗ／ｖ）の濃度表示である。

＜Ｃ－ペプチドの測定方法＞
本発明で測定されるＣ－ペプチド（Ｃ－ペプチド）は、任意の動物由来のＣ－ペプチドであるが、好ましくは、哺乳動物（例、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類；マウス、ラット等の齧歯類、ウサギ等の重歯類；ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等の食肉類）；鳥類（例、ニワトリ））由来のＣ－ペプチドであり、より好ましくは霊長類由来のＣ－ペプチドであり、特に好ましくは、ヒト由来のＣ－ペプチドである。

１．前処理工程
本発明の方法は、生体から分離された生体試料中に存在するＣ－ペプチドを測定する方法である。Ｃ－ペプチドの測定方法としては、イムノアッセイが好ましいが、これに限定されるものではなく、例えば、質量分析等の他の方法によっても測定することができる。以下は、好ましい測定方法であるイムノアッセイでＣ－ペプチドを測定する場合について説明する。

本発明の方法は、イムノアッセイにおける免疫反応（反応工程）の前に、生体試料と前処理液とを混和することによる前処理工程を含むことを特徴とする。実施例に示すように、特に低濃度のＣ－ペプチドを含む検体（低値検体）において、従来の方法では、Ｃ－ペプチドの濃度が正確に測定できない検体が存在することが判明した。これは偽高値を引き起こす反応阻害物質によって引き起こされると考えられた。前処理工程により、低値検体においても、精度良くＣ－ペプチドを測定できるようになる。前処理液は、アルカリ性物質又は酸性化剤のいずれかを含む。

前記前処理工程において混和する生体試料と前処理液の体積比は、１：１０～１０：１、特に１：５～５：１、さらに１：３～３：１とすることが好ましい。本発明で用いられる生体試料は、Ｃ－ペプチドを含有し得る試料であれば特に限定されず、例えば、血清、血漿、全血、尿、便、口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜、及び生検試料（例、甲状腺穿刺吸引細胞診（Ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ：ＦＮＡ）試料、腸管試料、肝臓試料）が挙げられる。好ましくは、生体試料は、血清又は血漿である。

前記前処理液に含まれるアルカリ性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化マグネシウム等のアルカリ土類水酸化物等を好適に使用できる。アルカリ性物質を使用する場合、前処理液のアルカリ性物質の規定度は、前処理時（混和後）の濃度として、０．０１Ｎ以上１Ｎ以下、特に０．１Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。アルカリ性物質の規定度を０．０１Ｎ以上１Ｎ以下とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。

本発明において、アルカリ性物質を含む前処理液と試料とを混和した際のｐＨは、添加するアルカリ性物質にもよるが、例えばｐＨ１０．０以上、好ましくはｐＨ１１．０以上、より好ましくはｐＨ１２．０以上である。また、本発明において、アルカリ性物質を含む前処理液と試料とを混和した際のｐＨは、添加するアルカリ性物質にもよるが、例えばｐＨ１３．７以下、好ましくはｐＨ１３．５以下、より好ましくはｐＨ１３．３以下である。具体的には、アルカリ性物質を含む前処理液と試料とを混和した際のｐＨは、例えばｐＨ１０．０～１３．７、好ましくはｐＨ１１．０～１３．５、より好ましくはｐＨ１２．０～１３．３である。前処理工程におけるｐＨをこれらの範囲とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。

前記前処理液に含まれる酸性化剤としては、塩酸、硫酸、酢酸等を好適に使用できる。酸性化剤を使用する場合、前処理液の酸の規定度は、前処理時の濃度として、０．０１Ｎ以上１Ｎ以下、特に０．１Ｎ以上０．４Ｎ以下とすることが好ましい。酸の規定度を０．０１Ｎ以上１Ｎ以下とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。

本発明において、酸性物質を含む前処理液と試料とを混和した際のｐＨは、添加する酸性物質にもよるが、例えばｐＨ４．８以下、好ましくはｐＨ４．５以下、より好ましくはｐＨ４．２以下である。また、本発明において、酸性物質を含む前処理液と試料とを混和した際のｐＨは、添加する酸性物質にもよるが、例えばｐＨ０．３以上、好ましくはｐＨ０．４以上、より好ましくはｐＨ０．５以上である。具体的には、酸性物質を含む前処理液と試料とを混和した際のｐＨは、例えばｐＨ０．３～４．８、好ましくはｐＨ０．４～４．５、より好ましくはｐＨ０．５～４．２である。前処理工程におけるｐＨをこれらの範囲とすることで、前処理の効果が十分に得られ、かつ、後段の反応工程への影響を最小化することが可能である。

本発明において、酸性物質を含む前処理液と試料とを混和した際のｐＨは、添加する界面活性剤や変性剤の種類や濃度によって、上記の例示の範囲で、より至適なｐＨを設定することができる。

前処理液は、界面活性剤を含んでいてもよい。前処理液がアルカリ性物質を含む場合、界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤が好ましい。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム等の硫酸エステル型界面活性剤、Ｎ-ラウロイルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）等のカルボン酸型界面活性剤、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のスルホン酸型界面活性剤、デオキシコール酸、コール酸等の胆汁酸若しくはその誘導体、又はそれらの塩等を好適に使用でき、特にＳＤＳ及びＮＬＳを好適に使用できる。界面活性剤の濃度は、特に限定されず、適宜設定できるが、例えばＳＤＳ又はＮＬＳを使用する場合は、生体試料と混和した混和液の前処理時の濃度として、０．０１～１２．５％、特に０．０５～１０％、さらに０．１～７．５％とすることが好ましい。ＳＤＳを使用する場合は、ＳＤＳの濃度を０．０５～１０％とすることで、本発明の効果をさらに高めることができる。

