CN113365627A - 用于治疗炎症性肠病的vdac抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗炎症性肠病(IBD)的方法。具体地，本发明涉及电压依赖性阴离子通道(VDAC1)的特定抑制剂，如哌嗪衍生物和/或哌啶衍生物等，例如肽和寡核苷酸用于治疗IBD的用途。

Description

用于治疗炎症性肠病的VDAC抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年11月26日提交的标题为“VDAC INHIBITORS FOR TREATINGINFLAMMATORY BOWEL DISEASES”的美国临时专利申请号62/771,213的优先权权益，其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于治疗炎症性肠病(IBD)的方法。具体地，本发明涉及用于治疗IBD的电压依赖性阴离子通道(VDAC1)抑制剂。
背景技术
炎症性肠病(IBD)，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(UC)，是复发缓解型(relapsingand remitting)状况，其特征在于胃肠道(GI)中各个部位的慢性炎症，导致腹泻和腹痛。
肠炎症由GI粘膜中的细胞介导的免疫应答引起。确切的病因尚不清楚，但是有证据表明正常的肠道菌群在具有多因素遗传易感性(multifactorial geneticpredisposition)的患者中触发异常的免疫反应(可能涉及异常的上皮屏障和粘膜免疫防御)。尚未确定具体的环境、饮食或传染病因。免疫反应涉及炎性介质，包括细胞因子、白细胞介素和TNF的释放。
线粒体DNA是编码37个基因的环状DNA，包括氧化磷酸化所必需的蛋白质复合物的亚基。尽管每个细胞中存在数千个拷贝的mtDNA，但大多数mtDNA不以游离形式存在，而是包装成拟核，即被束缚在线粒体内膜(IMM)基质侧的大结构。尽管机制尚不完全清楚，但是来自受到胁迫的线粒体的mtDNA或其片段可被释放至胞质溶胶中，在胞质溶胶中其可以与大量的免疫刺激性DNA传感器相互作用并将其激活。
由三种同种型(VDAC1、2和3)组成的电压依赖性阴离子通道(VDAC)是OMM中最丰富的蛋白质，并且调节新陈代谢、炎性体活化和细胞死亡(Shoshan-Barmatz等人,2018)。单体的孔可能太小而无法使mtDNA(2nm直径)穿过OMM，但发现VDAC处于单体状态与低聚状态之间的动态平衡中，并且低聚体可形成的孔要显著大于单体的孔。
目前，对于治疗IBD(例如，克罗恩病(Chron's disease)、溃疡性结肠炎(UC))的改进的方法的需求仍然未得到满足，这种改进的方法提供增强的功效但不涉及广泛的免疫抑制。
发明内容
本发明提供了用于减慢IBD的进展或治疗IBD的方法，包括降低对其有需要的对象中VDAC的表达或活性。
被释放至胞质溶胶和/或胞外空间中的线粒体DNA(mtDNA)及其片段在诱导和/或促进炎症中起重要作用。本发明部分地基于以下发现：在可接受的小鼠模型中，VDAC1在炎症性肠病中过表达并抑制VDAC-1改善炎症性肠病的一些标志性特征。VDAC-1特异性抑制剂降低小鼠的体重减轻和结肠缩短，同时还提高存活率。进一步，VDAC-1特异性抑制剂，例如VBIT化合物以及siRNA在已知促进mt-DNA释放的氧化条件下已成功减少mtDNA分泌/泄漏。
根据一个方面，提供了用于减慢炎症性肠病(IBD)的进展或治疗炎症性肠病(IBD)的方法，包括向需要这种治疗的对象给予包含治疗有效量的VDAC抑制性化合物的药物组合物。
在一些实施方式中，VDAC抑制剂是通式(I)的化合物：
Figure BDA0003177871630000021
其中：A是碳(C)或氮(N)；R3不存在，或选自氢、未取代的或取代的酰胺或包含除氢原子外3-12个原子的杂烷基，其中所述3-12个原子中的至少一个是选自氮、硫和氧的杂原子；其中当A是氮(N)时，R3不存在；L1不存在或是氨基连接基团–NR4–，其中R4是氢、C1-5-烷基、C1-5-亚烷基或取代的烷基-CH2R，其中R是选自以下的官能团：氢、卤基(halo)、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基和杂芳基；R1是芳族部分，其任选地被Z中的一个或多个取代；Z在每次出现时独立地是选自以下的官能团：氢、卤基、卤代烷基、卤代烷氧基、全卤代烷氧基或C1-2-全氟烷氧基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基和杂芳基；L2是连接基团，使得当A是氮(N)时，L2是由除氢原子外4-10个原子组成的基团，任选地形成环，其中原子中的至少一个是氮，所述氮形成酰胺基团的部分；并且当A是碳(C)时，则L2选自C1-4亚烷基或由除氢原子外4-10个原子组成的基团，任选地形成环，其中原子中的至少一个是氮，所述氮形成酰胺基团的部分；R2是苯基或萘基，任选地被卤素取代；或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
根据一些实施方式，所述化合物具有选自式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的式。
根据一个实施方式，所述化合物是N-(4-氯苯基)-4-羟基-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-哌嗪-1-基)丁酰胺(式1)，在整个说明书中被称为VBIT-4。
根据另一实施方式，所述化合物是1-(4-氯苯基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2,5-二酮(式2)，在整个说明书中被称为VBIT-3。
根据进一步的实施方式，所述化合物是(1-(萘-2-基甲基)-4-(苯基氨基)哌啶-4-羰基)甘氨酸(式3)，在整个说明书中被称为VBIT-12。
根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是衍生自或对应于人VDAC1 N-末端结构域(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基1-26的肽：包含：(i)相比于SEQ ID NO:1的一个或多个突变，(ii)相比于SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸的截短，或其组合。
根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是1-25个氨基酸的肽，其包含衍生自包含氨基酸序列：MAVPPTYADLGKSARDVFTKXYXFX(SEQ ID NO:2)的人VDAC1 N-末端结构域的氨基酸残基1-26的连续序列(毗邻序列，contiguous sequence)，其中X是除甘氨酸以外的任何氨基酸。
根据某些示例性实施方式，所述肽包含选自SEQ ID No.:4-13的氨基酸序列。
根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是VDAC沉默寡核苷酸分子或包含其的构建体。任何VDAC沉默寡核苷酸分子都可以用于本发明的方法，只要所述寡核苷酸包含与SEQID NO:17、与其所编码的mRNA分子或与和其互补的序列相同的至少15个连续核酸即可。
根据某些实施方式，所述沉默寡核苷酸包含选自以下的核酸序列：SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；和SEQ ID NO:25。根据一些实施方式，自身免疫疾病选自涉及全身性自身免疫障碍的自身免疫疾病和涉及单个器官或单个细胞类型障碍的自身免疫疾病。
在一些实施方式中，所述IBD选自克罗恩病和溃疡性结肠炎(UC)。
在一些实施方式中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方式中，口服或肠胃外给予所述药物组合物。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明的实施方式，但是以下描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以该专利说明书，包括定义为准。另外，材料、方法和实例仅是示例性，而不意图必须是限制性的。
根据下文给出的详细描述，本发明的进一步实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应理解，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方式，但是仅以示例的方式给出，因为根据此详细描述，在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术而言将变得显而易见。
附图说明
图1是葡聚糖硫酸钠诱导的炎症性肠病(DSS诱导的IBD)的非限制性方案的流程图(scheme)。
图2是显示VBIT-4和VBIT-12对DSS-诱导的炎症性肠病(IBD)小鼠体重的影响的图。
图3是显示VBIT-4和VBIT-12对DSS诱导的IBD小鼠存活的影响的图。
图4A-图4B是显示VBIT-4和VBIT-12对DSS诱导的IBD小鼠的结肠长度的影响的图像和图。(3A)是从对照小鼠、DSS诱导的对照(DSS 2.5％)、DSS+VBIT-4和DSS+VBIT-12解剖的结肠的图像。(3B)是显示相对于DSS诱导的对照，VBIT-4和VBIT-12处理的小鼠中结肠缩短的％的垂直条形图。
图5是显示VBIT-4和VBIT-12对DSS诱导的IBD小鼠的组平均得分(GMS)的影响的图。GMS是根据表2中公开的标准计算的。
图6A-图6D是用苏木精和曙红(H&E)染色的C57BL/6小鼠中DSS诱导的IBD的组织学切片的显微照片。比例尺代表100μm。(6A)对照；(6B)2.5％DSS；(6C)DSS+VBIT-4；和(6D)DSS+VBIT-12。
图7A-图7D是C57BL/6小鼠中DSS诱导的IBD的组织学切片的显微照片，突出显示了VBIT-4和VIBT-12对结肠壁厚度及其淋巴浸润的影响。(7A)对照；(7B)2.5％DSS；(7C)DSS+VBIT-12；和(6D)DSS+VBIT-4。
图8A-图8D是用抗VDAC-1特异性抗体免疫染色的C57BL/6小鼠中DSS诱导的IBD的组织学切片的显微照片。(8A)对照；(8B)2.5％DSS；(8C)2.5％DSS+VBIT-4；和(8D)2.5％DSS+VBIT-12。
图9A-图9C是非限制性方案的流程图和以垂直条形图呈现的结果。(9A)是检查通过每天一次或两次强饲给予的VBIT-12对DSS-小鼠的影响的非限制性方案的流程图。(9B-9C)是显示两次给予对结肠长度减少(9B)以及对脾重量降低(9C)产生更好效果的图。分析了各个组的脾重量，显示VBIT-12将DSS处理的组中的增加的重量降低至接近DSS未处理的对照组(9C)中的重量。脾重量增加总体上与炎症和贫血程度相关。所有数据均表示为平均值±SEM，(n＝3)(*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001)。
图10A-图10F是显示用增殖标记物抗Ki-67抗体进行IHC染色的石蜡包埋的固定切片的显微照片。组如下：对照(10A-10B)、DSS处理的小鼠(10C-10D)和经历VBIT-12的DSS处理的小鼠(10E-10F；20mg/Kg)。结果(10A-10B)、(10C-10D)；和(10E-10F)是每组2只代表性小鼠的结肠图像。结果显示，当用VBIT-12处理时，DSS处理的小鼠中增加的Ki-67染色被去除。
图11A-图11L是显示用抗胱天蛋白酶3抗体进行IHC染色(11A-11F)或经处理进行TUNEL测定(使用DeadEnd Fluorometric TUNEL***)(11G-11L)的石蜡包埋的固定切片的显微照片。组：对照(11A-11B和11G-11H)、DSS处理的小鼠(11C-11D和11I-11J)和经历VBIT-12的DSS处理的小鼠(11E-11F和11K-11L；20mg/Kg)。结果显示，在VBIT-12处理的小鼠中活化的胱天蛋白酶水平增加，而细胞凋亡(TUNEL)降低。(11A-11B和11G-11H)、(11C-11D和11I-11J)；和(11E-11F和11L-11K)中的每一个是每组2只代表性小鼠的显微照片。
图12A-图12Q是显示VDAC1在人结肠病理状况中过表达的显微照片和垂直条形图。(12A-12P)是在组织微阵列载玻片上进行的VDAC1的免疫组织化学染色的显微照片。阵列包含来自以下的结肠切片：健康的(12A-12D)、慢性溃疡性结肠炎(12E-12H)、克罗恩病(12I-12L)和腺癌(12M-12P)。将指示的组织的代表性切片在4℃下与在PBS中1％BSA中稀释的抗VDAC1抗体一起孵育过夜，然后与在PBS中1％BSA中稀释的二抗一起孵育。随后将载玻片用3’3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)处理，并用苏木精复染。阴性对照在没有一抗的情况下进行孵育。在奥林巴斯显微镜(Olympus microscope)下观察组织的切片，并在相同的光强度和曝光时间下以200×的放大率拍摄图像。(12Q)使用全景显微镜和HistoQuant软件(QuantCenter 2.0软件，3DHISTECH Ltd)对所提供的切片的整个区域中VDAC1表达水平进行定量，如染色强度所反映。
图13A-图13J是显示VDAC1表达的若干自身免疫疾病的显微照片。(13A)正常甲状腺、(13B)正常滑膜、(13C)肉芽肿(Granulomat)、(13D)类风湿性关节炎(滑膜)、(13E)桥本甲状腺炎(13F)牛皮癣、(13G)正常肺、(13H)正常结肠、(13I)肉样瘤病(Sarkoidose)(肺)、和(13J)克罗恩病(Morbus Crohn)(Sigma)。显示了正常(图13A-13B和13G-13H)和针对VDAC1进行IHC染色的疾病(图13C-13F和13I-13J)组织的代表性图像。
