WO2016156092A1 - Verfahren zum lokalisieren wenigstens eines emitters mittels eines lokalisationsmikroskops - Google Patents

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WO2016156092A1
WO2016156092A1 PCT/EP2016/056166 EP2016056166W WO2016156092A1 WO 2016156092 A1 WO2016156092 A1 WO 2016156092A1 EP 2016056166 W EP2016056166 W EP 2016056166W WO 2016156092 A1 WO2016156092 A1 WO 2016156092A1
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emitter
optical detector
emission radiation
lenses
optical
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PCT/EP2016/056166
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Alexander Egner
Claudia Geisler
Haugen MITTELSTÄDT
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Laser-Laboratorium Göttingen e.V.
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Publication date
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
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    • G02B21/362—Mechanical details, e.g. mountings for the camera or image sensor, housings

Definitions

  • the invention relates to a method for locating at least one emitter of electromagnetic emission radiation by means of a localization microscope and to an apparatus for carrying out such a method.
  • Such methods are today known in various configurations in the prior art. Emitters can be observed in imaging and / or tracking processes that are smaller than the Abbe's
  • fluorophores for example, carbon nanotubes, quantum dots or fluorophores.
  • the fluorophores become electromagnetic
  • the electromagnetic emission radiation emitted by the emitter is collected and applied to an optical detector via suitable objectives and optical arrangements.
  • Dot images correspond to the lateral position of the emitter in the
  • Fluorophore prevails in the active state, it is by the electromagnetic Excitation radiation excitable. Only in this case, he can be excited zürn lights.
  • Activation radiation can be brought from a passive state to an active state.
  • fluorophores are known which can be brought from an active to a passive state. The following is from
  • PAM localization microscopy
  • STORM stochastic optical reconstruction microscopy
  • FPALM fluorescence photoactivation localization microscopy
  • PALMIRA ground state depletion microscopy followed by individual molecule return ( GSDIM) or "direct STORM” (dSTORM).
  • GSDIM ground state depletion microscopy followed by individual molecule return
  • dSTORM direct STORM
  • the methods have a high lateral localization accuracy of less than 20-30 nanometers. In the axial direction, however, the observable volume is limited to a layer of about 1 pm. Such methods are described, for example, in WO 2009/146016 A1. Attempts have been made to achieve good localization accuracy even in the axial direction. So far, however, the information on the positions in this direction must be determined indirectly. For this purpose, techniques such as two-plane detection, astigmatism or double helix are used, whereby the point-spread-function (PSF) is modified to determine the position along the optical axis from the z-dependent change of this function. However, this does not lead to an isotropic resolution in all spatial directions In the interference method, opposing objectives (4Pi) achieve better axial resolution, but all these methods are limited to layer thicknesses of about 1 pm.
  • PSF point-spread-function
  • the invention is therefore based on the object, a method for
  • the invention achieves the stated object by a method for locating at least one emitter of electromagnetic emission radiation by means of a localization microscope, the method having the following steps:
  • the measured values correspond to the distribution of the on the optical
  • Directed detector whose optical axes in linearly independent directions from each other. This corresponds to observation of the radiating emitter from two different, linearly independent directions.
  • the measured values of the electromagnetic emission radiation form an image of the emitter on the optical detector for each objective through which the electromagnetic emission radiation is conducted.
  • image is understood merely as a summary of the measured values which are caused by the electromagnetic emission radiation of one or more emitters which has been conducted through one of the at least two objectives.
  • the electromagnetic emission radiation of several emitters usually forms several "images" in this understanding, even if it was passed through a single one of the at least two objectives. in that, for at least one of the plurality of objectives, the plurality of emitters are closer together than the Abbe's dissolution criterion
  • the electromagnetic emission radiation of multiple emitters form a common image. This case can occur, for example, if two emitters are arranged offset along the optical axis of the respective objective. The emitters then shine for that
  • Lens to be very close to each other, although the actual distance may exceed the resolution criterion corresponding dimension. This can usually be resolved by the "images" of the at least one further objective.
  • Parameters that determine the position and viewing direction of the respective objective can be determined, for example, by solving a linear Gieichungssystems three-dimensional coordinates of each emitting emitter. By observing the volume in which the emitter is located, from two different, linearly independent viewing directions, one obtains information directly on the position of the emitter in two
  • Each lens directs the emission radiation to at least one optical detector.
  • the various optical detectors may be part of a single detector array, which may be in the form of a CCD chip of a digital camera, for example. In this case, for example, the different lenses would forward each one of them
  • Electromagnetic emission radiation passed through at least three, preferably at least four lenses on the at least one optical detector, wherein the optical axes of the lenses extend in pairs linearly independent directions.
  • the optimal positioning of, for example, four lenses is the tetrahedral arrangement. Between each two of the lenses then the tetrahedral angle of 09.5 ° is included. In this case, the localization accuracy is almost isotropic when the
  • the location accuracy with which the position of an emitter can be determined depends on the number of photons transmitted by the lenses which are emitted by the respective emitter.
  • the dyes used as fluorophore have only a limited duration of activity, so that the number of photons that can be emitted is limited. Since the individual fluorophores mostly by stochastic
  • a fluorophore that has been activated once can not be reactivated to increase, for example, the "exposure time" for that fluorophore and thus improve the locating accuracy of the emitted photons with the objectives, so that it is advantageous to use lenses with the largest possible numerical aperture and thus the largest possible aperture angle, for an isotropic image field in which the
  • the emitter is a fluorophore which emits electromagnetic excitation radiation to emit the
  • the Fiuorophor in an active by:
  • Electromagnetic excitation radiation excitable state and in a passive state in which excitation is not possible.
  • it can be brought from the active state to the passive state or from the passive state to the active state by electromagnetic radiation.
  • the at least one Fiuorophor is brought into a stimulable state before being excited by an electromagnetic activation radiation. This is often the case in particular with those already described
  • the measured values of the electromagnetic emission radiation emitted by one or more emitters each form an image of the emitters or emitters passing through one of the at least two
  • Lenses was passed to the at least one optical detector.
  • the images are weighted differently when determining the position of the at least one emitter.
  • the images are weighted less heavily the wider they are on the optical detector and / or the less emission radiation has been detected by the optical detector for the particular image.
  • the wider the image on the detector the more "blurred" the image of the emitter is, for example, because the emitter is relatively far out of the focal plane or the focal volume of the lens. Since the localization accuracy depends on the amount of collected photons, it decreases as the less emission radiation from the optical detector for an image is detected.
  • the different weighting can also be iterative. Thus, it is possible, for example, first to determine the position of the emitter in the aforementioned manner with or without additional weighting and to determine from the positions thus determined which emitters are furthest outside the focal planes of the individual objectives.
  • one or more iteratively can renew
  • Position determinations are performed in which the images of these emitters are weighted according to the determined in the previous step positions.
  • the position of the emitter in the imaging plane belonging to the respective objective is determined from the measured values recorded by the optical detector and / or the images formed therefrom.
