WO2017074009A1 - 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물 - Google Patents

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WO2017074009A1
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keratin
aging
skin
active ingredient
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조항의
김상범
최순호
이동우
강남주
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    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the present invention relates to an anti-aging cosmetic composition containing a keratin peptide as an active ingredient, and more particularly, to an anti-aging cosmetic composition containing a peptide obtained from keratin decomposition culture medium through ultra-high anaerobic microbial fermentation as an active ingredient.
  • Skin aging can be divided into intrinsic aging and extrinsic aging according to factors affecting aging.
  • Endogenous aging is a structure in which the structure and physiological function of the skin decreases with age regardless of environmental changes. Exogenous aging is due to continuous exposure to external environments such as sunlight. In particular, aging by light is called photoaging, and ultraviolet light is a major cause of physiological and morphological changes of skin aging. As the skin ages, the skin becomes dry, fine lines increase, and wrinkles deepen over time.
  • the factors directly affecting skin aging are collagen and keratin, which are wrinkles and sagging when the amount of collagen is quantitatively and qualitatively healthy, which accounts for most of the skin, 77% of the entire skin, and 90% of the dermis. Can be kept healthy and beautiful without.
  • collagen undergoes a denaturation process such as glycation, the balance between collagen production and degrading enzymes is broken, which inhibits collagen production and promotes degradation, thereby rapidly decreasing the amount of collagen in the skin. This can lead to deep wrinkles on the skin and reduce skin elasticity.
  • keratin is a protein that forms the basis of epidermal structures such as hair, nails, and skin to form a skin epidermal layer.
  • the epidermal layer not only protects the skin but also prevents skin aging.
  • keratin also reduces the division of keratinocytes when degeneration such as carbonylation occurs, thereby slowing down the formation of new cells, weakening the skin barrier function, increasing water loss through the skin, and skin It will cause a decrease in elasticity.
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-2010-0025500 is an oral preparation containing at least one selected from the group consisting of elastin protein, hyaluronic acid and vitamin C in the collagen peptide for improving oral skin care to improve the skin wrinkle improvement effect
  • a method of improving wrinkles of the skin with a composition is disclosed.
  • the collagen peptide is ingested as an oral preparation, not only the effect of improving the skin is low, but there is a problem that side effects occur in the human body when excessive ingestion occurs.
  • the present inventors continued the cosmetic research using microorganism-derived peptides, using peptides and metabolites naturally occurring in microorganisms through anaerobic fermentation, and excellent anti-aging and skin elasticity improvement effect, but can be mass-produced at low price. Cosmetics could be developed.
  • an object of the present invention is to provide an anti-aging cosmetic composition containing a keratin peptide as an active ingredient that can be mass-produced at a low price while having an anti-aging and skin elasticity improving effect.
  • the present invention provides a cosmetic composition for anti-aging containing keratin peptide as an active ingredient.
  • the keratin peptide of the present invention is prepared through the culture fermentation of anaerobic microorganisms.
  • anaerobic microorganism of the present invention is keratinase (Keratinase),
  • the keratinase is anaerobic strain F. islandicum AW-1, Caldanaeobacter yonseiensis KB-1, Caldanaeobacter sp. Any one selected from AB-1.
  • the conditions of the culture fermentation of the present invention is a high temperature of 65 ⁇ 80 °C and pH 6-8.
  • the content of the keratin peptide contained in the cosmetic composition of the present invention is 1 to 10% by weight relative to the total weight of the cosmetic.
  • the present invention also provides an antioxidant functional cosmetic composition containing keratin peptide as an active ingredient.
  • the present invention also provides an anti-allergic functional cosmetic composition containing a keratin peptide as an active ingredient.
  • the cosmetic composition containing the keratin peptide according to the present invention may have a conventional formulation, water-soluble liquid, lotion, cream, gel, pack, essence, oil-in-water (O / W), water-in-oil (W / O) type Or it may be formulated as a powder of silicon water (W / Si) type.
  • composition of each of the above formulations may contain various bases and additives necessary for the formulation of the formulation and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the cosmetic composition containing a keratin peptide having an anti-aging effect, anti-wrinkle effect, antioxidant effect, anti-allergic effect, etc. according to the present invention as an active ingredient can be used according to the usual method of use and according to the skin condition or taste of the user Can be used differently.
  • the anti-aging cosmetic composition provided by the present invention has an effect of improving the anti-aging and elasticity of skin, but mass production at an affordable price by containing keratin peptide as an active ingredient through anaerobic microbial culture fermentation.