图14是显示来自DSS诱导的UC小鼠的血清中线粒体DNA(mtDNA)定量的垂直条形图。用5ng的总DNA，通过qPCR和用于D-环区域的mtDNA特异性引物检测mtDNA。结果是关于线粒体编码的基因细胞色素c氧化酶亚基2(Cox-II)进行标准化的，并表示为相对于对照小鼠血浆中mtDNA水平的变化倍数。差异被认为具有统计显著性，其中***p<0.001。
图15是显示mtDNA从H2O2诱导的细胞中释放和VBIT-4或VBIT-12(20μM)的作用的垂直条形图。
图16是显示H2O2诱导的mtDNA从表达VDAC1的细胞释放，但没有从使用特异性siRNA(si-m/hVDAC1)针对VDAC1表达进行了沉默的细胞释放的垂直条形图。结果为平均值±SEM，(n＝3)，***p<0.001)。
具体实施方式
本发明提供了用于治疗IBD的方法，其包括向需要这种治疗的对象给予VDAC抑制剂或包含其的药物组合物。
本发明进一步提供了用于治疗IBD、减慢IBD或与其相关的一种或多种症状的进展的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象给予VDAC抑制剂或包含其的药物组合物。
在一些实施方式中，所述方法包括给予治疗有效量的至少一种如本文以下公开的哌嗪衍生物或哌啶衍生物。
哌嗪化合物
根据一些实施方式，用于本发明的方法的哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式(I)：
Figure BDA0003177871630000061
其中：A是碳(C)或氮(N)；R3不存在，或选自氢、未取代的或取代的酰胺或包含除氢原子外3-12个原子的杂烷基，其中所述3-12个原子中的至少一个是选自氮、硫和氧的杂原子；其中当A是氮(N)时，R3不存在；L1不存在或是氨基连接基团–NR4–，其中R4是氢、C1-5-烷基、C1-5-亚烷基或取代的烷基-CH2R，其中R是选自以下的官能团：氢、卤基、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基和杂芳基；优选地，R4是氢；R1是芳族部分，优选是苯基，其可以被Z中的一个或多个取代；Z在每次出现时独立地是选自以下的官能团：氢、卤基、卤代烷基、卤代烷氧基、全卤代烷氧基或C1-2-全氟烷氧基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基和杂芳基；优选地，Z是C1-2-全氟烷氧基；优选地，当A是氮(N)时，R1是苯基并且Z是三氟甲氧基；优选地，R1是最优选在对位被一个三氟甲氧基取代的苯基；优选地，当A是碳(C)时，R1是未取代的苯基；L2是连接基团，使得当A是氮(N)时，L2是包含4-10个原子(除氢原子外)的基团，任选地形成环，其中原子中的至少一个是氮，氮形成酰胺基团的部分；优选地，连接基团选自C4-6-烷基亚酰胺基(C4-6-alkylamidylene)和亚吡咯烷基(pyrrolidinylene)，所述连接基团任选地被烷基、羟基、氧基或硫代基团(硫基，thioxo group)中的一个或两个取代；最优选地，L2选自丁亚酰胺基(butanamidylene)、N-甲基丁亚酰胺基(N-methylbutanamidylene)、N,N-二甲基丁亚酰胺基(N,N-dimethylbutanamidylene)、4-羟基丁亚酰胺基(4-hydroxybutanamidylene)(HO-CH2-C*H-CH2-C(O)NH-，其中星号表示连接点)、4-氧基丁亚酰胺基(4-oxobutanamidylene)、4-羟基-N-甲基丁亚酰胺基(4-hydroxy-N-methylbutanamidylene)、4-氧基-N-甲基丁亚酰胺基(4-oxo-N-methylbutanamidylene)、2-吡咯烷酮基(2-pyrrolidonyl)、吡咯烷-2,5-二酮基(pyrrolidine-2,5-dionylene)、5-硫代-2-亚吡咯烷酮基(5-thioxo-2-pyrrolidinonylene)和5-甲氧基-2-亚吡咯烷酮基(5-methoxy-2-pyrrolidinonylene)；并且当A是碳(C)时，则L2与当A是氮(N)时关于L2所定义的一样或是C1-4亚烷基；L2优选是亚甲基(–CH2–)；R2是苯基或萘基，任选地被卤素取代，优选地，当R2是苯基时，其在对位上被卤素，优选氯取代，优选地，当R2是未取代的萘基时，L2是亚烷基，优选是-CH2-；
在一些实施方式中，所述方法包括向对其有需要的对象给予至少一种通式(I)的化合物，条件是当A是碳(C)，L1是-NR4-，R4是氢，并且R2是被氯取代的苯基时，则L2不是吡咯烷-2,5-二酮。
在一些实施方式中，R3是氢或包含除氢原子外3-12个原子的杂烷基，其中所述3-12个原子中的至少一个是选自氮、硫和氧的杂原子。在一些实施方式中，R3是C(O)NHCH2C(O)OH基团。在其它实施方式(即，当A是氮时)，R3不存在。
在一些实施方式中，R4是氢。
在一些实施方式中，R1是被三氟甲氧基取代的苯基。在一些实施方式中，R1是被一个三氟甲氧基取代的苯基。在一些实施方式中，R1是在对位被一个三氟甲氧基取代的苯基。在一些实施方式中，R1是苯基。
在一些实施方式中，L2是连接基团，其包含4-10个原子(除氢原子外)，任选地形成环，其中原子中的至少一个是氮，所述氮形成酰胺基团的部分；优选地，所述连接基团选自C4-6-烷基亚酰胺基和亚吡咯烷基，所述连接基团任选地被烷基、羟基、氧基或硫代基团中的一个或两个取代；最优选地，L2选自丁亚酰胺基、N-甲基丁亚酰胺基、N,N-二甲基丁亚酰胺基、4-羟基丁亚酰胺基(HO-CH2-C*H-CH2-C(O)NH-其中星号表示连接点)、4-氧基丁亚酰胺基、4-羟基-N-甲基丁亚酰胺基、4-氧基-N-甲基丁亚酰胺基、2-吡咯烷酮基、吡咯烷-2,5-二酮基、5-硫代-2-亚吡咯烷酮基和5-甲氧基-2-亚吡咯烷酮基。每种可能性都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，L2是4-羟基丁亚酰胺基(HO-CH2-C*H-CH2-C(O)NH-，其中星号表示连接点)。在一些实施方式中，L2是C1-4亚烷基，优选是亚甲基(-CH2-)。
术语“亚吡咯烷基”指代作为二价取代基的吡咯烷环。亚吡咯烷基包括未取代的和取代的环，如，但不限于吡咯烷-2-5-二酮、2-吡咯烷酮、5-硫代-2-吡咯烷酮、5-甲氧基-2-吡咯烷酮等。
在一个实施方式中，当A是氮(N)时，连接基团L2选自C4-6-烷基亚酰胺基和亚吡咯烷基，所述连接基团任选地被烷基、羟基、氧基或硫代基团中的一个或两个取代。例如，L2可以是丁亚酰胺基、N-甲基丁亚酰胺基、N,N-二甲基丁亚酰胺基、4-羟基丁亚酰胺基、4-氧基丁亚酰胺基、4-羟基-N-甲基丁亚酰胺基、4-氧基-N-甲基-丁亚酰胺基、2-吡咯烷酮基(2-pyrrolidonyle)、吡咯烷-2,5-二酮基、5-硫代-2-亚吡咯烷酮基或5-甲氧基-2-亚吡咯烷酮基。优选地，当L2是丁亚酰胺基、N-甲基丁亚酰胺基、N,N-二甲基丁亚酰胺基、4-羟基丁亚酰胺基、4-氧基丁亚酰胺基、4-羟基-N-甲基丁亚酰胺基或4-氧基-N-甲基丁亚酰胺基时，则优选地，丁酰胺部分的第3位的碳(C)键合至哌嗪环的或哌啶环的氮(N)，并且丁酰胺部分的氮(N)键合至R2。例如，在一些实施方式中，当L2是2-吡咯烷酮、吡咯烷-2,5-二酮、5-硫代-2-吡咯烷酮或5-甲氧基-2-吡咯烷酮时，则优选地，吡咯烷部分的碳(C)键合至哌嗪环或哌啶环的氮(N)，并且吡咯烷部分的氮(N)键合至R2。可选地，在一些实施方式中，当L2是4-羟基丁亚酰胺基时，则优选地，丁亚酰胺基部分的碳(C)键合至哌嗪环的氮(N)，并且丁亚酰胺基部分的氮(N)键合至R2。
在另一实施方式中，A是碳(C)，R3是杂烷基，并且L2是亚甲基。
本发明还涉及根据本发明的通式(I)的化合物的立体异构体、对映异构体、其混合物、和盐，具体是生理学上可接受的盐。
根据某些实施方式，所述至少一种哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式Ia：
Figure BDA0003177871630000081
其中：A、R3、Z和L1与先前关于式(I)的化合物所定义的一样；优选地，A是氮(N)；L2'是选自C4-烷基亚酰胺基、C5-烷基亚酰胺基和C6-烷基亚酰胺基的连接基团，任选地被烷基、羟基、氧基或硫代基团中的一个或两个取代；优选地，L2'选自丁亚酰胺基、N-甲基丁亚酰胺基、N,N-二甲基丁亚酰胺基、4-羟基丁亚酰胺基、4-氧基丁亚酰胺基、4-羟基-N-甲基丁亚酰胺基或4-氧基-N-甲基丁亚酰胺基；最优选地，L2'是4-羟基丁亚酰胺基；其中优选地，烷基亚酰胺基L2'的烷基部分的第3位的碳(C)键合至哌嗪环的或哌啶环的氮(N)，并且丁酰胺部分的氮(N)键合至苯基；优选地，L2’是HO-CH2-C*H-CH2-C(O)NH-，其中星号表示连接点；Y是卤素，优选氯，例如在对位上；或是其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
根据某些实施方式，所述哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式(Ib)：
Figure BDA0003177871630000091
其中：A、R3和Z与先前关于式(I)的化合物所定义的一样；优选地，A是氮(N)；L1不存在；L2"是亚吡咯烷基连接基团，任选地被烷基、羟基、氧基或硫代基团中的一个或两个取代，优选地，L2"选自2-亚吡咯烷酮基、吡咯烷-2,5-二酮基、5-硫代-2-亚吡咯烷酮基和5-甲氧基-2-亚吡咯烷酮基；最优选地，L2"是吡咯烷-2,5-二酮基；其中优选地，吡咯烷基部分L2"的第4位的碳(C)或第3位的碳(C)键合至哌嗪环或哌啶环的氮(N)，并且吡咯烷基部分的氮(N)键合至被Y取代的苯基；并且Y是卤素，优选氯，例如在对位上。
根据某些实施方式，所述哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式(Ic)：
Figure BDA0003177871630000092
其中：A、R3和Z与先前关于通式(I)的化合物所定义的一样；优选地，其中A是碳(C)；L1是–NH–；并且Y1和Y2各自独立地不存在或是卤素；优选地，其中Y1和Y2各自独立地不存在；或是其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。优选的式(Ic)的化合物是其中R3是-C(O)NHCH2C(O)OH基团，和/或其中Z是C1-2-烷氧基或卤代的C1-2-烷氧基，例如C1-2-全氟烷氧基的式(Ic)的化合物。
根据某些实施方式，所述哌嗪衍生物或哌啶衍生物具有通式(Id)：
Figure BDA0003177871630000101
其中：L2选自C4-6-烷基亚酰胺基(例如HO-CH2-C*H-CH2-C(O)NH-，其中星号表示连接点)和亚吡咯烷基(例如，吡咯烷-2,5-二酮基)，任选地被烷基、羟基、氧基或硫代基团中的一个或两个取代；并且Z是卤代烷氧基，例如C1-2-全氟烷氧基，优选地，OCF3，并且Y是卤素。
在一些实施方式中，L2是HO-CH2-C*H-CH2-C(O)NH-，其中星号表示连接点。在一些实施方式中，Z是OCF3。在一些实施方式中，Y是氯。在一些实施方式中，Y是位于L2对位的氯。
本发明还涉及根据本发明的通式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的立体异构体、对映异构体、其混合物和其盐。表1提供了通式(I)的化合物的非限制性实例。其包括以下化合物：N-(4-氯苯基)-4-羟基-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)-哌嗪-1-基)丁酰胺(式1)；1-(4-氯苯基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2,5-二酮(式2)；(1-(萘-2-基甲基)-4-(苯基氨基)哌啶-4-羰基)甘氨酸(式3)；1-(4-氯苯基)-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2-酮(式4)；1-(4-氯苯基)-5-硫代-3-(4-(4-(三氟-甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)吡咯烷-2-酮(式5)；1-(4-氯苯基)-5-甲氧基-4-(4-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基)哌啶-1-基)吡咯烷-2-酮(式6)；1-(4-氯苯基)-5-硫代-4-(4-((4-(三氟甲氧基)苯基)氨基)哌啶-1基)吡咯烷-2-酮(式7)；4-(4-氯苯基)-4-氧基-3-(4-(4-(三氟甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酰胺(式8)；和N-(4氯苯基)-4-羟基-N-甲基-3-(4-(4-(三氟-甲氧基)苯基)哌嗪-1-基)丁酰胺(式9)。
表1：通式(I)的化合物的实例
Figure BDA0003177871630000102
Figure BDA0003177871630000111
Figure BDA0003177871630000121
