WO2016144146A1 - 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2016144146A1
WO2016144146A1 PCT/KR2016/002502 KR2016002502W WO2016144146A1 WO 2016144146 A1 WO2016144146 A1 WO 2016144146A1 KR 2016002502 W KR2016002502 W KR 2016002502W WO 2016144146 A1 WO2016144146 A1 WO 2016144146A1
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arthritis
seq
polypeptide
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PCT/KR2016/002502
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김상준
정영미
김수현
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사회복지법인 삼성생명공익재단
한국과학기술연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, an injection for preventing or treating arthritis, and a pharmaceutical composition for inducing chondrocyte differentiation, including a synthetic polypeptide.
  • Bones support the soft tissues and weight of the body and surround internal organs to protect internal organs from external shocks. It is also an important part of the body that not only structurally supports muscles or organs, but also stores calcium and other essential minerals in the body, such as phosphorus and magnesium.
  • Joints exist between the bones that make up the human body. Joints are immovable joints with little or no mobility between two bones or cartilage that are in contact with each other, such as the skull or its roots, and movable joints with large connective joints and joints between both bones, such as bones and jaws of the arms and legs of animals. And half joints.
  • a joint refers to a movable joint, which is divided into ligament and synovial joint where both bones are combined by ligaments only.
  • Synovial joints are joints are stacked in the connective tissue pockets (articular capsules), the inside of the joints secretion of the synovial fluid, which is a lubricant, and the external ligaments are attached to reinforce the joints.
  • Cartilage tissue makes up the joint and absorbs the transmission of joint movement.
  • arthritis is caused by swelling, heat, and pain.
  • Arthritis occurs regardless of race, and is divided into more than 100 kinds depending on the cause. The most common of these is osteoarthritis, a degenerative joint disease caused mainly by aging, and other autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, and infection. Septic arthritis caused by.
  • degenerative arthritis is a representative disease of the elderly and is mainly caused by aging of the joints.
  • overload caused by the complex action is a disease that occurs frequently in young people.
  • arthritis is a disease with a high incidence in a wide range of ages, but once damaged tissue is not naturally regenerated or repaired, it causes long-term patients' social activities and reduces quality of life.
  • conservative treatments such as exercise therapy, diet therapy, injection therapy, and drug therapy, including weight control, and surgical therapies, such as tissue regeneration and artificial joint replacement, which are used for severe injury, are also used to treat arthritis. It is used.
  • exercise therapy has the effect of strengthening the surrounding tissues and delaying the further worsening of symptoms, but it does not fundamentally regenerate damaged tissues, and it is difficult to perform due to pain in severe cases.
  • HA hyaluronic acid
  • Aspirin is also used to reduce inflammation and pain.
  • Steroid drugs such as acetaminophen, or a variety of nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) and cortisone (cortisone) are used.
  • NSAIDs nonsteroidal antiinflammatory drugs
  • cortisone cortisone
  • drug therapy is not a fundamental treatment that can recover damaged tissues, and it is known that additional verification is required to be used as a therapy, as it is reported to damage the stomach, tissue, and bone as a side effect of long-term use.
  • the inventors of the present invention while studying a synthetic polypeptide having stem cell mobilization activity, found that the synthetic polypeptide can effectively prevent and treat arthritis, such as increasing bone density and inhibiting apoptosis of chondrocytes. Completed.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, an injection for preventing or treating arthritis, and a pharmaceutical composition for inducing chondrocyte differentiation.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, comprising a synthetic polypeptide consisting of a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and a polypeptide represented by SEQ ID NO: 2. .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, comprising a mixture of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3.
  • the present invention provides an injection for preventing or treating arthritis, comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and a synthetic polypeptide comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 2.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inducing chondrocyte differentiation, comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and a synthetic polypeptide comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 2.
  • Synthetic polypeptide comprising the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 has stem cell mobilization activity to the site of arthritis, inhibits apoptosis of chondrocytes, anti-inflammatory Unlike the existing arthritis therapeutics, it exhibits activity and promoting cartilage cell regeneration, and thus, can not only improve cartilage damage but also inhibit degenerative changes and exhibit effects as a stem cell therapeutic at the same time.
  • Figure 1 shows the results of the effects of the treatment of KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC on the behavioral characteristics of rats before, 2, 4 weeks after treatment It is also.
  • Figure 2 is a view showing the results confirming the bone mineral density improvement effect according to KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC treatment.
  • Figure 3 is a diagram showing the results confirming the inhibitory effect of apoptosis of chondrocytes according to KLD12-SP1, KLD12-SP-MSC treatment.
  • Figure 4 shows the results confirming the decreased expression of inflammatory factors IL-1 ⁇ and caspase-3 and increased expression of chondrocyte differentiation collagen type II and SOX-9 according to KLD12-SP1 or KLD12-SP-MSC treatment to be.
  • Figure 5 shows the degree of cartilage damage in tissue cells of arthritis model rats injected with KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5 and KLD12-SP-MSC after KLD12-SP treatment.
  • the figure which shows the result of comparing phosphorus mankine score.
  • 6 and 7 show the results of confirming that the expression of caspase-8 and TIMP-1, the expression of collagen type II and the substance P (SP) are maintained in the rat knee joint through immunofluorescence analysis It is also.
  • Figure 8 confirms that the expression of mesenchymal stem cell markers CD 90, CD 105 is increased by KLD12-SP treatment, it is a diagram showing the results of confirming their stem cell mobilization capacity.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, comprising a synthetic polypeptide comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and a polypeptide represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 is a self-assembly polypeptide
  • SEQ ID NO: 2 is a substance P (Substance P).
  • Synthetic polypeptide according to the present invention can not only effectively recruit mesenchymal stem cells to the arthritis site by stem cell recruitment activity, but also inhibits apoptosis of chondrocytes, and promotes anti-inflammatory activity and promoting cartilage cell regeneration. Therefore, unlike conventional arthritis treatments, cartilage damage may be improved and the degenerative change itself may be suppressed and the effects as stem cell treatments may be exhibited simultaneously.
  • polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and “polypeptide represented by SEQ ID NO: 2” refers to a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by peptide bonds, known chemical synthesis methods known in the art, In particular, according to solid-phase synthesis techniques (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co .: Rockford, 111 (1984).
  • the "substance p" of the present invention is one of mammalian tachykinin consisting of 11 amino acid sequences of RPKPQQFFGLM, and is excessively secreted when tissue wounds occur, which is used to restore mobilization of multipotent stem cells for wound recovery. It is a substance with the ability to induce.
  • the N-terminal of the substance P may be a spacer of the sequence repeating 2 to 10 glycine (G) or glutamic acid (E), between the substance P and the self-assembled peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 And synthetic polypeptides can be prepared.
  • the synthetic polypeptide is composed of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2, which is stem cell mobilization activity, apoptosis inhibitory activity of chondrocytes, anti-inflammatory activity and chondrocyte regeneration Unlike conventional therapeutic agents for arthritis, it has a promoting activity and not only improves cartilage damage, but can also include a polypeptide which can achieve the object of the present invention by inhibiting degenerative change itself, and is a polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 Is particularly preferred.
  • polypeptide represented by SEQ. ID. No. 3 is a combination of SEQ ID NO. 1 polypeptide KLD12 and substance P, which are self-assembled peptides, and was used throughout the specification of the present invention as “KLD12-SP”.
