WO2016129029A1 - 自動分析装置 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an automatic analyzer that measures the concentration of a substance to be measured contained in a sample.
- Latex aggregation turbidimetry is a method for highly sensitive determination of proteins, hormones, viruses, etc. contained in biological samples (samples) such as blood and urine.
- the latex agglutination turbidimetry is a technique for quantifying the agglutination reaction of latex particles, which are insoluble carriers contained in a reagent, as an optical change.
- the latex particle surface in the reagent is sensitized with an antibody that reacts immunologically with the antigen to be measured in the sample.
- the sample and the reagent are mixed, latex particles are aggregated through the antigen to be measured by the antigen-antibody reaction in the mixed reaction solution.
- the concentration quantification is performed by measuring a sample whose concentration of the antigen to be measured is known in advance and comparing the signal change amount with a plotted calibration curve.
- the aggregation change of latex particles can be grasped as an optically large signal change amount, it leads to high sensitivity.
- Patent Document 1 discloses an apparatus configuration that performs scattered light measurement on an automatic analyzer.
- Patent Document 2 discloses a high-sensitivity configuration and a reagent composition plan using scattered light measurement.
- Patent Document 3 discloses an increase in sensitivity by measuring scattered light using a polarization scattering intensity difference measurement (PIDS) method.
- PIDS polarization scattering intensity difference measurement
- Patent 5318296 JP 2013-64705 A Japanese translation of PCT publication No. 2004-536302
- an absorptiometer In order to increase the sensitivity, it is necessary that the change when the particles contained in the reagent aggregate to form an aggregate is optically indicated by a large amount of signal change.
- an absorptiometer In an automatic analyzer used for measuring protein in a sample, an absorptiometer is mainly used. Although the scattering photometer is more sensitive than the absorptiometer, the dynamic range is narrow. Therefore, an apparatus configuration using both the absorptiometer and the scattering photometer is desirable. In such a case, using a conventional absorptiometer, it is possible to increase the sensitivity by receiving scattered light at any angle with a reagent using latex particles of any particle size in the scattering photometer. I didn't know what would happen.
- a reagent using latex particles is prepared for an absorptiometer, which is composed mainly of components having a particle size of latex particles less than 300 nm. Therefore, the apparatus configuration achieves high sensitivity within a range that assumes a latex reagent for an absorptiometer.
- Patent Document 1 shows a configuration in which light receivers are arranged at many angles in a latex agglutination reaction.
- the amount of components contained in the sample is small and only slightly aggregates, and only the change rate of the amount of scattered light when the particle size of the latex particles changes by 1% was considered.
- the same tendency is shown for any particle size on the low angle side where the light receiving angle is smaller than 20 °. Therefore, on the low angle side, the sensitivity is increased up to a light receiving angle of about 20 °, and no further sensitivity has been achieved.
- Patent Document 2 discloses the conditions of the apparatus and the reagent regarding the particle diameter and density in the latex agglutination reaction. However, since the noise may increase at the scattered light receiving angle of less than 15 °, only the light receiving angle of 15 ° or more is assumed, which is limited. For this reason, the calculation is generally performed at a light receiving angle of 20 ° ( ⁇ 2.5 °). As a result, it is concluded that the latex particle diameter of 300 nm to 430 nm is a suitable condition, but no further increase in sensitivity has been achieved.
- Patent Document 3 describes a method for quantifying a substance to be measured in a sample with higher sensitivity using a polarization scattering intensity difference measurement (PIDS) method, but does not show specific reagents or angle conditions. . In particular, conditions on an analysis system with a limited reaction time and optical measurement time such as an automatic analyzer are not shown.
- PIDS polarization scattering intensity difference measurement
- the automatic analyzer holds a cell containing a reaction mixture in which a sample and a reagent are mixed on the circumference, and repeatedly rotates and stops a reaction disk, and irradiates light from a light source while the reaction disk is rotating.
- a scattered light measuring unit that measures the scattered light after irradiating the cell and interacting with the reaction liquid in the cell.
- the scattered light measuring unit emits scattered light at an angle of less than 15 ° from the optical axis of the irradiated light.
- a sample containing the substance to be measured and latex Measured as reaction process data of the agglutination reaction of the reaction liquid mixed with the reagent, and the substance to be measured in the sample is quantified.
- the scattered light measurement unit receives scattered light at an angle of 7.5 to 12.5 ° from the optical axis of the irradiated light.
- the reagent according to the present invention contains, for example, latex particles having an average particle diameter of 450 nm or more and 875 nm or less, and the latex particles are sensitized with an antibody that recognizes the antigen to be measured. Particle aggregation occurring between the antibody sensitized to the latex particles and the antigen to be measured is measured as a signal change amount of scattered light.
- the optical system conditions of the scattering photometer suitable for high sensitivity were selected from the particle size dependence of the optical signal of the particles, that is, the absorbance and the amount of scattered light.
- the aggregate is generally spherical, and that the aggregate exhibits the same properties as particles having a particle size twice that of a single particle.
- FIG. 1 (A) and (B) show polystyrene in water calculated according to "C. F. Bohren, D. R. Huffman, Absorption and Scattering of Light by Small Particles," J. Wiley & Sons, 1983 "(references).
- the particle size dependence of the amount of scattered light generated when a single particle (refractive index: 1.59) is irradiated with light having a wavelength of 700 nm is shown for each light receiving angle of 5 °, 10 °, 20 °, and 30 °.
- FIG. 1B is an enlarged view of the vertical axis of FIG.
- the light receiving angle is defined by the center angle of the light receiving range with respect to the optical axis of the irradiation light.
- the light receiving range is about ⁇ 2.5 ° with respect to the center angle.
- the aggregates formed can be made larger. Therefore, particles having a relatively large particle size can be used or mixed as the particle size of the latex particles initially included in the reagent. A method is mentioned. A large amount of signal change associated with a larger size change of the aggregate can be expected by binding the large particle diameter to become a part of the aggregate.
- the concentration of the latex reagent must be above a certain level in order to proceed with the reaction.
- a particle concentration corresponding to an absorbance of 0.25 abs to 2.0 abs (converted to an optical path length of 10 mm) is assumed in a reaction solution for final concentration determination using light having a wavelength of approximately 700 nm.
- the present invention is also applied in a similar concentration range.
- the signal size dependence as shown in FIG. 2 is applicable because it shows the same tendency in any concentration range. Even when particles of different particle sizes are mixed, if the absorbance of 1/3 or more of the total absorbance of the latex reagent is caused by particles in that range, the effect of increasing the sensitivity is obtained in the same manner. It is possible.
- the signal difference between a single latex particle (monomer) and an aggregate (dimer) in which two latex particles are bound is measured as a signal change amount.
- the dimer exhibits the same characteristics as latex particles having a particle size twice that of the initial latex particles
- the light reception angle of 30 ° can measure the signal change amount of the aggregate diameter up to 0.9 ⁇ m. It can be seen that particles having a latex particle size of less than 0.45 ⁇ m (450 nm) are suitable for high sensitivity.
- the signal change amount of the aggregate diameter up to 1.3 ⁇ m can be measured at a light receiving angle of 20 °, it can be seen that as large an initial latex particle size as less than 0.65 ⁇ m (650 nm) is suitable for high sensitivity. Since the signal change amount of the aggregate diameter up to 1.9 ⁇ m can be measured at a light receiving angle of 10 °, it can be seen that as large particles as possible with an initial latex particle size of less than 0.95 ⁇ m (950 nm) are suitable for high sensitivity.
