JPWO2017170597A1 - 血中でハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、IVIGの代替とし得る、Fcγ受容体に対して高い結合活性を有する抗体、該抗体をコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる抗体の製造方法、該抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤を提供することを目的とする。本発明は、配列番号70で表されるアミノ酸配列からなるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、該ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成するモノクローナル抗体に関する。
Description
本発明は、血中でヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成し、Fcγ受容体に対して高い結合活性を有する抗体、該抗体をコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる抗体の製造方法、該抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤に関する。
静注用免疫グロブリン(Intravenous Immunoglobulin:IVIG)は健康な人の血漿に由来するIgGを高純度に精製した血液製剤である。低ガンマグロブリン血症又は無ガンマグロブリン血症などに対しては感染防御を目的として用いられ、自己免疫疾患に対しては免疫抑制を目的として用いられている。
IVIGの具体的な例としては、例えば、田辺三菱製薬社のヴェノグロブリンIH、帝人ファーマ社のベニロン−I、日本赤十字社のポリグロビンN、バクスター社のガンマガード、日本製薬社のグロベニン−I、CSLベーリング社のプリビジェンなどが挙げられる。
IVIGの薬効メカニズムとしては、様々な説が提唱されている。例えば、マクロファージ細胞表面上のFcγ受容体(FcγR)の阻害、マクロファージにおけるFcγR II bの発現上昇を介した貪食機能の抑制、シアリル化抗体によるマクロファージでのFcγR II bの発現上昇、B細胞の増殖抑制やアポトーシス誘導、B細胞の自己抗体産生抑制、抗イディオタイプ抗体による自己抗体の中和、自己抗体による補体の消費の阻害、サイトカインやT細胞の機能阻害などである(非特許文献1、2)。
FcγRの阻害に基づくIVIGの薬効は、例えば、免疫性血小板減少症[ITP、特発性(免疫性)血小板減少性紫斑病とも言う]の治療においてもたらされる。ITPは、血小板に対する自己抗体により、オプソニン化された血小板が網内系で各種FcγRを介してマクロファージに貪食されることにより発症する(非特許文献1)。
従って、IVIGは、FcγRを阻害することにより、血小板が貪食されることを阻害すると考えられている(非特許文献3)。実際に、Macrogenics社のFcγR III a抗体(製品名GMA161)は、開発はPhase Iで中断されたものの、ITPにおける薬効が確認されている(ClinicalTrials.gov NCT00244257)(非特許文献4)。
IVIGによるFcγRの阻害は、IVIGに含まれる抗体と血清タンパク質が形成する様々な免疫複合体(Immune Complex:IC)や、IVIGに含まれる抗体のダイマーあるいは凝集体などの成分により増強されるという仮説も提唱されている(非特許文献5)。
特に、Lemieuxらは、IVIGには自己の血清タンパク質に反応する成分が最大で3%程度含まれており、該成分が血清と混合された時に可溶性免疫複合体を形成することを示している(非特許文献6、7)。また、マウスのITPモデルに対して可溶性免疫複合体がIVIGよりも高い比活性を持つことが示されている(非特許文献8)。
これらの知見は、IVIGに含まれる成分が血清タンパク質と結合することにより、FcγRを介した自己組織に対する貪食機能を阻害する免疫抑制効果を示すことを示唆している。実際に、自己抗体を精製して自己免疫疾患治療に使用するという概念も提唱されている(特許文献1)。
さらに、自己免疫疾患に対するIVIGの投与量は、基本処方で1日0.4g/kgの連続5日間投与と極めて高用量であることが知られている。高用量投与は、血栓症などの副作用、点滴による長い投与時間などの問題を齎す(非特許文献9)。従って、IVIGを比活性が高い有効成分からなる薬剤に置き換え、用量を減らすニーズは高いと考えられる。
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IVIGに含まれる有効成分を同定し、IVIGの代替とすることは、高用量のIVIGを投与しなければならない自己免疫疾患治療をより簡便にし得る手段として期待されている。したがって、本発明は、IVIGの代替とし得る、Fcγ受容体に対して高い結合活性を有する抗体、該抗体をコードするDNA、該DNAを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる抗体の製造方法、該抗体を有効成分とする自己免疫疾患治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、IVIGから有効成分を同定する目的で、FcγR III a(CD16a)を固相化したカラムを用い、IVIGと血清の混合液に含まれる、CD16aに対する高い結合活性を有するIgG成分の分離と同定を試みた。
その結果、再現性よく高い該結合活性が検出されるIgG成分として、血清タンパク質であるハプトグロビン(Haptpglobin;Hp、以下Hpと表記する場合もある)を認識するIgG成分を同定した。該成分は、IVIG中の有効成分の一つであると考えられる。
そこで、抗Hp抗体の取得を試みたところ、該抗体及びHpからなる免疫複合体を形成することにより、IVIGよりも強くCD16aに結合する抗Hp抗体の取得に成功し、本発明を完成させた。
本発明は、以下の(1)〜(22)に関する。
(1)配列番号70で表されるアミノ酸配列からなるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、該ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成するモノクローナル抗体。
(2)以下の(a)〜(d)から選ばれる1の抗体と競合して配列番号70で表されるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、前記抗体が結合するヒトハプトグロビンに含まれるエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体。
(a)相補鎖決定領域(complementarity determining region、以下、CDRと記す)1〜3がそれぞれ配列番号31、32及び33で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖(以下、H鎖と記す)を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号34、35及び36で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖(以下、L鎖と記す)を含む抗体
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号37、38及び39で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号40、41及び42で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(d)配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(3)以下の(a)〜(d)から選ばれる1のモノクローナル抗体。
(a)CDR1〜3がそれぞれ配列番号31、32及び33で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号34、35及び36で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号37、38及び39で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号40、41及び42で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(d)配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(4)配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、44番目のPhe及び49番目のGluに結合する、(1)〜(3)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(5)配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、155番目のSer、156番目のThr及び157番目のValに結合する、(1)〜(3)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(6)遺伝子組換え抗体である、(1)〜(5)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(7)ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、(6)に記載のモノクローナル抗体。
(8)モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトFcγ受容体III、ヒトFcγ受容体II及びヒトFcγ受容体Iからなる群から選ばれる少なくとも1つのヒトFcγ受容体に結合する、(1)〜(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(9)モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体2分子及びヒトハプトグロビン1分子を含む、(1)〜(8)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(10)抗体のFc領域に結合するN−グリコシド結合糖鎖の還元末端N−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、(1)〜(9)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(11)(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体をコードするDNA。
(12)(11)に記載のDNAを含有する組換え体ベクター。
(13)(12)に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
(14)(13)に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、培養物から該抗体を採取することを特徴とする(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
(15)(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
(16)(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体と薬理学的に許容される担体を含む、自己免疫疾患治療剤。
(17)ヒトハプトグロビンに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とする自己免疫疾患治療剤。
(18)モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、(17)に記載の自己免疫疾患治療剤。
(19)モノクローナル抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、(18)に記載の自己免疫疾患治療剤。
(20)モノクローナル抗体が、ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体である、(17)〜(19)のいずれか1に記載の自己免疫疾患治療剤。
(21)モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトFcγ受容体III、ヒトFcγ受容体II及びヒトFcγ受容体Iからなる群から選ばれる少なくとも1つのヒトFcγ受容体に結合する、(17)〜(20)のいずれか1に記載の自己免疫疾患治療剤。
(22)モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体2分子及びヒトハプトグロビン1分子を含む、(20)又は(21)に記載の自己免疫疾患治療剤。
(1)配列番号70で表されるアミノ酸配列からなるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、該ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成するモノクローナル抗体。
(2)以下の(a)〜(d)から選ばれる1の抗体と競合して配列番号70で表されるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、前記抗体が結合するヒトハプトグロビンに含まれるエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体。
(a)相補鎖決定領域(complementarity determining region、以下、CDRと記す)1〜3がそれぞれ配列番号31、32及び33で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖(以下、H鎖と記す)を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号34、35及び36で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖(以下、L鎖と記す)を含む抗体
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号37、38及び39で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号40、41及び42で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(d)配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(3)以下の(a)〜(d)から選ばれる1のモノクローナル抗体。
(a)CDR1〜3がそれぞれ配列番号31、32及び33で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号34、35及び36で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号37、38及び39で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号40、41及び42で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(d)配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(4)配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、44番目のPhe及び49番目のGluに結合する、(1)〜(3)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(5)配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、155番目のSer、156番目のThr及び157番目のValに結合する、(1)〜(3)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(6)遺伝子組換え抗体である、(1)〜(5)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(7)ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、(6)に記載のモノクローナル抗体。
(8)モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトFcγ受容体III、ヒトFcγ受容体II及びヒトFcγ受容体Iからなる群から選ばれる少なくとも1つのヒトFcγ受容体に結合する、(1)〜(7)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(9)モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体2分子及びヒトハプトグロビン1分子を含む、(1)〜(8)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(10)抗体のFc領域に結合するN−グリコシド結合糖鎖の還元末端N−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、(1)〜(9)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体。
(11)(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体をコードするDNA。
(12)(11)に記載のDNAを含有する組換え体ベクター。
(13)(12)に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
(14)(13)に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、培養物から該抗体を採取することを特徴とする(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
(15)(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
(16)(1)〜(10)のいずれか1に記載のモノクローナル抗体と薬理学的に許容される担体を含む、自己免疫疾患治療剤。
(17)ヒトハプトグロビンに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とする自己免疫疾患治療剤。
(18)モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、(17)に記載の自己免疫疾患治療剤。
(19)モノクローナル抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、(18)に記載の自己免疫疾患治療剤。
(20)モノクローナル抗体が、ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体である、(17)〜(19)のいずれか1に記載の自己免疫疾患治療剤。
(21)モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトFcγ受容体III、ヒトFcγ受容体II及びヒトFcγ受容体Iからなる群から選ばれる少なくとも1つのヒトFcγ受容体に結合する、(17)〜(20)のいずれか1に記載の自己免疫疾患治療剤。
(22)モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体2分子及びヒトハプトグロビン1分子を含む、(20)又は(21)に記載の自己免疫疾患治療剤。
本発明の抗体はヒトハプトグロビンと結合して多価の免疫複合体を形成することにより、該抗体のFcドメインにおいてCD16aと結合し、抗体依存性細胞傷害(ADCC)反応をIVIGよりも強力に阻害する。したがって、本発明により、ヒトハプトグロビンに結合する抗体を有効成分として含有する自己免疫疾患治療剤が提供される。
ヒトハプトグロビンは、1つのα鎖と1つのβ鎖からなるサブユニット(以下、α/β−サブユニットと記す)が2つ以上結合した糖タンパク質である。ヒトハプトグロビンの合成過程は3段階に分けられる。
第1段階目では、1つのオープンリーディングフレームにコードされているα鎖とβ鎖が連結して1本のポリペプチドとして発現する。
第2段階目では、ポリペプチドのα鎖間のジスルフィド結合によって2本以上のポリペプチドによって構成されるハプトグロビン前駆体を形成する。同時に、ポリペプチドの分子内でもα鎖とβ鎖の間にジスルフィド結合を形成する。
第3段階目では、ポリペプチドが特異的なタンパク質分解によりα鎖とβ鎖に分離され、α鎖とβ鎖がジスルフィド結合を形成したα/β−サブユニットとなる。以上の過程によって、ヒトハプトグロビンは、前記のα/β−サブユニットが2つ以上結合した構造を形成する[Redox Rep., 6,379(2001)]。
本発明におけるヒトハプトグロビンは、α/β−サブユニットが4つ結合したものを基本構造とする。この、α鎖とβ鎖を連結してコードするヒトハプトグロビン遺伝子には、2種類の遺伝子多型が存在し、それぞれ、GenBankアクセッション番号NM_005143.3(配列番号67)又はNM_001126102.1(配列番号68)で示される。これら遺伝子の違いは、α鎖をコードする部分にあり、β鎖をコードする部分は同一である。
具体的には、配列番号67では、α鎖のエキソン3及びエキソン4領域が重複している。この重複している領域にシステイン残基がコードされているため、配列番号67が翻訳されて生成するα鎖を含むハプトグロビンは、ジスルフィド結合によりα/β−サブユニットが3つ以上結合した、より大きな多量体を形成し得る[J.Biochem.Mol.Biol.,40,1028(2007)]。
α鎖のアミノ酸配列はGenBankアクセッション番号NP_005134.1(配列番号65)の19番目から160番目のアミノ酸配列(配列番号69)、又はNP_001119574.1(配列番号66)の19番目から101番目のアミノ酸配列(配列番号71)で表される。β鎖のアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NP_005134.1(配列番号65)の162番目から406番目のアミノ酸配列(配列番号70)、又はNP_001119574.1(配列番号66)の103番目から347番目のアミノ酸配列(配列番号70)で表される。
本発明におけるヒトハプトグロビンとしては、α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列を含み、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチド、α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列において、α鎖及び/又はβ鎖の1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチド、α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列と、α鎖及び/又はβ鎖が60%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチド並びにα鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるα鎖及び/又はβ鎖のアミノ酸配列を含み、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。また、本発明におけるヒトハプトグロビンとしては、日本血液製剤機構が販売しているヒトハプトグロビンなどが挙げられる。
ヒトハプトグロビンの機能としては、溶血によって血液中に遊離されたヘモグロビンと特異的に結合して免疫複合体を形成し、尿中への遊離ヘモグロビンの喪失を防ぐことにより、体内からの鉄の漏出や、遊離ヘモグロビンによる酸化的血管障害及び腎細尿管障害を防ぐことが挙げられる。
α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で示されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得る方法としては、部位特異的変異導入法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987−1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]などを用いて、例えば配列番号69、70又は71で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA、即ち、ヒトハプトグロビンをコードする遺伝子に、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは1個〜数十個、例えば、1〜20個、より好ましくは1個〜数個、例えば、1〜5個のアミノ酸である。
ヒトハプトグロビンをコードする遺伝子としては、配列番号67又は配列番号68で表される塩基配列が挙げられる。配列番号67又は配列番号68で表される塩基配列において、1以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつヒトハプトグロビンの機能を有する蛋白質をコードするDNAを含む遺伝子、配列番号67又は配列番号68で表される塩基配列と少なくとも60%以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは80%以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは95%以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチドをコードするDNAを含む遺伝子、並びに配列番号67又は配列番号68で表される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなり、かつヒトハプトグロビンの機能を有するポリペプチドをコードするDNAを含む遺伝子なども本発明のハプトグロビンをコードする遺伝子に包含される。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、配列番号67又は配列番号68で表される塩基配列を有するDNAをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はDNAマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なDNAを意味する。
具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のDNA、又は該配列を有するPCR産物若しくはオリゴDNAを固定化したフィルター又はスライドガラスを用いて、0.7〜1.0mol/Lの塩化ナトリウム存在下、65℃にてハイブリダイゼーション[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987−1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University,(1995)]を行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mmol/L塩化ナトリウム、15mmol/Lクエン酸ナトリウムよりなる)を用い、65℃条件下でフィルター又はスライドグラスを洗浄することにより同定できるDNAを挙げることができる。
