WO2017135311A1 - 配列特異的で設計可能な標的遺伝子の転写抑制阻害剤およびこれを含む組成物並びにその使用 - Google Patents

配列特異的で設計可能な標的遺伝子の転写抑制阻害剤およびこれを含む組成物並びにその使用 Download PDF

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cancer
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金田　篤志
憲一 篠原
哲宏 根本
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国立大学法人千葉大学
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Definitions

  • the present invention relates to a sequence-specific and designable target gene transcription repression inhibitor, a composition containing the same, and use thereof.
  • Pyrrole imidazole polyamide is a DNA-binding molecule that can be designed to bind to DNA in a sequence-specific manner (Non-patent Document 3).
  • Non-patent Document 4 Various methods for modifying sequence-specific epigenetic modifications using a fusion drug of pyrrole-imidazole polyamide and a DNA demethylating agent or histone deacetylase inhibitor have begun to be reported (Non-Patent Document 4). ).
  • a technique for inhibiting the methylation of plasmid DNA in a sequence-specific manner with pyrrole-imidazole polyamide has been reported (Non-patent Document 5).
  • Non-Patent Document 5 concludes that pyrrole-imidazole polyamide competes directly with DNA methyltransferase (DNMT) binding and inhibits it directly, and presents the concept of competition between pyrrole-imidazole polyamide and DNA methyltransferase. .
  • Non-patent document 5 only verified that pyrrole-imidazole polyamide can inhibit methylation of C residues present in the binding sequence of several bases to which it binds, and proposed competition with DNMT as a mechanism. In view of this, it is assumed that there is no effect on the C residues surrounding this sequence.
  • gene suppression is due to hypermethylation over the entire promoter region, according to Non-Patent Document 5, there can be very little or no effect on gene expression suppression. Clearly not suitable for causing inhibition of gene expression suppression in vivo.
  • the present invention provides a sequence-specific and designable target gene transcription repression inhibitor, a composition containing the same, and use thereof.
  • pyrrole-imidazole polyamide can be concentrated and distributed in the nucleus in the cell, can suppress the methylation of the target site in the cell, and can further suppress the DNA region around the target site. It was found that methylation can be suppressed. In particular, the inventors have found that it is sufficient for PIP to have four monomer units to suppress methylation of the DNA region around the target site. The present inventors have also revealed that this can inhibit transcriptional repression of the gene due to methylation. The present inventors further found that the transcriptional repression of the gene can be effectively inhibited by treating with pyrrole-imidazole polyamide after the DNA demethylation treatment and preferably the histone deacetylation inhibition treatment.
  • a compound can be delivered to genomic DNA in a sequence-dependent manner by conjugating a compound such as a histone modifying enzyme inhibitor to pyrrole-imidazole polyamide.
  • the present invention has been made based on these findings.
  • a composition for use in inhibiting suppression of gene expression due to DNA methylation in a living body comprising pyrrole imidazole polyamide, which is a minor groove of DNA in the promoter region of the gene.
  • a composition that is designed to bind sequence-specifically comprising a conjugate of pyrrole imidazole polyamide and histone modifying enzyme inhibitor, and pyrrole imidazole in the conjugate Polyamide is a composition designed to bind sequence-specifically to a minor groove of DNA in the promoter region of the gene.
  • composition according to (7) above, wherein the gene is MLH1 gene A pharmaceutical composition for treating cancer in a subject of cancer, comprising the composition according to (7) or (8) above, which can inhibit transcriptional repression of a tumor suppressor gene.
  • Pharmaceutical composition. The cancer is selected from colon cancer, stomach cancer, gastric pit type stomach cancer, esophageal cancer, head and neck squamous cell carcinoma, non-small cell lung cancer, and colorectal cancer, and DNA in the promoter region is methylated
  • composition according to (9) or (10) above which is used in combination with a DNA demethylating agent and a histone deacetylation inhibitor.
  • a pharmaceutical composition for use in preventing the onset of cancer or for reducing the risk of developing cancer in a subject having increased methylation of the MLH1 gene wherein (8) A pharmaceutical composition comprising the composition according to 1.
  • a DNA methylation inhibitor for use in inhibiting DNA methylation in or near target DNA in a living body comprising pyrrole imidazole polyamide, and pyrrole imidazole polyamide binds to the target DNA in a sequence-specific manner DNA methylation inhibitors designed to
  • FIG. 1 shows, as an example, a diagram in which a pyrrole-imidazole polyamide (PIP1) that specifically binds to the -19 to -13 region of the promoter region of the MLH1 gene is designed.
  • TSS indicates a transcription start site (transcription start point).
  • FIG. 2 shows the binding characteristics of the designed PIP1 in vitro (FIG. 2A) and the distribution in the cell (FIG. 2B).
  • FIG. 3 shows a plasmid in which a DNA region including the promoter region of the MLH1 gene is incorporated (FIG. 3A), a relative position (FIG. 3B) at which a methylation level is confirmed on the DNA region, and methylation of DNA by PIP1.
  • FIG. 3A shows a plasmid in which a DNA region including the promoter region of the MLH1 gene is incorporated
  • FIG. 3B a relative position at which a methylation level is confirmed on the DNA region, and methylation of DNA
  • FIG. 4A shows the methylation level of the promoter region of the MLH1 gene in cells treated with 5-aza-2'-deoxycytidine (AZA) or 5-aza-2'-deoxycytidine and trichostatin A (AZA + TSA).
  • FIG. 4B shows changes in the expression level of the MLH1 gene due to the above treatment.
  • FIG. 5 shows a change in the methylation level (FIG. 5A) and a change in the expression level of the MLH1 gene (FIG. 5B) in the region of the cells cultured under hypoxic conditions after the treatment.
  • FIG. 6 shows that PIP1 can inhibit the increase in methylation level (FIGS.
  • FIG. 6A and B that it can release the suppression of MLH1 gene expression (FIGS. 6C and D), and a promoter region away from the binding site of PIP1. Again, it shows that it has an effect of suppressing methylation (FIG. 6E).
  • FIG. 7 shows a schematic diagram of a 4-base recognition PIP. These form homodimers on the DNA sequence.
  • FIG. 8 shows the results of genome-wide methylation analysis with Im0 or Im3 and the results of methylation analysis of the transcription initiation region ⁇ 1 kb region.
  • FIG. 9 shows changes in gene expression in cells treated with DMSO, inhibitor (NCD38) or Im3-N.
  • FIG. 10 shows the results of identifying histone acetylation after Im0-N or Im3-N treatment by the ChIP sequencing method.
  • the horizontal axis of the graph shows the result of counting the number of WWWW sequences (Im0-N treatment) or the number of WCGW sequences (Im3-N treatment) in the histone acetylated region.
  • the vertical axis of the graph indicates the rate at which each count occurs.
  • FIG. 11 shows the results obtained by further analyzing the results of FIG.
  • the pie chart of FIG. 11 (two from the left) is classified into 36 or more (rich) and 12 or less (poor) by the count of WWW sequences by treatment with the inhibitor NCD38 alone, and Im0-N or Im3-N for each.
  • the rich portion When processed, the rich portion is indeed activated with Im0-N, indicating that it is less activated with Im3-N.
  • the pie chart of FIG. 11 (two from the right) is classified into 5 or more (rich) and 3 or less (poor) by the count of the WCGW array, and when processed with Im0-N or Im3-N for each, the rich part is surely It is activated by Im3-N, but not activated by Im3-0.
  • living body means a living body of animals and plants, and a cell or a cell population regardless of whether or not separated from the living body.
  • the animals and plants are, for example, animals, for example, vertebrates, for example, mammals, for example, primates, for example, humans.
  • the “subject” is a mammal such as a primate such as a human.
  • a subject suffering from cancer may be referred to as a subject of cancer.
  • the subject if the subject is a human, the subject may be a patient.
  • DNA methylation means methylation of DNA molecules.
  • methylation of DNA methylation with respect to the carbon atom at the 5-position of the pyrimidine ring of cytosine is known.
  • DNA methylation occurs at CpG dinucleotide sites on the DNA molecule.
  • DNA methylation is known to reduce the expression of nearby genes and has been found to play an important role in the development of almost all types of cancer.
  • excessive methylation of DNA occurs in the promoter region of a tumor suppressor gene and causes cancer by suppressing transcription of the tumor suppressor gene.
  • gene expression suppression by gene promoter region methylation include, for example, suppression of CDKN2A gene expression in human colon cancer and suppression of MGMT gene expression in brain tumors.
  • promoter means a transcriptional regulatory region of a gene. Promoters are known to be present in the upstream region of ⁇ 200 to ⁇ 1, particularly in the region of ⁇ 100 to ⁇ 1, when the transcription start site is +1. For example, in eukaryotes, the promoter has a TATA sequence called a TATA box upstream from the ⁇ 25 region. A CAAT box exists in the region from -100 to -60, and a GC box exists in the region from -60 to -40. These sequences are well known for being involved in the transcriptional regulation of genes.
  • a number is used to represent the position of DNA in the promoter region
  • the transcription start point (site) is set to +1, and the number is decreased by 1 every time one base moves upstream
  • a specific DNA location is specified by a number based on the relative position from the transcription start site by incrementing by 1 every time one base moves downstream.
  • RNA expression means transcription from DNA to RNA.
  • RNA include messenger RNA (hereinafter referred to as “mRNA”). Reducing gene expression means reducing the amount of transcription to mRNA.
  • pyrrole-imidazole polyamide means a linear chain formed by linking an N-methylpyrrole unit (hereinafter abbreviated as “Py”) and an N-methylimidazole unit (hereinafter abbreviated as “Im”). It is a macromolecule in which a linker (for example, ⁇ -aminobutyric acid) is interposed between Py units and / or Im units in the molecule, whereby the molecule takes a hairpin structure.
  • pyrrole-imidazole polyamides were fused with agents (promoters and inhibitors) for histone protein modifications such as histone deacetylation inhibitors and DNA modifications such as DNA methylation inhibitors. It is not a form.
  • Pyrrole imidazole polyamide can penetrate into the minor groove of DNA, where Im / Py binds to GC base pairs, Py / Im binds to CG base pairs, and A -It is known that Py / Py binds to -T base pairs or TA base pairs, and in particular, the interaction between G and Py is strong, which makes pyrrole-imidazole polyamides in the minor groove of DNA. It binds sequence-specifically.
  • the Im unit can be changed to, for example, a ⁇ -alanine unit.
  • One ⁇ -alanine unit can be included in 3 to 4 units of Py unit or Im unit.
  • Py and Im when expressed as Py / Im, Py and Im have a hairpin structure when the molecule is bent even though the Py unit and the Im unit in the molecule are arranged at different positions in the arrangement order. In some cases, it means that they are located close together.
  • the pyrrole imidazole polyamide is represented by the general formula (A): ⁇ Wherein m, n, o, p, x, y, and z are each independently a natural number, and R 1 and R 2 are each independently a protecting group. ⁇
  • the units of the same kind are collectively shown for convenience in the figure, but actually, the Py unit, the Im unit, and the ⁇ -alanine unit are the same as the above-mentioned rules.
  • the DNA is rearranged in the arrangement order corresponding to the DNA sequence to be bound.
  • the R 1 group can be, for example, —CO—NH—CH 2 —CH 2 —CO—NH—CH 2 —CH 2 —CH 2 —N (CH 3 ) 2.
  • the R 2 group can be, for example, —NH—CO—CH 3 .
  • p can be a natural number of 2 to 4, for example 3, and m + n + o and x + y + z are 5 to 20, 7 to 15 or, depending on the length of DNA to be bound. It can be 7-10.
  • the compound of the formula (I) is an example of pyrrole-imidazole polyamide, but is a molecule in which a Py unit and an Im unit are connected by —CO—NH—, and between the Py unit and the Im unit in the molecule. ⁇ -aminobutyric acid is interposed as a linker, the molecule is bent at the linker portion, and the entire molecule has a hairpin structure. Pyrrole imidazole polyamide takes a hairpin structure in the minor groove of DNA and stabilizes the bond by interacting with the base of DNA and Py unit or Im unit. This compound of the formula (I) can bind in a sequence-specific manner to a 7-base long region from -19 to -13 from the transcription start site of the MLH1 gene.
  • the compound of the above formula (I) has the technical significance in the sequence-specific binding of DNA with the sequence order of Py unit and Im unit as shown below.
  • the sequence is described on a straight line, but binding to DNA is performed by forming a hairpin structure at the “ ⁇ ” portion. In this specification, this arrangement may be referred to as a primary structure.
  • Ac represents an acetyl group
  • ⁇ represents ⁇ -alanine
  • ⁇ represents ⁇ -aminobutyric acid
  • Dp represents diaminopropane.
  • sequence-specific means that pyrrole-imidazole polyamide and DNA bind in a sequence-dependent manner, and thus bind to the target sequence as designed, or to the target sequence more than other sequences. Is used to mean a stronger bond.
  • lengthen the target DNA sequence for example, 4 bases or more, 5 base pairs or more, 6 base pairs or more, 7 base pairs or more, It can be 8 base pairs or more, 9 base pairs or more, 10 base pairs or more, or more.
  • demethylation treatment means treatment for removing methylation from the 5-position carbon atom of the pyrimidine ring of cytosine.
  • deacetylation inhibition treatment means treatment for inhibiting deacetylation of histones.
