WO2018029858A1 - 血中循環癌細胞の検出方法及び血中循環癌細胞を検出するための前処理方法 - Google Patents

血中循環癌細胞の検出方法及び血中循環癌細胞を検出するための前処理方法 Download PDF

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WO2018029858A1
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surfactant
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勝也 遠藤
清太 中村
達也 松永
理美 八木
雅之 樋口
アンソニー エイチ ツァイ
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日立化成株式会社
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting circulating cancer cells in blood and a pretreatment method for detecting circulating cancer cells in blood.
  • CTC circulating tumor cells
  • the cells captured on the filter can be detected by fluorescently staining the cell nucleus and detecting this fluorescence.
  • the filter has a cell diameter similar to that of the CTC.
  • the leukocytes they have are also captured. Therefore, the captured cells are reacted with a fluorescently labeled antibody specific for each of leukocytes and CTCs, and the fluorescence emitted by each cell is detected to determine whether the captured cells are leukocytes or CTCs. Can be identified.
  • the captured leukocytes exhibit fluorescence indicating the cell nucleus and fluorescence indicating CTC (false positive), or in the captured cell, the cell nucleus is detected. In some cases, fluorescence showing fluorescence, fluorescence showing white blood cells, and fluorescence showing CTC were observed (triple positive).
  • the present invention is a method for detecting circulating cancer cells in a blood sample, comprising: (a) filtering the blood sample with a filter and capturing the cells on the filter; and (b) capturing the cells.
  • a primary antibody recognizing a white blood cell marker protein with the filter, and then contacting a secondary antibody that recognizes the primary antibody and labeled with a first fluorescent dye;
  • An antibody that recognizes a marker protein of (c1) animal serum, (c2) a surfactant, and (c3) epithelial cell and is labeled with a second fluorescent dye on the filter in which the cells are captured ,
  • (d) contacting the filter with the captured cells with a third fluorescent dye for staining the nucleic acid and (e) contacting the filter with the captured cells.
  • step (d) is performed at any stage between step (a) and step (e).
  • the step (b) in the above method is a step in which an antibody that recognizes a leukocyte marker protein and labeled with a first fluorescent dye is brought into contact with a filter in which cells are captured. Provide a way.
  • Step (c) and step (d) may be performed simultaneously, and (c1), (c2), (c3) and a third fluorescent dye for staining nucleic acid may be simultaneously contacted with the filter in which the cells are captured.
  • the surfactant may have a nonionic surfactant and may have poly (oxyethylene) octylphenyl ether.
  • the concentration of the surfactant may be 0.05% by mass to 0.2% by mass.
  • the animal from which the animal serum is derived, the primary antibody that recognizes the leukocyte marker protein or the animal from which the antibody is derived, and the animal from which the antibody that recognizes the marker protein of the epithelial cell is derived may be the same animal. May be a mouse.
  • the concentration of animal serum may be 2% to 10% by weight.
  • the leukocyte marker protein may be CD45.
  • the epithelial cell marker protein may be cytokeratin or a tumor marker.
  • the present invention is also a pretreatment method for detecting circulating cancer cells in the blood on the filter in which the cells have been captured, wherein animal serum and a surfactant are added to the filter in which the cells have been captured simultaneously or in any arbitrary manner.
  • a method comprising the steps of sequentially contacting is provided.
  • the filter in which the cells are captured is a primary antibody that recognizes the leukocyte marker protein, and a secondary antibody that recognizes the primary antibody, and is a first fluorescent dye. It may be treated with a labeled secondary antibody, or may be treated with an antibody that recognizes a leukocyte marker protein and is labeled with a first fluorescent dye.
  • antibodies that recognize animal serum, surfactants, epithelial cell marker proteins and labeled with a second fluorescent dye, and a third fluorescent dye that stains nucleic acid on a filter in which cells are captured May be contacted simultaneously.
  • the surfactant may have a nonionic surfactant and may have poly (oxyethylene) octylphenyl ether.
  • the concentration of the surfactant may be 0.05% by mass to 0.2% by mass.
  • the animal from which the animal serum is derived, the primary antibody that recognizes the leukocyte marker protein or the animal from which the antibody is derived, and the animal from which the antibody that recognizes the marker protein of the epithelial cell is derived may be the same animal. May be a mouse.
  • the concentration of animal serum may be 2% to 10% by weight.
  • the leukocyte marker protein may be CD45.
  • the epithelial cell marker protein may be cytokeratin or a tumor marker.
  • FIG. 2 is a sectional view taken along line II-II in FIG.
  • a method for detecting circulating cancer cells in a blood sample includes (a) a step of filtering the blood sample with a filter and capturing the cells on the filter; Contacting the captured antibody with a primary antibody that recognizes a marker protein of leukocytes, and then a secondary antibody that recognizes the primary antibody and labeled with a first fluorescent dye; and (C) A cell-captured filter is labeled with (c1) animal serum, (c2) a surfactant, and (c3) an epithelial cell marker protein and labeled with a second fluorescent dye Contacting the antibodies simultaneously or in any order; (d) contacting the filter with the captured cells with a third fluorescent dye that stains the nucleic acid; and (e) contacting the filter with the captured cells.
  • a blood sample is filtered through a filter, and cells in the blood sample are captured on the filter.
  • “cell” means a white blood cell or circulating cancer cell (CTC) in blood unless otherwise specified.
  • CTC is not contained in the blood of a healthy person, but CTC is contained in the blood of a subject to whom cancer has metastasized. Therefore, when the blood of a subject to whom cancer has metastasized is filtered through a filter, CTC is captured on the filter. Further, since the diameter of white blood cells is approximately the same as the diameter of CTC, white blood cells are captured together with CTC on the filter.
  • blood collected from a subject can be used as it is, or blood diluted with a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS) or other suitable medium can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the blood sample may be added with additives that are usually added to blood samples, such as anticoagulants and fixatives.
  • the filter is not particularly limited as long as it can selectively capture white blood cells and CTCs present in the blood sample, and a conventionally known filter can be used.
  • the filter may be, for example, a metal filter, and preferably has a through hole having a pore diameter of 5 ⁇ m to 15 ⁇ m, more preferably 6 ⁇ m to 12 ⁇ m, and even more preferably 7 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the hole diameter of the through hole is the maximum value of the diameter of a sphere that can pass through the through hole.
  • the filter in which the cells are captured may be washed (step (x)).
  • Step (x) is performed, for example, by bringing a cleaning solution containing a known buffer solution such as PBS into contact with the filter.
  • the washing solution may contain additives such as bovine serum albumin (BSA) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
  • BSA bovine serum albumin
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the step (x) is not limited to the step (a), and may be appropriately performed after each step.
  • contacting means passing the substance or a solution of the substance through the filter in which cells are trapped, or a filter in which cells are trapped.
  • the method is not limited to these methods.
  • step (b) the primary antibody that recognizes the leukocyte marker protein is brought into contact with the filter in which the cells have been captured, and then the secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with the first fluorescent dye. Secondary antibodies can be contacted. By this step, the leukocytes captured on the filter are fluorescently labeled. After the primary antibody is brought into contact with the filter in which the cells have been captured, the filter in which the cells have been captured may be washed with a washing solution (step (x)) before being brought into contact with the secondary antibody.
  • Fluorescent labeling of leukocytes captured on the filter can be performed in two steps as described above, but may be performed in one step. That is, in step (b), an antibody that recognizes leukocyte marker protein and labeled with a first fluorescent dye is brought into contact with the filter in which the cells are captured, thereby capturing the filter on the filter.
  • White blood cells may be fluorescently labeled in one step.
  • leukocyte marker protein examples include CD45 expressed in all hematopoietic stem cells.
