WO2016110250A1 - 芒果苷 -6-o- 小檗碱盐及其制备方法与用途 - Google Patents

芒果苷 -6-o- 小檗碱盐及其制备方法与用途 Download PDF

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吴巍
张婧卓
林喆
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滕厚雷
吴巍
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Definitions

  • the present invention relates to mangiferin-6-0-berberine salt, a process for the preparation thereof and use as an AMPK activator or the like.
  • Mangiferin is a natural polyphenolic compound having the formula: C 19 H 18 0 consult, molecular weight: 422.
  • Berberine is an isoquinoline alkaloid. Molecular formula: [ C 2 . H 18 NO .
  • the mangiferin berberine salt should be mangiferin-3-0-berberine salt and mangiferin-7- A composition of 0-berberine salt.
  • the specific conditions of mangiferin-3-0-berberine salt and mangiferin-7-0-berberine salt, such as the ratio of the two, WO2010/145192A1 is not described.
  • ATP-activated protein kinase is a protein kinase that regulates energy metabolism in cells.
  • a MPK plays a vital role in the pathogenesis of metabolic diseases, cardiovascular diseases, nervous system diseases, inflammatory diseases, tumors, and systemic diseases.
  • AMPK is becoming a new target for disease treatment.
  • AMPK activator listed, so the study of AMPK activators has important clinical significance [ ⁇ .AMPK: a new target for the treatment of diabetes and cardiovascular disease. China Medical Tribune, 2009,
  • the structure of the drug substance provided by the listed drug must be clear, if the raw material The drug is a composition, and the proportion must also be determined in order to meet the controllable requirements of the drug quality. Therefore, the mangiferin berberine salt which obtains a single salt-forming site is a technical problem that must be solved for the compound as a drug substance.
  • reaction solvent and mangiferin are suspended to obtain a suspension, and an aqueous solution of an alkaline sodium (potassium) salt is added to the suspension, and the reaction is clarified, and filtered to obtain a solution A.
  • the reaction solvent is one or a mixture of two or more of water and a water-miscible organic solvent such as ethanol, methanol or acetone, wherein the volume ratio of water is 10 to 90% (v/v) o.
  • the present invention provides a mangiferin-6-0-berberine salt, characterized in that the mangiferin-6-0-berberine salt has a structure of the following formula (I).
  • the present invention provides a method for preparing the mangiferin-6-0-berberine salt, which is characterized in that: [0020] 1 alkaline sodium salt or alkaline potassium salt is added to water to prepare an alkaline sodium salt solution or an alkaline potassium salt solution, concentration
  • [0021] 2 is added mangiferin dissolved in dimethyl sulfoxide, to prepare a mangiferin solution;
  • the preparation method of the mangiferin-6-0-berberine salt according to the present invention is characterized in that the ratio of the mangiferin to dimethyl sulfoxide is 1:0.2-5 (w/v) ).
  • the method for preparing mangiferin-6-0-berberine salt according to the present invention is characterized in that the molar ratio of the mangiferin to the basic sodium salt or the basic potassium salt is 1:0.5- 1.
  • the method for preparing mangiferin-6-0-berberine salt according to the present invention is characterized in that: the mangiferin-6-0
  • the preparation method of the mangiferin-6-0-berberine salt according to the present invention is characterized in that the basic sodium salt or the basic potassium salt is selected from the group consisting of sodium carbonate, sodium hydrogencarbonate and potassium carbonate.
  • the basic sodium salt or the basic potassium salt is selected from the group consisting of sodium carbonate, sodium hydrogencarbonate and potassium carbonate.
  • the present invention provides a medicament, characterized in that: the medicament consists of the above-mentioned mangiferin-6-0-berberine salt and a pharmaceutically acceptable adjuvant, and can be clinically applied according to a corresponding pharmaceutical method.
  • Oral preparations such as tablets, capsules, granules, oral solutions, oral suspensions, syrups, pills, etc.; gels
  • the present invention provides the use of the mangiferin-6-0-berberine salt in the preparation of an AMPK activator.
  • the present invention provides the use of a medicament prepared by using the mangiferin-6-0-berberine salt as an active ingredient in the preparation of an AMPK activator.
  • AMPK activators can be used to prevent or treat any one or more of the following diseases: diabetes, diabetes, various Chronic complications (including coronary heart disease, atherosclerosis, cerebrovascular disease, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, neuropathy, diabetic foot, maculopathy, cataract, glaucoma, refractive changes, iridocyclitis, etc.), Obesity, hyperlipidemia, insulin resistance, hyperinsulinemia, metabolic syndrome, hypertension, atherosclerosis, ischemic heart disease, cardiac hypertrophy, arrhythmia, heart failure, upper respiratory tract infection, chronic bronchitis, Chronic obstructive pulmonary disease, asthma, pulmonary fibrosis, hepatitis, simple fatty liver, nonalcoholic fatty liver disease, non
  • the present invention also provides a manganoside-6-0-berberine salt for use in the preparation of a medicament for the treatment of breast hyperplasia, uterine polyps, prostatic hyperplasia, sexual dysfunction, infertility, eczema and fatigue.
  • the effective dosage range of the mangiferin-6-0-berberine salt provided by the present invention for the treatment of the above diseases is 37.5-
  • 600 mg / day / person preferably 75 - 300 mg / day / person, administered 1-3 times a day, preferably 2 times a day.
  • the usage can be selected according to the specific disease, and oral administration is preferred.
  • mangiferin-6-0-berberine salt is formed.
  • mangiferin-6-0-berberine salt not only solves the problem that the mangiferin berberine salt has a well-defined structure as a drug substance, but also, compared with the mangiferin berberine salt disclosed in WO2010/145192A1, The mangiferin-6-0-berberine salt of the compound of the present invention achieves the following unexpected technical effects:
  • the maximum solubility of mangiferin-6-0-berberine salt is 12 mg/ml, while the mangiferin berberine salt of W 02010/145192A1 is 4 mg/ml, mangiferin-
  • the solubility of 6-0-berberine salt in hydrochloric acid solution of pH 1 is 3 times that of mangiferin berberine salt disclosed in WO2010/145192A1, and the solution of mangiferin-6-0-berberine salt The stability is much better than the mangiferin berberine salt disclosed in WO2010/145192A1.
  • the mangiferin-6-0-berberine salt of the present invention has a hygroscopic weight gain ratio which is much smaller than the mangiferin berberine salt disclosed in WO2010/1 45192A1 in a high-humidity environment. This stability in a high-humidity environment is conducive to the storage of the drug, reduces the absorption of water during the preparation process, and improves the quality of the drug.
  • the mangiferin-6-0-berberine salt of the present invention has a therapeutic effect on mammary gland hyperplasia, uterine polyps, sexual dysfunction, benign prostatic hyperplasia, infertility, fatigue, and eczema. These therapeutic effects are not predicted and known from the activity of the mangiferin berberine salt disclosed by W O2010/145192A1.
  • Test Example 1 Comparison of acid and water dissolution of two mangiferin berberine salts at pH 1
  • Sample B Mangiferin berberine salt prepared by the method for preparing mangiferin berberine salt disclosed in WO2010/145192A1.
  • Sample B was soluble in 1 minute, but the solution quickly became cloudy, indicating precipitation of precipitates.
  • Another 50 ml of the solution was placed in a triangular flask, and the mango saponin berberine salt sample A which was ground into a fine powder was accurately weighed.
  • sample A 400 mg was rapidly dissolved in 50 ml of an aqueous acid solution, and the solution was clear. After 24 hours of storage, no precipitate was precipitated.
  • sample A 600 mg was completely dissolved in 50 ml of an aqueous acid solution, and the solution was clear. A small amount of precipitation occurred in about 30 minutes, and the solution was slightly turbid.
  • Test Example 2 Comparison of the stability of two mangiferin berberine salts in high humidity environment
  • Sample B Mangiferin berberine salt prepared by the preparation method of mangiferin berberine salt disclosed in WO2010/145192A1
  • sample A and sample B are placed in a flat dish, accurately weighed, the test sample is placed in a constant humidity sealed container, placed at 25 ° C, RH90% ⁇ 5% for 10 days , accurately weighed on the 5th and 10th days respectively, and recorded the results. Calculate the moisture absorption gain ratio.