  • Brightness distribution by a function such as a Gaussian function, or by several, for example, two or three Gaussian functions, attach and determine in this way how many emitters are at least likely responsible. In this way, a probable
  • electromagnetic emission radiation of an emitter which is passed through in each case one of the at least two lenses on the optical detector, determines an orientation of the emitter in space. Assuming that the emitter is a radiating dipole, the amount of radiated is
  • electromagnetic radiation is not distributed isotropically over all spatial directions.
  • the radiation characteristic of the dipole is known, so that from the
  • Subsets of incident on the optical detector emission radiation for each different lenses on the orientation of the dipole and thus the orientation of the emitter can be closed in space.
  • the invention also achieves the stated object by an apparatus for carrying out one of the methods described here, comprising at least two lenses with optical axes which are linearly independent of one another
  • the device also has an optical detector, an electrical controller for evaluating the detector measured values and at least one
  • the device has at least two, preferably at least three, more preferably at least four objectives. These should be positioned as close as technically feasible to the tetrahedral arrangement, which offers a nearly isotropic spatial resolution. This is difficult with commercially available lenses, possibly even impossible.
  • a device manufactured by the inventors has four lenses, one of which is arranged vertically below the sample holder, and at the same time serves as a supply for the excitation radiation and optionally the activation radiation.
  • This objective is advantageously oriented vertically upwards and designed as an air immersion objective with a numerical aperture of 0.75.
  • Above the sample holder there are three identical lenses, which are advantageously designed as water immersive lenses with a numerical aperture of, for example, 0.8.
  • the optical axes of the upper lenses intersect the optical axis of the lower one
  • Lens in the aforementioned embodiment at an angle of 125.5 °.
  • the deviation from the optimum tetrahedral angle of 109.5 ° has the consequence that more information is collected via the positioning in the x and y directions, ie a direction perpendicular to the optical axis of the lower objective, than via the perpendicularly extending z-axis.
  • the focal volume, in which the highest resolution and localization accuracy is present, is formed by the four focal planes of the four lenses, each having a thickness of the focal depth.
  • lenses with a smaller numerical aperture they can be arranged at an angle closer to the optimum
  • Tetrahedral angle of 09.5 ° Due to the lower numerical aperture, however, not so many photons emitted by the respective fluorophore are captured and directed to the optical detector, so that the
  • lenses with the largest possible aperture angle are used. This corresponds to half the opening angle and is preferably at least 17.5 °.
  • At least one of the lenses is designed as an immersion objective, preferably as a water immersion objective.
  • the sample holder in this case has an immersion liquid,
  • the vessel advantageously has a depth which allows the vessel to be filled with immersion liquid so high that the entrance lenses of the immersion objectives are completely submerged therein.
  • immersion liquid water or an aqueous medium is advantageously used.
  • the proportion of water in the aqueous medium used is advantageously 80%, particularly preferably 89%.
  • Immersion liquids are preferably liquids, as they are in the state of Technique of super-resolution microscopy can be used in particular with regard to the fluorescence properties of the markers and / or the structure of the cell. These are known to the person skilled in the art, so that a further description is omitted here.
  • the sample holder has a cover glass, which is arranged such that at least a part of a emitted from the emitter
  • Emission radiation on the way to one of the lenses passes through the coverslip, and which has a refractive index that the
  • Immersion liquid in particular at a wavelength of
  • Cover glass does not affect the beam path in the upper lenses, in particular due to the transition at the interface between the coverslip and the surrounding water.
  • the cover glass consists of a fluoropolymer and has a refractive index of 1.34. This minimizes influences of the cover glass on the optical image.
  • cover glass with a refractive index deviating from the refractive index of the immersion liquid it is preferable to use a suitable cover slip.
  • the device has an environmental structure surrounding the sample, in which at least one lens is embedded.
  • These are advantageously lenses that simultaneously meet the sine and the Herrschel conditions.
  • Such lenses are known in the art.
  • Both the lateral and the axial magnification corresponds to the ratio of the refractive indices in the sample and in the image space. This results in a "swapping out" of the image, which results in the individual lenses being able to be arranged at a greater distance from one another, which means that the installation space required for the objectives no longer becomes a limiting factor, so that lenses with a larger numerical aperture are also used can be.
  • a particularly advantageous embodiment of the environmental structure is tetrahedral with four lenses embedded therein, which are arranged in the surfaces of the tetrahedron.
  • the environmental structure may also be part of the sample holder.
  • At least one of the lenses used has a holder which allows translation in different, advantageously all, spatial directions and permits tilting or rotation of the objective. Only a rotation around the optical axis is not necessary.
  • the different optical detectors are particularly preferably part of a single optical chip, for example a CCD chip, which is part of a digital camera. If the embodiment described above is used with three upper and one lower objective, it is sufficient for one, preferably the lower one
  • Lenses allow a movement only along its optical axis.
  • the sample is attached to a sample holder separately on a sample table on which it is placed, in all three if possible
  • the entire device is preferably mounted on a vibration-damped table, for example a Heiliagerston.
  • a vibration-damped table for example a Luftiagerston.
  • the position was measured 100 times and the emitter position was determined with two, three or four lenses. From the distribution of these emitter positions calculated in this way, the standard deviation and the FWHM can be used as a measure of the localization accuracy, including the lower lens and one, two or three of the upper lenses used lenses have a half-width of 9 nm in the x-direction, 8 nm in the y-direction and 20 nm in the z-direction resulting in standard deviations of 3.8 nm, 3.4 nm and 8.5 nm used three lenses, two of which are located above the sample holder, results in a half-width of 11 nm in the x-direction, 9 nm in the y-direction and 15 nm in the z-direction, resulting in standard deviations of 4.7 nm, 3 When using all four objectives, a half-width of 11 nm in the x-direction, 8 nm in the y-direction
  • Embodiment of the present invention explained in more detail. It shows the schematic representation of a section of a device according to a first embodiment of the present invention, the schematic section through a part of a device according to the embodiment of the present invention, the schematic section through a sample holder of such a device and the schematic plan view of the lens assembly Figure 1 and a schematic plan view of an objective assembly with a modified sample holder.
  • Figure 1 shows the detail of a device according to a first
  • Embodiment of the present invention Centrally there is a sample holder 2, which is designed as a water-fillable vessel. Below the sample holder 2 is a first lens 4, which is formed in the present embodiment as Heilimmersions solicitiv with a numerical aperture of 0.75.
  • the first objective 4 serves to guide at least part of the electromagnetic emission radiation emitted by the fluorophore to an optical detector (not shown) and, on the other hand, to conduct electromagnetic radiation
  • FIG. 2 shows a section through the embodiment shown in FIG. One recognizes the sample holder 2, the first objective 4 and one of the second objectives 8. In the central region of the sample holder 2 there is an elevation 10 on which the sample 6 is arranged and which ensures that the sample 6 is at the optimum distance from one another first input lens 12 of the first lens 4 can be arranged.