  • the deacetylation treatment is performed by inhibiting histone deacetylase (HDAC).
  • HDAC histone deacetylase
  • treatment is used to mean both treatment and prevention.
  • the present inventors widely suppress DNA methylation on the promoter around the target site by using pyrrole-imidazole polyamide whose target sequence is only 4 base pairs (for example, 7 base pairs) on the promoter region. As a result, it was found that the transcriptional repression of the gene driven by the promoter is released. For this purpose, special DNA methylation inhibitors are not necessary. This is thought to be due to the fact that pyrrole-imidazole polyamide binds to the promoter region in the living body, so that the DNA conformation changes widely, and the DNA methylation reaction and transcription reaction are widely affected.
  • a composition for use in inhibiting gene expression suppression due to DNA methylation in a living body, comprising pyrrole-imidazole polyamide, and comprising pyrrole-imidazole polyamide
  • a composition that is designed to sequence-specifically bind to a minor groove of DNA in the promoter region of the gene.
  • the composition does not contain a DNA methylation inhibitor other than pyrrole-imidazole polyamide.
  • an N-methylpyrrole unit hereinafter referred to as Py
  • an N-methylimidazole unit hereinafter referred to as Im
  • the Py unit and / or Im unit Including one linker 1 and one or more linkers 2 in between, takes a hairpin structure folded at the site of linker 1 in the minor groove of DNA, and Im / Py binds to GC base pairs of DNA Py / Im binds to CG base pair, Py / Py binds to AT base pair or TA base pair, and Py may be replaced with ⁇ -alanine.
  • pyrrole-imidazole polyamide which is ⁇ -aminobutyric acid
  • the replacement of Py with ⁇ -alanine can be performed at a ratio of 1 to 3 to 4 structural units.
  • a pyrrole-imidazole polyamide that binds to the target DNA in a sequence-specific manner can be designed.
  • this molecule can be synthesized on a solid phase by the Boc method or Fmoc method well known to those skilled in the art, and can be synthesized using a commercially available automatic synthesizer or the like. Are known.
  • the present inventors have found that DNA methylation is suitably inhibited by pyrrole-imidazole polyamide in an environment where methylation is promoted.
  • the present inventors have also described that when cells are cultured under hypoxic conditions after DNA demethylation treatment and after DNA demethylation treatment and histone demethylation treatment, the cells become free of their own DNA methyltransferases.
  • the DNA methylation is enhanced by the action (see, for example, Lu, Y. et al., Cell Reports, 8: 501-513, 2014), but pyrrole-imidazole polyamide suitably inhibits DNA methylation. I found out. Therefore, the composition of the present invention can be used after DNA demethylation treatment or after DNA demethylation treatment and histone demethylation treatment.
  • compositions of the present invention can also be used, for example, to inhibit DNA methylation induced under hypoxic conditions, for example after DNA demethylation or DNA demethylation and histone It can be used to inhibit DNA methylation induced under hypoxic conditions after demethylation treatment.
  • hypoxia chronic inflammation caused by H. pylori infection is known as an environment in which DNA methylation is promoted in vivo (for example, Matsusaka, K. et al., World J. Gastroenterol., 20 ( 14): See 3916-3926, 2014).
  • infection with some pathogens such as Epstein-Barr virus infection promotes DNA methylation (see, for example, Matsusaka, K. et al., 2014).
  • DNA methylation can also be promoted by abnormalities of living cells such as increased expression of DNA methyltransferase (DNMT), mutation of IDH gene, decreased activity of TET2 enzyme (for example, Figueroa, ME. Et al., Cancer Cell, 18: 553-567, 2010 and Turcan S., Nature, 483: 479-483).
  • DNMT DNA methyltransferase
  • TET2 enzyme for example, Figueroa, ME. Et al., Cancer Cell, 18: 553-567, 2010 and Turcan S., Nature, 483: 479-483.
  • composition of the present invention can be used after DNA demethylation treatment and histone deacetylation inhibition treatment.
  • the DNA methylation treatment can be performed using, for example, a DNA methylation inhibitor.
  • a DNA methylation inhibitor examples include DNA methyltransferase inhibitors.
  • the DNA methylation inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit DNA methylation, and examples thereof include anti-cancer agents such as 5-aza-2′-deoxycytidine and 5-azacytidine. Can be used.
  • the treatment for inhibiting histone deacetylation can be performed using, for example, an HDAC inhibitor.
  • HDAC inhibitors include, but are not limited to, trichostatin A, n-butyric acid, apicidin vorinostat (SAHA), and valproic acid, and can be used in the present invention.
  • the gene (target gene) that inhibits expression suppression due to DNA methylation is, for example, a gene in which DNA in the promoter region is methylated.
  • genes in which promoter region DNA is methylated include tumor suppressor genes in which promoter region DNA is methylated, and such genes are well known to those skilled in the art.
  • genes in which promoter region DNA is methylated or tumor suppressor genes include MLH gene, BRCA1 gene, estrogen receptor gene, CDKN2A gene, MGMT gene, CDH1 gene, RUNX3 gene, RASSF1A gene, and SFRP1 gene. It is done.
  • Pyrrole imidazole polyamide binds sequence-specifically to part of the DNA of the promoter region of these target genes (eg, ⁇ 1 kb region, -200 to -1, preferably -100 to -1 region).
  • a region of ⁇ 200 to ⁇ 1, preferably ⁇ 100 to ⁇ 1, more preferably a portion of ⁇ 50 to ⁇ 1 of the MLH1 gene (a region having a length of 5 bases or more as described above) ) Can be designed to bind in a sequence-specific manner.
  • a pyrrole-imidazole polyamide that inhibits methylation of the promoter region of the MLH1 gene a pyrrole-imidazole polyamide that can be sequence-specifically bound to the promoter region of the MLH1 gene, for example, a compound represented by the formula (I) can be used.
  • the conjugate of the pyrrole imidazole polyamide and the histone modifying enzyme inhibitor can be used as the conjugate of the pyrrole imidazole polyamide and the histone modifying enzyme inhibitor that inhibits methylation of the promoter region of the MLH1 gene.
  • a conjugate of pyrrole-imidazole polyamide and a histone modifying enzyme inhibitor is provided.
  • the pyrrole-imidazole polyamide in the conjugate has a target DNA sequence length of, for example, 4 bases or more, 5 base pairs or more, 6 base pairs or more, 7 base pairs or more, 8 base pairs or more, 9 base pairs As mentioned above, it can be 10 base pairs or more.
  • the length of the target DNA sequence of pyrrole-imidazole polyamide in the conjugate can be 7 base pairs or less, 6 base pairs or less, 5 base pairs or less, or 4 base pairs.
  • the histone modifying enzyme inhibitor is an inhibitor of histone methylase, a histone acetyltransferase activator (HAT activator) or a histone deacetylase inhibitor (HDAC inhibitor).
  • HAT activator histone acetyltransferase activator
  • HDAC inhibitor histone deacetylase inhibitor
  • the histone modifying enzyme inhibitor is an inhibitor of LSD1, which is a lysine-specific demethylase. Examples of inhibitors for LSD1 include NCD38 and GSK-LSD1, which can be used in the present invention.
  • HDAC inhibitors include trichostatin A (TSA), butyric acid, apicidin, valproic acid, LBH589 and suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA).
  • the HAT activator is N- (4-chloro-3-trifluoromethylphenyl) -2-ethoxy-6-pentadecylbenzamide (CTBP) or a derivative thereof such as N- (4-Chloro-3-trifluoromethylphenyl) -2-ethoxy-benzamide (CTB).
  • a composition for reducing DNA methylation comprising a conjugate of pyrrole-imidazole polyamide and a histone modifying enzyme inhibitor.
  • sequence-specific binding to a part of DNA of a promoter region of a target gene eg, ⁇ 1 kb region, -200 to -1, preferably -100 to -1 region
  • a composition for use in improving the expression level of the target gene comprising a conjugate of a pyrrole-imidazole polyamide designed with a histone modifying enzyme inhibitor.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer in a cancer subject comprises pyrrole imidazole polyamide or pyrrole imidazole polyamide and histone, which sequence-specifically binds to the promoter region of a tumor suppressor gene in which DNA in the promoter region is methylated. Conjugates with modified enzyme inhibitors are included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention inhibits the methylation of DNA in the promoter region of the tumor suppressor gene, thereby suppressing the transcriptional repression of the tumor suppressor gene, and can treat cancer.
  • the DNA of the promoter region of the tumor suppressor gene is methylated, and this is the cause.
  • colorectal cancer colonal cancer
  • stomach cancer esophageal cancer
  • squamous cell carcinoma of the head and neck lung cancer
  • pancreatic cancer liver cancer
  • bile duct cancer blood tumor
  • breast cancer endometrial cancer
  • ovarian cancer brain tumor
  • soft tissue sarcomas one of the causes is that DNA in the promoter region of the tumor suppressor gene is methylated.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises colorectal cancer (colorectal cancer), stomach cancer, esophageal cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, lung cancer, pancreatic cancer, liver cancer, bile duct cancer, blood tumor, breast cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, It can be used to treat brain tumors and soft tissue sarcomas.
  • colorectal cancer colonal cancer
  • stomach cancer esophageal cancer
  • squamous cell carcinoma of the head and neck lung cancer
  • pancreatic cancer liver cancer
  • bile duct cancer blood tumor
  • breast cancer endometrial cancer
  • ovarian cancer it is known that the DNA of the promoter region of the MLH1 gene is methylated. Therefore, the target gene of pyrrole-imidazole polyamide in the pharmaceutical composition of the present invention can be MLH1 gene.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with a DNA demethylating agent or a combination of a DNA demethylating agent and a histone deacetylation inhibitor (hereinafter sometimes referred to as a “combination agent”). .
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject treated with a DNA demethylating agent or a combination of a DNA demethylating agent and a histone deacetylation inhibitor.
  • the DNA demethylating agent used in combination with the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited.
  • anticancer agents such as azacitidine and decitabine can be used.
  • histone deacetylation inhibitor used in combination with the pharmaceutical composition of the present invention trichostatin A, n-butyric acid, apicidin, valproic acid and the like can be used.
  • the order of administration of the pharmaceutical composition of the present invention and a DNA demethylating agent or a combination of a DNA demethylating agent and a histone deacetylation inhibitor is not particularly limited. After the combination of the DNA demethylating agent and the histone deacetylation inhibitor is administered, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient who is receiving anticancer drug treatment with a DNA demethylating agent or a DNA demethylating agent and a histone deacetylation inhibitor. Since the pharmaceutical composition of the present invention can suppress DNA methylation, the dosage of DNA demethylating agent or DNA demethylating agent and histone deacetylation inhibitor can be achieved in this manner. And the administration interval can be reduced, and the biological toxicity known to be caused by these drugs can be alleviated.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a cancer patient according to an administration plan in which a concomitant drug is administered and then a cycle of administering the pharmaceutical composition of the present invention is performed multiple times.
  • the transcriptional repression of the MLH1 gene is released.
  • the gene expression of the MLH1 gene can be at least partially maintained.
  • a pharmaceutical composition for use in preventing the onset of cancer or reducing the risk of developing cancer in a subject with increased methylation of the MLH1 gene comprising MLH1
  • Pharmaceutical compositions comprising pyrrole imidazole polyamides or pyrrole imidazole polyamides and conjugates of histone modifying enzymes that bind sequence-specifically to DNA in the promoter region of the gene are provided.
  • This pharmaceutical composition can also be used in combination with the above combination agent.
  • Examples of subjects with increased methylation of MLH1 gene include large intestine serrated adenoma. If the subject of a large intestine serrated adenoma is left untreated, MLH1 gene methylation is increased, resulting in transcriptional repression of the MLH1 gene, thereby developing colon cancer. Therefore, by administering the pharmaceutical composition of the present invention to such a subject, the onset of colorectal cancer can be prevented or the risk of developing colorectal cancer can be reduced.
  • a method for inhibiting gene expression suppression by DNA methylation in a living body Contacting a living body with a pyrrole imidazole polyamide or a conjugate of a pyrrole imidazole polyamide and a histone modifying enzyme inhibitor, or administering a pyrrole imidazole polyamide or a conjugate of a pyrrole imidazole polyamide and a histone modifying enzyme inhibitor to a living body,
  • a method is provided wherein the pyrrole imidazole polyamide or the conjugate of pyrrole imidazole polyamide and a histone modifying enzyme inhibitor is designed to bind sequence-specifically to a minor groove of DNA in the promoter region of the gene.
  • the method may further comprise contacting the living body with a DNA demethylating agent, or administering a DNA demethylating agent to the living body, or contacting the living body with a DNA demethylating agent, or The method may further comprise administering a DNA demethylating agent to the living body, contacting the living body with the HDAC inhibitor, or administering the HDAC inhibitor to the living body.
  • a method of treating cancer in a subject with cancer comprising: There is provided a method comprising administering a pharmaceutical composition of the present invention to said subject.
  • a method for preventing the onset of cancer or a method for reducing the risk of developing cancer in a subject having increased methylation of the MLH1 gene wherein the pharmaceutical composition of the present invention is administered to the subject.
  • a method is provided.
  • a pyrrole imidazole polyamide designed to bind to a promoter region of a tumor suppressor gene or a conjugate of a pyrrole imidazole polyamide and a histone modifying enzyme inhibitor for producing the pharmaceutical composition of the present invention is provided. Use is provided.