  • KLD12-SP may be used by mixing with KLD12 which is a self-assembled peptide.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, comprising a mixture of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3.
  • the mixing ratio of KLD12 represented by SEQ ID NO: 1 and KLD12-SP represented by SEQ ID NO: 3 is not limited thereto, but may be 200: 1 to 200: 200 weight ratio, preferably 200: 1 to 200: 30 weight ratio It may be more preferably 200: 3 to 200: 20 weight ratio, more preferably 200: 3.5 to 200: 15 weight ratio.
  • Preferred embodiments herein disclose polypeptides mixed in a weight ratio of 200: 7, 200: 14, 200: 3.5, which are referred to as KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, respectively. If the mixing ratio exceeds 200: 200, that is, the weight ratio of 1: 1, the strength of the hydrogel is closer to the liquid phase, there is a problem that it is difficult to maintain the shape of the gel.
  • arthritis may refer to chronic inflammation of joints not only in tissues around the joints, such as tendons, ligaments and muscles, but also in other organs of the body, preferably osteoarthritis, degenerative arthritis, exfoliative bone Chondritis, joint ligament injury, meniscus damage, arthritis due to infection, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, rheumatoid arthritis and childhood rheumatoid arthritis.
  • the degenerative arthritis may be idiopathic degenerative arthritis or secondary degenerative arthritis.
  • “Degenerative arthritis” is a disease in which inflammation and pain occur due to gradual damage or degenerative changes in the cartilage that protects joints, resulting in damage to bones and ligaments that form joints.
  • idiopathic degenerative arthritis is caused by aging without any particular cause, and it is also called primary degenerative arthritis.
  • Secondary degenerative arthritis is caused by trauma, disease and malformations that can damage articular cartilage. It refers to the case where the articular cartilage is destroyed after bacterial arthritis or tuberculosis arthritis, also called secondary degenerative arthritis.
  • the polypeptide of the present invention is applicable to both idiopathic degenerative arthritis or secondary degenerative arthritis, but is more preferably applicable to idiopathic arthritis accompanied by degenerative changes due to aging.
  • degenerative arthritis means arthritis that occurs in all the joints of the body where arthritis may occur due to cartilage damage, etc., preferably knees and fingers , Jaw, hip and waist may be degenerative arthritis occurring at one or more sites selected from the group consisting of, but not limited to.
  • synthetic polypeptides of the present invention are particularly for inhibiting apoptosis of chondrocytes.
  • the synthetic polypeptides of the present invention have anti-inflammatory activity and promote regeneration of chondrocytes. More specifically, the polypeptide of the present invention reduces the gene expression levels of inflammatory factors IL-1 ⁇ and caspase-3 in chondrocytes and increases the expression of collagen type II and SOX-9 genes associated with chondrocyte regeneration.
  • the present invention also relates to a composition for preventing or treating arthritis, further comprising mesenchymal stem cells.
  • the synthetic polypeptide of the present invention has an excellent ability to mobilize stem cells, stem cells are mobilized to the injected site so that differentiation can be made actively. Therefore, since the number of mesenchymal stem cells is increased at the corresponding site even without introducing a separate stem cell at the polypeptide injection site, there is an advantage that the cartilage cell regeneration can be promoted through differentiation of stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be mixed with the polypeptide and administered to the arthritis site. In this case, since the mesenchymal stem cells used as stem cell therapeutics can be located and distributed better in the arthritis site, the cartilage regeneration effect can be increased.
  • the present invention is also used in combination with a known therapeutic agent known to be useful for treating or preventing arthritis in addition to the synthetic polypeptide comprising the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2, Or it may include continuous use, and can be used in addition to known treatment methods, such as exercise therapy.
  • composition of the present invention comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation of lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, saline, phosphate buffered saline) or a medium and the like, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably, parenterally, and most preferably intraarticularly.
  • another aspect of the present invention is an injection for preventing or treating arthritis or a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and a synthetic polypeptide consisting of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 It relates to an injection for preventing or treating arthritis, including a mixture of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3.
  • the injection is most preferably for intraarticular administration.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for inducing chondrocyte differentiation comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and a synthetic polypeptide comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 2.
  • Synthetic polypeptides comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and a polypeptide represented by SEQ ID NO: 2; And a mixture of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 increases the expression of SOX-9 and collagen type II and the like at the site of arthritis and is capable of differentiating mesenchymal stem cells into chondrocytes. Induction of mobilization can promote the differentiation of chondrocytes.
  • composition comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and a synthetic polypeptide comprising a polypeptide represented by SEQ ID NO: 2; Or administering to the subject a mixture of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3; It relates to a method for preventing or treating arthritis comprising a.
  • the subject is preferably a mammal, including a human, and may include, without limitation, any group of potential arthritis patients suffering from, suffering from, or potentially suffering from arthritis.
  • the polypeptide may be delivered in a pharmaceutically effective amount to the arthritis site of the subject, but the delivery is not limited thereto, but preferably by injection form.
  • the injection is more preferably for the administration of articular cavity to a mammalian subject, preferably a human patient.
  • an arthritis prevention or treatment agent comprising the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the synthetic polypeptide comprising the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 or the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 and the sequence It relates to the use for the preparation of an agent for the prevention or treatment of arthritis comprising a mixture of the polypeptide represented by the number 3.
  • a polypeptide having a therapeutic effect on degenerative arthritis a polypeptide was prepared in which a self-assembled peptide KLD12 represented by SEQ ID NO: 1 and a substance P (Substance P) represented by SEQ ID NO: 2 were combined and named KLD12-SP.
  • KLD12-SP a self-assembled peptide KLD12 represented by SEQ ID NO: 1
  • substance P Substance P
  • the method of synthesizing KLD12-SP by the solid phase method is as follows.
  • Trifluoroacetic acid phenol: thioanisole: water: ethanedithiol
  • Trifluoroacetic acid Phenol: Thioanisole: H2O: Ethandithiol
  • the reaction group was allowed to react to remove the protecting group of the peptide, and the peptide was separated from the resin.
  • Cold ethyl ether was added to the solution to obtain a white precipitated peptide.
  • the peptide thus obtained was purified by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) using a C4 semi-prep column (Phenomenex).
  • Buffer A was equilibrated with water and 0.1% TFA, and buffer B was eluted with acetonitrile and 0.1% TFA to prepare KLD12-SP with substance P linked to KLD12 and KLD12, respectively. Sequence information used and synthesized in this Preparation Example is shown in Table 1 below.
  • KLD12 and KLD12-SP were dissolved in 295mM sucrose solution to make 1% peptide solution, and the prepared peptide solution was mixed with PBS to make 0.5% peptide gel.
  • KLD12 and KLD12-SP peptide solutions were mixed at 200: 7, 200: 14, and 200: 3.5 weight ratios to prepare KLD12-SP having various concentrations.
  • the KLD12-SP mixed in the above weight ratio was named KLD12-SP1, KLD12-SP2, and KLD12-SP0.5, respectively.
  • mice the experimental group containing mesenchymal stem cells (MSC) in a peptide solution mixed with KLD12 and KLD12-SP at 200: 7 was KLD12-SP-MSC, and a control group containing only saline was added.
  • MSC mesenchymal stem cells
  • KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC prepared as described above was confirmed through the following examples of the treatment of degenerative arthritis.