  • the sample holder 2 is up to one
  • Water level 14 which is shown in Figure 2 by a dashed line, filled with water. This water level 14 must be so high that a second input lens 16 is completely covered with water.
  • Figure 3 shows an enlarged sectional view of the sample holder 2 with the central elevation 10, on which the sample 6 is to be arranged, and the
  • the three second lenses 8 can be seen, which are arranged around the sample 6.
  • wavefronts 18 are shown, which correspond to the electromagnetic emission radiation. Due to the design of the lenses 8, the space is the limiting factor and the lenses 8 are very close to each other.
  • the three second objectives 8 are arranged around the sample 6, a sample holder 2 having an environmental structure 20 being arranged around the sample 6.
  • the first objective 4 is not shown in this illustration. It "looks" from below from the plane of the drawing on the sample 6.
  • lenses 22 are embedded, which have a lateral and an axial magnification, which correspond to the ratio of the refractive indices in the sample 2 lying outside the surrounding structure 20 image space 24.
  • the perfect real intermediate images 28 are observed by the second objectives 8. As a result, they can be arranged at a greater distance from the sample 6 and the installation space of the Lenses 8 is no longer the limiting factor.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Lokalisieren wenigstens eines Emitters elektromagnetischer Emissionsstrahlung mittels eines Lokalisatlonsmikroskops, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Leiten der elektromagnetischen Emissionsstrahlung durch wenigstens zwei Objektive (4, 8) auf wenigstens einen optischen Detektor, wobei die optischen Achsen der wenigstens zwei Objektive (4, 8) in voneinander linear unabhängigen Richtungen verlaufen, b) Detektieren der elektromagnetischen Emissionsstrahlung durch den wenigstens einen optischen Detektor, wobei der wenigstens eine optische Detektor Messwerte aufnimmt, und c) Ermitteln der Position des wenigstens einen Emitters aus den von dem optischen Detektor aufgenommenen Messwerten.

Description

Verfahren zum Lokalisieren wenigstens eines Emitters mittels eines Lokalisationsmikroskops
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Lokalisieren wenigstens eines Emitters elektromagnetischer Emissionsstrahlung mittels eins Lokalisationsmikroskops sowie eine Vorrichtung zum Durchführen eines derartigen Verfahrens. Derartige Verfahren sind heute in unterschiedlichen Ausgestaltungen im Stand der Technik bekannt. Es können Emitter in Bildgebungs- und/oder Tracking- Verfahren beobachtet werden, die kleiner als die dem Abbe'schen
Aufiösungskriterium entsprechenden Abmessungen sind. Dies sind
beispielsweise Kohlenstoff-Nano-Röhren, Quantenpunkte oder Fluorophore. Insbesondere die Fluorophore werden mit elektromagnetischer
Anregungsstrahlung zum Leuchten angeregt. Die von dem Emitter ausgesandte elektromagnetische Emissionsstrahlung wird aufgefangen und über geeignete Objektive und optische Anordnungen auf einen optischen Detektor,
beispielsweise einen CCD-Chip einer digitalen Kamera geleitet. Man erhält somit im Bildfeld des jeweiligen Objektivs verteilt liegende Punktbilder, die jeweils einem Emitter zugeordnet werden können. Die Zentren dieser
Punktbilder korrespondieren mit der lateralen Position der Emitter im
beobachteten Volumen. Die gattungsgemäßen Verfahren sind insbesondere dann interessant, wenn die zu beobachtenden Emitter so dicht beieinander angeordnet sind, dass sie mit einem herkömmlichen Beobachtungssystem nach Abbe wegen der optischen Auflösungsgrenze nicht aufgelöst und getrennt werden können. Für diesen Anwendungsfall sind sogenannte„super-resolution-microscopy"-Verfahren entwickelt worden. Dabei werden Fluorophore verwendet, die beispielsweise durch einen Farbstoff gebildet werden. Dieser Farbstoff kann in einem aktiven und einem passiven Zustand vorliegen. Der aktive Zustand unterscheidet sich von dem passiven Zustand in mindestens einem optischen Merkmal. Im passiven Zustand ist beispielsweise eine Anregung durch die
elektromagnetische Anregungsstrahlung nicht möglich. Nur wenn der
Fluorophor in dem aktiven Zustand voriiegt, ist er durch die elektromagnetische Anregungsstrahlung anregbar. Nur in diesem Fall kann er zürn Leuchten angeregt werden.
Es sind Fluorophore bekannt, die durch elektromagnetische
Aktivierungsstrahlung aus einem passiven Zustand in einen aktiven Zustand gebracht werden können. Ebenso sind Fluorophore bekannt, die aus einem aktiven in einen passiven Zustand bringbar sind. Im Folgenden wird von
Aktivierungsstrahlung gesprochen, da in der Regel Fluorophore verwendet werden, die durch die elektromagnetische Aktivierungsstrahlung in einen aktiven Zustand gebracht werden können. Dies ist jedoch auch für die hier beschriebenen Verfahren nicht zwingend nötig. Aus dem Stand der Technik sind Verfahren bekannt, bei denen durch die Aktivierungsstrahlung nur ein Teil der jeweils vorhandenen Fluorophore vom inaktiven oder passiven Zustand in den aktiven Zustand gebracht werden kann, sodass der Abstand zwischen zwei auf diese Weise aktivierten Fluorophoren größer ist, als es der optischen Auflösungsgrenze nach Abbe entspricht. Diese Verfahren können als
Einzelmoleküf-schalten („single-marker-switching" SMS) bezeichnet werden und sind aus dem Stand der Technik bekannt. Je nach verwendetem
Schaltmechanismus, der verwendet wird, sind sie als„photo activated
localization microscopy" (PALM),„stochastic optical reconstruction microscopy" (STORM),„fluorescence photoactivation localization microscopy" (FPALM), „PALM with independently running acquisition" (PALMIRA),„ground State depletion microscopy followed by individual molecule return" (GSDIM) oder „direct STORM" (dSTORM) bekannt. Diese Aufzählung umfasst Verfahren, bei denen Fluorophore durch Strahlung in den aktiven Zustand gebracht werden und Verfahren, bei denen Fluorophore durch Strahlung in den passiven
Zustand gebracht werden.
Die Verfahren haben eine hohe laterale Lokalisierungsgenauigkeit von weniger als 20 - 30 Nanometern. In axialer Richtung ist das beobachtbare Volumen jedoch auf eine Schicht von ca. 1 pm begrenzt. Derartige Verfahren sind beispielsweise in der WO 2009/146016 A1 beschrieben. Es sind Versuche unternommen worden, auch in axialer Richtung eine gute Lokalisierungsgenauigkeit zu erreichen. Bisher muss die Information über die Positionen in dieser Richtung jedoch indirekt ermittelt werden. Dazu werden Techniken wie Zwei-Ebenen-Detektion, Astigmatismus oder Doppelhelix verwendet, wobei die Punktspreizfunktion („point-spread-function", PSF) modifiziert wird, um die Position entlang der optischen Achse aus der z- abhängigen Änderung dieser Funktion zu bestimmen. Dies führt jedoch nicht zu einer isotropen Auflösung in allen Raumrichtungen. Im Interferenzverfahren erreichen einander gegenüber liegende Objektive (4Pi) eine bessere axiale Auflösung. Alle diese Verfahren sind jedoch auf Schichtdicken von ca. 1 pm begrenzt.