- the initial latex particle size is less than 1.15 ⁇ m (1150 nm) and that the largest possible particle is suitable for high sensitivity.
- the particle agglomeration reaction is measured using a scattering photometer that measures light at a low angle (an angle smaller than 20 ° (17.5 ° to 22.5 °)). It has become clear that even larger optical signal changes in aggregates can be captured than absorbance measurements that have been used in biochemical analyzers. As a result, by combining the scattered light receiving angle and the particle diameter of the reagent, a larger amount of signal change can be measured as a scattered photometer, leading to higher sensitivity.
- the insoluble carrier for sensitizing the antibody recognizing the substance to be measured used in the present invention is preferably polystyrene latex particles having an average particle diameter of 450 nm or more and less than 875 nm. Further, metal colloids, magnetic particles, silica particles and the like can be used instead of latex particles. As a method for sensitizing an antibody to an insoluble carrier, a generally used physical adsorption method or chemical bonding method can be applied.
- sample containing the substance to be measured to be measured in the present invention examples include human or animal blood, plasma, serum, urine and the like.
- the substance to be measured in the present invention may be any substance that can recognize the substance to be measured specifically.
- proteins such as D-dimer, C-reactive protein (CRP), and prostate specific antigen (PSA).
- the antibody used in the present invention may be any antibody that can specifically recognize the substance to be measured.
- polyclonal antibodies and monoclonal antibodies derived from rabbits, mice, rats, and goats can be used. If specificity is taken into consideration, the use of a monoclonal antibody is preferred.
- buffer used in the present invention for example, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, glycine buffer, Good buffer, and the like are preferably used.
- the signal change of particle aggregation is measured with scattered light.
- FIG. 3 is a diagram showing an example of the overall configuration of the automatic analyzer according to the present invention.
- the configuration of the automatic analyzer shown in FIG. 3 is used only for explaining the basic concept of the present invention.
- the automatic analyzer according to the present embodiment controls three types of disks, a sample disk 3, a reagent disk 6 and a reaction disk 9, and dispensing mechanisms 10 and 11 for moving samples and reagents between these disks, and these.
- Control circuit 23 absorbance measurement circuit 24 for measuring the absorbance of the reaction solution, scattered light measurement circuit 25 for measuring scattered light from the reaction solution, data processing unit 26 for processing data measured by each measurement circuit, data processing unit 26 has an input unit 27 and an output unit 28 which are interfaces with the H.26.
- the data processing unit 26 includes a data storage unit 2601 and an analysis unit 2602.
- the data storage unit 2601 stores control data, measurement data, data used for data analysis, analysis result data, and the like.
- the input unit 27 and the output unit 28 input / output data to / from the data storage unit 2601.
- the input unit 27 is a keyboard.
- a touch panel, a numeric keypad, or other input device may be used.
- a plurality of sample cups 2 that are containers for the sample 1 are arranged on the circumference of the sample disk 3.
- Sample 1 is as in the sample example shown above.
- the sample dispensing mechanism 10 is a mechanism used when a certain amount of sample 1 is moved from the sample cup 2 to the cell 8.
- the sample dispensing mechanism 10 includes, for example, a nozzle that discharges or sucks a solution, a robot that positions and transports the nozzle to a predetermined position, and a pump that discharges or sucks the solution from the nozzle.
- the antibody reagent dispensing mechanism 11 is a mechanism used when a certain amount of reagent 4 is moved from the reagent bottle 5 to the cell 8.
- the reagent dispensing mechanism 11 also includes, for example, a nozzle that discharges or sucks a solution, a robot that positions and transports the nozzle to a predetermined position, and a pump that discharges or sucks the solution from the nozzle.
- the stirring unit 12 is a mechanism unit that stirs and mixes the sample 1 and the reagent 4 in the cell 8.
- the cleaning unit 14 is a mechanism unit that discharges the reaction solution 7 from the cell 8 that has undergone the analysis process, and then cleans the cell 8. After the washing is finished, the next sample 1 is again dispensed from the sample dispensing mechanism 10 and the new reagent 4 is dispensed from the reagent dispensing mechanism 11 and used for another reaction process.
- the cell 8 In the reaction disk 9, the cell 8 is immersed in a constant temperature fluid 15 in a constant temperature bath whose temperature and flow rate are controlled. For this reason, the temperature of the cell 8 and the reaction liquid 7 therein is maintained at a constant temperature even during movement by the reaction disk 9.
- water is used as the constant temperature fluid 15 and its temperature is adjusted to 37 ⁇ 0.1 ° C. by the control circuit 23.
- the medium and temperature used as the constant temperature fluid 15 are examples.
- An absorbance measuring unit 13 and a scattered light measuring unit 16 are arranged on a part of the circumference of the reaction disk 9.
- FIG. 4 is a schematic diagram illustrating a configuration example of the absorbance measurement unit 13. 4 absorbs the light emitted from the halogen lamp light source 29 during the rotation of the reaction disk 9 to the cell 8, and the light 30 transmitted through the reaction liquid in the cell 8 is spectrally separated by the diffraction grating 31.
- the photodiode array 32 receives light.
- the wavelengths received by the photodiode array 32 are 340 nm, 405 nm, 450 nm, 480 nm, 505 nm, 546 nm, 570 nm, 600 nm, 660 nm, 700 nm, 750 nm, and 800 nm.
- Light reception signals from these light receivers are transmitted to the data storage unit 2601 of the data processing unit 26 through the absorbance measurement circuit 24.
- the absorbance measurement circuit 24 acquires a light reception signal in each wavelength region at regular time intervals, and outputs the acquired light amount value to the data processing unit 26.
- FIG. 5 is a schematic diagram illustrating a configuration example of the scattered light measurement unit 16.
- an LED light source unit is used as the light source 17.
- the irradiation light 18 emitted from the light source 17 is irradiated to the cell 8 located on the optical path, and the transmitted light 19 transmitted through the reaction solution 7 in the cell 8 is received by the transmitted light receiver 20.
- 700 nm is used as the wavelength of the irradiation light.
- an LED light source unit is used as the light source 17, but a laser light source, a xenon lamp, a halogen lamp, or the like may be used.
- the scattered light measuring unit 16 irradiates the cell 8 with the irradiation light 18 from the light source 17 while the reaction disk 9 is rotating, and the scattered light after interacting with the reaction liquid 7 in the cell 8 is scattered light receiver 22a, Measurement is performed at 22b and 22c.
- the scattered light receiver 22a receives scattered light 21a in a direction away from the optical axis of the irradiation light 18 or the transmitted light 19 by an angle of 10 ° in the air.
- the scattered light receiver 22b receives scattered light 21b in a direction away from the optical axis of the irradiation light 18 or the transmitted light 19 by an angle of 20 ° in the air.
- the scattered light receiver 22c receives the scattered light 21c in a direction away from the optical axis of the irradiation light 18 or the transmitted light 19 by an angle of 30 ° in the air.
- the light receiving angles of the scattered light receivers 22a, 22b, and 22c are 10 °, 20 °, and 30 °, respectively, and specifically, 7.5 to 12.5 °, 17.5 to 22.5 °, and 27, respectively. .5 to 32.5 °.