  • a primary antibody that recognizes a leukocyte marker protein, a secondary antibody that is labeled with a first fluorescent dye, and an antibody that recognizes a leukocyte marker protein and is labeled with a first fluorescent dye in particular, It is not limited, A polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be sufficient.
  • the animal from which the antibody is derived is not particularly limited as long as the animal from which the primary antibody is derived is different from the animal from which the secondary antibody is derived.
  • the first fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye usually used for fluorescent labeling of antibodies.
  • the first fluorescent dye is a fluorescent dye different from the second and third fluorescent dyes. Each fluorescent dye is distinguishable because it has a different fluorescence wavelength.
  • Alexa Fluor registered trademark
  • the first fluorescent dye can be used as the first fluorescent dye.
  • the cells captured on the filter may be immobilized (step (y1)).
  • the cells can be fixed by bringing a known fixing agent such as formaldehyde into contact with the filter in which the cells are captured. By fixing the cells, cell spoilage or aggregation can be further reduced.
  • the cells captured on the filter may be further permeabilized (step (y2)).
  • the cells can be permeabilized by bringing a known permeabilizing agent into contact with the filter in which the cells are captured.
  • a known permeabilizing agent for example, poly (oxyethylene) octylphenyl ether can be used.
  • Steps (y1) and (y2) are preferably performed between step (b) and step (c).
  • step (c) the filter in which the cells are trapped is subjected to (c1) animal serum, (c2) a surfactant, and (c3) an antibody that recognizes a marker protein of epithelial cells, and a second fluorescence.
  • An antibody labeled with a dye can be contacted.
  • the animal serum (c1) is not particularly limited as long as it is a commonly used animal serum, but may be serum derived from the same animal as the animal from which the antibody recognizing the epithelial cell marker protein is derived. Serum derived from the same animal as the animal from which the antibody recognizing the marker protein is derived, and the animal from which the primary antibody or antibody recognizing the marker protein of leukocytes is derived. For example, when the primary antibody or antibody that recognizes the leukocyte marker protein and the antibody that recognizes the epithelial cell marker protein are mouse-derived antibodies, the animal serum is preferably mouse serum.
  • Animal serum (c1) may be diluted with a buffer solution such as PBS or other suitable medium.
  • concentration of animal serum (c1) is preferably 2% by mass to 10% by mass, more preferably 4% by mass to 6% by mass, and even more preferably 5% by mass.
  • concentration of animal serum is 2% by mass or more, false positives and triple positives are further reduced when used in combination with a surfactant described later.
  • concentration of animal serum is 10% by mass or less, when used in combination with a surfactant described later, contamination of the filter with animal serum is reduced.
  • the surfactant preferably has a nonionic surfactant.
  • Nonionic surfactants include, for example, poly (oxyethylene) octylphenyl ether, polyethylene glycol sorbitan monolaurate (polysorbate), and n-octyl ⁇ -D-glucopyranoside, and poly (oxyethylene) octylphenyl Ether is preferred.
  • Surfactant (c2) may be diluted with a buffer solution such as PBS or other suitable medium.
  • concentration of the surfactant is preferably 0.05% by mass to 0.2% by mass, more preferably 0.05% by mass to 0.1% by mass, and even more preferably 0.05% by mass.
  • concentration of the surfactant is 0.05% by mass or more, false positives and triple positives are further reduced when used in combination with animal serum.
  • concentration of the surfactant is 0.2% by mass or less, the physical form of the cell is well maintained.
  • Examples of the epithelial cell marker protein that recognizes the epithelial cell marker protein and is the antigen of the antibody (c3) labeled with the second fluorescent dye include cytokeratin and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM). , CD146, CD176, and tumor markers such as EGFR or HER2, and cytokeratin or tumor marker is preferred. Since CTC is derived from epithelial cells, it has a marker protein for these epithelial cells.
  • the second fluorescent dye is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye usually used for fluorescent labeling of antibodies.
  • fluorescein such as fluorescein isothiocyanate (FITC) can be used.
  • the antibody (c3) is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the animal from which the antibody (c3) is derived is not limited.
  • step (c) (c1), (c2), and (c3) can be brought into contact with the filter in which the cells are captured simultaneously or in any order, but the effects of the present invention are more prominent. From the viewpoint, it is preferable to contact (c1) and (c2) at the same time, and then contact (c3), more preferably (c1), (c2), and (c3). In the step (c), the washing step (x) may be appropriately performed.
  • a third fluorescent dye for staining the nucleic acid can be brought into contact with the filter in which the cells are captured.
  • the third fluorescent dye for staining nucleic acid is not particularly limited as long as it is a fluorescent dye capable of binding to nucleic acid, and a fluorescent dye usually used for fluorescent staining of nucleic acid can be used.
  • the third fluorescent dye include 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and 2 ′-(4-ethoxyphenyl) -5- (4-methyl-1-piperazinyl) -2,5. And '-bi-1H-benzimidazole trihydrochloride (Hoechst 33342).
  • step (d) can be performed after the step (c), it is not essential to perform the step (c), and at any stage between the steps (a) and (e). It can be carried out. It is preferable to perform the step (c) and the step (d) at the same time from the viewpoint of more prominently achieving the effects of the present invention. More specifically, it is preferable that (c1) and (c2) are simultaneously contacted with a filter in which cells are captured, and then (c3) and a third fluorescent dye for staining nucleic acid are simultaneously contacted, More preferably, c1), (c2), (c3), and a third fluorescent dye that stains nucleic acid are contacted simultaneously.
  • the animal serum (c1) and the surfactant (c2) are simultaneously brought into contact with the filter in which the cells are trapped, a mixture obtained by previously mixing the animal serum and the surfactant may be used.
  • the combination of the concentrations of animal serum and surfactant in the mixed solution is preferably 2% to 10% by weight of animal serum and 0.05% to 0.2% by weight of surfactant. More preferably, the serum is 4% to 6% by weight and the surfactant is 0.05% to 0.1% by weight, the animal serum is 5% by weight and the surfactant is 0.05% by weight. It is more preferably from 0.1 to 0.1% by weight, particularly preferably 5% by weight of animal serum and 0.05% by weight of surfactant.
  • false positives and triple positives are sufficiently reduced by bringing a combination of animal serum and a surfactant into contact with a filter in which cells are trapped, and a back-up caused by filter contamination. Ground staining is reduced and the physical morphology of the cells is maintained.
  • the filter in which the cells are captured is irradiated with the excitation light of the first, second and third fluorescent dyes, respectively, and the first emitted from each cell captured on the filter.
  • the fluorescence of the second and third fluorescent dyes is detected.
  • White blood cells are labeled with the first and third fluorescent dyes. Therefore, when detecting the fluorescence of the first, second and third fluorescent dyes, the fluorescence by the second fluorescent dye is not detected (negative), and the fluorescence by the first and third fluorescent dyes is detected. (Positive) cells are identified as white blood cells.
  • CTC is labeled with second and third fluorescent dyes. Therefore, a cell in which fluorescence from the first fluorescent dye is not detected (negative) and fluorescence from the second and third fluorescent dyes is detected (positive) is identified as CTC.
  • the first, second and third fluorescent dyes are detected (positive), that is, triple positive, it is not possible to identify whether the cell is a leukocyte or a CTC.
  • the cells are leukocytes, the fluorescence by the first fluorescent dye is not detected (negative), and the fluorescence by the second and third fluorescent dyes is detected (positive) is false positive. .
  • a filter a primary antibody recognizing a leukocyte marker protein, a secondary antibody labeled with a first fluorescent dye, and an antibody recognizing a leukocyte marker protein, the first antibody
  • the details of the reaction solution are as described in the above embodiment.
  • a CTC capturing cartridge (cartridge) 100 shown in FIGS. 1 and 2 has a housing having an inlet 130 to which an inflow pipe 125 into which liquid flows is connected and an outlet 140 to which an outflow pipe 135 from which liquid flows out is connected.