ハイブリダイズ可能なDNAとしては、配列番号67又は配列番号68で表される塩基配列と少なくとも60%以上の相同性を有するDNA、好ましくは80%以上の相同性を有するDNA、さらに好ましくは95%以上の相同性を有するDNAを挙げることができる。
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明で用いるハプトグロビンをコードする遺伝子に包含される。
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、BLAST2[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997)、Genome Res.,7,649(1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
デフォルトのパラメータとしては、G(Cost to open gap)が塩基配列の場合は5、アミノ酸配列の場合は11、−E(Cost to extend gap)が塩基配列の場合は2、アミノ酸配列の場合は1、−q(Penalty for nucleotide mismatch)が−3、−r(reward for nucleotide match)が1、−e(expect value)が10、−W(wordsize)が塩基配列の場合は11残基、アミノ酸配列の場合は3残基、−y[Dropoff(X)for blast extensions in bits]がblastn の場合は20、blastn以外のプログラムでは7、−X(X dropoff value for gapped alignment in bits)が15及びZ(final X dropoff value for gapped alignment in bits)がblastn の場合は50、blastn以外のプログラムでは25である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを得る方法としては、例えば、配列番号69、70又は71で表されるアミノ酸配列をコードするDNAの一部を欠失させ、これを含む組換え体ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
また、α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列の部分配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも、前述の部位特異的変異導入法などを用いて得ることができる。
さらに、α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、あるいは、α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列の部分配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)法又はt−ブチルオキシカルボニル(tBoc)法などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明のモノクローナル抗体(以下、本発明の抗体ともいう)は、ヒトハプトグロビンのうち、β鎖のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合する抗体であり、血中で多価の免疫複合体を形成する。
本発明におけるヒトハプトグロビンの立体構造としては、α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列を含むヒトハプトグロビンが天然状態で取り得る構造と同等の効能を有していれば、いずれの構造でもよい。ヒトハプトグロビンが天然状態で取り得る立体構造とは、ヒトハプトグロビンの天然型の立体構造のことをいう。
本発明における、多価の免疫複合体とは、具体的には、少なくとも2分子の本発明の抗体及び少なくとも1分子のヒトハプトグロビンを含む免疫複合体が挙げられる。該免疫複合体に少なくとも抗体2分子及びヒトハプトグロビン1分子を含むことにより、CD16及びCD32に対する高い結合活性を示し、ADCC反応に対する優れた阻害活性を示す。
前記1分子のヒトハプトグロビンには、配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列を有する1つのα鎖及び配列番号70で表されるアミノ酸配列を有する1つのβ鎖からなるα/β−サブユニットが4つ含まれる。
本発明のモノクローナル抗体及びヒトハプトグロビンが結合して形成される多価の免疫複合体の分子量は5×105以上であることが好ましく、7×105以上であることがより好ましい。該免疫複合体の分子量が5×105以上であることにより、CD16及びCD32に対する高い結合活性を示し、ADCC反応に対する優れた阻害活性を示す。
本発明の抗体が多価の免疫複合体を形成することは、例えば、HPLC等を用いたゲルろ過クロマトグラフィーで確認することができる。
本発明の抗体が形成する免疫複合体が、少なくとも2分子の本発明の抗体及び少なくとも1分子のヒトハプトグロビンを含むことは、免疫複合体の分子量から確認できる。免疫複合体の分子量は、例えば、HPLC等を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって該免疫複合体を分離及び検出することにより、測定することができる。本発明の抗体の分子量が約150kDaであること及びヒトハプトグロビンの分子量が約200〜220kDaであることから、該免疫複合体に含まれる抗体と抗原の分子数を算出することができる。
本発明の抗体としては、具体的には、配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、44番目のPhe(フェニルアラニン)及び49番目のGlu(グルタミン酸)に結合する抗体が挙げられる。また、本発明の抗体としては、具体的には、配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、155番目のSer(セリン)、156番目のThr(スレオニン)及び157番目のVal(バリン)に結合する抗体が挙げられる。
前記抗体として、具体的には、以下の(a)又は(b)のモノクローナル抗体が挙げられる。
(a)CDR1〜3がそれぞれ配列番号31、32及び33で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号34、35及び36で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号37、38及び39で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号40、41及び42で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(a)CDR1〜3がそれぞれ配列番号31、32及び33で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号34、35及び36で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号37、38及び39で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号40、41及び42で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
また、本発明のモノクローナル抗体としてより具体的には、以下の(c)又は(d)のモノクローナル抗体が挙げられる。
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(d)配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(d)配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
さらに、本発明のモノクローナル抗体としては、前記モノクローナル抗体と競合して、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、前記モノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンに含まれるエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体を挙げることができる。
本発明において、モノクローナル抗体と競合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体と同一又は部分的に同一のエピトープ(抗原決定基ともいう)を有し、該エピトープに結合する抗体をいう。本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体が認識するヒトハプトグロビンのアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合する抗体をいう。
本発明のモノクローナル抗体が、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造に結合することは、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法(ELISA)、ウエスタンブロット法、免疫組織染色(IHC)法、公知の免疫学的検出法等、特定の抗原と特定抗原に対する抗体の結合活性を調べる方法により確認することができる。
具体的には、FMAT8100HTSシステム(アプライドバイオシステム社製)などを用いる蛍光抗体染色法[Cancer Immunol.Immunother.、36、373(1993)]、フローサイトメトリーを用いる蛍光染色法、Biacoreシステム(GEヘルスケア社製)などを用いた表面プラズモン共鳴、ITC(DKSH社製)などを用いた等温滴定カロリメトリーなどの方法が挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体が、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造に結合することを、Biacoreシステム(GEヘルスケア社製)などを用いた表面プラズモン共鳴で確認する場合は、抗IgG抗体をセンサーチップCM5にアミンカップリング法により固定した後、該抗体を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度のヒトハプトグロビン又はその融合体を流し、結合、解離を測定するのが好ましい。
また、その他の公知の免疫学的検出法[Monoclonal Antibodies−Principles and Practice、Third edition、Academic Press(1996)、Antibodies - A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)]などを組み合わせて確認することもできる。
本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより産生される抗体、又は抗体遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換した形質転換体により産生される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ(抗原決定基ともいう)を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列(1次構造)が均一であることが特徴である。
エピトープとしては、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列及び該アミノ酸配列からなる立体構造並びに翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列及び該アミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列としては、O結合型糖鎖が付加されたアミノ酸配列(糖鎖がOH置換基を有するスレオニン及びセリンに結合)、N結合型糖鎖が付加されたアミノ酸配列(NH2置換基を有するグルタミン及びアスパラギンに結合)、並びに硫酸基が付加されたアミノ酸配列(硫酸分子がOH置換基を有するスレオニンに結合)などが挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンのエピトープは、ヒトハプトグロビンの一部のドメインを欠失させた欠損体、ヒトハプトグロビンの一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換させた変異体、他のタンパク質由来のドメインと置換させたヒトハプトグロビン変異体及びヒトハプトグロビンの部分ペプチド断片等に対する、本発明のモノクローナル抗体の結合活性を調べることにより決定することができる。
また、本発明のモノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンのエピトープは、タンパク質分解酵素にて消化したヒトハプトグロビンに本発明の抗体を添加し、既知の質量分析法を用いたエピトープマッピングを行うことによっても決定することができる。
本発明のモノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンのエピトープは、ハプトグロビンのβ鎖として配列番号70で示されるアミノ酸配列のうち、25番目から239番目のアミノ酸配列に含まれる。
本発明のモノクローナル抗体が結合するハプトグロビンのエピトープには、配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、44番目のPhe及び49番目のGluが含まれる。また、本発明のモノクローナル抗体が結合するハプトグロビンのエピトープには、配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、155番目のSer、156番目のThr及び157番目のValが含まれる。
ハイブリドーマは、例えば、上記のヒトハプトグロビンを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、又は該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水がん化させ、該培養液又は腹水を分離、精製することにより抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を取得することができる。
抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ又はラビットなどが用いられる。また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にin vitroで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
本発明において遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型CDR移植抗体、ヒト抗体など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体は、例えば上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVH及びVLとヒト抗体の重鎖定常領域(以下、CHと記す)及び軽鎖定常領域(以下、CLと記す)とからなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、VH及びVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体のCH及びCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用組換え体ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体組換え体ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン(以下、hIgと記す)に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはhIgGクラスのものが用いられ、さらにhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、又はhIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
さらに、本発明のキメラ抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、前記モノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンに存在するエピトープと同じエピトープに結合するキメラ抗体を挙げることができる。
ヒト型CDR移植抗体とは、ヒト化抗体という場合もあり、ヒト以外の動物の抗体のVH及びVLのCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVH及びVLの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型CDR移植抗体は、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体のVH及びVLのCDRのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のVH及びVLのフレームワーク領域(以下、FRと記す)に移植したV領域をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCH及びCLをコードする遺伝子を有する動物細胞用組換え体ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体組換え体ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはhIgGクラスのものが用いられ、さらにhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、又はhIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型CDR移植抗体のCLとしては、hIgに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型CDR移植抗体としては、具体的には、CDR1〜3がそれぞれ配列番号31〜33で表されるアミノ酸配列を含む抗体のVHを含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号34〜36で表されるアミノ酸配列を含む抗体のVLを含むヒト化抗体、並びに、CDR1〜3がそれぞれ配列番号37〜39で表されるアミノ酸配列を含む抗体のVHを含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号40〜42で表されるアミノ酸配列を含む抗体のVLを含むヒト化抗体が挙げられる。
さらに、本発明のヒト化抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、前記モノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビンに存在するエピトープと同じエピトープに結合するヒト化抗体を挙げることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により2本の完全なH鎖及び2本の完全なL鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスES細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ES細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
本発明のヒト抗体の具体例としては、抗体のVHが配列番号25及び抗体のVLが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含むヒト抗体、並びに、抗体のVHが配列番号27及び抗体のVLが配列番号28で表されるアミノ酸配列を含むヒト抗体などが挙げられる。
本発明の抗体が形成する多価の免疫複合体は、本発明の抗体のFc領域を介して、ヒトFcγ受容体に結合する。従って、本発明の抗体は、自己抗体がFcγ受容体に結合することで引き起こす反応を阻害することができる。
本発明の抗体が形成する多価の免疫複合体が結合するヒトFcγ受容体としては、ヒトIgG抗体のFc領域に特異的に結合するヒトFcγ受容体であればいずれも包含されるが、例えば、ヒトFcγ受容体III(CD16)、ヒトFcγ受容体II(CD32)及びヒトFcγ受容体I(CD64)が挙げられる。これらヒトFcγ受容体は、例えば、白血球やマクロファージなどの細胞表面に発現する。
ヒトFcγ受容体III[J. Exp. Med., 170, 481 (1989)]とは、重鎖γを有するヒトIgG抗体のFc領域と結合する活性を有する、ヒト細胞表面上に発現する3種類のFcγ受容体のうち、タイプIIIのFcγ受容体を意味する。ヒトFcγ受容体IIIには、別々の異なる遺伝子にコードされる2つのアイソフォームが存在し、ヒトFcγ受容体IIIa(CD16a、アロタイプV158及びF158を含む)とヒトFcγ受容体IIIb(CD16b、アロタイプFcγRIIIb−NA1及びアロタイプFcγRIIIb−NA2を含む)に分類される。本発明において、ヒトFcγ受容体IIIとは、いずれのアイソフォーム又はアロタイプも含まれる。
ヒトFcγ受容体II[J. Exp. Med., 170, 1369 (1989)]とは、重鎖γを有するヒトIgG抗体のFc領域と結合する活性を有する、ヒト細胞表面上に発現する3種類のFcγ受容体のうち、タイプIIのFcγ受容体を意味する。ヒトFcγ受容体IIには、別々の異なる遺伝子にコードされる3つのアイソフォームが存在し、ヒトFcγ受容体IIa(アロタイプH131[H型]及びR131[R型]を含む)、ヒトFcγ受容体IIb(FcγRIIb−1及びFcγRIIb−2を含む)、ヒトFcγ受容体IIcに分類される。本発明において、ヒトFcγ受容体IIIとは、いずれのアイソフォーム又はアロタイプも含まれる。
ヒトFcγ受容体I[J Biol Chem., 266, 13449 (1991)]とは、重鎖γを有するヒトIgG抗体のFc領域と結合する活性を有する、ヒト細胞表面上に発現する3種類のFcγ受容体のうち、タイプIのFcγ受容体を意味する。ヒトFcγ受容体Iには、別々の異なる遺伝子にコードされる3つのアイソフォームが存在し、ヒトFcγ受容体Ia、ヒトFcγ受容体Ib、ヒトFcγ受容体Icに分類される。本発明において、ヒトFcγ受容体Iとは、いずれのアイソフォームも含まれる。
ヒトFcγ受容体Iは単量体のヒトIgG抗体に結合に高い親和性で結合することが知られており、ヒトFcγ受容体II及びIIIはヒトIgG抗体に対して、単量体のよりも高い親和性で免疫複合体に結合することが知られている[Trends in Immunology, 29, 608 (2008)]。よって、本発明の抗体は免疫複合体の形成の有無によらずヒトFcγ受容体Iに結合する。
本発明の抗体が阻害できる、自己抗体がFcγ受容体に結合することで引き起こす反応としては、例えば、IgGクラスの自己抗体が白血球やマクロファージの細胞表面上のFcγ受容体に結合し、自己細胞の傷害や貪食を引き起こす反応が挙げられる。自己細胞の傷害や貪食としては、例えば、抗体依存性細胞傷害活性(ADCC活性)や抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシス活性(ADCP活性)が挙げられる。
ADCC活性とは、自己組織に結合した自己抗体分子が、Fc部分を介して、Fcγ受容体を発現した例えばナチュラルキラー細胞(以下、NK細胞と表記する)などに結合することにより、自己抗体パーフォリンやグランザイムなどの細胞傷害性分子の放出や貪食作用の亢進などによって生じる細胞傷害反応[Clark M、Chemical Immunology, 65, 88(1997);Gorter Aら、Immunol Today, 20, 576(1999)]である。
また、ADCP活性とは、自己組織に結合した自己抗体分子が、Fc部分を介して、Fcγ受容体を発現した、例えばマクロファージなどに捕捉され、貪食及び破壊によって生じる自己組織傷害である。
本発明の抗体には、抗体のFc領域のアミノ酸を、Fcγ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体が包含される。具体的には、例えば、本発明の抗体に、ポテリジェント技術及び/又は該抗体のFcアミノ酸に改変を施す技術を組み合わせて得られた抗体は、Hpと免疫複合体を形成した該抗体のFcドメインがより強くCD16aに結合し、ADCC活性をIVIGよりも強力に阻害する。
抗体のFc領域のアミノ酸を、Fcγ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体としては、抗体のFc領域に結合するN−グリコシド結合糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体が挙げられる。
抗体のFc領域に結合するN−グリコシド結合糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体としては、例えば、α1,6−フコース転移酵素遺伝子が欠損したCHO細胞(国際公開第2005/035586号、国際公開第02/31140号)を用いて作製される抗体が挙げられる。
従来、既存の抗体のFc領域に結合するN−グリコシド結合糖鎖の構造を、N−グリコシド結合糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない構造に改変する技術は、既存の抗体のADCC活性を高めるために用いられてきた。しかしながら、本発明の抗体には、Fcγ受容体との親和性を高め、Fcγ受容体を発現したNK細胞等に結合することにより、病態で亢進するADCC活性を阻害する方法として、この技術を用いることができる。
抗体のFc領域のアミノ酸を、Fcγ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体としては、例えば、米国特許第7,317,091号明細書に記載の方法で作製された抗体分子を挙げることができる。
また、本発明の抗体は、抗体の可変領域を含むポリペプチドの表面電荷や早期エンドソーム内でのpHにおける抗原結合活性を改変することにより、血中半減期を伸ばすことができる。
抗体分子の可変領域を含むポリペプチドの表面電荷や早期エンドソーム内でのpHにおける抗原結合活性を改変し血中半減期を伸ばす方法としては、例えば日本国特開2013−165716号公報、日本国特許第4961501号明細書に記載の方法が挙げられる。
上述の抗体を構成するアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加され、かつ上述の抗体と同様な活性を有するモノクローナル抗体も、本発明の抗体に包含される。
欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸の数は1個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換若しくは付加できる程度の数である。例えば、1〜数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
本発明の抗体のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、次のことを示す。即ち、抗体のアミノ酸配列中において、1又は複数のアミノ酸残基の欠失、付加、置換、又は挿入があることを意味する。また、欠失、付加、置換、又は挿入が同時に生じる場合もあり、欠失、付加、置換、又は挿入されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