前処理液が陰イオン性界面活性剤を含む場合、前処理後に、反応系に持ち込まれる陰イオン性界面活性剤の影響を軽減するために、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を単独又は複数を添加してもよい。前処理後に添加する陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤は、下記の中和液に添加してもよい。

前処理液が酸性化剤と界面活性剤を含む場合、該界面活性剤が陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、又はそれらの組合せであることが好ましい。陽イオン性界面活性剤としては、炭素数１０個以上の一本鎖アルキル基と、第３級アミン又は第４級アンモニウム塩を同分子中に有している陽イオン性界面活性剤が好ましい。このような陽イオン性界面活性剤の例としては、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ラウリルピリジニウムクロライド、テトラデシルピリジニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド等が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商品名・登録商標）シリーズ）、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商品名・登録商標）シリーズ）等が挙げられる。両イオン性界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｃ１２ＡＰＳ）、Ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｃ１４ＡＰＳ）、Ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｃ１６ＡＰＳ）等のスルホベタイン型界面活性剤等が挙げられる。これらの界面活性剤の添加量は、検体との混和時の濃度で０．１％以上１５%以下が好ましく、さらに、０．５％～１０％が好ましい。

前処理液には、必要に応じて、尿素、チオ尿素等、他のタンパク変性剤が含まれていてもよい。変性剤の濃度は、処理時濃度で０．１Ｍ以上が好ましく、さらに０．５Ｍ以上４Ｍ未満が好ましい。また、前処理液には、処理効果を増強させるために、単糖類、二糖類、クエン酸、及びクエン酸塩類のいずれか、又はこれらを組合せて添加してもよい。さらに、前処理液には、ＥＤＴＡ等のキレート剤が含まれていてもよい。

前処理工程は、生体試料と前処理液を混和し、混合液を室温で放置することにより行うことができる。前処理時間は、精度良くＣ－ペプチドを測定できるように検体を処理可能な時間であればよく、特に限定されないが、例えば、1秒以上、10秒以上、30秒以上、１分以上、３分以上、５分以上とすることができる。前処理時間の上限は特に存在しないが、６０分以下、３０分以下、特には１５分以下でよい。

前処理工程は、生体試料と前処理液を混和した後、さらに加熱してもよい。加熱温度は３０～５０℃とすることが好ましい。また、加熱時間は、前処理時間に含まれ、精度良くＣ－ペプチドを測定できるように検体を処理可能な時間であればよく、特に限定されないが、例えば、1秒以上、10秒以上、30秒以上、１分以上、３分以上、５分以上とすることができる。加熱時間の上限は特に存在しないが、通常、６０分以下、３０分以下、特には１５分以下でよい。

前処理液がアルカリ性物質を含む場合、前処理後に、ｐＨを中和するために酸性化剤を含む中和液を添加する工程を更に含んでもよい。酸性化剤としては上記したものが挙げられる。また、中和液を添加する工程を含まない場合、例えば、下記の反応工程において、混合する緩衝液の緩衝能及びｐＨ等を調整することで、前処理液のアルカリ性物質を中和し、反応工程における影響を緩和してもよい。反応工程におけるｐＨは、反応工程に含まれる成分によって適宜設定することができるが、例えば、ｐＨ５．５～９．５になるように反応工程の液中に含まれる酸性化剤又は緩衝液等の添加量を適宜設定することができる。また、中和液を添加後のｐＨが、上記の反応工程におけるｐＨよりも高い場合又は低い場合は、反応工程において、混合する緩衝液の緩衝能及びｐＨ等を調整することで、前処理液のアルカリ性物質を中和し、反応工程における影響を緩和してもよい。

前処理液が酸性化剤を含む場合、前処理後に、ｐＨを中和するためにアルカリ性物質を含む中和液を添加する工程を更に含んでもよい。アルカリ性物質としては上記したものが挙げられる。また、中和液を添加する工程を含まない場合、例えば、下記の反応工程において、混合する緩衝液の緩衝能及びｐＨ等を調整することで、前処理液の酸性化剤を中和し、反応工程における影響を緩和してもよい。反応工程におけるｐＨは、反応工程に含まれる成分によって適宜設定することができるが、例えば、ｐＨ５．５～９．５になるように反応工程の液中に含まれる酸性化剤又は緩衝液等の添加量を適宜設定することができる。また、中和液を添加後のｐＨが、上記の反応工程におけるｐＨよりも高い場合又は低い場合は、反応工程において、混合する緩衝液の緩衝能及びｐＨ等を調整することで、前処理液の酸性化剤を中和し、反応工程における影響を緩和してもよい。

２．反応工程
本発明の方法の上記前処理工程で得られた生体試料混和液（生体試料と前処理液とを混和し前処理して得られた試料、又は混和液を中和して得られた試料）は、次いでイムノアッセイの反応工程に供される。反応工程においては、生体試料混和液を緩衝液と混合させ、混合液中の抗原をＣ－ペプチドに対する抗体と反応させる。なお、Ｃ－ペプチドのイムノアッセイ自体は種々の方法が周知であり、Ｃ－ペプチドを定量可能ないずれのイムノアッセイをも採用することができる。