在一些实施方式中，所述哌嗪衍生物或哌啶衍生物(在本文也被称为取代的N-杂环)由选自式#1(VBIT-4)、式#2(VBIT-3)、式#3(VBIT-12)、式#4(VBIT-5)、式#5(VBIT-6)、式#6(VBIT-9)、式#7(VBIT-10)、式#8(VBIT-7)或式#9(VBIT-8)的式或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐表示。在一些实施方式中，取代的N-杂环选自VBIT-4、VBIT-3、VBIT-12、VBIT-5、VBIT-6、VBIT-9、VBIT-10、VBIT-7或VBIT-8或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。每种可能性都代表单独的实施方式。在一些实施方式中，取代的N-杂环选自VBIT-4、VBIT-3或VBIT-12或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环选自VBIT-4或VBIT-12或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环选自VBIT-4或VBIT-3或其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环是VBIT-4或其对映异构体、非对映异构体、或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环是VBIT-12或其对映异构体、非对映异构体、或盐。在一些实施方式中，取代的N-杂环是VBIT-3或其对映异构体、非对映异构体、或盐。
下文更具体地定义了本文用于描述根据本发明的化合物的一些术语。
术语“N-杂环”和“氮-杂环”可以互换并且表示具有5至7个环原子的杂环化合物，其中至少一个是氮。N-杂环尤其包括哌啶和哌嗪。
术语“卤素”表示选自F、Cl、Br和I的原子，优选Cl和Br。
本文关于通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(IIa)的R3部分所使用的术语“杂烷基”指代3-12个原子(除氢原子外)饱和的或不饱和的基团，其中一个或多个(优选1、2或3个)原子是氮、氧或硫原子，例如烷氧基，例如甲氧基或乙氧基，或甲氧基甲基-、腈-、甲基羧基烷基酯-或2,3-二氧乙基-基团；优选地，杂烷基是包含亚烷基，和羧酸部分、羰基部分、胺部分、羟基部分、酯部分、酰胺部分中至少一个的链。术语杂烷基还指代羧酸或衍生自羧酸的基团，例如酰基、酰氧基、羧基烷基、羧基烷基酯，如，例如甲基羧基烷基酯、羧基烷基酰胺、烷氧基羰基或烷氧基羰氧基；优选地，该术语指代-C(O)NHCH2C(O)OH基团。
术语“C1-n-烷基”，其中n可以具有如本文定义的值，表示具有1至n个碳(C)原子的饱和、支化或未支化的烃基。这些基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基等。
术语“C1-4-烷基”表示具有1至4个碳(C)原子的饱和、支化或未支化的烃基。
术语“C1-n-烷氧基”，其中n可以具有如本文定义的值，表示通过–O-(氧)连接体键合的如本文定义的烷基。
术语“C1-n亚烷基”，其中n可以具有如本文定义的值，表示具有通式CnH2n的饱和烃取代基的亚烷基。通常地，n是正整数。例如，C1亚烷基指代亚甲基(-CH2-)，C3亚烷基指代C3H6，其可以是正亚丙基(-CH2CH2CH2-)或异亚丙基(-CH(CH3)CH2-或-CH2CH(CH3)-)。优选地，该术语指代未支化的正亚烷基。
术语“C1-n-全氟烷氧基”，其中n可以具有如本文定义的值，表示其中氢原子被氟原子取代的烷氧基。
术语“C1-m-烷基酰胺基”，其中m可以具有如本文定义的值，表示包含1至m个碳(C)原子和由Cm-a烷基-COOH和H2N-Ca烷基或Cm-a烷基-NH2和HOOC-Ca烷基形成的酰胺基团的基团，其中a小于或等于m。类似地，术语C4-烷基亚酰胺基、C5-烷基亚酰胺基和C6-烷基亚酰胺基指代二价Cm-烷基酰胺基，其中m分别为4、5或6。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物可以根据本领域已知的方法制备(参见，例如WO 2018/116307和US 2018/0078548，其内容通过引用并入本文，如同在本文全部阐述一样)。
本发明还涉及通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的以及结构式1、2、3、4、5、6、7、8和9的化合物的立体异构体，如非对映异构体和对映异构体、混合物和盐，具体是生理学上可接受的盐。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物、或通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的合成中的中间产物可以使用本领域已知的方法基于其物理-化学差异解析(resolved)成其对映异构体和/或非对映异构体。例如，顺式/反式混合物可以通过色谱法解析成其顺式和反式异构体。例如，可以通过对手性相的色谱法或通过从旋光溶剂中重结晶或通过对映异构体富集的晶种来分离对映异构体。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物以及结构式1、2、3、4、5、6、7、8和9的化合物可以转化为其盐，具体是用于药物用途的生理学上可接受的盐。通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物的以及结构式1、2、3、4、5、6、7、8和9的化合物的合适的盐可以用有机酸或无机酸，包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸或马来酸形成。可以用有机碱或无机碱将含有羧基的通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)的化合物转化为其盐，具体转化为生理学上可接受的盐，用于药物用途。用于此目的的合适的碱包括，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、精氨酸或乙醇胺。
根据某些实施方式，所述化合物具有通式(IIa)：
Figure BDA0003177871630000141
其中：A是碳(C)；R3是氢、未取代的或取代的酰胺或包含除氢原子外3-12个原子的杂烷基，其中所述3-12个原子中的至少一个是选自氮、硫和氧的杂原子；L1是氨基连接基团–NR4–，其中R4是氢、C1-5-烷基、C1-5-亚烷基或取代的烷基–CH2R，其中R是选自以下的官能团：氢、卤基、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；当R3是氢时，则L1优选是–NH–；当R3是包含3-12个原子的杂烷基时，则L1优选是–NCnH2n–，使得其与R3一起形成环；R1是芳族部分，其任选地被C1-2-烷氧基，例如卤代烷氧基，如C1-2-全氟烷氧基中的一个或多个取代；L2是包含4-10个原子(除氢原子外)的连接基团，任选地形成环，其中原子中的至少一个是氮，所述氮形成酰胺基团的部分或L2是C1-5烷基或C1-5亚烷基；所述连接基团L2在氮(N)原子处键合哌啶或哌嗪部分；优选地，L2选自丁亚酰胺基、N-甲基丁亚酰胺基、N,N-二甲基丁亚酰胺基、4-羟基丁亚酰胺基、4-氧基丁亚酰胺基、4-羟基-N-甲基丁亚酰胺基、4-氧基-N-甲基丁亚酰胺基、2-亚吡咯烷酮基(2-pyrrolidonylene)、吡咯烷-2,5-二酮基、5-硫代-2-亚吡咯烷酮基和5-甲氧基-2-亚吡咯烷酮基；并且R2是芳基，任选地被卤素取代，任选地当R2是苯基时，其被卤素取代，进一步任选地，当R2是萘基时，L2是亚烷基。在具体的实施方式中，R3是氢，L1是–NH–，并且R1是被三氟甲氧基取代的苯基。本发明还涉及通式(I)和(IIa)的化合物的立体异构体、对映异构体、其混合物、和盐，具体是生理学上可接受的盐的用途。
在一些实施方式中，A是碳(C)，R3是氢(H)，L1是NH基团，R1是被一个三氟甲氧基取代的苯基，L2是吡咯烷-2,5-二酮，并且R2是在对位被氯取代的苯基。
在一些实施方式中，A是碳(C)，R3是C(O)NCH2C(O)OH基团并且连接至A和L1两者，L1是NCH2基团并且连接至R1和R3两者，R1是苯基，L2是亚甲基C1亚烷基，并且R2是萘基。
根据某些实施方式，本发明的方法包括向对象给予至少一种根据通式(IIa)的化合物，其具有选自式10和式11的结构式：
Figure BDA0003177871630000151
式10的化合物在本文中也标识为AKOS022或AKOS022075291。
Figure BDA0003177871630000152
式11的化合物在本文中也标识为DIV 00781。
通式(IIa)的化合物，诸如但不限于结构式10和11的化合物，可以转化为其盐，具体是生理学上可接受的盐，用于药物用途。通式(IIa)的化合物——包括但不限于结构式10和11的化合物——的合适的盐可以用有机酸或无机酸，诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸或马来酸形成。可以用有机碱或无机碱将含有羧基的通式(IIa)的化合物转化为其盐，具体转化为生理学上可接受的盐，用于药物用途。用于此目的的合适的碱包括，例如，钠盐、钾盐、精氨酸盐、铵盐、或乙醇胺盐。
肽
本发明还部分地基于以下出乎预料的发现，即mtDNA与VDAC1的相互作用需要VDAC1的N-末端结构域。N-末端结构域含有三个带正电荷的残基(K12、R15、K20)，其可以与mtDNA的带负电荷的骨架相互作用。事实上，与表达WT VDAC1的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)相比，表达N-末端或N-末端截短蛋白突变的VDAC1(ΔN-VDAC1)的小鼠胚胎成纤维细胞中ISG表达显著降低，表明N-末端结构域在与mtDNA相互作用和激活cGAS途径两者中的重要性。
根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是这样的肽，其衍生自或对应于人VDAC1 N-末端结构域(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基1-26并且包括：(a)相比于SEQ ID NO:1的一个或多个突变；(b)相比于SEQ ID NO:1的至少1个氨基酸的截短；或其任意组合，并且其中突变的、截短的或两者的VDAC抑制性肽缺乏促凋亡活性。
在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽不对细胞凋亡进行诱导、引发、传播、或其任意等同表达(equivalent)。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含至少1个突变，其中所述突变使所述肽具有抗凋亡性或非促凋亡性。
应理解，本发明包括具有1-25个氨基酸之间任意长度的肽，所述1-25个氨基酸衍生自或对应于人VDAC1 N-末端结构域的氨基酸残基1-26，例如衍生自或对应于人VDAC1N-末端结构域的氨基酸残基1-26的至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个氨基酸。
根据某些实施方式，所述肽包含8个氨基酸。根据其它实施方式，所述肽包含12个氨基酸。根据另外的实施方式，所述肽包含16个氨基酸。根据进一步的实施方式，所述肽包含22个氨基酸。
根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是包含衍生自人VDAC1 N-末端结构域的氨基酸残基1-26的连续序列的1-25个氨基酸的肽。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1相比，所述VDAC抑制性肽包含更少的氨基酸。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽是SEQ ID NO:1的截短形式。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1相比，所述VDAC抑制性肽包含一个或多个突变和至少2个氨基酸的截短。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含至少2、至少3、至少4、或至少5个突变，或其之间的任意值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:1相比，所述VDAC抑制性肽包含1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、或4-5个突变。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，所述突变位于所述VDAC抑制性肽的C'-末端的最后5个氨基酸中。在一些实施方式中，所述突变位于所述抑制性肽的C-末端处GXXXG基序(SEQ ID NO:3)中。在一些实施方式中，所述截短是所述VDAC抑制性肽的C'-末端处至少1、至少2、至少3、至少4、或至少5个氨基酸的省略或缺失，或其之间的任意值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，所述截短是所述VDAC抑制性肽的C'-末端处1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、或4-5个氨基酸的省略或缺失。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，所述截短是所述抑制性肽的C-末端处GXXXG基序(SEQ ID NO:3)的完全或部分的省略或缺失。如本文所用，“完全”是100％，例如，GXXXG基序的5个氨基酸全都从所述VDAC抑制性肽中缺失。如本文所用，部分地包含GXXXG基序的1-2、1-3、1-4、2-3、2-4、或3-4个氨基酸从所述VDAC抑制性肽中缺失。
在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：MAVPPTYADLGKSARDVFTKXYXFX(SEQ ID NO:2)，其中X是除甘氨酸以外的任意氨基酸。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7；或SEQ ID NO:8。