  • composition or pharmaceutical composition of the present invention may contain a pyrrole imidazole polyamide or a conjugate of a pyrrole imidazole polyamide and a histone modifying enzyme inhibitor that binds sequence-specifically to one site of the promoter region of the target gene, A plurality of different pyrrole imidazole polyamides or conjugates of pyrrole imidazole polyamides and histone-modifying enzyme inhibitors may be included, each of which specifically binds to different sites.
  • the composition or pharmaceutical composition of the present invention may comprise a conjugate linked as a pyrrole-imidazole polyamide with a histone modifying enzyme inhibitor such as a DNA methylation inhibitor or an HDAC inhibitor via a linker.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain an excipient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered, for example, by local administration (for example, intratumoral administration), intravenous administration, and transdermal administration.
  • the excipient can be appropriately selected by those skilled in the art, and the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately formulated.
  • Example 1 Design and preparation of pyrrole-imidazole polyamide for the promoter region of the MLH1 gene
  • the CpG island of the gene promoter region undergoes methylation, which is known to inactivate the transcription of the MLH1 gene. It is a gene.
  • a pyrrole-imidazole polyamide for the promoter region of the MLH1 gene was designed and prepared.
  • a pyrrole-imidazole polyamide is a polymer compound in which an N-methylpyrrole unit (denoted as Py) and an N-methylimidazole unit (denoted as Im) are polymerized, and is usually a ⁇ -aminobutyric acid unit (denoted as ⁇ ). It is folded at the site and takes a U-shaped conformation and binds to a minor groove of DNA. Im binds strongly to the G base and Py binds to the C base, A base and T base. Therefore, when Py and Im are properly aligned to correspond to the DNA sequence, the target DNA sequence is specific. Bonding pyrrole-imidazole polyamides can be designed. Py can be substituted for ⁇ -alanine, and the pitch of DNA and the pitch of pyrrole-imidazole polyamide can be matched by appropriately introducing ⁇ -alanine (for example, every 3 or 4 base pairs).
  • this pyrrole imidazole polyamide is referred to as PIP1.
  • the above numbers indicate the positions on the gene indicated by a method of -1 when moving one base upstream from the transcription start site as +1 (the same applies hereinafter).
  • the pyrrole-imidazole polyamide can be easily synthesized by a solid phase synthesis method such as the Boc method or the Fmoc method, and can also be synthesized using a commercially available automatic synthesizer.
  • PIP1 was obtained by presenting the designed pyrrole-imidazole polyamide and synthesizing it with Hipep Laboratories (Kyoto, Japan).
  • PIP2 see FIG. 1 and the compound of formula (II) having no binding site on the MLH1 gene was used.
  • Pyrrole imidazole polyamide was stored in dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration of 20 mM. ⁇ The symbols in the formula are as defined above. ⁇
  • a 15-base-pair FAM-labeled double-stranded oligo DNA (double-stranded oligo DNA obtained by annealing SEQ ID NOs: 2 and 3) containing the -22 to -8 region of the MLH1 gene was prepared (lower part of FIG. 2A), 10 mM PIP1 or PIP2 dissolved in 10 ⁇ L of a reaction solution containing Tris-HCl (pH 8.0) and 10% DMSO and 1 ⁇ M double-stranded oligo DNA were mixed at the indicated final concentration and incubated at 37 ° C. for 1 hour. did. The obtained reaction product was electrophoresed using 20% polyacrylamide gel, and the double-stranded DNA on the gel was visualized using LAS-3000 (Fujifilm, Japan).
  • Example 2 Intracellular localization of PIP1
  • the intracellular localization of PIP1 was confirmed.
  • intracellular localization in the colorectal cancer cell line RKO was confirmed.
  • the fixed cells were washed with PBS, stained with 1 ⁇ g / mL 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), and then using a fluorescence microscope BZ-X710 (KEYENCE, Osaka, Japan) And observed.
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • Example 3 PIP1 and DNA methylation
  • PIP1 and DNA methylation In this example, the effect of PIP1 on the methylation of the MLH1 gene was examined.
  • the -780 to +483 region (SEQ ID NO: 1) of MLH1 was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 6 and 7, to obtain a DNA fragment, and pGEM-T Easy vector (Promega, Fitchburg , USA) according to the manufacturer's manual (see FIG. 3A). 1 ⁇ g of the resulting plasmid was incubated at 25 ° C. for 12 hours in various concentrations of PIP1 or 40 ⁇ M PIP2 and 1 ⁇ NEB buffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, USA) to bind pyrrole-imidazole polyamide to DNA. . DMSO was added to the plasmid as a negative control and incubated.
  • Example 4 Effect of PIP1 on the methylation of the promoter region of the MLH1 gene in RKO cells
  • the inhibitory effect of PIP1 on methylation was examined using cells.
  • RKO cells were seeded 1.0 ⁇ 10 5 cells in 6cm dishes and treated with medium containing 5.0 ⁇ M 5-aza-2'-deoxycytidine (AZA) over the following seven days. The medium was replaced with fresh medium every 24 hours. On day 7, cells were treated with medium containing 10 nM trichostatin A (TSA), and cells were collected on day 8.
  • AZA 5-aza-2'-deoxycytidine
  • Example 3 the degree of methylation of the promoter region ⁇ 27 to ⁇ 1 of the MLH1 gene was confirmed by the pyrosequencing method. The result was as shown in FIG. 4A. As shown in FIG. 4, the degree of methylation decreased in this region both when treated with AZA alone and when treated with TSA in addition to AZA.
  • RT-PCR primer sequences were SEQ ID NOS: 2 and 3
  • the expression was recovered in the case of AZA treatment and AZA and TSA treatment (see FIG. 4B).
  • the expression of GAPDH was confirmed by RT-PCR (primer sequences were SEQ ID NOs: 4 and 5).
  • Day 8 cells were cultured under hypoxic conditions of 1% O 2 and 5% CO 2 .
  • Cells were treated with 0.1% DMSO containing 5 ⁇ M PIP1 or PIP2, and cells were harvested on day 0 (R0), day 20 (R20) and day 30 (R30) to obtain ⁇ 27 for the MLH1 gene.
  • the degree of methylation in the -1 region was examined by the pyrosequencing method. During treatment with PIP, the medium containing PIP1 or PIP2 was changed every 5 days and passaged when the cells became confluent.
  • FIGS. 6A and 6B in the PIP untreated group, the degree of DNA methylation was generally improved in R20 and R30, whereas in the PIP1-treated cells, the degree of methylation was increased. The rise in was suppressed.
  • FIGS. 6C and D in the cells treated with AZA + TSA, the expression of MLH1 gene mRNA that decreases with methylation was maintained by PIP1 treatment.
  • PIP1 can be concentrated and distributed in the nucleus in the cell, can suppress the methylation of the target site in the cell, and surprisingly, it can methylate the DNA region around the target site. It became clear that suppression was possible. Moreover, it became clear that the transcription
  • AZA and TSA are highly toxic to living bodies, and the dependence on these drugs in treatment cannot be increased.
  • PIP after AZA and / or TSA treatment, it is possible to maintain the effects of AZA and TSA treatment and provide a treatment method with reduced burden on the living body. Conceivable.
  • Example 5B Inhibition of methylation by 4-base recognizing PIP
  • the effect of inhibiting methylation by 4-base recognizing PIP was confirmed.
  • PIP was synthesized by combining motifs of W (ie, A or T) recognition, C recognition, or G recognition. Specifically, Me-Py-Py-Py-Py- ⁇ -Dp was synthesized as Im0, and Me-Py-Py-Im-Py- ⁇ -Dp was synthesized as Im3 (J. Am. Chem . ⁇ Soc. 1996, 118, 6141) (where ⁇ represents ⁇ -alanine, Me represents a methyl group, and Dp represents dimethylaminopropylamide).
  • Im0 forms a homodimer on the DNA sequence, recognizes the A / T sequence (ie 5′-WWW-3 ′), does not recognize the CpG site, Im3 forms a homodimer on the DNA sequence, Recognizes the CpG site (ie, 5′-WCGW-3 ′).
  • the colon cancer cell line RKO cells were seeded at a density of 1 ⁇ 10 5 cells in 6cm dishes and incubated for 24 hours. The culture was then replaced with a culture containing 0.5 ⁇ M 5-aza-2′-deoxycytidine (AZA) and the cultured cells were exposed to AZA for 24 hours. Cells were harvested on day 10 or cultured under hypoxic conditions as described below.
  • AZA 5-aza-2′-deoxycytidine
  • Cells were cultured for 8 days under continuous air aeration conditions. The CO 2 concentration was maintained by an internal CO 2 concentration control mechanism.
  • Cells treated with AZA were then treated with 0.1% DMSO containing 10 ⁇ M Im0 or Im3 for 75 days. During this time, the medium containing PIP was changed every 5 days. Cells were passaged at a density of 2 ⁇ 10 5 cells in a 6 cm dish when almost confluent. Cells were harvested on day 0 (H0, before hypoxia treatment) and day 75 (H75).
  • Genome-wide DNA methylation analysis was performed as follows. First, 500 ng of genomic DNA obtained from each sample was bisulfite-treated using a Zymo EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Whole genome amplification, labeling, hybridization and scanning were performed according to the manufacturer's manual. The methylation analysis was performed using Infinium Human Methylation450 BeadChip (Illumina) in the whole genome or in the ⁇ 1 kb region of the transcription initiation region (TSS) of each gene. Specifically, the ratio of the probe for the methylated sequence to the sum of the probe for the methylated sequence and the probe for the unmethylated sequence (referred to herein as “ ⁇ value”) was determined. The ⁇ value is 0.00 when no methylation is found at all CpG sites and 1.00 when all CpG sites are methylated.
  • genes having a ⁇ value> 0.8 in RKO cells as negative controls were selected. From the selected genes, genes that had a ⁇ value ⁇ 0.5 in H0 and a ⁇ value> 0.8 when treated with 0.1% DMSO in H75 were further selected.
  • a gene was selected as a gene whose methylation is selectively reduced by Im0. This corresponds to the 6099 probe in the whole genome, and this corresponds to the 1110 gene (2135 probe) in the TSS ⁇ 1 kb region. Gene whose methylation level is selectively reduced by Im3. Also, ⁇ value ⁇ 0.65 in H75 cells treated with Im3 and ⁇ value> 0.8 in H75 cells treated with Im-0N. A gene was selected as a gene whose methylation was selectively reduced by Im3.
  • DNA is demethylated genome-wide by AZA treatment.
  • methylation is induced genome-wide.
  • the methylation level of some genes was greatly reduced.
  • the methylation level of the gene was significantly reduced as a whole.
  • RNA libraries were prepared according to the manufacturer's manual using TruSeq Stranded RNA Sample Prep Kit (Illumina). Deep sequencing was performed using Illumina HiSeq 1500 or NextSeq 500 platform. FASTQ reads were mapped using ToppHat, and transcripts were assembled using Cufflinks. Gene expression was expressed as FPKM (fragments per kilobase of exon per million reads mapped). The results were as shown in the right graph of FIG.
  • gene expression of NOSTRIN, DSCR9, SLC22A25, OR3A4P, and C1WTNF6 was selectively maintained at Im3.
  • gene expression of TCP11, LYPD5, STAR, LOC253573, and LOC100507573 was maintained by Im0 and Im3.
  • Im0 and Im3 were able to decrease the gene methylation level in a sequence-specific manner and to maintain the normal gene expression level in the cells. From this, PIP containing four monomer units markedly controlled the gene expression level and methylation level genome-wide.
  • Example 6B In Creation embodiment of a conjugate with a histone modification enzyme inhibitors and PIP, a histone modification enzyme inhibitor alone are not activate gene expression, the PIP and the inhibitors including four monomeric units It was investigated whether the conjugate could be activated.
  • a conjugate of a histone modifying enzyme inhibitor and PIP was obtained by linking the following compound 4 to the amino group at the amino terminal of Im0 or Im3.
  • the conjugate of Im0 and LSD1 inhibitor thus obtained is referred to as Im0-N
  • the conjugate of Im3 and LSD1 inhibitor is referred to as Im3-N.
  • Compound 4 is an analog of NCD38, and is a compound optimized for fusion with PIP and maintenance of LSD1 inhibitory activity.
  • Colon cancer cell line RKO cells were seeded at a density of 1 ⁇ 10 5 cells in a 6 cm dish and incubated for 24 hours. The culture medium was then replaced with a culture medium containing 2 ⁇ M NCD38 and Im0-N, Im3-N, and the cultured cells were exposed to the drug for 30 days. During this time, the medium containing the compound was changed every 5 days. Cells were passaged at a density of 2 ⁇ 10 5 cells in a 6 cm dish when almost confluent. Cells were harvested on day 30.
  • the sequence specificity of delivery of histone modifying enzyme inhibitors on the genome by PIP was confirmed from the viewpoint of histone acetylation change, which is another histone activation marker.
  • the cells were treated with Im0-N or Im3-N by the method described in Example 5B, and the histone activation region was identified by the ChIP-Seq method using a histone acetylated antibody (H3K27Ac).
  • H3K27Ac histone acetylated antibody
  • PIP is sufficient for sequence-dependent binding to genomic DNA if at least four monomer units are included. It has also been clarified that PIP can deliver other linked molecules to genomic DNA in a sequence-dependent manner.