前記緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液をベースとしたものが挙げられ、特にＴｒｉｓ緩衝液をベースとしたものを好適に使用できる。前処理液として界面活性剤を含有するものを使用した場合には、未反応の界面活性剤を吸収するために、例えば、ＢＳＡ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）デキストラン硫酸ナトリウム等の水溶性高分子を、前処理後の混和液と混合した際の終濃度で０．０１～１０．０％、特に０．０５～５．０％程度含む緩衝液を使用することが好ましい。また、前処理工程において、アルカリ性物質を含有する前処理液を使用した場合、前記緩衝液はアルカリ性物質の影響を緩和し得る緩衝能を有する緩衝液を使用してもよい。前記の通り、中和工程を含まない場合、又は中和後のｐＨが高い場合は、アルカリ性物質の影響を緩和し得る緩衝能を有する緩衝液を使用することが好ましい。また、酸性化剤を含有する前処理液を使用した場合は、前処理液の酸の影響を緩和し得る緩衝能を有する緩衝液を使用してもよい。前記の通り、中和工程を含まない場合、又は中和後のｐＨが低い場合は、酸性化剤の影響を緩和し得る緩衝能を有する緩衝液を使用することが好ましい。前処理工程の混和液と緩衝液との混合は、体積比で、例えば、１：１０～１０：１、特に１：５～５：１、さらに１：３～３：１としてもよい。

本発明の方法で使用されるＣ－ペプチドに対する抗体は、Ｃ－ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部をエピトープとして認識する抗体である。Ｃ－ペプチドに対する抗体は、特に限定されず、既知のエピトープを認識する抗体をいずれも使用することができるが、好ましくは、Ｃ－ペプチドに対する抗体は、Ｃ－ペプチド特異的エピトープ（特に、ヒトＣ－ペプチド特異的エピトープ）を認識する抗体である。

Ｃ－ペプチドに対する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。Ｃ－ペプチドに対する抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。Ｃ－ペプチドに対する抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域及び定常領域を各々含む重鎖及び軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分及びＦｃ部分を含む抗体）をいう。Ｃ－ペプチドに対する抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。Ｃ－ペプチドに対する抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。

Ｃ－ペプチドに対する抗体は、従前公知の方法を用いて作製することができる。例えば、Ｃ－ペプチドに対する抗体は、上記のエピトープを抗原として用いて作製することができる。また、上述したようなエピトープを認識するＣ－ペプチドに対する多数の抗体が市販されているので、このような市販品を使用することもできる。

Ｃ－ペプチドに対する抗体は、固相に固相化されていてもよい。またＣ－ペプチドに対する抗体は、反応工程において固相に固相化され得る抗体であってもよい。本明細書において、固相に固相化された抗体、及び反応工程において固相に固相化され得る抗体を、単に固相化抗体ということがある。固相としては、例えば、液相を収容又は搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、及びウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）、ならびに液相中に懸濁又は分散可能な固相（例、粒子等の固相担体）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、及びカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、又は磁性材料を用いることができるが、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。固相は、好ましくは固相担体であり、より好ましくは磁性固相担体であり、さらにより好ましくは磁性粒子である。抗体の固相化方法としては、従前公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、及びイオン結合法が挙げられる。特定の実施形態では、Ｃ－ペプチドに対する抗体は、固相に固相化された抗体であり、好ましくは、磁性の固相に固相化された抗体であり、より好ましくは、磁性粒子に固相化された抗体である。

反応工程は、前処理工程の混和液と緩衝液とを混合した後、固相化抗体に接触させてもよく、前記混和液と、固相化抗体を含む緩衝液とを混合してもよい。例えば、緩衝液中に、粒子上に固相化した抗体を予め入れて粒子液とし、前記混和液と粒子液とを混合させてもよい。反応工程は、例えば免疫凝集法や競合法のように一次反応工程のみで実施してもよいが、サンドイッチ法のように二次反応工程を設けてもよい。なお、二次反応工程を設ける場合、一次反応工程と二次反応工程の間に、未反応成分を除去するための洗浄工程を設けてもよい。またサンドイッチ１ステップ法のように、一次反応と二次反応を同時に行ってもよい。

Ｃ－ペプチドに対する抗体は、標識物質で標識化されていてもよい。本明細書において、標識物質で標識化された抗体を、単に標識化抗体ということがある。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質又は蛍光タンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光物質又は吸光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウム、ルテニウム）、放射性物質（例、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法では二次反応を設ける場合、二次反応に用いる抗体は、このような標識物質で標識化されていてもよい。

特定の実施形態では、本発明の方法は、二次反応に用いる抗体として、一次反応に用いるＣ－ペプチドに対する抗体と異なるエピトープを認識するＣ－ペプチドに対する別の抗体を含む。このような別の抗体が認識するエピトープの詳細は、上述したＣ－ペプチドに対する抗体について詳述したエピトープと同様である（但し、併用される場合、エピトープの種類は異なる）。Ｃ－ペプチドに対する抗体により認識されるエピトープと、Ｃ－ペプチドに対する別の抗体により認識されるエピトープとの組合せは、特に限定されない。このような別の抗体の使用は、例えば、サンドイッチ法が利用される場合に好ましい。

３． 検出工程
一次抗体又は二次抗体に標識を用いた場合、使用する標識に適した方法、例えば酵素標識を用いた場合は酵素の基質を添加することによって、検出することができる。例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を標識抗体として用いた場合は、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を酵素基質として用いた化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）の系とすることができる。

本発明の方法は、Ｃ－ペプチドに対する抗体を使用するイムノアッセイである。このようなイムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、例えば、化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。これらのイムノアッセイ自体は周知であり、ここで詳しく述べる必要はないが、それぞれ簡単に説明する。