在一些实施方式中，所述VDAC抑制性肽包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID:9；SEQ ID:10；SEQ ID:11；SEQ ID:12或SEQ ID:13。
在一个实施方式中，本发明的肽包含调节VDAC1和mtDNA之间的相互作用的氨基酸序列。如本文所用，术语“调节”包括“提高”和“增加”或“降低”和“减少”。
本发明的另一目的是提供基于VDAC1 N-末端结构域的序列的短肽及其缀合物，所述短肽及其缀合物包含具有进一步提高的稳定性和细胞渗透性质的肽模拟物(peptidomimetic)化合物。这种化合物的非限制性实例包括所选择的肽残基的N-烷基化、所选择的肽残基的侧链修饰、非天然氨基酸、氨基甲酸酯、脲、磺酰胺和肼用于肽键取代、以及通过肽键或非肽键并入非肽部分，包括但不限于哌啶、哌嗪和吡咯烷。根据本发明的肽模拟物中氨基酸残基之间的修饰的键可以选自：酰胺、脲、氨基甲酸酯、肼或磺酰胺键。除非另有明确说明，否则氨基酸残基之间的键均是酰胺键。
酶促降解的稳定性是设计用作治疗剂的合成肽的重要因素。已知氨基酸的D-立体异构体对这种降解更稳定。
因此，根据某些实施方式，本发明的肽是L-立体异构肽，仅包含L-氨基酸。根据其它实施方式，所述肽是D-L立体异构肽，包含D-氨基酸和L-氨基酸的组合。根据又一实施方式，所述肽是D-立体异构肽，仅包含D-氨基酸。
根据某些实施方式，基于VDAC1 N-末端结构域的肽与通过直接的键或通过连接体共价连接至所述肽的渗透性增强部分缀合，形成肽缀合物。
根据本发明的渗透性增强部分可以连接至活性肽的C-末端游离基团。所述部分可以直接连接至肽或通过连接体或间隔体(spacer)连接。
主动或被动促进化合物对细胞的渗透性或增强化合物对细胞的渗透性的本领域已知的任何部分都可以用于与根据本发明的肽核心缀合。非限制性实例包括：疏水部分，如脂肪酸、类固醇和大体积芳香族或脂肪族化合物；可具有细胞膜受体或载体的部分，如类固醇、维生素和糖类、天然和非天然氨基酸、脂质体、纳米颗粒和转运肽。根据某些实施方式，渗透性增强部分是细胞穿透肽(CPP)。在一个示例性实施方式中，CPP是包含果蝇触角足(Drosophila antennapedia)(ANTP)结构域的氨基酸序列或其片段。在某些实施方式中，ANTP结构域包含SEQ ID NO:14中所列的氨基酸序列。根据这些实施方式，所述肽缀合物包含选自SEQ ID:14的氨基酸序列，在其前面是连续的SEQ IN No:2和4-13中的任意一个。
根据另外的示例性实施方式，CPP包含由人运铁蛋白受体(Tf)识别的TIR结构域的片段，其具有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16中所列的氨基酸序列。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。也可以使用本领域已知的其它CPP作为TAT。
沉默寡核苷酸
根据一些实施方式，所述VDAC抑制剂是VDAC1沉默寡核苷酸分子或包含其的构建体。任何VDAC1沉默寡核苷酸分子都可以用于本发明的方法中，只要所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO:17、与其所编码的mRNA分子或与和其互补的序列相同的至少15个连续核酸即可。
在一些实施方式中，所述VDAC1沉默寡核苷酸与SEQ ID NO:17相同至少14个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少15个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少16个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少17个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少18个连续核酸、与SEQ IDNO:17相同至少19个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少20个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少21个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少22个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少23个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少24个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少25个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少26个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少27个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少28个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同至少29个连续核酸、或与SEQID NO:17相同至少30个连续核酸，或其之间的任意值和范围。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，所述VDAC1沉默寡核苷酸与SEQ ID NO:17相同14至30个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同15至28个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同16至29个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同22至26个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同17至25个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同16至24个连续核酸、与SEQ ID NO:17相同24至30个连续核酸、与SEQ IDNO:17相同16至23个连续核酸、或与SEQ ID NO:17相同18至26个连续核酸。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
根据某些实施方式，所述VDAC1沉默寡核苷酸包含选自以下的核酸序列：SEQ IDNO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22；SEQ ID NO:23；SEQ IDNO:24；SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28，或其互补序列。
根据某些实施方式，所述VDAC1沉默寡核苷酸是RNA干扰(RNAi)分子或反义分子。根据一些实施方式，RNAi分子是未修饰的和/或修饰的双链(ds)RNA分子，包括但不限于小时序RNA(short-temporal RNA)(stRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、和微小RNA(miRNA)。
根据某些示例性实施方式，RNAi是siRNA。根据一些示例性实施方式，siRNA包含与SEQ ID NO:17的至少15个核苷酸或与其所编码的mRNA相同的第一寡核苷酸序列以及与所述第一寡核苷酸基本上互补的第二寡核苷酸序列；其中所述第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列彼此退火形成siRNA分子。
根据一些实施方式，siRNA是单链短发夹RNA(shRNA)，其中第一寡核苷酸序列与第二寡核苷酸序列通过连接体分开，该连接体在第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列退火时形成环结构。在一些实施方式中，连接体为约3至约60个核苷酸。
根据一些示例性实施方式，siRNA包含具有SEQ ID NO:18中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:31中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。
根据一些示例性实施方式，siRNA包含具有SEQ ID NO:19中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:26中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。
根据一些示例性实施方式，siRNA包含具有SEQ ID NO:20中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:27中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。
根据一些示例性实施方式，siRNA包含具有SEQ ID NO:25中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:28中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。
根据另外的实施方式，siRNA核酸中的至少一种被化学修饰。通常，所述修饰是鸟嘌呤或尿嘧啶的2'-O-甲基修饰。根据某些实施方式，RNAi的第一多核苷酸和第二多核苷酸包含若干化学修饰的鸟嘌呤和/或尿嘧啶核苷酸。
根据某些示例性实施方式，修饰的siRNA分子包含具有SEQ ID NO:29中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:30中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。
根据某些示例性实施方式，修饰的siRNA分子包含具有SEQ ID NO:32中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:33中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。
根据某些实施方式，所述方法包括向对象给予能够在所述对象的细胞中表达治疗有效量的至少一种VDAC1沉默寡核苷酸的构建体。根据一些实施方式，所述方法包括向对象给予能够表达包含选自SEQ ID No:18-25的核酸序列的至少一种寡核苷酸的构建体。根据一些实施方式，所述方法包括向对象给予能够表达包含SEQ ID No:26-28和31中任一个所列的核酸序列的siRNA分子的构建体。根据某些示例性实施方式，所述方法包括向对象给予能够表达siRNA寡核苷酸的构建体，所述siRNA寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:18中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:31中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。根据某些示例性实施方式，所述方法包括向对象给予能够表达siRNA寡核苷酸的构建体，所述siRNA寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:29中所列的核酸序列的第一寡核苷酸和具有SEQ ID NO:30中所列的核酸序列的第二寡核苷酸。
可以根据本领域已知的任何核酸合成方法，包括酶促合成和固相合成两者生成根据本发明的教导设计的沉默寡核苷酸分子。也可以采用用于这种合成的任何其它手段；核酸剂的实际合成完全在本领域技术人员的能力范围内，并且可以通过例如：Sambrook,J.和Russell,D.W.(2001),“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”；Ausubel,R.M.等人,eds.(1994,1989),“Current Protocols in Molecular Biology,”第I-III卷,JohnWiley&Sons,Baltimore,Maryland；Perbal,B.(1988),"A Practical Guide to MolecularCloning,"John Wiley&Sons,New York；和Gait,M.J.,ed.(1984),“OligonucleotideSynthesis”中详述的已建立的方法；利用固相化学，例如氰乙基亚磷酰胺，之后脱保护，脱盐，并通过例如自动化的基于三苯甲基的方法(trityl-on method)或HPLC纯化来完成。
将理解，本发明的核酸剂也可以利用如本文以下进一步描述的表达载体产生。
在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低mtDNA从线粒体释放至胞质溶胶的速率。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低胞质溶胶中mtDNA/片段(例如，cmtDNA)的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物维持线粒体中mtDNA/片段的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC寡聚的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC mRNA的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC mRNA的稳定性。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC蛋白的水平。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC蛋白合成的速率。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低VDAC蛋白的电导。在一些实施方式中，所述VDAC抑制性化合物降低1型干扰素信号传导的水平。术语“抑制”和“降低”在本文中可互换使用。