  • the degenerative arthritis model rats used to confirm the effectiveness of the treatment for degenerative arthritis were purchased from “Orient Bio” 9-week-old rats and brought to Samsung Life Sciences Research Institute for 1 week in quarantine and 15 weeks after breeding for 5 weeks as a model for degenerative arthritis. The produced one was used.
  • the medial patellar skin and fascia were incised, the patella was folded outward to expose the joint cavity, and the anterior cruciate ligament, medial collateral ligament and medial meniscus were removed with scissor. Thereafter, the patella was in place and then prepared by performing a step of skin suture.
  • KLD12-SP-MSC As shown in FIG. 1, the number of times about 20 times before each KLD12-SP treatment was increased in the KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, and KLD12-SP-MSC treated groups. In comparison, it was confirmed that the knee joint function of rats was improved. In particular, KLD12-SP-MSC mixed with stem cells and KLD12-SP showed the best improvement effect.
  • KLD12-SP which can improve knee joint function, can simultaneously have an effect of improving bone density. More specifically, arthritis model rats were injected KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC and the control group into the degenerative arthritis model rat joint cavity using a 1 ml syringe, respectively, and injected 4 weeks. After the removal of the knee and muscle and adipose tissue, the bone density was measured using a Siemens Inveon Micro-PET / CT scanner.
  • ROI region of interest
  • KLD12-SP1 As shown in Figure 2, it was confirmed that the bone density increased in all the KLD12-SP treatment group compared to the control group.
  • KLD12-SP inhibits apoptosis of degenerative arthritis due to aging and not only promotes the regeneration of chondrocytes at the localized site but also suppresses the reduction of chondrocytes themselves, thereby suppressing degenerative changes due to aging. It was confirmed.
  • TUNEL terminal
  • ApopTag® Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit catalog # S7100, Millipore.
  • Deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling was performed.
  • tumor tissues in which TUNEL expression was confirmed were used previously, and the negative control was reacted with a TUNEL reaction mixture in which terminal trasnferase was omitted.
  • Tissue slides were pre-incubated in TdT reaction buffer for 10 minutes, then TdT reaction mixture was dispensed and reacted at 37 ° C for 1 hour, immersed in stop / wash buffer, stirred for 15 seconds and left at room temperature for 10 minutes to react TdT reaction mixture. Stopped. At this time, a wet chamber was used to prevent drying of the tissue. After washing with PBS, tissue slides were treated with HRP conjugated anti-digoxigenin for 30 minutes at room temperature and washed with water. The reaction was carried out for 3 minutes at room temperature using DAB as a colorant, and after staining with Mayer's hematoxylin, the microscopic staining was observed under a microscope. The results are shown in FIG.
  • KLD12-SP has a prophylactic and therapeutic effect of inhibiting cell death due to arthritis itself as well as regenerative effect in degenerative arthritis, it was confirmed that it can more effectively treat degenerative arthritis due to aging.
  • the rats injected with KLD12-SP1 increased the expression of collagen type II, a major member of the extracellular matrix (ECM) of glassy cartilage, compared with the control group by more than two times, and proliferated and differentiated chondrocytes.
  • SOX-9 a gene involved in regulation, also significantly increased expression in both KLD12-SP1 and KLD12-SP-MSC injected rats.
  • the inflammatory factors IL-1 ⁇ and caspase-3 were reduced to less than half of the control group in both KLD12-SP1 and KLD12-SP-MSC injected rats.
  • the knee joints of arthritis-induced rats were extracted and analyzed.
  • the collected samples were fixed in 10% (v / v) formalin solution and demineralized in hydrogen chloride ethylene-diaminetetraacetic acid solution.
  • the demineralized samples were embedded with paraffin, and the tissues were cut to 6 ⁇ m thickness in the sagittal direction using a slicing machine, followed by hematoxylin and eosin (H & E) staining for morphological analysis of cells.
  • MT Masson Trichrome
  • Substance P (SP) bound to the self-assembled polypeptide was maintained in the knee joint of the rat, it was stained using Substance P antibody (Santa Cruz Biotechnology) and Alexa Fluor 488 chicken anti goat IgG (Invitrogen) was used as a secondary antibody.
  • the stained specimens were observed at 200-fold magnification using a fluorescence microscope (Eclipse TE2000U), and after taking four pictures at random, the specific expressions were observed using Image J program. Indicated.
  • tissue cells of arthritis model rats injected with KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5 and KLD12-SP-MSC showed damage to cartilage tissue as compared to the control group.
  • Mankin score was low. Mankin score is an indicator of normal tissue as the score approaches 0, especially the lowest score in the KLD12-SP1 group. According to these results, it was confirmed that both KLD12-SP effectively improved cartilage damage in arthritis model rats.
  • substance P of KLD12-SP is expected to have mobilization activity of mesenchymal stem cells, it is specifically expressed in mesenchymal stem cells in KLD12-SP-treated group treated with KLD12-SP without MSC binding.
  • Immunofluorescence staining was performed using markers CD90 (Thy-1 antibody, Santa Cruz Biotechnology) and CD105 (Anti-Endoglin monoclonal antibody, Millipore, Temecula, CA). Alexa Fluor 594 donkey anti rabbit IgG (Invitrogen) and Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG (Invitrogen) were used as secondary antibodies, and DAPI counterstaining was performed to identify cell nuclei. The results are shown in FIG.
  • the expression of the mesenchymal stem cell markers CD 90 and CD 105 was at least two-fold higher than that of the control group even when treated with KLD12-SP without MSC binding. According to these results, KLD12-SP was found to have the effect of mobilizing mesenchymal stem cells to the arthritis site, and as the mesenchymal stem cells move to the arthritis site, the regeneration of chondrocytes by the mesenchymal stem cells is more effective. It was confirmed that it can be made actively.

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Abstract

본 발명은 합성 폴리펩타이드를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 관절염 예방 또는 치료용 주사제 및 연골세포 분화 유도용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드는 관절염 부위로 줄기세포의 동원 활성을 가지며, 연골 세포의 세포자멸사를 억제하고, 항-염증 활성 및 연골세포 재생 촉진활성을 나타내므로 기존 관절염 치료제와 달리 연골 손상을 개선할 뿐만 아니라 퇴행성 변화 자체를 억제하고 줄기세포 치료제로서의 효과를 동시에 나타낼 수 있어 관절염 예방 또는 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 합성 폴리펩타이드를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 관절염 예방 또는 치료용 주사제 및 연골세포 분화 유도용 약학적 조성물에 관한 것이다.
뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질, 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.
인체를 구성하는 뼈 사이에는 관절이 존재한다. 관절은 두개골이나 이의 치근처럼 서로 접하는 두 개의 뼈나 연골 사이에 가동성이 거의 또는 전혀 없는 부동성관절과, 동물의 팔·다리의 뼈나 턱뼈처럼 양쪽 뼈 사이에 결합조직이 많고 가동성이 큰 가동관절, 연합관절 및 반관절로 나뉜다. 일반적으로 관절이라 하는 것은 가동관절을 말하며, 이 가동관절은 양쪽의 뼈가 인대만으로 결합되어 있는 인대결합과 활액막성 결합으로 나뉜다. 활액막성 결합은 관절이 결합조직성의 주머니(관절낭)로 쌓여 있는 것으로, 관절낭의 안쪽은 윤활유의 성격을 하는 활액을 분비하고 외부에는 많은 인대가 부착되어 있어 관절을 보강한다.
