WO2017174188A1 - Verfahren und vorrichtung zum extrakorporalen entfernen von pathogenen und/oder überzahlingen bestandteilen aus einer zellprobe eines patienten - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum extrakorporalen entfernen von pathogenen und/oder überzahlingen bestandteilen aus einer zellprobe eines patienten Download PDF

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Walter Schubert
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Definitions

  • the invention relates to a method and a device for extracorporeal removal of pathogenic and / or excess components from a cell sample of a human or animal patient.
  • the corporeal treatment of many diseases is often associated with severe side effects or even impossible so far.
  • devices are known which are located outside the body (extracorporeal) of the patient and with the aid of which cell samples of the patient can be treated and subsequently returned.
  • a gentler treatment of the disease in question is possible because, for example, the immune system of the patient is affected to a lesser extent by the treatment than would be possible by ancorporeal treatment.
  • the object of the present invention is to provide a method and a device for extracorporeal removal of pathogenic and / or excess components from a cell sample of a human or animal patient, which allow a more specific and flexible treatment of a variety of diseases.
  • the objects are achieved by a method with the features of claim 1 and by a device according to claim 16.
  • Advantageous embodiments with expedient developments of the invention are specified in the respective subclaims, wherein advantageous embodiments of the method are to be regarded as advantageous embodiments of the device and vice versa.
  • a first aspect of the invention relates to a method for the extracorporeal removal of pathogenic and / or supernumerary components from a cell sample of a human or animal patient suffering from a disease, in which at least the steps a) determining at least one protein cluster (CMP) suitable for characterizing the disease of the patient; b) providing the patient's cell sample; and c) extracorporeal removal of constituents having the at least one detected CMP from the cell sample.
  • CMP protein cluster
  • removal in the context of the present invention encompasses not only a partial or complete “removal” of the relevant components, but alternatively or additionally also a partial or complete inactivation or destruction of these components, whereby these at least no longer in their pathogenic form in the cell sample present or be depleted as much as possible.
  • a protein cluster is understood to mean a combinatorial molecular phenotype (CMP), the colocalized and / or anti-colonized CDs (clusters of differentiation, groups), proteins and / or molecules in a particular location Cell describes. Accordingly, groups of CMPs represent regions of colocalized and / or anti-colonized CDs, proteins, and / or other molecules in a cell or cell complex of the cell sample.
  • CMP combinatorial molecular phenotype
  • groups of CMPs represent regions of colocalized and / or anti-colonized CDs, proteins, and / or other molecules in a cell or cell complex of the cell sample.
  • a CMP in this context may be given in the form of a binary code, where it is possible to encode each digit of the binary number (ie, each "bit") to determine whether a predetermined CD / protein / molecule is within a given one Location and / or in a concentration exceeding a certain limit (eg L, 1 or True) occurs in the cell.
  • a certain limit eg L, 1 or True
  • a different coding z, B. ⁇ , 0 or False
  • CDs / proteins / molecules are only occasionally colocalized with one or more other CDs / proteins / molecules and sometimes are not colocalized.
  • CDs / proteins / molecules can be encoded with "wildcards" (eg W, * ).
  • the invention is based on the finding that certain CDs / proteins / molecules function as disease-specific and / or patient-specific as so-called lead proteins.
  • proteins are often coupled together as clusters or networks (corresponding to said CMP motifs), which is controlled by lead proteins: when the lead proteins are inhibited or removed, these clusters disintegrate, causing their loss biological function leads. Therefore, many diseases can be treated effectively and at least essentially without side effects by determining the CMP or group of CMPs that is characteristic of a particular disease, according to which the particular constituents of the cell sample carrying these pathological "markers" , be removed extracorporeally from the cell sample or inactivated.
  • the method according to the invention can in principle be carried out once or several times. For example, multiple cycles may be performed at certain consistent or varying intervals. The number and frequency of the procedures should be determined and controlled by a physician.
  • the cell sample can be optimally selected depending on the disease to be treated.
  • the at least one CMP being based on a database and / or by means of a multi-epitope ligand cartography (MELK) or ICM method (multi-epitope ligand cartography / imaging cycler microscopy) and / or is determined by means of a MELK robot system.
  • MELK multi-epitope ligand cartography
  • ICM multi-epitope ligand cartography / imaging cycler microscopy
  • the CMP (s) characteristic for the disease is / are determined with the aid of a multi-epitope ligand cartography (MELK) or I CM method (imaging cycler microscopy) and / or is determined by means of a MELK robot system or be.
  • MELK multi-epitope ligand cartography
  • I CM method imaging cycler microscopy
  • the extracorporeal removal of the components is monitored and / or controlled by means of a MELK or IC method and / or by means of a MELK robot system. In this way, the desired depletion of the disease-specific components of the cell sample can be controlled and optionally controlled or regulated.
  • a particularly specific and therefore effective removal of the pathogenic and / or supernumerary components from the cell sample is possible in a further embodiment of the invention if the disease is a tumor disease and / or an inflammatory disease.
  • diseases have a particularly high degree of cellular organization and can accordingly be specifically addressed in the context of the present invention.
  • More valuable advantages are achieved by carrying out the extracorporeal removal by means of an apheresis method and / or by means of an apheresis device.
  • pathogenic and / or supernumerary constituents which are found at least predominantly in the blood and / or blood plasma of the diseased patient, can thereby be removed from the blood and / or blood plasma particularly effectively and with little side effects.
  • an unselective apheresis and / or a selective apheresis and / or a whole blood aphrodisiac Rese and / or a photopheresis is performed and / or that the Apheresevor- device for performing at least one apheresis method from the group unselective apheresis, selective apheresis, whole blood apheresis and photopheresis is formed. This allows an optimal adaptation to the respective disease or to the characteristic of the disease components.
  • the patient's blood may first be separated by means of a centrifuge to enrich the pathogenic components for non-pathogenic components. It is also possible to completely run and / or substitute certain components.
  • the pathogenic constituents are subjected to a controlled irradiation with light of a certain wavelength (s) in order to achieve destruction or depletion.
  • the wavelength (s), irradiation time and irradiation time can be selected depending on the properties of the pathogenic components.
  • the optionally separated or fractionated cell sample can be exposed to controlled UV-A and / or UV-B irradiation.
  • the blood or blood plasma in which the pathogenic components have been depleted or completely removed may be returned to the patient.
  • the treated cell sample is thereby presented to the untreated immune system and in some cases may cause additional modulation of the immune system.
  • At least one streptamer and / or at least one antibody and / or at least one ligand in particular a variable single-chain fragment (scFv) and / or a multivalent antibody fragment (scFv multimer) .
  • scFv variable single-chain fragment
  • scFv multimer multivalent antibody fragment
  • a selection optimally adapted to the component to be removed can be carried out.
  • the at least one streptamer and / or the at least one antibody and / or the at least one ligand can in principle be added to the cell sample and / or used immobilized on a carrier material.
  • Antibody fragments offer the advantage of high binding affinity and specificity for a wide range of targets and haptens.
  • Single-chain fragments can also be cross-linked or expressed as diabodies (60 kDa), triabodies (90 kDa), tetrabodies (120 kDa), etc., whereby different linker lengths between V domains are possible.
  • a special Another advantage is that molecules of 80-120 kDa increase the penetration of cells and have faster clearance rates than corresponding igs (150 kDa).
  • the antibody and / or ligand is a diabody, triabody, tetrabody, pentabody, hexabody, heptabody or octabody.
  • the antibody and / or ligand mono-, bk tri- is formed quad, pent, hex, hept, oct, enn- or multi-specific.
  • This allows the cross-linking of two, three, four, five, six, seven or eight target structures or target proteins, whereby scFv multimers can be adapted particularly precisely and individually to the possibly patient-specific spatial arrangement of the target epitopes of specific combinatorial protein clusters (CMPs).
  • CMPs combinatorial protein clusters
  • the at least one streptamer and / or the at least one antibody and / or the at least one ligand specifically binds and / or inactivates a lead protein that is characteristic of the disease.
  • a particularly efficient and comprehensive removal of the pathogenic and / or excess components can be achieved and a correspondingly reliable treatment of the disease in question can be made possible.
  • the disease is amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and / or that the cell sample is a blood sample of the patient and / or that the at least one CMP one or more from the group CD16, CD8, NeuN , Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, immunoglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1, RAC1, BMX, GAK, JNK2, APKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 and STAP2 comprises and / or that the components by means of at least one antibody and / or ligand, which is at least one of the group CD16, CD8, NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138 , CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • the pathogenic components responsible for the ALS are aberrant T-lymphocytes which, in addition to the CD8 receptor, also express the CD16 receptor complex. Therefore, they are characterized by CMPs containing CD8 and / or CD16 as lead proteins.
  • the lead proteins can be colocalized or anti-colonized with the other indicated CDs and proteins.
  • the antibody and / or ligand used to remove the pathogenic constituents contains one, two, three, four, five or more of the group CD16, CD8, STTP1, NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1b , CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, immunoglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1, RAC1.
  • MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 and STAP2 binds.
  • the antibody and / or ligand mono-, bk tri-, quad, pent, hex, hept, oct, denominated or multi-specific.
  • These proteins in various combinations, form supra-individual and individual clusters in ALS-specific cells and can therefore be cross-linked extracorporeally and thus blocked, as a result of which the ALS-specific cells lose their functionality. This makes it possible to treat ALS with a particularly specific and thus low-side-effect or even side effect-free treatment. Further advantages arise when the antibody and / or ligand binds at least CD16, CD8 and STTP1.
  • STTP1 here denotes the possibly patient-specific signal protein (signal transduction p red in 1, eg kinase) which mediates the signal cascade extending from the cell surface to the nucleus and together with the module "CD16a and CD8" at the Surface of the cell where it is colocalized with CD16a and CD8 STTP1 can be prepared using the well-known MELK and / or ICM technique (Multi Epitope Ligand Cartography or Imaging Cycler Microscopy) for the respective patient It may further be provided that STTP1 is at least one protein from the group RAC, STAP2 and SMAD2 when the antibody and / or ligand is recombinant, human or de novo.
  • signal transduction p red in 1, eg kinase possibly patient-specific signal protein which mediates the signal cascade extending from the cell surface to the nucleus and together with the module "CD16a and CD8" at the Surface of the cell where it is colocalized with CD16a and CD8 STTP1 can be
  • ALS-specific protein clusters which, in addition to one or more cell surface proteins (eg CD8, CD16, CD45RA) are additionally directly associated with one or more signal chain molecules from the group RAC1, STAP2 and / or SMAD2, RAC1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) as a member of the RAG subfamily regulates a variety of cellular events including cell growth control, cytoskeletal reorganization, and activation of protein kinases.
  • STAP2 signal transducing adapter p red in 2
  • SMAD 2 mothers against decapentaplegic homolog 2 are also part of the signal transduction chain and regulate the signal transduction and transcription of central signaling pathways in ALS-specific cells.
  • the disease is prostate cancer and / or that the cell sample is prostate tissue and / or that the at least one CMP comprises one or more of the group CD26 and CD29 and / or that the components are at least one antibody and / or or ligands which bind at least one of the group CD26 and CD29 are removed extracorporeally.
  • the invention is based on the finding that prostate cancer is characterized by CMPs which contain CD26 and / or CD26 as lead proteins, which are optionally colocalized with other CDs or proteins or are antico-localized.
  • the at least one CMP also comprises CD44 and / or CD54 and / or CD138 and / or if the at least one CMP has at least one of CD3, CD4, CDS, CD10, CD13, CD19, CD20, CD38, CD49d, CD58 and CD80 are missing. This allows a particularly reliable identification and monitoring of the removal of the pathogenic components of the cell sample which are responsible for prostate cancer.
  • Prostate cancer is particularly present when the cell and / or when at least 70%, preferably at least 75% of the CMPs on the cell surface of at least one cell contain CD26 and / or CD29, and / or if at least 20%, preferably at least 35% of the CMPs on the cell surface of at least one cell comprise CD28 and / or CD29 and they lack at least CD3, CD4, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20, CD38, CD49d, CD58 and CD80.
  • the pathogenic constituents of the cell sample can be removed particularly reliably by extracorporeal removal using an antibody and / or ligand which binds at least one or more of CD26, CD29, CD44, CD54 and CD138.
  • the disease is a cutaneous lymphoma, in particular mycosis fungoides, and / or that the cell sample is a skin sample and / or that the at least one CMP is one or more of the group HLA-DQ, CD2, CD3, CD4, CD7 , CDS, CD10, CD13, CD18, CD18, CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD71, CD80 and HLA-DR and / or that the constituents are at least one antibody and / or ligand comprising at least one of the group HLA-DQ, CD2, CD3, CD4, CD7, CDS, CD10, CD13, CD18, CD18, CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD71, CD80 and HLA-DR binds to be removed extracorporeally.
  • the at least one CMP is one or
  • a second aspect of the invention relates to a device which is designed to carry out a method according to the first aspect of the invention.
  • the term "trained to be” means an apparatus which not only has a fundamental suitability for carrying out such a method, but is actually set up and equipped to carry out such a method.
  • the device being designed to carry out at least one apheresis method from the group of unselective apheresis, selective Aphere se, full blood apheresis and photopheresis.
  • the plasma is separated from the blood by means of the device and completely substituted.