天然型アミノ酸残基としては、例えば、L−アラニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−グルタミン、L−グルタミン酸、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−スレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリン、L−システインなどが挙げられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、O−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、O−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリン
G群:フェニルアラニン、チロシン
本発明の形質転換体としては、配列番号70で表されるヒトハプトグロビンのβ鎖に特異的に認識し、該ヒトハプトグロビンに結合し、多価の免疫複合体を形成する抗体分子をコードするDNAを含有する組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体であって、本発明の抗体を生産する形質転換体であればいかなる形質転換体でも包含される。宿主細胞として具体的には、以下の(1)〜(5)などが挙げられる。
(1)チャイニーズ・ハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(2)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(3)マウスミエローマ細胞株NS0細胞;
(4)マウスミエローマ細胞株SP2/0−Ag14細胞;
(5)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(1)チャイニーズ・ハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(2)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(3)マウスミエローマ細胞株NS0細胞;
(4)マウスミエローマ細胞株SP2/0−Ag14細胞;
(5)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
また、抗体のFc領域に結合するN−グリコシド結合糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体を生産する本発明の形質転換体には、国際公開第2005/035586号、国際公開第02/31140号に記載の方法で作製された糖転移酵素の低下又は欠損した宿主細胞を用いることができる。
本発明は、本発明のモノクローナル抗体と薬理学的に許容される担体を含む自己免疫疾患治療剤に関する。
また、本発明は、ヒトハプトグロビンに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とする自己免疫疾患治療剤に関する。該ヒトハプトグロビンとしては、α鎖として配列番号69又は配列番号71で表されるアミノ酸配列及びβ鎖として配列番号70で表されるアミノ酸配列を有するヒトハプトグロビンが好ましい。
自己免疫疾患としては、自己抗体による組織障害が関係する自己免疫疾患が挙げられ、限定するものではないが、免疫性血小板減少性紫斑病(特発性血小板減少性紫斑病、又は、血小板減少症とも言う)、川崎病、ANCA関連血管炎、ギランバレー症候群、慢性脱髄性多発性根神経炎、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチー、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、強皮症、自己免疫性蕁麻疹、天疱瘡、グッドバスチャー症候群、乾癬性関節炎、シェーングレン症候群、多発性筋炎/皮膚筋炎などのIVIG製剤が治療薬として用いられる自己免疫疾患や、IgG4関連疾患などの自己抗体の産生が病態に関与している自己免疫疾患が挙げられる。
また、本発明の自己免疫疾患治療剤は自己抗体による組織障害が関係する自己免疫疾患の治療及び/又は予防に用いることができる。
本発明の治療剤は、有効成分としての該抗体、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される1以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
投与経路としては、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内若しくは腹腔内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏又はテープ剤などが挙げられる。
投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢及び体重などにより異なるが、通常成人1日当たり10μg/kg〜100mg/kgである。
本発明の治療薬は、単独で使用してもよく、少なくとも1つのその他の治療薬を併用してもよい。本発明の治療薬とその他の治療薬との併用方法としては、本発明の治療薬と併用される治療薬が、本発明の治療薬と同時に投与されてもよいし、連続的に投与されてもよい。その他の治療薬としては、例えば、ステロイド、アスピリン、シクロフォスファミド又はシクロスポリン等が挙げられる。
以下に、本発明の抗体の製造方法及び疾患の治療方法について、具体的に説明する。
1.抗体の製造方法
(1)抗原の調製
抗原となるヒトハプトグロビン又はヒトハプトグロビンを発現させた細胞は、ヒトハプトグロビンを形成するα鎖及びβ鎖の全長又はそれらの部分長をコードするcDNAを含む組換え体ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ヒトハプトグロビンを多量に発現している各種ヒト培養細胞、ヒト組織などからヒトハプトグロビンを精製することによっても、得ることができる。
(1)抗原の調製
抗原となるヒトハプトグロビン又はヒトハプトグロビンを発現させた細胞は、ヒトハプトグロビンを形成するα鎖及びβ鎖の全長又はそれらの部分長をコードするcDNAを含む組換え体ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ヒトハプトグロビンを多量に発現している各種ヒト培養細胞、ヒト組織などからヒトハプトグロビンを精製することによっても、得ることができる。
また、該培養細胞、又は該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Fmoc法又はtBoc法などの化学合成法によりヒトハプトグロビンの部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原として用いることもできる。
ヒトハプトグロビン又はヒトハプトグロビンの部分配列を有する合成ペプチドには、C末端若しくはN末端にFLAG若しくはHisなどの公知のタグが付加されていてもよい。
本発明で用いられるヒトハプトグロビンは、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)又はCurrent Protocols inmolecular Biology、John Wiley&Sons(1987−1997)などに記載された方法などを用い、例えば、以下の方法により、該ヒトハプトグロビンをコードするDNAを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
まず、ヒトハプトグロビンを形成するα鎖及びβ鎖をコードする部分を含む完全長cDNAを適当な組換え体ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長cDNAの代わりに、完全長cDNAをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を用いてもよい。次に、得られた該組換えベクターを、該組換え体ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
組換え体ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするDNAを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換え体ベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ヒトハプトグロビンをコードする部分を含むDNA及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該組換え体ベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換え体ベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
該組換え体ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列(SD配列ともいう)と開始コドンとの間を適当な距離(例えば6〜18塩基)に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
また、該ヒトハプトグロビンをコードするDNAの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするヒトハプトグロビンの生産率を向上させることができる
組換え体ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社)、pKK233−2(ファルマシア社)、pSE280(インビトロジェン社)、pGEMEX−1(プロメガ社)、pQE−8(キアゲン社)、pKYP10(日本国特開昭58−110600号公報)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry、48、669(1984)]、pLSA1[Agric Biol.Chem.、53、277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、4306(1985)]、pBluescript II SK(−)(ストラタジーン社)、pTrs30[大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP−5407)より調製]、pTrs32[大腸菌JM109/pTrS32(FERM BP−5408)より調製]、pGHA2[大腸菌IGHA2(FERM BP−400)より調製、日本国特開昭60−221091号公報]、pGKA2[大腸菌IGKA2(FERM BP6798)より調製、日本国特開昭60−221091号公報]、pTerm2(米国特許第4,686,191号明細書、米国特許第4,939,094号明細書、米国特許第5,160,735号明細書)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.、172、2392(1990)]、pGEX(ファルマシア社)、pETシステム(ノバジェン社)、又はpME18SFL3などが挙げられる。
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター(Ptrp)、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、又はT7プロモーターなどの、大腸菌又はファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ptrpを2つ直列させたタンデムプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、又はlet Iプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
宿主細胞としては、例えば、大腸菌XL−1Blue、大腸菌XL2−Blue、大腸菌DH1、大腸菌MC1000、大腸菌KY3276、大腸菌W1485、大腸菌JM109、大腸菌HB101、大腸菌No.49、大腸菌W3110、大腸菌NY49、又は大腸菌DH5αなどが挙げられる。
宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、69、2110(1972)、Gene、17、107(1982)、Molecular&General Genetics、168、111(1979)]が挙げられる。
動物細胞を宿主として用いる場合、組換え体ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、pcDNA I、pcDM8(以上、フナコシ社)、pAGE107[日本国特開平03−22979号公報;Cytotechnology、3、133(1990)]、pAS3−3(日本国特開平2−227075号公報)、pcDM8[Nature、329、840(1987)]、pcDNA I/Amp、pcDNA3.1、pREP4(以上、インビトロジェン社)、pAGE103[J.Biochemistry、101、1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(国際公開第97/10354号)、N5KG1val(米国特許第6001358号明細書)、INPEP4(Biogen−IDEC社)及びトランスポゾンベクター(国際公開第2010/143698号)などが挙げられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)のimmediate early(IE)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Namalwa細胞、サル腎臓組織由来COS細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣組織由来CHO細胞[Journal of Experimental Medicine、108、945(1958);Proc.Natl.Acad.Sci.USA、60、1275(1968);Genetics、55、513(1968);Chromosoma、41、129(1973);Methods in Cell Science、18、115(1996);Radiation Research、148、260(1997);Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、4216(1980);Proc.Natl.Acad.Sci.USA、60、1275(1968);Cell、6、121(1975);Molecular Cellgenetics、Appendix I、II(pp.883−900)]、CHO/DG44、CHO−K1(ATCC番号:CCL−61)、DUkXB11(ATCC番号:CCL−9096)、Pro−5(ATCC番号:CCL−1781)、CHO−S(Life Technologies、Cat#11619)、Pro−3、ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(又はYB2/0細胞ともいう)、マウスミエローマ細胞株NS0細胞、マウスミエローマ細胞株SP2/0−Ag14細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来BHK又はHBT5637細胞(日本国特開昭63−000299号公報)などが挙げられる。
宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology、3、133(1990)]、リン酸カルシウム法(日本国特開平02−227075号公報)、又はリポフェクション法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413(1987)]などが挙げられる。
以上のようにして得られるヒトハプトグロビンをコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ヒトハプトグロビンを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ヒトハプトグロビンを製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたヒトハプトグロビンを得ることができる。
誘導性のプロモーターを用いた組換え体ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドなどを、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているRPMI1640培地[The Journal of the American Medical Association、199、519(1967)]、EagleのMEM培地[Science、122、501(1952)]、ダルベッコ改変MEM培地[Virology、8、396(1959)]、199培地[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、73、1(1950)]、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)培地、又はこれら培地に牛胎児血清(FBS)などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5%CO2存在下などの条件下で1〜7日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
ヒトハプトグロビンをコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]を用いることができる。
ヒトハプトグロビンの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、又は生産させるヒトハプトグロビンの構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
ヒトハプトグロビンが宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[J.Biol.Chem.、264、17619(1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86、8227(1989)、Genes Develop.、4、1288(1990)]、日本国特開平05−336963号公報、又は国際公開第94/23021号などに記載の方法を用いることにより、ヒトハプトグロビンを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系(日本国特開平2−227075号公報)を利用してヒトハプトグロビンの生産量を上昇させることもできる。
得られたヒトハプトグロビンは、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
ヒトハプトグロビンが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)−セファロース、DIAION HPA−75(三菱化学社)などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF(ファルマシア社)などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
ヒトハプトグロビンが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ヒトハプトグロビンの不溶体を回収する。回収した該ヒトハプトグロビンの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ヒトハプトグロビンを正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
ヒトハプトグロビン又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ヒトハプトグロビン又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明において用いられるヒトハプトグロビンは、Fmoc法、又はtBoc法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社、パーキン・エルマー社、ファルマシア社、プロテインテクノロジインストルメント社、シンセセル−ベガ社、パーセプチブ社、又は島津製作所社などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
(2)動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、(1)で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ハプトグロビンノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。また、ヒト抗体産生動物から抗体産生細胞を採取することもできる。
3〜20週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、(1)で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ハプトグロビンノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。また、ヒト抗体産生動物から抗体産生細胞を採取することもできる。
免疫は、動物の皮下、尾根部、静脈内又は腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、BSA(ウシ血清アルブミン)、又はKLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、1回目の投与の後、1〜4週間おきに1〜10回行う。各投与後1〜14日目に眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法[Antibodies−A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]などを用いて測定する。
抗原の最終投与後3〜7日目に、免疫した動物より脾臓やリンパ節などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
(3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology、18、1(1978)]、P3−NS1/1Ag41(NS−1)[European J.Immunology、6、511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature、276、269(1978)]、P3−X63−Ag8653(653)[J.Immunology、123、1548(1979)]、又はP3−X63−Ag8(X63)[Nature、256、495(1975)]などを用いる。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1(P3−U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology、18、1(1978)]、P3−NS1/1Ag41(NS−1)[European J.Immunology、6、511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature、276、269(1978)]、P3−X63−Ag8653(653)[J.Immunology、123、1548(1979)]、又はP3−X63−Ag8(X63)[Nature、256、495(1975)]などを用いる。
該骨髄腫細胞は、正常培地[グルタミン、2−メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、FBS及び8−アザグアニンを加えたRPMI1640培地]で継代し、細胞融合の3〜4日前に正常培地に継代し、融合当日2×107個以上の細胞数を確保する。
(4)細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
(2)で得られる融合用抗体産生細胞と(3)で得られる骨髄腫細胞をMinimum Essential Medium(MEM)培地又はPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
(2)で得られる融合用抗体産生細胞と(3)で得られる骨髄腫細胞をMinimum Essential Medium(MEM)培地又はPBS(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸一カリウム0.21g、食塩7.65g、蒸留水1リットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−1000(PEG−1000)、MEM培地及びジメチルスルホキシドの混液を37℃にて、攪拌しながら加える。さらに1〜2分間毎にMEM培地1〜2mLを数回加えた後、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、HAT培地[ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを加えた正常培地]中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を5%CO2インキュベーター中、37℃にて7〜14日間培養する。
培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のハイブリドーマの選択方法により、ヒトハプトグロビンを含む抗原に反応し、ヒトハプトグロビンを含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し[1回目はHT培地(HAT培地からアミノプテリンを除いた培地)、2回目は正常培地を使用する]、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
(5)精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理[2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mLを腹腔内投与し、2週間飼育する]した8〜10週令のマウス又はヌードマウスに、(4)で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、40〜50%硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgG又はIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
プリスタン処理[2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン(Pristane)0.5mLを腹腔内投与し、2週間飼育する]した8〜10週令のマウス又はヌードマウスに、(4)で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、40〜50%硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、IgG又はIgM画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