연골조직은 관절을 구성하고 있으며, 관절 운동의 전달력을 흡수한다. 이와 같은 연골조직이 손상되면, 붓기, 열감, 통증을 동반한 관절염 (arthritis)이 유발되는데, 관절염은 인종에 무관하게 발병하며 그 원인에 따라 100여종 이상으로 나누어진다. 그 중 가장 흔한 형태가 주로 노화에 의해 발병하는 퇴행성 관절 질환 (degenerative joint disease)인 골관절염 (osteoarthritis)이며, 그 외 자가 면역질환인 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis)과 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 감염에 의한 패혈성 관절염 (septic arthritis) 등이 있다. 특히 퇴행성 관절염은 노년층의 대표적인 질환으로 주로 관절의 노화에 의해 발병하지만, 그 외에도 유전적 요인, 영양 불균형, 운동 부족, 과격한 운동이나 부상, 과도한 노동과 같이 관절에 무리를 주는 행동이나 잘못된 자세, 비만으로 인한 과부하 등 여러 가지 요인이 복합적으로 작용하여 발병하기 때문에 젊은층에서도 빈번히 발병하는 질환이다. 이처럼 관절염은 폭넓은 연령대에서 발병빈도가 높은 질환이지만, 한번 손상된 조직은 자연적으로 재생이나 복구가 잘되지 않아 장기간 환자의 사회적 활동을 제한하고 삶의 질을 저하시키는 원인이 된다.
이와 같은 관절염을 치료하기 위하여, 전통적으로 자가골 이식(autografting)과 동종골 이식(allografting) 그리고 인조골 이식(artificial bone grafting) 등의 연구가 수행되었으나, 골 채취 부위의 감염, 혈종 등과 같은 합병증 유발(자가골이식), 공여자로부터의 질병 전염 가능성(동종골 이식), 근본적인 골 생성이 되지 않는(인조골 이식) 문제점을 가지고 있는 것으로 알려졌다.
또한 체중 조절을 포함한 운동요법, 식이요법, 주사 요법, 약물요법과 같은 보존적인 치료법 및 조직 재생술(tissue regeneration), 손상 정도가 심할 경우에 사용하는 인공관절 교체술과 같은 수술요법 역시 관절염 치료를 위하여 사용되고 있다.
그러나 운동 요법은 관절 주변 조직을 강화시켜 추가적인 증상 악화를 지연시키는 효과는 있지만, 손상된 조직을 근본적으로 재생시키지는 않으며 증상이 심한 경우 통증으로 인해 시행하기 어렵다는 한계점이 있다.
또한 손상된 부위의 마찰을 줄여 통증을 경감시키고 증상의 악화를 막기 위해 관절의 윤활액 성분인 히알루론산(hyaluronic acid; HA)을 주사하는 방법도 사용되고 있으며, 염증이나 통증을 경감시킬 목적으로 아스피린(aspirin), 아세트아미노펜 (acetaminophen), 또는 여러 종류의 비스테로이드성 소염제(nonsteroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)와 코티손 (cortisone)과 같은 스테로이드성 약물이 사용되고 있다. 하지만 이러한 약물요법도 손상된 조직을 복구시킬 수 있는 근본적인 치료법은 아니며, 장기간 사용시 부작용으로 위장이나 조직, 뼈를 손상시키는 것으로 보고되고 있는 등 치료요법으로 사용되기 위해서는 추가적인 검증이 필요한 것으로 알려져 있다.
앞서 언급한 보존적인 치료법으로 효과가 없거나 극심한 통증이 지속되는 경우, 인공 관절로 교체하는 수술적 요법이 사용되는데, 인공 관절은 수명이 약 10년 정도로 한정되어 있어 필요에 따라 재수술이 필요하다. 이 경우 뼈에 협착된 인공 관절 제거의 어려움, 보다 큰 인공관절 이식의 필요성, 보다 광범위한 주변 뼈조직이 필요하게 되어 재수술에 제한이 따른다. 이러한 문제점으로 인공 관절 교체술을 젊은층에 적용할 때는 보다 신중을 기해야 한다.
최근에는 인공세포배양기술이 발달함에 따라 다기능 줄기세포(multipotent stem cell)나 자가 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell)로부터 연골세포 (chondrocyte)를 인공적으로 배양하여 이식(implantation)하는 방법이 보고되었다. 하지만 충분한 자가 세포를 얻기가 쉽지 않고, 이식한 세포의 부착, 재생 효율, 안전성 측면에서 많은 환자들에게 적용하기에는 기술적으로나 비용적인 측면에서 아직까지 해결해야 할 문제점들이 많다.
고령화 사회로 접어들면서 관절염으로 고통 받는 노년층 인구가 꾸준히 증가하고 있고, 과도한 운동, 영양 불균형, 비만 등으로 인한 관절 질환이 젊은 연령층에서도 증가 추세에 있다. 이에 따라 다양한 관절염 질환에 적용 가능한 새로운 치료제에 대한 요구가 지속적으로 있으나, 아직까지 관절염으로 손상된 연골 조직을 재생 복구 시킬 뿐만 아니라, 연골 세포의 자체의 사멸을 막고 줄기세포 치료제의 효과까지 가져올 수 있는 새로운 개념의 치료제에 대해서는 보고된바 없으며 이와 같은 치료제 개발에 대한 필요성이 있다.
본 발명자들은 줄기세포 동원 활성을 갖는 합성 폴리펩타이드에 대하여 연구하던 중, 합성 폴리펩타이드가 골밀도를 증가시키고, 연골세포의 세포자멸사를 억제하는 등 관절염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 합성 폴리펩타이드를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 관절염 예방 또는 치료용 주사제 및 연골세포 분화 유도용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 제공하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 주사제를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드를 포함하는, 연골세포 분화 유도용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드는 관절염 부위로 줄기세포 동원 활성을 가지며, 연골 세포의 세포자멸사를 억제하고, 항-염증 활성 및 연골세포 재생 촉진활성을 나타내므로 기존 관절염 치료제와 달리 연골 손상을 개선할 뿐만 아니라 퇴행성 변화 자체를 억제하고 줄기세포 치료제로서의 효과를 동시에 나타낼 수 있어 관절염 예방 또는 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 관절염 모델에서 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC 의 처리가 랫트의 행동학적 특성에 미치는 영향을 처리 전, 2주, 4주 후에 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC 처리에 따른 골밀도 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 KLD12-SP1, KLD12-SP-MSC 처리에 따른 연골 세포의 세포자멸사 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 KLD12-SP1 또는 KLD12-SP-MSC 처리에 따른 염증성 인자 IL-1β 및 카스파아제-3의 발현 감소 및 연골 세포 분화 인자인 콜라겐 Ⅱ형 및 SOX-9의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 KLD12-SP 처리 후, 조직학적 분석을 통해 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5 및 KLD12-SP-MSC를 주입한 관절염 모델 랫트의 조직 세포에서 연골조직의 손상을 나타내는 정도인 만킨점수를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 6 및 도 7은 면역형광분석을 통해, 카스파아제-8 및 TIMP-1 의 발현 감소, 콜라겐 Ⅱ형의 발현 증가 및 물질 P(SP)가 랫트의 무릎 관절에 유지되고 있는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 중간엽 줄기세포 마커 CD 90, CD 105의 발현이 KLD12-SP 처리에 의하여 증가함을 확인하고, 이의 줄기세포 동원 능력을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1은 자가조립 폴리펩타이드(self-assembly polypeptide)이며, 상기 서열번호 2는 물질 P(Substance P)이다.