  • FIG. 1 is a graph showing the anaerobic fermentation optimal culture conditions (temperature, pH) of the keratin degrading enzyme AW-1 strain for producing a keratin peptide according to the present invention.
  • FIG. 2 is a flow chart for the isolation and purification of keratin peptides according to the present invention.
  • 3 to 6 is a control of the anti-atopic activity test cells (Raw 264.7), whitening effect test cells (B16F10), skin inflammation alleviation effect test cells (JB6P +) and skin keratinocytes (HaCaT cells) of the keratin peptide according to the present invention Comparison of cytotoxicity with.
  • Figure 7 (a), (b) and Figure 8 is a graph showing the protective effect against ultraviolet cytotoxicity in the keratinocytes (HaCaT cells) LMW and HMW group of keratin peptides according to the present invention.
  • Figure 9 is a graph showing the efficacy of the intracellular lipid peroxide production of keratin peptides according to the present invention.
  • Figure 10 (a), (b) and Figure 11 is a graph showing the antioxidant activity of the keratin peptide according to the invention.
  • Figure 13 (a), (b) is a graph showing the anti-allergic efficacy of keratin peptides according to the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing the anti-aging efficacy of keratin peptides according to the present invention.
  • the preparation of keratin peptides according to the present invention is to adjust the temperature and pH of the culture medium containing keratinase (Keratinase), an anaerobic microorganism, and to add the keratin to the prepared culture medium and fermentation to prepare a culture medium, This is accomplished by precipitation and filtration of the culture. This will be described in detail as follows.
  • keratinase (Keratinase) excellent in protein degradation, such as keratin, collagen was used, the keratinase is anaerobic strain F. islandicum AW-1, Caldanaeobacter yonseiensis KB-1, Caldanaeobacter sp. AB-1 was used.
  • strains were isolated purely by serial-dilution method using Hungate tube (Chemglass Life Sciences) under anaerobic conditions, and the identification of each strain was performed using universal primers (9F & 1542R) for sequencing 16S rRNA gene (1.5 kb). After the PCR was performed, the nucleotide sequences obtained through Sanger sequencing were separated using NCBI database and EzTaxon-e program (ChunLab).
  • the keratin degrading enzyme capable of producing the keratin peptide of the present invention was most suitable for the high temperature bacterium Fervidobacterium islandicum AW-1 (hereinafter referred to as 'AW-1 strain'), which is an extreme anaerobic microorganism having excellent keratin degrading ability among microorganisms.
  • the anaerobic fermentation culture conditions of the AW-1 strain is preferably adjusted to a culture temperature of 65 ⁇ 80 °C, pH 6 ⁇ 8, but keratin degradability at anaerobic fermentation conditions of the culture temperature 70 °C, pH 7.0 Represents the maximum value.
  • the pH value is preferably adjusted by KOH.
  • samples were fractionated and concentrated to ⁇ 1 kDa, 1-10 kDa, and> 10 kDa using ultrafiltration (UF) and size exclusion chromatography. .
  • supernatant cultured AW-1 strain was fractionated after ultrafiltration (UF) under optimized conditions for LC-MS / MS analysis to identify peptides showing activity to separate keratin peptides.
  • keratin peptide separation and purification were carried out using ammonium sulfate precipitation method and hydrophobic interaction chromatography (HIC) method according to hydrophobicity.
  • the absorbance of the flow-through was measured at 280 nm to measure and 210 nm to measure the amount of peptide.
  • This keratin peptide separation, purification and fractionation process flow chart is shown in FIG.
  • the protective effect against ultraviolet cytotoxicity the amount of lipid peroxide produced by the cells, and the antioxidant effect were measured.
  • the amount of lipid peroxide produced in keratin peptides of LMW and HMW was measured by measuring thibarturic acid reaction product (TBARS).
  • Experimental principle is to homogenize the liver tissue of the mouse using a sonicator, and then put the evaluation sample in the supernatant diluted in PBS, react with KCl and FeCl 3 for 30 min at 90 °C, measure the absorbance and oxidize the lipid In the process, the evaluation sample was investigated to prevent lipid peroxide formation.
  • BHT dibutyl hydroxy toluene
  • LMW 25 ⁇ g / mL, HMW 0.2 ⁇ g / mL, 1 ⁇ g / mL, and 5 ⁇ g / mL of keratin peptides each had an effect of preventing lipid peroxide production more than two times higher than that of BHT. Indicated.