在一些实施方式中，术语“抑制”指代与对照相比降低至少5％、至少15％、至少25％、至少40％、至少50％、至少70％、至少85％、至少95％、至少97、至少99％、或100％，或其之间的任意值或范围。在一些实施方式中，抑制指代与对照相比降低5-15％、10-25％、20-40％、30-50％、45-70％、65-85％、80-95％、90-97、94-99％、或95-100％。每种可能性都代表本发明的单独实施方式。
药物组合物
本发明提供了药物组合物，其包含通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(IIa)的一种或多种化合物，诸如而不限于结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，具体是式1、2、3、10和11的特定化合物，或其对映异构体、非对映异构体、混合物或药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或稀释剂，任选地进一步包含一种或多种赋形剂，用于治疗选自1型干扰素介导的疾病和IBD的疾病。
本发明提供了药物组合物，其包含本文公开的VDAC抑制性肽和药学上可接受的载体或稀释剂，任选地进一步包含一种或多种赋形剂，用于治疗选自1型干扰素介导的疾病和IBD病的疾病。
本发明提供了药物组合物，其包含VDAC1沉默寡核苷酸和药学上可接受的载体或稀释剂，任选地进一步包含一种或多种赋形剂，用于治疗选自1型干扰素介导的疾病和IBD病的疾病。
根据某些实施方式，本发明的VDAC1沉默寡核苷酸分子，具体是siRNA分子被包封在适合于将siRNA递送至对其需要的对象中的作用位点的颗粒中。根据某些实施方式，siRNA被包封在聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)基纳米颗粒中。根据某些实施方式，PLGA基纳米颗粒进一步包含聚乙烯亚胺(PEI)，在本文中也被称为PEI-PLGA纳米颗粒。
本发明进一步提供了药物组合物，其包含未修饰的和修饰的本发明的VDAC1沉默寡核苷酸、包含其的颗粒、和一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。根据某些实施方式，所述组合物被配制用于局部、瘤内、静脉内或肺部给予。
术语“药学上可接受的”意为经联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其它普遍承认的药典中列出用于动物，更具体地用于人。
术语“载体”指代与治疗化合物一起给予的稀释剂、佐剂、或媒介物。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。
所述组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、贴剂、凝胶、膏状物、软膏、缓释制剂等形式。
所述药物组合物可以进一步包含药物赋形剂，包括但不限于润湿剂、乳化剂和pH调节剂。抗细菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；并且还设想了用于调节张力的剂，如氯化钠或右旋糖。
对于治疗化合物的静脉内给予，水是优选的载体。也可以采用盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油水溶液。也可以使用缓冲剂。
用于肠胃外给予的药物组合物也可以配制成活性化合物的悬浮液。这种悬浮液可以制备成油性注射悬浮液或水性注射悬浮液。对于油性悬浮液注射，可以使用合适的亲脂性溶剂或媒介物，包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液黏度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的剂，从而允许制备高浓缩溶液。
对于经粘膜和经皮给予，可以在制剂中使用适合于待对屏障进行渗透的渗透剂。这种渗透剂，包括例如DMSO或聚乙二醇，是本领域已知的。
对于口服给予，可容易地通过将活性化合物与本领域公知的药学上可接受的载体和赋形剂组合来配制所述化合物。这些载体使得本发明的化合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等供对象口服摄入。可以使用固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并在添加合适的助剂(如果需要的话)后对颗粒混合物进行处理，以获得片剂或糖衣丸芯来制备口服使用的药理学制剂。合适的赋形剂具体是填充剂，如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨糖醇；纤维素制剂，如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。
另外，如果期望防止本发明的化合物暴露于胃环境，则可以使用肠溶衣。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推合胶囊(push-fit capsules)以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软质密封胶囊。推合胶囊可以包含与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。
在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇中。另外，可以添加稳定剂。
通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(IIa)，具体是结构式1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的化合物，更具体是式1、2、3、10和11的特定化合物及其药学上可接受的盐可以配制成纳米颗粒。纳米颗粒可以在公知的聚合物，例如聚乳酸-共-乙醇酸中制备。通常，所述化合物可以与所述聚合物共同溶解在合适的有机溶剂中，然后可以将有机相分散在包含稳定剂和/或表面活性剂的水相中。稳定剂可以是例如聚乙烯醇。在有机溶剂从水相中蒸发后，纳米颗粒可以被纯化，例如通过离心和洗涤。
根据一些实施方式，所述药物组合物包含根据本发明的VDAC1基的肽和屏蔽颗粒(保护颗粒，shielding particle)。在某些实施方式中，屏蔽颗粒包含聚乙二醇(PEG)和/或脂质。
根据一些实施方式，所述VDAC1沉默寡核苷酸分子被包封在聚乙烯亚胺(PEI)-聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)纳米颗粒内。
所述组合物可以与常规的粘合剂和载体，如甘油三酯、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶一起配制成栓剂。
可以根据本领域，例如Remington,The Science and Practice of Pharmacy(先前被称为Remington’s Pharmaceutical Sciences)，ISBN 978-0-85711-062-6提供的一般指导，通过本领域公知的方法，例如通过常规的混合、溶解、造粒、研磨、磨碎、糖衣丸制造、研碎、乳化、包封、包埋或冻干方法制造本发明的药物组合物。
待给予的组合物的剂量将取决于多种因素，包括被治疗的对象、IBD病的阶段、给予途径、和处方医师的判断。
本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种已知治疗IBD病或与其相关的一种或多种症状的活性剂。
治疗用途
本发明提供了用于减慢NETosis相关疾病或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗NETosis相关疾病或与其相关的一种或多种症状的方法，包括向需要这种治疗的对象给予VDAC1抑制性化合物或包含其的药物组合物，从而减慢NETosis相关疾病或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗NETosis相关疾病或与其相关的一种或多种症状。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括选择适合使用VDAC1抑制性化合物治疗本文公开的疾病的对象的步骤。在一些实施方式中，与对照相比，合适的对象具有增加水平的：NET(即，NETosis)、胞质溶胶mtDNA、或其任意组合。
用于测定NETosis和胞质溶胶mtDNA水平的方法对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。
NET的定量和可视化的方案的非限制性实例如下：在例如正常密度的粒细胞中诱导NET，通过在RPMI 1640培养基中将该细胞与钙离子载体A23187(25μM)一起孵育2h，然后使用SYTOX荧光染料在485/520nm下对胞外DNA定量来对NET进行定量。在485/520nm下测量例如t＝0min的PicoGreen的荧光(发射/消光)，以对总DNA定量。NET定量的另一非限制性实例包括荧光显微术。简而言之，将细胞附着在盖玻片室上，在37℃下用钙离子载体刺激90min，在4℃下用4％多聚甲醛固定过夜，并用0.2％Triton X-100透化10min，之后0.5％明胶20min。然后在室温下用抗人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抗体对细胞染色2h，在PBS中洗涤，并用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488二抗在室温下染色2h。封固后，通过共聚焦显微镜对细胞可视化。
不希望受任何理论或作用机制的束缚，通式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(IIa)的化合物，具体是具有式1的化合物(VIBIT-4)抑制VDAC寡聚、mtDNA释放、和嗜中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps)(NETs)的能力有助于其在治疗IBD(例如克罗恩病和UC)中的治疗效果。
如本文所用，术语“mtDNA”包括完整的mtDNA、其片段、或其组合。
在一些实施方式中，所述方法涉及减少或抑制mtDNA或其片段从线粒体中泄漏。在一些实施方式中，所述方法涉及减少循环mtDNA的量或水平。在一些实施方式中，所述方法涉及抑制或减少线粒体的基质或嵴内空间(intra-cristae space)、线粒体的***空间或两者、胞质、胞外环境、循环(例如，血液、血清)、或其任意组合中mtDNA/片段的量或水平。在一些实施方式中，IBD或障碍包括mtDNA/片段泄漏。
如本文所用，术语“嵴内空间”指代在线粒体内膜的嵴内形成的空间。如本文所用，术语“***空间”指代在线粒体内膜和外膜之间形成的空间。
用于测定mtDNA泄漏或循环mtDNA的量或水平的方法是常见的并且对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。用于测定循环mtDNA/片段泄漏的量的方法的非限制性实例在下文示例，并且包括但不限于实时定量PCR和特异性引物的使用。
在一些实施方式中，提供了用于降低循环mtDNA/片段的量或水平的组合物，其中循环在胞质、胞外环境、循环(例如，血液、血清)、或其任意组合中。
在一些实施方式中，所述方法涉及通过向具有增加的循环mtDNA/片段量或水平的对象给予治疗有效量的VDAC抑制剂或包含其的组合物来治疗IBD。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的术语“VDAC”指代高度保守的线粒体孔蛋白家族的电压依赖性阴离子通道蛋白。该术语指代所有VDAC同种型，例如指代同种型VDAC1、指代同种型VDAC2、或指代同种型VDAC3。
在一些实施方式中，本发明提供了用于减慢IBD或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗IBD或与其相关的一种或多种症状的方法，包括向需要这种治疗的对象给予VDAC抑制性化合物或包含其的药物组合物，从而减慢IBD或与其相关的一种或多种症状的进展或治疗IBD或与其相关的一种或多种症状。
症状和严重程度可以变化，并且包括以下一种或多种：通常与IBD突然发作(flare-ups)并行的障碍、明显与IBD相关但似乎独立于IBD活动的障碍、以及肠生理紊乱导致的障碍。
通常与IBD突然发作并行的障碍的非限制性实例包括但不限于：外周关节炎、巩膜外层炎、口疮性口炎、和结节性红斑。关节炎趋向于涉及大关节，并且具有迁移性和暂时性。多于三分之一的IBD住院患者中发展了这些并行障碍中的一种或多种。