  • human blood products are used as replacement fluids.
  • plasma perfusion the cells carrying the protein cluster (CMP), which is characteristic of the disease of the patient, are separated from the plasma by filtration or adsorption by means of the device. The purified plasma can then be returned to the patient.
  • CMP protein cluster
  • the cells which carry the protein cluster (CMP), which is characteristic of the disease of the patient, for example, are filtered affinity chromatography directly from the blood by means of the device.
  • CMP protein cluster
  • the cell sample or the blood of the patient can first be separated by means of a centrifuge of the device, leukocyte-enriched blood plasma can be collected by means of the device and exposed to the device in an extracorporeal cycle of controlled UV irradiation by means of a UV irradiation device ,
  • the wavelength of the UV irradiation is typically between 340 and 380 nanometers, for example 365 nanometers (UV-A).
  • the average UV exposure of the leukocytes can typically be between 0.1 and 5 J / cm 2 , for example 1.5 J / cm 2 .
  • the total duration of the treatment is between 2 and 5 hours, depending on the volume of the cell or blood sample.
  • the sample can be used in extracorporeal photopheresis by means of the device a photoactivatable pharmaceutical, for example methoxsalen, may be added.
  • a photoactivatable pharmaceutical for example methoxsalen
  • the advantage is that the immune system of the patient is not or only to a limited extent mitigated, so that in addition to the direct cytostatic and cytotoxic effects on the irradiated cell or blood sample, an immune modulation of the non-irradiated immune system can be effected.
  • the treatment frequency can be 4 to 20 cycles in 2-20 day intervals. The intervals between individual treatments may increase over time. Treatment success can be achieved by determining the decrease in the concentration of cells that make up the protein cluster
  • CMP CMP
  • ALS topical treatment
  • ALS can at least stop in early stages, with up to about 26 treatments per year, which can be realized for a fraction of the previous annual costs, the emergence of progressive severe disability and the associated burden can be prevented which, in addition to the unquantifiable gain in lifetime and quality of life for the patient, also leads to significant savings in healthcare.
  • a third aspect of the invention relates to a streptamer and / or an antibody and / or a ligand for use in a method according to the first aspect of the invention.
  • Embodiments of the first aspect of the invention are to be regarded as advantageous embodiments of the third aspect of the invention and vice versa.
  • the streptamer, the antibody and / or the ligand may be coupled in a further embodiment with an adsorber and / or a chromophore. As a result, they are particularly suitable for use in the context of a photopheresis with tuned to the absorber or the chromophore wavelengths.
  • the streptamer, the antibody and / or the ligand can be coupled with a marker, in particular a magnetic marker (magnetic cell separation).
  • the streptamer, the antibody and / or the ligand can be coupled to a fluorescent dye, a quantum dot, a radioactive marker, a spin label and / or a tag for a further antibody / ligand and / or an enzyme ,
  • Figures 2a to 2f show the step process of these abnormal cells leading to the ALS specific disease
  • Fig. 3 is a schematic representation of the topological hierarchy of
  • Fig. 4 is a Toponom badge, the location of the 30 most of more than
  • Figure 5 is a representation of the selective expression of the prostate cancer-specific CMP in subcellular sites of neoplastic
  • Fig. 6 is an illustration of the cyclic localization of 25 biomolecules and the subsequent determination of the CMPs using the MELK / ICM method;
  • Fig. 8 is a schematic representation of the pathomechanism of
  • Fig. 9 is a schematic representation of a therapy of ALS. Mechanisms of ALS in the toponom
  • ALS Toponome Analyzes of cell surfaces of immune cells in the blood have shown that ALS has a specific abnormal topon. Essential feature is the existence of aberrant T-lymphocytes, in addition to also express the CD16 receptor complex to the CD8 receptor. Exactly the same cell forms are found in the morphologically well-preserved ALS postmortem tissue within postcapillary venules of the spinal pyramidal tract ( Figure 1 a, b; Box).
  • CD8 / CD16 complexes are required by "forward transport" for transient migration of these cells through the endothelial cell layer via vesicle budding in the cell surface to promote transmigration as part of an abnormal "homing code” CD16 is also referred to as Fe region reeeptor III-A or Fcylll After transmigration, this complex is degraded because CD8 positive T cells in the parenchyma of the pyramidal tract do not have the CD16 complex 15.
  • CD16 is necessary to control the abnormal homing aberrant CD8 cells into the pyramidal tract, and when this homing process is complete, the cells degrade (lose) the CD16 complex, then migrate as CD8 + CD16 cells between the cells myelinated neurons penetrate the myelin sheaths and axotomize neurons, a process that is apparently primarily autonomous, as the cells are never observed in the context of ZeFdebris, which is a sign of primary neuronal degradation. The cells therefore play a primary pathogenetic role. This interpretation is supported by the fact that downregulation of CD16 leads to a halt of disease progression: when CD16 is no longer available as in Fig. 1 f, the endothelial homing process can no longer be performed.
  • Part of the (sporadic) ALS can therefore be described as a disease of the immune cell toponoma, which generates the ALS-specific pyramidal tract lesions (axotomy) by means of a highly selective "homing code.”
  • Many genetic findings and protein aggregations that have been described in ALS are also have been described in experimental axotomy, so that the immunocelltoponomically-mediated axotomy explains these findings.
  • the invasive cells according to FIG. 1c further coexpress the following molecules:
  • NeuN (Fox-3, Rbfox3, or Hexaribonucleotide Binding Protein-3) is a neuronal, nuclear antigen that is normally used as a biomarker for neurons.
  • Nuclear coexpression of NeuN and CD49d, as well as cytoplasmic expression of immunoglobulin G (IgG) along with the CD16 bearing vesicles of Figure 1df) and cell surface expression of CD8 and CD3 indicate that this cell has abnormal differentiation status: a cell with Merkma - a T cell (CD3, CD8), a neuronal cell (NeuN in the nucleus), a monocyte (CD16) and a B lymphocyte (IgG).
  • IgG immunoglobulin G
  • Proteins partially colocalized with specific CD8 and / or CD16 in ALS-indicative cells, in some cases with specific individuality or frequency, are given in Table 1. All of these proteins thus represent therapeutic target structures (targets) individually or in combination with CD8 and / or CD16, since switching off these proteins leads to a collapse of the intracellular information flow and thus to a loss of function of the aberrant cells.
  • the invasive cell described above can be detected as an ALS-specific cell with the abovementioned features in the blood or in tissue samples by means of spatial tomography analysis. Since their invasion behavior into the pyramidal tract is known as set forth above, and since it is further known that the cell transforms to a NeuN positive T cell by phenotype switching (CD16-), axotomizing the neurons leaves the detection of cells of the CD16 / CD8 phenotype from Fig. 1 c close to the process of axotomy. It follows that cell invasion of the cell of Figure 1c must be therapeutically prevented by molecular blocking or lysis to prevent axotomy and stop the progression of ALS.
  • the described two-step process is a violation of basic rules of cooperation of cells of different cotyledons: In intact systems, cells from different cotyledons follow the rule of non-injury of the mutual cell surfaces. In the case of ALS, the transformed T-cell-like cells (cotyledon mesenchyme) injure the surfaces of neurons (cotylus ectoderm), resulting in a physical transcellular crosslinking of the two cotyledonous functions with the consequence of the disruption of the nerve tracts to the voluntary musculature.
  • NeuN in the cell nucleus of the acting cells (immune tents in the circulation and after invasion into the nervous system of the pyramidal tract) means that these cells follow a program of aberrant neuronal stem cells, since NeuN is only expressed in neurons under physiological conditions.
  • NeuN can be used as a marker for the presence of ALS-causing cells, that is for the diagnosis of ALS.
  • the blood of the patient can be subjected to a therapeutic apheresis in which the pathogenic cells are removed from the blood with the aid of preferably immobilized antibodies and / or ligands which bind CD16.
  • immobilized antibodies and / or ligands which bind CDS and / or RAC1 and / or STAP2 and / or SMAD2.
  • a plurality of different antibodies and / or ligands which are arranged together and / or viewed in the flow direction of the blood, one after the other, resulting in a multistage depletion of the pathogenic constituents of the blood.
  • ALS cells means of cells carrying the ALS-specific CMP in the blood of patients suffering from ALS was achieved as follows:
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • TIS Toponome Imaging System
  • ALS cells ie cells with ALS-typical CMPs were detected
  • Photopheresis makes it possible to carry out a targeted depletion procedure, so that the number and concentration of "ALS cells" in the blood of the patients considerably, that is to below the detection limit can be reduced. It has been found that the patients felt subjectively better when in a photopheresis cycle more than 1 liter of blood volume, i.e. at least 2 and preferably up to 5 liters of blood volume, was passed through the device for treatment.
  • the cell count of the "ALS cells” in the blood correlates very well with the course of the disease, for example, in one patient with approximately 50 million “ALS cells”. per liter of blood less than half as fast as in a patient with about 140 million “ALS cells” per liter of But this as well as the above-discussed finding that exactly these "ALS cells” immigrate after conversion of the cell surface in the pyramidal tract (pathological homing) where they axotomize the axons in the pyramidal tract are further proof that it is the "ALS cells" detected in the blood are the crucial pathogenetically relevant cells and thus a central target of the ALS treatment.
  • ALS cells can recur in breaks between photopheresis cycles in the blood, and the recurrent "ALS cells” can be fully depleted again by photopheresis. According to previous knowledge, this procedure can be repeated as often as required, so that at least a progression of ALS disease can be stopped or significantly slowed down.
  • the pathogenic ALS-specific combinatorial CMP motifs of the "ALS cells” decreased at least by a factor of 100 after their return in the blood.
  • Further possibilities for extracorporeal removal of the pathogenic cells by means of apheresis methods include: Use of molecules (antibodies / ligands) that bind and / or block / inhibit IgG (1/3) or block / inhibit the physiological mechanism of IgG-mediated activation of CD16.
  • An example of this is antibodies to IgG and (optionally recombinant) streptococcal protein G; Blocking (eg by crosslinking / cross-linking) of the ALS-specific cluster CD16a + CD8 + STTP1, for example by means of at least one bi-, trioder multispecific antibody (recombinant, human, de novo, etc.), which is preferably immobilized on a Matrix bound exists.
  • STTP1 denotes the optionally patient-specific signal protein (signal transduction protein 1, z, B. kinase), which mediates the signal cascade emanating from the nucleus and coupled together with the module "CD 16a and CD8" on the surface of the cell or with CD 16a and CD8 and colocalized STTP1 can be individually determined or controlled with the help of the known MELK and / or ICM technique (multi-epitope ligand cartography or imaging cycler microscopy) for the respective patient.
  • signal transduction protein 1, z, B. kinase signal transduction protein 1, z, B. kinase
  • STTP1 may be, for example, one or more proteins from the group RAC1, STAP2 and / or SMAD2 and / or another protein from the signal transduction chain of ALS cells
  • a corresponding antibody for example a trispecific anti-CD16a-CD8-STTP1 antibody
  • Adam17 metalopeptidase domain 17
  • TACE tumor necrosis factor-a-converting enzyme
  • Adam 17 is a 70 kDa enzyme belonging to the ADAM protein family of disintegrins and metalloproteases.
  • Adam17 or the respective CD16-Shedding-capable molecule may optionally be coupled to a mono-, bi-, tri- or multispecific antibody (see point 2) to advantageously increase its specificity; 4.
  • Use of at least one mono-, bi-, tri- or multi-specific anti-CD16 antibody (recombinant, human, de novo, etc.), which is preferably immobilized on a matrix material;
  • the pathogenic cells are not or not completely removed from the blood sample, but are inactivated extracorporeal so that they lose their biological functionality.
  • the abovementioned compounds (medicaments) can in principle be used individually or in any combination as part of an apheresis process.
  • the effectiveness and extent of the removal should be checked through regular monitoring and adjusted if necessary.
  • the control can be carried out, for example, by means of the diagnostic method described above. Upon successful removal, significantly fewer or, preferably, no abnormal ALS-specific cells (see above) can usually be detected in the cell or blood sample of the subject patient.
  • ALS-specific supraindividual and / or individual thenutic options results in numerous ALS-specific supraindividual and / or individual thenutic options.
  • Superindividual therapy may be directed to the ALS-specific surface proteins (CDS) or surface protein clusters, which are cross-linked, inhibited or bound to a matrix.
  • CDS ALS-specific surface proteins
  • central signaling chain molecules of ALS cells may be cross-linked, inhibited, or otherwise blocked.
  • the cell surface CD8 / CD16A CD45RA may optionally be extracorporeally blocked together with the signal-chain molecule RAC1, since these are exclusively associated directly in ALS cells.
  • Such a therapy can be carried out, for example, with the aid of bi-, tri- and / or tetraspecific antibodies or by means of corresponding variable single-chain fragments (scFv) or multivalent antibody fragments (scFv multimers), ie by so-called diabodies, triabodies or tetrabodies.
  • scFv variable single-chain fragments
  • scFv multimers multivalent antibody fragments
  • Individual targets that may be therapeutically addressed as an alternative or in addition to the ALS-specific cluster described above include individual clusters of CD16 / CD8 with the molecules STAP2 and / or SMAD2, and optionally combinations of the molecules designated in Table 1 together with the CD8 / CD16 clusters or as isolated clusters without CD8 / CD16. These clusters can also be switched off with the help of optionally multispecific antibodies and / or antibody fragments.