Die Verwendung von Farbstoffen, die als emittierende Marker verwendet werden, ist insbesondere für die Betrachtung biologischer Objekte,
beispielsweise lebender oder fixierter Zellen, von Interesse. Um die gesamte Zelle betrachten zu können, ist jedoch ein beobachtbares Volumen von nur einem pm Dicke nicht ausreichend, sodass die gute axiale Auflösung nicht über den gesamten Bereich der Zelle erreicht wird. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zum
Lokalisieren wenigstens eines Emitters elektromagnetischer
Emissionsstrahlung mittels eines Lokalisationsmikroskops so zu verbessern, dass eine isotrope oder zumindest nahezu isotrope Auflösung über ein großes Bildfeld, insbesondere in drei Raumrichtungen, erreicht wird.
Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe durch ein Verfahren zum Lokalisieren wenigstens eines Emitters elektromagnetischer Emissionsstrahlung mittels eines Lokalisationsmikroskops, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
a) Leiten der elektromagnetischen Emissionsstrahlung durch wenigstens zwei Objektive auf wenigstens einen optischen Detektor, wobei
- die optischen Achsen der wenigstens zwei Objektive in voneinander linear unabhängigen Richtungen verlaufen und b) Detektieren der elektromagnetischen Emissionsstrahlung durch den wenigstens einen optischen Detektor, wobei der wenigstens eine optische Detektor Messwerte aufnimmt, und
c) Ermitteln der Position des wenigstens einen Emitters aus den von dem optischen Detektor aufgenommenen Messwerten.
Die Messwerte entsprechen dabei der Verteilung der auf den optischen
Detektor auftreffenden Photonen, also vorzugsweise deren Menge und
Auftreff Positionen. In diesen so erfassten Daten sind aufgrund der mindestens zwei linear unabhängigen Beobachtungsrichtungen Informationen Über die Position des oder der jeweiligen Emitter enthalten, die mit einem geeigneten Verfahren extrahiert werden können, so dass die Position des oder der jeweiligen Emitter ermittelt werden kann. Dabei können unterschiedliche
Verfahren verwendet werden, wobei unterschiedliche Situationen und
Anforderungen unterschiedliche Verfahren zur Folge haben können.
Anders als bei den Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren die elektromagnetische
Emissionsstrahlung durch wenigstens zwei Objektive auf den optischen
Detektor geleitet, deren optische Achsen in linear unabhängigen Richtungen voneinander verlaufen. Dies entspricht einer Beobachtung des strahlenden Emitters aus zwei unterschiedlichen, linear unabhängigen Richtungen. Die Messwerte der elektromagnetischen Emissionsstrahlung bilden für jedes Objektiv, durch das die elektromagnetische Emissionsstrahlung geleitet wird, jeweils ein Bild des Emitters auf dem optischen Detektor. Dabei wird der Begriff „Bild" im Rahmen der vorliegenden Erfindung nur als Zusammenfassung der Messwerte verstanden, die durch die elektromagnetische Emissionsstrahlung eines oder mehrerer Emitter hervorgerufen werden, die durch eines der wenigstens zwei Objektive geleitet wurde.
Die elektromagnetische Emissionsstrahlung mehrerer Emitter bildet in der Regel bei diesem Verständnis mehrere„Bilder", auch wenn sie durch ein einziges der wenigstens zwei Objektive geleitet wurde. Lediglich für den Fall, dass für wenigstens eins der mehreren Objektive die mehreren Emitter dichter bei einander liegen als die dem Abbe'schen Auflösungskriterium
entsprechende Abmessung kann die elektromagnetische Emissionsstrahlung mehrerer Emitter ein gemeinsames Bild bilden. Dieser Fall kann beispielsweise eintreten, wenn zwei Emitter entlang der optischen Achse des jeweiligen Objektives versetzt angeordnet sind. Die Emitter scheinen dann für das
Objektiv sehr nah beieinander zu sein, obwohl der tatsächliche Abstand dem Auflösungskriterium entsprechende Abmessung überschreiten kann. Dies lässt sich in der Regel durch die„Bilder" des zumindest eines weiteren Objektives auflösen.
Aus der Kenntnis dieser Messwerte des optischen Detektors sowie der
Parameter, die die Lage und Blickrichtung des jeweiligen Objektivs bestimmen, lassen sich beispielsweise durch Lösen eines linearen Gieichungssystems dreidimensionale Koordinaten des jeweils emittierenden Emitters ermitteln. Durch die Beobachtung des Volumens, in dem sich der Emitter befindet, aus zwei unterschiedlichen, linear unabhängigen Blickrichtungen, erhält man auf direktem Wege Informationen über die Position des Emitters in zwei
zueinander verkippten Ebenen, und damit über die dreidimensionale Position im Raum.
Jedes Objektiv leitet die Emissionsstrahlung auf wenigstens einen optischen Detektor. Die verschiedenen optischen Detektoren können Teil einer einzigen Detektoranordnung sein, die beispielsweise in Form eines CCD-Chips einer Digitälkamera vorliegen kann. In diesem Fall würden beispielsweise die unterschiedlichen Objektive die jeweils von ihnen weitergeleitete
Emissionsstrahlung auf unterschiedliche Bereiche des Chips übermitteln.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird die
elektromagnetische Emissionsstrahlung durch wenigstens drei, bevorzugt wenigstens vier Objektive auf den wenigstens einen optischen Detektor geleitet, wobei die optischen Achsen der Objektive in paarweise linear unabhängigen Richtungen verlaufen. Durch die Verwendung von mehr als zwei Objektiven wird die Isotropie des Auflösungsvermögens und der Lokalisierungsgenauigkeit verbessert. Die optimale Positionierung von beispielsweise vier Objektiven ist die Tetraederanordnung. Zwischen jeweils zwei der Objektive ist dann der Tetraederwinkel von 09,5° eingeschlossen. In diesem Fall ist die Lokalisierungsgenauigkeit nahezu isotrop, wenn die
Objektive effektiv den gleichen Aperturwinkel aufweisen.