  • a body 120 and a filter 105 are provided.
  • the filter 105 is fixed by a casing 120 including an upper member 110 and a lower member 115.
  • the blood sample, the cleaning liquid, and other reaction liquids are introduced into the housing 120 through the inflow pipe 125, and are discharged to the outside through the filter 105 through the outflow pipe 135.
  • Such a liquid flow can be created, for example, by connecting a pump upstream of the inflow pipe 125 or downstream of the outflow pipe 135.
  • a cock may be provided upstream of the inflow pipe 125 and / or downstream of the outflow pipe 135 to control the flow of the liquid.
  • a blood sample is introduced into the cartridge 100 from the inflow tube 125, and the blood sample is filtered by the filter 105 (step (a)).
  • White blood cells and CTC in the blood sample cannot pass through the through hole 106 of the filter 105 and remain on the surface of the filter 105.
  • Other components in the blood sample pass through the through hole 106 and are discharged out of the cartridge 100.
  • the cleaning liquid may be passed through the filter 105 to clean the filter 105 (step (x)).
  • cleaning process (x) can be suitably performed after each following process.
  • a solution containing a primary antibody recognizing a leukocyte marker protein is introduced into the cartridge 100 and held in the cartridge 100 for a predetermined time, thereby causing the cells captured on the filter 105 to react with the primary antibody. be able to.
  • a solution containing the secondary antibody labeled with the first fluorescent dye is introduced into the cartridge 100 and held in the cartridge 100 for a predetermined time, thereby causing the primary antibody and the secondary antibody to react with each other. (Step (b)). After reacting the cells with the primary antibody and before reacting the primary antibody and the secondary antibody, the filter 105 may be washed by passing a washing solution through the filter 105 (step (x)).
  • the step (b) may be performed in two steps using the primary antibody that recognizes the leukocyte marker protein and the secondary antibody labeled with the first fluorescent dye, as described above.
  • An antibody that recognizes a protein and labeled with a first fluorescent dye may be used in one step.
  • a solution containing an antibody that recognizes a leukocyte marker protein and labeled with a first fluorescent dye is introduced into the cartridge 100, and the cartridge 100 is filled with a predetermined amount. By maintaining the time, the cells captured on the filter 105 are reacted with the antibody.
  • the cells captured on the filter 105 may be fixed by introducing a solution containing a fixing agent into the cartridge 100 and holding the solution in the cartridge 100 for a predetermined time (step (y1)).
  • a solution containing a permeabilizing agent may be introduced into the cartridge 100 and held in the cartridge 100 for a predetermined time, so that the cells captured on the filter 105 may be permeabilized (step (y2)).
  • a solution containing the animal serum (c1), a solution containing the surfactant (c2), and a solution containing the antibody (c3) labeled with the second fluorescent dye are introduced into the cartridge 100, and the cartridge By holding the sample in 100 for a predetermined time, the cells captured on the filter 105 can be reacted with (c1) to (c3) (step (c)).
  • Each solution may be independently introduced into the cartridge 100, or a mixed solution obtained by mixing each solution in any combination may be introduced into the cartridge 100 in any order.
  • a solution containing a third fluorescent dye for staining nucleic acid is introduced into the cartridge 100 and held in the cartridge 100 for a predetermined time, whereby the cells captured on the filter 105 and the nucleic acid are stained.
  • the fluorescent dye can be reacted (step (d)).
  • the step (d) can be performed after the step (c), it is not essential to perform the step (c), and at any stage between the steps (a) and (e). It can be carried out.
  • the solution containing the third fluorescent dye for staining nucleic acid may be mixed with each solution in step (c) in any combination and introduced into the cartridge 100 as a mixed solution.
  • the fluorescence emitted from each cell captured on the filter 105 is detected by irradiating the cartridge 100 with excitation light of each fluorescent dye using a fluorescence microscope (step (e)).
  • the fluorescence is detected by, for example, observing the cartridge 100 from the upper surface in the vertical direction of the cartridge 100 and processing the fluorescence observation image. Depending on the detected fluorescence combination, it is identified whether the cell is CTC or leukocyte.
  • a pretreatment method for detecting circulating cancer cells in a cell on which a cell has been trapped includes adding animal serum and a surfactant to the filter in which the cell is trapped simultaneously or arbitrarily. The process of making it contact in order of these.
  • the details of the filter, animal serum, surfactant, and other reaction solutions in the method according to this embodiment are as described in the embodiment of the method for detecting circulating cancer cells in the blood sample. is there.
  • the filter in which the cells are captured can be obtained, for example, by filtering a blood sample with a filter and capturing the cells on the filter.
  • the filter in which the cells have been captured is previously contacted with a primary antibody that recognizes the leukocyte marker protein, and then a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with the first fluorescent dye. It may be contacted, or may be an antibody that recognizes a leukocyte marker protein and that is contacted with an antibody labeled with a first fluorescent dye.
  • the filter in which the cells have been captured may be further contacted with a third fluorescent dye that stains nucleic acids.
  • the filter in which the cells have been captured can be pretreated by bringing animal serum and a surfactant into contact with the thus-obtained filter in which the cells have been captured.
  • the animal serum and the surfactant can be contacted simultaneously or in any order with the filter in which the cells are captured, but it is preferable to contact them simultaneously from the viewpoint of more prominently achieving the effects of the present invention.
  • the filter in which the cells are captured is subjected to the pretreatment of the method according to the present embodiment, and then circulating blood cancer cells are detected. Detection of circulating cancer cells in the blood can be performed, for example, as follows. First, an antibody that recognizes a marker protein of an epithelial cell and is labeled with a second fluorescent dye, and a third fluorescent dye that stains a nucleic acid simultaneously or in any order before the cells are captured. Contact the treated filter. However, if the filter in which the cells have been captured has been contacted with a third fluorescent dye that stains the nucleic acid in advance before the pretreatment, the third fluorescent dye that stains the nucleic acid again at this stage is filtered.
  • the excitation light of the first, second and third fluorescent dyes is respectively irradiated to detect the fluorescence of the first, second and third fluorescent dyes emitted from each cell captured on the filter. .
  • Cells that are negative for the first fluorescent dye and positive for the second and third fluorescent dyes are identified as circulating cancer cells in the blood.
  • the cells labeled with the second fluorescent dye that are brought into contact with the filter on which the cells are captured and the third fluorescent dye that stains the nucleic acid are preliminarily treated at the pretreatment stage. It can also be kept in contact with the captured filter. That is, in the pretreatment method according to the present embodiment, an antibody labeled with a second fluorescent dye, and a third fluorescent dye that stains a nucleic acid together with animal serum and a surfactant, and a filter in which cells are captured. Can be contacted simultaneously.
  • the pretreatment method according to the present embodiment can reduce triple positives and false positives in CTC detection.
  • Example 1 Using a CTC capture cartridge (cartridge) in which a thin-film metal filter (membrane area 6 mm ⁇ 6 mm, film thickness 18 ⁇ m) having many through-holes having a major axis of 100 ⁇ m and a minor axis of 8 ⁇ m is incorporated into the cartridge, As detected.
  • the CTC capture cartridge corresponds to the cartridge 100 described in the above embodiment.
  • the process from the process (a) to the process (c) was performed using the CTC capture device.
  • the CTC capture device includes a reservoir for introducing a blood sample and other reaction solutions.
  • the cartridge was filled with a PBS solution containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA (hereinafter referred to as “cleaning solution”). 7 mL of the cleaning solution was placed in the reservoir, and 3 mL of healthy human blood collected with a Streek Cell Free DNA Blood Collection Tube was added under the cleaning solution so that the blood and the cleaning solution were layered.