直接競合法は、例えば、測定すべき標的抗原（本発明ではＣ－ペプチド）に対する抗体を固相に固相化し（固相及び固相化については上記のとおり）、非特異吸着を防ぐためのブロッキング処理（血清アルブミン等のタンパク質溶液で固相を処理）後、この抗体と、前記標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料）と、一定量の標識した抗原（標識は上記のとおり）とを反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。被検試料中の抗原と標識抗原とが、抗体に対して競合的に結合するので、被検試料中の抗原量が多いほど、固相に結合する標識の量が少なくなる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化された標識量（標識の性質に応じて、吸光度、発光強度、蛍光強度等、以下同じ）を測定して、抗原濃度を横軸、標識量を縦軸にとった検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。直接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 20150166678Aに記載されている。

間接競合法では、例えば、標的抗原（本発明ではＣ－ペプチド）を固相に固相化する（固相及び固相化については上記のとおり）。次いで、固相のブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料）と、一定量の抗標的抗原抗体とを混合し、前記固相化抗原と反応させる。洗浄後、固相に結合された前記抗標的抗原抗体を定量する。これは、前記抗標的抗原抗体に対する標識した二次抗体（標識は上記のとおり）を反応させ、洗浄後、標識量を測定することにより行うことができる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化されて標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。なお、標識二次抗体を用いずに、標識した一次抗体を用いることも可能である。間接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、上記したUS 20150166678Aに記載されている。

サンドイッチ法は、例えば、固相に抗標的抗原抗体を固相化し（固相及び固相化については上記のとおり）、ブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料）を反応させ、洗浄後、標的抗原に対する標識した二次抗体（標識は上記のとおり）を反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化された標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。サンドイッチ法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 20150309016Aに記載されている。

上記した各種イムノアッセイのうち、化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、上記した直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等を行う際に用いる標識の種類に基づいて分類したイムノアッセイである。化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、上記したアルカリフォスファターゼ）を用い、基質として化学発光性化合物を生じる基質（例えば、上記したＡＭＰＰＤ）を用いる、イムノアッセイである。酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、上記したペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等）を用いるイムノアッセイである。各酵素の基質としては、吸光度測定等により定量可能な化合物が用いられる。例えば、ペルオキシダーゼの場合には、1,2-フェニレンジアミン(OPD)や3,3'5,5'-テトラメチルベンチジン(TMB)等、アルカリフォスファターゼの場合には、p-ニトロフェニルフォスフェート(pNPP)等、β－ガラクトシダーゼの場合には、MG：4-メチルウンベリフェリルガラクトシド、NG：ニトロフェニルガラクトシド等、ルシフェラーゼの場合には、ルシフェリン等が用いられる。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、標識として放射性物質を用いる方法であり、放射性物質としては、上記のとおり^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ等の放射性元素が挙げられる。蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、標識として蛍光物質又は蛍光タンパク質を用いる方法であり、蛍光物質又は蛍光タンパク質としては、上記のとおりフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質等が挙げられる。これらの標識を用いるイムノアッセイ自体はこの分野において周知であり、例えば、US 8039223BやUS 20150309016Aに記載されている。

免疫比濁法（ＴＩＡ）は、測定すべき標的抗原（本発明ではＣ－ペプチド）と、該抗原に対する抗体との抗原抗体反応により生成された抗原抗体複合物により濁度が増大する現象を利用したイムノアッセイである。抗標的抗原抗体溶液に、種々の既知濃度の抗原を添加し、それぞれ濁度を測定し、検量線を作成する。未知の被検試料について、同様に濁度を測定し、測定された濁度を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。免疫比濁法自体は周知であり、例えば、US 20140186238Aに記載されている。ラテックス凝集法は、免疫比濁法と類似しているが、免疫比濁法における抗体溶液に代えて、表面に抗標的抗原抗体を固定化したラテックス粒子の浮遊液を用いる方法である。免疫比濁法及びラテックス凝集法自体はこの分野において周知であり、例えば、US7820398Bに記載されている。

イムノクロマトグラフィー法は、ろ紙、セルロースメンブレン、ガラス繊維、不織布等の多孔性材料で形成された基体（マトリックスやストリップとも呼ばれる）上で上記したサンドイッチ法や競合法を行う方法である。例えば、サンドイッチ法によるイムノクロマトグラフィー法の場合、抗標的抗原抗体を固定化した検出ゾーンを上記基体上に設け、標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った生体試料）を基体に添加し、上流側から展開液を流して標的抗原を検出ゾーンまで移動させ、検出ゾーンに固定化させる。固定化された標的抗原を、標識した二次抗体でサンドイッチして、検出ゾーンに固定化された標識を検出することにより、被検試料中の標的抗原を検出する。標識二次抗体を含む標識ゾーンを検出ゾーンよりも上流側に形成しておくことにより、標的抗原と標識二次抗体との結合体が検出ゾーンに固定化される。標識が酵素の場合には、酵素の基質を含めた基質ゾーンも検出ゾーンよりも上流側に設けられる。競合法の場合には、例えば、検出ゾーンに標的抗原を固定化しておき、被検試料中の標的抗原と、検出ゾーンに固定化された標的抗原とを競合させることができる。検出ゾーンよりも上流側に標識抗体ゾーンを設けておき、被検試料中の標的抗原と標識抗体を反応させ、未反応の標識抗体を検出ゾーンに固定化して標識を検出又は定量することにより、被検試料中の標的抗原を検出又は定量することができる。イムノクロマトグラフィー法自体は、この分野において周知であり、例えばUS6210898Bに記載されている。