また、(4)で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、10%FBS添加を添加したRPMI1640培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Hybridoma−SFM培地に懸濁し、3〜7日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインA−カラム又はプロテインG−カラムによる精製を行ない、IgG画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Hybridoma−SFM培地には5%ダイゴGF21を添加することもできる。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は280nmでの吸光度より算出する。
(6)モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は、以下に示す通り、ヒトハプトグロビン及びマウスハプトグロビンに対する結合活性を酵素免疫測定法(ELISA)で解析することにより行う。
モノクローナル抗体の選択は、以下に示す通り、ヒトハプトグロビン及びマウスハプトグロビンに対する結合活性を酵素免疫測定法(ELISA)で解析することにより行う。
ヒトハプトグロビン又はマウスハプトグロビンを96ウェルプレートなどのプレートに分注し、該タンパク質を固相化した後、第1抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。反応後のプレートを、0.1%Tweenを含むPBS(以下、PBSTと記す)などでよく洗浄した後、第2抗体として、ビオチン、酵素、化学発光物質又は放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。PBSTなどでよく洗浄した後、第2抗体の標識に物質に応じた反応を行い、ヒトハプトグロビン又はマウスハプトグロビンに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
また、本発明のモノクローナル抗体と競合してヒトハプトグロビン及びマウスハプトグロビンに結合するモノクローナル抗体は、上述のELISAを用いた結合反応検出系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時に本発明のモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ヒトハプトグロビン及びマウスハプトグロビンのアミノ酸配列、又はその立体構造への結合について、本発明で取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
さらに、本発明のモノクローナル抗体が結合するヒトハプトグロビン又はマウスハプトグロビンに含まれるエピトープと、同じエピトープに結合するモノクローナル抗体は、上述のELISAを用いた結合反応検出系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
2.遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト化抗体の作製方法を示す。
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト化抗体の作製方法を示す。
(1)遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のCH及びCLをコードするDNAが組み込まれた動物細胞用組換え体ベクターであり、動物細胞用組換え体ベクターにヒト抗体のCH及びCLをコードするDNAをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のCH及びCLをコードするDNAが組み込まれた動物細胞用組換え体ベクターであり、動物細胞用組換え体ベクターにヒト抗体のCH及びCLをコードするDNAをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のC領域は任意のヒト抗体のCH及びCLを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ1サブクラスのCH及びκクラスのCLなどを用いる。ヒト抗体のCH及びCLをコードするDNAには、cDNAを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体DNAを用いることもできる。
動物細胞用組換え体ベクターには、ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107[Cytotechnol.、3、133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.、101、1307(1987)]、pHSG274[Gene、27、223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78、1527(1981)]、pSG1bd2−4[Cytotechnol.、4、173(1990)]、又はpSE1UK1Sed1−3[Cytotechnol.、13、79(1993)]などを用いる。
動物細胞用組換え体ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、SV40の初期プロモーター[J.Biochem.、101、1307(1987)]、モロニーマウス白血病ウイルスLTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.、149、960(1987)]、又は免疫グロブリンH鎖のプロモーター[Cell、41、479(1985)]とエンハンサー[Cell、33、717(1983)]などを用いる。
遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、組換え体ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体H鎖及びL鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体H鎖及びL鎖が同一のベクター上に存在するタイプ(タンデム型)の組換え体ベクター[J.Immunol.Methods、167、271(1994)]を用いるが、抗体H鎖及びL鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の組換え体ベクターには、pKANTEX93(国際公開第97/10354号公報)、pEE18[Hybridoma、17、559(1998)]などを用いる。
(2)ヒト以外の動物由来の抗体のV領域をコードするcDNAの取得及びアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のVH及びVLをコードするcDNAの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
非ヒト抗体のVH及びVLをコードするcDNAの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。
前記ライブラリーより、マウス抗体のC領域部分又はV領域部分をコードするDNAをプローブとして用い、VH又はVLをコードするcDNAを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のVH又はVLの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりVH又はVLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
ハイブリドーマ細胞からの全RNAの調製には、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法[Methods in Enzymol.、154、3(1987)]、又はRNA easy kit(キアゲン社)などのキットを用いる。
全RNAからのmRNAの調製には、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]、又はOligo−dT30<Super>mRNA Purification Kit(タカラバイオ社)などのキットなどを用いる。また、Fast Track mRNA Isolation Kit(インビトロジェン社)、又はQuickPrep mRNA Purification Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社)などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からmRNAを調製することもできる。
cDNAの合成及びcDNAライブラリーの作製には、公知の方法[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols inmolecular Biology、Supplement 1、John Wiley&Sons(1987−1997)]、SperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(インビトロジェン社)、又はZAP−cDNA Synthesis Kit(ストラタジーン社)などのキットなどを用いる。
cDNAライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターには、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAP ExPress[Strategies、5、58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research、17、9494(1989)]、λZAPII(ストラタジーン社)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A Practical Approach、I、49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech社)、λEx Cell、pT7T3−18U(ファルマシア社)、pcD2[Mol.Cell.Biol.、3、280(1983)]、又はpUC18[Gene、33、103(1985)]などを用いる。
ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌には、該cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL−1Blue MRF[Strategies、5、81(1992)]、C600[Genetics、39、440(1954)]、Y1088、Y1090[Science、222、778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.、166、1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.、16、118(1966)]、又はJM105[Gene、38、275(1985)]などを用いる。
cDNAライブラリーからの非ヒト抗体のVH又はVLをコードするcDNAクローンの選択には、アイソトープ又は蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法[Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]などを用いる。
また、プライマーを調製し、mRNAから合成したcDNA又はcDNAライブラリーを鋳型として、Polymerase Chain Reaction法[以下、PCR法と記す、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols inmolecular Biology、Supplement 1、John Wiley&Sons(1987−1997)]を行うことよりVH又はVLをコードするcDNAを調製することもできる。
選択されたcDNAを、適当な制限酵素などで切断後、pBluescript SK(−)(ストラタジーン社)などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該cDNAの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、74、5463(1977)]などの反応を行った後、ABI PRISM3700(PEバイオシステムズ社)又はA.L.F.DNAシークエンサー(ファルマシア社)などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
決定した塩基配列からVH及びVLの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のVH及びVLの全アミノ酸配列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含む抗体のVH及びVLの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
分泌シグナル配列を含む抗体のVH及びVLの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のVH及びVLの全アミノ酸配列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びN末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、VH及びVLの各CDRのアミノ酸配列についても、既知の抗体のVH及びVLのアミノ酸配列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]と比較することによって見出すことができる。
また、得られたVH及びVLの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、SWISS−PROT又はPIR−Proteinなどの任意のデータベースに対してBLAST法[J.Mol.Biol.、215、403(1990)]などの相同性検索を行い、VH及びVLの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
(3)ヒト型キメラ抗体発現用組換え体ベクターの構築
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のVH又はVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現用の組換え体ベクターを構築することができる。
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のVH又はVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現用の組換え体ベクターを構築することができる。
非ヒト抗体のVH又はVLをコードするcDNAの3’末端側と、ヒト抗体のCH又はCLの5’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したVH及びVLのcDNAを作製する。
作製されたVH及びVLのcDNAを、(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現用の組換え体ベクターを構築する。
また、非ヒト抗体VH又はVLをコードするcDNAを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAを用いてPCR法によりそれぞれ増幅し、(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
(4)ヒト化抗体のV領域をコードするcDNAの構築
ヒト化抗体のVH又はVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。
ヒト化抗体のVH又はVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。
非ヒト抗体のVH又はVLのCDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のVH又はVLのFRのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するFRのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
例えば、Protein Data Bankなどのデータベースに登録されているヒト抗体のFRのアミノ酸配列、又はヒト抗体のFRの各サブグループの共通アミノ酸配列[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のVH又はVLのFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性(少なくとも60%以上)のFRのアミノ酸配列を選択する。
次に、選択したヒト抗体のVH又はVLのFRのアミノ酸配列に、もとの抗体のCDRのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のVH又はVLのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度[A.L.F.DNA、US Dept.Health and Human Services(1991)]を考慮してDNA配列に変換し、ヒト化抗体のVH又はVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列をそれぞれ設計する。
設計したDNA配列に基づき、100塩基前後の長さからなる数本の合成DNAを合成し、それらを用いてPCR反応を行う。この場合、PCR反応での反応効率及び合成可能なDNAの長さから、好ましくはH鎖、L鎖それぞれについて各6本の合成DNAを設計する。
また、両端に位置する合成DNAの5’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、容易に、ヒト化抗体のVH又はVLをコードするcDNAを、(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターに、クローニングすることができる。
PCR反応後、増幅産物をpBluescript SK(−)(ストラタジーン社)などのプラスミドにそれぞれクローニングし、(2)に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のH鎖全長又はL鎖全長のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するプラスミドを取得する。
又は、設計したDNA配列に基づき、VH全長及びVL全長を各々1本の長鎖DNAとして合成したものを、上記PCR増幅産物に代えて用いることもできる。さらに、合成長鎖DNAの両端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のVH又はVLをコードするcDNAを、(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
(5)ヒト化抗体のV領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、非ヒト抗体のVH及びVLのCDRのみをヒト抗体のVH及びVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する[BIO/TECHNOLOGY、9、266(1991)]。
ヒト化抗体は、非ヒト抗体のVH及びVLのCDRのみをヒト抗体のVH及びVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する[BIO/TECHNOLOGY、9、266(1991)]。
ヒト化抗体では、ヒト抗体のVH及びVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、CDRのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
抗原結合活性に関わるFRのアミノ酸残基を同定するために、X線結晶解析[J.Mol.Biol.、112、535(1977)]又はコンピューターモデリング[Protein Engineering、7、1501(1994)]などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト化抗体を取得できる。
ヒト抗体のVH及びVLのFRのアミノ酸残基は、改変用合成DNAを用いて(4)に記載のPCR反応を行うことにより、改変させることができる。PCR反応後の増幅産物について(2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
(6)ヒト化抗体発現用組換え体ベクターの構築
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のVH又はVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現用組換え体ベクターを構築することができる。
(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のVH又はVLをコードするcDNAをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現用組換え体ベクターを構築することができる。
例えば、(4)及び(5)で得られるヒト化抗体のVH又はVLを構築する際に用いる合成DNAのうち、両端に位置する合成DNAの5’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、(1)で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のCH又はCLをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
(7)遺伝子組換え抗体の一過性発現
(3)及び(6)で得られる遺伝子組換え抗体発現用組換え体ベクター、又はそれらを改変した組換え体ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
(3)及び(6)で得られる遺伝子組換え抗体発現用組換え体ベクター、又はそれらを改変した組換え体ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
組換え体ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばCOS−7細胞(ATCC番号:CRL1651)を用いる[Methods in Nucleic Acids Res.、CRC Press、283(1991)]。
COS−7細胞への組換え体ベクターの導入には、DEAE−デキストラン法[Methods in Nucleic Acids Res.、CRC Press(1991)]、又はリポフェクション法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、7413(1987)]などを用いる。
組換え体ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Thiral Antibodies-Principles and Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)]などを用いて測定する。
(8)遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体の取得と遺伝子組換え抗体の調製
(3)及び(6)で得られた遺伝子組換え抗体発現用組換え体ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体を得ることができる。
(3)及び(6)で得られた遺伝子組換え抗体発現用組換え体ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞への組換え体ベクターの導入には、エレクトロポレーション法[日本国特開平02−257891号公報、Cytotechnology、3、133(1990)]などを用いる。
組換え体ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、CHO−K1(ATCC番号:CCL−61)、DUkXB11(ATCC番号:CCL−9096)、Pro−5(ATCC番号:CCL−1781)、CHO−S(Life Technologies、Cat#11619)、ラットミエローマ細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(又はYB2/0ともいう)、マウスミエローマ細胞NS0、マウスミエローマ細胞SP2/0−Ag14(ATCC番号:CRL1581)、マウスP3−X63−Ag8653細胞(ATCC番号:CRL1580)、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(Dihydroforate Reductase、以下、DHFRと表記する)が欠損したCHO細胞[Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、4216(1980)]、レクチン耐性を獲得したLec13[Somatic Cell and Molecular Genetics、12、55(1986)]、α1,6−フコース転移酵素遺伝子が欠損したCHO細胞(国際公開第2005/035586号、国際公開第02/31140号)、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC番号:CRL1662)などを用いる。
また、細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質、又はN−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質、又は細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下又は欠失した宿主細胞、例えばα1,6−フコース転移酵素遺伝子が欠損したCHO細胞(国際公開第2005/035586号、国際公開第02/31140号)などを用いることもできる。
組換え体ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換体は、G418硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する(日本国特開平02−257891号公報)。
動物細胞培養用培地には、RPMI1640培地(インビトロジェン社)、GIT培地(日本製薬社)、EX−CELL301培地(ジェイアールエイチ社)、IMDM培地(インビトロジェン社)、Hybridoma−SFM培地(インビトロジェン社)、又はこれら培地にFBSなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。
得られた形質転換体を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はELISA法などにより測定できる。また、DHFR増幅系(日本国特開平02−257891号公報)などを利用して、形質転換体が産生する遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
遺伝子組換え抗体は、形質転換体の培養上清よりプロテインA−カラムを用いて精製する[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
