WO2016047797A1 - 注射用医薬組成物 - Google Patents

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leu
pro
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悟史 田中
朋美 中谷
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大日本住友製薬株式会社
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    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response

Definitions

  • the present invention relates to an injectable pharmaceutical composition
  • a WT1 protein-derived cancer antigen peptide belonging to the field of cancer immunotherapy and having cytotoxic T cell-inducing activity comprising a WT1 protein-derived cancer antigen peptide belonging to the field of cancer immunotherapy and having cytotoxic T cell-inducing activity.
  • the WT1 protein-derived cancer antigen peptide is a partial peptide derived from human WT1 protein (SEQ ID NO: 2) consisting of 449 amino acids, specifically a peptide having 8 to 12 amino acids or a dimer thereof, Antigen recognition by major histocompatibility antigen (Major Histocompatibility Complex, MHC) class I antigen and cytotoxic T cells (cytotoxic T lymphocyte, Cytotoxic T-cell, hereinafter referred to as CTL) Containing the peptide to be produced.
  • MHC major histocompatibility Complex
  • CTL cytotoxic T cells Containing the peptide to be produced.
  • MHC is called human leukocyte type antigen (HLA) in humans.
  • a partial peptide consisting of an amino acid sequence represented by Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 3) (WT1 126-134 peptide);
  • the second amino acid from the N-terminal of the partial peptide (WT1 235-243 peptide) consisting of the amino acid sequence represented by Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO: 6)
  • a modified peptide modified from methionine to tyrosine ie, a peptide having an amino acid sequence represented by Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (SEQ ID NO: 5)
  • HLA It is reported to be useful as a peptide for inducing CTL (see Patent Documents 1 to 4).
  • Patent Documents 1 to 4 see Patent Documents 1 to 4).
  • Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu SEQ ID NO:
  • the partial peptide consisting of the amino acid sequence represented by 1) (WT1 34-51 peptide) itself is useful as a peptide that binds to HLA and induces CTL. It has been reported that there is an effect as a peptide (see Patent Document 5). However, an optimal cancer vaccine composition containing this peptide has not been known.
  • WT1 and 126-134 peptides and / or modified WT1 235-243 peptide the optimum cancer vaccine composition comprising an WT1 34-51 peptide, since it is useful as a cancer vaccine, to ensure the stability of these peptides It was expected to develop a formulation.
  • the subject of the present invention is a peptide represented by the formula (1) or Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-
  • An object of the present invention is to provide a stable pharmaceutical composition for injection of a peptide that can be used for the preparation of a cancer vaccine preparation containing a WT1 partial peptide consisting of the amino acid sequence represented by Leu (SEQ ID NO: 1).
  • the present inventors have found that trehalose and pH adjustment in a liquid preparation containing the peptide represented by the formula (1) or the WT1 partial peptide having the sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the present inventors have found that a liquid agent and / or a lyophilized preparation excellent in formulation stability can be obtained by containing an agent, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to the following.
  • Item 1 Injectable pharmaceutical composition
  • Item 2 The composition according to Item 1, wherein the component (a) is one or more peptides selected from a peptide represented by the formula (1) and a salt thereof.
  • Item 3. The composition according to Item 2, further comprising mannitol.
  • Item 4. The composition according to Item 3, wherein the mannitol is D-mannitol.
  • Item 5. The composition according to any one of Items 2 to 4, further comprising methionine.
  • Item 6. The composition according to Item 5, wherein the methionine is L-methionine.
  • Item 7. The composition according to any one of Items 2 to 6, wherein the pH is 1 to 3.
  • Item 8 The composition according to any one of Items 2 to 7, wherein the composition is a liquid or suspension and the content of the component (b) is 1 to 100 mg / g.
  • Item 9 The composition according to any one of Items 3 to 8, wherein the composition is a liquid or a suspension, and the content of mannitol is 1 to 50 mg / g.
  • Item 10 The composition according to any one of Items 5 to 9, wherein the composition is a liquid or a suspension, and the content of methionine is 1 to 30 mg / g.
  • Component (a) is represented by Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO: 1)
  • Item 2 The composition according to Item 1, which is one or more peptides selected from peptides consisting of amino acid sequences and salts thereof.
  • Item 12. The composition according to Item 11, further comprising a solubilizing agent.
  • Item 13 The composition according to Item 12, wherein the dissolution aid is citric acid, lactic acid, tartaric acid, acetic acid, or trifluoroacetic acid.
  • Item 14 The composition according to Item 12, wherein the dissolution aid is tartaric acid.
  • Item 15 The composition according to any one of Items 12 to 14, wherein the pH is 2 to 3.
  • Item 16 The composition according to Item 11, wherein the pH is 5 to 10.
