WO2017159722A1 - 活性型肝細胞増殖因子（ｈｇｆ）の製造方法 - Google Patents

活性型肝細胞増殖因子（ｈｇｆ）の製造方法 Download PDF

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佐藤　俊孝
貴久 有田
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    • C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase

Definitions

  • the present inventors have cultured mammalian cells expressing inactive hepatocyte growth factor activator (pro-HGFA) in a medium not containing serum. It was found that pro-HGFA contained in the culture supernatant can be converted to active HGFA by obtaining the culture supernatant and subjecting the culture supernatant to a specific treatment. As a result, pro-HGF produced in a culture that does not contain animal serum can be converted into active HGF by active HGFA produced in a culture that does not contain animal serum. An active HGF that does not contain serum-derived components or a preparation containing the same can be produced.
  • pro-HGFA inactive hepatocyte growth factor activator
  • HGF may include HGF derived from humans, mice, rats, rabbits, and other animals.
  • HGF is preferably human-derived HGF.
  • HGFA may include HGFA derived from human, mouse, rat, rabbit and other animals.
  • HGFA is preferably human-derived HGFA.
  • the “plurality” herein is 2 to 150, more preferably 2 to 80, more preferably 2 to 70, more preferably 2 to 60, more preferably 2 to 50, and more preferably 2 -40, more preferably 2-30, more preferably 2-20, more preferably 2-10, or more preferably 2-5.
  • a column load solution having an appropriate pH and salt concentration can be used for adsorbing active HGF on the mixed mode carrier.
  • a pH range is pH 6.0 to 10.0, more preferably pH 7.0 to 9.0, for example pH 8.0.
  • the salt concentration is 0.01 to 5M, preferably 0.1 to 2M, for example 1M.
  • the salt concentration can be prepared using, for example, 0.001M to 4M sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium citrate, sodium sulfate, ammonium sulfate, or a combination thereof.
  • the cells were removed by centrifugation, subjected to microfiltration through a 0.2 ⁇ m filter (manufactured by Sartorius, 5445307H7-00), and the collected pro-HGFA supernatant was refrigerated until use.
  • the value obtained by subtracting the value of the untreated pro-HGFA culture supernatant (A405) was defined as the HGFA activity value.
  • a response surface plot was created by statistical analysis from the obtained HGFA activity values under a total of 27 conditions, and a range having an activity value of 0.4 or more was shown in white. From these results, it was found that the conditions under which the highest HGFA activity value can be obtained are pH 5.4, reaction temperature 26.1 ° C., and HGFA activity values can be obtained in a wide range (FIG. 2).
  • FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE performed under non-reducing conditions using the solution recovered in this step.
  • XV-PANTERA NXV-271HP
  • BIORAD Biolabel Plus Protein All Blue Standards (161-03373) manufactured by BIORAD was used.
  • the sample was subjected to SDS-PAGE analysis after heat treatment at 60 ° C. for 10 minutes in a Laemmli sample buffer.

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Abstract

【課題】　動物血清を使用せずに、活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（ＨＧＦＡ）、および活性型肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を製造する方法を提供する。 【解決手段】　本発明は、動物血清を使用せずに、活性型ＨＧＦＡを製造する方法に関する。当該方法は、不活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（ｐｒｏ－ＨＧＦＡ）を発現する哺乳動物細胞を、血清を含まない培地において培養することにより、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を取得する工程、および、前記工程により取得されたｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を、弱酸性に調整して、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換する工程を含むことを特徴とする。本発明はまた、前記方法によって製造されたＨＧＦＡを用いた、活性型ＨＧＦの製造方法に関する。

Description

活性型肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の製造方法
　本発明は、動物血清を使用せずに、活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（本明細書中、「活性型ＨＧＦＡ」とも称する）、および活性型肝細胞増殖因子（本明細書中、「活性型ＨＧＦ」とも称する）を製造する方法に関する。