精製した遺伝子組換え抗体のH鎖、L鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法[Nature、227、680(1970)]、又はウェスタンブロッティング法[Monoclonal Antibodies−Principles and practice、Third edition、Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]などを用いて測定することができる。
3.精製モノクローナル抗体の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体の活性評価、例えば、ヒトハプトグロビンに対する結合活性は、前述の1.(6)記載のELISAを用いた結合反応検出系を用いて測定できる。
精製した本発明のモノクローナル抗体の活性評価、例えば、ヒトハプトグロビンに対する結合活性は、前述の1.(6)記載のELISAを用いた結合反応検出系を用いて測定できる。
4.抗体のエフェクター活性を制御する方法
本発明のモノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のFc領域の297番目のアスパラギン(Asn)に結合するN−グリコシド結合糖鎖の還元末端N=アセチルグルコサミン(GlcNAc)にα1,6結合するフコース(コアフコースともいう)の量を制御する方法(国際公開第2005/035586号、国際公開第2002/31140号、国際公開第00/61739号)、又は抗体のFc領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明のモノクローナル抗体には、いずれの方法を用いてもエフェクター活性を制御することができる。
本発明のモノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のFc領域の297番目のアスパラギン(Asn)に結合するN−グリコシド結合糖鎖の還元末端N=アセチルグルコサミン(GlcNAc)にα1,6結合するフコース(コアフコースともいう)の量を制御する方法(国際公開第2005/035586号、国際公開第2002/31140号、国際公開第00/61739号)、又は抗体のFc領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明のモノクローナル抗体には、いずれの方法を用いてもエフェクター活性を制御することができる。
エフェクター活性とは、抗体のFc領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ADCC活性、CDC活性、又はマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞によるADCP活性などが知られている。
エフェクター活性の測定法として、例えばADCC活性については、標的として炎症性細胞、エフェクターとしてヒト末梢血単核球(PBMC)、そして炎症性細胞特異的な抗体を混合し、4時間程度インキュベーションした後、細胞障害の指標として遊離してきた乳酸脱水素酵素(LDH)を、エフェクター活性として測定することができる。若しくは、ヒトPBMCに、例えばCD20の様な血液細胞特異的な抗原を認識する抗体を混合し、インキュベーションした後、遊離LDHやフローサイトメトリーによる該細胞数の減少を、エフェクター活性として測定することができる。
抗体のFcのN結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。抗体のFcに結合しているN結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α1,6−フコース転移酵素遺伝子が欠損したCHO細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体(以下、フコース非結合型ともいう)は、フコースが結合している抗体(以下、フコース結合型ともいう)に比べて、CD16aに対して高い結合活性を有する。また、それに伴って、高いADCC活性を有することが知られている。
一方、抗体のFcに結合しているN結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α1,6−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体に比べて、CD16aに対して低い結合活性を有する。また、それに伴って、低いADCC活性を有する。
また、抗体のFc領域のアミノ酸残基を改変することでADCC活性又はCDC活性を増加又は低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第2007/0148165号明細書に記載のFc領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のCDC活性を増加させることができる。
また、米国特許第6,737,056号明細書、米国特許第7,297,775号明細書、又は米国特許第7,317,091号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ADCC活性又はCDC活性を、増加させることも低下させることもできる。上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。
5.本発明のモノクローナル抗体を用いた疾患の治療方法
本発明の抗体は、自己抗体による組織傷害が関係する自己免疫疾患の治療に用いることができる。
本発明の抗体は、自己抗体による組織傷害が関係する自己免疫疾患の治療に用いることができる。
自己免疫疾患としては、自己抗体による組織障害が関係する自己免疫疾患が挙げられ、限定するものではないが、免疫性血小板減少性紫斑病、川崎病、ANCA関連血管炎、ギランバレー症候群、慢性脱髄性多発性根神経炎、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチー、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、強皮症、自己免疫性蕁麻疹、天疱瘡、グッドバスチャー症候群、乾癬性関節炎、シェーングレン症候群、多発性筋炎/皮膚筋炎などのIVIG製剤が治療薬として用いられる自己免疫疾患や、IgG4関連疾患などの自己抗体の産生が病態に関与している自己免疫疾患が挙げられる。
投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは腹腔内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などが挙げられる。
乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、p−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、又は噴霧剤などが挙げられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
坐剤はカカオ脂、水素化脂肪、又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。
噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。
さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
[実施例1]可溶性CD16aの作製
(1)ヒト末梢血単核球cDNAの作製
健常人の静脈血30mLを採取し、ヘパリンナトリウム(清水製薬社)0.5mLを加えて穏やかに混和した後、生理的食塩水(大塚製薬社)30mLと混合した。Lymphoprep(NYCOMED PHARMA AS社)4mLに対して、該混合液10mLを穏やかに重層し、室温下2000rpmで30分間の遠心分離を行った。
(1)ヒト末梢血単核球cDNAの作製
健常人の静脈血30mLを採取し、ヘパリンナトリウム(清水製薬社)0.5mLを加えて穏やかに混和した後、生理的食塩水(大塚製薬社)30mLと混合した。Lymphoprep(NYCOMED PHARMA AS社)4mLに対して、該混合液10mLを穏やかに重層し、室温下2000rpmで30分間の遠心分離を行った。
分離された単核球画分を各遠心管より集めて混合し、10%FBS(GIBCO社)を含むRPMI1640(GIBCO社)[以下、RPMI1640−FBS(10)]30mLに懸濁し、室温下1200rpmで15分間の遠心分離を行った。
遠心分離後、上清を除去し、該細胞をRPMI1640−FBS(10)20mLに懸濁した。この洗浄操作を2回繰り返した後、RPMI1640−FBS(10)を用いて2×106個/mLの末梢血単核球懸濁液を調製した。
調製した末梢血単核球懸濁液5mLについて、室温下800rpmで5分間の遠心分離を行った。遠心分離後、上清を除去し、5mLのPBS(Phosphate buffered saline)に懸濁して、室温下800rpmで5分間の遠心分離を行った。
遠心分離後、上清を除去し、得られたペレットから、QIAamp RNA Blood Mini Kit(キアゲン社)を用いて、添付書に従い、total RNAを調製した。
得られたtotal RNA2μgから、SUPERSCRIPT(商標)Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis(Life Technologies社)を用いて、添付書に従い、cDNAを調製した。
(2)ヒトCD16aをコードするcDNAの取得
ヒトCD16a(以下、CD16aと表記する)のcDNAの取得は、以下のように行った。
ヒトCD16a(以下、CD16aと表記する)のcDNAの取得は、以下のように行った。
まず、CD16aのcDNAの塩基配列[J. Exp. Med., 170, 481 (1989)]より、翻訳開始コドンを含む特異的なフォワードプライマー(配列番号1に示す)及び翻訳終止コドンを含む特異的なリバースプライマー(配列番号2に示す)を設計した。
次に、実施例1(1)で調製したヒト末梢血単核球由来cDNAを鋳型として、上記2種類のプライマー(配列番号1及び2)を用いて、PCRを行った。PCRはDNAポリメラーゼExTaq(タカラバイオ社)に添付の説明書に基づき行った。
PCR後、反応液をQIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社)を用いて、添付書に従い精製した。制限酵素EcoRI(タカラバイオ社)及びBamHI(タカラバイオ社)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅DNA断片(約800bp)を回収した。
一方、プラスミドpBluescriptII SK(−)2.5μg(Stratagene社)を制限酵素EcoRI(タカラバイオ社)及びBamHI(タカラバイオ社)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約2.9kbpのDNA断片を回収した。
これら約800bpのDNA断片と約2.9kbpの断片をDNA Ligation Kit Ver.2.0(タカラバイオ社)を用いて連結し、大腸菌DH5α株(TOYOBO社)を形質転換して、ヒトCD16aのアミノ酸配列の176番目がバリン[以下、CD16a(V)と表記する]であるcDNA(配列番号3)をコードするDNAを含むプラスミドpBs CD16a(V)を取得した。
(3)可溶性CD16aをコードするcDNAの取得
CD16aの細胞外領域(配列番号4の1〜193番目)とC末端にヒスチジンタグ(6個のHisが連続したアミノ酸配列)を有する可溶性CD16a(V)[以下、可溶性CD16a(V)]をコードするcDNAは、以下のように構築した。
CD16aの細胞外領域(配列番号4の1〜193番目)とC末端にヒスチジンタグ(6個のHisが連続したアミノ酸配列)を有する可溶性CD16a(V)[以下、可溶性CD16a(V)]をコードするcDNAは、以下のように構築した。
まず、CD16a(V)のcDNAの塩基配列(配列番号3)より、細胞外領域に特異的なプライマーFcgR3−1(配列番号5)を設計した。次に、pBs CD16a(V)を5ngとDNAポリメラーゼExTaq(タカラバイオ社)を用いて、実施例1(2)と同様にしてPCRを行った。
PCR後、反応液をQIAquick PCR Purification Kit(キアゲン社)を用いて、添付書に従い精製し、滅菌水に溶解した。制限酵素PstI(タカラバイオ社)及びBamHI(タカラバイオ社)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅DNA断片(約110bp)を回収した。
一方、pBs CD16a(V)2.5μgを制限酵素PstI(タカラバイオ社)及びBamHI(タカラバイオ社)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約3.5kbpの断片を回収した。これら約110bpのDNA断片と約3.5kbpの断片をDNA Ligation Kit Ver.2.0(タカラバイオ社)を用いて連結し、大腸菌DH5α株(TOYOBO社)を形質転換して、ヒスチジンタグ融合可溶性CD16a(配列番号6)をコードするプラスミドpBssCD16a(V)−Hisを取得した。
(4)可溶性CD16aの組換え体ベクターの構築
実施例1(3)で得られたプラスミドpBssCD16a(V)−His 3.0μgを制限酵素EcoRI(タカラバイオ社)及びBamHI(タカラバイオ社)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約620bpの断片を回収した。
実施例1(3)で得られたプラスミドpBssCD16a(V)−His 3.0μgを制限酵素EcoRI(タカラバイオ社)及びBamHI(タカラバイオ社)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約620bpの断片を回収した。
一方、国際公開第97/10354号に記載のプラスミドpKANTEX93 2.0μgを制限酵素EcoRI(タカラバイオ社)及びBamHI(タカラバイオ社)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約10.7kbpの断片を回収した。
これら約620bpのDNA断片と約10.7kbpの断片をDNA Ligation Kit Ver.2.0(タカラバイオ社)を用いて連結し、大腸菌DH5α株(TOYOBO社)を形質転換して、ヒスチジンタグ融合可溶性CD16aをコードする組換え体ベクターpKANTEX sCD16a(V)−Hisを取得した。
(5)可溶性CD16aの安定生産細胞の作製
実施例1(4)で構築した組換え体ベクターpKANTEX sCD16a(V)−HisをラットミエローマYB2/0細胞[ATCC CRL-1662、 J. Cell. Biol., 93, 576 (1982)]に導入し、可溶性CD16aの安定生産細胞を以下のように作製した。
実施例1(4)で構築した組換え体ベクターpKANTEX sCD16a(V)−HisをラットミエローマYB2/0細胞[ATCC CRL-1662、 J. Cell. Biol., 93, 576 (1982)]に導入し、可溶性CD16aの安定生産細胞を以下のように作製した。
制限酵素AatIIで消化し、線状化したpKANTEX sCD16a(V)−His 10μgをエレクトロポレーション法[Cytotechnology, 3, 133 (1990)]により4×106個のYB2/0細胞へ導入後、10%FBSを含むHybridoma−SFM培地(Life Technologie社)[以下、Hybridoma−SFM−FBS(10)]40mLに懸濁し、96ウェル培養用プレート(住友ベークライト社)に200μL/ウェルずつ分注した。
5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、G418を1.0mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。MTX濃度を50nmol/Lから順次上昇させ、最終的に、1.0mg/mLのG418及び200nmol/LのMTXを含むHybridoma−SFM−FBS(10)培地で増殖可能であり、かつ、可溶性CD16aを高生産する形質転換細胞を得た。
(6)可溶性CD16aの精製
実施例1(5)で得られた可溶性CD16a(V)を生産する形質転換細胞を、G418を1.0mg/mL、MTXを200nmol/Lで含むHybridoma−SFM−GF(5)[5%Daigo’s GF21(和光純薬社)を含むHybridoma−SFM培地(Life Technologie社)]に3×105細胞/mLとなるように懸濁し、182cm2フラスコ(Greiner社)に50mL分注した。
実施例1(5)で得られた可溶性CD16a(V)を生産する形質転換細胞を、G418を1.0mg/mL、MTXを200nmol/Lで含むHybridoma−SFM−GF(5)[5%Daigo’s GF21(和光純薬社)を含むHybridoma−SFM培地(Life Technologie社)]に3×105細胞/mLとなるように懸濁し、182cm2フラスコ(Greiner社)に50mL分注した。
5%CO2インキュベーター内で、37℃にて4日間培養し、培養上清を回収した。培養上清よりNi−NTA agarose(キアゲン社)カラムを用いて、添付書に従い、可溶性CD16a(V)を精製した。
[実施例2]IVIG中の高いCD16a結合活性をもつ成分の分離と分析
(1)高いCD16a結合活性を持つ成分の分離
0.25mgのHis−CD16aを、HiTrap NHS−activated HPカラム(GEヘルスケア社)に添付書に従い固相化した。その際、未反応の活性化エステル基は0.5mol/L Tris−HCl(pH8.0)をブロッキング用緩衝液として用いてブロッキングし、CD16aを固相化せずにブロッキングのみ行ったカラムをコントロールカラムとした。
(1)高いCD16a結合活性を持つ成分の分離
0.25mgのHis−CD16aを、HiTrap NHS−activated HPカラム(GEヘルスケア社)に添付書に従い固相化した。その際、未反応の活性化エステル基は0.5mol/L Tris−HCl(pH8.0)をブロッキング用緩衝液として用いてブロッキングし、CD16aを固相化せずにブロッキングのみ行ったカラムをコントロールカラムとした。
2倍希釈血清2.4mLに50mg/ml IVIG 100μLを添加し(終濃度1mg/ml)、室温で1時間回転混和した。そこに競合抗体として0.5mg/mL Xencor型抗Gal抗体2.5mLを添加し(終濃度0.25mg/mL)を添加し、ロードサンプルとした。
CD16a固相化カラム又はコントロールカラムに、ロードサンプル2mLをアプライした。素通り画分を再度アプライする操作を2回繰り返した。4mLの0.1%Tweenを含むPBS(Phosphate buffered saline)(以下、PBSTと記す)で7回(計28ml)洗浄し、0.5mol/L NaClを含む4mLのPBSで3回溶出した。
(2)溶出画分の分析
(i)SDS−PAGEによる分離
1回目の溶出画分のうち1.7mlを41μLまで濃縮した後、メルカプトエタノールを含む還元条件のサンプル緩衝液を用いて希釈し90℃にて5分間加熱した。加熱後、半分の液量を用いて、12%アクリルアミドゲルを用いて電気泳動(濃縮ゲル20mA 1時間、分離ゲル40mA 1時間)を行った後、SYPRO Ruby protein gel stain(インビトロジェン社)を用いて染色した。
(i)SDS−PAGEによる分離
1回目の溶出画分のうち1.7mlを41μLまで濃縮した後、メルカプトエタノールを含む還元条件のサンプル緩衝液を用いて希釈し90℃にて5分間加熱した。加熱後、半分の液量を用いて、12%アクリルアミドゲルを用いて電気泳動(濃縮ゲル20mA 1時間、分離ゲル40mA 1時間)を行った後、SYPRO Ruby protein gel stain(インビトロジェン社)を用いて染色した。
その結果、コントロールとの差があり、かつ分析に必要とする十分なタンパク質量のバンドが認められた。
(ii)ゲル内消化
目的のバンドを切り出し1mm四方に切断し、還元用緩衝液[10mM DTT(ナカライテスク社)、25mmol/L NH4HCO3]を加えて56℃にて1時間還元した。上清を取り除いた後アルキル化用緩衝液[5mmol/L IAA(ナカライテスク社)、25mmol/L NH4HCO3]を加えて暗所にて室温で1時間反応させた。
目的のバンドを切り出し1mm四方に切断し、還元用緩衝液[10mM DTT(ナカライテスク社)、25mmol/L NH4HCO3]を加えて56℃にて1時間還元した。上清を取り除いた後アルキル化用緩衝液[5mmol/L IAA(ナカライテスク社)、25mmol/L NH4HCO3]を加えて暗所にて室温で1時間反応させた。
ゲル片を25mmol/L NH4HCO3で洗浄後、さらに50%アセトニトリル(和光純薬工業社)を含む25mmol/L NH4HCO3による洗浄を2回行い遠心濃縮機で完全に乾燥させた。そこにTrypsin溶液[Trypsin(Promega社)が20μL辺り18ngになるように25mmol/L NH4HCO3で希釈した溶液]を20μL加えて4℃にて30分静置した後、25mmol/L NH4HCO3を80μL加えてvortexし、37℃にて16時間、Trypsinで消化した。
反応液上清を、50%アセトニトリルを含む5%ギ酸が上清の1/100量入ったチューブに回収し、水と50%アセトニトリルを含む5%ギ酸で、ゲル片からペプチドを抽出した。抽出液を回収後、該液に含まれるアセトニトリルを遠心濃縮機で除去し、分析サンプルとした。
(iii)LC−MS/MS
分析サンプルをLC−MS/MS(HPLC;Magic 2002、Michrome BioResources社、カラム;MonoCap C18 Nano−flow、0.2×50mm、ジーエルサイエンス社、MS;LTQ Orbitrap XL、Thermo Fisher Scientific社)で分析した。
分析サンプルをLC−MS/MS(HPLC;Magic 2002、Michrome BioResources社、カラム;MonoCap C18 Nano−flow、0.2×50mm、ジーエルサイエンス社、MS;LTQ Orbitrap XL、Thermo Fisher Scientific社)で分析した。
まず、抗体H鎖に相当する分子量51kDaのバンド(以下51k−Hと記す)の分析において、332Ile→Gluの変異を含むXencor型ペプチド(m/z=838.504,z=1,ALPAPEEK)、又は変異を含まない非Xencor型ペプチド(m/z=854.462,z=1,ALPAPIEK)のMSピークのシグナル強度を算出することで、溶出画分に含まれるXencor型抗体の割合を算出した。
MSデータの解析は解析ソフトウェアXcalibur Qual Browser(Thermo Fisher Scientific社)を用いた。その結果、Xencor型ペプチドのシグナル強度が4.07×106、非Xencor型ペプチドのシグナル強度が1.06×106であり、シグナル強度の比較から約8割がXencor型抗体、約2割が非Xencor型抗体であると思われた。
溶出画分に含まれる約2割の非Xencor型抗体はIVIG中に含まれる会合体や血清タンパク質とIVIG中の自己反応成分の免疫複合体など、Xencor型抗体に置き換わって結合したXencor型抗体と同等以上のCD16a結合活性を持つ成分と考えられた。
次に、免疫複合体を構成する血清タンパク質の同定を試みた。SDS−PAGEによる分離において、コントロールとの差があり、かつ分析に用いるのに十分なタンパク質量のバンド7本について、LC−MS/MSによる分析を行った。
分析結果を質量分析解析検索エンジンMASCOT(Matrix science社)を用いて解析し、タンパク質の同定を行った。その結果、高スコアのバンドは、H鎖の断片・重合体由来と考えられた。分子量43kDaのバンドからヒトHpが同定された。
[実施例3]ヒト抗体産生動物への免疫
ヒトHpに対するモノクローナル抗体を取得するために、ヒト抗体産生動物2匹にアジュバントで混合したヒトHp(ATHENS RESEARCH&TECHNOLOGY社、mixed type)を3週間から4週間ごとに合計5回免疫した。抗体価は、免疫後約10日後に、ヒト及びマウスHpに対する結合活性をELISAにより解析し、2匹とも結合活性を示した。
ヒトHpに対するモノクローナル抗体を取得するために、ヒト抗体産生動物2匹にアジュバントで混合したヒトHp(ATHENS RESEARCH&TECHNOLOGY社、mixed type)を3週間から4週間ごとに合計5回免疫した。抗体価は、免疫後約10日後に、ヒト及びマウスHpに対する結合活性をELISAにより解析し、2匹とも結合活性を示した。
[実施例4]ハイブリドーマの作製
3回から5回免疫後、外科的にリンパ組織を摘出し、細胞融合に供した。まず、摘出したリンパ組織をDMEM培地(インビトロジェン社)に懸濁し、組織をすりつぶし、DMEM培地で洗浄した。得られた細胞をマウスミエローマ細胞株Sp2/0と混合し、DMEM培地で洗浄した。
3回から5回免疫後、外科的にリンパ組織を摘出し、細胞融合に供した。まず、摘出したリンパ組織をDMEM培地(インビトロジェン社)に懸濁し、組織をすりつぶし、DMEM培地で洗浄した。得られた細胞をマウスミエローマ細胞株Sp2/0と混合し、DMEM培地で洗浄した。
遠心分離により上清を除いたのち、あらかじめ37℃に温めていたPEG1500(Roche Diagnostics社)1mLを6秒ごとに100μLずつ添加した。添加後2分間、手で温めながら懸濁液を混合した。
その後、4分間かけて4mlの37℃に温めていたDMEM培地を添加し、更に1分間かけて10mLの培地を添加した。懸濁液を37℃の温浴で5分間温めた後、室温、1200rpmで5分間遠心した。遠心分離後、細胞をDMEM培地に懸濁し、96ウェルプレート(BD社)に播種し培養した。翌日以降、薬剤選択培地で約1週間培養した。
[実施例5]ハイブリドーマスクリーニング
実施例4で作製したハイブリドーマの培養上清ヒトHp及びマウスHpに対する結合活性を酵素結合免疫吸着法(ELISA)により解析した。まず、96ウェルプレート(MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社)に、ヒトHp(ATHENS RESEARCH&TECHNOLOGY社、mixed type)あるいはマウスHp(Life Diagnotics社)をPBSで10μg/mLに調製したものを50μL/ウェルずつ分注し、4℃にて一晩静置して吸着させた。
実施例4で作製したハイブリドーマの培養上清ヒトHp及びマウスHpに対する結合活性を酵素結合免疫吸着法(ELISA)により解析した。まず、96ウェルプレート(MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社)に、ヒトHp(ATHENS RESEARCH&TECHNOLOGY社、mixed type)あるいはマウスHp(Life Diagnotics社)をPBSで10μg/mLに調製したものを50μL/ウェルずつ分注し、4℃にて一晩静置して吸着させた。
固相化液を取り除いた後、1%bovine serum albumin(BSA)を含むPBS(以下、BSA−PBSと記す)を100μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置してブロッキングし、PBSTで3回洗浄した。次にハイブリドーマの培養上清を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。
このプレートをPBSTで3回洗浄した後、1%BSA−PBSで希釈したGoat anti Human IgG(H&L)−HRP(American Qualex社)を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。