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Abstract

本発明は、配列特異的で設計可能な標的遺伝子の転写抑制阻害剤およびこれを含む組成物並びにその使用を提供する。より具体的には、本発明は、生体においてＤＮＡのメチル化による遺伝子の発現抑制を阻害することに用いるための組成物であって、ピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含み、ピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートは、前記遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡのマイナーグルーブに配列特異的に結合するように設計されたものである、組成物を提供する。

Description

配列特異的で設計可能な標的遺伝子の転写抑制阻害剤およびこれを含む組成物並びにその使用 関連出願の参照
　本願は、日本国特許出願（特願２０１６－０１６９５１；出願日：２０１６年２月１日）に基づく優先権を主張する出願であり、引用することによりその内容の全てが本願明細書に取り込まれる。
　本発明は、配列特異的で設計可能な標的遺伝子の転写抑制阻害剤およびこれを含む組成物並びにその使用に関する。
　ＤＮＡの異常な高メチル化は、特に遺伝子の発現調節部位であるプロモータ領域において生じると、遺伝子の転写抑制を引き起こす。そして、癌抑制遺伝子のプロモータ領域におけるＤＮＡの異常な高メチル化は、大腸癌など多くの癌において発癌の重要な原因となっている。
　癌の治療戦略として、癌抑制遺伝子の発現を向上させるために、高メチル化された遺伝子領域のメチル化を低下させる手法が採用されている。例えば、５－アザ－２’－デオキシシチジンおよび５－アザシチジンは、ＤＮＡの脱メチル化剤として機能するために投与される抗癌剤としても知られる。しかしながら、これらのＤＮＡの脱メチル化剤は、生体においてはゲノムＤＮＡ全体を非特異的に脱メチル化するため（非特許文献１および２）、それによる副作用は不可避である。
　ピロールイミダゾールポリアミドは、ＤＮＡに配列特異的に結合するように設計可能なＤＮＡ結合分子である（非特許文献３）。ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡの脱メチル化剤やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤との融合薬剤を用いて、配列特異的にエピジェネティックな修飾を改変する手法が様々に報告され始めた（非特許文献４）。また、ピロールイミダゾールポリアミドにより配列特異的にプラスミドＤＮＡのメチル化を阻害する手法が報告されている（非特許文献５）。非特許文献５は、ピロールイミダゾールポリアミドはＤＮＡメチル転移酵素（ＤＮＭＴ）の結合に競合して直接的に阻害すると結論付け、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡメチル転移酵素との競合という概念を提示するものである。非特許文献５で検証されたのは、ピロールイミダゾールポリアミドは、これが結合する数塩基長の結合配列内に存在するＣ残基のメチル化を阻害できることのみであり、ＤＮＭＴとの競合をメカニズムとして提唱していることを考慮すると、この配列の周囲のＣ残基への影響はないと推測される。その一方で、遺伝子抑制はプロモータ領域全域にわたる高メチル化に起因するから、非特許文献５によれば、遺伝子の発現抑制に対する影響は無いかごくわずかでしかあり得ず、ピロールイミダゾールポリアミドは単独では生体内で遺伝子の発現抑制の阻害を引き起こすには明らかに適さない。
Patai AV et al, PLoS One, 20, 10(8):e0133836, 2015 Taylor SM et al, Cell, 17(4):771-779, 1979 White, S et al., Nature, 391, 468, 1998 Pandian GN et al, Sci. Rep., 24(4), 3843, 2014 JeenJoo SK et al., JACS, 136, 3687-3694, 2015
　本発明は、配列特異的で設計可能な標的遺伝子の転写抑制阻害剤およびこれを含む組成物並びにその使用を提供する。
　本発明者らは、ピロールイミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）が細胞内において核内に濃縮されて分布できること、細胞内における標的部位のメチル化を抑制することができること、さらには、標的部位周辺のＤＮＡ領域のメチル化の抑制が可能であることを見出した。発明者らは特に、標的部位周辺のＤＮＡ領域のメチル化の抑制のためにはＰＩＰは４つの単量体単位を有すれば十分であることを見出した。本発明者らはまた、これによりメチル化による遺伝子の転写抑制を阻害することができることを明らかにした。本発明者らはさらに、ＤＮＡの脱メチル化処理と好ましくはヒストンの脱アセチル化阻害処理とをした後に、ピロールイミダゾールポリアミド処理をすることにより、遺伝子の転写抑制を効果的に阻害できることを見出した。本発明者らはさらにまた、ピロールイミダゾールポリアミドにヒストン修飾酵素阻害剤などの化合物をコンジュゲートすることにより、化合物を配列依存的にゲノムＤＮＡにデリバリーできることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいてなされた発明である。
　すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）生体においてＤＮＡのメチル化による遺伝子の発現抑制を阻害することに用いるための組成物であって、ピロールイミダゾールポリアミドを含み、ピロールイミダゾールポリアミドは、前記遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡのマイナーグルーブに配列特異的に結合するように設計されたものである、組成物。
（２）生体においてＤＮＡのメチル化による遺伝子の発現抑制を阻害することに用いるための組成物であって、ピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含み、コンジュゲート中のピロールイミダゾールポリアミドは、前記遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡのマイナーグルーブに配列特異的に結合するように設計されたものである、組成物。
（３）ＤＮＡのメチル化が、ＤＮＡの脱メチル化処理後に細胞内で生じるＤＮＡメチル化である、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４）ＤＮＡのメチル化が、ＤＮＡの脱メチル化処理とヒストンの脱アセチル化阻害処理後に細胞内で生じるＤＮＡメチル化である、上記（３）に記載の組成物。
（５）ＤＮＡの脱メチル化処理が、５－アザ－２’－デオキシシチジン（ＡＺＡ）処理により行われる、上記（４）または（４）に記載の組成物。
（６）ヒストンの脱アセチル化阻害処理が、トリコスタチンＡ処理により行われる、上記（４）または（５）に記載の組成物。
（７）遺伝子が、癌抑制遺伝子である、上記（１）～（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）遺伝子が、ＭＬＨ１遺伝子である、上記（７）に記載の組成物。
（９）癌の対象において癌を処置するための医薬組成物であって、上記（７）または（８）に記載の組成物を含み、これにより癌抑制遺伝子の転写抑制を阻害することができる、医薬組成物。
（１０）癌が大腸癌、胃癌、胃小窩型胃癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌および直腸結腸癌から選択される癌であり、プロモータ領域のＤＮＡがメチル化された癌抑制遺伝子がＭＬＨ１遺伝子である、上記（９）に記載の医薬組成物。
（１１）ＤＮＡの脱メチル化剤とヒストンの脱アセチル化阻害剤と併用するための、上記（９）または（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）ＭＬＨ１遺伝子のメチル化が亢進した対象において、癌の発症を予防することに用いるための、または癌の発症リスクを低減することに用いるための医薬組成物であって、上記（８）に記載の組成物を含む、医薬組成物。
（１３）生体において標的ＤＮＡまたはその近傍におけるＤＮＡメチル化を阻害することに用いるためのＤＮＡメチル化阻害剤であって、ピロールイミダゾールポリアミドを含み、ピロールイミダゾールポリアミドは、標的ＤＮＡに配列特異的に結合するように設計された、ＤＮＡメチル化阻害剤。
図１は、一例としてＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域の－１９～－１３領域に対して配列特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミド（ＰＩＰ１）を設計した図を示す。図中、ＴＳＳは、転写開始部位（転写開始点）を示す。 図２は、設計されたＰＩＰ１の試験管内での結合特性（図２Ａ）および細胞内での分布（図２Ｂ）を示す。 図３は、ＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域を含むＤＮＡ領域を組込んだプラスミド（図３Ａ）、該ＤＮＡ領域上でメチル化レベルを確認した部位の相対的位置（図３Ｂ）、およびＰＩＰ１によるＤＮＡのメチル化レベルの抑制（図３Ｃ）を示す。 図４Ａは、５－アザ－２’－デオキシシチジン（ＡＺＡ）または５－アザ－２’－デオキシシチジンとトリコスタチンＡ（ＡＺＡ＋ＴＳＡ）で処理した細胞におけるＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域のメチル化レベルを示す。図４Ｂは、上記処理によるＭＬＨ１遺伝子の発現量の変化を示す。 図５は、上記処理後、低酸素条件下で培養した細胞の上記領域のメチル化レベルの変化（図５Ａ）とＭＬＨ１遺伝子の発現量の変化（図５Ｂ）を示す。 図６は、ＰＩＰ１がメチル化レベルの上昇を阻害できること（図６ＡおよびＢ）、ＭＬＨ１遺伝子の発現抑制を解除できること（図６ＣおよびＤ）、および、ＰＩＰ１の結合部位から離れたプロモータ領域の部位に対してもメチル化抑制の効果を奏すること（図６Ｅ）を示す。 図７は、４塩基認識型ＰＩＰの模式図を示す。これらはＤＮＡ配列上ではホモダイマーを形成する。 図８は、Ｉｍ０またはＩｍ３によるゲノムワイドのメチル化解析の結果および転写開始領域±１ｋｂの領域のメチル化解析の結果を示す。 図９は、ＤＭＳＯ、阻害剤（ＮＣＤ３８）またはＩｍ３－Ｎで処理した細胞における遺伝子発現の変化を示す。 図１０は、Ｉｍ０－ＮまたはＩｍ３－Ｎ処理後のヒストンのアセチル化をＣｈＩＰシーケンス法により同定した結果を示す。グラフの横軸は、ヒストンアセチル化領域におけるＷＷＷＷ配列の数（Ｉｍ０－Ｎ処理）またはＷＣＧＷ配列の数（Ｉｍ３－Ｎ処理）をカウントした結果を示す。グラフの縦軸は、各カウントが生じる割合を示す。 図１１は、図１０の結果をさらに分析して得られた結果を示す。図１１の円グラフ（左から２つ）は、阻害剤ＮＣＤ３８単独処理によるＷＷＷＷ配列のカウントで３６以上（ｒｉｃｈ）と１２以下（ｐｏｏｒ）とに分類し、それぞれについてＩｍ０－ＮまたはＩｍ３－Ｎで処理するとｒｉｃｈ部分は確かにＩｍ０－Ｎで活性化され、Ｉｍ３－Ｎではあまり活性化されないことを示す。図１１の円グラフ（右から２つ）は、ＷＣＧＷ配列のカウントで５以上（ｒｉｃｈ）と３以下（ｐｏｏｒ）とに分類し、それぞれについてＩｍ０－ＮまたはＩｍ３－Ｎで処理するとｒｉｃｈ部分は確かにＩｍ３－Ｎで活性化され、Ｉｍ３－０ではあまり活性化されないことを示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「生体」とは、動植物の生きた身体、および生体から分離されたか否かを問わず細胞または細胞集団を意味する。動植物は、例えば、動物であり、例えば、脊椎動物であり、例えば、哺乳動物であり、例えば、霊長類であり、例えばヒトである。
　本明細書では、「対象」とは、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。本明細書では、癌に罹患した対象を癌の対象ということがある。本明細書では、対象がヒトである場合、対象は患者ということがある。
　本明細書では、「ＤＮＡのメチル化」とは、ＤＮＡ分子に対するメチル化を意味する。例えば、ＤＮＡのメチル化としては、シトシンのピリミジン環の５位の炭素原子に対するメチル化が知られる。ＤＮＡのメチル化は、ＤＮＡ分子上のＣｐＧジヌクレオチド部位において起こる。ＤＮＡのメチル化は、近傍の遺伝子の発現を低下させることが知られており、ほとんど全ての種類の癌の発達において重要な役割を果たしていることが分かっている。例えば、ＤＮＡの過剰なメチル化が癌抑制遺伝子のプロモータ領域において生じ、癌抑制遺伝子の転写を抑制することにより癌の原因となることが知られている。遺伝子プロモータ領域のメチル化により遺伝子発現が抑制される例としては、例えば、ヒトの大腸癌におけるＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の発現抑制、および脳腫瘍におけるＭＧＭＴ遺伝子の発現抑制が挙げられる。
　本明細書では、「プロモータ」とは、遺伝子の転写調節領域を意味する。プロモータは、転写開始部位を＋１とした場合に、遺伝子の上流側－２００～－１の領域、特に－１００～－１の領域に存在することで知られる。例えば、真核生物では、プロモータにはＴＡＴＡボックスと呼ばれるＴＡＴＡ配列が－２５領域から上流側に存在する。また、－１００～－６０の領域にはＣＡＡＴボックス、－６０～－４０の領域にはＧＣボックスが存在する。これらの配列は、遺伝子の転写調節に関係することでよく知られている。本明細書では、上記のように、プロモータ領域中でのＤＮＡの位置を表すために数字を用い、転写開始点（部位）を＋１とし、上流に１塩基移動する毎に数字を－１し、下流に１塩基移動する毎に＋１する方式で転写開始部位からの相対的位置により特定のＤＮＡの箇所を数字で特定する。
　本明細書では、「遺伝子の発現」とは、ＤＮＡからのＲＮＡへの転写を意味する。ＲＮＡとしてはメッセンジャーＲＮＡ（以下、「ｍＲＮＡ」という）が挙げられ、遺伝子の発現を低下させるとは、ｍＲＮＡへの転写量を低下させるということを意味する。