- the scattered light receivers 22a, 22b, and 22c are constituted by photodiodes, for example.
- the light reception signals of these scattered light receivers 22a, 22b, and 22c are transmitted to the data storage unit 2601 of the data processing unit 26 through the scattered light measurement circuit 25.
- the scattered light measurement circuit 25 also acquires three light reception signals having different light reception angles at regular time intervals, and outputs the acquired light amount values to the data processing unit 26.
- the scattered light receivers 22 a, 22 b, and 22 c are arranged in a plane that is substantially perpendicular to the moving direction of the cell 8 due to the rotation of the reaction disk 9.
- the reference position (starting point of scattering) of the light receiving angle is set at the center of the optical path of the light passing through the cell 8.
- the scattered light receivers 22a, 22b, and 22c are arranged so as to correspond to the light receiving angles of 10 °, 20 °, and 30 ° has been described. May be configured to receive scattered light at a plurality of angles at a time. By using a linear array, the choice of the light receiving angle can be expanded. Further, instead of the light receiver, an optical system such as an optical fiber or a lens may be disposed near the cell 8, and the light may be guided to the scattered light receiver disposed at another position.
- an optical system such as an optical fiber or a lens may be disposed near the cell 8, and the light may be guided to the scattered light receiver disposed at another position.
- Quantification of the concentration of the substance to be measured contained in sample 1 is performed according to the following procedure.
- control circuit 23 cleans the cell 8 in the cleaning mechanism 14. Next, the control circuit 23 dispenses a certain amount of the sample 1 in the sample cup 2 into the cell 8 by the sample dispensing mechanism 10. Next, the control circuit 23 dispenses a predetermined amount of the reagent 4 (first reagent) in the reagent bottle 5 to the cell 8 by the reagent dispensing mechanism 11.
- the control circuit 23 drives the sample disk 3, the reagent disk 6 and the reaction disk 9 to rotate by the corresponding drive unit.
- the sample cup 2, the reagent bottle 5, and the cell 8 are positioned at predetermined dispensing positions according to the driving timings of the dispensing mechanisms corresponding thereto. That is, the sample disk 3, the reagent disk 6, and the reaction disk 9 are repeatedly rotated and stopped under the control of the control circuit 23.
- the control circuit 23 controls the stirring unit 12 to stir the sample 1 and the reagent 4 dispensed in the cell 8 to generate a reaction solution 7.
- the cell 8 containing the reaction solution 7 passes through the measurement position where the absorbance measurement unit 13 is arranged and the measurement position where the scattered light measurement unit 16 is arranged.
- the transmitted light or scattered light from the reaction solution 7 is measured via the corresponding absorbance measurement unit 13 and scattered light measurement unit 16, respectively.
- each measurement time is about 10 minutes.
- Measurement data representing the temporal change in the amount of light received by the absorbance measurement unit 13 and the scattered light measurement unit 16 is sequentially output to the data storage unit 2601 and accumulated as reaction process data.
- second reagent a reagent containing latex particles sensitized with an antibody recognizing the substance to be measured
- the reagent is further dispensed into the cell 8 by the reagent dispensing mechanism 11 and stirred by the stirring unit 12 to cause an agglutination reaction, and further measured for a certain time (about 5 minutes).
- the reaction process data of the agglutination reaction acquired at regular time intervals is stored in the data storage unit 2601.
- FIG. 6 is a diagram showing an example of reaction process data acquired by a scattering photometer.
- the photometric points shown on the horizontal axis in FIG. 6 represent the order in which the reaction process data was measured.
- the vertical axis of FIG. 6 indicates the amount of scattered light measured by the scattered light measurement circuit 25.
- FIG. 6 shows reaction process data corresponding to a certain light reception angle. From the scattered light measurement circuit 25 according to the present embodiment, reaction process data corresponding to a light reception angle of 10 ° and light reception angle of 20 ° are shown. Reaction process data and reaction process data corresponding to a light receiving angle of 30 ° are output separately. In addition, reaction process data acquired with an absorptiometer is also output separately.
- the analysis unit 2602 calculates a change in the amount of light within a predetermined time specified through an analysis setting screen (not shown) as a calculation value.
- the fixed period used for calculation value calculation is defined by designating a calculation start point and a calculation end point from the photometric points.
- the calculated value is calculated as the difference between the light amount at the calculation start point and the light amount at the calculation end point. This calculated value corresponds to the signal change amount in this specification.
- a calculated value when a measured substance having a known concentration is measured in advance is held as calibration curve data.
- the analysis unit 2602 collates the calculated value with the calibration curve data, and quantifies the concentration of the substance to be measured.
- the quantified concentration value is displayed through the output unit 28.
- Example 1 A CRP measurement reagent with a changed particle size was prepared, and the absorbance and scattered light were measured with the automatic analyzer shown above.
- the light receiving angles of the scattered light from the irradiation optical axis are 10 °, 20 °, and 30 °.
- a 150 mM glycine solution (pH 7.0) was used as the first reagent, and a latex reagent prepared below was used as the second reagent.
- a 30 mM glycine solution (pH 7.0) and an antibody that recognizes CRP as a substance to be measured are mixed, and four kinds of latex particle solutions (manufactured by Polyscience, particle sizes 200 nm, 350 nm, 500 nm, 750 nm, and 1000 nm) are respectively mixed therewith. Mix and stir for 1 hour at room temperature. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 7 minutes at 25 ° C., the supernatant was removed, and a 30 mM glycine solution (pH 7.0) containing 0.1 to 0.2 mg / mL BSA was mixed and stirred at room temperature for 1 hour. Thereafter, the mixture was centrifuged at 25 ° C.
- the concentration of the final reaction solution after the addition of the second reagent is 1.5 abs, which is about half of the particle concentration of the reagent.
- FIG. 7 shows the magnitude of the signal change amount in the scattered light measurement for each particle size (200 nm, 350 nm, 500 nm, 750 nm, 1000 nm) and the light receiving angle (10 °, 20 °, 30 °).
- FIG. 8 is a diagram in which these data are plotted. It can be seen from FIG. 8 that the signal change amount at the light receiving angle of 10 ° is large.
- FIG. 9 shows the normalized signal change amount [A. 1] when the signal change amount that peaks at each light receiving angle (10 °, 20 °, 30 °) in FIG. U.
- FIG. 9 the signal change amount of the latex reagent having a particle size of 350 nm is obtained at a light receiving angle of 30 °, the signal change amount of the latex reagent having a particle size of 500 nm is received at a light receiving angle of 20 °, and the latex reagent having a particle size of 750 nm at a light receiving angle of 10 °. It can be seen that the amount of signal change is the maximum. This coincides with the high-sensitivity reagent particle size condition considered from the relationship between the particle size and the normalized signal in FIG.
- the signal change amount is a guideline, and whether the sensitivity is actually increased is evaluated by the S / N ratio considering the influence of noise.
- FIG. 10 is a diagram showing the variation (standard deviation) in the scattered light measurement value of the reaction process for each particle size and light receiving angle as the amount of noise. The amount of change in signal varies as much as the variation propagates as a standard deviation.
- FIG. 11 is a graph showing the particle size dependence of the S / N ratio obtained by dividing the signal change amount by the noise amount. The relationship and tendency between the particle diameter derived from the signal change amount and the light receiving angle are the same, and it was found that a latex reagent particle diameter of 750 nm at a light receiving angle of scattered light of 10 ° is advantageous for high sensitivity.