  • Fig. 3 shows a schematic representation of the topological hierarchy of proteins within a toponome.
  • the proteins are symbolized by the symbols star, square, triangle and pentagon. It can be seen that the star-symbolized protein occurs in all three CMPs 1 -3, so that this protein is a lead protein (L, 1, True). In contrast, the protein denoted square does not occur in any of the CMPs 1-3, so that this protein is an anti-colocalized protein (A-absent, 0, False).
  • the other proteins (triangle, pentagon) are variably associated with the lead protein and thus represent so-called wildcard proteins (W, * ).
  • Figure 4 shows a topographic map showing the location of the 30 most common of more than 2,000 different CMPs in prostate cancer. The location of these CMPs in the tissue is shown as an overlay with a CD138 fluorescence signal. Figure 4 illustrates the position of these CMPs by their different colors (or gray levels, respectively) aligned with the CD138 fluorescence signal.
  • CD26 and CD29 could be identified as lead proteins on the cell surfaces of prostate tissue cells of a patient affected by prostate cancer.
  • Figure 5 shows a representation of the selective expression of the prostate cancer-specific CMP in subcellular sites of neoplastic prostate acini.
  • Figure 5 illustrates the selective expression of CMP1 in subcellular sites of neoplastic prostate acini.
  • CMP1 is the most abundant CMP within the CMP motif of Table 2.
  • Figure 5a shows an overview in which arrow 1 and arrow 2 indicate apical sites of secretory cells, while arrow 3 indicates projections at the basolateral site of an acinus.
  • Fig. 5bc show details indicated by arrows.
  • "BE” means basal epithelial cell layer, (bars: 5 ai 100 ⁇ , 5 bd: 10 ⁇ )
  • prostate cancer analogous to ALS can be treated by extracorporeal removal of components and cells which have CMPs comprising at least CD26 and / or CD29 as disease-specific lead proteins.
  • CMPs comprising at least CD26 and / or CD29 as disease-specific lead proteins.
  • an apheresis or photopheresis method can be used in which the CD28 / CD29 expressing cells are separated and / or inactivated or destroyed in the manner described above.
  • FIG. 6 shows an illustration of the cyclic localization of 25 biomolecules and the subsequent determination of the CMPs by means of the ELK / ICM method
  • Fig. 8a shows an optical plane of 20 gemisamapped planes in the z-direction and serves to illustrate the fluorescence signals of the in Fig. 7 indicated biomolecules.
  • FIG. 6b illustrates the binarization of the primary signals of FIG. 6a shown in parallel.
  • Figure 6c shows 2D maps of the resulting combinatorial molecular phenotypes (CMPs) calculated for all data points from the binary data set ( Figure 6b).
  • Fig. 6d shows two exemplary CMPs from the data points (Fig. 6b).
  • FIG. 7 shows topographical images of the tissue organization of a cutaneous lymphoma (bars: in a-d, j: 10 ⁇ , in f, g, k: 1 ⁇ ).
  • Fig. 7a shows a 3D co-mapping of 3213 CMPs (from 7161 CMPs) within a range of cryosection of a tissue sample of a patient affected by a cutaneous lipomhoma (mycosis fungoides) according to Fig. 7b (boxed area). Different CMPs are coded with different colors.
  • Figure 7b shows a phase contrast image of the cryogenic skin section in which nuclei for histones are stained blue while the basal diamina for CD49f is stained white.
  • Figure 7c shows an enlargement of the boxed area ( Figure 7b) and is aligned identically to Figure 7d, showing the lead proteins of the CMPs of Figure 7a.
  • Figure 7b shows a 3D co-mapping of 32
  • a cytokeratin-containing cell projection extends away from the keratinocyte (e, arrow) and projects through the CD8 + / CD3 + T cell surface (compare h, which shows CK in green, compare g, which shows the same without CK).
  • Figure 7k shows a transverse virtual anatomical section through the CD8 + / CD3 + T cell (cell 2 in j). The projection of the keratinocyte penetrates into the T cell (arrow).
  • Figure 7i shows a list of the co-cartier molecules.
  • Fig. 71 specifies the CMP motif characteristic of cutaneous lymphoma:
  • CD2 CD2, CD10, CD18, CD54, CD57, CD58, CD62L, CD80
  • cutaneous lymphoma may be treated analogously to ALS by extracorporeal removal of components and cells having CMPs comprising at least HLA-DQ as a disease-specific lead protein.
  • CMPs comprising at least HLA-DQ as a disease-specific lead protein.
  • an apheresis or photopheresis method can be used in which the HLA-DQ expressing cells are separated and / or inactivated or destroyed in the manner described above.
  • the method may therefore, in principle, comprise a combination of toponomous technology with methods of isolating cells from body fluids and / or tissues.
  • toponomous technology By using toponom technology, cells can pass through
  • a particular aspect is the isolation of disease-specific cells from the blood circulation, which migrate as autoimmune cells or aberrant cells of the immune system in organs where they targeted tissue structures to destroy. In the latter case z.
  • Another advantage is the use of such cells for the development of drugs for the selective blocking / elimination of such cells or, in the case of stem cells, for reinfusion into the organism (e.g., therapeutic organ regeneration or tumor therapy), or for use with the development of diagnostics, or for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) or other diseases, by removing pathogenic cells from the blood-clotting, to prevent their biological mechanism, in the case of ALS invasion into the motor neuron system and its neurotoxic damage mechanisms.
  • drugs for the selective blocking / elimination of such cells or, in the case of stem cells, for reinfusion into the organism (e.g., therapeutic organ regeneration or tumor therapy), or for use with the development of diagnostics, or for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) or other diseases, by removing pathogenic cells from the blood-clotting, to prevent their biological mechanism, in the case of ALS invasion into the motor neuron system and its neurotoxic damage mechanisms.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Fig. 8 shows a schematic representation of the pathomechanism of ALS.
  • a normal or healthy T cell 10 first matures in an extrathymic environment 12 (skin) and is delivered to the bloodstream 14. Due to the lack of Hönning codes, the normal T cell 10 can (and should not) invade the pyramidal system 16, which is responsible for fine motor skills and voluntary motor function in mammals.
  • ALS cells represent 18 aberrant T cells with a defective homing code that can be characterized by the CMPs described above Accordingly, blood circulating ALS cells 18 can enter the pyramidal system 16 from the blood They axoto- mize neurons, which leads to a degeneration of the motor nervous system and thus to the ALS-typical clinical picture with progressive paralysis of the patient.
  • the aim of an ALS treatment must therefore be the formation of ALS cells 18 and / or the invasion of ALS cells
  • ALS cells 18 can be deactivated by blocking the lead proteins and / or by inducing apoptosis (deactivated ALS cells 18 '), thereby losing their biological functionality and not can migrate longer in the pyramidal system 16.
  • FIG. 9 shows a schematic representation of a therapy of ALS, aberrant ALS cells 18 mature as already mentioned in an extrathymic environment 12 (skin) and are delivered into the bloodstream 14.
  • a therapeutic treatment 20 of the blood 14 for example by photopheresis and / or by deactivation of the ALS-lead proteins CD8 and CD16 by cross-linking with bi- or multispecific antibodies, the ALS cells 18 circulating in the blood stream 14 become apoptotic (deactivated ALS cells). Line 18 ') and can no longer migrate into the pyramidal system 16.
  • the apoptotic bodies 22 are also presented to the immune system. Based on the current state of knowledge, it can be assumed with high probability that this mechanism can also induce an endogenous immune response against the aberrant ALS lines 18, so that the extrathymic maturation of the aberrant ALS cells 18 can be at least partially suppressed and the number of replicated ALS lines 18 decreases.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines menschlichen oder tierischen Patienten, der unter einer Erkrankung leidet. Das Verfahren umfasst die Schritte a) Ermitteln wenigstens eines Proteinclusters (CMP), das für die Erkrankung des Patienten charakteristisch ist, b) Bereitstellen der Zellprobe des Patienten und c) extrakorporales Entfernen von Bestandteilen, die das wenigstens eine ermittelte CMP aufweisen, aus der Zellprobe. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Verfahren und Vorrichtung zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines Patienten
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines menschlichen oder tierischen Patienten. Die inkorporale Behandlung von vielen Erkrankungen ist häufig mit starken Nebenwirkungen verbunden oder sogar bislang unmöglich. Alternativ sind Vorrichtungen bekannt, die sich außerhalb des Körpers (extrakorporal) des Patienten befinden und mit deren Hilfe Zellproben des Patienten behandelt und anschließend wieder zurückgeführt werden können. Hierdurch ist in manchen Fällen eine schonendere Be- handlung der betreffenden Erkrankung möglich, da beispielsweise das Immunsystem des Patienten durch die Behandlung in geringerem Maße in Mitleidenschaft gezogen wird, als dies durch eine inkorporale Behandlung möglich wäre.
Als nachteilig ist anzusehen, dass die bekannten extrakorporalen Behandlungsver- fahren und die zu deren Durchführung verwendeten Vorrichtungen vergleichsweise unspezifisch sind und sich daher nur zur entsprechend unspezifischen Behandlung relativ weniger Erkrankungen eigenen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines menschlichen oder tierischen Patienten anzugeben, die eine spezifischere und flexiblere Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen ermöglichen. Die Aufgaben werden erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 sowie durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 16 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen mit zweckmäßigen Weiterbildungen der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben, wobei vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens als vorteilhafte Ausgestaltungen der Vorrichtung und umgekehrt anzusehen sind.
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines menschlichen oder tierischen Patienten, der unter einer Erkrankung leidet, bei welchem zumindest die Schritte a) Ermitteln wenigstens eines Proteinclusters (CMP), das für die Erkrankung des Patienten charakteristisch ist, b) Bereitstellen der Zellprobe des Patienten und c) extrakorporales Entfernen von Bestandteilen, die das wenigstens eine ermittelte CMP aufweisen, aus der Zeilprobe durchgeführt werden. Hierdurch kann eine Vielzahl von Erkrankungen hochspezifisch und nebenwirkungsarm behandelt werden, da lediglich die betroffenen Bestandteile der Zellprobe außerhalb des Körpers des Patienten entfernt werden, während nicht von der Erkrankung betroffene Zellen der Zellprobe nicht entfernt werden bzw. zumindest weitge- hend unverändert bleiben. Der Begriff„Entfernen" umfasst im Kontext der vorliegenden Erfindung nicht nur ein teilweises oder vollständiges„Entfernen" der betreffenden Bestandteile, sondern alternativ oder zusätzlich auch ein teilweises oder vollständiges Inaktivieren bzw. Zerstören dieser Bestandteile, wodurch diese zumindest nicht mehr in ihrer pathogenen Form in der Zellprobe vorliegen bzw. möglichst stark abgereichert werden.
Unter einem Proteincluster wird innerhalb des Kontextes der vorliegenden Erfindung ein kombinatorischer molekularer Phänotyp (Combinatorial Molecular Phenotype, CMP) verstanden, der kolokalisierte und/oder antikolokalisierte CDs (Cluster of Diffe- rentiation, Unterscheidungsgruppen), Proteine und/oder Moleküle in einem bestimmten Ort einer Zelle beschreibt. Dementsprechend repräsentieren Gruppen von CMPs Regionen von kolokalisierten und/oder antikolokalisierten CDs, Proteinen und/oder sonstigen Molekülen in einer Zelle oder einem Zellkomplex der Zellprobe. Ein CMP in diesem Zusammenhang kann beispielsweise in Form eines binären Codes ange- geben werden, wobei es möglich ist, über jede Ziffer der Binärzahl (d.h. über jedes "Bit") zu kodieren, ob ein vorbestimmtes CD/Protein/Molekül in einem bestimmten vorgegebenen Ort und/oder in einer einen bestimmten Grenzwert übersteigenden Konzentration (z. B. L, 1 oder True) in der Zelle vorkommt. Im anderen Fall, das heißt wenn das vorbestimmte CD/Protein/Molekül nicht an dieser Stelle der Zelle vor- vorkommt oder nur in einer unterhalb eines Grenzwert liegenden Konzentration, wird eine abweichende Kodierung (z, B. Ä, 0 oder False) verwendet. Ebenso kann es vorgesehen sein, dass bestimmte CDs/Proteine/Moleküle nur manchmal mit einem oder mehreren anderen CDs/Proteinen/Molekülen kolokalisiert und manchmal nicht kolokalisiert sind. Diese CDs/Proteine/Moleküle können mit„Wildcards" (z. B. W, *) kodiert werden.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass bestimmte CDs/Proteine/Moleküle erkrankungsspezifisch und/oder patientenspezifisch als sogenannte Leitproteine fungieren. Auf einem hohen Level der molekularen Zellorganisation werden Proteine häufig als Cluster oder Netzwerke miteinander gekoppelt (entsprechend den besagten CMP- otiven), wobei diese Kopplung von Leitproteinen gesteuert wird: Wenn die Leitproteinen gehemmt oder entfernt werden, zerfallen diese Cluster, was zu einem Verlust ihrer biologischen Funktion führt. Deshalb können zahlreiche Erkran- kung effektiv und zumindest im Wesentlichen nebenwirkungsfrei behandelt werden, indem das CMP oder die Gruppe von CMPs ermittelt wird, das oder die für eine bestimmte Erkrankung charakteristisch ist, wonach die betreffenden Bestandteile der Zellprobe, die diese pathologischen„Marker" tragen, extrakorporal aus der Zellprobe entfernt bzw. inaktiviert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Abhängigkeit der Erkrankung und des Behandlungserfolgs grundsätzlich einmal oder mehrmals durchgeführt werden. Beispielsweise können mehrere Zyklen in bestimmten gleich bleibenden oder variierenden Abständen durchgeführt werden. Die Anzahl und Frequenz der Verfahrens- durchlaufe sollte von einem Arzt bestimmt und kontrolliert werden.