Die Lokalisierungsgenauigkeit, mit der die Position eines Emitters bestimmt werden kann, hängt von der Anzahl der durch die Objektive weitergeleiteten Photonen ab, die von dem jeweiligen Emitter ausgesandt werden. Vielfach verfügen beispielsweise die als Fluorophor verwendeten Farbstoffe nur über eine begrenzte Aktivitätsdauer, sodass die Anzahl der aussendbaren Photonen begrenzt ist. Da die einzelnen Fluorophore zumeist durch stochastische
Prozesse von dem inaktiven oder passiven Zustand in den aktiven Zustand geschaltet werden, lässt sich ein einmal aktivierter Fluorophor nicht gesteuert erneut aktivieren, um beispielsweise die„Belichtungszeit" für diesen Fluorophor zu erhöhen und somit die Lokaiisierungsgenauigkeit zu verbessern. Es ist daher wichtig, möglichst viele der ausgesandten Photonen mit den Objektiven aufzufangen, sodass es von Vorteil ist, Objektive mit einer möglichst großen numerischen Apertur und somit einem möglichst großen Aperturwinkel zu verwenden. Für ein isotropes Bildfeld, bei dem auch die
Lokalisierungsgenauigkeit in allen drei Raumrichtungen zumindest nahezu isotrop ist, ist es von Vorteil, wenn alle Objektive effektiv den gleichen
Aperturwinkel aufweisen.
Bei der Verwendung von mehr als drei Objektiven ist es nicht mehr möglich, alle Richtungen der optischen Achsen linear unabhängig voneinander auszugestalten, sodass nur die paarweise lineare Unabhängigkeit
gewährleistet sein kann.
Dadurch wird das Gleichungssystem, das zum Ermitteln der Position der Fluorophore zu lösen ist, überbestimmt. Auch dadurch wird die
Lokalisierungsgenauigkeit weiter gesteigert. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Emitter um einen Fiuorophor, der mittels elektromagnetischer Anregungsstrahlung zum Aussenden der
elektromagnetischen Emissionsstrahlung angeregt wird.
Vorteilhafterweise kann der Fiuorophor in einem aktiven, durch
elektromagnetische Anregungsstrahlung anregbaren Zustand und in einem passiven Zustand vorliegen, in dem eine Anregung nicht möglich ist.
Vorzugsweise kann er durch elektromagnetische Strahlung von dem aktiven Zustand in den passiven Zustand oder von dem passiven Zustand in den aktiven Zustand gebracht werden.
Vorteilhafterweise wird der wenigstens eine Fiuorophor vor dem Anregen durch eine elektromagnetische Aktivierungsstrahlung in einen anregbaren Zustand gebracht. Dies ist oftmals insbesondere bei den bereits beschriebenen
Verfahren nötig, um zu erreichen, dass der Fiuorophor überhaupt durch die elektromagnetische Anregungsstrahfung angeregt werden kann.
Wie bereits dargelegt, bilden die Messwerte der von einem oder mehreren Emittern ausgesandten elektromagnetischen Emissionsstrahlung jeweils ein Bild der Emitters oder der Emitter, die durch eines der wenigstens zwei
Objektive auf den wenigstens einen optischen Detektor geleitet wurde.
Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, dass unterschiedliche Bilder beim Ermitteln der Position des wenigstens einen Emitters unterschiedlich gewichtet werden. Vorteilhafterweise werden die Bilder weniger stark gewichtet, je breiter sie auf dem optischen Detektor sind und/oder je weniger Emissionsstrahlung von dem optischen Detektor für das jeweilige Biid detektiert wurde. Je breiter ein Bild auf dem Detektor ist, desto„unscharfer" ist das Bild des Emitters. Dies kann beispielsweise dadurch hervorgerufen werden, dass sich der Emitter relativ weit außerhalb der Fokalebene oder des Fokalvolumens des Objektivs befindet. Da die Lokalisierungsgenauigkeit von der Menge der aufgefangenen Photonen abhängt, nimmt sie ab, je weniger Emissionsstrahlung von dem optischen Detektor für ein Bild detektiert wird. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die unterschiedliche Gewichtung auch iterativ erfolgen. So ist es beispielsweise möglich, zunächst die Position der Emitter in genannter Weise mit oder ohne zusätzliche Wichtung zu ermitteln und aus den so bestimmten Positionen zu bestimmen, welche Emitter sich am weitesten außerhalb der Fokalebenen der einzelnen Objektive befinden.
Anschließend kann eine oder können iterativ mehrere erneute
Positionsbestimmungen durchgeführt werden, bei denen die Bilder dieser Emitter entsprechend der im vorigen Schritt bestimmten Positionen gewichtet werden. Aus den vom optischen Detektor aufgenommenen Messwerten und/oder den daraus gebildeten Bildern wird die Position des Emitters in der zu dem jeweiligen Objektiv gehörigen Abbildungsebene ermittelt. Dies kann
beispielsweise durch eine mathematischen Fit, beispielsweise mit einer Gauß- Funktion geschehen. Bei einem derartigen Fit werden in der Regel
Abweichungen definiert, die durch die Fitparameter minimiert werden.
Dabei ist es auch möglich, die Anzahl der Fit-Funktionen zu variieren und damit auch die Anzahl der Emitter zu variieren, deren ausgesandte
elektromagnetische Emissionsstrahlung das jeweils zu fittende Bild
hervorgerufen hat. Eine vom optischen Detektor aufgenommene
Helligkeitsverteilung durch eine Funktion, beispielsweise eine Gauß-Funktion, oder durch mehrere, beispielsweise zwei oder drei Gauß-Funktionen, anzufitten und auf diese Weise zu ermitteln, wie viele Emitter zumindest wahrscheinlich verantwortlich sind. Auf diese Weise lässt sich eine wahrscheinliche
Emitteranordnung und -Anzahl bestimmen. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn Emitter einen kleineren Abstand aufweisen als die durch das Abbe'sche Auflösungskriterium definierte Abmessung. In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird aus Teilmengen der von dem wenigstens einen optischen Detektor detektierten
elektromagnetischen Emissionsstrahlung eines Emitters, die durch jeweils eines der wenigstens zwei Objektive auf den optischen Detektor geleitet wird, eine Orientierung des Emitters im Raum bestimmt. Geht man davon aus, dass der Emitter ein strahlender Dipol ist, ist die Menge der abgestrahlten
elektromagnetischen Strahlung nicht isotrop über alle Raumrichtungen verteilt. Die Strahlungscharakteristik des Dipols ist bekannt, sodass aus den
Teilmengen der auf den optischen Detektor auftreffenden Emissionsstrahlung für die jeweils verschiedenen Objektive auf die Orientierung des Dipols und damit die Orientierung des Emitters im Raum geschlossen werden kann.
Bei Emittern und insbesondere auch bei Fluorophoren lässt sich beispielsweise aus der Ausgeprägtheit der Intensitätsverteiiung auf eine Rotation schließen. Ist die Teilmenge der elektromagnetischen Emissionsstrahlung, die durch die verschiedenen Objektive geleitet wird, beispielsweise für alle Objektive nahezu identisch, spricht dies für eine starke Rotation des strahlenden Dipols, so dass die Strahlungscharakteristik des Dipols sich nicht in der Intensitätsverteilung auf dem optischen Detektor und den jeweiligen Teilmengen der
elektromagnetischen Emissionsstrahlung niederschlägt. Sind die Teilmengen hingegen deutlich unterschiedlich für verschiedene Objektive, ist dies ein Anzeichen dafür, dass der Emitter keine großen Rotationen ausführt.