- the S / N ratio is improved at the light receiving angle of 10 ° compared to the light receiving angle of 20 °.
- the reception of scattered light at a light receiving angle of 20 ° is almost equivalent to the reception of scattered light at 17.5 to 22.5 ° from the optical axis of the irradiated light, so at least less than 17.5 ° from the optical axis of the irradiated light.
- measurement with an improved S / N ratio than the light receiving angle of 20 ° is possible by using scattered light having a light receiving angle of less than 15 °.
- the S / N ratio is improved by using scattered light having a light receiving angle of less than 12.5 °.
- the S / N ratio of 150 (dotted line) at a light reception angle of 20 ° is exceeded.
- High sensitivity can be obtained.
- the limitation on the larger particle size side can also be seen from the fact that the scattering angle of 10 ° in FIG. 3 can be measured up to an aggregate diameter of 1.9 ⁇ m (the particle size in the initial reaction tends to be halved to 950 nm).
- the S / N ratio is more than twice that in the case of a light receiving angle of 20 °, and high sensitivity can be reliably achieved compared to the conventional case. More preferably, a particle size of 750 nm capable of securing a S / N ratio of 3 times or more is preferable. Further, scattered light reception at a light receiving angle of 10 ° is almost equivalent to receiving scattered light at an angle of 7.5 to 12.5 ° from the optical axis of the irradiated light.
- the sensitivity is increased by using a reagent having a particle size of 500 nm at a light receiving angle of 20 ° and a particle size of 350 nm at a light receiving angle of 30 °. It was found that the sensitivity can be increased by 3 times or more. In this measurement, a reagent having a single particle size of 750 nm was used. However, the reagent particle size may be mixed to expand the dynamic range. Even if small particles or large particles are mixed, the S / N is simply three times more sensitive, so in the absorbance, 1/3 or more of the total absorbance is due to particles in the particle size range shown above. Similar effects can be obtained as long as the absorbance is obtained.
- the same effect can be obtained if the half-value width is in the range of about ⁇ 10%. That is, in the case of a particle size of 750 nm, the same effect can be expected if the particle size of the reagent is actually in the range of 675 nm to 825 nm.
- the reagent uses a concentration corresponding to 1.5 abs corresponding to the final concentration in the reaction solution at a wavelength of 700 nm, but the same effect can be obtained at a concentration of 0.25 to 2.0 abs in the final reaction solution.
- FIG. 12 shows the magnitude of the signal change obtained when the reagent concentration is adjusted to 4.0 abs, that is, at the final reaction solution concentration of 2.0 abs after the addition of the second reagent, the particle size (200 nm, 350 nm, 500 nm, 750 nm). , 1000 nm) and light receiving angles (10 °, 20 °, 30 °). The same tendency as in FIG. 8 could be confirmed, indicating that high sensitivity could be maintained up to a final reaction solution concentration of 2.0 abs.
- this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
- the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
- a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
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Abstract
サンプルと試薬とが混合した反応液を収めたセルを円周上に保持し、回転と停止を繰り返す反応ディスクと、反応ディスクの回転中に光源からの照射光をセルに照射し、セル中の反応液と相互作用した後の散乱光を測定する散乱光測定部とを有し、散乱光測定部は照射光の光軸から15°未満の角度の散乱光を受光し、試薬として被測定物質を認識する抗体を感作させた粒径が450nm以上875nm以下のラテックス試薬を用い、散乱光測定部による受光量の経時変化を、被測定物質を含むサンプルとラテックス試薬を混合した反応液の凝集反応の反応過程データとして測定し、サンプル中の被測定物質を定量する。
Description
本発明は、サンプルに含まれる被測定物質の濃度を測定する自動分析装置に関する。