  • Test Example 3 Activation of AMPK by Mangiferin-6-0-berberine salt
  • Mangiferin-6-0-berberine salt 2 hydrate was prepared according to the above examples, and dissolved in DMSO. Dilute with medium or HBS buffer before use. The final concentration of DMSO is ⁇ 0.2 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • L6 cells were purchased from ATCC.
  • High glucose DMEM medium was purchased from GIBCO; fetal calf serum was purchased from Hyclon e.
  • L6 cells before differentiation are treated with high glucose DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, 100
  • L6 cells U/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin, was placed in an incubator containing 5% C02 at 37 °C.
  • the differentiation of L6 cells is about 60% of the cells, and replaced with high-sugar DMEM medium containing 2% fetal bovine serum. The medium is changed every two days until the L6 cells differentiate to about 90%.
  • Cells in a 6-well plate were first starved in serum-free high glucose DMEM medium.
  • the test substance was added to serum-free high glucose DMEM medium at a different concentration gradient with a DMSO content of 0.2%.
  • the test substance was incubated with the cells for 3 h, then washed twice with ice-cold lxPBS, and added to 200 ⁇ l of lxSDS running buffer (50 mM Tris HCL, 100 mM).
  • the lysate was analyzed by 10% SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and then transferred to a PVDF membrane at 100 V, l-2 h in a film transfer apparatus.
  • the protein in the gel was semi-dried onto a nitrocellulose membrane and Ponce au S determined the band.
  • Block 1 small in blocking solution (3% skim milk powder, 0.1 ⁇ 3 ⁇ 4Tween, TBS dissolved) ⁇ , add 1: 1000 diluted primary antibody at 4 ° C overnight, TBS wash 3xl5min, add 1: 1000 diluted secondary antibody, incubate for 1 hour at room temperature, TBS wash 3xl5min, rinse in ECL for 5-10 min, use X-ray film Tablet display
  • Test Example 4 Improvement of various indicators of metabolic disorders by mangiferin-6-0-berberine salt
  • a patient who meets the diagnostic criteria for type 2 diabetes mellitus other than alcoholic fatty liver disease is administered 75 mg of mangiferin-6-0-berberine salt tablets (see Example 7 for the preparation method), twice daily, orally. After 6 months, the patient's liver enzyme (ALT).
  • AST liver color hyperlipidemia
  • APRI index reflecting liver fibrosis
  • mangiferin-6-0-berberine salt has liver-lowering enzymes, improves hepatic steatosis, improves liver fibrosis, hypoglycemic, insulin-lowering, increases insulin sensitivity, lowers blood fat, lowers blood pressure, lowers Urinary protein, the role of weight loss.
  • Test Example 5 Various therapeutic effects of mangiferin-6-0-berberine salt on human body
  • Mangiferin-6-0-berberine salt tablet (abbreviated as A, the preparation method is shown in Example 7) is administered orally.
  • Mangiferin-6-0-berberine salt is found in humans to improve rheumatoid arthritis, breast hyperplasia, uterine polyps, benign prostatic hyperplasia, dementia, sexual dysfunction, infertility, arrhythmia, heart failure, fatigue .
  • the mangiferin-6-0-berberine salt gel (abbreviated as B, the preparation method is shown in Example 10) is applied, and the affected area is applied to treat eczema. details as follows:
  • Test Example 6 Comparison of the pharmacokinetics of mangiferin-6-0-berberine salt with mangiferin berberine salt
  • Sample B Mangiferin berberine salt prepared by the method for preparing mangiferin berberine salt disclosed in WO2010/145192A1
  • Mangiferin reference solution Accurately weigh the mangiferin reference substance, put it into a 25ml volumetric flask, add methanol to dissolve and dilute to the mark, and prepare the reference mother liquor for use. Precisely dilute the reference mother solution to a reference solution containing mangiferin 2, 5, 10, 50, 100, 200 ng/ml.
  • Preparation of berberine hydrochloride reference solution accurately weigh berberine hydrochloride reference substance, placed in a 25ml volumetric flask Add methanol to dissolve and dilute to the mark to prepare the reference mother liquor for use. Precisely dilute the reference mother solution to a reference solution containing berberine 0.2, 0.5, 2, 10, 20, 50 ng/ml.
  • Blood sample processing method taking the blood of the rat in a heparin anticoagulation centrifuge tube, centrifuging at 6000 rpm for 10 min, taking plasma
  • Treatment of blank plasma Take 100 ul of plasma, add 500 ul of acetonitrile-acetic acid (9:1) solution for 5 min, centrifuge at 6000 rpm for 10 min, take the supernatant, vacuum dry at 50 ° C, and add 100 ul of the mobile phase solution to the residue. Vortex for 3 min, centrifuge at 6000 rpm for 10 min to obtain a blank plasma sample, and take 10 ul of the supernatant.
  • Pretreatment of the administered plasma sample 100 ul of plasma was collected from each blood collection point, acetonitrile-acetic acid (9:1) solution was added to vortex 500 ul for 5 min, centrifuged at 6000 rpm for 10 min, the supernatant was taken, and vacuum dried at 50 ° C for residue. Add 100 ⁇ l of the mobile phase solution, squish for 3 min, centrifuge at 6000 rpm for 10 min to obtain a blank plasma sample, and take 10 ul of the supernatant.
  • Mass spectrometry conditions Ion detection method: Multi-ion detection (MRM); Ion polarity: Positive ion; Mangiferin: m/z 422.9/327.1, Berberine: m/z 337.3/321.3, Internal standard: m/ z 494.2/369.1.
  • MRM Multi-ion detection
  • Ion polarity Positive ion
  • Mangiferin m/z 422.9/327.1
  • Berberine m/z 337.3/321.3
  • Internal standard m/ z 494.2/369.1.
  • the ratio of mangiferin to DMSO is l:0.5 (w/v)) Dissolved by heating to prepare mangiferin solution; slowly add mangiferin solution to potassium bicarbonate solution, stir well, keep the reaction at 70 °C, filter After, get the mangiferin-6-0-potassium salt solution, keep warm at 60 °C; take berberine hydrochloride O.lmol and dissolve in 3700ml of 70 °C water, get berberine hydrochloride solution, keep warm at 80 °C.
  • the mangiferin-6-0-potassium salt solution was slowly added to the berberine hydrochloride solution, stirred well, the reaction was completed, and the precipitate was allowed to stand still, filtered, and the solid was dried under vacuum at 45 ° C to obtain an orange-yellow solid mangiferin-6- 0 - Berberine salt 2 hydrate 65.7 g, yield 82.8%.
  • the sample purity was determined by HPLC to be 97.6 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • the mangiferin of the present invention is commercially available (Xi'an Yangling Dongke Pharmaceutical Co., Ltd., and the manufacturer having the corresponding extraction equipment can produce 98%).
  • Berberine hydrochloride, berberine sulfate, etc. are all commercially available (Xi'an Xiaocao Plant Technology Co., Ltd.).
  • Commercially available products such as sodium hydrogencarbonate, sodium carbonate, potassium hydrogencarbonate, potassium carbonate, and dimethyl sulfoxide (DMSO) are commercially available.
  • the reaction solution was cooled to 40 ° C, and acetone was added in an amount of 2 times the volume of the reaction solution, and the mixture was thoroughly stirred to precipitate a large amount of precipitate.
  • the mixture was filtered, and the precipitate was washed with absolute ethanol.
  • the precipitate was vacuum dried at 50 ° C, and pulverized to obtain a light yellow powdered mango.
  • the glycoside-6-0-potassium salt was 25.3 g, the yield was 60.2%, and the sample purity was 98.3% as determined by HPLC.