  • Vitamin C (0-100 ⁇ g / mL) was used as a control for both experiments, and the experimental group was expressed as VCEAC (Vitamin C equivalent antioxidant capacity) value.
  • VCEAC Vitamin C equivalent antioxidant capacity
  • the effect of inhibiting radical production of keratin peptides has an effect of 0.03 mg of Vitamin C per 10 mg in LMW and 0.09 mg of Vitamin C in 10 mg in HMW. It was measured to make an effect. Compared with the control group Gaclic acid (55.91 mg of Vitamin C per 10 mg) and Quercetin (18.79 mg of Vitamin C per 10 mg), the antioxidant activity was low.
  • LMW has a radical scavenging ability corresponding to 0.63 mg of Vitamin C per 10 mg
  • HMW has a radical scavenging ability corresponding to 0.59 mg of Vitamin C per 10 mg.
  • the keratin peptide was found to have a smaller antioxidant effect than the control.
  • the potency of keratin peptides to inhibit free radicals produced by UVB in keratinocytes was measured using DCF-da.
  • AW-1 enzymes fractionated from keratin-degrading strains
  • protease used by AP
  • proteolytic enzyme used in the cosmetic industry as a control
  • keratinase used by SA
  • the keratinase used in the present invention showed significantly higher thermal stability and surfactant resistance than the control.
  • ELISA was shown to inhibit the production of LPS-induced cytokines (Nitric oxide (NO), interlukins, TNF-alpha, etc.) using the RAW264.7 macropharge cell line of keratin peptides. Measured by assay.
  • LPS-induced cytokines Nitric oxide (NO), interlukins, TNF-alpha, etc.
  • keratin peptides have atopy prevention activity.
  • keratin peptides through anaerobic microbial fermentation are expected to have high industrial applications as anti-aging, antioxidant and anti-allergic functional cosmetic materials.
  • each base of the formulation such as skin, lotion, cream, essence and the preparation method thereof are as follows.
  • the content of the keratin peptide contained in the cosmetic of each formulation is preferably 1 to 10% by weight relative to the total weight of each cosmetic.
  • the content of keratin peptide is less than 1% by weight, there is a slight problem of anti-aging efficacy, and when it exceeds 10% by weight, the anti-aging effect is not enhanced by increasing the keratin peptide.
  • the skin is a skin cosmetic base containing the following [Table 1] components and prepared in the order of [Table 2].
  • the lotion was prepared in the order of [Table 4] including the following [Table 3] as a lotion cosmetic base.
  • the cream was prepared in the order of [Table 6] including the following [Table 5] components as a cream cosmetic base.
  • composition of the cosmetics introduced in the present invention represent a representative component of the formulation having the characteristics of each component, in addition to the other components having the characteristics can be replaced, of course.

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Abstract

본 발명은 혐기성 미생물의 배양발효를 통해 제조된 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 항노화 및 피부탄력 개선 효과가 우수하면서도 저렴한 가격에 대량생산이 가능한 효과가 있고 항알러지 및 항산화 효능이 있다.

Description

케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물
본 발명은 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초고온 혐기성 미생물 발효를 통한 케라틴 분해 배양액으로부터 얻어진 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부 노화는 나이가 들어감에 따라 필연적으로 발생하지만, 여러 가지 환경 요인에 의해 피부 노화의 발생 요인이 증가하고, 생활 수준 향상으로 삶의 질에 대한 요구가 증대되고 있는 지금에 들어서는 피부 노화에 대한 대책과 항노화(Anti-aging)에 대한 관심이 증폭되고 있다.
피부노화는 노화에 미치는 요인에 따라 내인성 노화(intrinsic aging)와 외인성 노화(extrinsic aging)로 구분할 수 있는데, 내인성 노화는 나이가 들어감에 따라 피부의 구조와 생리기능이 환경변화와는 무관하게 감퇴하는 것이고, 외인성 노화는 태양광선 등의 외부환경에 지속적으로 노출되기 때문에 나타나는 것이다. 특히, 빛에 의한 노화를 광노화(photoaging)라고 하며 자외선은 피부 노화의 생리학적 및 형태학적 변화의 주된 원인이 된다. 피부노화가 진행되면 피부는 건조해지며 잔주름이 늘어나고, 시간이 지나면서 주름은 더욱 깊어진다.