Dabei hat es sich als vorteilhaft gezeigt, wenn als Zellprobe eine Körperflüssigkeit, insbesondere Blut und/oder Blutplasma, und/oder eine Gewebeprobe des Patienten bereitgestellt wird. Hierdurch kann die Zellprobe optimal in Abhängigkeit der zu be- handelnden Erkrankung ausgewählt werden.
Weitere Vorteile ergeben sich, indem das wenigstens eine CMP anhand einer Datenbank und/oder mittels eines Multi-Epitop-Ligand-Kartographie (MELK) bzw. ICM- Verfahrens (Multi -Epitop- Ligand Kartographie/Imaging Cycler Mikroskopie) und/oder mittels eines MELK-Robotersystems ermittelt wird. Für Erkrankungen, bei denen das charakteristische CMP bzw. die charakteristische Gruppe von CMPs bereits bekannt und nicht in der Regel nicht patientenspezifisch ist, kann es ausreichend sein, das oder die CMPs aus einer entsprechenden medizinischen Datenbank zu ermitteln. Al- ternativ oder zusätzlich kann es vorgesehen sein, dass das oder die für die Erkrankung charakteristische(n) CMP(s) mit Hilfe eines Multi-Epitop-Ligand-Kartographie (MELK) bzw, I CM -Verfahrens (Imaging Cycler Mikroskopie) und/oder mittels eines MELK-Robotersystems ermittelt wird bzw. werden. Das MELK/IC M-Verfahren bzw. das MELK-Robotersystem sind als solche beispielsweise aus den Dokumenten US 6,150,173, DE 197 09 348 A1 , EP 0 810 428 AI , DE 100 43 470 A1 und WO
02/21 137 A2 bekannt.
Alternativ oder zusätzlich ist es vorgesehen, dass das extrakorporale Entfernen der Bestandteile mittels eines MELK bzw. IC -Verfahrens und/oder mittels eines MELK- Robotersystems überwacht und/oder kontrolliert wird. Hierdurch kann die gewünschte Abreicherung der krankheitsspezifischen Bestandteile der Zellprobe kontrolliert und gegebenenfalls gesteuert bzw. geregelt werden.
Eine besonders spezifische und damit effektive und nebenwirkungsarme Entfernung der pathogenen und/oder überzähligen Bestandteile aus der Zellprobe ist in weiterer Ausgestaltung der Erfindung möglich, wenn die Erkrankung eine Tumorerkrankung und/oder eine Entzündungserkrankung ist. Solche Erkrankungen weisen ein besonders hohes Maß an zellulärer Organisation auf und können im Rahmen der vorliegenden Erfindung dementsprechend spezifisch adressiert werden.
Wertere Vorteile ergeben sich, indem das extrakorporale Entfernen mittels eines Aphereseverfahrens und/oder mittels einer Apheresevorrichtung durchgeführt wird. Hierdurch können insbesondere pathogene und/oder überzählige Bestandteile, die sich zumindest überwiegend im Blut und/oder Blutplasma des erkrankten Patienten finden, besonders wirkungsvoll und nebenwirkungsarm aus dem Blut und/oder Blutplasma entfernen.
Dabei hat es sich weiterhin als vorteilhaft gezeigt, wenn als Aphereseverfahren eine unselekiive Apherese und/oder eine selektive Apherese und/oder eine Vollblutaphe- rese und/oder eine Photopherese durchgeführt wird und/oder dass die Apheresevor- richtung zur Durchführung wenigstens eines Aphereseverfahrens aus der Gruppe unselektive Apherese, selektive Apherese, Vollblutapherese und Photopherese ausgebildet ist. Dies erlaubt eine optimale Anpassung an die jeweilige Erkrankung bzw. an die für die betreffende Erkrankung charakteristischen Bestandteile. Bei der extrakorporalen Apherese kann in manchen Ausführungen zunächst das Blut des Patienten mittels einer Zentrifuge aufgetrennt werden, um die pathogenen Bestandteile gegenüber nicht-pathogenen Bestandteilen anzureichern. Ebenso ist es möglich, bestimmte Bestandteile vollständig anzutrennen und/oder zu substituieren. Im Rahmen einer Photopherese werden die pathogenen Bestandteile einer kontrollierten Bestrahlung mit Licht bestimmter Welienlänge(n) ausgesetzt, um eine Zerstörung bzw. Abreicherung zu erzielen. Die Wellenlänge(n), Bestrahlungszeit und Bestrahlungsdauer können in Abhängigkeit der Eigenschaften der pathogenen Bestandteile gewählt werden. Beispielsweise kann die gegebenenfalls aufgetrennte bzw. fraktionier- te Zellprobe einer kontrollierten UV-A- und/oder UV-B-Bestrahlung ausgesetzt werden. Im Anschluss an die Apherese kann das Blut bzw. Blutplasma, in welchem die pathogenen Bestandteile abgereichert oder vollständig entfernt wurden, wieder zum Patienten zurückgeführt werden. Die behandelte Zellprobe wird hierdurch dem nicht- behandelten Immunsystem präsentiert und kann in manchen Fällen eine zusätzliche Modulation des Immunsystems bewirken.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist es vorgesehen, dass zum extrakorporalen Entfernen wenigstens ein Streptamer und/oder wenigstens ein Antikörper und/oder wenigstens ein Ligand, insbesondere ein variables Einzelketten- fragment (scFv) und/oder ein multivalentes Antikörperfragment (scFv Multimer), verwendet wird. Hierdurch kann eine optimal auf den zu entfernenden Bestandteil an- gepasste Selektionierung durchgeführt werden. Das wenigstens eine Streptamer und/oder der wenigstens eine Antikörper und/oder der wenigstens eine Ligand können grundsätzlich der Zellprobe zugegeben und/oder immobilisiert an einem Trä- germaterial verwendet werden. Antikörperfragmente bieten den Vorteil einer hohen Bindungsaffinität bzw. -avidität und Spezifität für ein breites Spektrum an Zielstrukturen und Haptenen. Einzelkettenfragmente können zudem als Diabodies (60 kDa), Triabodies (90 kDa), Tetrabodies (120 kDa) etc. vernetzt bzw. exprimiert werden, wobei unterschiedliche Linkerlängen zwischen V-Domänen möglich sind. Ein beson- derer Vorteil ist zudem, dass Moleküle von 80-120 kDa die Penetration von Zellen erhöhen und schnellere Clearance-Raten als korrespondierende igs (150 kDa) besitzen. Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass der Antikörper und/oder Ligand ein Diabody, Triabody, Tetrabody, Pentabody, Hexabody, Heptabody oder Octabody ist, Mit anderen Worten ist es vorgesehen, dass der Antikörper und/oder Ligand mono-, bk tri-, quad-, pent-, hex-, hept-, oct-, enn- oder multispezifisch ausgebildet ist. Dies erlaubt die Quervernetzung von zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder acht Zielstrukturen bzw. Zielproteinen, wobei scFv Multimere besonders präzise und individuell an die gegebenenfalls patientenspezifische räumliche Anordnung der Zielepitope bestimmter kombinatorischer Proteincluster (CMPs) angepasst werden können. Die erhöhte Bindungswertigkeit von scFv-Multimeren führt zu einer besonders hohen A- vidität.
Wertere Vorteile ergeben sich, indem das wenigstens eine Streptamer und/oder der wenigstens eine Antikörper und/oder der wenigstens eine Ligand ein für die Erkrankung charakteristisches Leitprotein spezifisch bindet und/oder inaktiviert. Hierdurch können eine besonders effiziente und umfassende Entfernung der pathogenen und/oder überzähligen Bestandteile erzielt und eine entsprechend zuverlässige Behandlung der betreffenden Erkrankung ermöglicht werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist es vorgesehen, dass die Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist und/oder dass die Zellprobe eine Blutprobe des Patienten ist und/oder dass das wenigstens eine CMP eines oder mehrere aus der Gruppe CD16, CD8, NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, APKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 umfasst und/oder dass die Bestandteile mittels wenigstens eines Antikörpers und/oder Liganden, welcher mindestens eines aus der Gruppe CD16, CD8, NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d. CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 bindet, und/oder mittels eines CD16-Ectodomain-Shedding-Moleküls extrakorporal entfernt werden. Die amy- otrophe Lateralsklerose (ALS) beruht auf einer unaufhaltsam und rasch fortschrei- tenden irreversiblen Lähmung der Muskulatur, da bestimmte Nervenzellen, die die Muskulatur steuern, degenerieren. Es wurden bisher über 50 klinische Behandlungsstudien durchgeführt, deren Therapiekonzepte sich allerdings überwiegend als unwirksam erwiesen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es erstmals mög- lieh, die pathogenen ALS-spezifischen Zellen extrakorporal zu entfernen bzw. zu inhibieren, wodurch der Krankheitsfortschritt gestoppt oder zumindest erheblich verlangsamt werden kann. Bei den für die ALS verantwortlichen pathogenen Bestandteilen handelt es sich um aberrante T-Lymphozyten, die neben dem CD8-Rezeptor auch den CD16-Rezeptorkomplex exprimieren. Daher zeichnen sie sich durch CMPs aus, die CD8 und/oder CD16 als Leitproteine enthalten. Die Leitproteine können mit den weiteren angegebenen CDs und Proteinen kolokalisiert bzw. antikolokalisiert sein. Dementsprechend hat es sich als vorteilhaft gezeigt, wenn der zum Entfernen der pathogenen Bestandteile verwendete Antikörper und/oder Ligand einen, zwei, drei, vier, fünf oder mehr aus der Gruppe CD16, CD8, STTP1 , NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 . BMX, GAK, JNK2. MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 bindet. Mit anderen Worten ist es vorgesehen, dass der Antikörper und/oder Ligand mono-, bk tri-, quad-, pent-, hex-, hept-, oct-, enn- oder multispezifisch ausgebildet ist. Die genann- ten Proteine bilden in unterschiedlichen Kombinationen überindividuelle und individuelle Cluster in ALS-spezrfischen Zellen und können daher extrakorporal therapeutisch quervernetzt und damit blockiert werden, wodurch die ALS-spezifischen Zellen ihre Funktionalität einbüßen. Hierdurch wird eine besonders spezifische und damit nebenwirkungsarme oder sogar nebenwirkungsfreie Behandlung von ALS ermög- licht. Weitere Vorteile ergeben sich, wenn der Antikörper und/oder Ligand zumindest CD16, CD8 und STTP1 bindet. STTP1 bezeichnet hierbei das gegebenenfalls Patienten-spezifische Signalprotein (signal transduction p rote in 1 , z. B. Kinase), welches die Signalkaskade, die sich von der Zelloberfläche zum Zellkern erstreckt, vermittelt und zusammen mit dem Modul„CD16a und CD8" an der Oberfläche der Zelle kop- pelt, wo es mit CD16a und CD8 kolokalisiert ist. STTP1 kann mit Hilfe der an sich bekannten MELK- und/oder ICM-Technik (Multi-Epitope-Ligand-Kartographie bzw. Imaging Cycler Mikroskopie) für den betreffenden Patienten individuell ermittelt bzw. überwacht werden. Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass STTP1 wenigstens ein Protein aus der Gruppe RAC , STAP2 und SMAD2 ist. Weitere Vorteile ergeben sich, wenn der Antikörper und/oder Ligand rekombinant, human oder de novo hergestellt ist.
Weitere Vorteile ergeben sich, indem zum extrakorporalen Entfernen ein Antikörper und/oder Ligand verwendet wird, welcher zwei oder mehr aus der Gruppe CD16, CD8, RAC1 , STAP2 und SMAD2 bindet. Hierdurch können ALS-spezifische Protein- Cluster blockiert werden, die neben einem oder mehreren Zelloberflächenproteinen (z. B. CD8, CD16, CD45RA) zusätzlich mit einem oder mehreren Signalketten- Molekülen aus der Gruppe RAC1 , STAP2 und/oder SMAD2 direkt assoziiert sind, RAC1 (Ras-related C3 botulinum toxin Substrate 1) als Mitglied der RAG Subfamilie regelt eine Vielfalt von zellulären Ereignissen, einschließlich der Kontrolle des Zellwachstums, der Zytoskelett-Reorganisation und der Aktivierung von Proteinkinasen. STAP2 (Signal-transducing adaptor p rote in 2) und SMAD 2 (Mothers against deca- pentaplegic homolog 2) sind ebenfalls Teil der Signaltransduktionskette und regulie- ren die Signaltransduktion und Transkription zentraler Signalwege in ALS- spezifischen Zellen.