明显与IBD相关但似乎独立于IBD活动的障碍的非限制性实例包括但不限于：强直性脊柱炎、骶髂关节炎、眼葡萄膜炎、坏疽性脓皮症、原发性硬化性胆管炎、桥本甲状腺炎(Hashimoto-Thyreoiditis)、类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩病、肉样瘤病(肺)、和deQuervain肉芽肿性甲状腺炎(granulomat thyreoiditis de Quervain)。强直性脊柱炎多见于具有HLA-B27抗原的IBD患者。大多数脊柱或骶髂关节受累(sacroiliac involvement)的患者有眼葡萄膜炎的证据，反之亦然。原发性硬化性胆管炎(其是胆道癌的危险因素)与UC或克罗恩结肠炎密切相关。胆管炎可在肠病之前或同时出现，或者甚至在结肠切除术后20年出现。肝病(例如，脂肪肝、自身免疫性肝炎、胆管周围炎、肝硬化)发生在3％至5％的患者中，但是肝功能测试中的轻微异常更为常见。这些状况中的一些(例如，原发性硬化性胆管炎)可以在IBD之前很多年发生，在诊断时，应及时对IBD进行评估。
肠生理紊乱导致的障碍的非限制性实例主要发生在严重的小肠克罗恩病中，并且包括但不限于可能由广泛的回肠切除术引起并导致脂溶性维生素、维生素B12、或矿物质缺乏，从而导致贫血、低钙血症、低镁血症、凝血障碍、和骨脱矿质的吸收障碍。在儿童中，吸收障碍阻碍生长和发育。其它障碍包括饮食性草酸盐吸收过多引起的肾结石、肠道炎症过程对输尿管压迫引起的输尿管积水和肾积水、回肠对胆汁盐的重吸收受损引起的胆结石、以及继发于长期炎症和化脓性疾病的淀粉样变性病。
所有3种类别(即，通常与IBD突然发作并行的障碍、明显与IBD相关但似乎独立于IBD活动的障碍、以及肠生理紊乱导致的障碍)中的多种因素可导致血栓栓塞性疾病发生。
根据本发明的一个实施方式，IBD是克罗恩病。根据另一实施方式，IBD是溃疡性结肠炎(UC)。根据一些实施方式，IBD是NETosis依赖性疾病。根据一些实施方式，IBD是NETosis依赖性炎性疾病。
本文所用的术语“NETosis相关疾病”指代任何炎性疾病或障碍，包括在嗜中性粒细胞死亡后嗜中性粒细胞胞外陷阱的释放。
要通过本发明的方法治疗的对象是选自以下的人对象：患有所述疾病的患者；患有所述疾病的患者，其中所述患者处于缓解期；患有所述疾病的患者，所述患者已表现出与所述疾病相关的症状；及其任意组合。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括选择适合使用本发明的VDAC抑制性化合物治疗的对象的步骤，其中选择包括确定对象与健康对照相比具有增加的VDAC1表达水平。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括用于监测对象的治疗的有效性或进展的步骤，其中监测包括确定治疗的对象与未治疗的对照相比具有降低的VDAC1表达水平。如本文所用，未治疗的对照包括未给予本发明的VDAC抑制性化合物的上文所公开的患病对象或在用本发明的VDAC抑制性化合物治疗之前的患病对象。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括选择适合使用本发明的VDAC抑制性化合物治疗的对象的步骤，其中选择包括确定对象与健康对照相比具有增加的NETosis。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括监测对象的治疗的有效性或进展的步骤，其中监测包括确定治疗的对象与未治疗的对照相比具有降低的NETosis。如本文所用，未治疗的对照包括未给予本发明的VDAC抑制性化合物的上文所公开的患病对象或在用本发明的VDAC抑制性化合物治疗之前的患病对象。
本领域技术人员将理解，以上列举的IBD与严重的症状相关，即使在隐晦的疾病可能未被改善的情况下，这些严重症状的改善也会提供显著的治疗益处。本发明的方法用于治疗和/或预防与以上列举的IBD相关的多种不良症状。
本文关于本发明的化合物所用的术语“治疗有效量”是化合物当向对象给予时将具有预期治疗效果(例如改善与IBD相关的症状(一种或多种))的量。完全的治疗效果不一定通过给予一种剂量出现，而可能仅在给予一系列剂量后才出现。因此，治疗有效量可以以一种或多种剂量来给予。对象所需的精确有效量将取决于例如对象的体重、健康和年龄、IBD的性质、具体IBD症状的程度和严重性、本发明的药物组合物的给予模式，以及任选地，本发明的药物组合物与另外的活性剂(一种或多种)的组合。
本文所用的术语“治疗”指代抑制疾病状态，即，阻止疾病状态或其临床症状的发展，或缓解疾病状态，即，导致疾病状态或其临床症状的暂时或永久消退。该术语可以与以下任一种或多种互换：废除、改善、抑制、减弱、阻断、阻抑、减少、停止、减轻或预防疾病或与疾病相关的任何症状。
本文所用的术语“预防”意为在可能暴露于或易患疾病状态但尚未经历或表现出疾病状态的症状的对象中不引起疾病状态的临床症状发展。
动物模型可用作评估IBD治疗的资源。
实现疾病治疗所需的VDAC抑制性化合物的剂量通常取决于将要给予的化合物的药代动力学和药效学性质、患者、疾病的性质、和给予途径。这种化合物的合适剂量范围可以为1.0至100mg/kg体重。
根据一些实施方式，本发明的方法涉及使嗜中性粒细胞与以相比预处理水平有效减少线粒体DNA释放和/或NET形成至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多的量的本发明的一种或多种化合物或包含其的药物组合物接触。
在审查以下不旨在是限制性的实例后，本发明的另外目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见。另外，以上描述的和以下权利要求部分要求保护的本发明的各种实施方式和方面中的每一个都在以下实施例中找到实验支持。
应理解，为清楚起见，在单独实施方式的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的背景下描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合或适用于本发明的任意其它描述的实施方式的方式来提供。在各种实施方式的背景下描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有那些要素的情况下无法操作。
实施例
材料和方法
试剂和制剂
葡聚糖硫酸钠，MP Biomedicals，MW:36-50kDa，目录号#0216011010通过以下制备：用饮用水(2.5克/100ml)适当稀释一次达到2.5％(w/v)的浓度，并且量足以满足适当填充指定测试组的水瓶的要求，本文规定的测试组：VBIT-4VBIT-12，由ChemPartner合成(>95％纯度)。兔单克隆抗VDAC1(Abcam ab154856,1:500)、兔单克隆抗Ki67(RM-9106-s1,1:100)、胱天蛋白酶-3(Cell Signaling Technology,1:300)。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的的抗小鼠、抗兔和抗山羊抗体来自KPL(Gaithersburg,MD)。3,3-二氨基联苯胺(DAB)获自(ImmPact-DAB,Burlingame,CA)。组织阵列载玻片购自Biomax(Derwood,US Biomax)。
实验动物
健康的雌性，无特定病原体(SPF)，C57BL/6(H-2b)的6-7周龄小鼠获自以色列Invigo。根据机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)批准的实验协定保持动物居住和护理条件。对小鼠称重并检查健康。
动物被随意提供商业啮齿类动物的饮食，并且相应的指定的测试组自由获得常规或含有DSS的饮用水——通过带有不锈钢吸管的聚乙烯瓶向每个笼子供应。
IBD小鼠模型–研究计划
利用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎。这些小鼠的肠细胞增殖增加，表明肠道ATP水平增加(这是mtDNA多态性导致的)导致肠上皮更替率(turnover rate)激增——这是暴露于苛刻条件和有害激发(如DSS)后上皮更新的重要过程。
结肠炎诱导
通过在饮用水中提供DSS，连续地随意供应6天，随后是8天的常规饮用水，直至第14天研究终止来对所有动物进行实验性结肠炎诱导(图1A)。
检查和观察
体重
小鼠个体体重的测定在疾病诱导之前和之后每天进行一次，从研究第0天开始直至第14天存活者的预定安乐死时间。
临床体征、发病率和死亡检查
观察动物，并从研究第1天开始每天记录临床体征一次，持续到预定的安乐死时间为止。根据以下列出的分级***对临床体征的评价进行评分。
表1.得分
Figure BDA0003177871630000271
研究终止
安乐死–在研究结束时，通过CO2窒息对存活的动物实施安乐死。
结肠长度和重量测量–安乐死后立即将回肠-盲肠连接处到***的整个大肠移除，称重并使用尺子测量结肠的长度。
计算平均最高得分(MMS)
将各组所有小鼠的最高得分相加，并如下计算MMS：
Figure BDA0003177871630000272
计算组平均得分(GMS)
将每组中所有鼠的最高得分相加，并如下计算该组的平均最高得分和％活性：
Figure BDA0003177871630000273
计算结肠长度
计算每组的平均结肠长度，并如下计算结肠缩短的百分比：
Figure BDA0003177871630000274
Figure BDA0003177871630000275
计算盲肠长度
计算每组的平均盲肠长度，并如下计算盲肠缩短的百分比：
Figure BDA0003177871630000281
Figure BDA0003177871630000282
组织培养
使来自BALB/c小鼠(CT26)的鼠结直肠癌细胞系和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞系在37℃下，在95％空气和5％CO2的气氛下，在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1,000U/ml青霉素和1mg/ml链霉素的DMEM中生长。
H2O2诱导mtDNA从细胞释放
将细胞接种(150,000个细胞/孔)在6孔培养皿中至40-60％汇合(confluence)。24h后，在VBIT-4和VBIT-12存在或不存在的情况下，将细胞与100或200μM的H2O2孵育20h。
对于VDAC1沉默，将CT-26细胞接种(150,000个细胞/孔)在6孔培养皿中至40-60％汇合。24h后，根据制造商的说明书，使用JetPRIME转染试剂，用75nM的非靶向siRNA(si-NT)或识别人和小鼠VDAC1两者的靶向VDAC1的siRNA(si-m/hVDAC1)转染细胞。用si-NT或si-m/hVDAC1转染后四十八(48)h，将细胞与100μM的H2O2孵育20h。洗涤细胞并经历如下所述的mtDNA释放。
mtDNA释放的定量
将细胞(例如，CT-26、MFF)重悬在含有150mM NaCl、50mM HEPES pH 7.4和25μg/ml毛地黄皂苷(EMD Millipore Corp)的170μl毛地黄皂苷缓冲液中。将匀浆在室温下在旋转器上孵育10min，之后在4℃下以16,000g离心25min。上清液(cmtDNA)的1:20稀释液用于实时RT-PCR。将沉淀重悬于340μl含有5mM EDTA和蛋白酶K(Qiagen)的裂解缓冲液中，并在55℃下孵育过夜。消化后的沉淀用水稀释(1:20至1:100)，并在95℃下加热20min钝化蛋白酶K，并将样品用于实时PCR。使用的引物如下(5’-3’)：D-环3正向(SEQ ID NO:34)和反向(SEQID NO:35)。上清液中的cmtDNA被标准化为由线粒体DNA编码的总Cox-II。
为了对从小鼠获得的血清中的mtDNA定量，根据制造商的说明书，使用DNeasy组织和血液试剂盒(QIAGEN，目录号51104)，从获自对照小鼠、在2％DSS处理开始后用VBIT-12(20mg/kg)在第2天(VBIT-12-2)或第5天(VBIT-12-5)开始处理和不处理或用***(DEXA,0.5mg/kg)处理的经DSS处理的小鼠的血清中提取DNA。用5ng的总DNA，通过qPCR和用于D-环区域的mtDNA特异性引物：正向引物(SEQ ID NO:34)和反向引物(SEQ ID NO:35)检测mtDNA。结果是关于细胞色素c氧化酶亚基2(Cox-II)进行标准化的，并表示为相对于对照小鼠血浆中mtDNA水平的变化倍数。
免疫组织化学(IHC)
在获自Biomax US(CO245 D5,https://www.biomax.us/CO245 D5)的组织微阵列载玻片上进行VDAC1的免疫组织化学染色。该阵列含有来自以下的结肠切片：健康(4个样品)、慢性结肠粘膜炎——也代表炎症(4个样品)、慢性溃疡性结肠炎——也代表炎症(4个样品)、回盲连接的克罗恩病——也代表炎症(4个)、和代表恶性肿瘤的腺癌(4个)。人自身免疫组织微阵列来自Provitro(Provitro GmbH，目录号：401 3301)。该阵列包含桥本甲状腺炎(6个样品，甲状腺)、类风湿性关节炎(2个样品，滑膜)、牛皮癣(2个样品，滑膜)、克罗恩病(2个样品，Sigma)、肉样瘤病(2个样品肺)、de Quervain肉芽肿性甲状腺炎(2个样品，甲状腺)、和健康组织。
在4℃下将组织的代表性切片与在PBS中的1％BSA中稀释的抗VDAC1抗体一起孵育过夜，然后与在PBS中的1％BSA中稀释的二抗一起孵育。随后用3’3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)处理载玻片并用苏木精进行复染。阴性对照在没有一抗的情况下孵育。在奥林巴斯显微镜下观察组织的切片，并在相同的光强度和曝光时间下以200×放大率拍摄图像。使用全景显微镜和HistoQuant软件(Quant Center 2.0软件，3DHISTECH Ltd)对所提供的切片的整个区域中VDAC1表达水平进行定量，如染色强度所反映。
TUNEL测定