이러한 피부 노화 현상에 직접적으로 영향을 미치는 요소는 콜라겐과 케라틴으로, 피부의 대부분, 피부 전체의 77%, 진피의 90%를 차지하는 콜라겐이 양적으로 풍부하고 질적으로 건강할 때에는 피부 또한 주름과 처짐 현상없이 건강하고 아름답게 유지될 수 있다. 그러나, 이러한 콜라겐이 당화(glycation)와 같은 변성 과정을 거치게 되게 되면, 콜라겐 생성과 분해 효소간의 균형이 깨어져 콜라겐 생성이 억제되고 분해가 촉진되어 피부 내 콜라겐 양이 급격히 감소하게 된다. 이는 피부 깊은 주름으로 나타나게 되며 피부 탄력을 저하시키게 된다.
또한, 케라틴은 머리털, 손톱, 피부 등 상피구조의 기본을 형성하는 단백질로 피부 표피층을 형성하며, 표피층은 피부 보호 기능뿐만 아니라 피부 노화 방지 기능을 한다. 그런데 이런 케라틴 역시 탄화(carbonylation)와 같은 변성이 발생하면 각질형성세포(keratinocyte)의 분열을 저하시키며 이로 인해 새로운 세포 형성이 더디어지게 되어, 피부 장벽 기능의 약화, 피부를 통한 수분 손실의 증가, 피부 탄력 저하를 유발하게 된다.
따라서, 이와 같은 피부노화를 방지하는 주름개선 화장품에 대한 연구가 다방면으로 이루어지고 있으나, 특히 항노화 주름 개선 효능이 있으면서 인체에 부작용이 없는 화장료 조성물 개발이 절실히 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2010-0025500호에서는 콜라겐 펩티드에 엘라스틴 단백질, 히알루론산 및 비타민 C로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 함유하는 경구 제제로 피부주름 개선 효과를 향상시키는 경구용 피부미용 개선용 조성물로 피부의 주름을 개선시키는 방법이 개시되어 있다. 그러나 경구용 제제로 콜라겐 펩타이드를 섭취할 경우에는 피부 개선의 효과가 낮을 뿐만 아니라 과다섭취 시 인체에 부작용이 발생하는 문제가 있다.
또한, 최근들어 아미노산의 중합체로서 단백질보다 구조적으로 단순하지만, 생체 내 단백질과의 상호작용이 매우 크기 때문에 효소의 활성을 강화시키거나 억제시키는 기능에 의해 항노화 효과가 있는 다양한 펩타이드, 즉 식물성 펩타이드, 합성 펩타이드, 미생물유래 펩타이드 등으로 구분되는 화장품 소재가 개발되고 있다. 그러나, 이 중에서 가장 많은 비중을 차지하는 식물성 펩타이드의 경우에는 식물에서 펩타이드를 분리정제하는 과정이 복잡할 뿐만 아니라 대량으로 소재를 얻는데 어려움이 있고, 합성 펩타이드의 경우에는 현재 산업화 하기에는 합성비용으로 인해 가격 경쟁력에서 뒤쳐질 수 밖에 없고 기능성 화장품의 원료로 사용하기에는 비용부담 문제가 있다.
또한, 개발된 기능성 화장품의 피부 전달 관련해서 끊이지 않는 논란이 계속되는데, 즉, 일부 분자 크기가 작은 기능성 소재의 피부 투과 또는 경피흡수는 인정되고 있지만, 크기가 큰 기능성 소재의 경피흡수는 증명되지 못하였으며, 특히 항노화 및 주름개선 소재로 유망한 펩타이드 소재들의 경피흡수는 확인되지 않고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 미생물유래 펩타이드를 이용한 화장료 연구를 계속한 결과, 혐기발효를 통해 미생물에서 자연발생되는 펩타이드와 대사산물을 이용하여, 항노화 및 피부탄력 개선 효과가 우수하면서도 저렴한 가격에 대량생산이 가능한 화장료를 개발할 수 있었다.
(선행기술문헌)
대한민국 공개특허 제10-2010-0025500호
따라서, 본 발명의 목적은 항노화 및 피부탄력 개선 효과가 우수하면서도 저렴한 가격에 대량생산이 가능한 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.
여기서, 본 발명의 상기 케라틴 펩타이드는 혐기성 미생물의 배양발효를 통해 제조된다.
또한, 본 발명의 상기 혐기성 미생물은 케라틴 분해효소(Keratinase)이며,
상기 케라틴 분해효소는 혐기성 균주 F. islandicum AW-1, Caldanaeobacter yonseiensis KB-1, Caldanaeobacter sp. AB-1 에서 선택된 어느 하나이다.