  • the mangiferin-6-0-sodium salt solution is slowly added to the berberine hydrochloride solution, stirred well, the reaction is completed, the precipitate is allowed to stand still, filtered, and the solid is dried under vacuum at 60 ° C, and the obtained dried product is added to an appropriate amount of DM SO.
  • Dissolve slowly add DMSO solution to an appropriate amount of acetone, stir well, stand, precipitate, precipitate, filter, and wash the precipitate with an appropriate amount of absolute ethanol, solid 55.
  • the sample purity was determined by HPLC to be 95.6 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • the berberine hydrochloride solution is slowly added to the medium mangiferin-6-0-sodium salt solution, stirred well, the reaction is completed, the precipitate is allowed to stand still, filtered, and the solid is dried to obtain an orange-yellow solid mangiferin-6-0-small
  • the alkali salt 2 hydrate was 57.0 g, and the yield was 71.8%.
  • the sample purity was determined by HPLC to be 94.5%.
  • the berberine sulfate solution is slowly added to the mangiferin-6-0-potassium salt solution, stirred well, the reaction is completed, the precipitate is allowed to stand still, filtered, and the solid is dried under vacuum at 50 ° C to obtain an orange-yellow solid mangiferin-6- 0-berberine salt 2 hydrate 48.2 g, yield 57.6%.
  • the sample purity was determined by HPLC to be 95.5%.
  • the rate was 70.8%; the obtained dried product was recrystallized from an appropriate amount of methanol to obtain orange-yellow mangiferin-6-0-
  • the berberine salt 4 hydrate was 35.9 g, and the yield was 44.3%.
  • the sample purity was determined by HPLC to be 97.5 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • the berberine hydrochloride solution was slowly added to the medium mangiferin-6-0-sodium salt solution, stirred well, the reaction was completed, the temperature was lowered, the precipitate was allowed to stand still, filtered, and the precipitate was thoroughly washed with pure water, and the solid was vacuum dried at 55 ° C. , an orange-yellow solid mangiferin-6-0-berberine salt 2 hydrate 64.9 g was obtained, and the yield was 81.8%.
  • the sample purity was determined by HPLC to be 96.5%.
  • the mangiferin-6-0-berberine salt 2 hydrate prepared by the method of the example was pulverized through a 160 mesh sieve, and 37.5 g of the powder was weighed, and 50 g of microcrystalline cellulose and 45 g of pregelatinized starch were added as a dilution.
  • the agent, mixed, compressed, made into 1000 tablets, coated with a film, that is, the drug content is 37.5 mg / tablet.
  • the mangiferin-6-0-berberine salt prepared by the method of the example was pulverized through a 160 mesh sieve, 103 g of the powder was weighed, 150 g of pregelatinized starch was added as a diluent, and 100 g of xylose was added as a flavoring agent.
  • the preparation formula is prepared, mixed, and the soft material is made by using 1% sodium carboxymethyl cellulose solution as a binder, and the granules are sieved by 24 mesh, dried, granulated, and packaged, that is, the drug content is 42 mg/g.
  • the mangiferin-6-0-berberine salt 2 hydrate prepared by the method of the example was pulverized through a 160 mesh sieve, and 75 g of the powder was weighed, and 20 g of microcrystalline cellulose and 25 g of medicinal starch were added as a diluent.
  • Preparation formula, mix, use 10 ⁇ 3 ⁇ 4 povidone K30 ethanol solution as binder, soft material, 24 mesh sieve granules, dry and granulate, capsules, 1000 capsules, that is, the drug content It is 75 mg/grain.
  • Example 9 Preparation of mangiferin-6-0-berberine salt gel
  • the sulfoxide is dissolved and uniformly mixed with the matrix to prepare a 1000 ml homogeneous liquid, that is, a mangiferin-6-0-berberine salt gel.
  • the preparation method of the compound of the present invention solves the environmental pressure and cost problem caused by the use of a large amount of organic solvents, and is thus more suitable for industrial production.

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Abstract

本发明提供了一种芒果苷-6-O-小檗碱盐及其制备方法。另外亦提供该芒果苷-6-O-小檗碱盐用作AMPK激活剂治疗糖尿病等的用途。

Description

发明名称：芒果苷 -6-0-小檗碱盐及其制备方法与用途 技术领域
[0001] 本发明涉及芒果苷 -6-0-小檗碱盐及其制备方法及作为 AMPK激活剂等的用途。