このプレートをPBSTで3回洗浄し、ABTSを50μL/ウェルずつ分注して発色させた。適当な発色が得られたところで、1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を50μL/ウェルずつ分注し、サンプル波長415nm、リファレンス波長490nmにおける吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。
[実施例6]抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のクローニング
ヒトHpとマウスHpの両方に対して反応が見られたウェルのハイブリドーマについて、RNeasy Plus Micro Kit(キアゲン社)を用いて、添付書に従い、total RNAを調製した。得られたtotal RNAから、SMARTer RACE cDNA amplification kit(Clontech社)を用いて、添付書に従い、cDNAを調製した。
ヒトHpとマウスHpの両方に対して反応が見られたウェルのハイブリドーマについて、RNeasy Plus Micro Kit(キアゲン社)を用いて、添付書に従い、total RNAを調製した。得られたtotal RNAから、SMARTer RACE cDNA amplification kit(Clontech社)を用いて、添付書に従い、cDNAを調製した。
得られたcDNAを鋳型に、プライマーhhiu1(配列番号7)及びhhiu3(配列番号8)を用いて、ヒトIgG重鎖遺伝子を、プライマーhk2(配列番号9)及びhk5(配列番号10)を用いて、ヒト軽鎖(κ鎖)遺伝子を、それぞれPCRにより増幅した。増幅した遺伝子をサブクローニングし、塩基配列を解析した。
その結果、クローン#4、#6、#27、#105及び#96−6についてシグナル配列を除いたVH及びVLの塩基配列並びにアミノ酸配列を同定した。クローン#4のVH及びVLのそれぞれの塩基配列を配列番号11及び12並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号21及び22、クローン#6のVH及びVLのそれぞれの塩基配列を配列番号13及び14並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号23及び24、クローン#27のVH及びVLのそれぞれの塩基配列を配列番号15及び16並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号25及び26、クローン#105のVH及びVLのそれぞれの塩基配列を配列番号17及び18並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号27及び28、クローン#96−6のVH及びVLのそれぞれの塩基配列を配列番号19及び20並びにそれぞれのアミノ酸配列を配列番号29及び30で示した。
また、クローン#27のVHのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号31、32及び33に、クローン#27のVLのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号34、35及び36に、クローン#105のVHのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号37、38及び39に、クローン#105のVLのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号40、41及び42に示した。
[実施例7]ヒトIgG1型抗Hp抗体発現用組換え体ベクターの構築
ヒトIgG1型抗Hp抗体発現用組換え体ベクターは、実施例6で決定された抗Hp抗体重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を、それぞれヒトIgG1重鎖及びκ鎖定常領域遺伝子に連結することにより作製した。
ヒトIgG1型抗Hp抗体発現用組換え体ベクターは、実施例6で決定された抗Hp抗体重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子を、それぞれヒトIgG1重鎖及びκ鎖定常領域遺伝子に連結することにより作製した。
組換え体ベクターとしては、ヒトIgG1重鎖組換え体ベクターpFUSEss−CHIg−hG1(InvivoGen社)及びヒトIgG1κ鎖組換え体ベクターpFUSE2ss−CLIg−hk(InvivoGen社)を用いた。
実施例5で得られた転写産物から、重鎖可変領域遺伝子は制限酵素EcoRIとBsiWIサイト間に、軽鎖可変領域遺伝子は制限酵素EcoRIとNheIサイト間に、CloneEZ(登録商標)PCR Cloning Kit(GenScript社)を用いて挿入した。大腸菌DH5αコンピテントセル(TOYOBO社)に形質転換し、培養、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施することで、ヒトIgG1型抗Hp抗体発現用組換え体ベクターを作製した。
形質転換した大腸菌の培養には、重鎖組換え体ベクターは終濃度50μg/mLのZeocin(インビトロジェン社)を添加した培地LB Broth(Difco社)を用いて、κ鎖組換え体ベクターはFast−Media Blas TB(InvivoGen社)を用いた。
[実施例8]抗Hp抗体の一過性発現
ヒトIgG1型抗Hp抗体の一過性発現株を作製するため、宿主細胞に実施例7で作製された組換え体ベクターを導入した。宿主細胞としては、Freestyle 293F細胞(インビトロジェン社)を用いた。
ヒトIgG1型抗Hp抗体の一過性発現株を作製するため、宿主細胞に実施例7で作製された組換え体ベクターを導入した。宿主細胞としては、Freestyle 293F細胞(インビトロジェン社)を用いた。
プラスミド導入は293Fectin Transfection Reagent(インビトロジェン社)を用いて、添付書に従って行った。ヒトIgG1型抗Hp抗体組換え体ベクターとして、実施例7で作製した、重鎖組換え体ベクターとκ鎖組換え体ベクターを2:3で混合したものを用いた。回収した培養上清を遠心分離し、得られた培養上清を0.22μmフィルターを用いてろ過することでヒトIgG1型抗Hp抗体を含む培養上清を調製した。
[実施例9]抗Hp抗体の精製
実施例8で得られたヒトIgG1型抗Hp抗体一過性発現株を、Free style 293 expression medium(インビトロジェン社)に懸濁し、三角フラスコで6日間培養した後、培養上清を回収した。調製した培養上清からMabSelect SuRe(GEヘルスケア社)を用いて、ヒトIgG1型抗Hp抗体を精製した。
実施例8で得られたヒトIgG1型抗Hp抗体一過性発現株を、Free style 293 expression medium(インビトロジェン社)に懸濁し、三角フラスコで6日間培養した後、培養上清を回収した。調製した培養上清からMabSelect SuRe(GEヘルスケア社)を用いて、ヒトIgG1型抗Hp抗体を精製した。
まず、培養上清をカラムに通し、洗浄用緩衝液(0.15mol/L NaCl、0.2mol/L ホウ酸Na/pH7.5)でカラムを洗浄した後、pH3.5の溶出用緩衝液(0.1mol/Lクエン酸Na/pH3.5)で溶出した。
溶出したフラクションは速やかに中和用緩衝液(1mol/LTris−HCl/pH 8.5)で中和した。それぞれのフラクションの280nmの吸光度(A280)を測定し、測定値の高い連続フラクションを抗体画分として回収した。
Econo−Pac 10DG columns(BIO−RAD社)を用いて、PBSに緩衝液を交換し、0.22μmのフィルターを通したものを精製タンパク質とした。280nmの吸光係数を1.4として、濃度を算出した。
[実施例10]CD16a結合活性(ELISA)
実施例9で作製した抗Hp抗体(#4、#6、#27、#105及び#96−6)を用いて、抗Hp抗体とヒトHpの免疫複合体のCD16a結合活性をELISAで測定した。96ウェルプレート(MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社)に、抗Tetra−His抗体(キアゲン社)をPBSで5μg/mLに調製したものを50μL/ウェルずつ分注し、4℃にて一晩静置して吸着させた。
実施例9で作製した抗Hp抗体(#4、#6、#27、#105及び#96−6)を用いて、抗Hp抗体とヒトHpの免疫複合体のCD16a結合活性をELISAで測定した。96ウェルプレート(MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社)に、抗Tetra−His抗体(キアゲン社)をPBSで5μg/mLに調製したものを50μL/ウェルずつ分注し、4℃にて一晩静置して吸着させた。
固相化液を取り除いた後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置してブロッキングし、PBSTで5回洗浄した。次に実施例1で作製した可溶性CD16aを5μg/mLになるように1%BSA−PBSで希釈したものを50μL/ウェルずつ分注し、室温で2時間反応させて、PBSTで5回洗浄した。
抗Hp抗体とヒトHpの混合溶液(以下、ICと記す場合もある)を、1%BSA−PBSで希釈した後に室温で1時間静置して調製した。濃度は抗Hp抗体を150kDa、ヒトHpを200kDaとした時に、抗Hp抗体とヒトHpのモル比が1:2になるように添加した。適宜1%BSA−PBSで希釈した混合溶液を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間反応させた。
このプレートをPBSTで5回洗浄した後、1%BSA−PBSで希釈したGoat anti Human IgG(H&L)−HRP(American Qualex社)を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。
このプレートをPBSTで5回洗浄し、ABTSを50μL/ウェルずつ分注して発色させた。適当な発色が得られたところで、1%SDSを50μL/ウェルずつ分注し、サンプル波長415nm、リファレンス波長490nmにおける吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。
その結果、IVIGのEC50値が1.06μg/mLであったのに対し、各抗体単独でのEC50値は、#4は1.99μg/mL、#6は0.805μg/mL、#27は0.763μg/mL、#105は0.405μg/mL、#96−6は0.473μg/mLであった。いずれの抗Hp抗体も、IVIGに比べ、CD16aに対する結合活性が高いことが明らかとなった(図1A〜図1F)。
また、驚くべきことに、各抗体をヒトHpと混合した際のEC50値は、#4は0.298μg/mLであるのに対し、#6は0.0664μg/mL、#27は0.0490μg/mL、#105は0.0540μg/mL、#96−6は0.0459μg/mLであった。これは抗体をヒトHpと混合することにより、ヒトHpと免疫複合体が形成され、CD16aに対する結合活性が亢進したことを示している(図1A〜図1E)。
[実施例11]安定発現による抗Hp抗体の作製
以下に記載する方法で抗Hp抗体(#4、#6、#27、#105及び#96−6)を作製した。
(1)安定発現用の抗Hp抗体発現用組換え体ベクターの構築
組換え体ベクターとしては、ヒトIgG1κの定常領域遺伝子を含む組換え体ベクターとしてpDELTAを用いた。重鎖可変領域遺伝子は制限酵素NotIとApaIのサイト間に、軽鎖可変領域遺伝子は制限酵素EcoRIとBsiWIサイト間に、In−Fusion HD Cloning Kit(Clontech社)を用いて挿入し、安定発現用抗Hp抗体発現用組換え体ベクターを作製した。
以下に記載する方法で抗Hp抗体(#4、#6、#27、#105及び#96−6)を作製した。
(1)安定発現用の抗Hp抗体発現用組換え体ベクターの構築
組換え体ベクターとしては、ヒトIgG1κの定常領域遺伝子を含む組換え体ベクターとしてpDELTAを用いた。重鎖可変領域遺伝子は制限酵素NotIとApaIのサイト間に、軽鎖可変領域遺伝子は制限酵素EcoRIとBsiWIサイト間に、In−Fusion HD Cloning Kit(Clontech社)を用いて挿入し、安定発現用抗Hp抗体発現用組換え体ベクターを作製した。
大腸菌DH5αコンピテントセルに形質転換し、培養、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施することで、組換え体ベクターを作製した。PCRには、鋳型として実施例7で作製されたヒトIgG1型抗Hp抗体発現用組換え体ベクターを、PCRプライマーとして配列番号43−62で示すプライマーを用いた。
(2)フコース結合型抗体の作製
フコース結合型抗Hp抗体の安定発現株を作製するため、宿主細胞に実施例11(1)で作製した組換え体ベクターを導入した。宿主細胞としてCHO−K1細胞を用いた。エレクトロポレーション法による組換え体ベクターの細胞への遺伝子導入、培養、薬剤選抜は一般的な方法で行った。培養一週間に一度、薬剤入りの培地を交換し、生細胞の割合が98%程度に回復したものを安定発現バルク株とした。
フコース結合型抗Hp抗体の安定発現株を作製するため、宿主細胞に実施例11(1)で作製した組換え体ベクターを導入した。宿主細胞としてCHO−K1細胞を用いた。エレクトロポレーション法による組換え体ベクターの細胞への遺伝子導入、培養、薬剤選抜は一般的な方法で行った。培養一週間に一度、薬剤入りの培地を交換し、生細胞の割合が98%程度に回復したものを安定発現バルク株とした。
この安定発現株を8mmol/LGln及び50μg/mL ゲンタマイシン(ナカライテスク社)を含むEX−CELL 325 PF CHO Serum−Free Medium for CHO Cells(Sigma−Aldrich社)等の培地に3x105cells/mLとなるように懸濁して14日間培養後、培養上清を回収した。培養上清から実施例9に記載の方法で抗Hp抗体を精製した。
(3)フコース非結合型抗体の作製
フコース非結合型抗Hp抗体の安定発現株を作製するため、宿主細胞に実施例11(1)で作製した組換え体ベクターを導入した。宿主細胞としてFUT8ノックアウトCHO細胞(国際公開第2005/035586号、国際公開第02/31140号)を用い、その後の操作は実施例11(2)に記載の方法に準じて実施した。
フコース非結合型抗Hp抗体の安定発現株を作製するため、宿主細胞に実施例11(1)で作製した組換え体ベクターを導入した。宿主細胞としてFUT8ノックアウトCHO細胞(国際公開第2005/035586号、国際公開第02/31140号)を用い、その後の操作は実施例11(2)に記載の方法に準じて実施した。
(4)陰性対照抗体DNP抗体の作製
陰性対照抗体であるdinitrophenylhydrazine(DNP)抗体は、公知の方法(Motoki K et. al., Clin.Cancer Res.11,3126-3135,2005)に準じて作製した。
陰性対照抗体であるdinitrophenylhydrazine(DNP)抗体は、公知の方法(Motoki K et. al., Clin.Cancer Res.11,3126-3135,2005)に準じて作製した。
[実施例12]Fcアミノ酸改変型の抗Hp抗体の作製
組換え体ベクターは、アミノ酸改変(S239D、I332E)を含むヒトIgG1のFc領域遺伝子配列(配列番号63)(以下、hCg1 Xen 239 332と略記する場合もある)の合成DNA(GENEWIZ社)を、実施例11(1)で作製した組換え体ベクターの制限酵素NheIとBamHIサイトの間に挿入することによって作製した。また、当該組換え体ベクターは、NheIではなく、ApaIを用いても、作製することができた。
組換え体ベクターは、アミノ酸改変(S239D、I332E)を含むヒトIgG1のFc領域遺伝子配列(配列番号63)(以下、hCg1 Xen 239 332と略記する場合もある)の合成DNA(GENEWIZ社)を、実施例11(1)で作製した組換え体ベクターの制限酵素NheIとBamHIサイトの間に挿入することによって作製した。また、当該組換え体ベクターは、NheIではなく、ApaIを用いても、作製することができた。
その後の操作を、実施例11(3)に記載の方法に準じて行うことによって、フコース非結合型かつFcアミノ酸改変型の抗Hp抗体を作製した。同様の方法で、3カ所のFcアミノ酸改変(S239D、S298A、I332E)を施したフコース非結合型かつFcアミノ酸改変型の抗Hp抗体を作製した。
[実施例13]抗Hp抗体の抗原結合活性
実施例9で作製した抗Hp抗体(#4、#6、#27、#105及び#96−6)を用いて、抗Hp抗体のヒトHpに対する結合活性をELISAにより解析した。まず、96ウェルプレート(MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社)に、ヒトHp(日本血液製剤機構)をPBSで5μg/mLに調製したものを50μL/ウェルずつ分注し、4℃にて一晩静置して吸着させた。
実施例9で作製した抗Hp抗体(#4、#6、#27、#105及び#96−6)を用いて、抗Hp抗体のヒトHpに対する結合活性をELISAにより解析した。まず、96ウェルプレート(MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社)に、ヒトHp(日本血液製剤機構)をPBSで5μg/mLに調製したものを50μL/ウェルずつ分注し、4℃にて一晩静置して吸着させた。
固相化液を取り除いた後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置してブロッキングし、PBSTで3回洗浄した。次に1%BSA−PBSで適当な濃度になるように希釈した抗Hp抗体を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。その後の操作は、プレートリーダーによる吸光度測定(サンプル波長405nm)以外は、実施例5に記載の方法に準じて実施した。
その結果、#6、#27、#105及び#96−6の4抗体はいずれもヒトHpに対して高い結合活性を示した(図2)。なお、#4もこれら4抗体と同等の結合活性を示した。次に、ウェスタンブロッティングにより、実施例9で作製した抗Hp抗体(#4、#6、#27、#105及び#96−6)が、ヒトHpのうち、α鎖又はβ鎖のいずれに対し結合活性を有するかを解析した。まず、メルカプトエタノールを含む還元条件のサンプル緩衝液を用いて調製したヒトHpをSDS−PAGE電気泳動で分離した後、PVDF膜にブロットした。各抗Hp抗体と反応させた後、結合している抗体をGoat anti Human IgG(H&L)−HRP(American Qualex社)で検出した。
その結果、#4、#6、#27、#105及び#96−6の5抗体は、いずれもβ鎖に対する特異的な結合活性を示した。以上より、#4、#6、#27、#105及び#96−6の5抗体は、いずれもβ鎖を特異的に認識してヒトHpに結合する抗体であることがわかった。
[実施例14]抗Hp抗体とヒトHpの免疫複合体の分子量解析
抗Hp抗体とヒトHpが結合し、免疫複合体を形成していることを確認するために、HPLC(Prominence、島津製作所)を用いたゲルろ過クロマトグラフィー(Size Exclusion Chromatography、SEC)(カラム;BioSep SEC−s4000、7.8×300mm、phenomenex社)による分析を行った。
抗Hp抗体とヒトHpが結合し、免疫複合体を形成していることを確認するために、HPLC(Prominence、島津製作所)を用いたゲルろ過クロマトグラフィー(Size Exclusion Chromatography、SEC)(カラム;BioSep SEC−s4000、7.8×300mm、phenomenex社)による分析を行った。
移動相[50mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0、500mmol/L NaCl)]でカラムを平衡化し、抗Hp抗体とヒトHp(日本血液製剤機構)がそれぞれ0.5mg/mLと1.3mg/mLになるようにPBSで希釈して混合し、37℃にて16時間静置した。
混合液50μLに含まれる成分を流速0.5mL/minで分離後、波長280nmで検出される各ピークについて、多角度光散乱検出器(Multi Angle Light Scattering;MALS)(miniDAWN TREOS、Wyatt Technology社)によって検出される散乱強度の最大値を用いて分子量を算出した。結果を表1に示す。
その結果、混合液を分析した際は、抗Hp抗体あるいはヒトHpをそれぞれ単独で分析した場合よりも、溶出時間が速い高分子量のピークが検出され、このピークは抗Hp抗体及びヒトHpからなる免疫複合体を形成していることが示唆された。
前記の通り、Hpはα/β−サブユニットがいくつ含まれるかにより、複数の分子量の構造をとり得る。MALSによる分子量解析において、ヒトHpの分子量は206×103と算出された。よって、ここで用いたヒトHpの主成分はα/β−サブユニットが4つ含まれるものであると推定された[J Sep Sci., 32, 1224 (2009)]。
また、表1に示すように、免疫複合体の分子量は#4が形成する免疫複合体と比較して、#6、#27、#105及び#96−6が形成する免疫複合体の方が大きかった。
さらに、抗体の分子量を150×103として、免疫複合体に含まれる抗体及びヒトHpの分子数を推定した。その結果、#4が形成する免疫複合体では抗体1分子及びヒトHp1分子を含むと推定された。一方、#27が形成する免疫複合体では抗体2分子及びヒトHp1分子、#6、#105及び#96−6が形成する免疫複合体では抗体2分子及びヒトHp2分子以上を含むと推定された。
[実施例15]CD32a結合活性(ELISA)
(1)可溶性CD32aの作製
実施例1に記載の方法に準じて、ヒスチジンタグ融合可溶性CD32aを作製した。アミノ酸配列を配列番号64に示す。
(1)可溶性CD32aの作製
実施例1に記載の方法に準じて、ヒスチジンタグ融合可溶性CD32aを作製した。アミノ酸配列を配列番号64に示す。
(2)抗Hp抗体とヒトHpの免疫複合体のCD32a結合活性
実施例15(1)で作製した可溶性CD32aを用いて、実施例10と同様の方法で抗Hp抗体とヒトHpの免疫複合体のCD32a結合活性を解析した。
実施例15(1)で作製した可溶性CD32aを用いて、実施例10と同様の方法で抗Hp抗体とヒトHpの免疫複合体のCD32a結合活性を解析した。
その結果、実施例10において、抗体をヒトHpと混合することにより、ヒトHpと免疫複合体が形成され、CD16aに対する結合活性が亢進した抗体のうち4抗体(#6、#27、#105及び#96−6)は、CD32aに対する結合活性解析においても、ヒトHpと混合することにより、CD32aに対する結合活性の亢進を示した。一方、#4は、活性の亢進を示さなかった(図3)。
[実施例16]CD16aと抗DNP抗体の結合に対する阻害活性
(1)CD16aの組換え体ベクターの構築
実施例1(2)で作製した、全長CD16a(V)(配列番号4)をコードするcDNAを含む、プラスミドpBs CD16a(V)5.0μgを制限酵素NotI(タカラバイオ社)及びBamHI(タカラバイオ社)で消化後、1.5%アガロースゲル電気泳動に供し、約800bpのDNA断片を回収した。
(1)CD16aの組換え体ベクターの構築
実施例1(2)で作製した、全長CD16a(V)(配列番号4)をコードするcDNAを含む、プラスミドpBs CD16a(V)5.0μgを制限酵素NotI(タカラバイオ社)及びBamHI(タカラバイオ社)で消化後、1.5%アガロースゲル電気泳動に供し、約800bpのDNA断片を回収した。
一方、国際公開第97/10354号に記載のプラスミドpKANTEX93 10μgを制限酵素NotI I(タカラバイオ社)及びBamHI I(タカラバイオ社)で消化後、1.5%アガロースゲル電気泳動に供し、約11.7kbpのDNA断片を回収した。これら約800bpのDNA断片と約11.7kbpのDNA断片をDNA Ligation Kit Ver.2.0(タカラバイオ社製)にて連結し、大腸菌DH5α株(TOYOBO社)を形質転換して、全長CD16a(V)をコードする組換え体ベクターpKANTEX CD16a(V)を取得した。
(2)CD16a発現細胞の作製
実施例16(1)で構築した全長CD16a(V)をコードする組換え体ベクターpKANTEX CD16a(V)をDHFR遺伝子欠損CHO細胞DG44株(CHO/DG44細胞)に導入し、CD16aの安定生産細胞を以下のように作製した。
実施例16(1)で構築した全長CD16a(V)をコードする組換え体ベクターpKANTEX CD16a(V)をDHFR遺伝子欠損CHO細胞DG44株(CHO/DG44細胞)に導入し、CD16aの安定生産細胞を以下のように作製した。
pKANTEX CD16a(V)をエレクトロポレーション法によりCHO/DG44細胞に遺伝子導入した。実施例1(5)に記載の方法と同様にMTX濃度を順次上昇させ、最終的に0.5mg/mLのG418及び500nmol/LのMTX及び10%FBS(GIBCO社)を含むIMDM(GIBCO社)で増殖可能であり、かつ、CD16aを高発現する形質転換細胞を得た。
得られた形質転換細胞を0.02% EDTA溶液(ナカライテスク社)で剥離し、PBS(phosphate buffered saline)で洗浄した後、FCM用緩衝液1(2%FBS、0.05%NaN3及び1mmol/L EDTAを含むPBS)で懸濁した。
次に、2×105cells/wellとなるように96ウェルU底プレート(Falcon社)に播種しPE標識抗ヒトCD16抗体(BDバイオサイエンス社)で染色、洗浄後に、細胞をFCM用緩衝液1で懸濁し、蛍光強度をフローサイトメーター(BDバイオサイエンス社、FACS CantoII)で解析し、CD16aが高発現していることを確認した。
(3)CD16aと抗DNP抗体の結合に対する阻害活性
実施例11で作製した抗Hp抗体(フコース結合型及びフコース非結合型)、フコース非結合型抗Hp抗体及びヒトHpからなる免疫複合体、並びにIVIGを用いて、CD16aと抗DNP抗体の結合に対する阻害活性を検討した。
実施例11で作製した抗Hp抗体(フコース結合型及びフコース非結合型)、フコース非結合型抗Hp抗体及びヒトHpからなる免疫複合体、並びにIVIGを用いて、CD16aと抗DNP抗体の結合に対する阻害活性を検討した。
実施例16(2)で作製されたCD16a発現細胞を1.2×105cells/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種した。次に、実施例11で作製した抗Hp抗体(フコース結合型及びフコース非結合型)、フコース非結合型抗Hp抗体及びヒトHpからなる免疫複合体、並びにIVIGを、FCM用緩衝液1で希釈した後、室温で1時間静置し被験体とした。
フコース非結合型抗Hp抗体及びヒトHpからなる免疫複合体は、抗Hp抗体を150kDa、ヒトHpを200kDaとした時に、抗Hp抗体とヒトHpのモル比が1:2になるように調製した。これら被験体を、先に細胞を播種したプレートに10μL/ウェル加え、4℃にて5分間反応させた。
別で、実施例11(4)で作製した抗DNP抗体とDNP(2−4−Dinitrophenol)−BSA Protein Biotin Conjugate(Alpha Diagnotics社)がいずれも0.05mg/mLとなるように混合し、室温で1時間静置することにより、抗DNP抗体溶液とした。
被験体を添加して4℃にて5分間反応させた前記プレートに、競合抗体として抗DNP抗体溶液を10μL/ウェル加え、4℃にて3時間反応させた。FCM用緩衝液1でこのプレートを洗浄後、streptavidin,Alexa Fluor 647 conjugate(Molecular Probes社)を用いて、結合している抗DNP抗体を検出することにより、CD16a結合阻害活性を検討した。
その結果、IC50値は、#27のフコース結合型と#27のフコース非結合型、それぞれ238μg/mLと53.8μg/mLとなり、フコース非結合型にすることでより強い阻害活性を示した。