Alternativ ist es vorgesehen, dass die Erkrankung Prostatakrebs ist und/oder dass die Zellprobe Prostatagewebe ist und/oder dass das wenigstens eine CMP eines o- der mehrere aus der Gruppe CD26 und CD29 umfasst und/oder dass die Bestandteile mittels wenigstens eines Antikörpers und/oder Liganden, welcher mindestens eines aus der Gruppe CD26 und CD29 bindet, extrakorporal entfernt werden. Hierdurch ist es erstmals möglich, Prostatakrebs extrakorporal zu behandeln und die Therapie zu überwachen. Die Erfindung basiert dabei auf der Erkenntnis, dass sich Prostatakrebs durch CMPs auszeichnet, die CD26 und/oder CD26 als Leitproteine enthalten, die gegebenenfalls mit weiteren CDs bzw. Proteinen kolokalisiert bzw. an- tikolokalisiert sind.
Weitere Vorteile ergeben sich, wenn das wenigstens eine CMP auch CD44 und/oder CD54 und/oder CD138 umfasst und/oder wenn dem wenigstens einen CMP mindestens eines von CD3, CD4, CDS, CD10, CD13, CD19, CD20, CD38, CD49d, CD58 und CD80 fehlt. Dies ermöglicht eine besonders zuverlässige Identifizierung und Ü- berwachung der Entfernung der für Prostatakrebs verantwortlichen pathogenen Bestandteile der Zellprobe. Prostatakrebs liegt insbesondere dann vor, wenn die Zell- probe vom Stroma und/oder neoplastischen Epithel von Azini von Prostatagewebe stammt, und/oder wenn mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 75 % der CMPs auf der Zellenoberfläche mindestens einer Zelle CD26 und/oder CD29 enthalten, und/oder wenn mindestens 20 %, vorzugsweise mindestens 35 % der CMPs auf der Zellenoberfläche mindestens einer Zelle CD28 und/oder CD29 umfassen und ihnen mindestens CD3, CD4, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20, CD38, CD49d, CD58 und CD80 fehlt.
Dementsprechend können die pathogenen Bestandteile der Zellprobe in weiterer Ausgestaltung der Erfindung besonders zuverlässig dadurch extrakorporalen entfernt werden, dass zum Entfernen ein Antikörper und/oder Ligand verwendet wird, welcher mindestens eines oder mehrere aus der Gruppe CD26, CD29, CD44, CD54 und CD138 bindet. Alternativ ist es vorgesehen, dass die Erkrankung ein kutanes Lymphom, insbesondere Mycosis fungoides ist und/oder dass die Zellprobe eine Hautprobe ist und/oder dass das wenigstens eine CMP eines oder mehrere aus der Gruppe HLA -DQ, CD2, CD3, CD4, CD7, CDS, CD10, CD13, CD18, CD18, CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD71 , CD80 und HLA-DR um- fasst und/oder dass die Bestandteile mittels wenigstens eines Antikörpers und/oder Liganden, welcher mindestens eines aus der Gruppe HLA-DQ, CD2, CD3, CD4, CD7, CDS, CD10, CD13, CD18, CD18, CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD71 , CD80 und HLA-DR bindet, extrakorporal entfernt werden. Damit ist erstmals eine extrakorporale Behandlung und Therapie- kontrolle von kutanen Lymphomen ermöglicht. Die Erfindung basiert dabei auf der Erkenntnis, dass sich kutane Lymphome durch CMPs auszeichnet, die insbesondere HLA-DQ als Leitprotein enthalten, das mit einem oder mehreren der genannten CDs bzw. Proteine kolokalisiert bzw. antikolokalisiert ist. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Zellprobe nach dem teilweisen oder vollständigen extrakorporalen Entfernen der Bestandteile, die das wenigstens eine ermittelte CMP aufweisen, dem Patienten wieder zurückgeführt. Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft eine Vorrichtung, weiche zur Durchführung eines Verfahrens gemäß dem ersten Erfindungsaspekt ausgebildet ist. Unter dem Ausdruck„ausgebildet zu" ist dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zu verstehen, die nicht nur eine grundsätzliche Eignung zur Durchführung eines solchen Verfahrens aufweist, sondern konkret dazu eingerichtet und ausgestattet ist, ein solches Verfahren durchzuführen. Die sich hieraus ergebender» Merkmale und deren Vorteile sind den Beschreibungen des ersten Erfindungsaspekts zu entnehmen, wobei vorteilhafte Ausgestaltungen des ersten Erfindungsaspekts als vorteilhafte Ausgestaltungen des zweiten Erfindungsaspekts und umgekehrt anzu- sehen sind.
Weitere Vorteile ergeben sich, indem die Vorrichtung zur Durchführung wenigstens eines Aphereseverfahrens aus der Gruppe unselektive Apherese, selektive Aphere- se, Vollblutapherese und Photopherese ausgebildet ist. Bei der unselektiven Aphe- rese, die auch als Plasmaaustausch bezeichnet wird, wird das Plasma mittels der Vorrichtung vom Blut separiert und vollständig substituiert. Als Ersatzflüssigkeiten werden meist humane Blutprodukte verwendet. Bei der selektiven Plasmapherese (Plasmaperfusion) werden die Zellen, die das Proteincluster (CMP) tragen, das für die Erkrankung des Patienten charakteristisch ist, aus dem Plasma durch Filtration oder Adsorption mittels der Vorrichtung abgetrennt. Das gereinigte Plasma kann anschließend dem Patienten zurückgeführt werden. Bei der Vollblutapherese (Hämo- perfusion) werden die Zellen, die das Proteincluster (CMP) tragen, das für die Erkrankung des Patienten charakteristisch ist, beispielsweise affinitätschroma- tographisch mittels der Vorrichtung direkt aus dem Blut gefiltert. Bei der extrakorpo- raten Photopherese kann zunächst die Zellprobe bzw. das Blut des Patienten mittels einer Zentrifuge der Vorrichtung aufgetrennt, Leukozyten-angereichertes Blutplasma mittels der Vorrichtung gesammelt und in einem extrakorporalen Kreislauf einer kontrollierten UV-Bestrahlung mittels einer UV-Bestrahlungseinrichtung der Vorrichtung ausgesetzt werden. Die Wellenlänge der UV-Bestrahlung beträgt typischerweise zwischen 340 und 380 Nanometer, beispielsweise 365 Nanometer (UV-A). Als durchschnittliche UV-Exposition der Leukozyten können typischerweise zwischen 0,1 und 5 J/cm2, beispielsweise 1 ,5 J/cm2 vorgesehen sein. Die Gesamtdauer der Behandlung beträgt je nach Volumen der Zell- bzw. Blutprobe zwischen 2 und 5 Stunden. Der Probe kann bei der extrakorporalen Photopherese mittels der Vorrichtung ein lichtaktivierbares Pharmazeutikum, beispielsweise Methoxsalen, zugesetzt werden. Im Anschluss an die Bestrahlung kann die Zellprobe bzw. das Blut zum Patienten teilweise oder vollständig zurückgeführt werden. Der Vorteil besteht darin, dass das Immunsystem des Patienten nicht oder nur in geringem Ausmaß beeiträchtigt wird, so dass neben den direkten zytostatischen und zytotoxischen Effekten an der bestrahlten Zell- bzw. Blutprobe eine Immunmodulation des nicht-bestrahlten Immunsystems bewirkt werden kann. Die Behandlungsfrequenz kann 4 bis 20 Zyklen in jeweils 2-20-tägigen Abständen betragen. Die Abstände zwischen einzelnen Behandlungen können mit der Zeit steigen. Der Behandlungserfolg kann über die Er- mittlung der Konzentrationsabnahme der Zellen erfolgen, die das Proteincluster
(CMP) tragen, das für die Erkrankung des Patienten charakteristisch ist Ein weiterer Vorteil von Aphereseverfahren liegt in den vergleichsweise geringen Kosten. Nach einer australischen Analyse belaufen sich derzeit die Kosten pro ALS-Patient und Jahr auf etwa 750.000 bis 1 Millionen Euro. Da man beispielsweise mit einer Pho- topheresebehandlung die ALS im Frühstatium zumindest stoppen kann, können mit bis zu etwa 26 Behandlungen pro Jahr, die für einen Bruchteil der bisherigen jährlichen Kosten realisiert werden können, das Entstehen progressiver schwerer Behinderungen und der damit verbundenen Belastungen verhindert werden, was neben dem nicht bezifferbaren Gewinn an Lebenszeit und --qualität für den Patienten auch zu erheblichen Einsparungen im Gesundheitswesen führt.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft ein Streptamer und/oder einen Antikörper und/oder einen Ligand zur Verwendung in einem Verfahren gemäß dem ersten Erfindungsaspekt. Die sich hieraus ergebenden Merkmale und deren Vorteile sind den Beschreibungen des ersten Erfindungsaspekts zu entnehmen, wobei vorteilhafte
Ausgestaltungen des ersten Erfindungsaspekts als vorteilhafte Ausgestaltungen des dritten Erfindungsaspekts und umgekehrt anzusehen sind. Das Streptamer, der Antikörper und/oder der Ligand kann bzw. können in weiterer Ausgestaltung mit einem Adsorber und/oder einem Chromophor gekoppelt sein. Hierdurch eignen sie sich insbesondere für die Verwendung im Rahmen einer Photopherese mit auf den Absorber bzw das Chromophor abgestimmten Wellenlängen. Alternativ oder zusätzlich kann das Streptamer, der Antikörper und/oder der Ligand mit einem Marker, insbesondere einem magnetischen Marker (Magnetic Cell Separation) gekoppelt sein. Dies erlaubt eine einfache extrakorporale Abtrennung von mit dem Strepta- mer/Antikörper/Ligand gebundenen pathogenen Bestandteilen per Affinitätschromatographie, beispielsweise mit Hilfe von sogenannten MicroBeads. Dabei handelt es sich um etwa 50 Nanometer große Magnetpartikel, die an das Streptamer, den Antikörper bzw. den Ligand gebunden sind. Streptamer/Antikörper/Ligand erkennen krankheitsspezifische CMP(s) auf der Oberfläche von pathogenen Bestandteilen (Zellen) und sorgen damit für die Bindung der MicroBeads an diese Zellpopulation. Beim Durchfluss der Zellprobe durch eine Säule, die von einem starken Magnetfeld umgeben ist, werden die mit den MicroBeads markierten Zellen zurückgehalten. Auf diese Weise erhält man beim Spülen der Säule nur unmarkierte und damit nicht- pathogene Zellen, so dass aus dem ursprünglichen Zellgemisch die markierte Zell- popuiation und damit die für die Erkrankung charakteristischen Bestandteile entfernt wurden. Nach dem Entfernen des Magnetfeldes kann zudem auch die markierte Zellpopulation durch Spülen der Säule gewonnen werden und steht damit für weitere Versuche zur Verfügung. Durch wiederholte Behandlung eines Zellgemisches mit verschiedenen MicroBeads ist auch eine sogenannte fraktionierte Trennung, also die Auftrennung in mehrere Zellpopulationen, möglich. Das Streptamer, der Antikörper und/oder der Ligand kann bzw. können in weiterer Ausgestaltung mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Quantenpunkt, einem radioaktiven Marker, einem Spin-Marker und/oder einem Tag für einen weiteren Antikörper/Liganden und/oder ein Einzym gekoppelt sein.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen, den Figuren und der Figurenbeschreibung. Die vorstehend in der Beschreibung genannten Merkmale und Merkmalskombinationen, sowie die nachfolgend in der Figurenbeschreibung genannten und/oder in den Figuren alleine gezeigten Merkmale und Merkmalskombinationen sind nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen verwendbar, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Es sind somit auch Ausführungen von der Erfindung als umfasst und offenbart anzusehen, die in den Figuren nicht explizit gezeigt und erläutert sind, jedoch durch separierte Merkmaiskombinationen aus den erläuterten Ausführungen hervorgehen und erzeugbar sind. Es sind auch Ausführungen und Merkmalskombinationen als offenbart anzusehen, die somit nicht alle Merkmale eines ursprünglich formulierten unabhängigen Anspruchs aufweisen. Dabei zeigt: Fig. ia bis If verschiedene Toponomabbildungen ALS spezifischer, abnormer
Zellen; Fig. 2a bis 2f den Stufenprozess dieser abnormen Zellen, der zum ALS spezifischen Krankheitsbild führt;
Fig. 3 eine schematische Darstellung der topologischen Hierarchie von
Proteinen innerhalb eines Toponoms;
Fig. 4 eine Toponomkarte, die die Lage der 30 häufigsten aus mehr als
2.000 verschiedenen CMPs bei Prostatakrebs zeigt;
Fig. 5 eine Darstellung der selektiven Expression des Prostatakrebs- spezifischen CMPs in subzellulären Stellen von neoplastischen
Prostata Acini;
Fig. 6 eine Illustration der zyklischen Lokalisierung von 25 Biomolekülen und die nachfolgende Ermittlung der CMPs mit Hilfe des MELK/ICM Verfahrens;
Fig. 7 Toponomabbildungen zur Gewebeorganisation eines kutanen
Lymphoms; Fig. 8 eine schematische Darstellung des Pathomechanismus der
ALS; und
Fig. 9 eine schematische Darstellung einer Therapie von ALS. Mechanismen der ALS im Toponom
Synopsis des ALS-Toponoms: Analysen der Zelloberflächen von Immunzellen des Blutes haben gezeigt, dass bei ALS ein spezifisches abnormes Toponom vorkommt. Wesentliches Merkmal ist die Existenz von aberranten T-Lymphozyten, die neben dem CD8 -Rezeptor auch den CD16-Rezeptorkomplex exprimieren. Exakt dieselben Zellformen finden sich im morphologisch gut erhaltenen ALS postmortem Gewebe innerhalb von postkapillären Venolen der spinalen Pyramidenbahn (Fig. 1 a, b; Box). Detaillierte 3D Toponomauflösung zeigt, dass diese Zellen den CD16-Komplex (Fig. 5 1 , Pfeil 1) exprimieren, polarisiert sind und eine„leading edge" mit CD3 positiver Membran zeigen, die durch die Endothelzellschicht des Blutgefäßes dringt (Fig. 1 c; Pfeil 2), während CD3 positive Vesikel intrazellulär zu der„leading edge" transportiert werden (Fig. 1 c; Box). Einzelne Vesikel enthalten Komplexe aus CD8/CD16 (Fig. 1 d, e, f). Diese CD8/CD16-Komplexe sind durch„forward transport" für die Transi t) migration dieser Zellen durch die Endothelzellschicht via„vesicle budding" in der Zelloberfläche erforderlich, um als Teil eines abnormen„homing codes" (Referenzcodes) die Transmigration voranzutreiben. CD16 wird auch als Fe region reeeptor III- A bzw. Fcylll bezeichnet. Nach der Transmigration wird dieser Komplex degradiert, da CD8 positive T-Zellen im Parenchym der Pyramidenbahn den CD16-Komplex 15 nicht aufweisen. Stattdessen finden sie sich als einzelne Zellen zwischen den myeli- nisierten Neuronen (Fig. 2 a, CD8+CD16 - blaue Zelle). Stärkere 3D-Vergrößerung dieser Zelle weist einen Zellfortsatz auf, der tief in die Oberfläche eines morphologisch intakten Axons eingedrungen ist (Fig. 2 b, Box; Fig. 2 c: Vergrößerung der Box: Stern = morphologisch intakter Axonkörper). Dieser Zellfortsatz exprimiert CD3 und 0 CD8 (Fig. 2; Pfeile 1 , 2) Eine geometrisch exakte 3D-Berechnung ergibt den Zellfortsatz in Fig. 2 f (Pfeil 3) und das Axon in Fig. 2 f (mit Stern markiert). Ein ähnlicher Zellfortsatz findet sich ausgehend von derselben Zelle in Fig. 2 d (untere Bildhälfte): Hier hat der Zellfortsatz (rot) offensichtlich die intakte yelinscheide (weiß) durchdrungen. Zum Vergleich hierzu zeigt Fig. 2 e eine intakte Myelinscheide.