　本明細書では、「ピロールイミダゾールポリアミド」とは、Ｎ－メチルピロール単位（以下、「Ｐｙ」と略す）とＮ－メチルイミダゾール単位（以下、「Ｉｍ」と略す）とが連結してなる直鎖状の分子であり、分子内のＰｙ単位および／またはＩｍ単位との間にリンカー（例えば、γアミノ酪酸）が介在し、これにより分子がヘアピン構造を取る、高分子を言う。本明細書では、特に言及の無い限り、ピロールイミダゾールポリアミドは、ヒストン脱アセチル化阻害剤などのヒストンタンパク質の修飾やＤＮＡメチル化阻害剤などのＤＮＡ修飾に対する薬剤（促進剤および阻害剤）と融合した形態ではない。
　ピロールイミダゾールポリアミドは、ＤＮＡのマイナーグルーブに入り込むことができ、そこで、Ｇ－Ｃ塩基対に対してＩｍ／Ｐｙが結合し、Ｃ－Ｇ塩基対に対しては、Ｐｙ／Ｉｍが結合し、Ａ－Ｔ塩基対またはＴ－Ａ塩基対に対してはＰｙ／Ｐｙが結合することが知られており、特にＧとＰｙとの相互作用が強く、これによりピロールイミダゾールポリアミドは、ＤＮＡのマイナーグルーブに配列特異的に結合する。Ｉｍ単位は、例えば、β－アラニン単位に変更することが可能である。β－アラニン単位は、Ｐｙ単位またはＩｍ単位の３～４単位につき１単位含ませることができる。
　従って、上記の関係性が技術的に確立していることから、標的ＤＮＡに対して配列特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミドは、標的ＤＮＡの配列を元に当業者であれば容易に設計することができる。
　なお、Ｐｙ／Ｉｍと表記する場合には、ＰｙとＩｍは分子中でのＰｙ単位およびＩｍ単位の並び順においては離れた位置に存在するにも関わらず、分子が折れ曲がることによりヘアピン構造を取る場合には近接して位置することを意味する。
　ピロールイミダゾールポリアミドは、一般式（Ａ）により表される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 ｛式中、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ独立して自然数であり、Ｒ1およびＲ2は、それぞれ独立して保護基である。｝
　上記一般式（Ａ）を慣例に従って簡略化して記載すれば、Ｒ２－［（Ｐｙ）ｚ－βｙ－（Ｉｍ）ｘ］－（ＣＨ２）ｐ－（Ｉｍ）ｍ－βｎ－（Ｐｙ）ｏ］－Ｒ１｛式中、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｘ、ｙ、およびｚは、それぞれ独立して自然数であり、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して保護基である。｝
となる。
　上記一般式（Ａ）においては、各単位は図中では便宜的に同種の単位をひとまとまりに記載しているが、実際には、Ｐｙ単位とＩｍ単位とβ－アラニン単位は、上述のルールに従って結合対象となるＤＮＡの配列に対応する並び順で並べ替えられる。一般式（Ａ）ににおいて、Ｒ１基は、例えば、－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２とすることができる。Ｒ２基は、例えば、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ３とすることができる。一般式（Ａ）において、ｐは、２～４の自然数、例えば３とすることができ、ｍ＋ｎ＋ｏおよびｘ＋ｙ＋ｚは、結合対象となるＤＮＡの長さに対応させて５～２０、７～１５、または７～１０とすることができる。
　式（Ｉ）の化合物は、ピロールイミダゾールポリアミドの例であるが、Ｐｙ単位とＩｍ単位とが－ＣＯ－ＮＨ－により連結してなる分子であり、分子内のＰｙ単位とＩｍ単位との間にリンカーとしてγ－アミノ酪酸が介在し、リンカー部分で分子が折れ曲がって分子全体がヘアピン構造を取っている。ピロールイミダゾールポリアミドは、ＤＮＡのマイナーグルーブではヘアピン構造を取り、ＤＮＡの塩基とＰｙ単位またはＩｍ単位とで相互作用して結合を安定化させる。この式（Ｉ）の化合物は、ＭＬＨ１遺伝子の転写開始部位から－１９～－１３の７塩基長の領域に配列特異的に結合できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　なお、上記式（Ｉ）の化合物は、下記に示されるようにＰｙ単位とＩｍ単位の配列順序がＤＮＡとの配列特異的結合において技術的意義を有するので、慣例に従い、以下のように略して表記されることがある。以下の表記では直線上に配列が記載されているが、ＤＮＡとの結合は「γ」部分でヘアピン構造を形成して行われる。本明細書では、この配列を一次構造ということがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ｛式中、Ａｃはアセチル基を表し、βはβ－アラニンを表し、γはγ－アミノ酪酸を表し、Ｄｐはジアミノプロパンを表す。｝
　本明細書では、「配列特異的」とは、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡとが配列依存的に結合することから、標的配列に対して設計通りに結合する、または標的配列に対して他の配列よりもより強く結合するという意味で用いられる。ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡとの相互作用の配列特異性を高めるためには、標的ＤＮＡ配列を長くすることが好ましく、例えば、４塩基以上、５塩基対以上、６塩基対以上、７塩基対以上、８塩基対以上、９塩基対以上、１０塩基対以上、またはそれ以上とすることができる。
　本明細書では、「脱メチル化処理」とは、シトシンのピリミジン環の５位の炭素原子に対するメチル化を外す処理を意味する。
　本明細書では、「脱アセチル化阻害処理」とは、ヒストンに対する脱アセチル化を阻害する処理を意味する。例えば、脱アセチル化処理は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を阻害することにより行われる。
　本明細書では、「処置」とは、治療および予防の両方を含む意味で用いられる。
　本発明者らは、プロモータ領域上のわずか４塩基対（例えば、７塩基対）を標的配列としたピロールイミダゾールポリアミドにより、該プロモータ上のＤＮＡのメチル化が、標的部位周辺において広く抑制されること、並びにこれにより該プロモータにより駆動される遺伝子の転写抑制が解除されることを見出した。このためには、特別なＤＮＡメチル化阻害剤は必要ない。これは、生体内においてピロールイミダゾールポリアミドがプロモータ領域に結合することにより、ＤＮＡのコンフォメーションが広く変化し、ＤＮＡのメチル化反応や転写反応に広く影響を与えると考えられる。
　従って、本発明では、生体においてＤＮＡのメチル化による遺伝子の発現抑制を阻害することに用いるための組成物（または、遺伝子の転写抑制阻害剤）であって、ピロールイミダゾールポリアミドを含み、ピロールイミダゾールポリアミドは、前記遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡのマイナーグルーブに配列特異的に結合するように設計されたものである、組成物が提供される。ある態様では、前記組成物は、ピロールイミダゾールポリアミド以外のＤＮＡのメチル化阻害剤を含まない。
　ピロールイミダゾールポリアミドとしては、Ｎ－メチルピロール単位（以下、Ｐｙという）とＮ－メチルイミダゾール単位（以下、Ｉｍという）とがアミド結合を介して連結し、かつ、Ｐｙ単位および／またはＩｍ単位との間に１つのリンカー１および１つ以上のリンカー２を含み、ＤＮＡのマイナーグルーブ内でリンカー１の部位において折りたたまれたヘアピン構造をとり、ＤＮＡのＧ－Ｃ塩基対に対してＩｍ／Ｐｙが結合し、Ｃ－Ｇ塩基対に対してＰｙ／Ｉｍが結合し、Ａ－Ｔ塩基対またはＴ－Ａ塩基対に対してはＰｙ／Ｐｙが結合し、Ｐｙはβ－アラニンで置き換えられてもよく、リンカー１は、γ－アミノ酪酸である、ピロールイミダゾールポリアミドを用いることができる。前記のβ－アラニンによるＰｙの置き換えは、構成単位３～４つに１つの割合で行うことができる。結合させたい標的ＤＮＡ配列が分かれば、配列特異的に該標的ＤＮＡに結合するピロールイミダゾールポリアミドを設計できることは、上述の通りである。ピロールイミダゾールポリアミドの化学構造から明らかであるように、この分子は、当業者に周知のＢｏｃ法またはＦｍｏｃ法により固相合成することが可能であり、市販の自動合成機等を用いて合成できることが知られている。
　本発明者らは、メチル化が促進される環境化でピロールイミダゾールポリアミドにより好適にＤＮＡのメチル化が阻害されることを見出した。本発明者らはまた、ＤＮＡの脱メチル化処理後、およびＤＮＡの脱メチル化処理とヒストンの脱メチル化処理後に、例えば、低酸素条件下で培養すると、細胞は自前のＤＮＡメチル転移酵素の働きによりＤＮＡのメチル化を亢進させるが（例えば、Lu, Y. et al., Cell Reports, 8:501-513, 2014参照）、この際にピロールイミダゾールポリアミドにより好適にＤＮＡのメチル化が阻害されることを見出した。従って、本発明の組成物は、ＤＮＡの脱メチル化処理後またはＤＮＡの脱メチル化処理とヒストンの脱メチル化処理後に用いるためのものであり得る。本発明の組成物はまた、例えば、低酸素条件下で誘導されるＤＮＡメチル化を阻害することに用いることができ、例えば、ＤＮＡの脱メチル化処理後またはＤＮＡの脱メチル化処理とヒストンの脱メチル化処理後に低酸素条件下で誘導されるＤＮＡメチル化を阻害することに用いることができる。低酸素以外にも生体内でＤＮＡメチル化が促進される環境として、ピロリ菌感染などが原因で起きる慢性炎症が知られる（例えば、Matsusaka, K. et al., World J. Gastroenterol., 20 (14): 3916-3926, 2014参照）。またＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス感染など一部の病原体の感染はＤＮＡメチル化を促進する（例えば、上記Matsusaka, K. et al., 2014参照）。そしてＤＮＡメチル基転移酵素（ＤＮＭＴ）の発現上昇や、ＩＤＨ遺伝子変異、ＴＥＴ２酵素の活性低下など、生体細胞自身の異常によってもＤＮＡメチル化は促進しうる（例えば、Figueroa, ME. et al., Cancer Cell, 18: 553-567, 2010およびTurcan S., Nature, 483:479-483参照）。
　また、特にＤＮＡの脱メチル化処理とヒストンの脱メチル化処理後には、その後のプロモータ領域のＤＮＡのメチル化による遺伝子の転写抑制を少なくとも部分的に解除し、転写を維持できることも見出した。従って、本発明の組成物は、ＤＮＡの脱メチル化処理とヒストンの脱アセチル化阻害処理後に用いるためのものであり得る。
　ＤＮＡのメチル化処理は、例えば、ＤＮＡのメチル化阻害剤を用いて行うことができる。ＤＮＡのメチル化阻害剤としては、ＤＮＡメチル化転移酵素阻害剤が挙げられる。本発明では、ＤＮＡのメチル化阻害剤として、ＤＮＡのメチル化を阻害できる限り特に限定されないが、例えば、５－アザ－２’－デオキシシチジンおよび５－アザシチジンなどの抗癌剤が挙げられ、本発明で用いることができる。
　ヒストンの脱アセチル化阻害処理は、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤を用いて行うことができる。ＨＤＡＣ阻害剤としては、特に限定されないが例えば、トリコスタチンＡ、ｎ－酪酸、アピシジンボリノスタット（ＳＡＨＡ）、およびバルプロ酸が挙げられ、本発明で用いることができる。
　本発明において、ＤＮＡのメチル化による発現抑制を阻害する遺伝子（標的遺伝子）は、例えば、プロモータ領域のＤＮＡがメチル化された遺伝子である。プロモータ領域のＤＮＡがメチル化された遺伝子としては、例えば、プロモータ領域のＤＮＡがメチル化された癌抑制遺伝子が挙げられ、このような遺伝子は当業者に周知である。プロモータ領域のＤＮＡがメチル化された遺伝子または癌抑制遺伝子としては、例えば、ＭＬＨ遺伝子、ＢＲＣＡ１遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子、ＭＧＭＴ遺伝子、ＣＤＨ１遺伝子、ＲＵＮＸ３遺伝子、ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子、およびＳＦＲＰ１遺伝子が挙げられる。
　ピロールイミダゾールポリアミドは、これらの標的遺伝子のプロモータ領域（例えば、±１ｋｂの領域、－２００～－１の領域、好ましくは－１００～－１の領域）の一部のＤＮＡに配列特異的に結合するように設計することができる。例えば、ＭＬＨ１遺伝子の－２００～－１の領域、好ましくは－１００～－１の領域、より好ましくは、－５０～－１の領域の一部（上述のように５塩基以上の長さの領域）に対して配列特異的に結合するように設計することができる。
　ＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域のメチル化を阻害するピロールイミダゾールポリアミドとしては、ＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域に配列特異的に結合できるピロールイミダゾールポリアミド、例えば、式（Ｉ）で表される化合物を用いることができる。ＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域のメチル化を阻害するピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートには、上記ピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを用いることができる。
　本発明のある側面では、ピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートが提供される。コンジュゲート中のピロールイミダゾールポリアミドは、前述の通り、標的ＤＮＡ配列の長さは、例えば、４塩基以上、５塩基対以上、６塩基対以上、７塩基対以上、８塩基対以上、９塩基対以上、１０塩基対以上、またはそれ以上とすることができる。コンジュゲート中のピロールイミダゾールポリアミドの標的ＤＮＡ配列の長さは、７塩基対以下、６塩基対以下、５塩基対以下、または４塩基対とすることができる。本発明のある態様では、ヒストン修飾酵素阻害剤は、ヒストンメチル化酵素に対する阻害剤、ヒストンアセチル転移酵素活性化剤（ＨＡＴ活性化剤）またはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）であり得る。本発明のある特定の態様では、ヒストン修飾酵素阻害剤は、リジン特異的脱メチル化酵素であるＬＳＤ１に対する阻害剤である。ＬＳＤ１に対する阻害剤としては、ＮＣＤ３８、ＧＳＫ－ＬＳＤ１が挙げられ、本発明で用いることができる。本発明のある特定の態様では、ＨＤＡＣ阻害剤としては、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸、アピシジン、バルプロ酸、ＬＢＨ５８９およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）が挙げられる。本発明のある特定の態様では、ＨＡＴ活性化剤は、Ｎ－（４－クロロ－３－トリフルオロメチルフェニル）－２－エトキシ－６－ペンタデシルベンズアミド（ＣＴＢＰ）またはその誘導体、例えば、Ｎ－（４－クロロ－３－トリフルオロメチルフェニル）－２－エトキシ－ベンズアミド（ＣＴＢ）が挙げられる。