血液や尿などの生体試料(サンプル)中に含まれるタンパク質、ホルモン、ウイルスなどを高感度に定量する方法に、ラテックス凝集比濁法が存在する。ラテックス凝集比濁法は、試薬に含まれる不溶性担体であるラテックス粒子の凝集反応を光学的な変化として捉え定量する手法である。試薬中のラテックス粒子表面には、サンプル中の被測定抗原と免疫学的に反応する抗体を感作させる。サンプルと試薬とを混合すると、混合した反応液中で抗原抗体反応により被測定抗原を介してラテックス粒子同士が凝集する。濃度定量は、予め被測定抗原の濃度が分かっているサンプルを測定し、そのシグナル変化量をプロットしたキャリブレーションカーブと比較することで行う。ここでラテックス粒子の凝集変化を光学的に大きなシグナル変化量として捉えることができれば、高感度化につながる。
近年、散乱光を用いた高感度化についての技術開発がなされている。例えば、特許文献1には、自動分析装置上で散乱光測定を実施する装置構成が開示されている。特許文献2には、散乱光測定を用いた高感度化構成や試薬組成案が開示されている。特許文献3には、偏光散乱強度差計測(PIDS)法による散乱光測定による高感度化が開示されている。
高感度化のためには、試薬に含まれる粒子が凝集し凝集体を形成した際の変化が光学的に大きなシグナル変化量で示されることが必要である。サンプル中のたんぱく質の測定に用いられる自動分析装置では、主に吸光光度計が使用されている。散乱光度計は吸光光度計に比べ高感度であるもののダイナミックレンジが狭いため、吸光光度計と散乱光度計を併用する装置構成が望ましい。そのような場合に、従来の吸光光度計を生かしながら、散乱光度計においてどのような粒径のラテックス粒子を用いた試薬で、どのような角度で散乱光を受光すれば高感度化が可能になるかはこれまで分かっていなかった。特にラテックス粒子を用いた試薬は吸光光度計用に調整されており、それはラテックス粒子の粒径が主に300nm未満の成分で構成されていた。そのために吸光光度計用のラテックス試薬を想定した範囲での高感度化を実現する装置構成であった。
特許文献1には、ラテックス凝集反応において多数の角度に受光器を配置した構成が示されている。しかし、サンプルに含まれる成分量が少なくわずかしか凝集しない場合を想定しており、ラテックス粒子の粒径が1%変化したときの散乱光量の変化率のみで考えていた。特に受光角度が20°より小さい低角度側ではどの粒径に対しても同様の傾向を示すと考えられている。そのため低角度側では受光角度20°近傍の高感度化までであり、さらなる高感度化には至っていない。
特許文献2には、ラテックス凝集反応における粒径と密度について装置及び試薬の条件が示されている。しかし、散乱光受光角度15°未満の角度ではノイズが増えてしまうことがあるとして受光角度15°以上しか想定しておらず、限定的である。そのため概ね受光角度20°(±2.5°)で計算しており、結果ラテックス粒子径300nm~430nmまでが好適な条件と結論づけているが、更なる高感度化には至っていない。
特許文献3では、偏光散乱強度差計測(PIDS)法を用いてサンプル中の被測定物質をより高感度に定量する方法が記載されているが、具体的な試薬や角度条件は示されていない。特に自動分析装置のように反応時間や光学測定時間に制限のある分析システム上での条件は示されていない。
本発明による自動分析装置は、サンプルと試薬とが混合した反応液を収めたセルを円周上に保持し、回転と停止を繰り返す反応ディスクと、反応ディスクの回転中に光源からの照射光をセルに照射し、セル中の反応液と相互作用した後の散乱光を測定する散乱光測定部とを有し、散乱光測定部は照射光の光軸から15°未満の角度の散乱光を受光し、試薬として被測定物質を認識する抗体を感作させた粒径が450nm以上875nm以下のラテックス試薬を用い、散乱光測定部による受光量の経時変化を、被測定物質を含むサンプルとラテックス試薬を混合した反応液の凝集反応の反応過程データとして測定し、サンプル中の被測定物質を定量する。
一例として、散乱光測定部は、照射光の光軸から7.5~12.5°の角度の散乱光を受光する。
本発明によれば、低濃度の被測定物質を従来の散乱光度計での測定よりもより高感度に測定することが可能となる。
上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
本発明では、装置の散乱光受光角度及び試薬粒径範囲の想定を広げた場合の理論検討及び反応測定実験を行った。その結果、15°よりも低い受光角度、例えば受光角度10°の散乱光を受光することにより、従来の散乱光測定での高感度化、例えば特許文献2のように従来の受光角度20°で試薬粒径300nm~430nm以下の試薬を用いた場合よりも更に高感度化する方法を得たことにより、本発明を完成するに至った。なお、本明細書中に記載の角度は空気中での角度である。
本発明による試薬は、一例として平均粒径が450nm以上875nm以下のラテックス粒子を含有するものであり、ラテックス粒子には被測定抗原を認識する抗体が感作されている。このラテックス粒子に感作された抗体と被測定抗原との間に生じる粒子凝集を散乱光のシグナル変化量として測定する。
粒子の光学的なシグナル、すなわち吸光度及び散乱光量の粒径依存性から、高感度化のために適した散乱光度計の光学系条件を選定した。ここでは凝集体をおおむね球状とみなし、凝集体は単一粒子の二倍の粒径の粒子と同じ性質を示すと想定する。
図1(A)(B)に、“C. F. Bohren, D. R. Huffman, Absorption and Scattering of Light by Small Particles, J. Wiley & Sons, 1983”(参考文献)に従って算出した水中のポリスチレンの単一粒子(屈折率1.59)に波長700nmの光を照射した際に生じる散乱光量の粒径依存性を、受光角度5°,10°,20°,30°ごとに示す。図1(B)は図1(A)の縦軸を拡大して示した図である。受光角度は照射光の光軸に対する受光範囲の中心角度で定義される。なお受光範囲は中心角度に対して角度幅±2.5°程度である。これらの計算は、Mie散乱理論を用いて計算した。
Mie散乱理論では、散乱体のサイズが大きいほど、散乱光はより前方(照射光進行方向)に放射される性質が知られている。そのため、受光角度が小さくなるほど大きな粒径まで受光光量が増大する傾向にあり、また散乱光量も大きい。図1(A)(B)からその様子が分かる。粒子の凝集反応を散乱光で測定するならば、この傾向を利用して、より大きな凝集体をより低角度の散乱光で受光することで、より大きな光量を得ることができることが分かる。しかし、10°などの低角度側は大きな気泡やごみの影響を受けやすいため、S/N比としては不利になることが多かった。そのため特許文献2にあるように20°程度の受光角度が実際には用いられることが多く、それより低角度の受光角度はほとんど検討されてこなかった。
また、散乱光測定により測定範囲を高感度化するためには散乱光測定のシグナル変化量と凝集体径との関係を比較し、最初のラテックス試薬条件を選択する必要がある。そのため、特許文献1のように粒径が1%変化した場合の光量変化ではなく、厳密には2つのラテックス粒子が凝集し一つの凝集体を形成するときを想定し、それぞれの角度においてどの程度の凝集体径まで測定できるかの知見から、最初のラテックス試薬の粒子条件を選定することが必要である。図1(A)、(B)より、散乱光量の粒径依存性にはピークがあり、粒径が大きくなりすぎると散乱光量は低下してしまう。そのため最初のラテックス粒子が大きすぎると、凝集体の凝集体径が大きくなり大きなシグナル変化として測定できなくなってしまう。
角度ごとにどの程度の粒径(凝集体径)までがシグナル変化として測定できるか比較する。散乱光量を、図1(A)、(B)でのピーク値(粒径50nmから粒径を増大したときに最初に散乱光量が低下し始める際のピーク値)で割った値を規格化シグナルとして図2に示す。
図2より、散乱光測定において空気中換算角度5°,10°,20°,30°の受光角度で測定することでそれぞれ、2.3μm,1.9μm,1.3μm,0.9μmの凝集体径までをシグナル変化として捉えることができることが分かった。
低角度の散乱光を受光する条件であれば、形成される凝集体を大きくできるため、試薬に最初に含ませるラテックス粒子の粒径として比較的大きな粒径の粒子を用いたり、混合しておく方法が挙げられる。この大粒径粒子が結合して凝集体の一部となることで、凝集体のより大きなサイズ変化に伴う大きなシグナル変化量を期待できる。
自動分析装置では反応を計測するため、反応を進めるためにラテックス試薬の濃度は一定以上が必要である。概ね波長700nmの光を用いて最終的な濃度定量をする反応液において0.25abs~2.0absの吸光度(光路長10mm換算)相当となる粒子濃度を想定している。本発明も同様の濃度範囲において適用される。図2に示すようなシグナルの粒径依存性はどの濃度範囲でも同じ傾向を示すため適用できる。また異なる粒径の粒子を混合した場合にも単純にはラテックス試薬全体の吸光度のうち1/3以上の吸光度分がその範囲の粒子に起因していれば、同様に高感度化の効果を得ることが可能である。