背景技术
[0002] 芒果苷 (mangiferin)是天然多酚类化合物， 分子式： C 19H 180„， 分子量： 422。
其化学结构如下：
Figure imgf000002_0001
[0003] 小檗碱 (berberine)为异喹啉类生物碱。 分子式： [ C 2。H 18NO .
Figure imgf000002_0002
[0004] 我们已公幵一种将芒果苷与小檗碱以离子键结合的芒果苷小檗碱盐 【国际公布 号： WO2010/145192A1 ; 发明名称： 一种芒果苷小檗碱盐及其制备方法及用途
[0005] 首先， 该专利说明书第 5页-第 7页第 2段对所述芒果苷小檗碱盐的碳核磁数据、 氢核磁数据与芒果苷、 小檗碱原型化合物的相应数据进行了比较， 从而得出结 论： 芒果苷基团与小檗碱基团中各原子的化学环境发生了变化， 说明小檗碱基 团与芒果苷基团结合形成了芒果苷小檗碱盐。
[0006] 分析芒果苷的结构可知， 芒果苷分子结构中有 4个酚羟基， 所以芒果苷成盐位 点存在着多种可能性， 这使得获得单一成盐位点的芒果苷盐的技术难度大大增 加。
[0007] 根据 WO2010/145192A1所披露的芒果苷小檗碱盐的核磁数据分析可知， 其所述 芒果苷小檗碱盐应为芒果苷 -3-0-小檗碱盐与芒果苷 -7-0-小檗碱盐的组合物。 但 关于芒果苷 -3-0-小檗碱盐与芒果苷 -7-0-小檗碱盐的具体情况， 如二者比例如何 ， WO2010/145192A1并未予以阐述。
[0008] 磷酸腺苷 （AMP) 激活的蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase, AMPK) 是 一种在细胞内行使能量代谢调节的蛋白激酶。 随着对 ΑΜΡΚ研究的日益深入， A MPK在代谢性疾病、 心血管疾病、 神经***疾病、 炎症性疾病、 肿瘤、 肌肉系 统疾病的发病中发挥至关重要的作用， AMPK正成为疾病治疗新靶点， 但目前尚 未有上市的 AMPK激活剂， 故研究幵发 AMPK激活剂具有重要的临床意义 【李忌 .AMPK: 糖尿病与心血管疾病治疗新靶点.中国医学论坛报, 2009,
(1149)； 任俊芳 .AMPK与心血管重构.国际病理科学与临床杂志, 2008,28(1):33-36 ； Ricardo Lage, Carlos Dieguez, Antonio Vidal-Puig. et al. AMPK: a metabolic gauge regulating whole-body energy homeostasis. Trends Mol Med, 2008, 14(12): 539-49； 符庆瑛，高钰琪.蛋白激酶 AMPK的研究进展.生命科学, 17(2): 147-152; 陈奇,梁后杰 ，邹岚，等.一磷酸腺苷活化蛋白激酶对环氧合酶 -2表达与 5-氟尿嘧啶治疗结肠癌敏 感性的关系.实用医院临床杂志, 2008,5(3):56-58等】 。
技术问题
[0009] 按照药物注册的要求， 上市药物所提供的原料药结构必须是明确的， 如果原料 药是组合物， 其比例也必须是确定的， 才能符合药物质量可控的要求。 因此获 得单一成盐位点的芒果苷小檗碱盐对于该化合物做为原料药而言， 是必须解决 的技术问题。
[0010] 其次， WO2010/145192A1专利说明书第 4页第 3段至倒数第 3段及实施例 1-6对所 述芒果苷小檗碱盐的制备方法给予详细论述， 如下：
[0011] ①在反应器中加入反应溶媒和芒果苷混悬得混悬液， 将碱性钠 （钾） 盐水溶液 加入混悬液中， 反应至澄清， 滤过， 得溶液 A。
[0012] ②将小檗碱加入水中溶解， 滤过， 得溶液 B。
[0013] ③将溶液 A滴加入搅拌状态下的溶液 B中， 滴加完毕继续搅拌， 使反应完全， 产 生大量沉淀， 过滤， 固体物干燥， 得芒果苷小檗碱盐。
[0014] 所述反应溶媒为水与乙醇、 甲醇、 丙酮等可与水混溶的有机溶剂中一种或两种 以上的混合物， 其中水的体积比 10— 90%(v/v)o
[0015] 从上述 WO2010/145192A1所披露的制备方法中可以看出： 芒果苷小檗碱盐在制 备过程中需要较大量的乙醇、 甲醇、 丙酮等有机溶剂， 这些有机溶剂不仅成本 高， 而且在工业生产中会带来沉重的环保压力。
问题的解决方案
技术解决方案
[0016] 本发明提供一种芒果苷 -6-0-小檗碱盐， 其特征在于： 所述芒果苷 -6-0-小檗碱 盐具有下式 （I) 的结构。
Figure imgf000004_0001
C I )
[0017] 其中 0≤x≤4。
[0018] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐， 其特征在于： 所述 x=2。
[0019] 本发明提供所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于: [0020] ①将碱性钠盐或碱性钾盐加入水中， 制备碱性钠盐溶液或碱性钾盐溶液， 浓度
¾0.1%-2% (w/v) ；
[0021] ②将芒果苷加入二甲基亚枫中溶解， 制成芒果苷溶液；
[0022] ③将芒果苷溶液缓慢加入碱性钠盐溶液或碱性钾盐溶液中， 充分搅拌， 50°C-10 0°C反应完全， 得芒果苷 -6-0-钠盐溶液或芒果苷 -6-0-钾盐溶液；
[0023] ④取盐酸小檗碱加 50°C-100°C水溶解， 制成盐酸小檗碱溶液；
[0024] ⑤将盐酸小檗碱溶液与芒果苷 -6-0-钠盐溶液或芒果苷 -6-0-钾盐溶液充分混合， 反应完全， 析出沉淀， 过滤， 得固体物；
[0025] ⑥固体物干燥， 得芒果苷 -6-0-小檗碱盐。
[0026] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于： 所述芒果苷与二 甲基亚砜的配比为 1:0.2-5 (w/v) 。
[0027] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于： 所述芒果苷与碱 性钠盐或碱性钾盐的摩尔配比为 1:0.5-1。
[0028] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于： 所述芒果苷 -6-0
-钠盐或芒果苷 -6-0-钾盐与盐酸小檗碱摩尔比为 1： 1。
[0029] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于： 所述碱性钠盐或 碱性钾盐选自碳酸钠、 碳酸氢钠、 碳酸钾、 碳酸氢钾中的一种或两种以上的混 合物， 所述盐酸小檗碱可由硫酸小檗碱或其它小檗碱医学上可接受的盐替代。
[0030] 本发明提供一种药物， 其特征在于： 所述药物由上述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐与 可药用辅料组成， 并按相应制药方法， 即可制成临床适用的片剂、 胶囊剂、 颗 粒剂、 口服溶液剂、 口服混悬剂、 糖浆剂、 丸剂等任何一种口服制剂； 凝胶剂
、 软膏剂、 霜剂等外用制剂； 冻干粉针等注射剂。
[0031] 本发明提供所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐在制备 AMPK激活剂的用途。
[0032] 本发明提供以所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐为活性成分制备的药物在制备 AMPK 激活剂的用途。
[0033] 鉴于现代医学对 AMPK在疾病发生发展中所起重要作用的揭示， 本发明提供一 种芒果苷 -6-0-小檗碱盐在制备 AMPK激活剂的用途， 其特征在于： 所述 AMPK 激活剂可用于预防或治疗下述疾病中的任何一种或几种： 糖尿病、 糖尿病各种 慢性并发症 （包括冠心病、 动脉粥样硬化、 脑血管病、 糖尿病肾病、 糖尿病性 视网膜病变、 神经病变、 糖尿病足、 黄斑病、 白内障、 青光眼、 屈光改变、 虹 膜睫状体病变等） 、 肥胖、 高脂血症、 胰岛素抵抗、 高胰岛素血症、 代谢综合 征、 高血压、 动脉粥样硬化、 缺血性心脏病、 心肌肥大、 心律失常、 心力衰竭 、 上呼吸道感染、 慢性支气管炎、 慢性阻塞性肺病、 哮喘、 肺纤维化、 肝炎、 单纯性脂肪肝、 非酒精性脂肪性肝病、 非酒精性脂肪性肝炎、 酒精性肝病、 酒 精性肝炎、 肝纤维化、 肝硬化、 ***炎、 胰腺炎、 肾炎、 肾病综合征、 高血 压肾病、 慢性肾功能不全、 ***炎、 风湿性关节炎、 类风湿性关节炎、 骨性 关节炎、 炎症性肠病、 脑梗塞、 记忆障碍、 阿尔茨海默氏病、 梗塞性痴呆、 帕 金森氏症、 肿瘤、 肌肉萎缩、 肌肉无力症。
[0034] 本发明还提供一种芒果苷 -6-0-小檗碱盐在制备乳腺增生、 子宫息肉、 ***增 生、 性功能障碍、 ***、 湿疹、 疲劳治疗药物中的应用。
[0035] 本发明提供的芒果苷 -6-0-小檗碱盐用作上述疾病治疗的有效剂量范围为 37.5—
600mg/日 /人， 优选 75-300mg/日 /人， 每日给药 1-3次， 优选每日 2次。 用法可根据 具体疾病进行选择， 以口服为优选。
[0036] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐的理化性质：
[0037] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐， 分子式： C 2。H 18N0 4.C 19H 170„ cH 20， 橙黄色粉末状 物， 熔点： 177-179°C， 几乎不溶于水， 微溶于甲醇， 在稀盐酸溶液中略溶。 结 构式如下：
Figure imgf000006_0001
C I )