  • the CTC capturing device was activated, blood in the reservoir and washing solution were introduced into the cartridge at a flow rate of 200 ⁇ L / min, and leukocytes in the blood were captured on the filter. A washing solution was introduced into the cartridge to wash away blood components remaining on the filter.
  • 1.25 mL of anti-human CD45 mouse monoclonal antibody clone: 2D1 was introduced into the cartridge at a flow rate of 200 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes. 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged. 1.25 mL of Alexa Fluor (registered trademark) 594-labeled anti-mouse IgG goat polyclonal antibody was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes. 1.40 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged.
  • FITC-labeled anti-human cytokeratin mouse monoclonal antibody clone CK3 / 6H5 / AE1 / AE3 mixture, DAPI, 5% by mass mouse serum, 0.05% by mass Triton X-100, and a solution containing a washing solution (hereinafter, “ Also referred to as “solution C”.)
  • solution C a washing solution
  • 1.25 mL was introduced into the cartridge at 400 ⁇ L / min and allowed to react for 30 minutes at room temperature. 3.00 mL of the cleaning solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged. The cartridge was then removed from the CTC capture device.
  • the cartridge was set on a fluorescence microscope. Using fluorescent mirror units, fluorescent dyes on cells (FITC, Alexa Fluor 594, and DAPI) were each excited. The fluorescence emitted from each fluorescent dye was photographed, and the resulting images were synthesized. From the synthesized image, cells showing triple positive and cells showing false positive were extracted visually or using image analysis software, and the number of each cell was determined. The results are shown in Table 1. Here, the cells showing triple positive are FITC positive, Alexa Fluor594 positive and DAPI positive cells. Moreover, the cell which shows a false positive is a cell of FITC positive, Alexa Fluor594 negative, and DAPI positive.
  • the number of cells showing triple positive was expressed as a relative value when the number of cells showing triple positive in Comparative Example 1 was taken as 100.
  • the number of cells showing false positives was expressed as a relative value when the number of cells showing false positives in Comparative Example 1 was taken as 100. The results are shown in Table 1.
  • the filter staining was evaluated as follows. The fluorescence intensity was measured using spots on the upper right, lower right, upper left, lower left, and center of the filter without spots. The obtained fluorescence intensity was expressed as a relative value when the fluorescence intensity of background staining in Comparative Example 1 was defined as 100. The results are shown in Table 1.
  • the physical morphology of the cells was evaluated as follows. A plurality of cells trapped on the filter were randomly extracted and the morphology was visually observed. The results are shown in Table 1. In Table 1, A shows a case where no deformation was observed in the cells, and B shows a case where slight deformation of the cells was observed but there was no problem in observing the cells.
  • Example 1 The number of cells showing triple positive, the number of cells showing false positive, and the fluorescence intensity of background staining were determined in the same manner as in Example 1 except that the solution C not containing mouse serum and Triton X-100 was used. As required, the physical morphology of the cells was evaluated. The results are shown in Table 1.
  • Example 2 The cell permeation treatment was performed in the same manner as in Example 1. Thereafter, 1.25 mL of a solution containing 5% by mass mouse serum, 0.05% by mass Triton X-100, and a washing solution was introduced into the cartridge at 400 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes. 1.50 mL of the washing solution was introduced into the cartridge at a flow rate of 400 ⁇ L / min, and the reaction solution in the cartridge was discharged. 1.25 mL of PBS solution containing Anti-Cytokeratin-FITC and DAPI was introduced into the cartridge at 400 ⁇ L / min and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • Comparative Example 2 The relative value of the relative number of cells showing triple positive, the relative number of cells showing false positive, and the relative fluorescence intensity of background staining was the same as in Example 1 except that the solution C containing no mouse serum was used. The values were determined and the physical morphology of the cells was evaluated. The results are shown in Table 1.
  • Example 3 The relative value of the number of cells showing triple positive, the relative value of the number of cells showing false positive, and the fluorescence intensity of background staining were the same as in Example 1 except that the solution C not containing Triton X-100 was used. And the physical morphology of the cells was evaluated. The results are shown in Table 1.
  • Example 3 Comparative Examples 4 to 6
  • Example 3 and Comparative Examples 4 to 6 were performed in the same manner as Example 1 and Comparative Examples 1 to 3, respectively, except that blood collected from a healthy person different from Test Example 1 was used.
  • the results are shown in Table 2.