Bei Tracking-Anwendungen der hier beschriebenen Verfahren, bei denen es um die zeitaufgeiöste Untersuchung von Bewegungen der jeweiligen Emitter geht, kann über eine zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführte Ermittlung der Position der Emitter deren Bewegung im Raum verfolgt und untersucht werden. Durch die Bestimmung und Untersuchung der Veränderung der Teilmengen der ausgesandten Emissionsstrahiung, die auf die einzelnen Objektive verteilt sind, lassen sich Aussagen über Rotationen des Emitters treffen, insbesondere wenn diese so langsam stattfinden, dass innerhalb einer Zeitspanne, die zur Detektion einer ausreichenden Menge der
elektromagnetischen Emissionsstrahlung ausreichend ist, keine oder nur eine geringe Rotation stattfindet.
Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch eine Vorrichtung zum Durchführen eines der hier beschriebenen Verfahren, die wenigstens zwei Objektive mit optischen Achsen, die voneinander in linear unabhängigen
Richtungen verlaufen, und einen Probenhalter aufweist. Die Vorrichtung verfügt natürlich zudem über einen optischen Detektor, eine elektrische Steuerung zum Auswerten der Detektormesswerte und zumindest eine
Einkoppelmöglichkeit, für elektromagnetische Strahlung und/oder über wenigstens eine Strahlungsqueile.
Wie bereits dargelegt, verfügt die Vorrichtung über wenigstens zwei, bevorzugt mindestens drei, besonders bevorzugt wenigstens vier Objektive. Diese sollten so nah wie technisch realisierbar an der Tetraederanordnung positioniert werden, die eine nahezu isotrope Ortsauflösung bietet. Dies ist mit kommerziell erhältlichen Objektiven nur schwer, gegebenenfalls sogar gar nicht möglich. Eine von den Erfindern hergestellte Vorrichtung verfügt über vier Objektive, von denen eines senkrecht unterhalb des Probenhalters angeordnet ist, und gleichzeitig ais Zuführung für die Anregungsstrahlung und gegebenenfalls die Aktivierungsstrahlung dient. Dieses Objektiv ist vorteilhafterweise senkrecht nach oben gerichtet und als Luftimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,75 ausgebildet. Oberhalb des Probenhalters befinden sich drei identische Objektive, die vorteühafterweise ais Wassertauchobjektive mit einer numerischen Apertur von beispielsweise 0,8 ausgebildet sind. Die optischen Achsen der oberen Objektive schneiden die optische Achse des unteren
Objektivs im genannten Ausführungsbeispiel unter einem Winkel von 125,5°. Eine Anordnung, die näher an der optimalen Tetraederanordnung ist, ist durch den für die Objektive nötigen Bauraum mit den gewählten Objektiven nicht möglich. Die Abweichung vom optimalen Tetraederwinkel von 109,5° hat zur Folge, dass über die Positionierung in x- und y-Richtungen, also einer Richtung senkrecht zur optischen Achse des unteren Objektivs, mehr Informationen gesammelt werden, als über die senkrecht dazu verlaufende z-Richtung in Blickrichtung des unteren Objektivs, sodass die Lokalisationsgenauigkeit nicht vollständig isotrop ausgebildet ist. Das Fokalvolumen, in dem die höchste Auflösung und Lokalisierungsgenauigkeit vorliegt, wird gebildet durch die vier Fokusebenen der vier Objektive, die jeweils eine Dicke der Fokaltiefe („focal depth") aufweisen.
Werden Objektive mit kleinerer numerischer Apertur verwendet, lassen diese sich in einem Winkel zueinander anordnen, der näher am optimalen
Tetraederwinkel von 09,5° liegt. Durch die geringere numerische Apertur werden jedoch nicht so viele von dem jeweiligen Fluorophor ausgesandte Photonen aufgefangen und zum optischen Detektor geleitet, sodass die
Isotropie der Lokalisationsgenauigkeit zwar zunimmt, die
Lokalisationsgenauigkeit selbst jedoch abnimmt, da sie von der Anzahl der aufgefangenen Photonen abhängt. Vorzugsweise werden Objektive mit einem möglichst großen Aperturwinkel verwendet. Dieser entspricht dem halben Öffnungswinkel und beträgt vorzugsweise mindestens 17,5°.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist wenigstens eines der Objektive als Immersionsobjektiv, vorzugsweise als ein Wassertauchobjektiv, ausgebildet. Der Probenhalter weist in diesem Fall ein mit Immersionsflüssigkeit,
vorzugsweise mit Wasser oder wässrigem Medium, gefülltes oder füllbares Gefäß auf, in das das wenigstens ein Immersionsobjektiv eintaucht. Im zentralen Bereich des Gefäßes befindet sich im Boden des Gefäßes direkt unterhalb der zu beobachtenden Probe vorteilhafterweise eine Erhöhung, damit der Abstand zwischen dem sich darunter befindlichen Objektiv und der zu beobachtenden Probe auf die optimale Länge eingestellt werden kann. Das Gefäß weist vorteilhafterweise eine Tiefe auf, die es erlaubt, das Gefäß so hoch mit Immersionsflüssigkeit zu befüllen, dass die Eingangslinsen der Immersionsobjektive vollständig darin eintauchen. Als Immersionsflüssigkeit wird vorteilhafterweise Wasser oder ein wässriges Medium verwendet. Der Wasseranteil im verwendeten wässrigen Medium beträgt vorteilhafterweise 80%, besonders bevorzugt 89%. Derartige
Immersionsflüssigkeiten sind vorzugsweise Flüssigkeiten, wie sie im Stand der Technik der Superauflösungsmikroskopie insbesondere im Hinblick auf die Fluoreszenzeigenschaften der Marker und/oder den Strukturerhalt der Zelle verwendet werden. Diese sind dem Fachmann bekannt, so dass auf eine weitere Beschreibung an dieser Stelle verzichtet wird.
Vorzugsweise weist der Probenhalter ein Deckglas auf, das derart angeordnet ist, dass zumindest ein Teil einer von dem Emitter ausgesandten
Emissionsstrahlung auf dem Weg zu einem der Objektive das Deckglas passiert, und das einen Brechungsindex aufweist, der dem der
Immersionsflüssigkeit, insbesondere bei einer Wellenlänge der
Emissionsstrahlung, entspricht. Auf diese Weise wird erreicht, dass das
Deckglas den Strahlengang in die oberen Objektive insbesondere durch den Übergang an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas und dem umgebenden Wasser, nicht beeinflusst. Vorzugsweise besteht das Deckglas aus einem Fluoropolymer und weist einen Brechungsindex von 1 ,34 auf. Dadurch werden Einflüsse des Deckglases auf die optische Abbildung minimiert.