＜Ｃ－ペプチドの測定試薬＞
本発明のＣ－ペプチドの測定試薬は、上述のＣ－ペプチドの測定方法を実現し得る測定試薬である。本発明の測定試薬は、通常のイムノアッセイに使用される構成に加え、アルカリ性物質又は酸性化剤のいずれかを含む前処理液を構成成分として含むことを特徴とする。

本発明の試薬は、互いに隔離された形態又は組成物の形態において各構成成分を含む。具体的には、各構成成分はそれぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよいが、一部の構成成分が組成物の形態（例、同一溶液中）で提供されてもよい。あるいは、本発明の試薬は、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。

好ましい実施形態では、本発明の試薬は、採用されるべきイムノアッセイの種類に応じた構成を有していてもよい。例えば、サンドイッチ法が採用される場合、本発明の試薬は、必須の構成成分として、ｉ）前処理液、ｉｉ）Ｃ－ペプチドに対する抗体、ｉｉｉ）緩衝液、並びに任意の構成成分として、ｉｖ）Ｃ－ペプチドに対する別の抗体、ｖ）標識物質、ｖｉ）希釈液、及び、必要に応じて、ｖｉｉ）標識物質と反応する基質を含んでいてもよい。ｉｉ）及びｉｉｉ）の構成成分は、同一溶液に含まれていてもよい。ｉｖ）の構成成分は、ｖ）標識物質で標識化されていてもよい。好ましくは、Ｃ－ペプチドに対する抗体は、磁性粒子に固相化されていてもよい。

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

（参考例１）抗Ｃ－ペプチド抗体固相化磁性粒子液の調製
１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中で磁性粒子に抗Ｃ－ペプチド抗体を添加して、０．０４ｍｇ／ｍＬ 抗Ｃ－ペプチド抗体及び５ｍｇ／ｍＬ磁性粒子を含む懸濁液を得た。この懸濁液をゆるやかに攪拌しながら２５℃で１時間インキュベートして抗Ｃ－ペプチド抗体を磁性粒子に固相化した。その後、磁性粒子を磁石で集磁し、磁性粒子を洗浄液（５０ｍＭ トリス緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）にて洗浄し、抗Ｃ－ペプチド抗体固相化粒子を得た。測定では、抗Ｃ－ペプチド抗体固相化粒子を、粒子希釈液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．１％ ＮａＮ_３、２．０％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）中に懸濁した。これを抗体結合粒子液とした。

実施例１ アルカリ処理の希釈直線性確認試験
(1) 希釈検体の調製
Ｉ型糖尿病の購入検体（１）と検体（２）をルミパルス（登録商標）検体希釈液（富士レビオ社製）を用いて２倍希釈、４倍希釈、８倍希釈になるように調製した。１倍希釈検体は、未希釈の検体とし、この１～８倍希釈の検体を、段階的に希釈された検体という。

(2) 検体及びキャリブレータのアルカリ処理
各検体４５μＬにアルカリ処理液（条件３：０．２Ｍ ＮａＯＨ、０．８％ Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ）、前処理時ｐＨ１２．８、 条件４：０．２Ｍ ＮａＯＨ、０．１６％ ＳＤＳ、前処理時ｐＨ１２．７）７５μＬを混合し、３７℃で７分間インキュベートした後、７５μＬの中和液（０．２Ｍ ＨＣｌ）を添加して速やかに撹拌し、アルカリ処理検体を得た（条件３：中和時ｐＨ７．２、条件４：中和時ｐＨ９．８）。

測定のキャリブレータとして、ルミパルスプレスト（登録商標）Ｃ－ペプチドキャリブレータ（富士レビオ社製、濃度：０、０．０３、０．３、３、３０ｎｇ／ｍＬ）を使用した。このキャリブレータについても、条件３と４は上記と同様の方法で処理して、アルカリ処理キャリブレータを得た。

(3) 検体中のＣ－ペプチド測定
得られたアルカリ処理検体及びキャリブレータを、自動分析装置ルミパルスＬ２４００を用いてＣ－ペプチド濃度の測定を行った。

抗体結合粒子液５０μＬとサンプル（段階的に希釈された検体又はキャリブレータ）１０μＬとをキュベットに分注した。撹拌後、３７℃で８分間インキュベートした（条件３：１次反応時ｐＨ７．１５、条件４：１次反応時ｐＨ７．４７）。キュベット内の粒子を磁石で集磁し、キュベット内を洗浄液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）／ＰＢＳ）にて洗浄した。洗浄後のキュベットに、ルミパルスプレストＣ－ペプチドに付属する酵素標識抗体液（アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗Ｃ－ペプチドモノクローナル抗体）５０μＬを加え、３７℃で８分間インキュベートした。キュベット内の粒子を磁石で集磁し、キュベット内を洗浄液にて洗浄した後、基質としてＡＭＰＰＤを含む基質液（ルミパルスプレスト基質液(共通試薬)）２００μＬを添加し、３７℃で４分間反応させた。波長４６３ｎｍに極大吸収波長を持つ光の発光量（カウント）を測定した。キャリブレータのカウントを用いてそれぞれの検量線を作成し、希釈系列検体中のＣ－ペプチド濃度を算出した。

対照として未処理の検体及びキャリブレータについて、同様にＣ－ペプチド濃度の測定を行った（条件１）。

条件２は、一次反応時に界面活性剤（ＮＬＳ）のみ存在した場合の測定系への影響を確認するため、参考例１に記載する粒子希釈液にＮＬＳを終濃度０．０６１５％となるように更に添加して、段階的に希釈された検体とキャリブレータを条件１と同様に測定した。