또한, 본 발명의 상기 배양발효의 조건은 65~80℃의 고온 및 pH 6~8 인 것이다.
또한, 본 발명의 상기 화장료 조성물에 함유되는 케라틴 펩타이드의 함량은 화장료 총 중량 대비 1~10 중량% 이다.
또한, 본 발명은 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항산화 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항알러지 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드를 함유한 화장료 조성물은 통상의 제형을 가질 수 있으며 수용성 리퀴드, 로션, 크림, 젤, 팩, 에센스, 수중유(O/W), 유중수(W/O)형 또는 실리콘중수(W/Si)형의 파우더로 제형화 될 수 있다.
상기 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 항노화 효과, 주름 개선 효과, 항산화 효과, 항알러지 효과 등을 가지는 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며 사용자의 피부상태 또는 취향에 따라 사용횟수를 달리할 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 항노화용 화장료 조성물은 혐기성 미생물 배양발효를 통한 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유함으로써 항노화 및 피부탄력 개선 효과가 우수하면서도 저렴한 가격에 대량생산이 가능한 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드를 제조하기 위한 케라틴 분해효소인 AW-1 균주의 혐기발효 최적배양조건(온도, pH)을 나타낸 그래프.
도 2는 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 분리 및 정제 흐름도.
도 3 내지 도 6은 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 항아토피 활성검증 세포(Raw 264.7), 미백효과 검증세포(B16F10), 피부염증 완화효과 검증 세포(JB6P+)와 피부 각질세포(HaCaT cells)의 대조군과의 세포 독성 비교 그래프.
도 7의 (a),(b) 및 도 8은 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 피부 각질세포(HaCaT cells) LMW와 HMW군에서 자외선 세포 독성에 대한 방어 효능을 나타낸 그래프.
도 9은 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 세포내 지질 과산화물 생성 방지 효능을 나타낸 그래프.
도 10의 (a),(b) 및 도 11은 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 세포내 항산화 효능을 나타낸 그래프.
도 12의 (a),(b)는 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 열안정성 및 계면활성제 저항성을 나타낸 그래프.
도 13의 (a),(b)는 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 항알러지 효능을 나타낸 그래프.
도 14는 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 항노화 효능을 나타낸 그래프.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세하게 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것이 아님은 물론이다.
실시예 1. 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 제조
본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 제조는 혐기성 미생물인 케라틴 분해효소(Keratinase)를 함유하는 배양배지의 온도 및 pH를 조절하고, 제조된 배양배지에 케라틴을 첨가하고 배양발효하여 배양액을 제조하며, 제조된 배양액을 침전 및 여과하는 과정을 거쳐 이루어진다. 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
1-1. 케라틴 펩타이드를 제조하기 위한 혐기발효 미생물의 배양조건
케라틴 펩타이드를 제조하기 위해, 케라틴, 콜라겐 등 단백질 분해능이 우수한 케라틴 분해효소(Keratinase)가 사용되었으며, 케라틴 분해효소로는 혐기성 균주 F. islandicum AW-1, Caldanaeobacter yonseiensis KB-1, Caldanaeobacter sp. AB-1 를 이용하였다.
이들 균주는 혐기조건에서 Hungate tube(Chemglass Life Sciences)를 이용한 serial-dilution 방법을 통해 순수분리하였고, 각 균주의 동정은 16S rRNA gene (1.5 kb) 염기서열분석을 위해 universal primers (9F & 1542R)를 사용하여 PCR을 수행한 후, Sanger sequencing을 통해 얻어진 염기서열을 NCBI database 및 EzTaxon-e 프로그램(ChunLab)을 활용하여 분리하였다.
그 결과 본 발명의 케라틴 펩타이드를 생산할 수 있는 케라틴 분해효소로는 미생물 중 케라틴 분해능이 우수한 극한 혐기 미생물인 고온균 Fervidobacterium islandicum AW-1(이하, 'AW-1 균주'라 칭함)이 가장 적합하였다.
AW-1 균주의 혐기발효 배양조건은 도 1에 도시된 바와 같이, 배양온도 65~80℃, pH 6~8로 조절하는 것이 바람직하나, 배양온도 70℃, pH 7.0의 혐기발효조건에서 케라틴 분해능은 최대값을 나타내었다. 여기서, pH 값 조절은 KOH으로 조절하는 것이 바람직하다.