　本発明のある側面では、ピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含む、ＤＮＡのメチル化を低下させるための組成物が提供される。本発明のある側面では、標的遺伝子のプロモータ領域（例えば、±１ｋｂの領域、－２００～－１の領域、好ましくは－１００～－１の領域）の一部のＤＮＡに配列特異的に結合するように設計されたピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含む、前記標的遺伝子の発現レベルを向上させることに用いるための組成物が提供される。
　本発明の別の側面では、癌の対象において癌を処置するための医薬組成物が提供される。プロモータ領域のＤＮＡがメチル化された癌抑制遺伝子は、その転写が抑制されているため、癌抑制遺伝子の遺伝子産物の産生量が低下しており、癌の原因となる。従って、本発明の癌患者において癌を処置するための医薬組成物は、プロモータ領域のＤＮＡがメチル化された癌抑制遺伝子のプロモータ領域に配列特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含む。本発明の医薬組成物は、該癌抑制遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡのメチル化を阻害し、これにより癌抑制遺伝子の転写抑制を抑制することができ、癌を処置することが可能となる。
　癌抑制遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡがメチル化されていることがほぼ全ての癌において知られ、その原因となる。また、例えば、ＭＬＨ１遺伝子においては、大腸癌（結腸直腸癌）、胃癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、膵癌、肝癌、胆管癌、血液腫瘍、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、脳腫瘍、および軟部肉腫では、癌抑制遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡがメチル化されていることが原因の一つとなっている。従って、本発明の医薬組成物は、大腸癌（結腸直腸癌）、胃癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、膵癌、肝癌、胆管癌、血液腫瘍、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、脳腫瘍、および軟部肉腫を処置することに用いることができる。また、これらの癌ではＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡがメチル化されていることが原因として知られる。従って、本発明の医薬組成物においてピロールイミダゾールポリアミドの標的遺伝子は、ＭＬＨ１遺伝子であり得る。
　癌患者においては、上記癌抑制遺伝子のプロモータ領域では、ＤＮＡメチル化が亢進しており、癌の発症または進行と共にＤＮＡメチル化の程度が高まることが知られている。そして、本発明者らによれば、ピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートは、ＤＮＡの脱メチル化処理後、またはＤＮＡの脱メチル化処理とヒストンの脱アセチル化阻害処理後に、特にＤＮＡのメチル化の進行を抑制できた。従って、本発明の医薬組成物は、ＤＮＡの脱メチル化剤またはＤＮＡの脱メチル化剤とヒストン脱アセチル化阻害剤の組合せ（以下、「併用剤」ということがある）と併用することができる。あるいは、本発明の医薬組成物は、ＤＮＡの脱メチル化剤またはＤＮＡの脱メチル化剤とヒストン脱アセチル化阻害剤の組合せによる治療を受けた対象を投与対象とし得る。
　本発明の医薬組成物と併用するＤＮＡの脱メチル化剤としては、特に限定されないが例えば、アザシチジンおよびデシタビンなどの抗癌剤を用いることができる。本発明の医薬組成物と併用するヒストン脱アセチル化阻害剤としては、トリコスタチンＡ、ｎ－酪酸、アピシジンおよびバルプロ酸などを用いることができる。
　本発明の医薬組成物と、ＤＮＡの脱メチル化剤またはＤＮＡの脱メチル化剤とヒストン脱アセチル化阻害剤の組合せとの投与の順番は、特に限定されないが例えば、ＤＮＡの脱メチル化剤またはＤＮＡの脱メチル化剤とヒストン脱アセチル化阻害剤の組合せを投与した後に、本発明の医薬組成物を投与することができる。
　また、本発明の医薬組成物は、ＤＮＡの脱メチル化剤またはＤＮＡの脱メチル化剤とヒストン脱アセチル化阻害剤による抗癌剤治療を受けている患者に対して投与することができる。本発明の医薬組成物は、ＤＮＡのメチル化を抑制することができるので、このようにすることで、ＤＮＡの脱メチル化剤またはＤＮＡの脱メチル化剤とヒストン脱アセチル化阻害剤の投与量や投与間隔を低減させることが可能であり、これら薬剤により引き起こされることで知られる生体毒性を緩和することができる。従って、例えば、本発明の医薬組成物は、癌患者に対して、併用剤を投与し、その後、本発明の医薬組成物を投与するサイクルを複数回行う投与計画により投与することができる。
　本発明によれば、ＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡに配列特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを用いると、ＭＬＨ１遺伝子の転写抑制を解除する、またはＭＬＨ１遺伝子の遺伝子発現を少なくとも部分的に維持することができる。従って、本発明では、ＭＬＨ１遺伝子のメチル化が亢進した対象において、癌の発症を予防することに用いるための、または癌の発症リスクを低減することに用いるための医薬組成物であって、ＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡに配列特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含む、医薬組成物が提供される。この医薬組成物も、上記併用剤と併用することができる。
　ＭＬＨ１遺伝子のメチル化が亢進した対象としては、大腸鋸歯状腺腫が挙げられる。大腸鋸歯状腺腫の対象は、放置しておくとＭＬＨ１遺伝子のメチル化が亢進することにより、ＭＬＨ１遺伝子の転写抑制が生じ、これにより大腸癌を発症する。従って、このような対象に本発明の医薬組成物を投与することにより、大腸癌の発症を予防する、または大腸癌の発症リスクを低減することができる。
　本発明によれば、生体においてＤＮＡのメチル化による遺伝子の発現抑制を阻害する方法であって、
　生体にピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを接触させる、または生体にピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを投与することを含み、
　前記ピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートは、前記遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡのマイナーグルーブに配列特異的に結合するように設計されたものである、方法が提供される。この方法は、生体にＤＮＡ脱メチル化剤を接触させる、または生体にＤＮＡ脱メチル化剤を投与することをさらに含んでいてもよいし、あるいは、生体にＤＮＡ脱メチル化剤を接触させる、または生体にＤＮＡ脱メチル化剤を投与することと、生体にＨＤＡＣ阻害剤を接触させる、または生体にＨＤＡＣ阻害剤を投与することとをさらに含んでいてもよい。
　本発明の方法によれば、癌の対象において癌を処置する方法であって、
　本発明の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法
が提供される。
　本発明によれば、ＭＬＨ１遺伝子のメチル化が亢進した対象において、癌の発症を予防する方法、または癌の発症リスクを低減する方法であって、本発明の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法
が提供される。
　本発明によれば、本発明の医薬組成物を製造するための、癌抑制遺伝子のプロモータ領域に結合するように設計されたピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートの使用が提供される。
　本発明の組成物または医薬組成物は、標的遺伝子のプロモータ領域の１部位に配列特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含んでいてもよく、異なる複数部位にそれぞれ配列特異的に結合する複数の異なるピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含んでいてもよい。本発明の組成物または医薬組成物は、ピロールイミダゾールポリアミドとしてＤＮＡメチル化阻害剤またはＨＤＡＣ阻害剤などのヒストン修飾酵素阻害剤とリンカーを介して連結したコンジュゲートを含んでいてもよい。
　本発明の医薬組成物は、賦形剤を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、例えば、局所投与（例えば、腫瘍内投与）、静脈投与、および経皮投与により投与することができる。賦形剤は、当業者であれば適宜選択することができ、本発明の医薬組成物は、適宜製剤化することができる。
　以下、実施例に基づいて発明を説明するが、本発明は以下の具体的内容により限定されるものではない。本発明は特許請求の範囲により特定される発明である。
実施例１：ＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域に対するピロールイミダゾールポリアミドの設計と調製
　ＭＬＨ１遺伝子は、遺伝子プロモータ領域のＣｐＧアイランドがメチル化を受け、これによりＭＬＨ１遺伝子の転写が不活性化することが知られる癌抑制遺伝子である。本実施例では、ＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域に対するピロールイミダゾールポリアミドを設計して調製した。
　ピロールイミダゾールポリアミドは、Ｎ－メチルピロール単位（Ｐｙと表記する）とＮ－メチルイミダゾール単位（Ｉｍと表記する）が重合した高分子化合物であり、通常はγ－アミノ酪酸単位（γと表記する）の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションを取ってＤＮＡのマイナーグルーブに結合する。ＩｍがＧ塩基と強く結合し、ＰｙがＣ塩基、Ａ塩基およびＴ塩基と結合することから、ＰｙとＩｍとをＤＮＡ配列に対応するように適切に並べると、標的ＤＮＡの配列に特異的に結合するピロールイミダゾールポリアミドを設計することができる。Ｐｙはβアラニンと置換可能であり、βアラニンを適宜（例えば、３、４塩基対毎に）導入することでＤＮＡのピッチとピロールイミダゾールポリアミドのピッチとを合わせることができる。
　今回は、ＭＬＨ１遺伝子の－１９～－１３の７塩基に対して特異的なピロールイミダゾールポリアミドを合成した（図１および式（Ｉ）の化合物参照）（以下、このピロールイミダゾールポリアミドをＰＩＰ１という）。ここで上記数字は転写開始部位を＋１として上流に１塩基移動すると－１される方式により示される遺伝子上の位置を示す（以下同様）。
　ピロールイミダゾールポリアミドは、Ｂｏｃ法やＦｍｏｃ法などの固相合成法により容易に合成することが可能であり、市販の自動合成機等を用いても合成することができる。本実施例では、ＰＩＰ１は、設計したピロールイミダゾールポリアミドを提示してHipep Laboratories (Kyoto, Japan)に合成させて得た。陰性対照として、ＭＬＨ１遺伝子上には結合部位を有しないＰＩＰ２（図１および式（ＩＩ）の化合物参照）を用いた。ピロールイミダゾールポリアミドは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で２０ｍＭの濃度で保管した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ｛式中の記号は上で定義した通り。｝
　ゲルシフトアッセイにより、ＰＩＰ１が標的配列に結合することを確認した。ＭＬＨ１遺伝子の－２２～－８領域を含む１５塩基対のＦＡＭ標識二本鎖オリゴＤＮＡ（配列番号２および３をアニーリングして得た二本鎖オリゴＤＮＡ）を作製し（図２Ａ下部）、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１０％ＤＭＳＯを含む１０μＬの反応溶液に溶かしたＰＩＰ１またはＰＩＰ２と１μＭの二本鎖オリゴＤＮＡを表示した最終濃度となるように混合して３７℃で１時間インキュベートした。得られた反応物を２０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル上の二本鎖ＤＮＡをLAS-3000 (Fujifilm, Japan)を用いて可視化した。
　結果は、図２Ａに示される通りであった。ＰＩＰ１を添加した場合にのみ二本鎖ＤＮＡのバンドが上方にシフトし、これにより、ＰＩＰ１が標的の二本鎖ＤＮＡに結合したことが確認できた。
実施例２：ＰＩＰ１の細胞内局在
　本実施例では、ＰＩＰ１の細胞内局在を確認した。本実施例では、大腸癌細胞株ＲＫＯ内での細胞内局在を確認した。
　１．０×１０5細胞のＲＫＯ細胞を３５ｍｍディッシュに播種し、２ｍＬの培地（10% ウシ胎児血清, 100 単位/mL ペニシリン, および 100 μg/mL ストレプトマイシンを付加したEagle's MEM培地）中で培養した。２４時間後、細胞をＦＡＭ標識した１μＭのＰＩＰ１（ＦＡＭ－β－Ｐｙ－Ｉｍ－β－Ｉｍ－Ｉｍ－Ｐｙ－γ－Ｉｍ－Ｐｙ－β－Ｉｍ－Ｐｙ－Ｐｙ－β－Ｄｐ）と混合して２４時間インキュベートし、１０％ホルムアルデヒド中で氷上で２時間固定した。固定された細胞をＰＢＳで洗浄し、１μｇ／ｍＬの４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で核染色して、その後、蛍光顕微鏡BZ-X710 (KEYENCE, Osaka, Japan)を用いて観察した。