条件３は、上記のＮＬＳを含むアルカリ処理液によってアルカリ処理された段階的に希釈された検体と、アルカリ処理されたキャリブレータを、条件１と同様に測定した。

条件４は、上記のＳＤＳを含むアルカリ処理液によってアルカリ処理された段階的に希釈された検体と、アルカリ処理されたキャリブレータを、粒子液と混合させるサンプル量が３０μＬである点を除き、条件１と同様に測定した。

段階的に希釈された検体の、実測定値、実測定値に希釈倍率を乗して算出した換算値、各希釈倍率の換算値を１倍の換算値で割り、その割合を百分率で表した値（回収率）を表１に示す。回収率は、１００％に近いほど希釈直線性が良好で、検体中の対象物を適切に定量できていることを示す。一方、低い回収率は、検体中の対象物の実際の濃度よりも高い値（偽高値）となっていることを示し、高い回収率は、実際の濃度よりも低い値（偽低値）となっていることを示す。条件１と条件２では、検体（１）と検体（２）のいずれも、２倍希釈において、回収率が５０％を下回った。一方で、アルカリ処理を行った条件３及び条件４では、回収率の改善が確認された。ＮＬＳを含むアルカリ処理液で処理した条件３では、検体（１）では４倍希釈まで、検体（２）では８倍希釈まで、１００±５０％の回収率を示した。ＳＤＳを含むアルカリ処理液で処理した条件４では、検体（１）と検体（２）のどちらも８倍希釈まで１００±４０％の回収率を示した。これらの結果から、アルカリ性物質を含む前処理液で処理を行うことで、偽高値を起こす反応が低減され、検体中のＣ－ペプチドが低値であっても正確に測定できることが示された。

実施例２ 偽高値を示す検体について、アルカリ処理による吸収試験を用いた特異性確認試験
Ｉ型糖尿病の購入検体（購入先ＩＩＣ－Ｊａｐａｎ）について検体未処理の条件（条件１）により、実施例１と同様にＣ－ペプチドの濃度を測定したところ、０．００２ ｎｇ／ｍＬ以上の測定値を示す、５検体（検体（３）～（７））が抽出された。これら５検体について、実施例１の条件１と条件４の方法でそれぞれ測定したところ、アルカリ前処理を行う条件４の測定では、２検体（検体（３）、検体（４））はアルカリ未処理の方法より２倍以上高い値を示し、３検体（検体（５）、検体（６）、検体（７））は１／２以下の低値を示した（実施例１の表２中の抗体未添加測定値参照）。これらの検体について、特異性を確認するために以下に記載する吸収試験を行った。

吸収試験は、吸収剤として、測定に用いる固相用抗体（抗体結合粒子に使用する抗体）と標識用抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗体に使用する抗体）を各１００μｇ／ｍＬとなるように抗体結合粒子液に添加した吸収試験用粒子液を、抗体結合粒子液の代わりに用いる以外は、実施例１と同様の方法でＣ－ペプチドの濃度を測定することにより行った。条件５は実施例１の条件１と同様に、条件６は実施例１の条件４と同様にキャリブレータ及び上記５検体（３）～（７）を測定した。

検体（３）～（７）の、抗体結合粒子液に吸収用抗体が添加されていない試薬で測定した測定値（抗体未添加測定値）、抗体結合粒子液に吸収用抗体を添加した試薬（吸収試験用粒子液）で測定した測定値（抗体添加測定値）、及び「１－（抗体添加測定値／抗体未添加測定値）」の百分率で表した値（吸収率）を表２に示す。

アルカリ未処理の方法よりもアルカリ処理法により高値を示した２検体（検体（３）、（４））について、吸収試験を行った結果、アルカリ処理を行った条件６では全ての検体において、吸収率９０％以上を示した。この結果はアルカリ処理によって特異的にＣ－ペプチドを検出できていることを示す。アルカリ前処理法よりもアルカリ未処理の方法で高値を示した３検体（検体（５）、（６）、（７））について、吸収試験を行った結果、アルカリ処理を行わない条件５では、測定用抗体による吸収が起こらなかった。つまり、この３検体は、アルカリ処理を行わない場合、偽高値を示す検体であり、このような検体であっても、アルカリ処理を行うことで非特異的な反応を回避し、より正確にＣ－ペプチドを検出できていることを示す。

実施例３ アルカリ処理した場合の検出限界（ＬＯＤ）と定量限界（ＬＯＱ）の算出
(1) 希釈試料の調製
Ｃ－ペプチドが０、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００８、０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる希釈試料を使用した。

(2) 試料及びキャリブレータのアルカリ処理
各希釈試料３０μＬにアルカリ処理液（０．２Ｍ ＮａＯＨ、０．８％ Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム（ＮＬＳ））７５μＬを混合し、３７℃で７分間インキュベートした後、５０μＬの中和液（０．２Ｍ ＨＣｌ）を添加して速やかに撹拌し、アルカリ処理希釈試料を得た。

測定のキャリブレータとして、ルミパルスプレスト（登録商標）Ｃ－ペプチドキャリブレータ（富士レビオ社製、濃度：０、０．０３、０．３、３、３０ｎｇ／ｍＬ）を使用した。このキャリブレータについても、上記と同様の方法で処理して、アルカリ処理キャリブレータを得た。

(3) 試料中のＣ－ペプチド測定
得られたアルカリ処理希釈試料及びキャリブレータを、自動分析装置ルミパルスＬ２４００を用いて、実施例１条件３と同様に、Ｃ－ペプチド濃度の測定を行った。