Wird ein Deckglas mit einem vom Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit abweichenden Brechungsindex verwendet, wird vorzugsweise ein entspiege!tes Deckglas verwendet.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Vorrichtung verfügt die Vorrichtung über eine die Probe umgebende Umgebungsstruktur, in die wenigstens eine Linse eingebettet ist. Dabei handelt es sich vorteilhafterweise um Linsen, die gleichzeitig die Sinus- und die Herrschel-Bedingung erfüllen. Derartige Linsen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Sowohl die laterale als auch die axiale Vergrößerung entspricht dabei dem Verhältnis der Brechungsindexe in der Probe und im Bildraum. Dies hat eine„Auslagerung" des Bildes zur Folge, was dazu führt, dass die einzelnen Objektive in einem größeren Abstand zueinander angeordnet werden können. Dadurch wird der für die Objektive nötige Bauraum nicht mehr zur limitierenden Größe, sodass auch Objektive mit größerer numerischer Apertur verwendet werden können. Dabei kann in die Umgebungsstruktur nur eine Linse oder eine Mehrzahl von Linsen eingebettet sein, so dass das Bild für ein Objektiv, für einige Objektive oder für alle Objektive„ausgelagert" werden kann. Die tatsächlich gewählte Ausgestaltung hängt unter anderem vom benötigten Bauraum der Objektive ab. Eine besonders vorteilhafte Ausgestaltung der Umgebungsstruktur ist tetraederförmig mit vier darin eingebetteten Linsen, die in den Flächen des Tetraeders angeordnet sind.
Eine andere vorteilhafte Ausgestaltung weist eine tetraederförmige
Umgebungsstruktur auf, in die nur drei Linsen eingebettet sind. Diese befinden sich vorzugsweise in den drei Seitenflächen des Tetraeders, während die Boden- oder Grundfläche keine Linse aufweist. Eine solche Umgebungsstruktur kann einfach über eine bereits auf dem Probenhaiter angeordnete Probe gesetzt werden, so dass die Montage und Demontage, beispielsweise zum Wechseln der Probe sehr einfach möglich ist.
Natürlich kann die Umgebungsstruktur auch Teil des Probenhalters sein.
Vorteilhafterweise verfügt wenigstens eines der verwendeten Objektive, bevorzugt jedoch alle der verwendeten Objektive, über eine Halterung, weiche die Translation in unterschiedliche, vorteilhafterweise alle, Raumrichtungen ermöglicht und eine Verkippung oder Rotation des Objektivs erlaubt. Einzig eine Rotation um die optische Achse ist nicht nötig. Die unterschiedlichen optischen Detektoren sind besonders bevorzugt Teil eines einzigen optischen Chips, beispielsweise eines CCD-Chips, der Teil einer Digitaikamera ist. Wird die bereits beschriebene Ausgestaltung mit drei oberen und einem unteren Objektiv verwendet, ist es ausreichend, für eines, bevorzugt das untere
Objektive, eine Bewegung nur entlang seiner optischen Achse zu erlauben. Vorzugsweise ist die Probe an einem Probenhalter befestigt, der separat auf einem Probentisch, auf dem er angeordnet ist, in möglichst allen drei
Raumrichtungen verschiebbar ist. Die gesamte Vorrichtung ist vorzugsweise auf einem schwingungsgedämpften Tisch, beispielsweise einem Luftiagertisch, gelagert. Verwendet man die bereits beschriebene Ausgestaltung mit einem Objektiv unterhalb und einem, zwei oder drei weiteren Objektiven oberhalb des
Probenhalters, wobei der Winkel zwischen der optischen Achse der oberen Objektive und der optischen Achse des unteren Objektivs 125,5° beträgt, lässt sich die Lokalisationsgenauigkeit bei der Verwendung unterschiedlicher
Anzahlen von Objektiven zeigen. Dazu wurde zunächst die Position 100-mal gemessen und die Emitterposition mit zwei, drei oder vier Objektiven ermittelt. Von der Verteilung dieser so ausgerechneten Emitterpositionen iässt sich die Standardabweichung und die Halbwertsbreite („füll width at half maximum" FWHM) als Maß für die Lokalisationsgenauigkeit berechnen. Es wurde jeweils das untere Objektiv und ein, zwei oder drei der oberen Objektive einbezogen. Bei zwei verwendeten Objektiven ergibt sich eine Halbwertsbreite von 9 nm in x-Richtung, 8 nm in y-Richtung und 20 nm in z-Richtung. Daraus ergeben sich Standardabweichungen von 3,8 nm, 3,4 nm und 8,5 nm. Werden stattdessen drei Objektive, von denen zwei oberhalb des Probenhalters angeordnet sind, verwendet, ergibt sich eine Halbwertsbreite von 11 nm in x-Richtung, 9 nm in y- Richtung und 15 nm in z-Richtung, was zu Standardabweichungen von 4,7 nm, 3,8 nm und 6,4 nm führt. Bei der Verwendung aller vier Objektive ergibt sich eine Haibwertsbreite von 11 nm in x-Richtung, 8 nm in y-Richtung und 12 nm in z-Richtung, woraus sich Standardabweichungen von 4,7 nm, 3,4 nm und 5,1 nm ergeben.
Diese Standardabweichungen ergeben sich bei der Näherung, dass es sich um Gauß-Verteilungen handelt.
Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch eine Umgebungsstruktur für eine hier beschriebene Vorrichtung. Mit Hilfe der beiliegenden Zeichnungen wird nachfolgend ein
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung näher erläutert. Es zeigt die schematische Darstellung eines Ausschnittes aus einer Vorrichtung gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, den schematischen Schnitt durch einen Teil einer Vorrichtung gemäß dem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung, den schematischen Schnitt durch einen Probenhalter einer derartigen Vorrichtung und die schematische Draufsicht auf die Objektivanordnung aus Figur 1 und eine schematische Draufsicht auf eine Objektivanordnung mit einem geänderten Probenhalter.
Figur 1 zeigt den Ausschnitt einer Vorrichtung gemäß einem ersten
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Zentral befindet sich ein Probenhalter 2, der als ein mit Wasser befüllbares Gefäß ausgebildet ist. Unterhalb des Probenhalters 2 befindet sich ein erstes Objektiv 4, das im vorliegenden Ausführungsbeispiel als Luftimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,75 ausgebildet ist. Das erste Objektiv 4 dient einerseits dazu, zumindest einen Teil der von dem Fluorophor ausgesandten elektromagnetischen Emissionsstrahlung auf einen nicht gezeigten optischen Detektor zu leiten und andererseits dazu, elektromagnetische
Anregungsstrahlung auf eine Probe 6 zu senden, die sich in der Mitte des Probenhalters 2 befindet.