또한, AW-1 균주에서 케라틴 펩타이드 생산에 관여하는 유전자를 알아보기 위하여, Blast-search, ClusterX, Prosite, 및 RAST server를 사용하여 염기서열과 아미노산 서열의 상동성 분석을 수행한 결과, Fervidobacterium 속 균주에 있는 특이적으로 존재하는 cysteine desulfurase gene와, 그외 Thioredoxin-disulfide reductase gene, thermostable carboxypeptidase gene가 케라틴 펩타이드 생산에 관여하는 유전자로 예상되었다.
1-2. 케라틴 펩타이드의 분리 및 정제
케라틴 펩타이드를 분자량별로 분리 및 정제하여 항노화 및 미백효능을 확인하기 위하여, 한외여과(UF) 및 size exclusion chromatography를 이용하여 샘플을 <1 kDa, 1-10 kDa, >10 kDa로 분획 및 농축하였다.
또한, 활성을 보이는 펩타이드를 규명하기 위한 LC-MS/MS 분석을 위하여 최적화한 조건으로 AW-1 균주를 배양한 상등액을 한외여과(UF) 후 분획하여 케라틴 펩타이드 분리정제를 수행하였다.
또한, 케라틴 펩타이드의 정제공정을 효율적으로 간소화 및 최적화 하기 위하여, hydrophobicity에 따른 분리 공정인 ammonium sulfate 침전법과 hydrophobic interaction chromatography(HIC) 방법을 이용하여 케라틴 펩타이드 분리정제를 수행하였으며, Chromatography 수행시 단백질 양을 측정하기 위해 280nm, 펩타이드 양을 측정하기 위해 210 nm로 flow-through의 흡광도를 측정하였다.
이와 같은 케라틴 펩타이드의 분리, 정제 및 분획공정 흐름도는 도 2에 도시하였다.
실험예 1. 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 세포보호 효능 측정
본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 자외선에 의한 세포보호 효능여부를 측정하기 위하여, 자외선 세포독성에 대한 방어효능, 세포의 지질 과산화물 생성량, 항산화 효능을 측정하였다.
1-1. 피부 각질세포( HaCaT cells)에서 자외선 세포 독성에 대한 방어 효능 측정
우선, 세포독성을 갖지 않는 적절한 샘플농도를 찾기 위해서 MTT assay 방법으로 세포 생존율 평가 실험을 진행하였으며, 그 결과 항아토피 활성검증 세포(Raw 264.7), 미백효과 검증세포(B16F10), 피부염증 완화효과 검증 세포(JB6P+)와 피부 각질세포(HaCaT cells)에 케라틴 펩타이드를 처리하였을 때 도 3 내지 도 6에 도시된 바와 같이, 대조군의 세포생육곡선과 차이가 없는 것으로 나타났다. 이는 케라틴 펩타이드가 다양한 세포들에 대해 세포 독성이 없다는 것을 나타낸다. 도 3에서의 대조군(media)은 세포가 자라는 데 필요한 조건을 갖춘 배지가 사용되었음을 의미한다.
이후, 자외선 세포 독성에 대한 방어 효과를 측정하기 위해, 먼저 피부 각질세포 (HaCaT cells)를 seeding 한 후 90%이상의 confluence를 나타낼 때 까지 CO2 incubator에서 약 24h 동안 배양시켰다. 이후 배양 배지를 vacuum-based aspirator를 이용하여 제거한 뒤, LMW(Low Molecular Weight : under 1 kDa), HMW(High Molecular Weight : 1-10 kDa) 두 가지 군에 각 농도별로 케라틴 펩타이드가 포함 된 PBS를 넣고 자외선(30mJ/cm2)을 처리하였다. 그런 다음, 케라틴 펩타이드가 포함된 배양 배지를 통하여 24 h 동안 CO2 incubator에서 배양 시켰으며, MTT assay를 통한 흡광도 측정으로 자외선에 의해 유도되는 세포 독성으로 인한 세포 생존율 감소를 케라틴 펩타이드가 방어 기전에 효과가 있는지 측정하였다.
그 결과, 도 7의 (a),(b) 및 도 8에 도시된 바와 같이, 자외선 처리군과 비교 하였을 때, LMW와 HMW군 모두 유의적인 세포 생존율 증가를 나타내지는 못하였다.