　ＨＧＦは、ヒト劇症肝炎患者の血漿から精製された肝実質細胞増殖活性を有する因子であり（特許文献１、および非特許文献１）、抗腫瘍効果、細胞性免疫の増強、創傷治療効果、組織の再生促進効果など、様々な薬理学的効果があることが報告されている（特許文献２）。
　これまでに、当該ＨＧＦをコードする遺伝子がクローニングされ、組み換えＤＮＡ技術により製造されている（特許文献３～５）。また、ＨＧＦは、２種類のサブユニット（およそ６０ｋＤａのα鎖；およそ３０ｋＤａのβ鎖）から構成される一本鎖型および二本鎖型の形態をとり、一本鎖型は生理活性を有さず、二本鎖型で生理活性を有することが知られている。さらに、組み換えＤＮＡ技術による製造において、動物血清を用いた培養下では、二本鎖型の活性形態で取得することができるが、動物血清を含まない培養下では、製造されるＨＧＦの大半は、一本鎖型の不活性形態で取得されることが知られている（例えば特許文献６）。一本鎖型の不活性型肝細胞増殖因子（本明細書中、「ｐｒｏ－ＨＧＦ」とも称する）から二本鎖型の活性型ＨＧＦへの変換には、動物血清中に含まれるプロテアーゼが関与しているため、活性型ＨＧＦを効率的に取得するためには、動物血清を使用することが必要であると考えられている。
　一方、近年では、ウイルス混入などの危険性を回避するために、組み換えＤＮＡ技術による生物材料の製造において、動物血清を用いない培養が主流になっている。そこで、動物血清を含まない培地を用いて活性型ＨＧＦを製造するためには、一本鎖型ｐｒｏ－ＨＧＦを、何らかの手段で活性型ＨＧＦに変換する必要がある。そのような手段として、ｐｒｏ－ＨＧＦを活性型ＨＧＦに変換できるＨＧＦＡや（特許文献７）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターなどのセリンプロテアーゼ（非特許文献２）が知られている。しかし、ｐｒｏ－ＨＧＦを活性型ＨＧＦに変換できるこれらの酵素は、血清由来であったり、微生物や動物細胞に遺伝子を組み込んで産生する必要があり、無血清培養ではそれ自体が前駆体で産生されることから、そのまま使用することが難しいという問題がある。
特開昭６３－２２５２６号公報 日本国特許第２７４７９７９号 日本国特許第２５７７０９１号 日本国特許第２８５９５７７号 日本国特許第３０７２６２８号 日本国特許第３２１３９８５号 特開平５－１０３６７０号公報
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１，４１４（１９８８） ＪＧＨ　２６（２０１１）　Ｓｕｐｐｌ．１；１８８－２０２、１９２頁
　本発明は、動物血清を使用せずに、活性型ＨＧＦＡ、および活性型ＨＧＦを製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明はまた、本発明の方法により製造される、活性型ＨＧＦＡ、活性型ＨＧＦおよびこれらの調製物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、不活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（ｐｒｏ－ＨＧＦＡ）を発現する哺乳動物細胞を、血清を含まない培地で培養してその培養上清を取得し、当該培養上清に特定の処理を施すことで、当該培養上清に含まれるｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型のＨＧＦＡに変換できることを見出した。これにより、動物血清を含まない培養下で製造されたｐｒｏ－ＨＧＦを、同様に、動物血清を含まない培養下で製造された活性型ＨＧＦＡにより、活性型ＨＧＦを変換することができるため、動物血清由来の成分を含まない活性型ＨＧＦまたはこれを含む調製物を製造することができる。
　したがって、本発明は以下の態様を包含する：
　［１］　活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（ＨＧＦＡ）を製造する方法であって、
工程１：
　不活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（ｐｒｏ－ＨＧＦＡ）を発現する哺乳動物細胞を、血清を含まない培地において培養することにより、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を取得する工程、および、
工程２：
　前記工程により取得されたｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を、弱酸性に調整して、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換する工程、
を含む、
ことを特徴とする、
製造方法。
　［２］　［１］に記載の製造方法であって、
　前記工程が、前記培養上清に硫酸化多糖類を添加することをさらに含む、
ことを特徴とする、
製造方法。
　［３］　［１］または［２］に記載の製造方法であって、
　前記培養上清を弱酸性に調製する工程が、ｐＨを４．０～６．０に調整する工程である、
ことを特徴とする、
製造方法。
　［４］　［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法であって、
　前記培養上清を弱酸性に調製する工程が、１５～４０℃の温度で行われる、
ことを特徴とする、
製造方法。
　［５］　［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法であって、
　前記培養上清は、培養する哺乳動物細胞の生存率の低下後に取得される、
ことを特徴とする、
製造方法。
　［６］　［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法であって、
　前記哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、
ことを特徴とする、
製造方法。
　［７］　［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法であって、
　前記ｐｒｏ－ＨＧＦＡは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、
ことを特徴とする、
製造方法。
　［８］　［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法であって、
　前記培養上清が、前記培養上清そのものであるか、前記培養上清を希釈したものであるか、前記培養上清を濃縮したものであるか、または前記培養上清を部分精製したものである、
ことを特徴とする、
製造方法。
　［９］　［１］～［８］のいずれかに記載の製造方法によって取得される、
ことを特徴とする、
活性型ＨＧＦＡ。
　［１０］　活性型肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を製造する方法であって、
　不活性型肝細胞増殖因子（ｐｒｏ－ＨＧＦ）を含む培養上清に、活性型ＨＧＦＡを作用させて、前記ｐｒｏ－ＨＧＦを活性型ＨＧＦに変換する工程、
を含み、
　ここで、
　前記ｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清は、ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞を、血清を含まない培地において培養して得られる培養上清であり、
　前記活性型ＨＧＦＡが、［１］～［８］のいずれかに記載の方法によって製造されたものである、
ことを特徴とする、
製造方法。
　［１１］　［１０］に記載の製造方法であって、
　前記ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞を培養する培地が動物由来の成分を含まない培地である
ことを特徴とする、
製造方法。
　［１２］　［１０］または［１１］に記載の製造方法であって、
　前記ｐｒｏ－ＨＧＦは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする、
製造方法。
　［１３］　［１０］～［１２］のいずれかに記載の製造方法によって取得される、
ことを特徴とする、
活性型ＨＧＦ。
　以上述べた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれることを、当業者であれば理解するであろう。
　本発明によれば、動物血清を使用せずに、活性型ＨＧＦＡ、および活性型ＨＧＦを製造する方法が提供される。
　本発明の活性型ＨＧＦの製造方法においては、その製造プロセスにおいて、動物血清を一切使用する必要がないため、当該製造方法によって得られた活性型ＨＧＦを含む組成物には、動物血清由来の成分が含まれず、極めて安全にヒトに適用することができる。