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Zusammenfassend: CD16 ist notwendig, um das abnorme„homing" aberranter CD8 Zellen in die Pyramidenbahn zu steuern. Wenn dieser homing-Prozess abgeschlossen ist, degradieren (verlieren) die Zellen den CD16-Komplex, wandern dann als CD8+CD16-Zellen zwischen den myelinisierten Neuronen, dringen durch die Myelin- 0 scheiden und axotomieren Neurone. Dieser Prozess ist offensichtlich primär autonom, da die Zellen nie im Kontext mit ZeFdebris", also Zeichen primärer neuronaler Degradation beobachtet werden. Die Zellen spielen daher eine primäre pathogenetische Rolle. Diese Interpretation wird gestützt durch die Tatsache, dass die Herunterregulierung von CD16 zu einem Stopp der Krankheitsprogression führt: wenn CD16 nicht mehr wie in Fig. 1 f zur Verfügung steht, kann der endotheliale homing-Vorgang nicht mehr ausgeführt werden. Ein Teil der (sporadischen) ALS kann daher als Krankheit des Immunzelltoponoms beschrieben werden, das mittels eines hochselektiven„homing codes" die ALS-spezifischen Pyramidenbahn-Läsionen (Axotomie) generiert. Viele genetische Befunde und Proteinaggregationen, die bei ALS beschrieben wurden, sind auch bei experimenteller Axotomie beschrieben worden, so dass die Immunzelltoponom-vermittelte Axotomie diese Befunde erklärt.
Koepressionsmuster
Die invasiven Zellen gemäß Fig ic koexprimieren weiterhin folgende Moleküle:
Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45 A, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD8, HLADR, Immunglobulin G. MHCII, MHCI, NeuN, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2. S AD4 und STAP2.
NeuN (Fox-3, Rbfox3, oder Hexaribonucleotid Bindeprotein-3) ist ein neuronales, nukleares Antigen, das normalerweise als Biomarker für Neurone verwendet wird.
Die nukleare Koexpression von NeuN und CD49d, sowie die cytoplasmatische Expression von Immunglobulin G (IgG) zusammen mit den CD16 tragenden Vesikeln aus Fig 1 d-f) und die Zelloberflächenexpression von CD8 und CD3 zeigen, dass diese Zelle einen abnormen Differenzierungsstatus aufweist: Eine Zelle mit Merkma- len einer T Zelle (CD3, CD8), einer neuronalen Zelle (NeuN im Zellkern), eines Monozyten (CD16) und eines B Lymphocyten (IgG).
Proteine, die teilweise patientenspezifisch, das heißt mit individuell unterschiedlicher Wahrscheinlichkeit bzw. Häufigkeit mit CD8 und/oder CD16 in ALS-indikativen Zellen kolokalisiert sind, sind in Tabelle 1 angegeben. Alle diese Proteine stellen damit einzeln oder in Kombination mit CD8 und/oder CD16 therapeutische Zielstrukturen (Targets) dar, da ein Ausschalten dieser Proteine zu einem Zusammenbruch des intrazellulären Informationsflusses und damit zum Funktionsverlust der aberranten Zellen führt. Tabelle 1
Figure imgf000018_0001
Die Zelle aus Fig. 2 c,f), die wie obe begründet nach Invasion der Zelle aus Fig. 1 einen CD16 negativen Phänotyp exprimiert, bleibt positiv für NeuN.
Bedeutung: Die oben beschriebene invasive Zelle ist als ALS-spezifische Zelle mit den oben genannten Merkmalen im Blut oder in Gewebeproben durch räumliche To- ponomanalyse detektierbar. Da deren Invasionsverhalten in die Pyramidenbahn wie oben dargelegt bekannt ist und da ferner bekannt ist, dass die Zelle offenbar durch Phänotyp switching (CD16-) zu einer NeuN positiven T Zelle transformiert, die Neurone axotomiert, läßt die Detektion von Zellen des CD16/CD8 Phänotyps aus Fig. 1 c auf den Prozess der Axotomie schliessen. Daraus folgt, dass die Zellinvasion der Zelle aus Fig 1 c durch molekulare Blockierung oder Lyse therapeutisch verhindert werden muss, um die Axotomie zu verhindern und das Fortschreiten der AL S zu stoppen. Der beschriebene Zwei-Stufenprozess (Homing aberranter„NeuN" positiver Blutzellen in die Pyramidenbahn, deren Transformation in„NeuN" positive T Zellen, die die Oberflächen von Nervenzellen verletzen) stellt eine Verletzung grundlegender Regeln der Kooperation von Zellen verschiedener Keimblätter dar: Diese Regeln beru- hen in intakten Systemen darauf, dass Zellen aus verschiedenen Keimblättern die Regel der Nicht-Verletzung der gegenseitigen Zelloberflächen befolgen. Im Fall der ALS verletzen die transformierten T-Zell-artigen Zellen (Keimblatt Mesenchym) die Oberflächen von Neuronen (Keimblatt Ektoderm), Dadurch kommt es zu einer physischen transzellulären Vernetzung der beiden Keimblattfunktionen mit der Folge der Unterbrechung der Nervenbahnen zu der Willkürmuskulatur. Die Tatsache der Expression von„NeuN" im Zellkern der agierenden Zellen (Immunzelten in der Zirkulation und nach Invasion in das Nervensystem der Pyramidenbahn) bedeutet, dass diese Zellen einem Programm aberranter neuronaler Stammzellen folgen, da NeuN unter physiologischen Bedingungen nur in Neuronen exprimiert wird. Damit kann NeuN als Marker für das Vorliegen ALS-verursachender Zellen, das heißt zur Diagnose der ALS verwendet werden.
Um das molekulare„Programm" dieser aberranten Zellen zu blockieren, das heißt als Therapiemaßnahme zum Behandeln eines Patienten, der unter ALS leidet, bie- ten sich verschiedene extrakorporale Verfahren an, um die pathogenen Zellen, die das Leitprotein CD16 exprimieren, extrakorporal zu entfernen.
Hierzu kann das Blut des Patienten einer therapeutischen Apherese unterzogen werden, bei welcher die pathogenen Zellen mit Hilfe von vorzugsweise immobilisier- ten Antikörpern und/oder Liganden, die CD16 binden, aus dem Blut entfernt werden. Alternativ oder zusätzlich können auch vorzugsweise immobilisierte Antikörper und/oder Liganden, die CDS und/oder RAC1 und/oder STAP2 und/oder SMAD2 binden, verwendet werden. Ebenso ist es möglich, mehrere unterschiedliche Antikörper und/oder Liganden zu verwenden, die gemeinsam und/oder in Strömungsrichtung des Bluts betrachtet nacheinander angeordnet sind, so dass sich eine mehrstufige Abreicherung der pathogenen Bestandteile des Bluts ergibt. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, das Blut vor dem extrakorporalen Entfernen der pathogenen Zellen zu fraktionieren, beispielsweise durch Zentrifugation. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, das Blut durch Photopherese zu behandeln, wobei das gegebenenfalls fraktionierte Blut für eine vorbestimmte Zeit mit Licht bestimmter Wetlenlänge(n) bestrahlt wird, um die pathogenen Zellen zu inaktivieren, Eine therapeutische Depletion von„ALS Zellen", das heißt von Zellen, die das ALS- spezifische CMP tragen, im Blut von Patienten, die an ALS erkrankt waren, wurde folgendermaßen erreicht:
Zunächst wurden Blutproben von mehreren Patienten, die in Verdacht standen, an amyotrophe Lateralsklerose (ALS) erkrankt zu sein, mit Hilfe der Imaging Cycler Technologie ( ELK/ICM Verfahren) mit einer kombinatorischen molekularen Auflösung von bis zu 4,5x1 Ö481 untersucht. Hierzu wurde ein Toponome Imaging System (TIS) der Firma ToposNomos Ltd, (München, Germany) verwendet Patienten, bei denen sog.„ALS Zellen", das heißt Zellen mit ALS-typischen CMPs delektiert wur- den, wurden als an ALS erkrankt eingestuft, wobei die einzelnen Patienten jeweils unterschiedliche Verlaufsdauern der Krankheit aufwiesen. Die identifizierten Patienten wurden dann einer Photopheresebehandlung unterzogen. Photopherese ermöglicht die Durchführung eines gezielten Depletionsverfahrens, so dass die Anzahl und Konzentration an„ALS Zellen" im Blut der Patienten erheblich, das heißt bis unter die Nachweisgrenze verringert werden kann. Wie sich herausgestellt hat, fühlten sich die Patienten subjektiv besser, wenn im Rahmen eines Photopheresezyklus' mehr als 1 Liter Blutvolumen, das heißt mindestens 2 und vorzugsweise bis zu 5 Liter Blutvolumen zur Behandlung durch die Vorrichtung geleitet wurden. Wie durch die Anfangsuntersuchung und anschließende Verlaufskontrollen mit Hilfe der Imaging Cycler Technologie festgestellt werden konnte, korrelliert die Zellzahl der„ALS Zellen" im Blut sehr genau mit der Verlaufsgeschwindigkeit der Krankheit. Beispielsweise verlief die Krankheit bei einem Patienten mit etwa 50 Millionen„ALS Zellen" pro Liter Blut weniger als halb so schnell wie bei einem Patienten mit etwa 140 Millionen„ALS Zellen" pro Liter But. Dies sowie die vorstehend diskutierte Erkenntnis, dass exakt diese„ALS Zellen" nach Umwandlung der Zelloberfläche in die Pyramidenbahn einwandern (pathologisches Homing), wo sie die Axone in der Pyramidenbahn axotomieren, stellen einen weiteren Beweis dafür dar, dass es sich bei den im Blut delektierten„ALS Zellen" um die entscheidenden pathogenetisch relevanten Zellen und damit um ein zentrales Target der ALS-Behandlung handelt.