根据制造商的说明书，使用DeadEnd Fluorometric TUNEL***(Promega,Madison,WI)处理石蜡中的固定结肠切片用于TUNEL测定。对切片脱蜡，在PBS中平衡，用蛋白酶K(PBS中20μg/ml)透化，在4％多聚甲醛中后固定，并在黑暗下在TdT反应混合物中于37℃下孵育1h。然后在盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液中洗涤载玻片并用PI(1μg/ml)进行复染。用Vectashield封固介质(Vector Laboratories,Burigame,CA)封固后，利用共聚焦显微镜(Olympus IX81)采集图像。
实施例1
VDAC抑制剂对DSS诱导的IBD小鼠的影响
发现VDAC-1特异性抑制剂在小鼠模型中改善了IBD的一些较严重的临床表现。发现DSS诱导的IBD小鼠体重减轻(图2；表2)和存活率差(图3；表3)。给予VDAC-1抑制剂(例如，VBIT-4，并且尤其是VBIT-12)的DSS诱导的IBD小鼠显示出具有较高的体重(图2；表2)和提高的存活率(图3；表3)两者，在实验终止时，类似于非IBD对照。
表2.VDAC抑制剂对DSS诱导的IBD小鼠的体重的影响
Figure BDA0003177871630000291
Figure BDA0003177871630000301
*3只小鼠死亡
表3.VDAC抑制剂对DSS诱导的IBD小鼠的存活的影响。
Figure BDA0003177871630000302
另外，显示VDAC抑制剂降低作为IBD标志的结肠缩短的％。相对于从DSS诱导的IBD小鼠解剖的结肠，发现经处理的动物具有显著更长的结肠(图4A-图4B；表4)。
表4.VDAC抑制剂对DSS诱导的IBD小鼠的结肠长度的影响。
Figure BDA0003177871630000303
对IBD小鼠的粪便稠度和直肠出血的检查表明，后者遭受更严重的血性腹泻等，如3以上的MMS值所反映(表5)。此外，在大部分实验中，与IBD小鼠相比，两个处理组的GMS更低(图5)。
表5.VDAC抑制剂对DSS诱导的IBD小鼠的MMS的影响。
Figure BDA0003177871630000304
使用标准组织学染色(图6和图7)和免疫染色(图8)对组织深度观察，显示IBD小鼠的结肠壁明显更厚，其绒毛比非IBD对照的绒毛更大。还发现IBD结肠含有大的淋巴囊(lymphatic sacks)，并且还经历了炎症细胞向结肠腔的高度浸润。相反，发现VBIT-4处理的小鼠与IBD小鼠相比具有更薄的结肠壁，即更小的绒毛(与非IBD小鼠的相当)，并且似乎也容纳更少的浸润活性减小/无浸润活性的炎症细胞(图6-图8)。在所有进行的组织学检查中，无法将用VBIT-12处理的小鼠与非IBD对照进行区分(图6-图8)。
通过每天向DSS-小鼠强饲一次或两次所给予的VBIT-12的效果显示，给予两次对结肠长度以及对脾的效果更好(图9)。分析各组的脾重量，显示VBIT-12将DSS处理的组中的增加的重量降低至接近对照DSS未处理的对照组的重量(图9)。脾重量的增加通常与炎症和贫血的程度相关。
细胞增殖标记物Ki-67的表达，如IHC染色所示，在DSS处理的小鼠中高度增加，而通过VBIT-12处理降低至对照小鼠的水平(图10)。
在DSS处理的小鼠的结肠切片中对胱天蛋白酶-3IHC染色显示胱天蛋白酶3水平增加(图11A-图11F)，反映细胞凋亡增加，如TUNEL染色进一步所证明(图11G-图11L)。在用VBIT-12处理的DSS-小鼠中，胱天蛋白酶-3水平和TUNEL染色均高度降低。
实施例2
VDAC1在结肠病理学状况下过表达
发明人利用免疫组织化学(IHC)检查VDAC1蛋白表达。简而言之，对获自健康、慢性结肠粘膜炎、慢性溃疡性结肠炎和回盲连接的克罗恩病，也代表炎症，也代表超常增生和结肠癌——腺癌的结肠组织切片的VDAC1进行IHC染色。IHC显示VDAC1表达水平的高度提高(图12)。定量分析显示，在这些病理学状况下VDAC1的水平提高30倍至55倍(图12Q)。
还使用人自身免疫疾病的组织微阵列分析其它自身免疫疾病的VDAC1表达，其中组织显示在括号中。这些包括：桥本甲状腺炎(甲状腺)、类风湿性关节炎(滑膜)、牛皮癣(滑膜)、克罗恩病(Sigma)、肉样瘤病(肺)、和肉芽肿。来自健康和疾病组织的代表性图像，使用抗VDAC1抗体对VDAC1进行IHC染色。还呈现了定量分析(图13)。
实施例3
使用和不使用VBIT-12处理的DSS处理的小鼠的血清中线粒体DNA水平
发明人检查了在常规IBD模型生物体的循环中是否存在提高的mtDNA水平。结果显示，补充有DSS的小鼠(例如，诱导的IBD模型)的mtDNA血清水平提高，与对照相比提高约5.5倍。进一步，发明人显示当在初始DSS补充后2天给予时，VBIT-12给予将mtDNA血清水平降低至与对照DSS未处理的小鼠相当的mtDNA血清水平，达到对照DSS未处理的小鼠的水平(图14)。在DSS处理后5天开始给予VBIT-12导致mtDNA血清水平降低～40％。
实施例4
VDAC抑制剂减少mtDNA从不同细胞类型中释放
发明人进一步检查了培养的CT-26、来自BALB/c小鼠的鼠结直肠癌细胞系和MEF(鼠胚胎成纤维细胞)中由H2O2诱导的mtDNA的释放是否被VBIT-12抑制。简而言之，将细胞接种(150,000个细胞/孔)在6孔培养皿中至40-60％汇合。24h后，在VBIT-4或VBIT-12(20μM)存在或不存在的情况下，将细胞与100或200μM的H2O2孵育20h。洗涤细胞并经历如本文所述的mtDNA释放。结果显示VBIT-4和VBIT-12抑制了由H2O2诱导的mtDNA从培养细胞中释放(图15)。
为了测试H2O2诱导的mtDNA释放对VDAC1的需要，检查了H2O2诱导的mtDNA从表达VDAC1和利用识别人和鼠VDAC1两者的VDAC1特异性siRNA(si-m/hVDAC1)而缺乏VDAC1的C26细胞的释放，(图16)。在表达VDAC1的细胞中获得了H2O2诱导的mtDNA的释放，但在缺乏VDAC1的细胞中并未获得(图16)。
尽管本文已描述了本发明的某些特征，但是多种修改、替换、改变和等同方案现对于本领域普通技术人员都将是可以想到的。因此，应理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这种修改和改变。
序列表
<110> 国家生物技术研究所公司
<120> 用于治疗炎症性肠病的VDAC抑制剂
<130> NIBN-P-030-PCT
<150> 62/771,213
<151> 2018-11-26
<160> 35
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
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20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
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<223> 其中 X 是除甘氨酸外的任意氨基酸
<220>
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<223> 其中 X 是除甘氨酸外的任意氨基酸
<220>
<221> X
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<223> 其中 X 是除甘氨酸外的任意氨基酸
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20 25
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<223> 其中 X 是除甘氨酸外的任意氨基酸
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<221> X
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<223> 其中 X 是除甘氨酸外的任意氨基酸
<220>
<221> X
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<223> 其中 X 是除甘氨酸外的任意氨基酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Lys
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<211> 7
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<400> 16
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1 5
<210> 17
<211> 1993
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
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gagcgctgcc actggggccg aggtttccag caagaacccg cgtgtccctg cgcacgcaca 120
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acaagaagtt ggagaccgct gtcaatcttg cctggacagc aggaaacagt aacacgcgct 900
tcggaatagc agccaagtat cagattgacc ctgacgcctg cttctcggct aaagtgaaca 960
actccagcct gataggttta ggatacactc agactctaaa gccaggtatt aaactgacac 1020
tgtcagctct tctggatggc aagaacgtca atgctggtgg ccacaagctt ggtctaggac 1080
tggaatttca agcataaatg aatactgtac aattgtttaa ttttaaacta ttttgcagca 1140
tagctacctt cagaatttag tgtatctttt aatgttgtat gtctgggatg caagtattgc 1200
taaatatgtt agccctccag gttaaagttg attcagcttt aagatgttac ccttccagag 1260
gtacagaaga aacctatttc caaaaaaggt cctttcagtg gtagactcgg ggagaacttg 1320
gtggcccctt tgagatgcca ggtttctttt ttatctagaa atggctgcaa gtggaagcgg 1380
ataatatgta ggcactttgt aaattcatat tgagtaaatg aatgaaattg tgatttcctg 1440
agaatcgaac cttggttccc taaccctaat tgatgagagg ctcgctgctt gatggtgtgt 1500
acaaactcac ctgaatggga cttttttaga cagatcttca tgacctgttc ccaccccagt 1560
tcatcatcat ctcttttaca ccaaaaggtc tgcagggtgt ggtaactgtt tcttttgtgc 1620
cattttgggg tggagaaggt ggatgtgatg aagccaataa ttcaggactt attccttctt 1680
gtgttgtgtt tttttttggc ccttgcacca gagtatgaaa tagcttccag gagctccagc 1740
tataagcttg gaagtgtctg tgtgattgta atcacatggt gacaacactc agaatctaaa 1800
ttggacttct gttgtattct caccactcaa tttgtttttt agcagtttaa tgggtacatt 1860
ttagagtctt ccattttgtt ggaattagat cctccccttc aaatgctgta attaacaaca 1920
cttaaaaaac ttgaataaaa tattgaaacc tcatccttct tctgttgtct ttattaataa 1980
aatataaata aac 1993
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
acacuaggca ccgagauua 19
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
gggcuaugga uuuggcuua 19
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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gcuuggucua ggacuggaa 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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aagcugaccu ucgauucau 19
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 22
gaaugacggg acagaguuu 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
ucggaauagc agccaagua 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
cucuucugga uggcaagaa 19
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