[0038] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐的波谱数据： ESI-MS (-) m/z 756(M ),421； ESI-MS (+) m/z 336, 423； 芒果苷基团1 HNMR(400MHz， DMSO-d 6
)5： 4.56 (Η-1') ， 6.01 (Η-5),6.15 (Η-4),6.88 (Η-8)。 13 CNMR (400MHz, DMSO-d 6)δ: 161.51 (C-l) ， 106.58 (C-2) ， 163.06 (C-3 ) ， 92.77 (C-4) ， 155.55 (C-4a) ， 103.74 (C-4b) ， 98.64 (C-5) ， 166.93 ( C-6) ， 147.03 (C-7) ， 100.47 (C-8) ， 100.53 (C-8a) ， 154.37 (C-8b) ， 176 .73 (C-9) ， 73.51 (C-Γ) ， 70.34 (C-2，) ， 79.14 (C-3，) ， 70.34 (C-4，) ， 8 1.37 (C-5') ， 61.27 (C-6，) 。 小檗碱基团1 HNMR(400MHz， DMSO-d 6)δ: 3.2 (H-5)， 4.03 (-OCH3) , 4.07 (-OCH3) , 4.89 (H-6)， 6.13 (-0-CH2-0-) , 7.01 (H-4)， 7.69 (H-l)， 7.86 (H-12)， 8.07 (H-l l)， 8.78 (H-13) , 9.78 (H-8)。 13 CNMR (400MHz, DMSO-d 6)δ: 105.33 (C-l) ， 120.29 (C-la) ， 147.56 (C-2 ) ， 149.71 (C-3) ， 108.22 (C-4) ， 130.45 (C-4a) ， 26.28 (C-5) ， 55.07 (C -6) ， 145.06 (C-8) ， 121.24 (C-8a) ， 143.51 (C-9) ， 150.15 (C-10) ， 126. 55 (C-11) ， 123.33 (C-12) ， 132.87 (C-12a) ， 120.08 (C-13) ， 137.3 (C-13 a) ， 56.93 (C10(-OCH 3)) ， 61.74 (C9(-OCH 3)) ， 101.96 (-O-CH 2-0-) 。
[0039] 附： 芒果苷的波谱数据： ESI-MS m/z 421(M - ); ΉΝΜΚ(400ΜΗζ, DMSO-d 6) 5： 4.60 (Η-Ι') ， 6.37 (Η-5),6.86 (Η-4),7.39 (Η-8)。 3
CNMR (400MHz, DMSO-d 6)δ: 161.68 (C-l) ， 107.54 (C-2) ， 163.73 (C-3 ) ， 93.27 (C-4) ， 156.15 (C-4a) ， 101.25 (C-4b) ， 102.54 (C-5) ， 153.91
(C-6) ， 143.63 (C-7) ， 108.05 (C-8) ， 111.68 (C-8a) ， 150.7 (C-8b) ， 17 9.02 (C-9) ， 73.04 (C-Γ) ， 70.24 (C-2，) ， 78.9 (C-3，) ， 70.56 (C-4，) ， 8 1.44 (C-5') ， 61.41 (C-6，) 。
[0040] 小檗碱的波谱数据： ESI-MS m/z 336(M); ΉΝΜΚ(400ΜΗζ, DMSO-d 6
)5： 3.26 (Η-5)， 4.11 (-OCH3) , 4.21 (-OCH3) , 4.92 (Η-6)， 6.11 (-0-CH2-0-) ， 6.96 (Η-4)， 7.66 (Η-1)， 8.0 (Η-12)， 8.11 (Η-11)， 8.7 (Η-13), 9.76 (Η-8) 。 13CNMR (400MHz, DMSO-d 6)δ: 106.54 (C-l) ， 121.49 (C-la) ， 149.92
(C-2) ， 152.17 (C-3) ， 109.40 (C-4) ， 131.90 (C-4a) ， 28.24 (C-5) ， 57. 20 (C-6) ， 145.73 (C-8) ， 123.33 (C-8a) ， 146.42 (C-9) ， 152.02 (C-10) ， 128.04 (C-11) ， 124.55 (C-12) ， 135.13 (C-12a) ， 121.86 (C-13) ， 139.6 5 (C-13a) ， 57.61 (C10(-OCH 3)) ， 62.56 (C9(-OCH 3)) ,103.68 (-O-CH 2-0- [0041] 结构分析如下：
[0042] 与小檗碱原型化合物比较， 芒果苷 -6-0-小檗碱盐中小檗碱基团碳谱数据各碳原 子的化学位移由于屏蔽作用均发生明显改变。
[0043] 与芒果苷原型化合物比较， 芒果苷 -6-0-小檗碱盐中芒果苷基团碳谱数据中 C 6 ， C 7， C 8b碳原子的化学位移由于去屏蔽作用而发生显著改变， C 6化学位移变化 最大； C 5、 C 8、 C 8a碳原子的化学位移由于屏蔽作用均有不同程度的改变， 其中 处于 C 6原子间位的 C 8和对位的 C 8a化学位移变化较大。
[0044] 根据以上波谱数据分析显示： 芒果苷 -6-0 -与小檗碱 -N ÷
结合， 形成了芒果苷 -6-0-小檗碱盐。
[0045] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐及其水合物的元素分析数据：
[]
Figure imgf000008_0001
发明的有益效果
有益效果
[0046] 我们通过多年的研究， 终于成功获得了一种新的单一成盐位点的芒果苷小檗碱 盐， 即芒果苷 -6-0-小檗碱盐。 该芒果苷 -6-0-小檗碱盐不但解决了芒果苷小檗碱 盐做为原料药必须结构明确的问题， 而且， 相较于 WO2010/145192A1所公幵的 芒果苷小檗碱盐， 本发明化合物芒果苷 -6-0-小檗碱盐取得以下意想不到的技术 效果：
[0047] 1、 本发明的芒果苷 -6-0-小檗碱盐在盐酸溶液中的溶解度较 WO2010/145192A1 所公幵芒果苷小檗碱盐显著提高， 从而更有利于其在胃中的溶解， 从而增加吸 收。 在 pH值 1的盐酸溶液中， 芒果苷 -6-0-小檗碱盐最大溶解度为 12mg/ml， 而 W 02010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐为 4mg/ml， 芒果苷 -6-0-小檗碱盐在 pH 值 1的盐酸溶液中的溶解度是 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐的 3倍 ， 且芒果苷 -6-0-小檗碱盐溶液的稳定性远好于 WO2010/145192A1所公幵的芒果 苷小檗碱盐。
[0048] 2、 本发明的芒果苷 -6-0-小檗碱盐在高湿环境下， 吸湿增重比远小于 WO2010/1 45192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐。 这种在高湿环境下的稳定性有利于药物的贮 藏， 减少制剂过程中的水分吸收， 提高药物质量。
[0049] 3、 意外发现本发明的芒果苷 -6-0-小檗碱盐对乳腺增生、 子宫息肉、 性功能障 碍、 ***增生、 ***、 疲劳、 湿疹具有治疗作用。 这些治疗作用是无法根据 W O2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐的活性预测与获知的。
[0050] 我们还获得一种芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 相较于 WO2010/145192A1 所公幵的芒果苷小檗碱盐的制备方法， 本发明的制备方法不但解决大量有机溶 剂的使用带来的环保压力与成本问题， 从而更适合工业化生产， 而且还取得以 下意想不到的技术效果： 即获得了一种新的单一成盐位点的芒果苷小檗碱盐， 即芒果苷 -6-0-小檗碱盐。
[0051] 试验例 1: 两种芒果苷小檗碱盐在 pH值 1的酸水溶解情况比较
[0052] 1.供试样品：
[0053] 样品 A: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物
[0054] 样品 B: 按 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐制备方法制备的芒果苷 小檗碱盐。
[0055] 2.仪器： PHS-3C微机型 pH计 (上海康仪）
[0056] 3.试验方法与结果：
[0057] 取纯净水， 加盐酸调 pH值为 1的溶液 （25°C±2°C) 备用； 分别量取该溶液各 50 ml置三角瓶中， 分别精密称取研成细粉的芒果苷小檗碱盐样品 A和样品 B各 200m g加入三角瓶中， 振摇； 观察溶解情况。
[0058] 样品 A在数秒钟内迅速溶解， 溶液为澄明状。
[0059] 样品 B在 1分钟内能溶解， 但溶液迅速呈浑浊状态， 表明有沉淀物析出。 [0060] 另取溶液各 50ml置三角瓶中， 分别精密称取研成细粉的芒果苷小檗碱盐样品 A
400mg和 600mg， 分别加入三角瓶中， 振摇； 观察溶解情况。
[0061] 400mg样品 A在 50ml酸水溶液中迅速溶解， 溶液为澄明状， 放置 24小吋未见沉 淀物析出。
[0062] 600mg样品 A在 50ml酸水溶液中完全溶解， 溶液为澄明状， 约 30分钟有少量沉 淀析出， 溶液呈微浊状态。
[0063] 上述试验结果显示样品 A在 pH值 1的盐酸液中最大溶解度约为 12mg/ml， 样品 B 在 pH值 1的酸液中最大溶解度约为 4mg/ml。 芒果苷 -6-0-小檗碱盐溶液的稳定性 远好于 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐。