1-2. 세포의 지질 과산화물 생성량 측정
TBARS(thiobarturic acid 반응생성물) 측정을 통하여 LMW와 HMW 각각의 케라틴 펩타이드에서의 지질 과산화물 생성량을 측정하였다. 실험 원리는 mouse의 간 조직을 sonicator를 이용하여 조직을 균질화 시킨 뒤 PBS에 희석시킨 상층액에 평가 시료를 넣고 KCl과 FeCl3를 넣어 90℃에서 30min 간 반응시킨 뒤, 흡광도를 측정하여 지질의 산화과정 중 평가 시료가 얼마나 지질 과산화물 생성을 방지시키는지 조사하였다. 대조군으로는 합성산화 방지제로 알려진 BHT(dibutyl hydroxy toluene)를 사용하였다.
그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, LMW 25㎍/mL와 HMW 0.2㎍/mL, 1㎍/mL, 5㎍/mL 각각의 케라틴 펩타이드에서 BHT 대비 2배 이상의 높은 지질 과산화물 생성을 방지하는 효과를 나타내었다.
1-3. 케라틴 펩타이드의 세포내 항산화 효과 측정
(1) 시험관내 분석법에 의한 항산화 효과 측정
케라틴 펩타이드의 항산화 효과를 DPPH와 ABTS radical scavenging assay를 진행하여 측정하였다. 두 실험 모두 대조군으로 Vitamin C (0-100 ㎍/mL)를 사용하였으며, 실험군의 값을 VCEAC(Vitamin C equivalent antioxidant capacity) value로 나타내었다. 특히, DPPH assay의 경우에는 대조군으로 Galic acid와 Quercetin을 사용하였고, ABTS assay에서는 대조군으로 α-tocopherol을 사용하였다. 실험 결과는 도 10의 (a),(b)에 나타내었다.
DPPH에서는 도 10의 (a)에 도시된 바와 같이, 케라틴 펩타이드의 라디칼 생성 억제 효능이 LMW의 경우에는 10mg당 Vitamin C 0.03 mg의 효과를 내고, HMW의 경우에는 10 mg당 Vitamin C 0.09 mg에 해당하는 효과를 내는 것으로 측정되었다. 이는 대조군인 Gaclic acid(10 mg당 Vitamin C 55.91 mg)와 Quercetin(10 mg 당 Vitamin C 18.79 mg)과 비교하였을 때, 낮은 수치로 항산화 효과가 미미한 것으로 확인되었다.
또한, ABTS assay에서는 도 10의 (b)에 도시된 바와 같이, LMW는 10mg당 Vitamin C 0.63 mg에 해당하는 라디컬 소거능, HMW는 10 mg당 Vitamin C 0.59 mg에 해당하는 라디칼 소거능을 가진 것으로 나타났다. 이는 대조군 α-tocopherol의 10 mg당 Vitamin C 1.89 mg에 해당하는 항산화 효과와 비교하였을 때, 케라틴 펩타이드는 대조군 대비 항산화 효과가 미미한 것으로 확인되었다.
(2) 세포내 분석법에 의한 항산화 효과 측정
피부각질 세포내에서 UVB에 의해 생성된 활성산소를 케라틴 펩타이드가 억제하는 효능을 DCF-da를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, < 1 kDa 이하 케라틴 펩타이드는 200ppm에서 약 11.6% 억제 효능을 나타냈으며, 1-10 kDa 케라틴 펩타이드는 200ppm에서 31.6%의 억제 효능을 나타냈으나, 대조군이나 arscobic acid과 비교하여, 항산화 효과는 미미하였다.
실험예 2. 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 열안정성 및 계면활성제 저항성 측정
케라틴 펩타이드의 열안정성 및 계면활성제 저항성을 측정하기 위하여, 케라틴 분해균주로부터 분획한 효소(AW-1)와, 대조군으로 기존 화장품 산업에서 사용되고 있는 단백질 가수분해효소인 protease(AP사 제품에 사용) 및 keratinase(SA사 제품에 사용)을 비교하였다.
그 결과 도 12의 (a),(b)에 도시된 바와 같이, 본 발명에 사용된 케라틴 분해효소가 대조군보다 월등하게 높은 열안정성 및 계면활성제 저항성을 나타내었다.
실험예3. 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 항아토피 효능 측정
케라틴 펩타이드의 항아토피 효능을 측정하기 위하여, 케라틴 펩타이드의 RAW264.7 macropharge cell line을 이용하여 LPS로 유도된 cytokines(Nitric oxide (NO), interlukins, TNF-alpha, etc.)들의 생성 억제 효능을 ELISA assay를 통해 측정하였다.