　結果は、図２Ｂに示される通りであった。図２Ｂに示されるように、ＰＩＰ１の局在が核と完全に一致した。このことからＰＩＰ１は、培地中から細胞膜を透過して細胞内に侵入する上に、核内に濃縮されて分布することが明らかとなった。
実施例３：ＰＩＰ１とＤＮＡのメチル化
　本実施例では、ＭＬＨ１遺伝子のメチル化に対するＰＩＰ１の影響を調べた。
　ＲＫＯ細胞のゲノムＤＮＡからＭＬＨ１の－７８０～＋４８３領域（配列番号１）をＰＣＲ法により配列番号６および７のプライマーを用いて増幅してＤＮＡ断片を得て、pGEM-T Easy vector (Promega, Fitchburg, USA)に製造者マニュアルに従って組込んだ（図３Ａ参照）。得られたプラスミド１μｇを各種濃度のＰＩＰ１かあるいは４０μＭのＰＩＰ２と１×ＮＥＢ緩衝液２(New England Biolabs, Ipswich, USA)中で２５℃で１２時間インキュベートしてピロールイミダゾールポリアミドをＤＮＡに結合させた。陰性対照としてＤＭＳＯをプラスミドに添加してインキュベートした。
　Ｓ－アデノシルメチオニン(New England Biolabs)３２０μｇとＣｐＧメチル転移酵素Ｍ．ＳｓｓＩ(New England Biolabs)４ユニットをサンプルに添加して５％ＤＭＳＯを添加して２０μＬとした。３７℃で２時間インキュベートした後に、６５℃で２０分インキュベートして反応を停止させた。ＤＮＡをエタノール沈殿により精製して１００μＬの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解した。その後、パイロシーケンス法によりＭＬＨ１遺伝子の様々な箇所におけるＤＮＡのメチル化の程度を調べた。用いたプライマーは以下の表の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 ※表中「Ｂ」はビオチン化修飾を示す。
　結果は、図３Ｃに示される通りであった。図３Ｃに示されるように、ＰＩＰ１は、ＭＬＨ１遺伝子の－２７～－１の領域において濃度依存的にＤＮＡのメチル化を阻害した。
実施例４：ＲＫＯ細胞内のＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域のメチル化に対するＰＩＰ１の影響
　本実施例では、細胞を用いてＰＩＰ１のメチル化抑制効果を調べた。
　ＲＫＯ細胞を６ｃｍディッシュに１．０×１０５細胞播種して、翌日から７日間にわたり５．０μＭの５－アザ－２’－デオキシシチジン（ＡＺＡ）を含む培地で処理した。培地は２４時間毎に新鮮な培地に交換した。７日目に１０ｎＭのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を含む培地で処理し、８日目に細胞を回収した。
　実施例３と同様にパイロシーケンス法によりＭＬＨ１遺伝子のプロモータ領域－２７～－１のメチル化の程度を確認した。結果は図４Ａに示される通りであった。図４に示されるように、ＡＺＡのみで処理した場合も、ＡＺＡに加えてＴＳＡで処理した場合もメチル化の程度はこの領域で低下した。次に、ＭＬＨ１遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＴ－ＰＣＲ（プライマー配列は、配列番号２および３）により確認するとＡＺＡ処理とＡＺＡおよびＴＳＡ処理の場合に発現が回復した（図４Ｂ参照）。対照としてはＧＡＰＤＨの発現をＲＴ-ＰＣＲ（プライマー配列は、配列番号４および５）により確認した。
　８日目の細胞を１％Ｏ２および５％ＣＯ２の低酸素条件下で培養した。５μＭのＰＩＰ１またはＰＩＰ２を含む０．１％ＤＭＳＯで細胞を処理して、０日目（Ｒ０）、２０日目（Ｒ２０）および３０日目（Ｒ３０）に細胞を回収してＭＬＨ１遺伝子の－２７～－１領域のメチル化の程度をパイロシーケンス法により調べた。ＰＩＰによる処理中は、ＰＩＰ１またはＰＩＰ２を含む培地は、５日おきに交換し、細胞はコンフルエントになったときに継代した。
　結果は、図５および６に示される通りであった。図５に示されるように、ＰＩＰ処理をしない場合には、メチル化レベルは時間と共に回復すること、およびＭＬＨ１遺伝子の発現も時間と共に低下することが分かる。また、図６ＡおよびＢに示されるように、ＰＩＰ未処理群では、Ｒ２０およびＲ３０において全体的にＤＮＡのメチル化の程度が向上したが、これに対してＰＩＰ１処理した細胞では、メチル化の程度の上昇は抑制された。また、図６ＣおよびＤに示されるように、ＡＺＡ＋ＴＳＡ処理した細胞では、ＰＩＰ１処理により、メチル化と共に低下するＭＬＨ１遺伝子のｍＲＮＡの発現が維持された。さらに、ＭＬＨ１遺伝子の－７０～＋１７１の領域におけるメチル化の程度を確認したところ、図６Ｅに示されるように、ＰＩＰ１の標的部位からかなり離れた部位である－７０領域、－６３領域、＋１５６領域、および＋１７１領域においてＰＩＰ１によるメチル化の抑制が確認された。
　このように、ＰＩＰ１は、細胞内において核内に濃縮されて分布できること、細胞内における標的部位のメチル化を抑制することができること、さらには、意外にも標的部位周辺のＤＮＡ領域のメチル化の抑制が可能であることが明らかとなった。また、これによりメチル化による遺伝子の転写抑制を解除することができることが明らかになった。癌抑制遺伝子の転写抑制を解除することにより癌の処置にＰＩＰを用いることができると考えられる。
　また、ＡＺＡやＴＳＡは、生体への毒性が高く、治療におけるこれらの薬剤への依存度は高めることができない。本発明によれば、ＡＺＡおよび／またはＴＳＡ処理後にＰＩＰを投与することにより、ＡＺＡやＴＳＡ処理の効果を持続させることが可能であり、生体への負担が低減された処置法が提供されると考えられる。
実施例５Ｂ：４塩基認識型ＰＩＰによるメチル化阻害
　本実施例では、４塩基認識型ＰＩＰによるメチル化阻害効果を確認した。
　図７に示されるように、Ｗ（すなわち、ＡまたはＴ）認識、Ｃ認識、またはＧ認識のモチーフを組み合わせてＰＩＰを合成した。具体的には、Ｉｍ０として、Ｍｅ－Ｐｙ－Ｐｙ－Ｐｙ－Ｐｙ－β－Ｄｐを合成し、Ｉｍ３として、Ｍｅ－Ｐｙ－Ｐｙ－Ｉｍ－Ｐｙ－β－Ｄｐを合成した(J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6141参照)｛ここで、βはβアラニンを表し、Ｍｅはメチル基を表し、Ｄｐはジメチルアミノプロピルアミドを意味する｝。Ｉｍ０は、ＤＮＡ配列上でホモダイマーを形成し、Ａ／Ｔ配列（すなわち、５’－ＷＷＷＷ－３’）を認識し、ＣｐＧ部位を認識せず、Ｉｍ３は、ＤＮＡ配列上でホモダイマーを形成し、ＣｐＧ部位（すなわち、５’－ＷＣＧＷ－３’）を認識する。
　大腸がん細胞株ＲＫＯ細胞を６ｃｍディッシュに１×１０５細胞の密度で播種し、２４時間インキュベートした。次いで、培養液を０．５μＭ　５－アザ－２’－デオキシシチジン（ＡＺＡ）を含む培養液に入れ替え、培養細胞をＡＺＡに２４時間にわたって暴露した。細胞は、１０日目に回収されるか、または後述するように低酸素条件下で培養された。
　低酸素条件で細胞を培養するために、Ｏ２センサーとＭＣＯ－１８Ｍ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（Sanyo, Osaka, Japan）を備えたインキュベータ中で、９４％Ｎ２、５％ＣＯ２および１％Ｏ２を含む加湿された空気の連続通気条件下で細胞を８日間培養した。ＣＯ２濃度は、内部のＣＯ２濃度制御機構により維持した。次いで、ＡＺＡで処理した細胞を１０μＭのＩｍ０またはＩｍ３を含む０．１％ＤＭＳＯで７５日間処理した。この間、ＰＩＰを含む培地は、５日毎に交換した。細胞は、ほぼコンフルエントになったときに６ｃｍディッシュに２×１０５細胞の密度で継代した。細胞は、０日目（Ｈ０、低酸素処理前）および７５日目（Ｈ７５）で回収した。
　ゲノムワイドのＤＮＡメチル化解析は以下の通り行った。まず、Zymo EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA)を用いて、各試料から得られた５００ｎｇのゲノムＤＮＡをバイサルファイト処理した。全ゲノム増幅、標識化、ハイブリダイゼーションおよびスキャンは製造者マニュアルに従って行った。
　メチル化解析は、ゲノム全体または各遺伝子の転写開始領域（ＴＳＳ）の±１ｋｂの領域において、Infinium Human Methylation450 BeadChip (Illumina)を用いて行った。具体的には、メチル化配列に対するプローブおよび非メチル化配列に対するプローブの合計に対するメチル化配列に対するプローブの比（本明細書では「β値」という）を求めた。β値は、全てのＣｐＧ部位においてメチル化が見出されない場合に０．００であり、全てのＣｐＧ部位がメチル化されている場合に１．００となる。
　まず、ネガティブコントロールであるＲＫＯ細胞においてβ値＞０．８である遺伝子を選択した。選択された遺伝子から、Ｈ０においてβ値＜０．５であり、かつ、Ｈ７５において０．１％ＤＭＳＯで処理した場合にβ値＞０．８である遺伝子をさらに選択した。
Ｉｍ０により選択的にメチル化レベルが低下する遺伝子
　その上で、Ｉｍ０で処理したＨ７５の細胞においてβ値＜０．６５であり、かつ、Ｉｍ３で処理したＨ７５の細胞においてβ値＞０．８である遺伝子を、Ｉｍ０により選択的にメチル化が低下する遺伝子として選択した。全ゲノムで６０９９プローブがこれに該当し、ＴＳＳ±１ｋｂ領域では１１１０遺伝子（２１３５プローブ）がこれに該当した。
Ｉｍ３により選択的にメチル化レベルが低下する遺伝子
　また、Ｉｍ３で処理したＨ７５の細胞においてβ値＜０．６５であり、かつ、Ｉｍ－０Ｎで処理したＨ７５の細胞においてβ値＞０．８である遺伝子を、Ｉｍ３により選択的にメチル化が低下する遺伝子として選択した。全ゲノムで１１７１プローブがこれに該当し、ＴＳＳ±１ｋｂ領域では２５４遺伝子（４５０プローブ）がこれに該当した。
Ｉｍ０およびＩｍ３により共通してメチル化レベルが低下する遺伝子
　Ｉｍ０で処理したＨ７５の細胞においてβ値＜０．６５であり、かつ、Ｉｍ３で処理したＨ７５の細胞においてβ値＜０．６５である遺伝子を、Ｉｍ０およびＩｍ３により共通してメチル化レベルが低下する遺伝子として選択した。全ゲノムで１９プローブがこれに該当し、ＴＳＳ±１ｋｂ領域では９遺伝子（１９プローブ）がこれに該当した。
　結果は、図８に示される通りであった。
　図８に示されるように、ＡＺＡ処理によりＤＮＡはゲノムワイドで脱メチル化される。これに対して低酸素条件で培養すると、ゲノムワイドでメチル化が誘導される。これに対してＩｍ０処理した細胞のゲノムでは、一部の遺伝子のメチル化レベルが大幅に低下した。また、Ｉｍ３で処理した細胞のゲノムでは、全体的に遺伝子のメチル化レベルが大幅に低下した。
　次に、特定遺伝子の発現レベルを分析した。TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina)を用いて製造者マニュアルに従ってＲＮＡライブラリを調製した。Illumina HiSeq 1500またはNextSeq 500 platformを用いてディープシーケンシングを行った。ＴｏｐＨａｔを用いてＦＡＳＴＱリードをマップし、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを用いて転写産物をアッセンブルした。遺伝子発現は、FPKM（fragments per kilobase of exon per million reads mapped）として表現した。結果は、図８の右グラフに示される通りであった。
　図８の右グラフに示されるように、ＮＯＳＴＲＩＮ、ＤＳＣＲ９、ＳＬＣ２２Ａ２５、ＯＲ３Ａ４ＰおよびＣ１ＷＴＮＦ６は、Ｉｍ３に選択的に遺伝子発現が維持された。また、ＴＣＰ１１、ＬＹＰＤ５、ＳＴＡＲ、ＬＯＣ２５３５７３およびＬＯＣ１００５０７５７３は、Ｉｍ０およびＩｍ３によって遺伝子発現が維持された。このように、Ｉｍ０やＩｍ３は、配列特異的に遺伝子のメチル化レベルを低下させることができ、かつ、細胞における通常の遺伝子発現レベルを維持させることができた。このことから、４つの単量体単位を含むＰＩＰは、ゲノムワイドで遺伝子の発現レベルおよびメチル化レベルを顕著に制御した。
実施例６Ｂ：ヒストン修飾酵素阻害剤とＰＩＰとのコンジュゲートの創製
　本実施例では、ヒストン修飾酵素阻害剤単独では活性化されない遺伝子発現を、４つの単量体単位を含むＰＩＰと阻害剤とのコンジュゲートを用いて活性化することができるかを調べた。
　ヒストン修飾酵素阻害剤とＰＩＰとのコンジュゲートは、下記化合物４をＩｍ０またはＩｍ３のアミノ末端のアミノ基に連結させて得た。このようにして得られた、Ｉｍ０とＬＳＤ１阻害剤とのコンジュゲートをＩｍ０－Ｎといい、Ｉｍ３とＬＳＤ１阻害剤とのコンジュゲートをＩｍ３－Ｎという。なお、化合物４は、ＮＣＤ３８の類似体であり、ＰＩＰとの融合とＬＳＤ１阻害活性の維持に最適化させた化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　既存の合成手法(J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6141.)をもとに合成したPy-Py-Py-Py-NH2・HCl (27.8 mg, 0.05 mmol)、4-dimethylaminobutyric acid (16.8 mg, 0.1 mmol), DMAP (12.2 mg, 0.1 mmol)のDMF　(0.1 mL) 溶液に対して、EDC・HCl (19.1 mg, 0.1 mmol) を添加し、室温にて12時間撹拌した。反応液にCHCl3/i-PrOH(1/1)溶液を添加し、飽和重曹水で洗浄後、Na2SO4にて乾燥した。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHROMATOREX NH-DM1020, CHCl3/MeOH = 50/1 to 30/1)にて精製し目的物を17.0 mg (54% yield)得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　既存の合成手法(J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6141.)をもとに合成したPy-Py-Im-Py-NHBoc (90 mg, 0.145 mmol)に対し、4N HCl in dioxane溶液（0.48 mL）を添加し室温にて５時間撹拌した。溶媒を減圧留去したのち、残渣をヘキサンにて洗浄することでアミン体塩酸塩を80.3 mg （99% yield）得た。