アルカリ処理希釈試料は１試料につき１０回測定（Ｎ＝１０）し、キャリブレータは１濃度につき２回測定（Ｎ＝２）した。

Ｎ＝１０で測定したアルカリ処理希釈試料のうち、０ｎｇ／ｍＬの試料の平均値＋３ＳＤの値（検出限界（ＬＯＤ））を求めた。算出された検出限界（ＬＯＤ）は０．００１１ｎｇ／ｍＬ であった。さらに、アルカリ処理希釈試料の標準偏差を平均値で割った数の百分率（変動係数（ＣＶ））を求めた。各濃度のＣＶを求め、ＣＶが１０%以下となる最小の濃度（定量限界（ＬＯＱ））を求めた。算出された定量限界は、０．００８ｎｇ／ｍＬであった。これらの結果から、アルカリ性物質を含む前処理液で処理を行うことで、例えば試料中に含まれるＣ－ペプチドの濃度が０．０２ｎｇ／ｍＬ未満であっても精度良くＣ－ペプチドを測定又は定量可能であることが示された。さらに、試料中に含まれるＣ－ペプチドの濃度が０．００８ｎｇ／ｍＬ～０．０１５ｎｇ／ｍＬであっても精度良くＣ－ペプチドを測定又は定量可能であることが示された。

実施例４ 偽高値を示す検体における、酸処理による希釈直線性確認試験
（１）希釈検体の調製
希釈検体は、実施例１（１）に記載した、段階的に希釈された検体と同じものを使用した。

（２）検体の酸処理及び検体中のＣ－ペプチドの検出
条件７と条件８と条件９の酸処理及び検体中のＣ－ペプチドの検出は以下の通りに行った。条件７は、実施例１の条件１と同様の方法で希釈系列検体とキャリブレータを測定した。条件８は、各検体４５μＬに前処理液（０．５Ｍ ＨＣｌ、２Ｍ Ｕｒｅａ、４％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）７５μＬを混合し（前処理時ｐＨ１．０２）、３７℃で７分間インキュベートした後、７５μＬの中和液（０．５Ｍ ＮａＯＨ)を添加して速やかに撹拌し（中和時ｐＨ１０．１４）、酸処理検体を得た。

得られた酸処理検体３０μＬ のＣ－ペプチドの濃度を、実施例１と同様に測定した（１次反応時ｐＨ７．４４）。

ルミパルスＣ－ペプチドキャリブレータ（富士レビオ社製、濃度：０、０．０３、０．３、３、３０ｎｇ／ｍＬ）についても、上記と同様の方法で酸処理キャリブレータを調製し、実施例１と同様に測定した。

条件９は、検体の酸処理及び中和をルミパルスＬ２４００の装置上で行った。

条件９は、具体的には、酸処理液（２．４Ｍ Ｕｒｅａ、０．１６Ｍ ＨＣｌ、４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、６．４％ Ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｃ１６ＡＰＳ）、ｐＨ３．４３）９０μＬと検体又はキャリブレータ３０μＬを混合し、３７℃で６．５分間インキュベートした後（前処理時ｐＨ４．１３）、Ｃ－ペプチド抗体固相化磁性粒子を粒子希釈液（１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ ７．９）で希釈した粒子液８０μＬを加えて、３７℃で８分間反応させた（1次反応時ｐＨ７．６７）。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、ルミパルスプレストＣ－ペプチドに付属する酵素標識抗体液（アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗Ｃ－ペプチドモノクローナル抗体）５０μＬを加え、３７℃で８分間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄後、基質液２００μＬを添加し、３７℃で４分間反応させた。波長４６３ｎｍに極大吸収波長を持つ光の発光量（カウント）を測定した。キャリブレータのカウントを用いてそれぞれの検量線を作成し、段階的に希釈された検体中のＣ－ペプチド濃度を算出した。

段階的に希釈された検体の、実測定値、実測定値に希釈倍率を乗して算出した換算値、各希釈倍率の換算値を１倍の換算値で割り、その割合を百分率で表した値（回収率）を表３に示す。

条件７では、検体（１）と検体（２）のいずれも、２倍希釈において、回収率が５０％を下回った。一方で、酸処理を行った条件８及び条件９では、回収率の向上が確認された。条件８では、検体（１）では４倍希釈まで１００±４０％、検体（２）では８倍希釈まで１００±３０％の回収率を示した。陽イオン性界面活性剤を含む酸処理液で処理し、Ｔｒｉｓ緩衝液で中和を行った条件９では、検体（１）と検体（２）のどちらも８倍希釈まで１００±１０％の回収率を示した。これらの結果から、酸性化剤を含む前処理液で処理を行うことで、偽高値を起こす反応が低減され、検体中のＣ－ペプチドが低値であっても正確に測定できることが示された。

実施例５ 偽高値を示す検体について、酸処理による吸収試験を用いた特異性の確認
実施例２と同様に、実施例２に記載したＩ型糖尿病の購入検体について、実施例４の条件７と条件８の方法でそれぞれ測定したところ、酸処理を行う条件８では、２検体（検体（３）、検体（４））は検体を処理しない条件７より１．７倍以上高い値を示し、３検体（検体（５）、検体（６）、検体（７））は１／２以下の低値を示した（実施例４の表４中の抗体未添加測定値参照）。これらの検体について、特異性を確認するために粒子液に測定用抗体を添加した吸収試験を行った。