본 발명에 따른 합성 폴리펩타이드는 줄기세포 동원 활성에 의하여 관절염 부위로 중간엽 줄기세포를 효과적으로 동원할 수 있을 뿐만 아니라, 연골 세포의 세포자멸사를 억제하고, 항-염증 활성 및 연골세포 재생 촉진활성을 나타내므로 기존 관절염 치료제와 달리 연골 손상을 개선함과 동시에 퇴행성 변화 자체를 억제하고 줄기세포 치료제로서의 효과까지 동시에 나타낼 수 있다.
상기 “서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드" 및 "서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합하여 형성된 선형의 분자를 의미하며, 당업계의 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis technique)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 "물질 p"는 RPKPQQFFGLM의 11개의 아미노산 서열로 이루어진 포유류의 타키키닌의 하나로서, 조직 내 상처가 발생했을 때 과량 분비되고, 이는 상처 회복을 위해 다분화능이 있는 줄기세포의 동원을 유도할 수 있는 능력을 지닌 물질이다. 상기 물질 P의 N 말단에는 글리신(G) 또는 글루탐산(E)이 2 내지 10 개 반복되는 서열의 스페이서가 결합될 수 있고, 물질 P와 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드와의 사이에 위치하여 합성 폴리펩타이드가 제조될 수 있다.
상기 합성 폴리펩타이드는 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 것으로, 이는 줄기세포 동원활성, 연골 세포의 세포자멸사 억제활성, 항-염증 활성 및 연골세포 재생 촉진 활성을 갖고 기존 관절염 치료제와 달리 연골 손상을 개선할 뿐만 아니라 퇴행성 변화 자체를 억제하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 폴리펩타이드를 제한없이 포함할 수 있으며, 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드인 것이 특히 바람직하다.
상기 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드는 자가조립 펩타이드인 서열번호 1 폴리펩타이드 KLD12와 물질 P 가 결합한 것으로, 본 발명의 명세서 전반에서는 “KLD12-SP”로 명명하여 사용하였다.
상기 “KLD12-SP”는 자가조립 펩타이드인 KLD12와 혼합하여 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
서열번호 1로 표시되는 KLD12와 서열번호 3으로 표시되는 KLD12-SP의 혼합비율은 이에 제한되지 않으나, 200: 1 내지 200: 200 중량비일 수 있고, 바람직하게는 200: 1 내지 200: 30 중량비일 수 있으며, 더 바람직하게는 200:3 내지 200: 20 중량비, 더욱 바람직하게는 200: 3.5 내지 200: 15 중량비 일 수 있다. 본 명세서에서는 바람직한 구현예로 200:7, 200:14, 200:3.5 중량비로 혼합된 폴리펩타이드를 개시하고 있으며, 이는 각각 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5로 언급된다. 만약 혼합비율이 200:200, 즉 1:1의 중량비를 초과하는 경우 하이드로겔의 강도에 있어서 액체상에 가까워지므로 젤의 형상을 유지하기 어려워지는 문제점이 있다.
본 발명에 있어서, “관절염”은 힘줄, 인대 및 근육 등과 같은 관절 주변의 조직 뿐 아니라 신체의 기타 기관 내에서의 관절의 만성 염증을 의미할 수 있고, 바람직하게는 골관절염, 퇴행성 관절염, 박리성 골연골염, 관절 인대 손상, 반월상 연골판 손상, 감염으로 인한 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 류마티스 관절염 및 소아기 류마티스 관절염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
특히 본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 관절염은 특발성 퇴행성 관절염 또는 속발성 퇴행성 관절염일 수 있다. “퇴행성 관절염”이란 관절을 보호하고 있는 연골의 점진적인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나 염증과 통증이 생기는 질환으로 관절염 질환 중 가장 높은 빈도를 보이는 질환이다. 이 중 “특발성 퇴행성 관절염”이란 특별한 기질적 원인 없이, 노화 등에 의하여 발생하는 것이고 이를 일차성 퇴행성 관절염이라고도 한다.“속발성 퇴행성 관절염”이란 관절 연골에 손상을 줄 수 있는 외상, 질병 및 기형이 원인이 되는 것으로 세균성 관절염이나 결핵성 관절염 후 관절 연골이 파괴된 경우 등을 말하며 이차성 퇴행성 관절염이라고도 한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 특발성 퇴행성 관절염 또는 속발성 퇴행성 관절염에 모두 적용가능하나, 보다 바람직하게는 노화로 인한 퇴행성 변화가 수반되는 특발성 관절염에 적용할 수 있다.
본 발명의 합성 폴리펩타이드 투여로 인하여 치료될 수 있는 관절염, 보다 바람직하게는 퇴행성 관절염은 연골손상 등에 의하여 관절염이 발생할 수 있는 모든 신체의 관절부위에 발생하는 관절염을 의미하나, 바람직하게는 무릎, 손가락, 턱, 엉덩이 및 허리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 부위에서 발생하는 퇴행성 관절염일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 합성 폴리펩타이드는 특히 연골 세포의 세포자멸사(apoptosis)를 억제하는 것이다.
상기 연골세포의 “세포자멸사”가 억제됨으로써, 관절염, 특히 퇴행성 관절염과 같이 노화에 의하여 발생할 수 있는 관절염에서 국소부위에서의 연골 재생과 같은 재생효과 뿐만이 아니라 퇴행성 변화 자체를 저지할 수 있다는 점에서 매우 의미가 있다.
또한 본 발명의 합성 폴리펩타이드는 항-염증 활성을 갖고, 연골세포의 재생을 촉진하는 것이다. 보다 구체적으로 본 발명의 폴리펩타이드는 연골세포에서 염증성 인자인 IL-1β 및 카스파아제-3 의 유전자 발현량을 감소시키고, 연골세포 재생과 관련된 콜라겐 Ⅱ 형 및 SOX-9 유전자의 발현을 증가시킨다.
또한 본 발명은 중간엽 줄기세포를 추가적으로 더 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 합성 폴리펩타이드는 줄기세포를 동원하는 능력이 우수하므로, 주입된 부위로 줄기세포가 동원되어 분화가 활발하게 이루어질 수 있도록 한다. 따라서 폴리펩타이드 주입 부위에 별도의 줄기세포를 도입하지 않아도 해당 부위에서 중간엽 줄기세포의 수가 증가하므로 줄기세포의 분화를 통한 연골세포 재생 촉진 효과를 나타낼 수 있는 장점이 있다. 이와 같은 효과를 극대화하기 위하여 중간엽 줄기세포를 폴리펩타이드와 함께 혼합하여 관절염 부위로 투여할 수 있다. 이와 같이 투여하는 경우 줄기세포 치료제로 사용되는 중간엽 줄기세포가 관절염 부위에 더욱 잘 위치, 분포할 수 있게 되므로 연골 재생 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드 외에 당 분야에 관절염 치료 또는 예방에 유용한 것으로 알려져 있는 공지의 치료제 등을 함께, 병용하여 또는 연속적으로 사용하는 것을 포함할 수 있으며, 이외 운동요법 등과 같은 공지의 치료방법과 병행하여 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식, 가장 바람직하게는 관절낭 내(intraarticular)로 투여할 수 있다.