4-dimethylaminobutyric acid (16.8 mg, 0.1 mmol), HATU (38 mg, 0.1 mmol), diisopropylethylamine (51 μL, 0.3 mmol) をDMF (0.25 mL)に溶解したのち、室温にて30分撹拌した。撹拌溶液に対し、上記アミン塩酸塩（27.9 mg, 0.05 mmol）のDMF(0.25 mL)溶液を室温にて添加し、そのまま１６時間撹拌した。１M KHSO4水溶液を添加し、反応液をCHCl3/i-PrOH(1/1)溶液にて抽出した。有機相を水、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、Na2SO4にて乾燥した。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHROMATOREX NH-DM1020, CHCl3/MeOH = 50/1)にて精製し目的物を10.4 mg (33% yield)得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　既知の手法(Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 8620.)により合成した化合物1（649.7 mg, 1.55 mmol）のCH2Cl2（6.2 mL）溶液に対し、4N HCl in dioxane(3.9 mL)を0℃にて添加した。反応溶液を室温にて1時間撹拌し、溶媒を減圧留去し対応する塩酸塩を得た。3-(methoxycarbonyl)benzoic acid (279 mg 1.55 mmol)とCOMU(633.8 mg, 1.55 mmol)、N-methylmorpholine (0.68 mL, 6.2 mmol)のDMF溶液（5 mL）に対し、得られた塩酸塩のDMF溶液（2.8 mL）を0℃にて添加した。12時間後、飽和塩化アンモニウム水溶液にて反応を止め、酢酸エチルを添加した。混合液を１N塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、有機相を硫酸ナトリウムにて乾燥させた。減圧留去後、再結晶（酢酸エチル／ヘキサン）により化合物2（480.9 mg, 65% yield）を得た。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　化合物2（206.7 mg, 0.43 mmol）とヨウ化ナトリウム（1.2 g, 8 mmol）のアセトン懸濁液を18時間加熱還流した。反応液を室温としたのち、酢酸エチルを添加、反応液を飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムにより乾燥後、溶媒を減圧留去することで化合物3を得た。このものを直接次の反応へと利用した。化合物3とPCPA・塩酸塩(218.1 mg, 1.29 mmol)、炭酸カリウム（355.8 mg, 2.58 mmol）のDMF（0.86 mL）懸濁液を60℃にて48時間撹拌した。反応液を室温としたのち、酢酸エチルを添加、混合液を飽和重曹水、飽和食塩水にて洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(SiO2, AcOEt,then CHCl3/MeOH = 20/1 to 10/1)にて精製し化合物4を191.5 mg (86% yield)得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　化合物4（144.3 mg, 0.28 mmol）をdioxane (1.1 mL)と10% 炭酸ナトリウム水溶液（0.3 mL）の混合溶媒中で撹拌し、Boc2O(368.3 mg, 1.68 mmol)を室温にて添加した。2.5時間撹拌後、酢酸エチルを添加、溶液を飽和食塩水にて洗浄後、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(SiO2, hexane/AcOEt = 2/1 to 0/1)にて精製し化合物5を91.6 mg (53% yield)得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　化合物5（91.6 mg, 0.15 mmol）のメタノール（0.75 mL）溶液に対して、1M LiOH水溶液(0.3 mL)を0℃にて添加した。12時間後、酢酸エチルを添加し10%クエン酸水溶液にて反応液を酸性とした。クロロホルムにて抽出後、溶液を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去後、残渣を次の反応に用いた。得られた残渣とPyBOP(135.2 mg, 0.26 mmol),既知の化合物6 (Chem. Eur. J. 2013, 19, 15822.)（55.6 mg, 0.26 mmol）のDMF（0.65 mL）溶液に対して0℃にてiPr2NEt（0.09 mL, 0.52 mmol）を添加した。室温にて4時間撹拌後、酢酸エチルを添加した。１N塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄後、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(SiO2, CHCl3/MeOH = 20/1 to 10/1)にて精製し化合物7を95.6 mg (84% yield)得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　化合物7（52.5 mg, 0.0695 mmol）のメタノール(0.7 mL)溶液に対して、0度にて１M　LiOH水溶液(0.14 mL)を添加した。室温にて12時間撹拌後、酢酸エチルにて逆抽出、水相を10%クエン酸水溶液にて酸性としたのち、クロロホルムにて抽出。有機相を硫酸ナトリウムにより乾燥後、溶媒を減圧留去、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(SiO2, CHCl3/MeOH = 10/1 to 0/1)にて精製し化合物8を24.5 mg (48% yield)得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　化合物8（35.2 mg, 0.0048 mmol）、DMAP (12 mg, 0.096 mmol)、EDCI (18.4 mg, 0.096 mmol)のDMF(0.96 mL)溶液に対して、0度にてPy-Py-Py-Py-NH2・HCl(26.7 mg, 0.048 mmol)とiPr2NEt(32 μL, 0.192 mmol)を添加した。室温にて15時間撹拌後、酢酸エチルを添加し、１N塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムにより乾燥後、溶媒を減圧留去、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHROMATOREX NH-DM1020, CHCl3/MeOH = 20/1)にて精製し縮合体の粗生成物を15.7mg得た。得られた粗生成物15.7 mgを塩化メチレン(1.2 mL)に溶解し、0度にて4N HCl in dioxane(0.12 mL)を添加した。室温にて2時間撹拌後、水を添加し塩化メチレンにて逆抽出、得られた水相を1M LiOH溶液にて塩基性としたのち、クロロホルムにて抽出した。有機相を硫酸ナトリウムにより乾燥後、溶媒を減圧留去、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHROMATOREX NH-DM1020, CHCl3/MeOH = 20/1 to 10/1)にて精製して生成物9（すなわち、Ｉｍ０－Ｎ）を1.8 mg(3% yield)得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　化合物8（19.5 mg, 0.026 mmol）、PyBOP (19.5 mg, 0.039 mmol)のDMF(0.52 mL)溶液に対して、0度にてPy-Py-Im-Py-NH2・HCl(14.7 mg, 0.026 mmol)とiPr2NEt(18 μL, 0.104 mmol)を添加した。室温にて15時間撹拌後、酢酸エチルを添加し、１N硫酸水素カリウム水溶液、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムにより乾燥後、溶媒を減圧留去、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHROMATOREX NH-DM1020, CHCl3/MeOH = 20/1)にて精製し縮合体の粗生成物を26.5mg得た。得られた粗生成物26.5 mgを塩化メチレン(0.42 mL)に溶解し、0度にて4N HCl in dioxane(0.05 mL)を添加した。室温にて4時間撹拌後、水を添加し塩化メチレンにて逆抽出、得られた水相を1M LiOH溶液にて塩基性としたのち、クロロホルムにて抽出した。有機相を硫酸ナトリウムにより乾燥後、溶媒を減圧留去、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHROMATOREX NH-DM1020, CHCl3/MeOH = 20/1)にて精製して生成物１０（すなわち、Ｉｍ３－Ｎ）を4.9 mg(16% yield)得た。
　大腸がん細胞株ＲＫＯ細胞を６ｃｍディッシュに１×１０５細胞の密度で播種し、２４時間インキュベートした。次いで、培養液を２μＭのＮＣＤ３８およびＩｍ０－Ｎ、Ｉｍ３－Ｎを含む培養液に入れ替え、培養細胞を薬剤へ３０日間にわたって暴露した。この間、化合物を含む培地は、５日毎に交換した。細胞は、ほぼコンフルエントになったときに６ｃｍディッシュに２×１０５細胞の密度で継代した。細胞は３０日目で回収した。
　次に、回収した細胞を1%のホルムアルデヒドで固定した後、超音波破砕によって断片化させたクロマチンDNAを作成した。断片化クロマチンに対して、ヒストンメチル化抗体(H3K4me3)を用いたChIP-Seq法によって、遺伝子活性化マーカーの１つであるヒストンメチル化が亢進している領域を同定した。その結果、図９に示されるように、阻害剤処理ではヒストンメチル化に大きな変動が認められなかった複数の遺伝子プロモータ領域が、Ｉｍ３－Ｎ処理においてはヒストンメチル化が亢進する現象が認められた。このことから、ＰＩＰ－ＬＳＤ１阻害剤は、ヒストン活性化を選択的に誘導することが示唆された。
　ＰＩＰによるヒストン修飾酵素阻害剤のゲノム上へのデリバリーの配列特異性を、別のヒストン活性化マーカーであるヒストンアセチル化変化の観点から確認した。実施例５Ｂに記載の方法により、細胞をＩｍ０－ＮまたはＩｍ３－Ｎで処理し、ヒストンアセチル化抗体（H3K27Ac）を用いたChIP-Seq法により、ヒストン活性化領域を同定した。結果は、図１０および１１に示される通りであった。図１０および１１に示されるように、ＮＣＤ３８単体処理系と比較して、Ｉｍ０－Ｎによって活性化されたヒストン領域では、ＷＷＷＷを有する標的配列数が有意かつ顕著に多く認められた。また、Ｉｍ３－Ｎによって活性化されたヒストン領域において、ＷＣＧＷを有する標的配列数が有意に多く認められた。
　上述の通り、ＰＩＰは、少なくとも４つの単量体単位を含めば、ゲノムＤＮＡへの配列依存的な結合に十分であることが明らかとなった。また、ＰＩＰは、連結した他の分子をゲノムＤＮＡへの配列依存的にデリバリーできることも明らかとなった。

Claims (13)

  1. 　生体においてＤＮＡのメチル化による遺伝子の発現抑制を阻害することに用いるための組成物であって、ピロールイミダゾールポリアミドを含み、ピロールイミダゾールポリアミドは、前記遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡのマイナーグルーブに配列特異的に結合するように設計されたものである、組成物。
  2. 　生体においてＤＮＡのメチル化による遺伝子の発現抑制を阻害することに用いるための組成物であって、ピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含み、コンジュゲート中のピロールイミダゾールポリアミドは、前記遺伝子のプロモータ領域のＤＮＡのマイナーグルーブに配列特異的に結合するように設計されたものである、組成物。
  3. 　ＤＮＡのメチル化が、ＤＮＡの脱メチル化処理後に細胞内で生じるＤＮＡメチル化である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 　ＤＮＡのメチル化が、ＤＮＡの脱メチル化処理とヒストンの脱アセチル化阻害処理後に細胞内で生じるＤＮＡメチル化である、請求項３に記載の組成物。
  5. 　ＤＮＡの脱メチル化処理が、５－アザ－２’－デオキシシチジン（ＡＺＡ）処理により行われる、請求項３または４に記載の組成物。
  6. 　ヒストンの脱アセチル化阻害処理が、トリコスタチンＡ処理により行われる、請求項４または５に記載の組成物。
  7. 　遺伝子が、癌抑制遺伝子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 　遺伝子が、ＭＬＨ１遺伝子である、請求項７に記載の組成物。
  9. 　癌の対象において癌を処置するための医薬組成物であって、請求項７または８に記載の組成物を含み、これにより癌抑制遺伝子の転写抑制を阻害することができる、医薬組成物。
  10. 　癌が大腸癌、胃癌、胃小窩型胃癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌および直腸結腸癌から選択される癌であり、プロモータ領域のＤＮＡがメチル化された癌抑制遺伝子がＭＬＨ１遺伝子である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 　ＤＮＡの脱メチル化剤とヒストンの脱アセチル化阻害剤と併用するための、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
  12. 　ＭＬＨ１遺伝子のメチル化が亢進した対象において、癌の発症を予防することに用いるための、または癌の発症リスクを低減することに用いるための医薬組成物であって、請求項８に記載の組成物を含む、医薬組成物。
  13. 　生体において標的ＤＮＡまたはその近傍におけるＤＮＡメチル化を阻害することに用いるためのＤＮＡメチル化阻害剤であって、ピロールイミダゾールポリアミドまたはピロールイミダゾールポリアミドとヒストン修飾酵素阻害剤とのコンジュゲートを含み、ピロールイミダゾールポリアミドは、標的ＤＮＡに配列特異的に結合するように設計された、ＤＮＡメチル化阻害剤。
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