図１は、ｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清の活性化により調製されたＨＧＦＡ培養上清が、ｐｒｏ－ＨＧＦを含むＣＨＯ細胞由来の培養上清中のｐｒｏ－ＨＧＦを活性化することを示す。 図２は、実験計画法（ＤｏＥ）を用いた、ｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清が活性化する条件についての検証結果を示す。 図３は、クロマトグラフィー担体としてマルチモーダル陰イオン交換体のＣａｐｔｏ　Ａｄｈｅｒｅを用い、０．２５Ｍアルギニンおよび０．７Ｍアルギニンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を溶出液として用いたクロマトグラフィー精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。 図４は、クロマトグラフィー担体としてマルチモーダル陰イオン交換体のＣａｐｔｏ　Ａｄｈｅｒｅを用い、１Ｍアルギニンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を溶出液として用いたクロマトグラフィー精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。 図５は、実施例５と同様の精製をＨＧＦＡ培養上清によって活性化されていないｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清液を用いて行った、精製の各段階における精製品の非還元および還元のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。 図６は、実施例５で得た精製ＨＧＦについて、ＴＧＦβ存在下における細胞増殖活性を測定した結果を示す。
　本明細書中、「活性型肝細胞増殖因子（活性型ＨＧＦ）」と記載される場合には、特段の明示がない限り、二本鎖型の活性化ＨＧＦを指すものと解釈され、その一本鎖型の不活性の形態である不活性型肝細胞増殖因子（ｐｒｏ－ＨＧＦ）とは区別して使用される。
　本発明において、ＨＧＦは、ヒト、マウス、ラット、ラビット、その他の動物に由来するＨＧＦを含み得る。本発明において、ＨＧＦは、好ましくはヒト由来のＨＧＦである。
　本発明において、ヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）には、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその変異体が含まれる。配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体には、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換を有するアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等またはそれ以上のＨＧＦ活性を有するか、または有するように活性化し得る、ポリペプチドが含まれる。ここでいう「複数個」は、２～１５０個、より好ましくは２～８０個、より好ましくは２～７０個、より好ましくは２～６０個、より好ましくは２～５０個、より好ましくは２～４０個、より好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個、またはより好ましくは２～５個である。
　配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体には、また、配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等またはそれ以上のＨＧＦ活性を有するか、または有するように活性化され得る、ポリペプチドが含まれる。
　配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体には、また、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等またはそれ以上のＨＧＦ活性を有するか、または有するように活性化され得る、ポリペプチドが含まれる。
　本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、ポストハイブリダイゼーションの洗浄において、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」の条件、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件、または「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」の条件における洗浄でハイブリダイズしていること、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、または「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件における洗浄でハイブリダイズしていることが挙げることができる（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ　７．０）。より詳細には、Ｒａｐｉｄ－ｈｙｂ　ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッドを形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。より好ましくは、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの溶液としては、例えば５×ＳＳＣ、７％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬ変性サケ***ＤＮＡ、５×デンハルト液（１×デンハルト溶液は０．２％ポリビニールピロリドン、０．２％牛血清アルブミン、および０．２％フィコールを含む）を含む溶液を用い、プレハイブリダイゼーションを６５℃３０分から１時間、ハイブリダイゼーションを同じ温度で一晩（６～８時間）行う。その他、例えばＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７～５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６５℃または６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明の遺伝子のアイソフォーム、アレリック変異体、および対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．”（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７－９．５８）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７－１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３－６．４）、“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：　Ｃｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　２ｎｄ　ｅｄ．”（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（１９９５）；条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。
　本明細書中、「活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（活性型ＨＧＦＡ）」と記載される場合には、特段の明示がない限り、活性化ＨＧＦＡを指すものと解釈され、その不活性の形態である不活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（ｐｒｏ－ＨＧＦＡ）とは区別して使用される。
　本発明において、ＨＧＦＡは、ヒト、マウス、ラット、ラビット、その他の動物に由来するＨＧＦＡを含み得る。本発明において、ＨＧＦＡは、好ましくはヒト由来のＨＧＦＡである。
　本発明において、ヒトＨＧＦＡには、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその変異体が含まれる。配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体には、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換を有するアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等またはそれ以上のＨＧＦ活性を有するか、または有するように活性化し得る、ポリペプチドが含まれる。ここでいう「複数個」は、２～１５０個、より好ましくは２～８０個、より好ましくは２～７０個、より好ましくは２～６０個、より好ましくは２～５０個、より好ましくは２～４０個、より好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個、またはより好ましくは２～５個である。
　配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体には、また、配列番号２に示すアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等またはそれ以上のＨＧＦＡ活性を有するかまたは有するように活性化され得る、ポリペプチドが含まれる。