  • the relative value of the number of cells showing triple positive, the relative value of the number of cells showing false positive, and the relative value of the fluorescence intensity of background staining are the relative values when the corresponding value in Comparative Example 1 is 100. did.
  • Example 4 The experiment was performed in the same manner as in Example 3 except that the concentration of Triton X-100 in the solution C was 0.1% by mass. The results are shown in Table 2.

Abstract

本発明は、血中循環癌細胞を検出する方法であって、フィルター上に血液試料中の細胞を捕捉する工程と、細胞が捕捉されたフィルターに、第一の蛍光色素で標識された、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体を接触させる工程と、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清、界面活性剤、及び第二の蛍光色素で標識された、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体を接触させる工程と、細胞が捕捉されたフィルターに核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる蛍光を検出する工程と、を備える方法を提供する。

Description

血中循環癌細胞の検出方法及び血中循環癌細胞を検出するための前処理方法
　本発明は、血中循環癌細胞の検出方法及び血中循環癌細胞を検出するための前処理方法に関する。
　癌の転移の有無を予測する方法として、血管及びリンパ管を通じて体内を循環する血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ、以下、「ＣＴＣ」ともいう。）を検出する方法がある。ＣＴＣの検出は、まず、フィルター（例えば、特許文献１）を用いて、細胞のサイズ及び変形能の違いによりＣＴＣをフィルター上に捕捉し、次いで、捕捉されたＣＴＣを染色することによって行うことができる。
特開２０１３－４２６８９号公報
　フィルター上に捕捉された細胞の検出は、細胞の核を蛍光染色し、この蛍光を検出することによって行うことができるが、フィルター上には、ＣＴＣの他に、ＣＴＣと同程度の細胞直径を有する白血球も捕捉される。そこで、捕捉された細胞に対して、白血球とＣＴＣのそれぞれに特異的な蛍光標識抗体を反応させ、各細胞の発する蛍光を検出することで、捕捉された細胞が白血球又はＣＴＣのいずれであるかを同定することができる。しかしながら、従来のＣＴＣの検出方法では、捕捉された白血球において、細胞の核を示す蛍光とＣＴＣを示す蛍光とが観察される場合（偽陽性）、又は、捕捉された細胞において、細胞の核を示す蛍光と、白血球を示す蛍光と、ＣＴＣを示す蛍光とが観察される場合（トリプルポジティブ）があった。
　このような状況に鑑み、本発明者らは鋭意検討を行った結果、フィルター上に捕捉された細胞を、界面活性剤と動物血清とで処理することが、ＣＴＣの検出における偽陽性及びトリプルポジティブの低減に有効であることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法であって、（ａ）血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、（ｂ）細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）動物血清、（ｃ２）界面活性剤、及び（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、を同時に又は任意の順に接触させる工程と、（ｄ）細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、（ｅ）細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する工程と、を備え、工程（ｄ）が、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行われる方法を提供する。
　また、本発明は、上記方法における工程（ｂ）が、細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程である方法を提供する。
　工程（ｃ）及び工程（ｄ）を同時に行い、細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させてもよい。
　界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を有していてよく、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを有していてよい。界面活性剤の濃度は、０．０５質量％～０．２質量％であってよい。
　動物血清の由来となる動物、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物は同じ動物であってよく、由来動物はマウスであってよい。動物血清の濃度は２質量％～１０質量％であってよい。
　白血球のマーカータンパク質はＣＤ４５であってよい。また、上皮細胞のマーカータンパク質はサイトケラチン又は腫瘍マーカーであってよい。
　また、本発明は、細胞が捕捉されたフィルター上の血中循環癌細胞を検出するための前処理方法であって、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清及び界面活性剤を同時に又は任意の順に接触させる工程を含む方法を提供する。
　動物血清及び界面活性剤を接触させる工程の前に、細胞が捕捉されたフィルターは、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、及び一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体により処理されていてもよく、又は、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体により処理されていてもよい。
　また、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清、界面活性剤、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させてもよい。
　界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を有していてよく、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを有していてよい。界面活性剤の濃度は、０．０５質量％～０．２質量％であってよい。
　動物血清の由来となる動物、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物は同じ動物であってよく、由来動物はマウスであってよい。動物血清の濃度は２質量％～１０質量％であってよい。
　白血球のマーカータンパク質はＣＤ４５であってよい。また、上皮細胞のマーカータンパク質はサイトケラチン又は腫瘍マーカーであってよい。
　本発明によれば、ＣＴＣの検出における偽陽性及びトリプルポジティブを低減することができる。
細胞捕捉カートリッジの一実施形態を示す斜視図である。 図１におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。
　本発明の一実施形態に係る、血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法は、（ａ）血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、（ｂ）細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、（ｃ）細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）動物血清、（ｃ２）界面活性剤、及び（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、を同時に又は任意の順に接触させる工程と、（ｄ）細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、（ｅ）細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する工程と、を備える。以下、これらの工程について詳細に説明していく。
　はじめに、工程（ａ）において、血液試料がフィルターでろ過されて、血液試料中の細胞がフィルター上に捕捉される。本明細書において、「細胞」とは、特に明記しない限り、白血球又は血中循環癌細胞（ＣＴＣ）を意味する。健常者の血液にはＣＴＣが含まれないが、癌が転移した被験者の血液にはＣＴＣが含まれるため、癌が転移した被験者の血液をフィルターでろ過すると、ＣＴＣがフィルター上に捕捉される。また、白血球の直径はＣＴＣの直径と同程度であるため、フィルター上にはＣＴＣとともに白血球が捕捉される。
　血液試料としては、被験者から採取した血液をそのまま使用することもできるし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈された血液を使用することもできる。血液試料には、抗凝固剤及び固定剤等、通常血液試料に添加される添加剤が添加されていてもよい。
　フィルターは、血液試料中に存在する白血球及びＣＴＣを選択的に捕捉できるフィルターであれば特に限定されず、従来公知のフィルターを使用できる。フィルターは、例えば、金属製のフィルターであってよく、好ましくは５μｍ～１５μｍ、より好ましくは６μｍ～１２μｍ、さらに好ましくは７μｍ～１０μｍの孔径の貫通孔を有する。なお、貫通孔の孔径は、貫通孔を通過できる球の直径の最大値をいう。
　工程（ａ）の後、細胞が捕捉されたフィルターを洗浄してもよい（工程（ｘ））。工程（ｘ）は、例えば、ＰＢＳ等の既知の緩衝液を含む洗浄液を、フィルターに接触させることで行う。洗浄液には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の添加物が含まれていてよい。工程（ｘ）は、工程（ａ）の後に限らず、各工程の後に適宜行われてよい。
　なお、本明細書において、細胞が捕捉されたフィルターに物質を「接触させる」ことは、細胞が捕捉されたフィルターにその物質若しくはその物質の溶液を通液すること、又は細胞が捕捉されたフィルターをその物質若しくはその物質の溶液に浸すことにより行われてよいが、これらの方法に限定されない。
　次に、工程（ｂ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させることができる。この工程により、フィルター上に捕捉された白血球が蛍光標識される。細胞が捕捉されたフィルターに一次抗体を接触させた後、二次抗体を接触させる前に、細胞が捕捉されたフィルターを洗浄液で洗浄してもよい（工程（ｘ））。
　フィルター上に捕捉された白血球の蛍光標識は、上記のように二段階で行うことができるが、一段階で行ってもよい。すなわち、工程（ｂ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させることによって、フィルター上に捕捉された白血球を一段階で蛍光標識してもよい。
　白血球のマーカータンパク質としては、例えば、全造血幹細胞に発現するＣＤ４５が挙げられる。
　白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、第一の蛍光色素で標識されている二次抗体、及び白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。抗体が由来する動物は、一次抗体が由来する動物と二次抗体が由来する動物とが異なる動物である限り、特に限定されない。