また、驚くべきことに、#27のフコース非結合型又は#105のフコース非結合型をヒトHpとそれぞれ混合し免疫複合体を形成させると、IC50値はそれぞれ11.7μg/mLと7.92μg/mLとなり、免疫複合体形成によってさらに強い結合阻害活性を示した。IVIGのIC50値は540μg/mLであった。
このことから、#27又は#105による、CD16aと抗DNP抗体の結合に対する阻害活性は、#27及び#105をそれぞれフコース非結合型への改変することにより、さらに、それぞれがヒトHpと免疫複合体形成することにより、大幅に亢進することが明らかとなった(図4)。
[実施例17]PBMCを用いたADCC反応に対する阻害活性
PBMCを用いたADCC反応における、抗Hp抗体及び免疫複合体化した抗Hp抗体による阻害活性を検討した。ADCC活性は、国際公開第2007/011041号に記載の方法に準じて測定した。
PBMCを用いたADCC反応における、抗Hp抗体及び免疫複合体化した抗Hp抗体による阻害活性を検討した。ADCC活性は、国際公開第2007/011041号に記載の方法に準じて測定した。
標的細胞としてHer2陽性ヒト乳癌細胞SK−BR−3を用い、エフェクター細胞には健常人ドナー由来の凍結PBMC(Lonza社)を用いた。標的細胞は100ng/mLの市販抗Her2抗体Herceptinでオプソニン化した。標的細胞に対するエフェクター細胞の比は1:20で実験を行った。
まず、実施例11で作製した抗Hp抗体(フコース結合型及びフコース非結合型)、フコース非結合型抗Hp抗体及びヒトHpからなる免疫複合体、並びにIVIGを、5%FBSを含むRPMI1640で希釈した後に室温で1時間静置し被験体とした。フコース非結合型抗Hp抗体及びヒトHpからなる免疫複合体は、抗Hp抗体を150kDa、ヒトHpを200 kDaとした時に、抗Hp抗体とヒトHpのモル比が1:2になるように調製した。
次に、96ウェルU底プレート(Falcon社)に、Herceptin、被験体、エフェクター細胞、標的細胞の順に添加して37℃(5%CO2)で4時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸脱水素酵素(LDH)活性を、LDH−Cytotoxic Test(和光純薬社)を用いて、添付の説明書にしたがって測定した。ADCC(%)は以下の式により算出した。
ADCC(%)=100×(S−Ab)/(Max−T)
S=サンプル反応ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Ab=抗体無添加ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
T=標的ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Max=100%反応ウェル吸光度−100%反応対照ウェル吸光度
S=サンプル反応ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Ab=抗体無添加ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
T=標的ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Max=100%反応ウェル吸光度−100%反応対照ウェル吸光度
その結果、#27のフコース非結合型又は#105のフコース非結合型をヒトHpと混合しそれぞれ免疫複合体を形成させると、IVIG及び#27のフコース非結合型と比べて低濃度からADCC活性を阻害する作用を示した。このことから、ADCC活性は、免疫複合体形成によって大幅に減弱することが明らかとなった(図5)。#6及び#96−6に関しても、同様に本評価系に供することによって高い阻害活性を示すことを確認した。
[実施例18]健常人ドナーの末梢血液を用いたADCC反応の阻害活性
(1)フコース非結合型rituximabの作製
フコース非結合型抗CD20抗体rituximab(米国特許第5,736,137号明細書)は公知の方法(Masuda K et. al., Mol. Immunol.44,3122-3131,2007)に準じて作製した。
(1)フコース非結合型rituximabの作製
フコース非結合型抗CD20抗体rituximab(米国特許第5,736,137号明細書)は公知の方法(Masuda K et. al., Mol. Immunol.44,3122-3131,2007)に準じて作製した。
(2)健常人ドナーの末梢血液を用いたADCC反応の阻害活性
健常人ドナーの末梢血液を用いたADCC反応における、抗Hp抗体の阻害活性を検討した。健常人ドナーの末梢血液を用いたADCC反応は、公知の方法(Masuda K et.al., Mol. Immunol.44,3122-3131,2007)に準じて測定した。
健常人ドナーの末梢血液を用いたADCC反応における、抗Hp抗体の阻害活性を検討した。健常人ドナーの末梢血液を用いたADCC反応は、公知の方法(Masuda K et.al., Mol. Immunol.44,3122-3131,2007)に準じて測定した。
まず、実施例11及び実施例12で作製した抗Hp抗体、抗DNP抗体、及びこれら抗体の各種改変型、並びにIVIGを、RPMI1640で終濃度の15倍に調製し、被験体とした。
次に、48ウェルプレート(greiner bio−one社)の各ウェルに、被験体30μLと健常人ドナーの末梢血液を390μL、それぞれ分注した。37℃(5%CO2)で30分間培養後、(1)で作製されたフコース非結合型rituximabを、最終濃度が1μg/mLとなるようにRPMI1640で希釈して各ウェルに30μLずつ分注した。
ADCC未反応のウェルには、フコース非結合型rituxiamabの代わりにRPMI1640を、被験体非存在下でフコース非結合型rituximabによるADCC反応を行ったウェルには、被験体の代わりにRPMI1640を分注した。48ウェルプレートを37℃(5%CO2)で20時間培養後、B細胞数をカウントした。
具体的には、各ウェルから150μLを分取し、CountBright Absolute Counting Beads,for flow cytometry(Molecular Probes社)を30μL/サンプルで添加した後、溶血用溶液[10×RBC Lysis buffer(e−bioscience社)を滅菌水で10倍に希釈したもの]を用いて添付書に従って溶血操作をした。
遠心分離後、上清を捨て、沈査として得られた細胞を96ウェルU底プレート(Falcon社)に移し、FCM用緩衝液2(0.05%NaN3及び1mmol/L EDTAを含む1%BSA−PBS)75μLに懸濁した。
FcR Blocking Reagent,human(ミルテニーバイオテク社)を5μL/ウェルずつ分注し、4℃にて5分間静置した後、さらにFCM用緩衝液2で希釈したAPC Mouse Anti−Human CD19(BDバイオサイエンス社)、PE Mouse Anti−Human CD2(BDバイオサイエンス社)を添加し、4℃にて30分以上反応を行った。
死細胞はLIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit,for 405nm excitation(Molecular Probes社)を用いて添付の説明書に従い染色した。再び細胞を洗浄した後、FCM用緩衝液2に懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー(BDバイオサイエンス社、FACS CantoII)を用いて解析した。B細胞をFSC−SSC展開のリンパ球画分におけるLIVE/DEAD陰性、CD19陽性、CD2陰性画分として検出した。
ADCC活性は、CountBright Absolute Counting Beads 2400個あたりのB細胞数を解析する方法、あるいは、リンパ球画分におけるLIVE/DEAD陰性、CD19陽性の割合を解析する方法のいずれかにより評価した。
その結果、#27のフコース非結合型及び#105のフコース非結合型は、Fcドメインが同じ構造を持つ抗DNP抗体のフコース非結合型よりも、高いADCC反応に対する阻害活性を示すことが明らかになった。その阻害活性は、IVIGと比較して大幅に高かった。また、Fcアミノ酸改変(S239D、I332E)を施した抗Hp抗体のフコース非結合型は、さらに高い阻害活性を示した(図6A)。
抗DNP抗体は、本発明の抗Hp抗体と異なり、末梢血液中にリガンドを含まず、単量体で存在すると考えられる。従って、これらの結果は、本発明の抗Hp抗体が、血液中でヒトHpと免疫複合体を形成することで、高い阻害活性を発揮できることを示唆している。
以上の結果から、ADCC反応に対する阻害活性は、免疫複合体形成とポテリジェント技術に加えて、Fcアミノ酸改変を組み合わせることで、顕著に亢進することが明らかとなった(図6A)。
Fcアミノ酸改変(S239D、S298A、I332E)を施した#27のフコース非結合型は、図6Aの実験と同様に高い阻害活性を示した。このことから、ADCC反応に対する阻害活性は、Fcアミノ酸改変(S239D、S298A、I332E)によっても、顕著に亢進することが明らかとなった。
一方で、Fcアミノ酸改変(S239D、S298A、I332E)を施した#4のフコース非結合型では阻害活性の程度は低かった。このことから、抗Hp抗体のクローンによってその阻害活性が異なることが明らかとなった。実施例14の結果も併せて考察すると、高い阻害活性を発揮する上で、ヒトHpと抗Hp抗体の免疫複合体に含まれる抗体数が2個以上であることが重要だと考えられた(図6B)。
[実施例19]ヒトHpと抗Hp抗体の結合に対する作用
(1)酵素標識抗体の作製
実施例11(2)で作製した抗Hp抗体(#6、#105及び#96−6)及び抗Hpラビットポリクローナル抗体(ロックランド イムノケミカル社)(以下、抗Hpポリクロ抗体と記す)をPeroxidase Labeling Kit−NH2(同仁化学研究所社)を用い、添付の説明書に基づいて、標識した。各抗Hp抗体200μgの溶媒をFiltration Tubeを用いて洗浄用緩衝液に置換した後、NH2−Reactive Peroxidaseを添加し、37℃で2時間反応させた。その後、標識抗体の溶媒を洗浄用緩衝液に再度置換した。
(1)酵素標識抗体の作製
実施例11(2)で作製した抗Hp抗体(#6、#105及び#96−6)及び抗Hpラビットポリクローナル抗体(ロックランド イムノケミカル社)(以下、抗Hpポリクロ抗体と記す)をPeroxidase Labeling Kit−NH2(同仁化学研究所社)を用い、添付の説明書に基づいて、標識した。各抗Hp抗体200μgの溶媒をFiltration Tubeを用いて洗浄用緩衝液に置換した後、NH2−Reactive Peroxidaseを添加し、37℃で2時間反応させた。その後、標識抗体の溶媒を洗浄用緩衝液に再度置換した。
(2)ヒトHpと取得した抗Hp抗体の結合に対する作用
ヒトHpと実施例19(1)で作製した標識抗Hp抗体(#6、#105及び#96−6)の結合に対する#27及び#105の作用を評価した。96ウェルプレート (MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社)に、ヒトHpをPBSで5μg/mLに調製したものを50μL/ウェルずつ分注し、4℃で一晩静置して吸着させた。
ヒトHpと実施例19(1)で作製した標識抗Hp抗体(#6、#105及び#96−6)の結合に対する#27及び#105の作用を評価した。96ウェルプレート (MAXISORP NUNC−IMMUNO PLATE、Thermo Fisher Scientific社)に、ヒトHpをPBSで5μg/mLに調製したものを50μL/ウェルずつ分注し、4℃で一晩静置して吸着させた。
固相化液を取り除いた後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置してブロッキングし、PBSTで3回洗浄した。次に1%BSA−PBSで20μg/mLになるように希釈した抗Hp抗体(#27、#105、#6若しくは#96−6)、又は、対照抗体として抗DNP抗体(実施例11(4)で作製)若しくは抗Hpポリクロ抗体を50μL/ウェルずつ分注し、室温で10分間静置した。
その後、1%BSA−PBSで希釈した標識抗Hp抗体(#6、#105又は#96−6)[実施例19(1)で作製]を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。このプレートをPBSTで3回洗浄し、ABTSを50μL/ウェルずつ分注して発色させた。適当な発色が得られたところで、1%SDSを50μL/ウェルずつ分注し、サンプル波長415nm、リファレンス波長490nmにおける吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。
結果を表2に示す。表2内の+及び−は、吸光度が0.5以上であった場合を+とし、0.5未満であった場合を−として示した。ヒトHpと標識抗Hp抗体(#6、#105又は#96−6)の結合は、抗DNP抗体の添加では阻害されなかった一方で、それぞれの未標識体の抗Hp抗体の添加及び抗Hpポリクロ抗体の添加によって阻害され、本評価系で競合の有無が評価できることを予め確認した。
表2に示すように、ヒトHpと標識抗Hp抗体(#6、#105又は#96−6)の結合は#27の添加により阻害されなかった。このことは、#27が認識するヒトHpのエピトープは、#6、#105及び#96−6のエピトープとは異なることを示唆している。また、ヒトHpと#6又は#96−6の結合は#105の添加で阻害されなかった。このことは、#105のエピトープは、#27のみならず#6及び#96−6のエピトープとも異なることを示唆している。
(3)ヒトHpと市販抗Hp抗体の結合に対する作用
(i)ヒトHpと市販抗Hp抗体の結合性
市販の抗Hpマウス抗体3クローンを用いて、ヒトHpへの結合性を評価した。まず、実施例19(2)に記載の方法に準じて、96ウェルプレートにヒトHpを固相化し、ブロッキングした。ブロッキング後、1%BSA−PBSにより1μg/mLに希釈した市販抗Hp抗体2B11(LifeSpan BioSciences社)(以下、市販2B11抗体と記す)、2F4(Santa Cruz社)(以下、市販2F4抗体と記す)又はF8(Santa Cruz社)(以下、市販F8抗体と記す)、並びに、対照抗体としてマウスIgG1型アイソタイプコントロール抗体又は標識抗Hpポリクロ抗体[実施例19(1)で作製]を、それぞれ50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。
(i)ヒトHpと市販抗Hp抗体の結合性
市販の抗Hpマウス抗体3クローンを用いて、ヒトHpへの結合性を評価した。まず、実施例19(2)に記載の方法に準じて、96ウェルプレートにヒトHpを固相化し、ブロッキングした。ブロッキング後、1%BSA−PBSにより1μg/mLに希釈した市販抗Hp抗体2B11(LifeSpan BioSciences社)(以下、市販2B11抗体と記す)、2F4(Santa Cruz社)(以下、市販2F4抗体と記す)又はF8(Santa Cruz社)(以下、市販F8抗体と記す)、並びに、対照抗体としてマウスIgG1型アイソタイプコントロール抗体又は標識抗Hpポリクロ抗体[実施例19(1)で作製]を、それぞれ50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。
このプレートをPBSTで3回洗浄した後、1% BSA−PBSで希釈したRabbit anti−Mouse IgG−HRP(Dako社)を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。この後の、発色及び吸光度の測定は実施例5に記載の方法に準じて実施した。その結果、市販2B11抗体及び市販2F4抗体はヒトHpに対する結合性を示したが、市販F8抗体はヒトHpに対する結合性をほとんど示さなかった。このことから、市販2B11抗体及び市販2F4抗体を用いて他の評価を実施した。
(ii)ウシHp又はマウスHpと市販抗Hp抗体の結合性
市販2B11抗体及び市販2F4抗体の、ウシHp(Life Diagnostics社)及びマウスHpに対する結合性を、#27及び#105のウシHp及びマウスHpに対する結合性と比較した。まず、実施例19(2)に記載の方法に準じて、96ウェルプレートにヒトHp、ウシHp又はマウスHpを固相化し、ブロッキングした。
市販2B11抗体及び市販2F4抗体の、ウシHp(Life Diagnostics社)及びマウスHpに対する結合性を、#27及び#105のウシHp及びマウスHpに対する結合性と比較した。まず、実施例19(2)に記載の方法に準じて、96ウェルプレートにヒトHp、ウシHp又はマウスHpを固相化し、ブロッキングした。
ブロッキング後、1%BSA−PBSにより1μg/mLに希釈した抗Hp抗体(#27若しくは#105)、市販抗Hp抗体(市販2B11抗体若しくは市販2F4抗体)又は対照抗体(抗DNP抗体、マウスIgG1型アイソタイプコントロール抗体若しくは標識抗Hpポリクロ抗体)を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。
このプレートをPBSTで3回洗浄した後、1%BSA−PBSにより希釈したGoat anti Human IgG(H&L)−HRP又はRabbit anti−Mouse IgG−HRPを50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。このプレートをPBSTで3回洗浄し、TMB(Dako社)を50μL/ウェルずつ分注して発色させた。適当な発色が得られたところで、0.5mol/L H2SO4(和光純薬社)を50μL/ウェルずつ分注し、450nmにおける吸光度を測定した。
結果を表3に示す。抗Hp抗体(#27又は#105)を反応させたウェルの吸光度については、抗DNP抗体を反応させたウェルの吸光度を引いた値を求めた。また、市販抗Hp抗体(市販2B11抗体又は市販2F4抗体)を反応させたウェルの吸光度については、マウスIgG1型アイソタイプコントロール抗体を反応させたウェルの吸光度を引いた値を求めた。その値が1以上であった場合を+とし、1未満であった場合を−として表内に示した。抗Hpポリクロ抗体とヒトHp、ウシHp及びマウスHpの結合から、抗原が固相化されていることを予め確認した。
表3に示すように、#27、#105及び市販2F4抗体はウシHpに結合しなかったのに対し、市販2B11抗体はウシHpにも結合した。このことから、市販2B11抗体はヒト−ウシで相同のアミノ酸残基に結合しているのに対し、#27、#105及び市販2F4抗体はヒト−ウシで非相同のアミノ酸残基に結合することが示され、#27及び#105は市販2B11抗体と異なるエピトープを認識していることが明らかとなった。
さらに、#27及び#105はマウスHpに結合したのに対し、市販2F4抗体はマウスHpに結合しなかった。このことから、#27及び#105は、市販2F4抗体と同様にヒト−ウシで非相同のアミノ酸残基を認識することが明らかとなった。また、#27及び#105がヒト−マウスで相同のアミノ酸残基に結合するのに対し、市販2F4抗体はヒト−マウスで非相同のアミノ酸残基に結合していることが示され、#27及び#105は市販2F4抗体と異なるエピトープを認識していることが明らかとなった。
(iii)競合ELISA
#27及び#105が市販2F4抗体と異なるエピトープを認識することを別の方法で評価する目的で、ヒトHpと市販2F4抗体の結合に対する#27及び#105の作用を評価した。実施例19(1)に記載の方法に準じて、96ウェルプレートにヒトHpを固相化し、ブロッキングした後、1% BSA−PBSで20μg/mLになるように希釈した抗Hp抗体(#27若しくは#105)又は対照抗体として抗DNP抗体若しくは抗Hpポリクロ抗体を50μL/ウェルずつ分注し、室温で10分間静置した。
#27及び#105が市販2F4抗体と異なるエピトープを認識することを別の方法で評価する目的で、ヒトHpと市販2F4抗体の結合に対する#27及び#105の作用を評価した。実施例19(1)に記載の方法に準じて、96ウェルプレートにヒトHpを固相化し、ブロッキングした後、1% BSA−PBSで20μg/mLになるように希釈した抗Hp抗体(#27若しくは#105)又は対照抗体として抗DNP抗体若しくは抗Hpポリクロ抗体を50μL/ウェルずつ分注し、室温で10分間静置した。
続いて1%BSA−PBSで500倍に希釈した市販2F4抗体を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。このプレートをPBSTで3回洗浄した後、1%BSA−PBSで希釈したRabbit anti−mouse IgG HRP(Dako社)を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。この後の、発色及び吸光度の測定は実施例5に記載の方法に準じて実施した。
結果を表4に示す。表4内の+及び−は、吸光度が0.5以上であった場合を+とし、0.5未満であった場合を−とした。ヒトHpと市販2F4抗体の結合は抗DNP抗体の添加では阻害されなかった一方で、抗Hpポリクロ抗体の添加によって阻害された。本結果により、本評価系で競合の有無が評価できることを予め確認した。
表4に示すように、ヒトHpと市販2F4抗体の結合は#27又は#105の添加で阻害されず、実施例19(3)(ii)と同様に#27及び#105は市販2F4抗体とは異なるエピトープを認識することが明らかとなった。
[実施例20]取得した抗Hp抗体のエピトープ解析
(1)ヒトHp/ウシHpキメラタンパク質の作製
実施例13に記載の通り、#27及び#105はヒトHpのβ鎖を認識していることが示唆されている。#27及び#105がヒトHpβ鎖のうちのいずれのアミノ酸を認識しているかを明らかにし、市販2F4抗体のエピトープと比較する目的で、エピトープ解析を行った。
(1)ヒトHp/ウシHpキメラタンパク質の作製
実施例13に記載の通り、#27及び#105はヒトHpのβ鎖を認識していることが示唆されている。#27及び#105がヒトHpβ鎖のうちのいずれのアミノ酸を認識しているかを明らかにし、市販2F4抗体のエピトープと比較する目的で、エピトープ解析を行った。
実施例19(3)(ii)に記載の通り、#27及び#105はウシHpに結合せず、マウスHpに結合した。本結果に基づいて、ヒトHpβ鎖(配列番号70)のアミノ酸残基を一部ウシのアミノ酸残基に置換したキメラHpβ鎖を複数設計した。具体的には、ヒトHpのアミノ酸配列(配列番号65)、ウシHpのアミノ酸配列(配列番号73)及びマウスHpのアミノ酸配列(配列番号74)を比較し、ヒトHpβ鎖(配列番号70)のうち、ヒト−ウシで非相同かつヒト−マウスで相同のアミノ酸残基を抽出した。さらに、抽出した該残基を対応するウシHpのアミノ酸残基に置換した。
なお、キメラHpβ鎖の発現用組換えベクターは、5’末端からヒトHpα鎖(配列番号71)、キメラHpβ鎖、ヒスチジンタグの順にコードされるように設計した。これにより、キメラHpβ鎖は、C末端側にヒスチジンタグが結合し、さらにヒトHpα鎖がジスルフィド結合で連結した形で発現する(以下キメラA〜Fと表記する)。
作製したキメラA〜Fにおいて、置換したアミノ酸残基の位置と種類を表5に示す。作製したキメラA〜Fのアミノ酸配列を配列番号75〜80に、キメラA〜Fのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む合成DNA(ファスマック社またはGENEWIZ社)の塩基配列を配列番号81〜86に示す。
キメラA〜Fの発現用組換え体ベクターは、pCIベクターの制限酵素EcoRIとSalIサイトの間に、合成DNA(配列番号81〜86)をIn−Fusion HD cloning Kitを用いて挿入することにより作製した。また、アミノ酸置換を施していないヒトHpβ鎖(配列番号70)についても、キメラタンパク質と同様に発現用組み換えベクターを作製した。
作製した組換え体ヒトHpのアミノ酸配列を配列番号87に、合成DNAの配列を配列番号88に示す。ExpiFectamin 293 Transfection Kit(Gibco社)を用い、説明書に従って一過性発現によりキメラA〜F及び組換え体ヒトHpを作製した。
宿主細胞にはExpi293F(Life technologies社)を、培養用培地にはExpi293 Expression Medium(Gibco社)を用いた。回収した培養上清より、cOmplete His−Tag Purification Resin(Roche社)を用いて、添付の説明書に従ってキメラA〜F及び組換え体ヒトHpを精製した。
(2)ヒトHp/ウシHpキメラタンパク質に対する結合性
実施例20(1)で作製したキメラA〜Fに対する#27及び#105の結合性を評価した。96ウェルプレートに、キメラA〜F、組換え体ヒトHp及びウシHpを実施例5に記載の方法に準じて固相化し、ブロッキングした。ブロッキングした後、1% BSA−PBSにより希釈した抗Hp抗体(#27若しくは#105)、市販2F4抗体、又は、対照抗体(抗DNP抗体、マウスIgG1型アイソタイプコントロール抗体若しくは標識抗Hpポリクロ抗体)を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。
実施例20(1)で作製したキメラA〜Fに対する#27及び#105の結合性を評価した。96ウェルプレートに、キメラA〜F、組換え体ヒトHp及びウシHpを実施例5に記載の方法に準じて固相化し、ブロッキングした。ブロッキングした後、1% BSA−PBSにより希釈した抗Hp抗体(#27若しくは#105)、市販2F4抗体、又は、対照抗体(抗DNP抗体、マウスIgG1型アイソタイプコントロール抗体若しくは標識抗Hpポリクロ抗体)を50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。
このプレートをPBSTで3回洗浄した後、1%BSA−PBSで希釈したGoat anti Human IgG(H&L)−HRP又はRabbit anti−Mouse IgG−HRPを50μL/ウェルずつ分注し、室温で1時間静置した。この後の、発色及び吸光度の測定は実施例5に記載の方法に準じて実施した。各抗Hp抗体と組換え体ヒトHpを反応させたウェルの吸光度を1として、サンプル反応ウェルの吸光度から比を算出した。
結果を表6に示す。表6内の+及び−は、吸光度の比が、0.5以上であった場合を+、0.5未満であった場合を−として示した。抗DNP抗体及びマウスIgG1型アイソタイプコントロール抗体はいずれの固相化抗原とも結合しないことを予め確認した。また、抗Hpポリクロ抗体がすべての固相化抗原に対して結合性を示したことにより、抗原が固相化されていることも確認した。
表6に示すように、#27のキメラFに対する結合性が特異的に低下しており、#105のキメラAに対する結合性も特異的に低下していた。このことから、#27はエピトープに少なくともF44及びE49を含むこと、及び#105はエピトープに少なくともS155、T156及びV157を含むことが明らかとなった。一方で、市販2F4抗体はキメラA〜Fのいずれに対しても高い結合性を示したことから、#27及び#105のエピトープであるアミノ酸残基が、市販2F4抗体のエピトープには含まれないことが明らかとなった。
(3)ヒトHp/マウスHpキメラタンパク質の作製市販2F4抗体のエピトープを明らかにし、#27及び#105のエピトープと比較する目的で、市販2F4抗体のエピトープ解析を行った。実施例19(3)(ii)に記載の通り、市販2F4抗体はウシHp及びマウスHpに結合しなかった。
本結果に基づいて、ヒトHpβ鎖(配列番号70)のアミノ酸残基を一部マウスのアミノ酸残基に置換したキメラHpβ鎖を複数設計した。具体的には、ヒトHpのアミノ酸配列(配列番号65)、ウシHpのアミノ酸配列(配列番号73)及びマウスHpのアミノ酸配列(配列番号74)を比較し、ヒトHpβ鎖(配列番号70)のうち、ヒト−ウシで非相同かつヒト−マウスでも非相同のアミノ酸残基を抽出した。さらに、抽出した該残基を対応するマウスHpのアミノ酸残基に置換した。