[0064] 4.结论
[0065] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐在 pH值 1的盐酸液中最大溶解度为 WO2010/145192A1所 公幵的芒果苷小檗碱盐的 3倍。
[0066] 试验例 2: 两种芒果苷小檗碱盐高湿环境稳定性比较
[0067] 1.供试样品：
[0068] 样品 A: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物
[0069] 样品 B: 按 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐制备方法制备的芒果苷 小檗碱盐
[0070] 2.仪器： 万分之一电子天平 （Sartorius,德国） 。
[0071] 3.考察方法：
[0072] 分别取样品 A和样品 B适量各三份， 分别置平面皿内， 精密称定， 供试品置恒 湿密闭容器中， 于 25°C、 RH90%±5%条件下放置 10天， 分别于第 5天和第 10天精 密称定， 记录称定结果。 计算吸湿增重比。
4.结果： 如下表：
Figure imgf000010_0001
[0074] 5.结论
[0075] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物在高湿环境下， 吸湿增重比远小于 WO2010/14519
2A1所公幵的芒果苷小檗碱盐。
[0076] 试验例 3: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐对 AMPK激活作用
[0077] 1、 材料
[0078] 按上述实施例制备芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物， 以 DMSO溶解。 临用前以培 养基或 HBS缓冲液稀释。 DMSO终浓度≤0.2<¾。
[0079] L6细胞购自 ATCC。 高糖 DMEM培养基购自 GIBCO公司； 胎牛血清购自 Hyclon e公司。 抗 AMPK兔源多克隆抗体、 抗 ACC兔源多克隆抗体、 抗 AMPK苏氨酸 172 位点磷酸化兔源多克隆抗体、 抗 ACC丝氨酸 79位点磷酸化兔源多克隆抗体购自 C ell Signal Technology公司。
[0080] 2、 实验方法
[0081] 2.1细胞培养与分化：
[0082] 分化前的 L6细胞用高糖 DMEM培养基， 含 10%胎牛血清， 100
U/ml青霉素、 100 U/ml链霉素， 置于含有的 5% C02的培养箱内 37°C培养。 L6细 胞的分化是在细胞长满 60%左右吋， 换成含 2%胎牛血清的高糖 DMEM培养基， 每两天更换一次培养基， 直到 L6细胞分化至 90%左右。
[0083] 2.2化合物处理及样品收集：
[0084] 先将 6孔板中的细胞在无血清的高糖 DMEM培养基中饥饿。 受试物以不同的浓 度梯度加到无血清的高糖 DMEM培养基中， DMSO含量 0.2%。 受试物与细胞孵 育 3 h， 然后， 用冰冷的 lxPBS洗 2次， 加入 200μ1 lxSDS电泳缓冲液 （50mM Tris HCL, lOOmM
DTT， 2%电泳级 SDS， 0.1%溴酚蓝， 10%甘油） 裂解细胞 10min。 收集裂解液， 超声 15秒钟， 在 100°C煮样品 10 min。
[0085] 2.3免疫印迹检测：
[0086] 裂解液经 10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 再在转膜仪中以 100V， l-2h转移 到 PVDF膜上。 将凝胶中的蛋白质半干转移到硝酸纤维薄膜上， 丽春红 S (Ponce au S) 确定条带。 在封闭液 （3%脱脂奶粉， 0.1<¾Tween， TBS溶解） 中封闭 1小 吋， 加入 1 : 1000稀释一抗 4°C过夜， TBS洗涤 3xl5min， 加入 1 : 1000稀释二抗， 室温孵育 1小吋， TBS洗涤 3xl5min， 置于 ECL中冲洗 5-10 min， 用 X光片压片显
[0087] 3、 结果
[0088] 结果表明： 1.25-5 mol/L芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物呈剂量依赖性地显著增 强了 AMPK磷酸化水平， 同吋显著增强 ACC磷酸化水平。
[0089] 试验例 4: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐对代谢紊乱各项指标的改善作用
[0090] 符合 2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病诊断标准的患者， 给予芒果苷 -6-0-小檗 碱盐片 75mg (制备方法见实施例 7) ， 每日 2次， 口服。 6月后， 患者肝酶 （ALT
、 AST) 、 肝彩超脂肪变、 APRI指数 （反映肝纤维化） 、 糖化血红蛋白 （HbAl
C) 、 血清胰岛素 （INS) 、 胰岛素敏感指数 （ISI) 、 血脂 （TG) 、 血压 （收缩 压、 舒张压） 、 尿微量白蛋白、 体重皆明显改善。
[0091] 结果表明： 芒果苷 -6-0-小檗碱盐具有降肝酶、 改善肝脂肪变、 改善肝纤维化、 降糖、 降胰岛素、 增加胰岛素敏感性、 降脂、 降血压、 降尿蛋白、 降体重的作 用。
[0092] 具体如下表：
[]
Figure imgf000013_0001
注： *p .ft5。
[0093] 试验例 5: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐对人体的各种治疗作用
[0094] 给予芒果苷 -6-0-小檗碱盐片 （简称 A， 制备方法见实施例 7) ， 口服。 在人体 中发现芒果苷 -6-0-小檗碱盐对类风湿性关节炎、 乳腺增生、 子宫息肉、 *** 增生、 痴呆、 性功能障碍、 ***、 心律失常、 心力衰竭、 疲劳具有改善作用。 给予芒果苷 -6-0-小檗碱盐凝胶 （简称 B， 制备方法见实施例 10) ， 涂患处， 具有 治疗湿疹作用。 具体如下：
[]
Figure imgf000014_0001
[0095] 试验例 6: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐与芒果苷小檗碱盐的药代比较
[0096] 1.试验方案
[0097] 样品 A: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物
[0098] 样品 B: 按 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐制备方法制备的芒果苷 小檗碱盐
[0099] 一次性灌胃给予 SD大鼠受试样品 A或样品 B 100 mg/kg, 于 0， 0.083, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12 and 24 h经颈静脉采血。
[0100] 芒果苷对照品溶液的配制： 精密称取芒果苷对照品， 置 25ml容量瓶中， 加甲醇 溶解并稀释至刻度， 制得对照品母液， 备用。 精密量取对照品母液适量稀释成 含芒果苷 2、 5、 10、 50、 100、 200ng/ml的对照品溶液。
[0101] 盐酸小檗碱对照品溶液的配制： 精密称取盐酸小檗碱对照品， 置 25ml容量瓶中 ， 加甲醇溶解并稀释至刻度， 制得对照品母液， 备用。 精密量取对照品母液适 量稀释成含小檗碱 0.2、 0.5、 2、 10、 20、 50ng/ml的对照品溶液。
[0102] 内标物溶液的配制： 精密称取格列本脲， 置 25ml容量瓶中， 加乙腈溶解并稀释 至刻度， 制得格列本脲 50ng/ml的内标物溶液。
[0103] 血样处理方法： 取大鼠血液置肝素抗凝离心管中， 6000rpm离心 10min， 取血浆
， -20°C冷冻备用。
[0104] 空白血浆的处理： 取血浆 100ul， 加入乙腈 -乙酸 （9: 1) 溶液 500ul涡旋 5min， ， 6000rpm离心 10min， 取上清， 50°C真空干燥， 残留物加流动相溶液 100ul， 涡旋 3 min， 6000rpm离心 10min， 得空白血浆样品， 取上清进样 10ul。
[0105] 给药血浆样品的预处理： 取给药各采血点血浆 100ul， 加入乙腈 -乙酸 （9: 1) 溶 液 500ul涡旋 5min， 6000rpm离心 10min， 取上清， 50°C真空干燥， 残留物加流动 相溶液 100ul， 祸旋 3min， 6000rpm离心 10min， 得空白血浆样品， 取上清进样 10 ul。
[0106] 色谱条件： A相: 0.1%甲酸溶液， B相： 甲醇； 色谱柱： Waters Xbridge Cl 8
(50x2.1 mm, 5 μηι)； 流速： 0.40 mL-min- 1。
[0107] 梯度洗脱程序：
[]
Figure imgf000015_0001
[0108] 质谱条件： 离子检测方式： 多离子检测 （MRM) ； 离子极性： 正离子； 芒果 苷： m/z 422.9/327.1， 小檗碱： m/z 337.3/321.3， 内标： m/z 494.2/369.1。
[0109] 2.试验结果
[0110] 采用 Pharsight Phoenix 6.3中的非房室模型计算药代动力学参数。
[] 芒杲苷—S-C 、檗碱盐与芒果苷小檗碱盐的 ADC比较（均数 i 淮差)
Figure imgf000016_0001