　第一の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第一の蛍光色素は、第二及び第三の蛍光色素とは別の蛍光色素である。各蛍光色素は異なる蛍光波長を有するため、識別可能である。第一の蛍光色素としては、例えば、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）を使用できる。
　工程（ｂ）の後、フィルター上に捕捉された細胞を固定化してもよい（工程（ｙ１））。ホルムアルデヒド等の公知の固定剤を、細胞が捕捉されたフィルターに接触させることで、細胞を固定化できる。細胞を固定化することにより、細胞の腐敗又は凝集をより軽減することができる。
　また、工程（ｙ１）の後に、さらに、フィルター上に捕捉された細胞を透過処理してもよい（工程（ｙ２））。公知の透過処理剤を細胞が捕捉されたフィルターに接触させることで、細胞を透過処理することができる。透過処理剤としては、例えば、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを使用することができる。
　工程（ｙ１）及び（ｙ２）は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に行うことが好ましい。
　次に、工程（ｃ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）動物血清、（ｃ２）界面活性剤、及び（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体を接触させることができる。
　細胞が捕捉されたフィルターに動物血清（ｃ１）を接触させることは、ＣＴＣの検出における偽陽性及びトリプルポジティブを低減する方向に作用する。偽陽性及びトリプルポジティブが低減される機構は定かではないが、動物血清を細胞に接触させることで、抗体の非特異的結合を低減することができるためであると推測される。
　動物血清（ｃ１）は、一般に使用される動物血清であれば特に限定されないが、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物と同じ動物に由来する血清であってよく、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物、及び白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物と、同じ動物に由来する血清であってよい。例えば、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体がマウス由来の抗体である場合、動物血清はマウス血清であることが好ましい。
　動物血清（ｃ１）はＰＢＳ等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈されていてよい。動物血清（ｃ１）の濃度は、２質量％～１０質量％が好ましく、４質量％～６質量％がより好ましく、５質量％がさらに好ましい。動物血清の濃度が２質量％以上であると、後述する界面活性剤と併用した場合に、偽陽性及びトリプルポジティブがより一層低減される。動物血清の濃度が１０質量％以下であると、後述する界面活性剤と併用した場合に、動物血清によるフィルターの汚染が軽減される。
　細胞が捕捉されたフィルターに界面活性剤（ｃ２）を接触させることは、ＣＴＣの検出における偽陽性及びトリプルポジティブを低減する方向に作用する。偽陽性及びトリプルポジティブが低減される機構は定かではないが、界面活性剤を細胞に接触させることで、抗体の非特異的結合を低減することができるためであると推定される。
　また、動物血清（ｃ１）がフィルターに付着することでフィルターが汚染された場合であっても、界面活性剤（ｃ２）をフィルターに接触させることで、界面活性剤によりフィルターに付着した動物血清が除去される。
　界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を有することが好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート（ポリソルベート）、及びｎ－オクチルβ－Ｄ－グルコピラノシドが挙げられ、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルが好ましい。
　界面活性剤（ｃ２）はＰＢＳ等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈されていてよい。界面活性剤の濃度は、０．０５質量％～０．２質量％が好ましく、０．０５質量％～０．１質量％がより好ましく、０．０５質量％がさらに好ましい。界面活性剤の濃度が０．０５質量％以上であると、動物血清と併用した場合に、偽陽性及びトリプルポジティブがより一層低減される。界面活性剤の濃度が０．２質量％以下であると、細胞の物理的形態が良好に維持される。
　上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体（ｃ３）の抗原である上皮細胞のマーカータンパク質としては、例えば、サイトケラチン、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ１４６、ＣＤ１７６、及び、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２等の腫瘍マーカーが挙げられ、サイトケラチン又は腫瘍マーカーが好ましい。ＣＴＣは上皮細胞に由来するため、これら上皮細胞のマーカータンパク質を有する。
第二の蛍光色素は、抗体の蛍光標識に通常使用される蛍光色素であれば特に限定されない。第二の蛍光色素としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のフルオレセインを使用できる。
　抗体（ｃ３）は、特に限定されず、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってよい。抗体（ｃ３）の由来となる動物は限定されない。
　工程（ｃ）において、（ｃ１）、（ｃ２）、及び（ｃ３）は、同時に又は任意の順で、細胞が捕捉されたフィルターに接触させることができるが、本発明の効果をより顕著に奏する観点から、（ｃ１）及び（ｃ２）を同時に接触させて、次いで（ｃ３）を接触させることが好ましく、（ｃ１）、（ｃ２）、及び（ｃ３）を同時に接触させることがより好ましい。工程（ｃ）において、適宜、洗浄工程（ｘ）を行ってよい。
　次に、工程（ｄ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させることができる。
　核酸を染色する第三の蛍光色素は、核酸に結合することができる蛍光色素であれば特に限定されず、核酸を蛍光染色するのに通常用いられる蛍光色素を使用することができる。第三の蛍光色素としては、例えば、４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）及び２′－（４－エトキシフェニル）－５－（４－メチル－１－ピペラジニル）－２，５′－ビ－１Ｈ－ベンゾイミダゾール三塩酸塩（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）が挙げられる。
　工程（ｄ）は、工程（ｃ）の次に行うことができるが、工程（ｃ）の次に行うことは必須ではなく、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行うことができる。本発明の効果をより顕著に奏する観点から、工程（ｃ）及び工程（ｄ）は同時に行うことが好ましい。より具体的には、細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）及び（ｃ２）を同時に接触させて、次いで（ｃ３）及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させることが好ましく、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させることがより好ましい。
　細胞が捕捉されたフィルターに動物血清（ｃ１）及び界面活性剤（ｃ２）を同時に接触させる場合、動物血清及び界面活性剤をあらかじめ混合して混合液としたものを使用してもよい。混合液における、動物血清及び界面活性剤の濃度の組み合わせは、動物血清が２質量％～１０質量％であり界面活性剤が０．０５質量％～０．２質量％であることが好ましく、動物血清が４質量％～６質量％であり界面活性剤が０．０５質量％～０．１質量％であることがより好ましく、動物血清が５質量％であり界面活性剤が０．０５質量％～０．１質量％であることがさらに好ましく、動物血清が５質量％であり界面活性剤が０．０５質量％であることが特に好ましい。動物血清及び界面活性剤の濃度の組み合わせが上記範囲にあると、本発明の効果をより顕著に奏することができる。また、フィルターの汚染によるバックグラウンド染色を軽減することができるとともに、細胞の物理的形態を維持することができる。
　細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清（ｃ１）と界面活性剤（ｃ２）のうち動物血清のみを接触させる場合、偽陽性及びトリプルポジティブを十分に低減することができないか、又は、フィルター上に動物血清が付着してしまう（フィルターが汚染される）。フィルター上に動物血清が付着すると、付着した動物血清に、フィルター上に存在する第一の蛍光色素で標識されている二次抗体又は抗体が結合する（バックグラウンド染色）ことで、工程（ｅ）において、フィルターの広範囲にわたり第一の蛍光色素による蛍光が検出されてしまい、ＣＴＣの検出が困難となる。細胞に、動物血清（ｃ１）と界面活性剤（ｃ２）のうち界面活性剤のみを接触させる場合、偽陽性及びトリプルポジティブを十分に低減することができないか、又は、捕捉された細胞の物理的形態が破壊されてしまい、ＣＴＣの検出が困難となる。本実施形態に係る発明によれば、細胞が捕捉されたフィルターに動物血清と界面活性剤との組み合わせを接触させることにより、偽陽性及びトリルポジティブが十分に低減されるとともに、フィルターの汚染によるバックグラウンド染色が軽減され、また、細胞の物理的形態が維持される。
　最後に、工程（ｅ）において、細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光を検出する。
　白血球は、第一及び第三の蛍光色素で標識されている。したがって、第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光を検出する際に、第二の蛍光色素による蛍光が検出されず（陰性）、第一及び第三の蛍光色素による蛍光が検出される（陽性）細胞が、白血球として同定される。一方、ＣＴＣは、第二及び第三の蛍光色素で標識されている。したがって、第一の蛍光色素による蛍光が検出されず（陰性）、第二及び第三の蛍光色素による蛍光が検出される（陽性）細胞が、ＣＴＣとして同定される。ここで、第一、第二及び第三の蛍光色素が検出される（陽性）場合、すなわちトリプルポジティブである場合、その細胞が白血球又はＣＴＣのどちらであるかを同定することができない。また、細胞が白血球であるにも関わらず、第一の蛍光色素による蛍光が検出されず（陰性）、第二及び第三の蛍光色素による蛍光が検出される（陽性）場合が偽陽性である。
　次に、本発明の他の実施形態に係る、血液試料中のＣＴＣを検出する方法を、図１及び図２を参照しながら説明する。なお、本実施形態に係る方法における、フィルター、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、第一の蛍光色素で標識されている二次抗体、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体、（ｃ１）動物血清、（ｃ２）界面活性剤、（ｃ３）第二の蛍光色素で標識されている抗体、核酸を染色する第三の蛍光色素、及びその他の反応液についての詳細は、上記実施形態で述べたとおりである。