　配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの変異体には、また、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等またはそれ以上のＨＧＦ活性を有するか、または有するように活性化され得る、ポリペプチドが含まれる。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明は、一態様において、動物血清を使用することなく、活性型ＨＧＦＡを製造する方法に関する。具体的に、本発明の活性型ＨＧＦＡの製造方法は、哺乳動物細胞で組み換え発現されたｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を、所定の処理に付することによって活性型ＨＧＦＡに変換することで、活性型ＨＧＦＡを製造する方法である。この方法によれば、活性型ＨＧＦＡへの変換に、動物血清が使用されないため、得られるｐｒｏ－ＨＧＦＡまたはこれを含む組成物は、他種動物または他の個体の細胞由来のウイルス等、感染物質を混入するリスクを招く可能性が著しく低減され、安全性の高い生物材料として様々な用途に用いることができる。
　具体的に、本発明の活性型ＨＧＦＡの製造方法は、一実施形態において、以下の工程： 
工程１：
　ｐｒｏ－ＨＧＦＡを発現する哺乳動物細胞を、血清を含まない培地において培養することにより、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を取得する工程、および、
工程２：
　前記工程により取得されたｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を、弱酸性に調整して、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換する工程、
を含むことを特徴とする。
　本発明のＨＧＦＡ製造方法は、別の実施形態において、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を、弱酸性に調整して、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換する工程を含んでおり、その際、前記培養上清が、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを発現する哺乳動物細胞を、血清を含まない培地において培養して得られる培養上清であることを特徴とする。
　培養上清の弱酸性化は、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換するための処理である。培養上清に対して、外的に酵素等の添加を行わずに、弱酸性化のみによって、ｐｒｏ－ＨＧＦＡから活性型ＨＧＦＡへの変換が起こることから、哺乳動物細胞由来の成分が、ｐｒｏ－ＨＧＦＡから活性型ＨＧＦＡへの変換に関与しており、弱酸性化は、前記哺乳動物細胞由来の成分を活性化するための手段であると考えられる。弱酸性化は、例えば酸性溶液（塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸、酢酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸）を適切な濃度で添加するなど、当業者に周知の手段によって行えばよい。本発明の一実施形態において、「弱酸性」は、ｐＨ４．０～６．０の範囲であり、好ましくは５．０～６．０であり、より好ましくは５．３～５．６であり、例えばｐＨ５．５である。
　本発明において、「ｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清」は、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを発現する哺乳動物細胞を細胞培養することによって取得される、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む画分であり、当業者は、常法に従って、前記哺乳動物細胞の細胞培養物から取得することができる（本明細書中、「ｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清」とも称する）。例えば、ｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清は、前記哺乳動物細胞の細胞培養物から、遠心分離などの手段によって、残渣が取り除かれた画分であり得る。
　本発明において、培養上清は、ｐｒｏ－ＨＧＦＡの生物学的活性を損なわない程度に、培養上清に任意の処理を行うことによって、調製された任意の画分であってもよい。したがって、本発明において、培養上清は、これに限定されるものではないが、培養上清そのものであってもよいし、培養上清を希釈したもの、濃縮したもの、または部分精製したものなどが含まれる。
　本発明の好ましい実施形態において、「ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換する工程」は、前記培養上清に硫酸化多糖類を添加することをさらに含んでいる。硫酸化多糖類の添加により、ｐｒｏ－ＨＧＦＡから活性型ＨＧＦＡへの変換を、より効率的に行うことができる。硫酸化多糖類を添加するタイミングは、前記培養上清の弱酸性化前、弱酸性化と同時、または弱酸性化後のいずれの時点であってもよい。また、硫酸化多糖類の添加量は、使用される硫酸化多糖類の種類等に応じて変化し得るが、前記ｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清１ｍＬに対して、０．０１～５０ｍｇ、より好ましくは０．１～２０ｍｇ、例えば１ｍｇの量で、添加すればよい。
　本発明の活性型ＨＧＦＡの製造方法に使用することができる硫酸化多糖類として、これに限定されるものではないが、ペパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、フコイダンおよびそれらの塩などを挙げることができる。本発明の好ましい実施形態では、デキストラン硫酸が使用される。
　本発明の好ましい実施形態では、「ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換する工程」は、１５～４０℃、好ましくは２０～３７℃、例えば２５℃の温度で行われる。かかる温度範囲とすることで、ｐｒｏ－ＨＧＦＡの活性型ＨＧＦＡへの変換をより効率的なものとすることができる。
　本発明の活性型ＨＧＦＡの製造方法において、「ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換する工程」は、弱酸性化してから、所望のＨＧＦＡの活性が認められるのに十分な時間で行われる。そのような時間は、ｐＨ、硫酸化多糖の併用の有無、温度条件等によって変化し得るが、弱酸性化後１～１５時間、例えば６～８時間とすることができる。
　本発明の一実施形態において、ｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清は、培養する哺乳動物細胞の生存率の低下後に取得される培養上清である。哺乳動物細胞の生存率の低下に伴い、ｐｒｏ－ＨＧＦＡから活性型ＨＧＦＡへの変換に関与する動物細胞由来の成分が、死滅した細胞から溶出し、ｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清中に十分に回収することができる。ここでいう「培養する哺乳動物細胞の生存率の低下」とは、最大の細胞密度にまで増殖した後の哺乳動物細胞の生存率の低下を指す。本発明において、ｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清における哺乳動物細胞の生存率は、好ましくは９５％以下、より好ましくは８０％以下、例えば７０％である。
　ｐｒｏ－ＨＧＦＡから活性型ＨＧＦＡへの活性化には、宿主細胞のライソゾーム由来の酵素が関与していると考えられることから、ライソゾーム由来の酵素を添加して処理を施してもよい。
　本発明の活性型ＨＧＦＡの製造方法で使用可能な哺乳動物細胞としては、これに限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ細胞（ＨＥＫ２９３細胞を含む）、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０マウスミエローマ細胞、Ｓｐ２／０マウスミエローマ細胞などを挙げることができる。本発明の好ましい実施形態では、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを発現する哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞が使用される。