Oberhalb des Probenhalters 2 sind in Figur 1 drei zweite Objektive 8 dargestellt, die vorteilhafterweise identisch ausgebildet sind. Im gezeigten Ausführungsbeispiel sind sie als Wassertauchobjektive mit einer numenschen Apertur von 0,8 ausgebildet. Die optischen Achsen der verschiedenen Objektive 4,8 schneiden sich vorteilhafterweise in einem Punkt, der in der Probe 6 liegt. Figur 2 zeigt einen Schnitt durch die in Figur 1 gezeigte Ausführungsform. Man erkennt den Probenhalter 2, das erste Objektiv 4 und eines der zweiten Objektive 8. Im zentralen Bereich des Probenhalters 2 befindet sich eine Erhöhung 10, auf der die Probe 6 angeordnet ist und die dafür sorgt, dass die Probe 6 im optimalen Abstand zu einer ersten Eingangslinse 12 des ersten Objektivs 4 angeordnet werden kann. Der Probenhalter 2 ist bis zu einem
Wasserstand 14, der in Figur 2 durch eine gestrichelte Linie dargestellt ist, mit Wasser gefüllt. Dieser Wasserstand 14 muss so hoch sein, dass eine zweite Eingangslinse 16 vollständig mit Wasser bedeckt ist. Figur 3 zeigt eine vergrößerte Schnittdarstellung des Probenhalters 2 mit der zentralen Erhöhung 10, auf der die Probe 6 anzuordnen ist, und dem
Wasserstand 14, bis zu dem der Probenhalter 2 mit Wasser gefüllt wird.
Im oberen Teil der Figur 4 sind die drei zweiten Objektive 8 zu erkennen, die um die Probe 6 angeordnet sind. In gestrichelten Kreisen sind Wellenfronten 18 dargestellt, die der elektromagnetischen Emissionsstrahlung entsprechen. Aufgrund der Bauart der Objektive 8 ist der Bauraum der limitierende Faktor und die Objektive 8 stehen sehr nah beieinander. Im unteren Bereich der Figur 4 sind die drei zweiten Objektive 8 um die Probe 6 herum angeordnet, wobei um die Probe 6 ein Probenhaiter 2 angeordnet ist, der eine Umgebungsstruktur 20 aufweist. Das erste Objektiv 4 ist in dieser Darstellung nicht gezeigt. Es„blickt" von unten aus der Zeichenebene auf die Probe 6. In dieser sind schematisch dargestellte Linsen 22 eingebettet, die eine laterale und eine axiale Vergrößerung aufweisen, welche dem Verhältnis der Brechungsindexe in der Probe 2 außerhalb der Umgebungsstruktur 20 liegenden Bildraum 24 entsprechen. Die perfekten reellen Zwischenbilder 28 werden durch die zweiten Objektive 8 beobachtet. Dadurch können diese in größerem Abstand zur Probe 6 angeordnet werden und der Bauraum der Objektive 8 ist nicht mehr der begrenzende Faktor.
Bezugszeichenliste
2 Probenhalter
4 erstes Objektiv
6 Probe
8 zweites Objektiv
10 Erhöhung
12 erste Eingangsünse
14 Wasserstand
16 zweite Eingangslinse
18 Wellenfront
20 Umgebungsstruktur
22 Linse
24 Bildraum
28 reelles Zwischenbild

Claims

Patentansprüche:
1 . Verfahren zum Lokalisieren wenigstens eines Emitters
elektromagnetischer Emissionsstrahlung mittels eines
Lokalisationsmikroskops, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
a) Leiten der elektromagnetischen Emissionsstrahlung durch
wenigstens zwei Objektive (4,8) auf wenigstens einen optischen Detektor, wobei
- die optischen Achsen der wenigstens zwei Objektive (4,8) in voneinander linear unabhängigen Richtungen verlaufen, b) Delektieren der elektromagnetischen Emissionsstrahlung durch den wenigstens einen optischen Detektor, wobei der wenigstens eine optische Detektor Messwerte aufnimmt, und
c) Ermittein der Position des wenigstens einen Emitters aus den von dem optischen Detektor aufgenommenen Messwerten.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die
elektromagnetische Emissionsstrahlung durch wenigstens drei, bevorzugt wenigstens vier Objektive (4, 8) auf den wenigstens einen optischen Detektor geleitet wird, wobei die optischen Achsen der Objektive (4, 8) in paarweise linear unabhängigen Richtungen verlaufen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Emitter ein Fluorophor ist, der mittels
elektromagnetischer Anregungsstrahlung zum Aussenden der
elektromagnetischen Emissionsstrahlung angeregt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch
gekennzeichnet, dass die Messwerte der von einem Emitter
ausgesandten elektromagnetischen Emissionsstrahlung, die durch je ein Objektiv auf den wenigstens einen optischen Detektor geleitet wurde, je ein Bild des Emitters bilden und unterschiedliche Bilder beim Ermitteln der Position des wenigstens einen Emitters unterschiedlich gewichtet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Bilder
weniger stark gewichtet werden, je breiter sie auf dem optischen Detektor sind und/oder je weniger Emissionsstrahlung für das Bild von dem optischen Detektor detektiert wurde,
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass aus Teilmengen der von dem wenigstens einen optischen Detektor detektierten elektromagnetischen Emissionsstrahlung eines Emitters, die durch jeweils eines der wenigstens zwei Objektive (4, 8) auf den optischen Detektor geleitet wird, eine Orientierung des Emitters im Raum bestimmt wird.
7. Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der
vorstehenden Ansprüche, die wenigstens zwei Objektive {4, 8) mit optischen Achsen, die in voneinander linear unabhängigen Richtungen verlaufen, und einem Probenhalter (2) aufweist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass
wenigstens ein Objektiv (8) ein Immersionsobjektiv, vorzugsweise ein Wassertauchobjektiv, ist und der Probenhalter (2) ein mit einer
Immersionsflüssigkeit, vorzugsweise einem wässrigen Medium, gefülltes oder füllbares Gefäß aufweist, in das das wenigstens eine
Immersionsobjektiv (8) eintaucht.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenhalter (2) ein Deckglas aufweist, das derart angeordnet ist, dass zumindest ein Teil einer von einem Emitter ausgesandten
Emissionsstrahlung auf dem Weg zu einem der Objektive das Deckglas passiert, und das einen Brechungsindex aufweist, der dem der Immersionsflüssigkeit, insbesondere bei einer Wellenlänge der
Emissionsstrahlung, entspricht.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine die Probe (6) umgebende Umgebungsstruktur (20) aufweist, in die wenigstens eine optische Linse (22) eingebettet ist.
1 . Umgebungsstruktur für eine Vorrichtung nach Anspruch 10.
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ILARIA TESTA ET AL: "Nanoscale separation of molecular species based on their rotational mobility", OPTICS EXPRESS, vol. 16, no. 25, 8 December 2008 (2008-12-08), pages 21093 - 21104, XP055276282, DOI: 10.1364/OE.16.021093 *
TRAVIS J GOULD ET AL: "Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies", NATURE METHODS, vol. 5, no. 12, 16 November 2008 (2008-11-16), GB, pages 1027 - 1030, XP055276272, ISSN: 1548-7091, DOI: 10.1038/nmeth.1271 *

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