　図１及び図２に示すＣＴＣ捕捉カートリッジ（カートリッジ）１００は、液体が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、液体が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、フィルター１０５とを備える。フィルター１０５は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される筐体１２０により固定されている。血液試料、洗浄液及びその他の反応液は、流入管１２５を通って筐体１２０の内部に導入され、フィルター１０５を通って、流出管１３５から外部に排出される。このような液体の流れは、例えば、流入管１２５の上流又は流出管１３５の下流にポンプを接続することにより作り出すことができる。また、流入管１２５の上流及び／又は流出管１３５の下流にコックを設け、液体の流れを制御してもよい。
　はじめに、血液試料を流入管１２５からカートリッジ１００内に導入して、血液試料をフィルター１０５でろ過する（工程（ａ））。血液試料中の白血球及びＣＴＣはフィルター１０５の貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５表面に残留する。血液試料中のその他の成分は、貫通孔１０６を通過し、カートリッジ１００の外へと排出される。次いで、洗浄液をフィルター１０５に通液してフィルター１０５を洗浄してもよい（工程（ｘ））。なお、以下の各工程の後に、適宜、洗浄工程（ｘ）を行うことができる。
　次に、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞と一次抗体とを反応させることができる。次いで、第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、上記一次抗体と二次抗体とを反応させることができる（工程（ｂ））。細胞と一次抗体とを反応させた後、かつ、一次抗体と二次抗体とを反応させる前に、洗浄液をフィルター１０５に通液してフィルター１０５を洗浄してもよい（工程（ｘ））。
　工程（ｂ）は、上記のように、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体と第一の蛍光色素で標識されている二次抗体とを用いて二段階で行ってもよいが、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を用いて一段階で行ってもよい。工程（ｂ）を一段階で行う場合、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞と抗体とを反応させる。
　ここで、固定剤を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞を固定化してもよい（工程（ｙ１））。次いで、透過処理剤を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞を透過処理してもよい（工程（ｙ２））。
　次に、動物血清（ｃ１）を含む溶液、界面活性剤（ｃ２）を含む溶液、及び第二の蛍光色素で標識されている抗体（ｃ３）を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞と（ｃ１）～（ｃ３）とを反応させることができる（工程（ｃ））。なお、各溶液は、それぞれ独立にカートリッジ１００に導入してもよいし、各溶液を任意の組み合わせで混合した混合溶液を任意の順でカートリッジ１００に導入してもよい。
　次に、核酸を染色する第三の蛍光色素を含む溶液をカートリッジ１００内に導入して、カートリッジ１００内に所定時間保持することで、フィルター１０５上に捕捉された細胞と核酸を染色する第三の蛍光色素とを反応させることができる（工程（ｄ））。工程（ｄ）は、工程（ｃ）の次に行うことができるが、工程（ｃ）の次に行うことは必須ではなく、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行うことができる。なお、核酸を染色する第三の蛍光色素を含む溶液は、工程（ｃ）における各溶液と任意の組み合わせで混合して、混合溶液としてカートリッジ１００に導入してもよい。
　最後に、蛍光顕微鏡を使用して、カートリッジ１００にそれぞれの蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター１０５上に捕捉された各細胞から発せられる蛍光を検出する（工程（ｅ））。蛍光の検出は、例えば、カートリッジ１００の垂直方向上面からカートリッジ１００を観察し、蛍光観察像を処理することにより行う。検出された蛍光の組み合わせに応じて、細胞がＣＴＣ又は白血球のどちらであるかが同定される。
　本発明の一実施形態に係る、細胞が捕捉されたフィルター上の血中循環癌細胞を検出するための前処理方法は、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清及び界面活性剤を同時に又は任意の順に接触させる工程を含む。なお、本実施形態に係る方法における、フィルター、動物血清、界面活性剤、及びその他の反応液についての詳細は、血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法の実施形態で述べたとおりである。
　細胞が捕捉されたフィルターは、例えば、血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉することで得ることができる。細胞が捕捉されたフィルターは、あらかじめ、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで、一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させたものであってもよく、又は、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させたものであってもよい。細胞が捕捉されたフィルターは、さらに核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させたものであってもよい。
　このようにして得られた、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清及び界面活性剤を接触させることで、細胞が捕捉されたフィルターを前処理することができる。動物血清及び界面活性剤は、同時に又は任意の順で、細胞が捕捉されたフィルターに接触させることができるが、本願発明の効果をより顕著に奏する観点から、同時に接触させることが好ましい。
　細胞が捕捉されたフィルターには、本実施形態に係る方法の前処理が施された後、血中循環癌細胞の検出が行われる。血中循環癌細胞の検出は、例えば、次のように行うことができる。まず、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に又は任意の順で、細胞が捕捉された前処理後のフィルターに接触させる。ただし、細胞が捕捉されたフィルターが、前処理の前に、あらかじめ核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させたものである場合、この段階で再び核酸を染色する第三の蛍光色素をフィルターに接触させる必要はない。次いで、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する。第一の蛍光色素に陰性であり、第二及び第三の蛍光色素に陽性である細胞が血中循環癌細胞として同定される。
　ここで、前処理後に、細胞が捕捉されたフィルターに接触させる、第二の蛍光色素で標識されている抗体、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を、あらかじめ前処理の段階で、細胞が捕捉されたフィルターに接触させておくこともできる。すなわち、本実施形態に係る前処理方法において、動物血清及び界面活性剤とともに、第二の蛍光色素で標識されている抗体、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を、細胞が捕捉されたフィルターに同時に接触させることもできる。
　本実施形態に係る前処理方法によれば、ＣＴＣの検出において、トリプルポジティブ及び偽陽性を低減することができる。
＜試験例１＞
（実施例１）
　長径１００μｍ、短径８μｍの貫通孔を多数有する薄膜の金属フィルター（膜面積６ｍｍ×６ｍｍ、膜厚１８μｍ）をカートリッジに組み込んだＣＴＣ捕捉カートリッジ（カートリッジ）を用いて、血液試料中のＣＴＣを以下のように検出した。ＣＴＣ捕捉カートリッジは、上記実施形態で説明したカートリッジ１００に相当する。なお、工程（ａ）から工程（ｃ）までの工程は、ＣＴＣ捕捉装置を用いて行った。ＣＴＣ捕捉装置は、血液試料及びその他の反応液を導入するリザーバーを備える。
　まず、カートリッジを、０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ溶液（以下、「洗浄液」という。）で満たした。リザーバーに、洗浄液を７ｍＬ入れ、洗浄液の下に、Ｓｔｒｅｋ社のＣｅｌｌ　Ｆｒｅｅ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｔｕｂｅで採血した健常人の血液３ｍＬを、血液と洗浄液が層をなすように加えた。ＣＴＣ捕捉装置を作動させ、流速２００μＬ／分でリザーバー中の血液及び洗浄液をカートリッジに導入し、血液中の白血球をフィルター上に捕捉した。カートリッジに洗浄液を導入し、フィルターに残留した血液成分を洗い流した。
　１．２５ｍＬの抗ヒトＣＤ４５　マウスモノクロナール抗体　クローン：２Ｄ１を流速２００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。１．２５ｍＬのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４標識抗マウスＩｇＧヤギポリクロナール抗体を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　ホルムアルデヒドを０．５質量％～４質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させて、細胞を固定化した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．０５質量％～０．１質量％含有するＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて１０分反応させて、細胞を透過処理した。１．４０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。
　ＦＩＴＣ標識抗ヒトサイトケラチン　マウスモノクロナール抗体のクローン：ＣＫ３／６Ｈ５／ＡＥ１／ＡＥ３の混合物、ＤＡＰＩ、５質量％マウス血清、０．０５質量％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、及び洗浄液を含む溶液（以下、「溶液Ｃ」ともいう。）１．２５ｍＬを、４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。３．００ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。次いで、カートリッジをＣＴＣ捕捉装置から外した。
　カートリッジを蛍光顕微鏡に設置した。蛍光ミラーユニットを使用して、細胞上の蛍光色素（ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４、及びＤＡＰＩ）をそれぞれ励起させた。それぞれの蛍光色素から発せられた蛍光を撮影し、得られた画像を合成した。合成した画像から、トリプルポジティブを示す細胞及び偽陽性を示す細胞を、目視又は画像解析ソフトウェアを用いて抽出し、それぞれの細胞数を求めた。結果を表１に示す。ここで、トリプルポジティブを示す細胞とは、ＦＩＴＣ陽性、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４陽性かつＤＡＰＩ陽性の細胞のことである。また、偽陽性を示す細胞とは、ＦＩＴＣ陽性、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ５９４陰性かつＤＡＰＩ陽性の細胞のことである。
　トリプルポジティブを示す細胞の数を、比較例１におけるトリプルポジティブを示す細胞の数を１００とした場合の相対値として表した。同様に、偽陽性を示す細胞の数を、比較例１における偽陽性を示す細胞の数を１００とした場合の相対値として表した。結果を表１に示す。