따라서 본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 주사제 또는 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드와 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 주사제에 관한 것이다. 상기 주사제는 관절강 내(intraarticular) 투여용인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다
또한 본 발명은 서열번호 1 으로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2으로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드를 포함하는, 연골세포 분화 유도용 약학적 조성물에 관한 것이다.
서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 포함하는 합성 폴리펩타이드; 및 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드와 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 혼합물은 관절염 부위에서 SOX-9 및 콜라겐 타입 Ⅱ형 등의 발현을 증가시키고 연골세포로 분화될 수 있는 중간엽 줄기세포의 동원을 유도함으로써 연골세포의 분화를 촉진할 수 있다.
또한 본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드를 포함하는 조성물; 또는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드와 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 혼합물을 대상에 투여하는 단계; 를 포함하는 관절염 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
상기 대상은 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하며, 관절염을 앓고 있거나, 앓았거나, 앓을 가능성이 있는 잠재적인 관절염 환자군도 모두 제한없이 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 대상의 관절염 부위에 약학적으로 유효한 양으로 전달될 수 있으며, 전달은 이에 제한되는 것은 아니나 주사액 형태에 의한 것이 바람직하다. 특히 상기 주사액은 포유류 대상, 바람직하게는 인간 환자의 관절강 투여용인 것이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드를 포함하는 관절염 예방 또는 치료제 또는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드와 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 관절염 예방 또는 치료제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 제조예 및 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 폴리펩타이드 (KLD12-SP) 의 제조
퇴행성 관절염 치료 효과를 갖는 폴리펩타이드의 제조를 위하여, 서열번호 1로 표시되는 자가조립 펩타이드 KLD12와 서열번호 2로 표시되는 물질 (Substance P) 가 결합된 폴리펩타이드를 제조하였으며, KLD12-SP로 명명하였다. 보다 구체적으로 KLD12-SP를 고체상 방법으로 합성하는 방법은 다음과 같다.
0.06 mmol의 글루탐산-Wang 레진을 표준 반응용기 (Standard reaction vessel)에 넣고, 레진의 Fmoc을 염기(20% 피페리딘)로 제거하였다. 합성하려는 펩타이드의 카르복시 말단에 Fmoc-아미노산을 넣고 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBT), 디아이소프로필 카보다이이미드(DIC)를 혼합하여 활성화 시킨 후 합성을 시작하였다. 계속하여 동일한 방법을 이용하여, 원하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 합성하고, 커플링이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄으로 여러 번 세척한 다음 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산 : 페놀 : 티오아니솔 : 물 : 에탄디티올(Trifluoroacetic acid : Phenol :Thioanisole : H2O : Ethandithiol)의 82.5 : 5: 5 : 5: 2.5 (v/v)용액으로 2 내지 3시간 반응시켜 펩타이드의 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드를 분리하였으며, 용액에 차가운 에틸에테르를 첨가하여 흰색 침전된 펩타이드를 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 펩타이드를 C4 semi-prep 컬럼 (Phenomenex)을 사용하는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제하였다. 완충용액 A는 물 및 0.1 % TFA를 사용하여 평형화시키고, 완충용액 B는 아세토나이트릴 및 0.1 % TFA를 사용하여 펩타이드를 용출시켜, 각각 KLD12 및 KLD12에 물질 P가 연결된 KLD12-SP를 제조하였다. 본 제조예에 사용되고 합성된 서열정보를 하기 표 1에 나타내었다.
서열 비고
서열번호 1 KLDLKLDLKLDL KLD12 자가조립 펩타이드
서열번호 2 RPKPQQFFGLM 물질 P (SP)
서열번호 3 KLDLKLDLKLDLRPKPQQFFGLM KLD12-SP
제조된 KLD12 와 KLD12-SP를 혼합하여 펩타이드젤을 제조하였다. KLD12와 KLD12-SP를 각각 295mM 수크로오스 용액에 녹여 1%의 펩타이드 용액을 만들고, 제조된 펩타이드 용액을 PBS와 혼합하여 0.5%의 펩타이드젤을 만들었다. 다양한 KLD12-SP의 치료 효과를 확인하기 위하여, KLD12와 KLD12-SP 펩타이드 용액의 혼합 비율을 각각 200:7, 200:14, 200:3.5 중량비로 혼합하여 다양한 함량 농도의 KLD12-SP를 제조하였다. 상기 중량비로 혼합된 KLD12-SP를 각각 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5로 각각 명명하였다. 또한 KLD12와 KLD12-SP를 200:7로 혼합한 펩타이드 용액에 중간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cell; MSC)를 넣은 실험군은 KLD12-SP-MSC로 하였으며, 생리식염수만을 넣은 대조군도 추가하였다.
상기와 같이 제조된 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC의 퇴행성 관절염 치료 효과를 하기 실시예를 통해 확인하였다.
이하 퇴행성 관절염 치료 효과 확인에 사용된 퇴행성 관절염 모델 랫트는 9주령 랫트를 “오리엔트 바이오”에서 구입하여 삼성생명과학 연구소로 반입하여 1주 간 검역을 거치고 5주 간 사육 후 15주령 때 퇴행성 관절염 모델로 제작한 것을 사용하였다. 퇴행성 관절염 모델은 슬개골 내측 부위 피부 및 근막을 절개 후, 슬개골을 외측으로 젖혀 관절강을 노출시킨 후, 전방십자인대, 내측측부인대와 내측 반월상 연골을 scissor로 제거하였다. 이 후, 슬개골을 원위치 시킨 뒤 피부 봉합을 시행하는 단계를 수행하여 제조하였다.
실시예 1. 행동 실험
랫트(오리엔트 바이오)의 무릎관절 기능 측정을 통한 행동실험을 수행하였다. 행동 실험은 흰색 종이가 사면에 부착된 30 cm x 30 cm x 30 cm 아크릴 박스 바닥 전체에 잉크패드를 설치하고, 랫트를 30분간 자유롭게 움직이도록 놔둔 후, 흰색 종이를 수거하는 방식으로 수행하였다. 무릎 관절 기능은 4장의 흰색 종이에 바닥으로부터 5 cm 부위에 줄을 긋고, 5 cm 이상 부위에 앞 발이 찍힌 횟수를 측정하여 확인하였다. 주입 전 앞발이 찍힌 횟수를 측정하였으며, 제조예 1에서 제조된 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC 및 대조군을 퇴행성 관절염 모델 랫트에 관절강 내에 1ml 주사기를 이용하여 각각 200 마이크로리터를 주입하고 주입 2주 후, 4주 후 앞발이 찍힌 횟수를 측정하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 KLD12-SP를 처리하기 전에는 약 20회 정도였던 횟수가 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC 처리군에서 모두 증가하여 대조군과 비교하여 랫트의 무릎 관절 기능이 개선되었음이 확인되었다. 특히, 줄기세포와 KLD12-SP가 혼합 처리된 KLD12-SP-MSC는 가장 우수한 개선 효과를 나타내었다.