Die therapeutische Depletion dieser„ALS Zellen" im Blut gelang mittels Photophere- se bei allen bisher behandelten Patienten immer sehr sicher. Bereits nach wenigen Photopheresezyklen, typischerweise etwa 2 bis 6 Zyklen, konnten praktisch keine „ALS Zellen" mehr im Blut nachgewesen werden. Besondere Effekte beobachtet man bei Initialstadien der ALS Krankheit. So ist die Krankheit bei den behandelten Patienten, nach bisherigen Beobachtungen seit etwa 5 Monaten oder länger nicht mehr progredient, die elektrophysiologischen Parameter {EMG etc) zeigen keine weitere Progression und die behandelten Patienten fühlen sich deutlich besser. Insbesondere können keine oder kaum noch floride EMG Aktivitäten bei den behandelten Patienten festgestellt werden. Wie sich bei einigen Patienten gezeigt hat, können die„ALS Zellen" in Pausen zwischen den Photopheresezyklen im Blut wiederkehren. Die wiederkehrenden„ALS Zellen" können erneut vollständig mittels Photopherese zur Depletion gebracht werden. Nach bisherigem Wissen kann dieses Vorgehen beliebig oft wiederholt werden, so dass zumindest ein Fortschreiten der ALS Erkrankung gestoppt oder erheblich verlangsamt werden kann. Ausserdem wurde beobachtet, dass die pathogenen ALS spezifischen kombinatorischen CMP Motive der„ALS Zellen" mindestens um Faktor 100 nach deren Wiederkehr im Blut abnahmen. Ebenso nahm die Zahl der krankheitsspezifischen molekularen Kombinatoriken an der Zelloberfläche (die sog combi- natorial molecular Phenotypes, CMPs, mit Code (=1 ) und Anticode (=0) (Schubert W. et al. Nat. Biotechnol 2006)) der einzelnen„ALS Zellen" erheblich ab. Dieser Effekt zeigt sich stabil über den bislang untersuchten Zeitraum. Da Zelloberflächen- CMPs auf der Oberfläche von diesen pathologischen„ALS Zellen'' in der Postkapillare, dem Ort der Invasion, das Rolling Phänomen bis zum Stop„abbremsen", wird die durch Photopherese induzierte Abnahme der Zahl dieser CMPs das pathologische Homing nach Rolling verschlechtern und damit schon an der Pathogenesestelle der Invasion den Kankheitsprozess stoppen oder zumindest stark verlangsamen.
Weitere Möglichkeiten, um die pathogenen Zellen mit Hilfe von Apherese-Verfahren extrakorporal zu entfernen, umfassen: Verwendung von Molekülen (Antikörper/Liganden), die IgG (1/3) binden und/oder blockieren/inhibieren bzw. den physiologischen Mechanismus der IgG-vermittelten Aktivierung von CD16 blockieren/inhibieren. Ein Beispiel hierfür sind Antikörper gegen IgG und (gegebenenfalls rekombinantes) Streptokokken Protein G; Blockierung (z. B. durch Quervernetzung/cross-linking) des ALS-spezifischen Clusters CD16a+CD8+STTP1 , beispielsweise mittels wenigstens eines bi-, trioder multispezifischen Antikörpers (rekombinant, human, de novo etc.), der vorzugsweise immobilisiert an einer Matrix gebunden vorliegt. STTP1 bezeichnet hierbei das gegebenenfalls Patienten-spezifische Signalprotein (Signal transduction protein 1 , z, B. Kinase), welches die vom Zellkern ausgehende Signalkaskade vermittelt und zusammen mit dem Modul„CD 16a und CD8" an der Oberfläche der Zelle gekoppelt bzw. mit CD 16a und CD8 und kolokali- siert ist. STTP1 kann mit Hilfe der an sich bekannten MELK- und/oder ICM- Technik (Multi-Epitope-Ligand-Kartographie bzw. Imaging Cycler Mikroskopie) für den betreffenden Patienten individuell ermittelt bzw. kontrolliert werden. STTP1 kann beispielsweise ein oder mehrere Proteine aus der Gruppe RAC1 , STAP2 und/oder SMAD2 und/oder ein anderes Protein aus der Signaltrans- duktionskette von ALS-Zellen sein. Ein entsprechender Antikörper, beispielsweise ein trispezifischer Anti-CD16a~CD8-STTP1 -Antikörper, kann dann e- benfalls über an sich bekannte Herstellungsverfahren hergestellt und zur Therapie des betreffenden Patienten verwendet werden. Da ein solcher trispezifischer Antikörper eine extrem hohe Selektivität für abnorme, ALS-spezifische Zellen aufweist, ist eine solche Behandlung besonders nebenwirkungsarm; Verwendung von Molekülen, die die proteolytische Abtrennung der extrazellulären CD16-Domänen (Ektodomänen) bewirken (sog. Shedding, bzw. Ecto- domain-Shedding). Ein Beispiel hierfür ist die Verwendung von vorzugsweise immobilisiertem Adam17 (Metallopeptidase Domäne 17), das auch TACE (tu- mor necrosis factor-a-converting enzyme) genannt wird. Adam 17 ist ein 70- kDa Enzym, das zur ADAM Proteinfamilie von Disintegrinen und Metallopro- teasen gehört. Adam17 bzw. das jeweilige CD16-Shedding-fähige Molekül kann optional mit einem mono-, bi-, tri- oder multispezifischen Antikörper (siehe Punkt 2) gekoppelt sein bzw. werden, um seine Spezifität vorteilhaft zu erhöhen; 4. Verwendung wenigstens eines mono-, bi-, tri- oder multi-spezifischen Anti- CD16 Antikörpers (rekombinant, human, de novo etc.), der vorzugsweise an einem Matrixmaterial immobilisiert ist;
5. Verwendung wenigstens eines mono-, bi-, tri- oder multi-spezifischen Anti- NeuN Antikörpers (rekombinant, human, de novo etc.), der vorzugsweise an einem Matrixmaterial immobilisiert ist;
6. Verwendung von Streptameren und/oder magnetic beads zur Entfernung der pathogenen CD16-Zellen.
Dabei kann es vorgesehen sein, dass die pathogenen Zellen nicht oder nicht vollständig aus der Blutprobe entfernt werden, sondern extrakorporal inaktiviert werden, so dass sie ihre biologische Funktionalität verlieren. Die oben genannten Verbindungen (Arzneimittel) können grundsätzlich einzeln oder in beliebiger Kombination im Rahmen eines Apherese- Verfahrens verwendet werden. Die Wirksamkeit und der Umfang der Entfernung sollte durch regelmäßige Kontrolle überprüft und gegebenenfalls angepasst werden. Die Kontrolle kann beispielsweise mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Diagnose-Verfahrens durchgeführt werden. Bei erfolgreicher Entfernung können üblicherweise signifikant weniger oder vorzugsweise keine abnormen ALS-spezifischen Zellen (siehe oben) mehr in der Zell- bzw. Blutprobe des betreffenden Patienten festgestellt werden.
Generell ergeben sich damit zahlreiche ALS-spezifische überindividuelle und/oder indivduelle thereutische Optionen. Eine überindividuelle Therapie kann auf die ALS- spezifischen Oberflächenproteine (CDs) bzw. Oberflächenproteincluster gerichtet sein, die quervernetzt, inhibiert oder an eine Matrix gebunden werden. Zusätzlich können gegebenenfalls zentrale Signalketten-Moleküle von ALS-Zellen quervernetzt, inhibiert oder anderweitig blockiert werden. Beispielsweise können die Zelloberflä- chenproteine CD8/CD16A CD45RA gegebenenfalls zusammen mit dem Signalket- ten-Moleküi RAC1 extrakorporal blockiert werden, da diese ausschließlich in ALS- Zellen direkt assoziiert vorkommen. Eine solche Therapie kann beispielsweise mit Hilfe von bi-, tri- und/oder tetraspezifischen Antikörpern bzw. durch entsprechende variable Einzelkettenfragmenten (scFv) oder multivalente Antikörperfragmente (scFv Multimere), das heißt durch sogenannte Diabodies, Triabodies oder Tetrabodies erfolgen.
Als individuelle Targets, die alternativ oder zusätzlich zu dem vorstehend bezeichne- ten ALS spezifischen Cluster therapeutisch adressiert werden können, umfassen individuelle Cluster von CD16/CD8 mit den Molekülen STAP2 und/oder SMAD2 sowie gegebenenfalls Kombinationen der in Tabelle 1 bezeichneten Moleküle zusammen mit dem CD8/CD16 Cluster oder auch als isolierte Cluster ohne CD8/CD16. Auch diese Cluster können mit Hilfe von gegebenenfalls multispezifischen Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten ausgeschaltet werden.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung der topologischen Hierarchie von Proteinen innerhalb eines Toponoms. Die Proteine sind mit den Symbolen Stern, Quadrat, Dreieck und Fünfeck symbolisiert. Man erkennt, dass das mit Stern symbolisierte Protein in allen drei CMPs 1 -3 vorkommt, so dass es sich bei diesem Protein um ein Leitprotein (L, 1 , True) handelt. Demgegenüber kommt das mit Quadrat bezeichnete Protein in keinem der CMPs 1-3 vor, so dass es sich bei diesem Protein um ein anti- kolokalisiertes Protein (A - absent, 0, False) handelt. Die anderen Proteine (Dreieck, Fünfeck) sind variabel mit dem Leitprotein assoziiert und stellen damit sogenannte Wildcard-Proteine dar (W, *).
Fig. 4 zeigt eine Toponomkarte, die die Lage der 30 häufigsten aus mehr als 2.000 verschiedenen CMPs bei Prostatakrebs zeigt. Die Lage dieser CMPs im Gewebe ist als Overlay mit einem CD138 Fluoreszenzsignal gezeigt. Fig. 4 veranschaulicht die Position dieser CMPs durch ihre unterschiedlichen Farben (resp. Graustufen), die an dem CD138 Fluoreszenzsignal ausgerichtet sind. Relevante CMPs sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt und haben CD26 und CD29 als Leitproteine (= L), während in all diesen CMPs CD3 / CD4 / CD8 / CD19 / CD20 / CD44 / CD80, abwesend sind (anti-kolokalisiert, A, 0), und CD10 / CD13 / CD38 / CD49d / CD54 / CD58 / CD138 variabel assoziiert sind (W, *), Wie erwähnt ergibt dies den Symbolcode (L, A, W) für die Protein-Cluster (CMP-Motiv). Damit konnten CD26 und CD29 als Leitproteine auf den Zellenoberflächen von Zellen von Prostatagewebe eines Patienter» identifiziert werden kann, der von Prostatakrebs betroffen ist.
Tabelle 2
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Figure imgf000025_0001
Fig. 5 zeigt eine Darstellung der selektiven Expression des Prostatakrebs- spezifischen CMPs in subzellulären Stellen von neoplastischen Prostata Acini. Fig. 5 veranschaulicht die selektive Expression von CMP1 in subzellulären Stellen von neoplastischen Prostata Acini. CMP1 ist die häufigste CMP innerhalb des CMP-Motiv der Tabelle 2. Fig. 5a zeigt eine Übersicht, in der Pfeil 1 und Pfeil 2 apikale Stellen von sekretorischen Zellen kennzeichnen, während Pfeil 3 Projektionen an der baso- lateralen Stelle eines Acinus kennzeichnet. Fig 5 b-c zeigen Details, die durch Pfeile gekennzeichnet sind. Man erkennt die ringförmige Anordnung des CMP1 (braune Farbe) mit dem Zelloberflächenfluoreszenzsignal von CD133 (weiß). "BE" bedeutet basale epitheliale Zellschicht, (Bars: 5 ai 100 μηι; 5 b-d:. 10 μηη)
Dementsprechend kann Prostatakrebs analog zur ALS durch extrakorporales Entfer- nen von Bestandteilen und Zellen behandelt werden, welche CMPs aufweisen, die zumindest CD26 und/oder CD29 als krankheitsspezifische Leitproteine umfassen. Hierzu kann beispielsweise ein Apherese- bzw. Photophereseverfahren verwendet werden, bei welchem die CD28/CD29 exprimierenden Zellen in der oben beschriebenen Weise abgetrennt und/oder inaktiviert bzw. zerstört werden.
Fig. 6 zeigt eine Illustration der zyklischen Lokalisierung von 25 Biomolekülen und die nachfolgende Ermittlung der CMPs mit Hilfe des ELK/ICM Verfahrens, Fig. 8a zeigt eine optische Ebene aus 20 gemeisam gemappten Ebenen in der z-Richtung und dient zur Veranschaulichung der Fluoreszenzsignale der in Fig. 7 angegebenen Biomoleküle. Fig. 6b veranschaulicht die Binarisierung der parallel gezeigten Primärsignale von Fig. 6a. Fig. 6c zeigt 2D-Karten der resultierenden kombinatorischen molekularen Phänotypen (CMPs), die für alle Datenpunkte aus dem binären Datensatz (Fig. 6b) berechnet werden. Fig. 6d zeigt zwei beispielhafte CMPs aus den Datenpunkten (Fig. 6b).