高感度化では、低濃度領域であるため、単一のラテックス粒子(単量体)と2個のラテックス粒子が結合した凝集体(2量体)とのシグナルの差をシグナル変化量として計測する。2量体は、初期のラテックス粒子の2倍の粒径のラテックス粒子と同じ特性を示すと仮定すると、受光角度30°は0.9μmまでの凝集体径のシグナル変化量を測定できるため、初期のラテックス粒径が0.45μm(450nm)未満でなるべく大きな粒子が高感度化に好適と分かる。受光角度20°は1.3μmまでの凝集体径のシグナル変化量を測定できるため、初期のラテックス粒径が0.65μm(650nm)未満でなるべく大きな粒子が高感度化に好適と分かる。受光角度10°は1.9μmまでの凝集体径のシグナル変化量を測定できるため、初期のラテックス粒径が0.95μm(950nm)未満でなるべく大きな粒子が高感度化に好適と分かる。受光角度5°は2.3μmまでの凝集体径のシグナル変化量を測定できるため、初期のラテックス粒径が1.15μm(1150nm)未満でなるべく大きな粒子が高感度化に好適と分かる。
以上をまとめると、低角度(20°(17.5°~22.5°)より小さい角度)の受光角度で測定する散乱光度計を用いて、粒子の凝集反応を測定することで、従来の生化学分析装置に用いられてきた吸光度測定よりも、より大きな凝集体の光学的なシグナル変化まで捉えられることが明らかになった。これにより散乱光受光角度と試薬の粒径を合わせることで散乱光度計としてさらに大きなシグナル変化量を測定でき高感度化につながる。
本発明で使用する被測定物質を認識する抗体を感作させる不溶性担体は、平均粒径450nm以上875nm未満のポリスチレン製のラテックス粒子が好ましい。またラテックス粒子の代わりに、金属コロイド、磁性粒子、シリカ粒子などを使用することもできる。不溶性担体への抗体の感作方法としては、一般的に用いられている物理吸着法あるいは化学結合法を適用できる。
本発明において測定される被測定物質を含むサンプルとしては、ヒト又は動物の血液、血漿、血清、尿などが挙げられる。本発明において測定される被測定物質としては、被測定物質を特異的に認識できる物質が存在するものであれば良い。例えばD-ダイマー、C反応性タンパク(CRP)、前立腺特異抗原(PSA)などのタンパク質である。
本発明で使用する抗体としては、上記の被測定物質を特異的に認識できるものであれば良い。一般的には、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ由来のポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いることができる。特異性を考慮するならばモノクローナル抗体の使用が好ましい。
本発明で使用する緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド緩衝液などが好適に用いられる。
次に、測定を行う分析システムについて説明する。本発明では、粒子凝集のシグナル変化を散乱光で測定する。
図3は、本発明における自動分析装置の全体構成例を示す図である。なお、図3に示す自動分析装置の構成は、本発明の基本概念を説明するためのみに用いられる。本実施例の自動分析装置は、サンプルディスク3、試薬ディスク6、反応ディスク9の3種類のディスクと、これらのディスク間でサンプルや試薬を移動させる分注機構10,11と、これらを制御する制御回路23、反応液の吸光度を測定する吸光度測定回路24、反応液からの散乱光を測定する散乱光測定回路25、各測定回路で測定されたデータを処理するデータ処理部26、データ処理部26とのインタフェースである入力部27及び出力部28を有する。
なお、データ処理部26は、データ格納部2601と解析部2602を有する。データ格納部2601には、制御データ、測定データ、データ解析に用いるデータ、解析結果データ等が格納される。入力部27及び出力部28は、データ格納部2601との間でデータを入出力する。図3の例では、入力部27がキーボードの場合を表しているが、タッチパネル、テンキーその他の入力装置でも良い。
サンプルディスク3の円周上には、サンプル1の収容容器であるサンプルカップ2が複数配置される。サンプル1は上記に示したサンプル例の通りである。試薬ディスク6の円周上には、抗体試薬4の収容容器である抗体試薬ボトル5が複数配置される。反応ディスク9の円周上には、サンプル1と試薬4を混合させた反応液7の収容容器であるセル8が複数配置される。
サンプル分注機構10は、サンプルカップ2からセル8にサンプル1を一定量移動させる際に使用する機構である。サンプル分注機構10は、例えば溶液を吐出又は吸引するノズルと、ノズルを所定位置に位置決め及び搬送するロボット、溶液をノズルから吐出又はノズルに吸引するポンプで構成される。抗体試薬分注機構11は、試薬ボトル5からセル8に試薬4を一定量移動させる際に使用する機構である。試薬分注機構11も、例えば溶液を吐出又は吸引するノズルと、ノズルを所定位置に位置決め及び搬送するロボット、溶液をノズルから吐出又はノズルに吸引するポンプで構成される。
攪拌部12は、セル8内で、サンプル1と試薬4を攪拌し混合させる機構部である。洗浄部14は、分析処理が終了したセル8から反応液7を排出し、その後、セル8を洗浄する機構部である。洗浄終了後のセル8には、再び、サンプル分注機構10から次のサンプル1が分注され、試薬分注機構11から新しい試薬4が分注され、別の反応処理に使用される。
反応ディスク9において、セル8は、温度及び流量が制御された恒温槽内の恒温流体15に浸漬されている。このため、セル8及びその中の反応液7は、反応ディスク9による移動中も、その温度は一定温度に保たれる。本実施例の場合、恒温流体15として水を使用し、その温度は制御回路23により37±0.1℃に温度調整される。勿論、恒温流体15として使用する媒体や温度は一例である。
反応ディスク9の円周上の一部には、吸光度測定部13と散乱光測定部16が配置される。
図4は、吸光度測定部13の構成例を示す概略図である。図4に示す吸光度測定部13は、反応ディスク9の回転中にハロゲンランプ光源29から射出された光をセル8に照射し、セル8中の反応液を透過した光30を回折格子31で分光し、フォトダイオードアレイ32で受光する構造を有している。フォトダイオードアレイ32で受光する波長は、340nm,405nm,450nm,480nm,505nm,546nm,570nm,600nm,660nm,700nm,750nm,800nmである。これら受光器による受光信号は、吸光度測定回路24を通じ、データ処理部26のデータ格納部2601に送信される。ここで、吸光度測定回路24は、一定時間毎に各波長域の受光信号を取得し、取得された光量値をデータ処理部26に出力する。
図5は、散乱光測定部16の構成例を示す概略図である。本実施例の場合、光源17には、例えばLED光源ユニットを使用する。光源17から射出された照射光18は、その光路上に位置するセル8に照射され、セル8中の反応液7を透過した透過光19が透過光受光器20において受光される。照射光の波長には、例えば700nmを使用する。散乱光測定では、サンプルに含まれる散乱体(乳ビ、溶血、黄疸)の影響をより受けにくくすることと可視光であることを考慮し、600nm~800nmの波長の照射光を使用するのが好ましい。本実施例では、光源17としてLED光源ユニットを使用したが、レーザ光源、キセノンランプ、ハロゲンランプ等を用いても良い。
散乱光測定部16は、反応ディスク9の回転中に光源17からの照射光18をセル8に照射し、セル8中の反応液7と相互作用した後の散乱光を散乱光受光器22a,22b,22cで測定する。散乱光受光器22aは、照射光18又は透過光19の光軸に対し、空気中において角度10°だけ離れた方向の散乱光21aを受光する。散乱光受光器22bは、照射光18又は透過光19の光軸に対し、空気中において角度20°だけ離れた方向の散乱光21bを受光する。また、散乱光受光器22cは、照射光18又は透過光19の光軸に対し、空気中において角度30°だけ離れた方向の散乱光21cを受光する。散乱光受光器22a,22b,22cの受光角度はそれぞれ10°,20°,30°であるが、具体的にはそれぞれ7.5~12.5°,17.5~22.5°,27.5~32.5°などである。散乱光受光器22a,22b,22cは、例えばフォトダイオードで構成する。これら散乱光受光器22a,22b,22cの受光信号は、散乱光測定回路25を通じ、データ処理部26のデータ格納部2601に送信される。散乱光測定回路25も、一定時間毎に受光角度が異なる3つの受光信号を取得し、取得された光量値をデータ処理部26に出力する。