실시예 2. Micro-CT를 이용한 골밀도 개선효과 확인
퇴행성 관절염 환자는 골밀도 저하로 인한 골다공증 및 골절의 위험성을 갖는다. 따라서 무릎 관절 기능을 개선할 수 있는 KLD12-SP 가 골밀도 개선효과를 동시에 가질 수 있는 지 여부를 확인하였다. 보다 구체적으로 관절염 모델 랫트에 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5, KLD12-SP-MSC 및 대조군을 퇴행성 관절염 모델 랫트 관절강 내에 1ml 주사기를 이용하여 각각 200 마이크로리터를 주입하고 주입 4주 후 무릎관절을 적출하여 근육 및 지방 조직을 제거한 후, Siemens Inveon Micro-PET/CT 스캐너를 이용하여 골밀도를 측정하였다. 모든 조직들은 1.5 mm 간격으로 스캔 되었고, 70 kV, 400 ㎂ 로 스텝 당 0.5도 씩 전체 360도 회전을 하여 스캔 이미지를 얻어냈다. 각 픽셀은 20.26㎛ 크기의 해상도를 지녔다. 각 스캔된 이미지는 IAW(the Inveon Acquisition Workplace) software package (IAW, Siemens Medical Solutions, Knoxville, TN, USA)를 이용하여 재구성 되었고, IRW(Inveon Research Workplace)를 이용하여 2D와 3D 이미지 분석 소프트웨어로 분석되었다. 적출된 슬관절 부위는 내측 대퇴골(medial femur; MFC), 외측 대퇴골(lateral femur; LFC), 중앙 경골(medial tibia; MTP) 및 외측 경골(lateral tibia; LTP) 4군데로 나누어져 분석하였으며, 각 부분들은 전방, 중심, 후방의 실린더 모양의 ROI(region of interest)로 계산하였다. 각 ROI들은 0.8 mm의 직경과 0.8 mm 길이였으며, ROI 부피는 대략 0.45 mm3이 되었다. 각 부위별 골밀도는 기존에 밀도 값(g/cm3)이 알려진 막대를 이용하여 측정된 houndsfield를 비교하여 계산하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 모든 KLD12-SP 처리군에서 골밀도가 증가한 것이 확인되었다. KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5 및 KLD12-SP-MSC 은 골밀도가 500 내지 600mg/cm3 정도로 나타났으며, 이는 대조군의 골밀도가 약 400mg/cm3 인 것과 비교하여 증가된 것으로 KLD12-SP가 퇴행성 관절염 부위에서 골밀도의 개선 효과를 함께 갖는다는 것을 보여주었다.
실시예 3. KLD12-SP의 세포자멸사(apoptosis) 억제 효과
관절염의 발병 기전 중 하나로 관절 연골세포에서의 세포자멸사가 보고되고 있으며 관절염 환자의 연골세포에서 세포자멸사가 증가되어 있다는 관련성이 보고된 바 있다. 따라서 KLD12-SP가 노화에 의한 퇴행성 관절염의 세포자멸사를 억제하여, 단순히 국소 부위에서의 연골 세포 재생을 촉진하는 것이 아니라 연골 세포 자체가 감소되는 것을 억제하여 노화로 인한 퇴행성 변화를 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다.
KLD12-SP1 및 KLD12-SP-MSC를 주입한 관절염 모델 랫트의 단일 세포 수준에서의 세포자멸사를 관찰하기 위해서 상용화된 ApopTag® Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (cat # S7100, Millipore)를 사용하여 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling) 염색을 실시하였다. 양성 대조군으로는 기존에 TUNEL 발현이 확인된 종양조직을 이용하였으며, 음성 대조군은 말단 트랜스퍼라아제(terminal trasnferase)가 생략된 TUNEL 반응 혼합물에 반응시켰다.
KLD12-SP1, KLD12-SP-MSC 주입 4주 후 관절염 랫트 모델에서 수득한 4 μm로 절편된 조직 슬라이드를 60℃ 건조 오븐에 5분간 방치 후, 자일렌(xylene)에서 5분간 3회 반응시켜서 탈파라핀화(deparaffinization)를 실시하고 100%, 95%, 90%, 70% 알코올에 담가서 처리하고 증류수에서 수세하였다. 20 μg/mL 단백질 분해효소 K(Proteinase K)에 15분간 전처리 한 후 트윈 20이 함유된 PBS 완충액을 이용하여 세척하고 내인성 퍼옥시다아제의 활성을 억제하기 위하여 3% H2O2 용액에서 10분간 반응 시킨 후 PBS로 수세하였다. 조직 슬라이드를 TdT 반응 완충액에서 10분간 전-배양한 후 TdT 반응 혼합물을 분주하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 정지/세척 완충액에 담가서 15초간 교반한 후 10분간 실온에서 두어서 TdT 반응 혼합물의 반응을 중지시켰다. 이때 조직의 건조를 방지하고자 습윤화된 챔버를 사용하였다. PBS로 수세 후 조직 슬라이드를 HRP가 접합된 항-디곡시게닌(anti-digoxigenin)으로 실온에서 30 분간 처리 후 수세하였다. 발색제로 DAB를 이용하여 실온에서 3분간 반응시켰으며 Mayer’s 헤마톡실린을 이용하여 대조염색을 실시 후 현미경에서 검경하여 갈색으로 염색된 세포자멸사를 관찰하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 갈색으로 확인되는 세포자멸사가 대조군과 비교하여 KLD12-SP1, KLD12-SP-MSC 처리군에서 매우 현저하게 감소하였음을 확인하였다. 이를 통해, KLD12-SP는 퇴행성 관절염에서 재생 효과뿐만 아니라 관절염으로 인한 세포 사멸 자체를 억제하는 예방 및 치료 효과를 가짐으로, 노화로 인한 퇴행성 관절염을 더욱 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 정량적 실시간 PCR을 이용한 RNA 발현 확인
KLD12-SP1 또는 KLD12-SP-MSC 를 주입한 랫트의 무릎관절에서 연골만을 수득한 후, 가위로 잘게 다졌다. 작게 조각난 연골은 0.1% 콜라게네이즈 (collagenase) 용액에 분산시킨 후 37℃에서 하룻밤동안 진탕시킨 후, 효소반응으로 용액에 부유된 관절연골을 원심 분리하였으며, 이 후 상층액은 버리고, 하부의 침전물을 분리하였다. 하층 침전물을 PBS로 수세하고, 100㎛ 필터로 걸러내는 과정을 세 번 반복하여 연골세포를 얻었다. 정량적 RT-PCR을 위하여, 얻어진 연골세포를 RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Omniscript System Kit (QIAGEN), SYBR?GreenMasterMix(AppliedBiosystems,USA)를 이용하여 cDNA로 합성하고, 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭시켰다. 7500 RT-PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 이용하여 콜라겐 Ⅱ형 (Collagen type Ⅱ), SOX-9, IL-1β, 카스파아제-3(Caspase-3)의 유전자 발현양의 변화를 확인하였다. 정량적 RT-PCR에 사용된 프라이머는 각각 다음과 같다. GAPDH는 항존 유전자(housekeeping gene)로 사용하였다.