　本発明はまた、本発明の活性型ＨＧＦＡの製造方法によって製造された活性型ＨＧＦＡまたは活性型ＨＧＦＡを含む組成物に関する。本発明の活性型ＨＧＦＡまたは活性型ＨＧＦＡを含む組成物は、動物血清を使用することなく、組み換え発現されたｐｒｏ－ＨＧＦＡから動物血清を使用することなく製造することができるため、安全の高い生物材料として、例えば下記に説明する活性型ＨＧＦの製造方法に使用することができる。
　本発明は、別の態様において、活性型ＨＧＦを製造する方法に関する。本発明の活性型ＨＧＦの製造方法は、本発明の活性型ＨＧＦＡの製造方法によって取得された活性型ＨＧＦＡを、同じく血清を用いない培地で組換え発現されたｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清に作用させて、ｐｒｏ－ＨＧＦを活性型ＨＧＦに変換することを含んでいる。この方法によれば、活性型ＨＧＦへの変換に用いる活性型ＨＧＦＡの取得を含め、全ての工程で動物血清を用いることなく活性型ＨＧＦを製造することができるため、得られる活性型ＨＧＦまたはこれを含む組成物は、ウイルス等の感染物質を混入するリスクが排除された安全性の高い医薬品として使用することができる。
　具体的に、本発明の活性型ＨＧＦの製造方法は、一実施形態において、
　ｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清に、活性型ＨＧＦＡを作用させて、前記ｐｒｏ－ＨＧＦを活性型ＨＧＦに変換する工程、
を含み、
　ここで、
　前記ｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清は、ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞を、血清を含まない培地において培養して得られる培養上清であり、
　前記活性型ＨＧＦＡが、上記本発明の活性型ＨＧＦＡの製造方法によって製造されたものである、
ことを特徴とする方法である。
　また、本発明の活性型ＨＧＦの製造方法は、別の実施形態において、以下の工程：
工程Ａ：
　ｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を、弱酸性に調整して、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換する工程、ここで、前記培養上清が、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを発現する哺乳動物細胞を、血清を含まない培地において培養して得られる培養上清であり、
工程Ｂ：
　ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞を、血清を含まない培地において培養することにより、ｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清を取得する工程、
工程Ｃ：
　前記工程Ｂで得られたｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清に、前記工程Ａで得られた活性型ＨＧＦＡを作用させ、前記ｐｒｏ－ＨＧＦを活性型ＨＧＦに変換する工程、
を含む、
ことを特徴とする方法である。
　本発明において、「ｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清」は、ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞の細胞培養によって取得されるｐｒｏ－ＨＧＦを含む画分であり、当業者は、常法に従って、前記細胞の細胞培養物から取得することができる。例えば、ｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清は、前記細胞の細胞培養物から、遠心分離などの手段によって、残渣が取り除かれた画分であり得る。
　本発明の活性型ＨＧＦの製造方法において、「ｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清」に作用させる活性型ＨＧＦＡとして、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを発現する哺乳動物細胞を血清を含まない培地中で培養して得られる培養上清をそのまま用いてもよいし、当該培養上清を希釈したもの、濃縮したもの、部分的にまたは完全に精製したものを用いてもよい。
　本発明において、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを発現する哺乳動物細胞は、これに限定されるものではないが、ｐｒｏ－ＨＧＦＡをコードする核酸を含むベクターを作製し、これを宿主細胞である哺乳動物細胞に導入して形質転換することによって得ることができる。同様に、ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞は、ｐｒｏ－ＨＧＦをコードする核酸を含むベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換することによって得ることができる。
　上述のベクターとして、遺伝子発現ベクターなどを使用することができる。「遺伝子発現ベクター」は、目的の核酸が有する塩基配列を発現させる機能を有するベクターであり、前記塩基配列の発現を制御するためのプロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列等が含まれていてもよい。これらの配列は、宿主細胞において機能するものであれば特に限定はされない。
　目的の核酸を含むベクターを作製する手法は、当業者に公知であり、当業者は適宜適切な方法を選択することができる。例えば、そのような手法として、これに限定されるものではないが、制限酵素サイトを利用したリガーゼ反応などを挙げることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７）　Ｓｅｃｔｉｏｎ　１１．４－１１．１１；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）　Ｓｅｃｔｉｏｎ　５．６１－５．６３）。
　ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞は、ｐｒｏ－ＨＧＦを発現できるものであれば特に限定はされず、例えば昆虫細胞、真核細胞、哺乳動物細胞等が挙げられる。好ましくは、ヒト由来のｐｒｏ－ＨＧＦをコードする核酸を効率的に発現させる観点から、哺乳動物細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞（ＨＥＫ２９３細胞を含む）、ＨｅＬａ細胞、ＮＳ０細胞またはＳＰ２／０マウスミエローマ細胞が使用される。発明の好ましい実施形態では、ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する哺乳動物細胞として、ＣＨＯ細胞が使用される。
　上記のベクターを宿主細胞に導入する手法は、周知であり、当業者は適宜適切な方法を選択することができる。例えば、これに限定されるものではないが、宿主細胞へのベクターの導入は、エレクトポレーション法（Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１５：　１３１１－２６）、カチオニックリポソーム法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　（１９８７）　Ｓｅｃｔｉｏｎ　９．１－９．９）、微小ガラス管を使用した直接注入法、マイクロインジェクション法、リポフェクション（Ｄｅｒｉｊａｒｄ　（１９９４）　Ｃｅｌｌ　７：　１０２５－３７；　Ｌａｍｂ　（１９９３）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５：　２２－３０；　Ｒａｂｉｎｄｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９３）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：　２３０－４）、リポフェクタミン法（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ　ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ　（１９８７）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　７：　２７４５－５２）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２：　５７０７－１７；　Ｓｕｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ　（１９８５）　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４：　１６４２－３）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　ＭＡＸ　Ｒｅａｇｅｎｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などを挙げることができる。