なお、キメラHpβ鎖は、実施例20(1)に記載の方法と同様に、C末端側にヒスチジンタグを結合し、さらにヒトHpα鎖(配列番号71)がジスルフィド結合で連結した形で発現する(以下キメラG〜Kと表記する)。
作製したキメラG〜Kにおいて、置換したアミノ酸残基の位置と種類を表7に示す。作製したキメラG〜Kのアミノ酸配列を配列番号89〜93に、合成DNAの塩基配列を配列番号94〜98に示す。
(4)ヒトHp/マウスHpキメラタンパク質に対する結合性
実施例20(2)に記載の方法に準じて、実施例20(3)で作製したキメラG〜Kに対する市販2F4抗体の結合性を評価した。結果を表8に示す。各抗Hp抗体と組換え体ヒトHpを反応させたウェルの吸光度を1として、サンプル反応ウェルの吸光度から比を算出した。
実施例20(2)に記載の方法に準じて、実施例20(3)で作製したキメラG〜Kに対する市販2F4抗体の結合性を評価した。結果を表8に示す。各抗Hp抗体と組換え体ヒトHpを反応させたウェルの吸光度を1として、サンプル反応ウェルの吸光度から比を算出した。
表8内の+及び−は、吸光度の比が、0.5以上であった場合を+、0.5未満であった場合を−として示した。抗DNP抗体及びマウスIgG1型アイソタイプコントロール抗体はいずれの固相化抗原とも結合しないことを予め確認した。また、抗Hpポリクロ抗体がすべての固相化抗原に対して結合性を示したことにより、抗原が固相化されていることも確認した。
表8に示すように、市販2F4抗体のキメラKに対する結合性が特異的に低下していた。このことから、市販2F4抗体はエピトープにQ147、I149、R150及びP163を含むことが明らかとなった。一方で、#27及び#105はキメラG〜Kのいずれに対しても高い結合性を示し、市販2F4抗体のエピトープであるアミノ酸残基が、#27及び#105のエピトープには含まれないことが明らかとなった。
#27及び#105のエピトープ[実施例20(2)で同定]、並びに、市販2F4抗体のエピトープを表9に示す。
以上の結果より、市販2F4抗体のエピトープは、#27及び#105のエピトープと異なることが明らかとなった。
[実施例21]フコース非結合型かつCD16a/CD32a高親和性Fcアミノ酸改変型の抗Hp抗体の作製
組換え体ベクターは、アミノ酸改変(G236A、S239D、I332E)を含むヒトIgG1のFc領域遺伝子配列(配列番号72、以下、hCg1 Xen236 239 332と略記する場合もある)の合成DNA(GENEWIZ社)を、実施例11(1)で作製した組換え体ベクターのApaIとBamHIサイトの間に挿入することによって作製した。その後の操作を、実施例11(3)に記載の方法に準じて行うことによって、フコース非結合型かつCD16a/CD32a高親和性Fcアミノ酸改変型の抗Hp抗体を作製した。
組換え体ベクターは、アミノ酸改変(G236A、S239D、I332E)を含むヒトIgG1のFc領域遺伝子配列(配列番号72、以下、hCg1 Xen236 239 332と略記する場合もある)の合成DNA(GENEWIZ社)を、実施例11(1)で作製した組換え体ベクターのApaIとBamHIサイトの間に挿入することによって作製した。その後の操作を、実施例11(3)に記載の方法に準じて行うことによって、フコース非結合型かつCD16a/CD32a高親和性Fcアミノ酸改変型の抗Hp抗体を作製した。
[実施例22]マウス免疫性血小板減少症(Immune Thrombocytopenia:ITP)モデルにおける作用
(1)抗マウス血小板抗体の作製
組換え体ベクターとしては、マウスIgG2bκの定常領域遺伝子を挿入したpCIベクターを用いた。血小板減少等の全身性の自己免疫疾患症状を呈するNZW x BXSB F1マウスからクローニングされた抗マウス血小板抗体クローン6A6[Mizutani H et al., Blood. 82(3), 837-844,1993]の重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子をIn−Fusion HD cloning Kitを用いて挿入した。
(1)抗マウス血小板抗体の作製
組換え体ベクターとしては、マウスIgG2bκの定常領域遺伝子を挿入したpCIベクターを用いた。血小板減少等の全身性の自己免疫疾患症状を呈するNZW x BXSB F1マウスからクローニングされた抗マウス血小板抗体クローン6A6[Mizutani H et al., Blood. 82(3), 837-844,1993]の重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子をIn−Fusion HD cloning Kitを用いて挿入した。
大腸菌DH5 αコンピテントセルに形質転換し、培養、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施することで、マウスIgG2b型抗マウス血小板6A6抗体発現用組換え体ベクターを作製した。ExpiFectamin 293 Transfection Kit(Gibco社)を用い、説明書に従って一過性発現により抗体を作製した。培養上清の回収及び抗体の精製は抗体精製用レジンとしてAb−Capcher(プロテノバ社)を用いて、実施例8及び実施例9に記載の方法に準じて行った。
(2)マウス免疫性血小板減少症(Immune Thrombocytopenia:ITP)モデルにおける作用
マウスITPモデルにおける抗血小板抗体による血小板減少に対する、#105のフコース非結合型かつFcアミノ酸改変型(G236A、S239D、I332E)による阻害作用を評価した。マウスITPモデルの病態惹起は公知の方法[Mizutani H et al., Blood. 82(3), 837-844,1993]に準じて実施した。
マウスITPモデルにおける抗血小板抗体による血小板減少に対する、#105のフコース非結合型かつFcアミノ酸改変型(G236A、S239D、I332E)による阻害作用を評価した。マウスITPモデルの病態惹起は公知の方法[Mizutani H et al., Blood. 82(3), 837-844,1993]に準じて実施した。
雄性Crl:CD1(Icr)マウス(日本チャールス・リバー社)を購入し、6週齢(体重30g前後)で用いた。8群(各群n=5)に群分けしたマウスに、実施例21で作製した#105のフコース非結合型かつFcアミノ酸改変型(G236A、S239D、I332E)又はIVIGをPBSで調製したものを、それぞれ0.08、0.4、2、10mg/head(#105のフコース非結合型かつFcアミノ酸改変型)及び10、40mg/head(IVIG)の用量にて腹腔内投与した。
コントロール群にはPBSを投与した。被検体投与の30分後に実施例22(1)で作製した抗マウス血小板6A6抗体を10μg/headの用量にて静脈内投与し、血小板減少を惹起した。惹起しなかった場合の血小板数を把握するための対照群には、抗マウス血小板6A6抗体の代わりにPBSを投与した。抗マウス血小板6A6抗体を投与した24時間後にイソフルラン麻酔下にて腹大静脈から採血し、EDTA入り採血管に入れ、ADVIA 120 Hematology System(SIEMES社)を用いて血小板数を測定した。
その結果、#105のフコース非結合型かつFcアミノ酸改変型(G236A、S239D、I332E)の投与により、用量依存的に抗マウス血小板6A6抗体による血小板減少を抑制した。また、#105のフコース非結合型かつFcアミノ酸改変型(G236A、S239D、I332E)はIVIGよりも低い用量で、IVIGと同等以上の作用を示した(図7)。
本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、2016年3月29日付けで出願された日本特許出願(特願2016−066829)に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
配列番号1:ヒトCD16aクローニング用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号2:ヒトCD16aクローニング用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号3:ヒトCD16a(V)の塩基配列
配列番号4:ヒトCD16aのアミノ酸配列
配列番号5:可溶性ヒトCD16a組換え体ベクター作製用プライマー FcgR3−1の塩基配列
配列番号6:ヒスチジンタグ融合可溶性CD16aのアミノ酸配列
配列番号7:プライマーhhiu1の塩基配列
配列番号8:プライマーhhiu3の塩基配列
配列番号9:プライマーhk2の塩基配列
配列番号10:プライマーhk5の塩基配列
配列番号11:#4−VHの塩基配列
配列番号12:#4−VLの塩基配列
配列番号13:#6−VHの塩基配列
配列番号14:#6−VLの塩基配列
配列番号15:#27−VHの塩基配列
配列番号16:#27−VLの塩基配列
配列番号17:#105−VHの塩基配列
配列番号18:#105−VLの塩基配列
配列番号19:#96−6−VHの塩基配列
配列番号20:#96−6−VLの塩基配列
配列番号21:#4−VHのアミノ酸配列
配列番号22:#4−VLのアミノ酸配列
配列番号23:#6−VHのアミノ酸配列
配列番号24:#6−VLのアミノ酸配列
配列番号25:#27−VHのアミノ酸配列
配列番号26:#27−VLのアミノ酸配列
配列番号27:#105−VHのアミノ酸配列
配列番号28:#105−VLのアミノ酸配列
配列番号29:#96−6−VHのアミノ酸配列
配列番号30:#96−6−VLのアミノ酸配列
配列番号31:#27−VH CDR1のアミノ酸配列
配列番号32:#27−VH CDR2のアミノ酸配列
配列番号33:#27−VH CDR3のアミノ酸配列
配列番号34:#27−VL CDR1のアミノ酸配列
配列番号35:#27−VL CDR2のアミノ酸配列
配列番号36:#27−VL CDR3のアミノ酸配列
配列番号37:#105−VH CDR1のアミノ酸配列
配列番号38:#105−VH CDR2のアミノ酸配列
配列番号39:#105−VH CDR3のアミノ酸配列
配列番号40:#105−VL CDR1のアミノ酸配列
配列番号41:#105−VL CDR2のアミノ酸配列
配列番号42:#105−VL CDR3のアミノ酸配列
配列番号43:#4−VH 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号44:#4−VH 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号45:#4−VL 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号46:#4−VL 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号47:#6−VH 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号48:#6−VH 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号49:#6−VL 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号50:#6−VL 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号51:#27−VH 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号52:#27−VH 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号53:#27−VL 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列配列番号54:#27−VL 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号55:#105−VH 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号56:#105−VH 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号57:#105−VL 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号58:#105−VL 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号59:#96−6−VH 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号60:#96−6−VH 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号61:#96−6−VL 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号62:#96−6−VL 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号63:合成DNA(hCg1 Xen 239 332)の塩基配列
配列番号64:可溶性CD32aのアミノ酸配列
配列番号65:ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列 多型1(NP_005134.1)
配列番号66:ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列 多型2(NP_001119574.1)
配列番号67:ヒトハプトグロビンの遺伝子配列 多型1(NM_005143.3)
配列番号68:ヒトハプトグロビンの遺伝子配列 多型2(NM_001126102.1)
配列番号69:シグナル配列を含まないヒトハプトグロビン 多型1(NP_005134.1)α鎖のアミノ酸配列
配列番号70:ヒトハプトグロビンβ鎖のアミノ酸配列
配列番号71:シグナル配列を含まないヒトハプトグロビン 多型2(NP_001119574.1)α鎖のアミノ酸配列
配列番号72:合成DNA(hCg1 Xen 236 239 332)の塩基配列
配列番号73:ウシハプトグロビンのアミノ酸配列
配列番号74:マウスハプトグロビンのアミノ酸配列
配列番号75:キメラAのアミノ酸配列
配列番号76:キメラBのアミノ酸配列
配列番号77:キメラCのアミノ酸配列
配列番号78:キメラDのアミノ酸配列
配列番号79:キメラEのアミノ酸配列
配列番号80:キメラFのアミノ酸配列
配列番号81:キメラAの塩基配列
配列番号82:キメラBの塩基配列
配列番号83:キメラCの塩基配列
配列番号84:キメラDの塩基配列
配列番号85:キメラEの塩基配列
配列番号86:キメラFの塩基配列
配列番号87:組換えヒトHpのアミノ酸配列
配列番号88:組換えヒトHpの塩基配列
配列番号89:キメラGのアミノ酸配列
配列番号90:キメラHのアミノ酸配列
配列番号91:キメラIのアミノ酸配列
配列番号92:キメラJのアミノ酸配列
配列番号93:キメラKのアミノ酸配列
配列番号94:キメラGの塩基配列
配列番号95:キメラHの塩基配列
配列番号96:キメラIの塩基配列
配列番号97:キメラJの塩基配列
配列番号98:キメラKの塩基配列
配列番号2:ヒトCD16aクローニング用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号3:ヒトCD16a(V)の塩基配列
配列番号4:ヒトCD16aのアミノ酸配列
配列番号5:可溶性ヒトCD16a組換え体ベクター作製用プライマー FcgR3−1の塩基配列
配列番号6:ヒスチジンタグ融合可溶性CD16aのアミノ酸配列
配列番号7:プライマーhhiu1の塩基配列
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配列番号9:プライマーhk2の塩基配列
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配列番号11:#4−VHの塩基配列
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配列番号21:#4−VHのアミノ酸配列
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配列番号23:#6−VHのアミノ酸配列
配列番号24:#6−VLのアミノ酸配列
配列番号25:#27−VHのアミノ酸配列
配列番号26:#27−VLのアミノ酸配列
配列番号27:#105−VHのアミノ酸配列
配列番号28:#105−VLのアミノ酸配列
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配列番号34:#27−VL CDR1のアミノ酸配列
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配列番号40:#105−VL CDR1のアミノ酸配列
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配列番号43:#4−VH 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
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配列番号45:#4−VL 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号46:#4−VL 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
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配列番号51:#27−VH 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
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配列番号55:#105−VH 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号56:#105−VH 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号57:#105−VL 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号58:#105−VL 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号59:#96−6−VH 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号60:#96−6−VH 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号61:#96−6−VL 遺伝子増幅用PCRフォワードプライマーの塩基配列
配列番号62:#96−6−VL 遺伝子増幅用PCRリバースプライマーの塩基配列
配列番号63:合成DNA(hCg1 Xen 239 332)の塩基配列
配列番号64:可溶性CD32aのアミノ酸配列
配列番号65:ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列 多型1(NP_005134.1)
配列番号66:ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列 多型2(NP_001119574.1)
配列番号67:ヒトハプトグロビンの遺伝子配列 多型1(NM_005143.3)
配列番号68:ヒトハプトグロビンの遺伝子配列 多型2(NM_001126102.1)
配列番号69:シグナル配列を含まないヒトハプトグロビン 多型1(NP_005134.1)α鎖のアミノ酸配列
配列番号70:ヒトハプトグロビンβ鎖のアミノ酸配列
配列番号71:シグナル配列を含まないヒトハプトグロビン 多型2(NP_001119574.1)α鎖のアミノ酸配列
配列番号72:合成DNA(hCg1 Xen 236 239 332)の塩基配列
配列番号73:ウシハプトグロビンのアミノ酸配列
配列番号74:マウスハプトグロビンのアミノ酸配列
配列番号75:キメラAのアミノ酸配列
配列番号76:キメラBのアミノ酸配列
配列番号77:キメラCのアミノ酸配列
配列番号78:キメラDのアミノ酸配列
配列番号79:キメラEのアミノ酸配列
配列番号80:キメラFのアミノ酸配列
配列番号81:キメラAの塩基配列
配列番号82:キメラBの塩基配列
配列番号83:キメラCの塩基配列
配列番号84:キメラDの塩基配列
配列番号85:キメラEの塩基配列
配列番号86:キメラFの塩基配列
配列番号87:組換えヒトHpのアミノ酸配列
配列番号88:組換えヒトHpの塩基配列
配列番号89:キメラGのアミノ酸配列
配列番号90:キメラHのアミノ酸配列
配列番号91:キメラIのアミノ酸配列
配列番号92:キメラJのアミノ酸配列
配列番号93:キメラKのアミノ酸配列
配列番号94:キメラGの塩基配列
配列番号95:キメラHの塩基配列
配列番号96:キメラIの塩基配列
配列番号97:キメラJの塩基配列
配列番号98:キメラKの塩基配列
Claims (22)
- 配列番号70で表されるアミノ酸配列からなるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、該ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成するモノクローナル抗体。
- 以下の(a)〜(d)から選ばれる1の抗体と競合して配列番号70で表されるヒトハプトグロビンのβ鎖を特異的に認識し、前記抗体が結合するヒトハプトグロビンに含まれるエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体。
(a)相補鎖決定領域(complementarity determining region、以下、CDRと記す)1〜3がそれぞれ配列番号31、32及び33で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖(以下、H鎖と記す)を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号34、35及び36で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖(以下、L鎖と記す)を含む抗体
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号37、38及び39で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号40、41及び42で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(d)配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体 - 以下の(a)〜(d)から選ばれる1のモノクローナル抗体。
(a)CDR1〜3がそれぞれ配列番号31、32及び33で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号34、35及び36で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(b)CDR1〜3がそれぞれ配列番号37、38及び39で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつCDR1〜3がそれぞれ配列番号40、41及び42で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(c)配列番号25で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体
(d)配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む抗体のH鎖を含み、かつ配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む抗体のL鎖を含む抗体 - 配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、44番目のPhe及び49番目のGluに結合する、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 配列番号70で表わされるヒトハプトグロビンのβ鎖のアミノ酸配列のうち、少なくとも、155番目のSer、156番目のThr及び157番目のValに結合する、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 遺伝子組換え抗体である、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項6に記載のモノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトFcγ受容体III、ヒトFcγ受容体II及びヒトFcγ受容体Iからなる群から選ばれる少なくとも1つのヒトFcγ受容体に結合する、請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体2分子及びヒトハプトグロビン1分子を含む、請求項1〜請求項8のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 抗体のFc領域に結合するN−グリコシド結合糖鎖の還元末端N−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない、請求項1〜請求項9のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体をコードするDNA。
- 請求項11に記載のDNAを含有する組換え体ベクター。
- 請求項12に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
- 請求項13に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を生成蓄積させ、培養物から該抗体を採取することを特徴とする請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
- 請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
- 請求項1〜請求項10のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体と薬理学的に許容される担体を含む、自己免疫疾患治療剤。
- ヒトハプトグロビンに結合するモノクローナル抗体を含有することを特徴とする自己免疫疾患治療剤。
- モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項17に記載の自己免疫疾患治療剤。
- モノクローナル抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項18に記載の自己免疫疾患治療剤。
- モノクローナル抗体が、ヒトハプトグロビンに結合して多価の免疫複合体を形成する抗体である、請求項17〜請求項19のいずれか1項に記載の自己免疫疾患治療剤。
- モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、ヒトFcγ受容体III、ヒトFcγ受容体II及びヒトFcγ受容体Iからなる群から選ばれる少なくとも1つのヒトFcγ受容体に結合する、請求項17〜請求項20のいずれか1項に記載の自己免疫疾患治療剤。
- モノクローナル抗体が形成する多価の免疫複合体が、少なくとも抗体2分子及びヒトハプトグロビン1分子を含む、請求項20又は請求項21に記載の自己免疫疾患治療剤。
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