　次のように、フィルターの染色（バックグラウンド染色）を評価した。フィルターの右上、右下、左上、左下、中央の細胞のない部分をスポットで蛍光強度を測定した。得られた蛍光強度を、比較例１におけるバックグラウンド染色の蛍光強度を１００とした場合の相対値として表した。結果を表１に示す。
　また、次のように、細胞の物理的形態を評価した。フィルター上に捕捉されている複数の細胞をランダムに抽出し形態を目視で観察した。結果を表１に示す。表１において、Ａは細胞に変形が見られない場合を、Ｂはわずかに細胞の変形が見られたが細胞の観察には問題がない程度の場合を、それぞれ示す。
（比較例１）
　マウス血清及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含まない溶液Ｃを使用した以外は、実施例１と同様にして、トリプルポジティブを示す細胞の数、偽陽性を示す細胞の数、及びバックグラウンド染色の蛍光強度を求めるとともに、細胞の物理的形態を評価した。結果を表１に示す。
（実施例２）
　細胞の透過処理までは実施例１と同様に行った。その後、５質量％マウス血清、０．０５質量％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、及び洗浄液を含む溶液１．２５ｍＬを、４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。１．５０ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－ＦＩＴＣ及びＤＡＰＩを含むＰＢＳ溶液１．２５ｍＬを、４００μＬ／分でカートリッジに導入し、室温にて３０分反応させた。３．００ｍＬの洗浄液を流速４００μＬ／分でカートリッジに導入し、カートリッジ内の上記反応液を排出した。次いで、カートリッジをＣＴＣ捕捉装置から外した。その後、実施例１と同様にして、トリプルポジティブを示す細胞数の相対値、偽陽性を示す細胞数の相対値、及びバックグラウンド染色の蛍光強度の相対値を求めるとともに、細胞の物理的形態を評価した。結果を表１に示す。
（比較例２）
　マウス血清を含まない溶液Ｃを使用した以外は、実施例１と同様にして、トリプルポジティブを示す細胞数の相対値、偽陽性を示す細胞数の相対値、及びバックグラウンド染色の蛍光強度の相対値を求めるとともに、細胞の物理的形態を評価した。結果を表１に示す。
（比較例３）
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含まない溶液Ｃを使用した以外は、実施例１と同様にして、トリプルポジティブを示す細胞数の相対値、偽陽性を示す細胞数の相対値、及びバックグラウンド染色の蛍光強度の相対値を求めるとともに、細胞の物理的形態を評価した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　細胞に、動物血清及び界面活性剤を反応させた場合（実施例１，２）、トリプルポジティブ及び偽陽性が比較例１と比べて低減された。また、バックグラウンド染色が軽減され、細胞の変形も見られなかった。一方、細胞に、動物血清又は界面活性剤の一方のみを反応させた場合（比較例２，３）、偽陽性が十分に低減されないか（比較例２）、バックグラウンド染色の染色強度が大きく上昇した（比較例３）。また、動物血清及び界面活性剤を、抗サイトケラチン抗体及び核酸染色剤と一緒に細胞に反応させた場合（実施例１）、動物血清及び界面活性剤を、抗サイトケラチン抗体及び核酸染色剤を反応させる前に、細胞に反応させた場合（実施例２）と比較して、トリプルポジティブ及び偽陽性がより低減された。
＜試験例２＞
（実施例３、比較例４～６）
　試験例１とは別の健常者から採取した血液を使用した以外は、実施例１及び比較例１～３と同様にして、それぞれ実施例３及び比較例４～６の実験を行った。結果を表２に示す。なお、トリプルポジティブを示す細胞数の相対値、偽陽性を示す細胞数の相対値、及びバックグラウンド染色の蛍光強度の相対値は、比較例１における対応する値を１００とした場合の相対値とした。
（実施例４）
　溶液ＣにおけるＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００の濃度を０．１質量％とした以外は、実施例３と同様にして実験を行った。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　細胞に、動物血清及び界面活性剤を反応させた場合（実施例３，４）、トリプルポジティブ及び偽陽性が比較例４と比べて低減された。また、バックグラウンド染色が軽減され、細胞の変形も見られなかったか（実施例３）、変形が見られても、細胞の観察に支障のない範囲のわずかな変形であった（実施例４）。一方、動物血清又は界面活性剤の一方のみを反応させた場合（比較例５，６）、トリプルポジティブが十分に低減されないか（比較例５）、バックグラウンド染色の染色強度が大きく上昇した（比較例６）。
　１００…ＣＴＣ捕捉カートリッジ、１０５…フィルター、１０６…貫通孔、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体、１２５…流入管、１３０…流入口、１３５…流出管、１４０…流出口。

Claims (23)

  1. 　血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法であって、
    （ａ）血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、
    （ｂ）細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体を接触させ、次いで一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体を接触させる工程と、
    （ｃ）細胞が捕捉されたフィルターに、
    　（ｃ１）動物血清、
    　（ｃ２）界面活性剤、及び
    　（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、
    を同時に又は任意の順に接触させる工程と、
    （ｄ）細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、
    （ｅ）細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する工程と、を備え、
    　工程（ｄ）が、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行われる、
    方法。
  2. 　血液試料中の血中循環癌細胞を検出する方法であって、
    （ａ）血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、
    （ｂ）細胞が捕捉されたフィルターに、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体を接触させる工程と、
    （ｃ）細胞が捕捉されたフィルターに、
    　（ｃ１）動物血清、
    　（ｃ２）界面活性剤、及び
    　（ｃ３）上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、
    を同時に又は任意の順に接触させる工程と、
    （ｄ）細胞が捕捉されたフィルターに、核酸を染色する第三の蛍光色素を接触させる工程と、
    （ｅ）細胞が捕捉されたフィルターに、第一、第二及び第三の蛍光色素の励起光をそれぞれ照射して、フィルター上に捕捉された各細胞から発せられる第一、第二及び第三の蛍光色素の蛍光をそれぞれ検出する工程と、を備え、
    　工程（ｄ）が、工程（ａ）と工程（ｅ）との間の任意の段階で行われる、
    方法。
  3. 　工程（ｃ）及び工程（ｄ）を同時に行い、細胞が捕捉されたフィルターに、（ｃ１）、（ｃ２）、（ｃ３）及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させる、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　界面活性剤が非イオン性界面活性剤を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　界面活性剤がポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　界面活性剤の濃度が０．０５質量％～０．２質量％である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　動物血清の由来となる動物、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物が同じ動物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　由来動物がマウスである、請求項７に記載の方法。
  9. 　動物血清の濃度が２質量％～１０質量％である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　白血球のマーカータンパク質がＣＤ４５である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　上皮細胞のマーカータンパク質がサイトケラチン又は腫瘍マーカーである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　細胞が捕捉されたフィルター上の血中循環癌細胞を検出するための前処理方法であって、細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清及び界面活性剤を同時に又は任意の順に接触させる工程を含む、
    方法。
  13. 　動物血清及び界面活性剤を接触させる工程の前に、細胞が捕捉されたフィルターが、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体、及び一次抗体を認識する二次抗体であって第一の蛍光色素で標識されている二次抗体により処理されている、請求項１２に記載の方法。
  14. 　動物血清及び界面活性剤を接触させる工程の前に、細胞が捕捉されたフィルターが、白血球のマーカータンパク質を認識する抗体であって第一の蛍光色素で標識されている抗体により処理されている、請求項１２に記載の方法。
  15. 　細胞が捕捉されたフィルターに、動物血清、界面活性剤、上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体であって第二の蛍光色素で標識されている抗体、及び核酸を染色する第三の蛍光色素を同時に接触させる、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 　界面活性剤が非イオン性界面活性剤を有する、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　界面活性剤がポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを有する、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　界面活性剤の濃度が０．０５質量％～０．２質量％である、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　動物血清の由来となる動物、白血球のマーカータンパク質を認識する一次抗体又は抗体の由来となる動物、及び上皮細胞のマーカータンパク質を認識する抗体の由来となる動物が同じ動物である、請求項１５に記載の方法。
  20. 　由来動物がマウスである、請求項１９に記載の方法。
  21. 　動物血清の濃度が２質量％～１０質量％である、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 　白血球のマーカータンパク質がＣＤ４５である、請求項１３又は１４に記載の方法。
  23. 　上皮細胞のマーカータンパク質がサイトケラチン又は腫瘍マーカーである、請求項１５に記載の方法。
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