　ｐｒｏ－ＨＧＦＡを発現する細胞、およびｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞の培養に使用される無血清培地は、使用する宿主細胞の種類等に応じて、当業者は適宜適切な組成を選択することができる。また、その他の培養条件も、当業者は適宜選択することができ、例えばこれに限定されるものではないが、培養温度は、３５．５～３７．５℃の間で適宜選択することができ、培養期間は、５～２０日間の間で選択することができる。ｐｒｏ－ＨＧＦＡについては、目的とする生存率に応じて、培養期間を設定してもよい。培養中の二酸化炭素濃度は、一般的なプロトコールにしたがって、５％ＣＯ２とすることができる。
　本発明の活性型ＨＧＦの製造方法は、一実施形態において、前記工程に続き、さらに、活性型ＨＧＦを精製する工程を含むことを特徴とする。本工程には、活性型ＨＧＦを含む調製物中に残存し得るｐｒｏ－ＨＧＦの精製が含まれてもよい。
　本発明で使用し得る精製方法は、タンパク質の生理的活性を失わせることなく、精製することが可能なものであれば、特に制限されないが、本発明においては、特に、ミックスモード担体を用いたクロマトグラフィー精製を使用することが好ましい。
　ミックスモード担体は、混合モード担体とも称し、２種類以上の特性を有するモードのリガンドを１つの担体に結合したクロマトグラフィー担体である。本発明において、活性型ＨＧＦの精製には、特に、疎水性とイオン交換担体の特徴をもつミックスモード担体を用いたクロマトグラフィー精製によって、効率的に活性型ＨＧＦを精製することができる。
　本発明の方法に使用し得る「疎水性とイオン交換担体の特徴をもつミックスモード担体」として、これに限定されるものではないが、例えばＣａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ　ＭＭＣ、ＨＥＡ　ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＰＰＡ　ＨｙｐｅｒＣｅｌ、ＭＥＰ　ＨｙｐｅｒＣｅｌおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０Ｍなどを挙げることができる。
　前記ミックスモード担体を用いたクロマトグラフィー精製は、前記ミックスモード担体にカラム負荷液中の活性型ＨＧＦを吸着させた後、緩衝液で洗浄して不純物を除去し、次いで溶出することにより行うことができる。不純物を除去するための緩衝液は、精製の対象となるタンパク質と担体との吸着性が維持される一方で、不純物と担体との親和性が低下するようなｐＨ、電気伝導度、緩衝液成分、塩濃度または添加物に基づいて設定することができる。
　使用されるカラム負荷液および緩衝液としては、これに限定されるものではないが、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ（ｂａｓｅ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳまたはＴｒｉｃｉｎｅなどが挙げられる。
　使用されるカラム負荷液および緩衝液には、アミノ酸を含有させることができる。そのようなアミノ酸としては、これに限定されるものではないが、例えばグリシン、アラニン、アルギニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、およびその誘導体などを挙げることができる。
　本発明において、前記ミックスモード担体に活性型ＨＧＦを吸着させるために、適当なｐＨおよび塩濃度を有するカラム負荷液を使用することができる。そのようなｐＨの範囲は、ｐＨ６．０～１０．０、より好ましくはｐＨ７．０～９．０、例えばｐＨ８．０である。また、そのような塩濃度は、０．０１～５Ｍ、好ましくは０．１～２Ｍ、例えば１Ｍである。上記の塩濃度は、例えば、０．００１Ｍ～４Ｍの塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムまたはこれらの組み合わせを用いて調製することができる。
　本発明において、活性型ＨＧＦの溶出は、前記ミックスモード担体と活性型ＨＧＦとの親和性が低下するような緩衝液を用いることによって行うことができる。そのような緩衝液としては、少なくとも０．１Ｍのアルギニン、より好ましくは少なくとも０．３Ｍのアルギニン、さらに好ましくは少なくとも０．４Ｍのアルギニン、例えば０．７Ｍのアルギニンを含む緩衝液が挙げられる。また、アルギニンと併せて、またこれに代えて、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を含む緩衝液を用いることもできる。あるいは、活性型ＨＧＦの溶出は、段階的にｐＨを低下させて活性型ＨＧＦを溶出させるステップワイズ法によってもよい。
　本発明の一実施形態において、前記精製は、イオン交換基および疎水性相互作用基を含む混合モード担体による精製後に、単回または複数回の追加のクロマトグラフィーによる精製をさらに含んでもよい。これにより、活性型ＨＧＦをより高純度で取得することができる。そのようなクロマトグラフィー精製には、これに限定されるものではないが、例えばミックスモード担体、陰イオン交換担体、陽イオン交換担体、疎水性相互作用担体、サイズ排除担体、ゲルろ過担体、逆相担体、ヒドロキシアパタイト担体、フルオロアパタイト担体、硫酸化セルロース担体、または硫酸化アガロース担体等を用いたクロマトグラフィー精製が含まれる。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
　以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　ｐｒｏ－ＨＧＦＡ全長を組み換え発現するＣＨＯ細胞をＥＸ－ＣＥＬＬ特注培地 （ＳＡＦＣ社製）を用いてＴ７５フラスコ（コーニング社製、４３０４２１）に融解し２５０ｍＬ　シェーカーフラスコ（コーニング社製、４３１１４４）で拡大培養を行った後、７Ｌ培養槽（ＡＢＬＥ／Ｂｉｏｔｔ社製、ＢＣＰ－０７）で１２１ｒｐｍ、３６．５℃設定で１０日間培養した。培養１０日目の細胞の生存率は４７．１％であった。培養終了後、遠心分離により細胞を除去し０．２μｍフィルター（ザルトリウス社製、５４４５３０７Ｈ７-―００）を通して精密ろ過し、回収したｐｒｏ－ＨＧＦＡ上清液は使用するまで冷蔵保存した。
　上記と同様にして得たｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清５０ｍＬを１００ｍＬのガラスビーカーに入れ、１０ｇ／Ｌデキストラン硫酸ナトリウム（Ｍｗ．５００，０００）水溶液を１／１０量である５ｍＬを加えた後、２Ｍ塩酸を用いてｐＨ５．３に調整した。ｐＨ調整後、０．２μｍフィルターろ過を行った後、２５０ｍＬシェーカーフラスコに入れた。５％炭酸ガスを６０秒吹き込み後、室温、設定攪拌数８０ｒｐｍで６時間反応させた。活性化反応はｐＨ５．５付近で推移した。 反応６時間後にサンプリングし合成ペプチドを基質としたＨＧＦＡ活性測定を行った。０．２５％ＢＳＡを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ－０．１５Ｍ塩化ナトリウム－１０ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ７．５）バッファーに合成基質Ｈ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－ｐＮＡ・２ＡｃＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ社製、Ｌ－１８８５）を溶解し、２ｍＭになるよう調製した。これを１００μＬ／ｗｅｌｌで９６穴プレートに必要なｗｅｌｌ数分をアプライし、活性化処理されたＨＧＦＡ培養上清、ポジティブコントロール、未処理のｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清を各１０μＬずつ添加した。ポジティブコントロールには、予め活性化させ、ｐｒｏ－ＨＧＦを十分に活性化できることを確認した、ＨＧＦＡ培養上清を用いた。アルミ箔で遮光し、３７℃、１時間インキュベートした。ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダー（４０５ｎｍ）で吸光度を読み取り、未処理のｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清の数値を差し引いた値をＨＧＦＡ活性値とした。その結果、活性化後のＨＧＦＡサンプルの活性値は０．５７７を示し、ポジティブコントロールの活性値とほぼ同程度であることを確認した。本反応液中に酵素等を外来的に添加していないことから、宿主であるＣＨＯ細胞由来の酵素の働きによってｐｒｏ－ＨＧＦＡが活性化されると推測される。また、反応７．６時間後の溶液に１Ｍ　Ｔｒｉｓを加えてｐＨを７．０に調整した後、２日間冷蔵保存しＨＧＦＡ活性値の変化を調べたところ、活性値は、中和直後が０．６５３、冷蔵１日目が０．６６７、冷蔵２日目が０．