gaauagcagc caaguaucag 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
uaagccaaau ccauagccc 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
uuccaguccu agaccaagc 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
ugauacuugg cugcuauuc 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (5)..(5)
<223> um
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (8)..(8)
<223> gm
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (13)..(13)
<223> gm
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<221> 修饰的_碱基
<222> (17)..(17)
<223> um
<400> 29
acacuaggca ccgagauua 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (6)..(6)
<223> um
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (16)..(16)
<223> gm
<400> 30
uaaucucggu gccuagugu 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
uaaucucggu gccuagugu 19
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> um或尿嘧啶
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (14)..(14)
<223> gm
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (17)..(17)
<223> um或尿嘧啶
<400> 32
gaauagcagc caaguaucag tt 22
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<221> 修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> um
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (13)..(13)
<223> gm
<400> 33
ugauacuugg cugcuauuct t 21
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
tcctccgtga aaccaacaa 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
agcgagaaga ggggcatt 18

Claims (29)

1.用于减慢炎症性肠病(IBD)的进展或治疗炎症性肠病的方法，包括向需要这种治疗的对象给予包含治疗有效量的VDAC抑制性化合物的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述VADC抑制性化合物具有通式(I)：
式(I)
Figure FDA0003177871620000011
其中：
A是碳(C)或氮(N)；
R3不存在、是氢、未取代的或取代的酰胺、或包含除氢原子外3-12个原子的杂烷基，其中所述3-12个原子中的至少一个是氮、硫或氧，其中当A是氮(N)时，R3不存在；
L1不存在或者是氨基连接基团–NR4–，其中R4是氢、C1-5-烷基、C1-5-亚烷基或取代的烷基–CH2R，其中R是选自以下的官能团：氢、卤基、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基和杂芳基；
R1是芳族部分，其任选地被Z中的一个或多个取代；
Z在每次出现时独立地是选自以下的官能团：氢、卤基、卤代烷基、卤代烷氧基、全卤代烷氧基或C1-2-全氟烷氧基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基和杂芳基；
L2是连接基团，使得当A是氮(N)时，L2是由除氢原子外4-10个原子组成的基团，任选地形成环，其中所述原子中的至少一个是氮，所述氮形成酰胺基团的部分；并且当A是碳(C)时，L2选自C1-4亚烷基或由除氢原子外4-10个原子组成的基团，任选地形成环，其中所述原子中的至少一个是氮，所述氮形成酰胺基团的部分；
R2是任选地被卤素取代的苯基或萘基；
或是其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
3.根据权利要求2所述的方法，其中A是氮(N)，并且所述连接基团L2选自C4-6-烷基亚酰胺基和亚吡咯烷基，所述连接基团任选地被包括烷基、羟基、氧基或硫代基团的取代基取代。
4.根据权利要求2和3中任一项所述的方法，其中L2选自丁亚酰胺基、N-甲基丁亚酰胺基、N,N-二甲基丁亚酰胺基、4-羟基丁亚酰胺基、4-氧基丁亚酰胺基、4-羟基-N-甲基丁亚酰胺基、4-氧基-N-甲基丁亚酰胺基、2-吡咯烷酮基、吡咯烷-2,5-二酮基、5-硫代-2-亚吡咯烷酮基和5-甲氧基-2-亚吡咯烷酮基。
5.根据权利要求3和4中任一项所述的方法，其中当L2是丁亚酰胺基、N-甲基丁亚酰胺基、N,N-二甲基丁亚酰胺基、4-羟基丁亚酰胺基、4-氧基丁亚酰胺基、4-羟基-N-甲基丁亚酰胺基或4-氧基-N-甲基丁亚酰胺基时，丁酰胺部分的第3位的碳(C)键合，并且所述丁酰胺部分的氮(N)键合至R2；或其中当L2是2-吡咯烷酮、吡咯烷-2,5-二酮、5-硫代-2-吡咯烷酮或5-甲氧基-2-吡咯烷酮时，吡咯烷部分的碳(C)键合至哌嗪环的氮(N)，并且所述吡咯烷部分的氮(N)键合至R2。
6.根据权利要求2所述的方法，其中A是碳(C)，R3是取代的酰胺基团，并且L2是亚甲基。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物具有通式(Ia)：
Figure FDA0003177871620000021
其中：
A、R3、Z和L1如权利要求2中所定义，
L2'是选自C4-烷基亚酰胺基、C5-烷基亚酰胺基和C6-烷基亚酰胺基的连接基团，任选地被烷基、羟基、氧基或硫代基团中的一个或两个取代；并且
Y是卤素；
或是其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其中烷基亚酰胺基L2'的第3位的碳(C)键合至哌嗪环的或哌啶环的氮(N)，并且所述烷基亚酰胺基L2’的氮(N)键合至所述苯基。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物具有通式(Ib)：
Figure FDA0003177871620000031
其中：
A、R3和Z如权利要求2中所定义，
L1不存在；
L2"是亚吡咯烷基连接基团，任选地被烷基、羟基、氧基或硫代基团中的一个或两个取代；
Y是卤素；
或是其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其中L2"选自2-亚吡咯烷酮基、吡咯烷-2,5-二酮基、5-硫代-2-亚吡咯烷酮基和5-甲氧基-2-亚吡咯烷酮基。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中吡咯烷基部分L2"的碳(C)原子键合至哌嗪环或哌啶环的氮(N)，并且所述吡咯烷基部分的氮(N)键合至所述苯基。
12.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物具有通式(Ic)：
Figure FDA0003177871620000041
其中：
A、R3和Z如权利要求2中所定义；
L1是–NH–；
Y1和Y2各自独立地不存在或是卤素；
或是其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
13.根据权利要求12所述的方法，其中R3是-C(O)NHCH2C(O)OH基团。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中Z是C1-2-烷氧基或C1-2-全氟烷氧基。
15.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物具有通式(Id)：
Figure FDA0003177871620000042
其中
Z是C1-2-全氟烷氧基，并且Y是卤素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述化合物具有式1：
Figure FDA0003177871620000051
或是其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述化合物具有式3：
Figure FDA0003177871620000052
或是其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
18.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物具有式(IIa)：
Figure FDA0003177871620000053
其中：
A是碳(C)；
R3是氢或包含除氢原子外3-12个原子的杂烷基链，其中至少一个是选自氮、硫和氧的杂原子；
L1是氨基连接基团–NR4–，其中R4是氢、C1-5-烷基、C1-5-亚烷基或取代的烷基-CH2R，其中R是选自以下的官能团：氢、卤基、卤代烷基、氰基、硝基、羟基、烷基、烯基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷基脲基、芳基脲基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、二烷基氨基、二芳基氨基、芳基烷基氨基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、磺基、烷基磺酰基酰氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基或杂芳基；
当R3是包含除氢原子外3-12个原子的杂烷基时，则L1与R3一起形成环；
R1是芳族部分，其任选地被C1-2-烷氧基和/或C1-2-全氟烷氧基中的一个或多个取代；
L2是由除氢原子外4-10个原子组成的连接基团，任选地形成环，其中所述原子中的至少一个是氮，所述氮形成酰胺基团的部分，或者L2是C1-5烷基或C1-5亚烷基；所述连接基团L2在氮(N)原子处键合哌啶或哌嗪部分；并且
R2是芳基，任选地被卤素取代，任选地，当R2是苯基时，其被卤素取代，进一步任选地，当R2是萘基时，L2是亚烷基；
或是其对映异构体、非对映异构体、混合物或盐。
19.根据权利要求18所述的方法，其中式(IIa)的所述化合物具有式10：
Figure FDA0003177871620000061
20.根据权利要求18所述的方法，其中式(IIa)的所述化合物具有式11：
Figure FDA0003177871620000062
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述VDAC抑制性化合物是衍生自或对应于人VDAC1 N-末端结构域(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基1-26的肽，包含：(i)相比于所述SEQIDNO:1的一个或多个突变，(ii)相比于所述SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸的截短，或其组合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述肽是1-25个氨基酸的肽，包含衍生自包含氨基酸序列：MAVPPTYADLGKSARDVFTKXYXFX(SEQ ID NO:2)的人VDAC1 N-末端结构域的氨基酸残基1-26的连续序列，其中X是除甘氨酸外的任意氨基酸。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述肽包含选自SEQ ID No.:4-13的氨基酸序列。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述VDAC1抑制性化合物是VDAC沉默寡核苷酸分子或包含VDAC沉默寡核苷酸分子的构建体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述VDAC1沉默寡核苷酸分子包含核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:17、由SEQ ID NO:17编码的mRNA分子、或与其互补的序列相同的至少15个连续核苷酸。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述VDAC1沉默寡核苷酸分子选自SEQIDNO:18-25。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述IBD选自：慢性结肠粘膜炎、克罗恩病、和慢性溃疡性结肠炎(UC)。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中口服或肠胃外给予所述药物组合物。
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