散乱光受光器22a,22b,22cは、反応ディスク9の回転によるセル8の移動方向に対して概ね垂直である面内に配置される。ここでは、受光角度の基準位置(散乱の起点)を、セル8内を通過する光の光路の中央部に設定している。
図5では、受光角度10°,20°,30°にそれぞれ対応するように散乱光受光器22a,22b,22cを配置する場合について説明したが、受光器を内部に多数保持する単体のリニアアレイを配置し、複数角度の散乱光を一度に受光する構成であってもよい。リニアアレイを用いることにより、受光角度の選択肢を広げることができる。また、受光器でなく光ファイバやレンズなどの光学系をセル8の近くに配置し、別位置に配置された散乱光受光器に光を導いても良い。
サンプル1に含まれる被測定物質の濃度の定量は、次の手順により行われる。
まず、制御回路23は、洗浄機構14において、セル8を洗浄する。次に、制御回路23は、サンプル分注機構10により、サンプルカップ2内のサンプル1をセル8に一定量分注する。次に、制御回路23は、試薬分注機構11により、試薬ボトル5内の試薬4(第一試薬)をセル8に一定量分注する。
各溶液の分注時、制御回路23は、それぞれに対応する駆動部により、サンプルディスク3、試薬ディスク6、反応ディスク9を回転駆動させる。この際、サンプルカップ2、試薬ボトル5、セル8は、それぞれに対応する分注機構の駆動タイミングに応じ、所定の分注位置に位置決めされる。すなわち、サンプルディスク3、試薬ディスク6、反応ディスク9は、制御回路23の制御下にそれぞれ回転と停止を繰り返す。
続いて、制御回路23は、攪拌部12を制御して、セル8内に分注されたサンプル1と試薬4とを攪拌し、反応液7を生成する。反応ディスク9の回転により、反応液7を収容するセル8は、吸光度測定部13が配置された測定位置と散乱光測定部16が配置された測定位置をそれぞれ通過する。反応ディスクの回転中にセル8が測定位置を通過するたび、反応液7からの透過光又は散乱光は、それぞれ対応する吸光度測定部13及び散乱光測定部16を介して測定される。本実施例の場合、各測定時間は約10分である。吸光度測定部13及び散乱光測定部16による受光量の経時変化を表す測定データはデータ格納部2601に順次出力され、反応過程データとして蓄積される。この反応過程データの蓄積の間に、典型的には5分後に、試薬4としてもう一種類の試薬(第二試薬:被測定物質を認識する抗体を感作したラテックス粒子を含有する試薬)を試薬分注機構11によりセル8に追加で分注し、攪拌部12により攪拌して凝集反応を生じさせ、さらに一定時間(約5分間)測定する。これにより、一定の時間間隔で取得された凝集反応の反応過程データが、データ格納部2601に格納される。
図6は、散乱光度計で取得された反応過程データの一例を示す図である。図6の横軸に示す測光ポイントは、反応過程データが測定された順番を表している。一方、図6の縦軸は散乱光測定回路25により測定された散乱光量を示している。図6は、ある受光角度に対応する反応過程データを表しているが、本実施例に係る散乱光測定回路25からは、受光角度10°に対応する反応過程データと、受光角度20°に対応する反応過程データと、受光角度30°に対応する反応過程データが別々に出力される。また吸光光度計で取得された反応過程データも別に出力される。
解析部2602は、不図示の分析設定画面を通じて指定される一定時間内の光量変化を演算値として算出する。ここで、演算値の算出に使用される一定期間は、測光ポイントの中から演算開始ポイントと演算終了ポイントを指定することで規定される。なお、演算値は、演算開始ポイントにおける光量と演算終了ポイントにおける光量の差分として計算される。この演算値が本明細書中のシグナル変化量に相当する。
データ格納部2601には、ここでの演算値の他に、予め既知濃度の被測定物質を測定したときの演算値が検量線データとして保持されている。解析部2602は、計算された演算値と検量線データとを照合し、被測定物質の濃度を定量する。定量された濃度値は出力部28を通じて表示される。
なお、各部の制御・分析に必要なデータは、入力部27からデータ格納部2601に入力される。データ格納部2601に格納された各種のデータ、測定結果、分析結果、アラーム等は出力部28により表示される。
[実施例]
粒径を変更したCRP測定用試薬を調製し、上記に示した自動分析装置で吸光度及び散乱光を測定した。散乱光の照射光軸からの受光角度は10°,20°,30°である。第一試薬には150mMのグリシン溶液(pH7.0)を用い、第二試薬には以下調製のラテックス試薬を用いた。30mMグリシン溶液(pH7.0)と被測定物質であるCRPを認識する抗体とを混合し、そこにラテックス粒子溶液4種(Polyscience社製、粒径200nm,350nm,500nm,750nm,1000nm)をそれぞれ混合して一時間室温で攪拌した。その後25℃、15000rpmで7分間遠心し、上清を除いて、0.1~0.2mg/mL BSAを含む30mMグリシン溶液(pH7.0)を混合し室温で一時間攪拌した。その後25℃、15000rpmで7分間遠心し、上清を除いて150mMグリシン、20%アルギニン酸(pH7.0)溶液で3.0abs近傍(700nm波長)濃度になるように濃度調製した。サンプルに用いるCRPは濃度0.3mg/dLのサンプルを用いた。0濃度でのシグナル変化量はほぼ0であるので、この濃度のサンプルを用いた際のシグナル変化量を比較することで、低濃度側の感度比較が可能である。サンプルと第一試薬を混合攪拌した後、第二試薬を添加した。それぞれの液量は、第一試薬120μL、第二試薬120μL、サンプル2.4μLとした。第二試薬添加の約45秒後と約300秒後のシグナル変化量を算出した。第二試薬添加後の最終的な反応液の粒子濃度は試薬の粒子濃度の約半分の1.5absとなる。
粒径を変更したCRP測定用試薬を調製し、上記に示した自動分析装置で吸光度及び散乱光を測定した。散乱光の照射光軸からの受光角度は10°,20°,30°である。第一試薬には150mMのグリシン溶液(pH7.0)を用い、第二試薬には以下調製のラテックス試薬を用いた。30mMグリシン溶液(pH7.0)と被測定物質であるCRPを認識する抗体とを混合し、そこにラテックス粒子溶液4種(Polyscience社製、粒径200nm,350nm,500nm,750nm,1000nm)をそれぞれ混合して一時間室温で攪拌した。その後25℃、15000rpmで7分間遠心し、上清を除いて、0.1~0.2mg/mL BSAを含む30mMグリシン溶液(pH7.0)を混合し室温で一時間攪拌した。その後25℃、15000rpmで7分間遠心し、上清を除いて150mMグリシン、20%アルギニン酸(pH7.0)溶液で3.0abs近傍(700nm波長)濃度になるように濃度調製した。サンプルに用いるCRPは濃度0.3mg/dLのサンプルを用いた。0濃度でのシグナル変化量はほぼ0であるので、この濃度のサンプルを用いた際のシグナル変化量を比較することで、低濃度側の感度比較が可能である。サンプルと第一試薬を混合攪拌した後、第二試薬を添加した。それぞれの液量は、第一試薬120μL、第二試薬120μL、サンプル2.4μLとした。第二試薬添加の約45秒後と約300秒後のシグナル変化量を算出した。第二試薬添加後の最終的な反応液の粒子濃度は試薬の粒子濃度の約半分の1.5absとなる。
図7は、散乱光測定におけるシグナル変化量の大きさを粒径(200nm,350nm,500nm,750nm,1000nm)と受光角度(10°,20°,30°)ごとに示したものである。また、図8は、これらのデータをプロットした図である。図8より受光角度10°のシグナル変化量が大きいことが分かる。
図9は、図8においてそれぞれの受光角度(10°,20°,30°)でピークとなるシグナル変化量を1としたときの規格化シグナル変化量[A.U.]を示す図である。図9によると、受光角度30°では粒径350nmのラテックス試薬のシグナル変化量が、受光角度20°では粒径500nmのラテックス試薬のシグナル変化量が、受光角度10°では粒径750nmのラテックス試薬のシグナル変化量が最大となることが分かる。これは図2における粒径と規格化シグナルの関係から考察した高感度試薬粒径条件と一致する。
シグナル変化量は目安であり、実際に高感度化したかどうかはノイズの影響も考慮したS/N比で評価する。図10は、粒径、受光角度ごとの反応過程の散乱光測定値のばらつき(標準偏差)をノイズ量として示した図である。シグナル変化量はこのばらつき分が標準偏差として伝播し同じ量変動する。図11は、シグナル変化量をノイズ量で割ったS/N比の粒径依存性を示す図である。シグナル変化量から導いた粒径と受光角度の関係と傾向は同じであり、散乱光受光角度10°でラテックス試薬粒径は750nmが高感度化に有利であることが分かった。