[0111] 上述结果显示： 口服芒果苷 -6-0-小檗碱盐 AUC是芒果苷小檗碱盐的 2倍， 表明 芒果苷 -6-0-小檗碱盐的吸收较芒果苷小檗碱盐有所提高。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0112] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物的制备
[0113] 在反应器中加水 670ml， 将碳酸氢钾 O.lmol加入水中制成浓度为 1.5<¾(w/v)的碳 酸氢钾溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 21ml DMS0 (芒果苷与 DMSO的配 比为 l:0.5(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸氢钾 溶液中， 充分搅拌， 70°C保温反应完全， 滤过， 得芒果苷 -6-0-钾盐溶液， 60°C 保温备用； 取盐酸小檗碱 O.lmol加 70°C水 3700ml溶解， 得盐酸小檗碱溶液， 80°C 保温备用。 将芒果苷 -6-0-钾盐溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中， 充分搅拌， 反 应完全， 静置析出沉淀， 过滤， 固体物 45°C真空干燥， 得橙黄色固体芒果苷 -6-0 -小檗碱盐 2水合物 65.7g， 收率为 82.8%。 样品纯度经 HPLC测定为 97.6<¾。
本发明的实施方式
[0114] 本发明所述的芒果苷采用市售品 （西安杨凌东科药业有限公司， 具有相应提取 设备的厂家均可以生产， 含量 98%) 。 盐酸小檗碱、 硫酸小檗碱等均为市售品 ( 西安小草植物科技有限公司） 。 碳酸氢钠、 碳酸钠、 碳酸氢钾、 碳酸钾、 二甲 基亚砜 （DMSO) 等试剂均采用市售品。
[0115] 制备例 1 : 芒果苷 -6-0-钠盐的制备
[0116] 在反应器中加水 1700ml， 将碳酸氢钠 O.lmol力卩入水中制成浓度为 0.5<¾(w/v)的碳 酸氢钠溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 85ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配 比为 l:2(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸氢钠溶 液中， 充分搅拌， 85°C保温反应完全， 滤过， 反应液降至室温， 加入反应液体积 2倍量的丙酮， 充分搅拌， 析出大量沉淀， 过滤， 沉淀物无水乙醇充分洗涤， 沉 淀物 40°C真空干燥， 粉碎， 得淡黄色粉末芒果苷 -6-0-钠盐 21.3g， 收率为 50.5% ， 样品纯度经 HPLC测定为 98.6%。
[0117] 芒果苷 6-0-钠盐： ΉΝΜΚ(400ΜΗζ， DMSO-d 6
)5： 4.60 (Η-1') ， 6.01 (Η-5),6.10 (Η-4),6.96 (Η-8)。 13
CNMR(400MHz， DMSO-d 6) (5ppm) ： 162.43(C-1), 106.82(C-2)， 161.56(C-3) ， 93.50(C-4)， 157.12 (C-4a)， 101.06(C-4b) , 99.53C-5) , 161.56(C-6), 147.08(C- 7)， 103.75(C-8)， 106.83 (C-8a) ， 154.28 (C-8b) ， 176.63(C-9)， 73.67(C-1') ， 70.24(C-2，）， 79.19(C-3')， 70.24(C-4，）， 81.05(C-5，）， 60.97(C-6')=
[0118] 制备例 2: 芒果苷 -6-0-钾盐的制备
[0119] 在反应器中加水 1700ml， 将碳酸钾 0.05mol力卩入水中制成浓度为 0.8<¾(w/v)的碳 酸钾溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 42ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配比 为 l:l(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸钾溶液中 ， 充分搅拌， 60°C保温反应完全， 滤过， 反应液降温至 40°C， 加入反应液体积 2 倍量的丙酮， 充分搅拌， 析出大量沉淀， 过滤， 沉淀物无水乙醇充分洗涤， 沉 淀物 50°C真空干燥， 粉碎， 得淡黄色粉末芒果苷 -6-0-钾盐 25.3g， 收率为 60.2% ， 样品纯度经 HPLC测定为 98.3%。
[0120] 实施例 1 : 芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备
[0121] 在反应器中加水 2000ml， 将碳酸氢钠 O.lmol力卩入水中制成浓度为 0.4<¾(w/v)的碳 酸氢钠溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 127ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配 比为 l:3(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸氢钠溶 液中， 充分搅拌， 80°C保温反应完全， 滤过， 得芒果苷 -6-0-钠盐溶液， 60°C保 温备用； 取 O.lmol盐酸小檗碱加 60°C7j 2000ml溶解， 得盐酸小檗碱溶液， 60°C保 温备用。 将芒果苷 -6-0-钠盐溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中， 充分搅拌， 反应 完全， 静置析出沉淀， 过滤， 固体物 60°C真空干燥， 将所得干燥物加入适量 DM SO中溶解， 将 DMSO溶液缓慢滴加入适量丙酮中， 充分搅拌均匀， 静置， 析出 沉淀， 过滤， 沉淀物用适量无水乙醇洗涤， 固体物 55。C真空干燥， 得橙黄色固体 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 52.0g， 收率为 65.6%。 样品纯度经 HPLC测定为 95.6<¾。
[0122] 实施例 2: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物的制备
[0123] 在反应器中加水 3500ml， 将碳酸钠 0.05mol力卩入水中制成浓度为 0.3<¾(w/v)的碳 酸钠溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 169ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配比 为 l:4(w/v)) 溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸钠溶液中， 充 分搅拌， 100°C保温反应完全， 得芒果苷 -6-0-钠盐溶液， 80°C保温备用； 取 0.1m ol盐酸小檗碱加 90°C水 3700ml溶解， 得盐酸小檗碱溶液， 80°C保温备用。 将盐酸 小檗碱溶液缓慢加入中芒果苷 -6-0-钠盐溶液， 充分搅拌， 反应完全， 静置析出 沉淀， 过滤， 固体物干燥， 得橙黄色固体芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物 57.0g， 收率为 71.8%。 样品纯度经 HPLC测定为 94.5%。
[0124] 实施例 3: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物的制备
[0125] 在反应器中加水 13800ml， 将碳酸钾 0.06mol力卩入水中制成浓度为 0.1<¾(w/v)的碳 酸钾溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 210ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配比 为 l:5(w/v)) 溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸钾溶液中， 充 分搅拌， 50°C保温反应完全， 得芒果苷 -6-0-钾盐溶液， 40°C保温备用； 取 O.lmol 硫酸小檗碱加 50°C水 870ml溶解， 滤过， 得硫酸小檗碱溶液， 40°C保温备用。 将 硫酸小檗碱溶液缓慢加入芒果苷 -6-0-钾盐溶液中， 充分搅拌， 反应完全， 静置 析出沉淀， 过滤， 固体物 50°C真空干燥， 得橙黄色固体芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水 合物 48.2g， 收率为 57.6%。 样品纯度经 HPLC测定为 95.5%。
[0126] 实施例 4: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 4水合物的制备
[0127] 在反应器中加水 800ml， 将碳酸氢钠 O.lmol加入水中制成浓度为 l<¾(w/v)的碳酸 氢钠溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 8.5ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配比 为 l:0.2(W/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸氢钠溶 液中， 充分搅拌， 90°C保温反应完全， 滤过， 得芒果苷 -6-0-钠盐溶液， 80°C保 温备用； 取盐酸小檗碱 O.lmol加 80°C水 37000ml溶解， 得盐酸小檗碱溶液， 70°C 保温备用。 将芒果苷 -6-0-钠盐溶液加入得盐酸小檗碱溶液中， 充分搅拌， 反应 完全， 析出沉淀， 过滤， 沉淀物用纯水充分洗涤， 固体物干燥， 得干燥物 56.2g ， 收率为 70.8%; 将所得干燥物用适量甲醇中进行重结晶， 得橙黄色芒果苷 -6-0- 小檗碱盐 4水合物 35.9g， 收率为 44.3%。 样品纯度经 HPLC测定为 97.5<¾。