정방향 역방향
콜라겐 II 형 CCCCTGCAGTACATGCGG CTCGACGTCATGCTGTCTCAAG
SOX-9 CTGAAGGGCTACGACTGGAC TACTGGTCTGCCAGCTTCCT
IL-1 CACCTCTCAAGCAGAGCACAG; GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC
카스파아제-3 AATTCAAGGGACGGGTCATG GCTTGTGCGCGTACAGTTTC
GAPDH GACATGCCGCCTGGAGAAAC AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, KLD12-SP1 를 주입한 랫트에서는 대조군과 비교하여 유리질 연골의 세포외 메트릭스(ECM)의 주요 구성원인 콜라겐 Ⅱ 형의 발현이 2배 이상 증가하였으며, 연골세포의 증식 및 분화조절에 관여하는 유전자인 SOX-9 역시 KLD12-SP1 및 KLD12-SP-MSC 주입 랫트 모두에서 발현이 크게 증가하였다. 반면 염증성 인자인 IL-1β 및 카스파아제-3는 KLD12-SP1 및 KLD12-SP-MSC 주입 랫트 모두에서 대조군의 절반 이하로 감소하였다. 이와 같은 결과를 통해 KLD12-SP는 퇴행성 관절염에서 연골 분화와 관련된 인자의 발현은 효과적으로 증가시키는 동시에, 염증 인자는 감소시켜 염증 반응의 활성화를 억제하는 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5. 조직학적 분석 및 면역형광 분석
관절염을 유도시킨 랫트의 무릎관절을 적출하여 조직학적 분석을 시행하였다. 수집한 샘플은 10% (v/v) 포르말린용액에 고정시키고, 염화수소 에틸렌다이아민테트라아세틱 산성용액 (hydrogen chloride ethylene-diaminetetraacetic acid solution)에서 탈회하였다. 탈회된 시료는 파라핀으로 포매하고 박절기를 이용하여 조직을 시상면 방향으로 6μm 두께로 자른 후, 세포의 형태학적인 분석을 위한 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 실시하였고, 연골조직형성 평가를 위해 MT(Masson Trichrome)염색과 알시안 블루(Alcian blue)염색을 진행하였다. 또한 콜라겐 Ⅱ (Chemicon, Darmstadt, Germany), 카스파아제-8 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), TIMP-1 (Santa Cruz Biotechnology) 항체를 사용하여 면역형광염색을 시행하였으며, 이 때 Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG (Invitrogen, Eugene, Oregon), Alexa Fluor 594 donkey anti rabbit IgG (Invitrogen), Alexa Fluor 594 rabbit anti mouse IgG (Invitrogen)를 이차 항체로 사용하였다. 세포의 핵 관찰을 위하여 DAPI (4’,6-amidino-2-phenylindole, Molecular Probes)를 사용하여 대비염색 하였고, 염색된 조직시편은 200배의 배율에서 형광현미경 (Eclipse TE2000U, Nikon, Tokyo, Japan) 으로 관찰하여 무작위 4군데 사진 촬영 후, 이미지 J 프로그램을 이용하여 정량화 된 수치로 나타내었다.
또한 자가조립 폴리펩타이드에 결합된 물질 P (Substance P; SP)가 랫트의 무릎 관절에 유지되고 있는지를 확인하기 위하여 물질 P의 항체 (Substance P antibody, Santa Cruz Biotechnology) 를 이용하여 염색하였고, Alexa Fluor 488 chicken anti goat IgG (Invitrogen)은 2차 항체로 사용하였다. 염색이 끝난 시편은 형광현미경 (Eclipse TE2000U) 을 이용하여 200배 배율로 관찰하였고, 무작위로 4군데의 사진을 찍은 후 특이적으로 발현이 나타난 부분을 Image J 프로그램을 이용하여 이미지 처리 후 정량적 수치로 나타내었다.
결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 조직학적 분석 결과 KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5 및 KLD12-SP-MSC를 주입한 관절염 모델 랫트의 조직 세포에서는 대조군과 비교하여 연골조직의 손상을 나타내는 정도인 만킨점수가 낮게 나타났다. 만킨 점수는 0에 가까울수록 정상 조직을 나타내는 지표로, 특히 KLD12-SP1 군에서 가장 낮은 점수가 확인되었다. 이와 같은 결과에 따라 KLD12-SP 모두 관절염 모델 랫트에서 연골조직의 손상을 효과적으로 개선함을 확인하였다.
도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, KLD12-SP1, KLD12-SP2, KLD12-SP0.5 및 KLD12-SP-MSC를 주입한 관절염 모델 랫트의 조직 세포에서는 대조군과 비교하여 카스파아제-8 및 TIMP-1 의 발현이 감소되고, 콜라겐 Ⅱ 형의 발현이 뚜렷하게 모든 군에서 증가하는 것으로 나타났다. 또한 KLD12에 결합된 물질 P(SP)가 랫트의 무릎 관절에 유지되고 있는 것 역시 확인되었다. 보다 구체적으로 콜라겐 Ⅱ형의 발현은 대조군에 비하여 모든 실험군에서 약 2배 이상 증가하였으며, 카스파아제-8 및 TIMP-1 은 KLD12-SP 처리군의 SP 함량에 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다.
실시예 6. KLD12-SP 의 줄기세포 동원활성
KLD12-SP 의 물질 P는 중간엽 줄기세포의 동원 활성이 있을 것으로 기대되므로, KLD12-SP-MSC 처리군과 MSC 결합없이 KLD12-SP을 처리한 처리군에서 중간엽 줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커인 CD90 (Thy-1 antibody, Santa Cruz Biotechnology), CD105 (Anti-Endoglin monoclonal antibody, Millipore, Temecula, CA) 항체를 사용하여 면역형광염색을 시행하였다. Alexa Fluor 594 donkey anti rabbit IgG (Invitrogen) 및 Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG (Invitrogen)를 2차 항체로 사용하였으며, 세포의 핵을 확인하기 위하여 DAPI 대비염색을 하였다. 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 중간엽 줄기세포 마커인 CD 90, CD 105의 발현은 MSC 결합없이 KLD12-SP을 처리한 처리군에서도 대조군의 최소 2배 이상으로 나타났다. 이와 같은 결과에 따라, KLD12-SP 는 중간엽 줄기세포를 관절염 부위로 동원하는 효과가 있음이 확인되었으며, 관절염 부위로 중간엽 줄기세포가 이동함에 따라 중간엽 줄기세포에 의한 연골세포의 재생이 더욱 활발하게 이루어질 수 있다는 것을 확인하였다.

Claims (16)

  1. 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드로 구성된 합성 폴리펩타이드를 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드는 자가조립 폴리펩타이드(self-assembly polypeptide)인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드는 물질 P(Substance P)인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 합성 폴리펩타이드는 서열번호 3의 폴리펩타이드인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 혼합물을 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 혼합물은 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드와 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드가 200: 1 내지 200: 200 중량비로 혼합된 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 관절염은 골관절염, 퇴행성 관절염, 박리성 골연골염, 관절 인대 손상, 반월상 연골판 손상, 감염으로 인한 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 류마티스 관절염 및 소아기 류마티스 관절염로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 퇴행성 관절염은 특발성 퇴행성 관절염 또는 속발성 퇴행성 관절염인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 퇴행성 관절염은 무릎, 손가락, 턱, 엉덩이 및 허리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 부위에서 발생하는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 합성 폴리펩타이드는 연골 세포의 세포자멸사를 억제하는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 합성 폴리펩타이드는 항-염증 활성을 갖고, 연골세포의 재생을 촉진하는 것인, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 중간엽 줄기세포를 더 포함하는, 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드로 구성된 합성 폴리펩타이드를 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 주사제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 주사제는 관절강 내(intraarticular) 투여용인, 관절염 예방 또는 치료용 주사제.
  15. 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드로 구성된 합성 폴리펩타이드를 포함하는, 연골세포 분화 유도용 약학적 조성물.
  16. 서열번호 1 로 표시되는 폴리펩타이드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 구성으로 하는 합성 폴리펩타이드; 또는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩타이드와 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩타이드의 혼합물을 대상에 투여하는 단계; 를 포함하는 관절염 예방 또는 치료 방법.
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