図11から受光角度10°では受光角度20°よりもS/N比が向上していることがわかる。受光角度20゜での散乱光受光は照射光の光軸から17.5~22.5゜の散乱光受光とほぼ同等であるから、少なくとも照射光の光軸から17.5°未満、さらに言えば受光角度15°未満の角度の散乱光を利用することにより受光角度20°よりもS/N比を向上した測定が可能であることが分かる。さらに言えば受光角度12.5°未満の角度の散乱光を利用することにより、S/N比が向上する。特に受光角度10°(受光角度7.5°~12.5°)において試薬粒径範囲375nm以上950nm以下の粒径を用いることにより受光角度20°のS/N比150(一点鎖線)を上回る高感度化を得ることができる。なお粒径の大きい側の制限は図3の散乱角度10°が1.9μmの凝集体径まで測定できることからもわかる(反応初期の粒径は半分の950nmまで測定できる傾向)。また450nm以上875nm以下の試薬粒径を用いることでS/N比は受光角度20°の場合に対して2倍以上となり、従来に対して確実に高感度を達成できる。さらに好適にはS/N比として3倍以上を確保できる粒径750nmが好ましい。また、受光角度10°方向での散乱光受光は、照射光の光軸から7.5~12.5°の角度の散乱光を受光するのとほぼ同等である。
以上から、受光角度10°方向で粒径750nmの試薬の凝集反応を散乱光測定することにより、受光角度20°で粒径500nm、受光角度30°で粒径350nmの試薬を用いて高感度化するよりも、3倍以上高感度化できることが分かった。本測定では750nm単一粒径の試薬を用いたが、試薬粒径はダイナミックレンジ拡大のために混合することがある。粒径の小さい粒子や大きな粒子が混合したとしても、単純にはS/Nが3倍高感度化しているため、吸光度において全吸光度の1/3以上が上記で示した粒径範囲の粒子による吸光度分であれば同様の効果を得ることが可能である。
上記で一つの粒径を指定した場合は代表的なピーク粒径を示したものであり、半値幅が±10%程度の粒径範囲であれば同様の効果が得られる。つまり粒径750nmの場合は、実際には粒径として675nmから825nmの範囲の試薬粒径が含まれていれば同様の効果が見込める。 また本実験において試薬は、波長700nmにおいて反応液での最終濃度が1.5abs相当の濃度を用いているが、最終反応液の濃度0.25~2.0absで同様の効果が得られる。
図12は、試薬濃度を4.0absに調製した場合、すなわち第二試薬添加後の最終反応液の濃度2.0absにおいて取得したシグナル変化量の大きさを粒径(200nm,350nm,500nm,750nm,1000nm)と受光角度(10°,20°,30°)ごとにプロットしたものである。図8と同様の傾向が確認でき、最終反応液の濃度2.0absまで高感度を維持できることを示した。
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
1 サンプル
2 サンプルカップ
3 サンプルディスク
4 試薬
5 試薬ボトル
6 試薬ディスク
7 反応液
8 セル
9 反応ディスク
10 サンプル分注機構
11 試薬分注機構
12 攪拌部
13 吸光度測定部
14 洗浄部
15 恒温流体
16 散乱光測定部
17 光源
18 照射光
19 透過光
20 透過光受光器
21a,21b,21c 散乱光
22a,22b,22c 散乱光受光器
27 入力部
28 出力部
29 光源
30 透過光
31 回折格子
32 受光器
2 サンプルカップ
3 サンプルディスク
4 試薬
5 試薬ボトル
6 試薬ディスク
7 反応液
8 セル
9 反応ディスク
10 サンプル分注機構
11 試薬分注機構
12 攪拌部
13 吸光度測定部
14 洗浄部
15 恒温流体
16 散乱光測定部
17 光源
18 照射光
19 透過光
20 透過光受光器
21a,21b,21c 散乱光
22a,22b,22c 散乱光受光器
27 入力部
28 出力部
29 光源
30 透過光
31 回折格子
32 受光器
Claims (6)
- サンプルと試薬とが混合した反応液を収めたセルを円周上に保持し、回転と停止を繰り返す反応ディスクと、
前記反応ディスクの回転中に光源からの照射光を前記セルに照射し、前記セル中の反応液と相互作用した後の散乱光を測定する散乱光測定部とを有し、
前記散乱光測定部は、前記照射光の光軸から15°未満の角度の散乱光を受光し、
前記試薬として被測定物質を認識する抗体を感作させた粒径が450nm以上875nm以下のラテックス試薬を用い、
前記散乱光測定部による受光量の経時変化を、前記被測定物質を含むサンプルと前記ラテックス試薬を混合した前記反応液の凝集反応の反応過程データとして測定し、前記サンプル中の前記被測定物質を定量することを特徴とする自動分析装置。 - 請求項1記載の自動分析装置において、
前記散乱光測定部は、前記照射光の光軸から7.5°~12.5°の角度の散乱光を受光することを特徴とする自動分析装置。 - 請求項1記載の自動分析装置において、
前記試薬として被測定物質を認識する抗体を感作させた粒径が675nmから825nmのラテックス試薬を用いることを特徴とする自動分析装置。 - 請求項2記載の自動分析装置において、
前記試薬として被測定物質を認識する抗体を感作させた粒径が675nmから825nmのラテックス試薬を用いることを特徴とする自動分析装置。 - 請求項3記載の自動分析装置において、
前記試薬として被測定物質を認識する抗体を感作させた粒子の濃度が、前記反応液において波長700nmにて0.25abs~2.0absとなるラテックス試薬を用いることを特徴とする自動分析装置。 - 請求項5記載の自動分析装置において、
前記反応液の675nmから825nmのラテックス試薬成分が全体のラテックス試薬の吸光度の1/3以上の吸光度分に起因していることを特徴とする自動分析装置。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/JP2015/053484 WO2016129029A1 (ja) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 自動分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/JP2015/053484 WO2016129029A1 (ja) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 自動分析装置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2016129029A1 true WO2016129029A1 (ja) | 2016-08-18 |
Family
ID=56614583
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2015/053484 WO2016129029A1 (ja) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 自動分析装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
WO (1) | WO2016129029A1 (ja) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04503106A (ja) * | 1989-01-26 | 1992-06-04 | セラダイン,インコーポレイテッド | 定量免疫検定システム |
JP2000230901A (ja) * | 1999-02-09 | 2000-08-22 | Mitsubishi Chemicals Corp | 光学ユニット |
WO2011004781A1 (ja) * | 2009-07-10 | 2011-01-13 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 自動分析装置 |
JP2013064705A (ja) * | 2011-09-20 | 2013-04-11 | Hitachi High-Technologies Corp | 自動分析装置及び分析方法 |
-
2015
- 2015-02-09 WO PCT/JP2015/053484 patent/WO2016129029A1/ja active Application Filing
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