Fig. 7 zeigt Toponomabbildungen zur Gewebeorganisation eines kutanen Lymphoms (Bars: in a-d, j: 10 μΐτι, in f, g, k: 1 μιτι). Fig. 7a zeigt eine 3D-Cokartierung von 3213 CMPs (aus 7161 CMPs) innerhalb eines Bereichs einer Kryosektion einer von einem kutanen Lypmhom (Mycosis fungoides) betroffenen Gewebeprobe eines Patienten gemäß Fig. 7b (eingekastelter Bereich). Unterschiedliche CMPs sind mit unterschiedlichen Farben kodiert. Fig. 7b zeigt ein Phasenkontrastbild der kryogenen Hautsektion, in der Nuclei für Histone blau eingefärbt sind, während die Basaliamina für CD49f weiß gefärbt ist. Fig. 7c zeigt eine Vergrößerung des eingekastelten Bereichs (Fig. 7b) und ist identisch wie Fig. 7d ausgerichtet, in welcher die Leitproteine der CMPs von Fig. 7a gezeigt sind. Man erkennt einen länglichen multizellulären
Komplex von fünf Zelltypen (Zellen 1 -5 in a, d, c). Eine längliche Zellprojektion (Pfeil 1 in a) der Zellen 3, 4, 5 erstreckt sich von der Dermis über die Basaliamina (a, BL) in die Epidermis, wo sie nahe an CD8+/CD3+ T-Zellen liegt (Zelle 2 in a, c, d, braune Farbe in d und benachbarter Keratinozyt (Zelle 1 in a, c, d)). Fig. 7e zeigt Details eines suprabasalen Teils dieser Struktur aus unterschiedlichem Blickwinkel (e, f, g, h). Eine Zytokeratin-enthaltende Zellprojektion (CK) erstreckt sich vom Keratinozyt (e, Pfeil) weg und projiziert durch die CD8+/CD3+ T-Zelloberfläche (vergleiche h, welche CK in grün zeigt; vergleiche g, welche das gleiche ohne CK zeigt). Fig 7k zeigt einen transversen virtuellen anatomischen Schnitt durch die CD8+/CD3+ T-Zelle (Zelle 2 in j). Die Projektion des Keratinozyten dringt in die T-Zelle ein (Pfeil). Fig 7i zeigt eine Liste der kokartieren Moleküle. Fig. 71 spezifiziert das für das kutane Lymphom charakteristische CMP-Motif:
L: HLA-DQ
A: CD2, CD10, CD18, CD54, CD57, CD58, CD62L, CD80
W: CD3, CD4, CD7, CD8, CD13» CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD56, CD71 , HLA-DR, Cytok., Histone.
Dementsprechend kann das kutane Lymphom analog zur ALS durch extrakorporales Entfernen von Bestandteilen und Zellen behandelt werden, welche CMPs aufweisen, die zumindest HLA-DQ als krankheitsspezifisches Leitprotein umfassen. Hierzu kann beispielsweise ein Apherese- bzw. Photophereseverfahren verwendet werden, bei welchem die HLA-DQ exprimierenden Zellen in der oben beschriebenen Weise abgetrennt und/oder inaktiviert bzw. zerstört werden.
Das Verfahren kann daher grundsätzlich eine Kombination der Toponomtechnologie mit Verfahren der Isolierung von Zellen aus Körperflüssigkeiten und/oder Geweben umfassen. Durch Anwendung der Toponomtechnologie können Zellen durch
Kokartierung von tausenden Multiproteinkomplexen extrem genau klassifiziert werden. Auf diese Weise werden die krankheitsspezifische Zellen bzw. CMPs gefunden. Die betreffenden Zellen können dann mit Hilfe an sich bekannter
Verfahren gezielt isoliert werden und für diverse Zwecke weiter verwendet werden, z. B. Klonierung, extrakorporale Expansion, Re-Transfer in Gewebe bzw. Blut, therapeutische Anwendungen etc. Ein besonderer Aspekt ist die Isolierung von krankheitsspezifischen Zellen aus der Blutzirkulation, die als autoimmune Zellen oder aberrante Zellen des Immunsystems in Organe einwandern, wo sie gezielt Gewebestrukturen zerstören. In dem letzteren Fall wäre z. B. die Isolierung solcher Zellen aus der Blutzirkulation durch eine therapeutische Apherese/Photopherese durch eine therapeutische Apherese/Photopherese eine sehr zielgerichtete Massnahme mit dem Ziel des Stopps der Krankheitsprogression, da die krankheitsspezifischen Zellen durch hochdimensionale Toponomkartierung exakt vordefiniert werden können, sodass sie gezielt über antikörperbasierte Isolierung aus der Zirkulation ent- fernt werden können. Ober konsekutives Monitoring mittels Toponomkartierung des Blutes kann die Effizenz des Verfahrens kontrolliert werden. Ein weiterer Vorteil besteht in der Verwendung solcher Zellen für die Entwicklung von Medikamenten zur selektiven Blockierung / Eliminierung solcher Zellen oder, im Falle von Stammzellen, zur Reinfusion in den Organismus (z. B. therapeutische Organregenration oder Tu- mortherapie), oder zur Verwendung für die Entwicklung von Diagnostika, oder für die Therapie der amyotrophen Laterasklerose (ALS) oder anderer Erkrankungen durch Entfernung von pathogenen Zellen aus der Blutzikulation, um deren biologischen Mechanismus, im Fall von ALS die Invasion in das Motoneuronsystem und deren neurotoxische Schädigungsmechanismen, zu verhindern.
Fig, 8 zeigt eine schematische Darstellung des Pathomechanismus der ALS. Eine normale bzw. gesunde T-Zelle 10 reift zunächst in einer extrathymischen Umgebung 12 (Haut) und wird in den Blutstrom 14 abgegeben. Aufgrund fehlender Hönning- Codes kann (und soll) die normale T-Zelle 10 nicht in das pyramidale System 16 eindringen, welches bei Säugetieren für die Feinmotorik und die willkürliche Motorik zuständig ist. Demgegenüber stellen„ALS-Zellen" 18 aberrante T-Zellen mit einem fehlerhaften Homing-Code dar, der durch die vorstehend beschriebenen CMPs charakterisiert werden kann. Dementsprechend können im Blut zirkulierende ALS-Zellen 18 aus dem Blut in das pyramidale System 16 eindringen, wo sie Neuronen axoto- mieren, was zu einer Degeneration des motorischen Nervensystems und damit zum ALS-typischen Krankheitsbild mit fortschreitender Lähmung des Patienten führt. Ziel einer ALS-Behandlung muss es daher sein, die Entstehung von ALS-Zellen 18 und/oder die Invasion von bereits vorhandenen ALS-Zellen 18 in das pyramidale System 16 zu verhindern. Beispielsweise können ALS-Zellen 18 durch Blockierung der Leitproteine und/oder durch Induktion von Apoptose deaktiviert werden (deaktivierte ALS-Zellen 18'), wodurch sie ihre biologische Funktionalität verlieren und nicht länger in das pyramidale System 16 einwandern können. Fig. 9 zeigt eine schematische Darstellung einer Therapie von ALS, Aberrante ALS- Zellen 18 reifen wie bereits erwähnt in einer extrathymischen Umgebung 12 (Haut) und werden in den Blutstrom 14 abgegeben. Durch eine therapeutische Behandlung 20 des Blutes 14, beispielsweise durch Photopherese und/oder durch Deaktivierung der ALS-Leitproteine CD8 und CD16 durch Quervernetzung mit bi- oder multispezifischen Antikörpern, werden die im Biutstrom 14 zirkulierenden ALS-Zellen 18 apopo- totisch (deaktivierte ALS-Zeile 18') und können nicht länger in das pyramidale System 16 einwandern. Es bilden sich apoptotische Körper 22 der deaktivierten ALS- Zellen 18'. Diese apoptotischen Körper 22 werden von benachbarten Zellen 24 auf- genommen (Phagozytose) und abgebaut. Dabei werden die apoptotischen Körper 22 auch dem Immunsystem präsentiert. Nach derzeitigem Wissensstand ist mit hoher Wahrscheinlichkeit davon auszugehen, dass durch diesen Mechanismus auch eine körpereigene Immunantwort gegen die aberranten ALS-Zeilen 18 induziert werden kann, so dass die extrathymische Reifung der aberranten ALS-Zellen 18 zumindest teilweise unterbunden werden kann und die Zahl der nachgebildeten ALS-Zeilen 18 abnimmt.
Die in den Unterlagen angegebenen Parameterwerte zur Definition von Prozess- und Messbedingungen für die Charakterisierung von spezifischen Eigenschaften des Er- findungsgegenstands sind auch im Rahmen von Abweichungen - beispielsweise aufgrund von Messfehlern, Systemfehlern, Einwaagefehlern, DIN-Toleranzen und dergleichen - als vom Rahmen der Erfindung mitumfasst anzusehen.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zum extrakorporalen Entfernen von pathogenen und/oder überzähligen Bestandteilen aus einer Zellprobe eines menschlichen oder tierischen Patienten, der unter einer Erkrankung leidet, folgende Schritte umfassend: a) Ermitteln wenigstens eines Proteinclusters (CMP), das für die Erkrankung des Patienten charakteristisch ist;
b) Bereitstellen der Zellprobe des Patienten; und
c) extrakorporales Entfernen von Bestandteilen, die das wenigstens eine ermittelte CMP aufweisen, aus der Zellprobe.
Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass
als Zellprobe eine Körperflüssigkeit, insbesondere Blut und/oder Blutplasma, und/oder eine Gewebeprobe des Patienten bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, dass
das wenigstens eine CMP anhand einer Datenbank und/oder mittels eines Multi-Epitop-Ligand-Kartographie (MELK) bzw. ICM-Verfahrens (Multi-Epitop- Ligand Kartographie/Imaging Cycler Mikroskopie) und/oder mittels eines MELK-Robotersystems ermittelt wird und/oder dass das extrakorporale Entfernen der Bestandteile mittels eines MELK bzw. ICM-Verfahrens und/oder mittels eines MELK-Robotersystems überwacht und/oder kontrolliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Erkrankung eine Tumorerkrankung und/oder eine Entzündungserkrankung ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, dass das extrakorporale Entfernen mittels eines Aphereseverfahrens und/oder mittels einer Apheresevorrichtung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass
als Aphereseverfahren eine unselektive Apherese und/oder eine selektive Apherese und/oder eine Vollblutapherese und/oder eine Photopherese durchgeführt wird und/oder dass die Apheresevorrichtung zur Durchführung wenigstens eines Aphereseverfahrens aus der Gruppe unselektive Apherese, selektive Apherese, Vollblutapherese und Photopherese ausgebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, dass
zum extrakorporalen Entfernen wenigstens ein Streptamer und/oder wenigstens ein Antikörper und/oder wenigstens ein Ligand, insbesondere ein variables Einzelkettenfragment (scFv) und/oder ein multivalentes Antikörperfragment (scFv Multimer), verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet, dass
das wenigstens eine Streptamer und/oder der wenigstens eine Antikörper und/oder der wenigstens eine Ligand ein für die Erkrankung charakteristisches Leitprotein spezifisch bindet und/oder inaktiviert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist und/oder dass die Zellprobe eine Blutprobe des Patienten ist und/oder dass das wenigstens eine CMP eines oder mehrere aus der Gruppe CD16, CD8, NeuN, Bax, Bcl2, CD11b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 umfasst und/oder dass die Bestandteile mittels wenigstens eines Antikörpers und/oder Liganden, welcher mindestens eines aus der Gruppe CD16, CD8, NeuN, Bax, Bcl2, CD11 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2,
PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 bindet, und/oder mittels eines CD16- Ectodomain-Shedding-Moleküls extrakorporal entfernt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet, dass
zum extrakorporalen Entfernen ein Antikörper und/oder Ligand verwendet wird, welcher zwei oder mehr aus der Gruppe CD16, CD8, RAC1 , STAP2 und SMAD2 bindet.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Erkrankung Prostatakrebs ist und/oder dass die Zellprobe Prostatagewebe ist und/oder dass das wenigstens eine CMP eines oder mehrere aus der Gruppe CD26 und CD29 umfasst und/oder dass die Bestandteile mittels wenigstens eines Antikörpers und/oder Liganden, welcher mindestens eines aus der Gruppe CD26 und CD29 bindet, extrakorporal entfernt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass
das wenigstens eine CMP auch CD44 und/oder CD54 und/oder CD138 umfasst und/oder bei welchem mindestens eines von CD3, CD4, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20, CD38, CD49d, CD58 und CD80 fehlt.
13. Verfahren nach Anspruch 1 1 oder 12,
dadurch gekennzeichnet, dass zum extrakorporalen Entfernen ein Antikörper und/oder Ligand verwendet wird, welcher mindestens eines oder mehrere aus der Gruppe CD26, CD29, CD44, CD54 und CD138 bindet.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Erkrankung ein kutanes Lymphom ist und/oder dass die Zellprobe eine Hautprobe ist und/oder dass das wenigstens eine CMP eines oder mehrere aus der Gruppe HLA-DQ, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD13, CD18, CD18, CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD71 , CD80 und HLA-DR umfasst und/oder dass die Bestandteile mittels wenigstens eines Antikörpers und/oder Liganden, welcher mindestens eines aus der Gruppe HLA-DQ, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD13, CD18, CD18, CD26, CD29, CD36, CD44, CD45, CD49f, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD71 , CD80 und HLA-DR bindet, extrakorporal entfernt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Zellprobe nach dem teilweisen oder vollständigen extrakorporalen Entfernen der Bestandteile, die das wenigstens eine ermittelte CMP aufweisen, dem Patienten wieder zurückgeführt wird.
16. Vorrichtung, welche zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 ausgebildet ist. 17. Vorrichtung nach Anspruch 16, welche zur Durchführung wenigstens eines
Aphereseverfahrens aus der Gruppe unselektive Apherese, selektive Aphere- se, Vollblutapherese und Photopherese ausgebildet ist.
18. Streptamer und/oder Antikörper und/oder Ligand zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
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