吸収試験は、吸収剤として、測定に用いる固相用抗体（抗体結合粒子に使用する抗体）と標識用抗体（アルカリフォスファターゼ標識抗体に使用する抗体）を各１００μｇ／ｍＬとなるように抗体結合粒子液に添加した吸収試験用粒子液を、抗体結合粒子液の代わりに用いる以外は、実施例４と同様の方法でＣ－ペプチドの濃度を測定することにより行った。条件１０は実施例４の条件７と同様に、条件１１は実施例４の条件８と同様に、条件１２は実施例４の条件９と同様にキャリブレータ及び上記５検体（３）～（７）を測定した。

検体（３）～（７）の、抗体結合粒子液に吸収用抗体が添加されていない試薬で測定した測定値（抗体未添加測定値）、抗体結合粒子液に吸収用抗体を添加した試薬（吸収試験用粒子液）で測定した測定値（抗体添加測定値）、及び「１－（抗体添加測定値／抗体未添加測定値）」の百分率で表した値（吸収率）を表４に示す。

検体を処理しない方法よりも酸処理法により高値を示した２検体について、吸収試験の結果、酸処理を行った条件１１及び条件１２は、全検体で吸収率９５%以上を示した。この結果は酸処理によって特異的にＣ－ペプチドを検出できていることを示す。酸前処理法よりも酸未処理の方法で高値を示した３検体（検体（５）、（６）、（７））について、吸収試験を行った結果、酸処理を行わない条件１０では、測定用抗体による吸収が起こらなかった。つまり、この３検体は、酸処理を行わない場合、偽高値を示す検体であり、このような検体であっても、酸処理を行うことで非特異的な反応を回避し、より正確にＣ－ペプチドを検出できていることを示す。

実施例６ 酸処理した場合の検出限界（ＬＯＤ）と定量限界（ＬＯＱ）の算出
(1)希釈試料の調製
Ｃ－ペプチドが０、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００８、０．０１ｎｇ／ｍＬの濃度で含まれる希釈試料を使用した。

(2)試料及びキャリブレータの酸処理及びＣ－ペプチド測定
自動分析装置ルミパルスＬ２４００を用いて、実施例４条件９と同様に、試料中のＣ－ペプチド濃度の測定を行った。即ち、各希釈試料３０μＬに酸処理液（２．４Ｍ Ｕｒｅａ、０．１６Ｍ ＨＣｌ、４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、６．４％ Ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート（Ｃ１６ＡＰＳ）、ｐＨ３．４３）９０μＬを混合し、３７℃で６．５分間インキュベートした後、８０μＬのＣ－ペプチド抗体固相化磁性粒子を粒子希釈液（１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ｐＨ ７．９）で希釈した粒子液を加えて、３７℃で８分間反応させた。

測定のキャリブレータとして、ルミパルスプレスト（登録商標）Ｃ－ペプチドキャリブレータ（富士レビオ社製、濃度：０、０．０３、０．３、３、３０ｎｇ／ｍＬ）を使用した。このキャリブレータについても、上記と同様の方法でＣ－ペプチドを測定した。

酸処理希釈試料は１試料につき１０回測定（Ｎ＝１０）し、キャリブレータは１濃度につき２回測定（Ｎ＝２）した。

Ｎ＝１０で測定した酸処理希釈試料のうち、０ｎｇ／ｍＬの試料の平均値＋３ＳＤの値（検出限界（ＬＯＤ））を求めた。算出された検出限界（ＬＯＤ）は０．０００２ｎｇ／ｍＬ であった。さらに、アルカリ処理希釈試料の標準偏差を平均値で割った数の百分率（変動係数（ＣＶ））を求めた。各濃度のＣＶを求め、ＣＶが１０%以下となる最小の濃度（定量限界（ＬＯＱ））を求めた。算出された定量限界は、０．００１ｎｇ／ｍＬであった。これらの結果から、アルカリ性物質を含む前処理液で処理を行うことで、例えば試料中に含まれるＣ－ペプチドの濃度が０．０２ｎｇ／ｍＬ未満であっても精度良くＣ－ペプチドを測定又は定量可能であることが示された。さらに、試料中に含まれるＣ－ペプチドの濃度が０．００１ｎｇ／ｍＬ～０．０１５ｎｇ／ｍＬであっても精度良くＣ－ペプチドを測定又は定量可能であることが示された。

Claims (10)

1. 生体から分離された試料と、アルカリ性物質又は酸性化剤のいずれかを含む前処理液とを混和する前処理工程を含む、生体から分離された試料中のＣ－ペプチドの測定方法。
2. 前記試料中のＣ－ペプチドをイムノアッセイにより測定する、請求項１に記載の方法。
3. 前記前処理液がアルカリ性物質を含み、前処理工程が０．０１Ｎ以上１Ｎ以下のアルカリ濃度の条件下で行われる、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記前処理液が酸性化剤を含み、前処理工程が０．０１Ｎ以上１Ｎ以下の酸濃度の条件下で行われる、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記前処理液が界面活性剤を含む、請求項１または２に記載の方法。
6. 前記前処理液がアルカリ性物質と界面活性剤を含み、該界面活性剤が陰イオン性界面活性剤である、請求項５に記載の方法。
7. 前記陰イオン性界面活性剤がＳＤＳ又はＮＬＳである、請求項６に記載の方法。
8. 前記前処理液が酸性化剤と界面活性剤を含み、該界面活性剤が陽イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、または両イオン性界面活性剤である、請求項５に記載の方法。
9. 前記前処理液が尿素を含む、請求項８に記載の方法。
10. 酸性化剤又はアルカリ性物質のいずれかを含む前処理液を備える、Ｃ－ペプチド測定用試薬。