[0128] 实施例 5: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物的制备
[0129] 在反应器中加水 380ml， 将碳酸钠 0.04mol和 0.04mol碳酸氢钠加入水中制成浓度 为 2<¾(w/v)的碱性钠盐溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 50ml DMSO (芒果苷 与 DMSO的配比为 l:1.2(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢 加入碱性钠盐溶液中， 充分搅拌， 95°C保温反应完全， 滤过， 得芒果苷 -6-0-钠 盐溶液， 90°C保温备用； 取 O.lmol盐酸小檗碱加 100°C水 3700ml溶解， 滤过， 得 盐酸小檗碱溶液， 90°C保温备用。 将盐酸小檗碱溶液缓慢加入中芒果苷 -6-0-钠 盐溶液， 充分搅拌， 反应完全， 降温， 静置析出沉淀， 过滤， 沉淀物用纯水充 分洗涤， 固体物 55°C真空干燥， 得橙黄色固体芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物 64.9g ， 收率为 81.8%。 样品纯度经 HPLC测定为 96.5%。
[0130] 实施例 6: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐片剂的制备
[0131] 将按实施例方法制备的芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物粉碎过 160目筛， 称取粉末 37.5g， 加入微晶纤维素 50g、 预胶化淀粉 45g作为稀释剂组成制剂配方， 混匀， 以 10%聚维酮 K30乙醇溶液为粘合剂制软材， 24目筛制粒， 干燥后整粒， 加入 0.5 %硬脂酸和 2%的微粉硅胶为润滑剂， 混匀， 压片， 制成 1000片， 包薄膜衣， 即 得， 含药量为 37.5mg/片。
[0132] 实施例 7: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐颗粒的制备
[0133] 将按实施例方法制备的芒果苷 -6-0-小檗碱盐粉碎过 160目筛， 称取粉末 103g， 加入预胶化淀粉 150g作为稀释剂， 加入 100g木糖为矫味剂组成制剂配方， 混匀 ， 以 1%羧甲基纤维素钠溶液为粘合剂制软材， 24目筛制粒， 干燥后整粒， 分装 ， 即得， 含药量为 42mg/g。
[0134] 实施例 8: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐胶囊的制备
[0135] 将按实施例方法制备的芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物粉碎过 160目筛， 称取粉末 75g， 加入微晶纤维素 20g、 药用淀粉 25g作为稀释剂组成制剂配方， 混匀， 以 10 <¾聚维酮 K30乙醇溶液为粘合剂制软材， 24目筛制粒， 干燥后整粒， 分装胶囊， 制成 1000粒， 即得， 含药量为 75mg/粒。
[0136] 实施例 9: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐凝胶剂的制备 [0137] 取羟丙基甲基纤维素 15g、 海藻酸钠 10g， 加适量水， 搅拌溶解， 制成基质， 取 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 4水合物 5g加 100ml二甲基亚砜溶解， 与基质混合均匀， 制 成 1000ml均匀液体， 即芒果苷 -6-0-小檗碱盐凝胶。
[0138] 实施例 10: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐冻干粉针的制备
[0139] 称取 40g甘露醇， 置于适当容器内， 加入 200ml注射用水， 加针用炭 0.2g(0.1<¾w/ v)， 加热至 80°C， 搅拌 30min， 0.22μηι微孔滤膜过滤， 滤液备用。 称取 10g芒果 苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物， 加叔丁醇 100ml， 搅拌使芒果苷 -6-0-小檗碱盐完全溶 解。 混合芒果苷 -6-0-小檗碱盐溶液及甘露醇溶液， 补加注射用水至 1000ml, 用 0 .22μηι微孔滤膜过滤， 分装， 装量为每支含芒果苷 -6-0-小檗碱盐 10mg， 冷冻干 燥。 真空压塞， 轧盖， 贴签， 包装即得。
[0140] 上述具体实施方式对本发明作进一步说明， 但不限于此。
工业实用性
[0141] 本发明的化合物的制备方法解决大量有机溶剂的使用带来的环保压力与成本问 题， 从而更适合工业化生产。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种芒果苷 -6-0-小檗碱盐， 其特征在于： 所述芒果苷 -6-0-小檗碱盐 具有下式 （I) 的结构：
Figure imgf000021_0001
C！ }
其中 0≤x≤4。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐， 其特征在于： 所述 x=2 [权利要求 3] 权利要求 1-2任一所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在 于：
①将碱性钠盐或碱性钾盐加入水中， 制备碱性钠盐溶液或碱性钾盐溶 液， 浓度为 O.l^ ^ (w/v) ；
②将芒果苷加入二甲基亚枫中溶解， 制成芒果苷溶液；
③将芒果苷溶液缓慢加入碱性钠盐溶液或碱性钾盐溶液中， 充分搅拌 ， 50°C-100°C反应完全， 得芒果苷 -6-0-钠盐溶液或芒果苷 -6-0-钾盐 溶液；
④取盐酸小檗碱加 50°C-100°C水溶解， 制成盐酸小檗碱溶液；
⑤将盐酸小檗碱溶液与芒果苷 -6-0-钠盐溶液或芒果苷 -6-0-钾盐溶液 充分混合， 反应完全， 析出沉淀， 过滤， 得固体物；
⑥固体物干燥， 得芒果苷 -6-0-小檗碱盐。
[权利要求 4] 根据权利要求 3所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于 ： 所述芒果苷与二甲基亚砜的配比为 1:0.2-5 (w/v) 。
[权利要求 5] 根据权利要求 3所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于 ： 所述芒果苷与碱性钠盐或碱性钾盐的摩尔配比为 1:0.5-1。 根据权利要求 3所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于 ： 所述芒果苷 -6-0-钠盐或芒果苷 -6-0-钾盐与盐酸小檗碱摩尔比为 1： 1。
根据权利要求 3所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于 ： 所述碱性钠盐或碱性钾盐选自碳酸钠、 碳酸氢钠、 碳酸钾、 碳酸氢 钾中的一种或两种以上的混合物， 所述盐酸小檗碱可由硫酸小檗碱或 其它小檗碱医学上可接受的盐替代。
一种药物， 其特征在于： 所述药物由权利要求 1-2任一所述的芒果苷- 6_0_小檗碱盐与可药用辅料组成。
权利要求 8所述的药物， 其特征在于： 所述药物制成临床适用的片剂 、 胶囊剂、 颗粒剂、 口服溶液剂、 口服混悬剂、 糖浆剂、 丸剂、 外用 制剂、 注射剂。
权利要求 1-2任一所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐在制备 AMPK激活剂的 用途。
根据权利要求 10所述的应用， 其特征在于： 所述 AMPK激活剂可用于 预防或治疗下述疾病中的任何一种或几种： 糖尿病、 糖尿病各种慢性 并发症、 肥胖、 高脂血症、 胰岛素抵抗、 高胰岛素血症、 代谢综合征 、 高血压、 动脉粥样硬化、 缺血性心脏病、 心肌肥大、 心律失常、 心 力衰竭、 上呼吸道感染、 慢性支气管炎、 慢性阻塞性肺病、 哮喘、 肺 纤维化、 肝炎、 单纯性脂肪肝、 非酒精性脂肪性肝病、 非酒精性脂肪 性肝炎、 酒精性肝病、 酒精性肝炎、 肝纤维化、 肝硬化、 ***炎、 胰腺炎、 肾炎、 肾病综合征、 高血压肾病、 慢性肾功能不全、 *** 炎、 风湿性关节炎、 类风湿性关节炎、 骨性关节炎、 炎症性肠病、 脑 梗塞、 记忆障碍、 阿尔茨海默氏病、 梗塞性痴呆、 帕金森氏症、 肿瘤 、 肌肉萎缩、 肌肉无力症。
根据权利要求 11所述的应用， 其特征在于： 所述糖尿病各种慢性并发 症具体指糖尿病并发冠心病、 动脉粥样硬化、 脑血管病、 糖尿病肾病 、 糖尿病性视网膜病变、 神经病变、 糖尿病足、 黄斑病、 白内障、 青 光眼、 屈光改变、 虹膜睫状体病变中的一种或几种。
[权利要求 13] 权利要求 1-2任一所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐在制备用于治疗乳腺增 生、 子宫息肉、 ***增生、 性功能障碍、 ***、 疲劳、 湿疹的药物 中的应用。
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