그 결과, 도 13의 (a),(b)에 도시된 바와 같이, 케라틴 펩타이드에 의한 nitric oxide 및 TNF-alpha에 대한 약한 생성 억제 효과가 확인되었다.
이는 케라틴 펩타이드가 아토피 예방 활성을 가지고 있는 것을 나타낸다고 할 수 있다.
실험예4. 본 발명에 따른 케라틴 펩타이드의 항노화 효능 측정
케라틴 펩타이드의 항노화 효능을 측정하기 위하여, 도 2와 같이 분자량 별로 분획 및 농축된 케라틴 펩타이드 3개 분획물(<1 kDa, 1-10 kDa, >10 kDa)에 대해 항노화 기능성 여부를 스크리닝 하였다.
그 결과, 도 14에 도시된 바와 같이, 콜라겐 분해효소로 잘 알려진 MMP-1 발현을 3개 케라틴 펩타이드 분획물 모두 유의적으로 억제함을 확인하였다.
따라서, 혐기성 미생물발효를 통한 케라틴 펩타이드가 항노화, 항산화, 항알러지 기능성 화장품 소재로서의 산업적 활용 가능성이 높을 것으로 예상된다.
제조예. 화장료
본 발명에 따른 케라틴 펩타이드를 함유하는 화장료로서, 예를들어 스킨, 로션, 크림, 에센스와 같은 제형의 각 베이스의 구성성분 및 그 제조방법은 다음과 같다.
이때 각 제형의 화장료에 포함되는 케라틴 펩타이드의 함량은 각 화장료 총 중량 대비 1~10 중량%인 것이 바람직하다. 케라틴 펩타이드의 함량이 1 중량% 미만인 경우에는 항노화 효능이 미미한 문제가 있고, 10 중량%를 초과할 경우에는 케라틴 펩타이드의 증가에 따른 항노화 효능 향상이 일어나지 않게 된다.
(1) 스킨
스킨은 스킨 화장료 베이스로 아래의 [표1] 성분들을 포함하며 [표2]의 순서대로 제조하였다.
Figure PCTKR2016012067-appb-T000001
Figure PCTKR2016012067-appb-T000002
(2) 로션
로션은 로션 화장료 베이스로 아래의 [표3] 성분들을 포함하여 [표4]의 순서대로 제조하였다.
Figure PCTKR2016012067-appb-T000003
Figure PCTKR2016012067-appb-T000004
(3) 크림
크림은 크림 화장료 베이스로 아래의 [표5] 성분들을 포함하여 [표6]의 순서대로 제조하였다.
Figure PCTKR2016012067-appb-T000005
Figure PCTKR2016012067-appb-T000006
(4) 에센스
에센스는 에센스 화장료 베이스로 아래의 [표7] 성분들을 포함하여 [표8]의 순서대로 제조하였다.
Figure PCTKR2016012067-appb-T000007
Figure PCTKR2016012067-appb-T000008
본 발명에서 소개되는 화장료의 조성물을 이루는 성분들은 각 성분들의 특징을 갖는 제형 중 대표적인 성분을 표기한 것으로, 이 이외에 해당 특징을 갖는 다른 성분들로 대체가능함은 물론이다.
비록 본 발명이 상기에서 언급한 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다른 다양한 수정이나 변형이 가능할 것이며, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 범위 내에 속하는 그러한 수정 및 변형을 포함한다.

Claims (8)

  1. 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 것이 특징인 항노화용 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 케라틴 펩타이드는 혐기성 미생물의 배양발효를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 항노화용 화장료 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 혐기성 미생물은 케라틴 분해효소(Keratinase)이며,
    상기 케라틴 분해효소는 혐기성 균주 F. islandicum AW-1, Caldanaeobacter yonseiensis KB-1, Caldanaeobacter sp. AB-1 에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항노화용 화장료 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 배양발효의 조건은 65~80℃의 고온 및 pH 6~8 인 것을 특징으로 하는 항노화용 화장료 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화장료 조성물에 함유되는 케라틴 펩타이드의 함량은 화장료 총 중량 대비 1~10 중량% 인 것을 특징으로 하는 항노화용 화장료 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항산화 기능성 화장료 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 케라틴 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항알러지 기능성 화장료 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 화장료 조성물이 수용성 리퀴드, 로션, 크림, 젤, 팩, 에센스, 수중유(O/W), 유중수(W/O)형 및 실리콘중수(W/Si)형의 파우더로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 항노화, 항산화 및 항알러지 기능성 화장료 조성물.
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