６７９と、活性値に大きな低下は見られず、活性化後２日間は安定であった（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｐｒｏ－ＨＧＦを組換えて発現するＣＨＯ細胞をＥＸ－ＣＥＬＬ特注培地を用いてＴ７５フラスコに融解し、２５０ｍＬシェーカーフラスコおよび７Ｌ培養槽で拡大培養を行った後、２０Ｌ培養槽で１４４ｒｐｍ、３６．５℃設定で９日間培養した。培養９日目の細胞の生存率は９０．６％であった。除細胞ろ過後、０．２μｍフィルター（ザルトリウス社製、５４４５３０７Ｈ９-―００）を通して精密ろ過した１９．１４ｋｇのｐｒｏ－ＨＧＦ培養上清を３０Ｌ培養槽に投入した。そこに、活性化してｐＨを７．０に戻し、２日間冷蔵保存しておいたＨＧＦＡ培養上清を、１／２０量である０．９６ｋｇ加え、３０ｒｐｍ、２５℃設定で攪拌しながら反応させた。なお、投入した活性化済みのＨＧＦＡ培養上清は、ＨＧＦＡ活性測定でポジティブコントロールと同程度の活性値が得られたものを使用した。約２０時間反応後にサンプリングを行い、５－２０％ポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ社製、ＮＸＶ－２７１ＨＰ）を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥで、ｐｒｏ－ＨＧＦの活性化状態を確認した。非還元条件下で見られる１本鎖のバンドが、還元条件下では、活性化後は1本鎖体が消失し、α鎖とβ鎖に分離していることから、ｐｒｏ－ＨＧＦが十分に活性化されていることを確認できた（図１）。
［実施例２］
　実験計画法（ＤｏＥ）を用いて、実施例１に記載のｐｒｏ－ＨＧＦＡ活性化パラメーターであるｐＨ（５．３～５．５）および反応温度（室温）の妥当性を検証した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳインスティチュート社製）を用いて中心複合計画で実験条件を設定し、実施例1に記載の方法と同様にしてｐｒｏ－ＨＧＦＡ活性化処理のための溶液調製を行った。なお、ｐＨは２Ｍ塩酸を用いてｐＨ５．０、５．５および６．０の３条件に調整した。１００μＬずつ１．５ｍＬチューブに入れ、２０℃、２８．５℃および３７℃で静置反応させた。反応３、６、９、１５時間後にサンプリングし、合成ペプチドを基質としたＨＧＦＡ活性測定を行った。未処理のｐｒｏ－ＨＧＦＡ培養上清の数値（Ａ４０５）を差し引いた値をＨＧＦＡ活性値とした。得られた計２７条件のＨＧＦＡ活性値から統計学的解析により応答曲面プロットを作成し、０．４以上の活性値を有する範囲を白抜きで示した。本結果から、最も高いＨＧＦＡ活性値が得られる条件は、ｐＨ５．４、反応温度２６．１℃であり、また広い範囲でＨＧＦＡ活性値を得られることが分かった（図２）。
［実施例３］
　マルチモーダル陰イオン交換体のＣａｐｔｏ　Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥヘルスケア社製、２８－４０５８－４４）２ｍＬを、２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化した。活性型ＨＧＦを含む培養上清３２ｍＬには、１Ｍになるように塩化ナトリウムを添加した。この培養上清を、流速２ｍＬ／分でカラムに負荷して素通り液を回収した。負荷終了後に２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を３カラム体積相当流して洗浄し、溶出液を回収した。洗浄終了後に、０．２５Ｍアルギニンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を３カラム体積相当流して洗浄し、溶出液を回収した。次に、０．７Ｍアルギニンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１カラム体積相当流して溶出液を回収する操作を５回繰り返し行った。最後に、１．０Ｍアルギニンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を３カラム体積相当流して溶出液を回収した。図３に、この工程で回収した溶液を用いて、非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のゲルは、ＤＲＣ社製のＸＶ－ＰＡＮＴＥＲＡ（ＮＸＶ－２７１ＨＰ）を、分子量マーカーはＢＩＯＲＡＤ社製のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｌｌ　Ｂｌｕｅ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（１６１－０３７３）を用いた。試料は、Ｌａｅｍｍｌｉのサンプルバッファー中で６０℃、１０分間の加熱処理を行った後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。電気泳動は１５０Ｖの定電圧下で行い、電気泳動終了後にコスモバイオ社製のＰＡＧＥ　Ｂｌｕｅ８３を用いてゲルを染色し、分離されたタンパク質の確認を行った。カラム負荷液と素通り液を比較すると、素通り液では分子量７万５千付近のＨＧＦのバンドが減少し、担体に吸着されたことが示された。ＨＧＦは、２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を通液しても溶出されなかった。引き続く０．２５Ｍアルギニンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）での洗浄で、不純物を多く含む成分が溶出されてきた。そして０．７Ｍアルギニンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を通液することにより、活性型ＨＧＦが溶出された。
［実施例４］
　マルチモーダル陰イオン交換体のＣａｐｔｏ　Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥヘルスケア社製、２８－４０５８－４４）１ｍＬを、あらかじめ２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した。活性型ＨＧＦを含む培養上清８ｍＬには、１Ｍになるように２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を等量添加した。この培養上清を、カラムに負荷して素通り液を回収した。負荷終了後に２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を３カラム体積相当流して洗浄し、溶出液を回収した。１Ｍアルギニンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５カラム体積相当流して溶出液を回収した。図４に、この工程で回収した溶液を用いて非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った結果を示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のゲルは、ＤＲＣ社製のＸＶ－ＰＡＮＴＥＲＡ（ＮＸＶ－２７１ＨＰ）を、分子量マーカーはＢＩＯＲＡＤ社製のＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｌｌ　Ｂｌｕｅ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（１６１－０３７３）を用いた。試料は、Ｌａｅｍｍｌｉのサンプルバッファー中で６０℃、１０分間の加熱処理を行った後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。電気泳動は１５０Ｖの定電圧下で行い、電気泳動終了後にコスモバイオ社製のＰＡＧＥ　Ｂｌｕｅ８３を用いてゲルを染色し、分離されたタンパク質の確認を行った。カラム負荷液と素通り液を比較すると、素通り液ではＨＧＦのバンドが減少し、担体に吸着されたことが示された。ＨＧＦは、２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を通液しても溶出されなかった。引き続く１Ｍアルギニンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）での溶出で、活性型ＨＧＦが溶出された。
［実施例５］
　実施例１の方法で得られた活性型ＨＧＦを含む培養上清液に、２Ｍ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を等量加えた後、ｐＨ８．０に調整した。２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＣａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅ（ＧＥヘルスケア１７－５４４４－０５）カラムに上記溶液を負荷して、負荷終了後に平衡化に用いた緩衝液で洗浄した。カラムは０．２５Ｍアルギニン塩酸を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、０．７Ｍアルギニン塩酸を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出して、ＨＧＦを含む画分を回収した。
　Ｃａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅ精製画分をプールし、０．０１２％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で７倍希釈した溶液を、０．０１２％ポリソルベート８０を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＣａｐｔｏ　Ｑ（ＧＥヘルスケア１７－５３１６－０５）カラムに負荷し、負荷終了後に平衡化に用いた緩衝液で洗浄した。カラム素通り液および洗浄液をプールして、Ｃａｐｔｏ　Ｑ精製画分とした。
　Ｃａｐｔｏ　Ｑ精製画分を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＵＮＯｓｐｈｅｒｅ　Ｓ（バイオラッド１５６－０１１７）カラムに負荷し、負荷終了後に平衡化に用いた緩衝液で洗浄を行った。同溶液での洗浄終了後、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）による洗浄操作を行った後、０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、吸着したＨＧＦを溶出してＵＮＯｓｐｈｅｒｅ　Ｓ精製画分とした。
　ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ　Ｓ精製画分に、５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて、溶液の塩化ナトリウム濃度が３．３Ｍになるように調製し、ｐＨが７．５になるように調整した。Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア１７－１０８２－０４カラム）を、３．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したのち、上記ＨＧＦ溶液を負荷した。負荷終了後、平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄した。吸着したＨＧＦは、平衡化緩衝液（Ａ）と、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（Ｂ）とのリニアグラジエント（Ｂを３０から１００％）により溶出した。
［実施例６］
　活性型ＨＧＦＡが添加されず、活性化されていないｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清液について実施例５と同じようにＣａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅｓｅ精製、ＣａｐｔｏＱ精製、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ精製、ＵＦ濃縮バッファー交換を実施した。活性化されていないＰｒｏ－ＨＧＦも本精製工程で精製されることを示している、各工程で得られたサンプルの非還元および還元のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図５に示す。
［実施例７］
　実施例５で得られた活性型ＨＧＦにつき、ＴＧＦβ－１存在下における細胞増殖活性を測定した。ミンク肺上皮細胞Ｍｖ　１　Ｌｕ（細胞番号：ＪＣＲＢ９１２８）を用い、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　β－１（ＴＧＦβ－１）存在下で増殖抑制された細胞に活性型ＨＧＦを添加し、そのＴＧＦβ－１活性への拮抗作用に基づいた活性型ＨＧＦの増殖活性を検出することで力価を測定した（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５８、１－１１、２００１）。
　９６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌにＴＧＦβ－１（４ｎｇ／ｍＬ）を５０μＬ、国際ＨＧＦ標準品（ＮＩＢＳＣ　ｃｏｄｅ：９６／５６４）またはＨＧＦ（０、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４　ｎｇ／ｍＬ）を各々５０μＬ、ミンク肺上皮細胞懸濁液（１×１０５　ｃｅｌｌ／ｍＬ）を１００μＬ添加後、３７℃、ＣＯ２濃度５％で３日間培養後、Ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ（同仁化学研究所、Ｃａｔ　Ｎｏ．３４３－０７６２３）により生細胞を着色した。マイクロプレートリーダーを使用し、４５０ｎｍの吸光度から、国際ＨＧＦ標準品およびＨＧＦにつき、各々シグモイドカーブを得た（図６）。国際ＨＧＦ標準品およびＨＧＦのＥＣ５０は、各々１３．４，１５．４ｎｇ／ｍＬであり、上記の製造方法で得られたＨＧＦは国際ＨＧＦ標準品と同等の活性を有していた。

Claims (13)

  1. 　活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（ＨＧＦＡ）を製造する方法であって、
    工程１：
    　不活性型肝細胞増殖因子アクチベーター（ｐｒｏ－ＨＧＦＡ）を発現する哺乳動物細胞を、血清を含まない培地において培養することにより、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を取得する工程、および、
    工程２：
    　前記工程により取得されたｐｒｏ－ＨＧＦＡを含む培養上清を、弱酸性に調整して、ｐｒｏ－ＨＧＦＡを活性型ＨＧＦＡに変換する工程、
    を含む、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  2. 　請求項１に記載の製造方法であって、
    　前記工程が、前記培養上清に硫酸化多糖類を添加することをさらに含む、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  3. 　請求項１または２に記載の製造方法であって、
    　前記培養上清を弱酸性に調製する工程が、ｐＨを４．０～６．０に調整する工程である、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法であって、
    　前記培養上清を弱酸性に調製する工程が、１５～４０℃の温度で行われる、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法であって、
    　前記培養上清は、培養する哺乳動物細胞の生存率の低下後に取得される、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法であって、
    　前記哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法であって、
    　前記ｐｒｏ－ＨＧＦＡは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法であって、
    　前記培養上清が、前記培養上清そのものであるか、前記培養上清を希釈したものであるか、前記培養上清を濃縮したものであるか、または前記培養上清を部分精製したものである、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法によって取得される、
    ことを特徴とする、
    活性型ＨＧＦＡ。
  10. 　活性型肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を製造する方法であって、
    　不活性型肝細胞増殖因子（ｐｒｏ－ＨＧＦ）を含む培養上清に、活性型ＨＧＦＡを作用させて、前記ｐｒｏ－ＨＧＦを活性型ＨＧＦに変換する工程、
    を含み、
    　ここで、
    　前記ｐｒｏ－ＨＧＦを含む培養上清は、ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞を、血清を含まない培地において培養して得られる培養上清であり、
    　前記活性型ＨＧＦＡが、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法によって製造されたものである、
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  11. 　請求項１０に記載の製造方法であって、
    　前記ｐｒｏ－ＨＧＦを発現する細胞を培養する培地が動物由来の成分を含まない培地である
    ことを特徴とする、
    製造方法。
  12. 　請求項１０または１１に記載の製造方法であって、
    　前記ｐｒｏ－ＨＧＦは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする、
    製造方法。
  13. 　請求項１０～１２のいずれか１項に記載の製造方法によって取得される、
    ことを特徴とする、
    活性型ＨＧＦ。
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