  • Item 17 The composition according to any one of Items 11 to 16, wherein the composition is a liquid or suspension and the content of the component (b) is 1 to 100 mg / g.
  • Item 18 The composition according to any one of Items 12 to 15, wherein the composition is a solution or a suspension, and the content of the solubilizing agent is 0.1 to 10 mg / g.
  • Item 19 The composition according to any one of Items 11 to 18, wherein the acid used as the pH adjuster is a weak acid.
  • Component (a) is one or more peptides selected from the peptide represented by formula (1) and salts thereof, and Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly A peptide comprising the amino acid sequence represented by -Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO: 1) and one or more peptides selected from salts thereof, Item 2.
  • Item 21 The composition according to Item 20, further comprising mannitol.
  • Item 22 The composition according to Item 20 or 21, further comprising methionine.
  • Item 23 The composition according to any one of Items 20 to 22, further comprising a solubilizing agent.
  • Item 24 The composition according to any one of Items 20 to 23, wherein the pH is 2 to 3.
  • Item 25 The composition according to any one of Items 20 to 24, wherein the composition is a liquid or a suspension, and the content of the component (b) is 1 to 100 mg / g.
  • Item 26 The composition according to any one of Items 21 to 25, wherein the composition is a liquid or suspension, and the content of mannitol is 1 to 50 mg / g.
  • Item 27 The composition according to any one of Items 22 to 26, wherein the composition is a liquid or a suspension, and the content of methionine is 1 to 30 mg / g.
  • Item 28 The pharmaceutical composition for injection according to any one of Items 23 to 27, wherein the composition is a liquid or a suspension, and the content of the solubilizing agent is 0.1 to 10 mg / g. .
  • Item 29 A lyophilized preparation obtained by lyophilizing the composition according to any one of Items 8 to 10, 17, 18, and 25 to 28.
  • Item 30 The composition according to any one of Items 1 to 18, wherein the composition is a solution, a suspension, or a lyophilized formulation.
  • Item 31 The pharmaceutical composition according to any one of Items 1 to 7, 11 to 16, 19 to 24, and 30, wherein the composition is a liquid or a suspension.
  • Item 32 is produced by adding the composition according to any one of Items 11 to 15 in the form of a liquid agent to the composition according to any one of Items 2 to 7 that is in the form of a lyophilized formulation.
  • Item 25 The composition according to any one of Items 20 to 24.
  • Item 33 The composition according to item 32, which is a liquid or suspension.
  • Item 34 A cancer vaccine composition comprising the composition according to any one of Items 1 to 28 and 30 to 33.
  • Item 35 The cancer vaccine composition according to Item 34, further comprising an adjuvant.
  • Item 36 The cancer vaccine composition according to Item 35, wherein the adjuvant is montanide.
  • Item 39 The composition according to any one of Items 2 to 7 which is in the form of a lyophilized formulation, and the composition according to any one of Items 11 to 15 which is in the form of a liquid agent.
  • Item 25 A method for producing the composition according to any one of Items 20 to 24.
  • Item 40 A method for producing a cancer vaccine composition, comprising adding a composition obtained by the method according to Item 39 to an adjuvant.
  • Item 41 The composition according to Item 18, wherein the content of component (b) is 1 to 100 mg / g.
  • Item 42 The pharmaceutical composition for injection according to any one of Items 1 to 18, wherein the pH adjuster is hydrochloric acid and / or sodium hydroxide.
  • a cancer vaccine composition stably containing the peptide of the present invention having cytotoxic T cell-inducing activity can be produced, and a cancer vaccine having excellent formulation stability Can be prepared.
  • a lyophilized preparation in which the peptide is stably maintained can be prepared.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Test Example 4.
  • the vertical axis represents the number of cells that reacted in the number of seeded cells, and the horizontal axis represents the peptide pulsed in vitro.
  • the black bars in FIG. 1 show the results of culturing spleen cells derived from HLA-A * 02: 01 transgenic mice while pulsing the peptide represented by SEQ ID NO: 3, and the white bars show the results of non-pulse culture.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Test Example 4.
  • the vertical axis represents the number of cells that reacted in the number of seeded cells, and the horizontal axis represents the peptide pulsed in vitro.
  • the black bar in FIG. 2 shows the result of culturing splenocytes derived from the HLA-A * 24: 02 transgenic mouse while pulsing the peptide represented by SEQ ID NO: 5, and the white bar is cultured without pulse. Results are shown.
  • the “injectable pharmaceutical composition” in the present invention refers to a composition comprising the peptide of the present invention and one or more components excluding the peptide.
  • a cancer vaccine composition can be prepared by mixing an injectable pharmaceutical composition with various adjuvants.
  • the pharmaceutical composition for injection of the present invention can be provided in the form of a solution, suspension, lyophilized preparation or the like.
  • the “solution” is obtained by dissolving each component contained in the “injectable pharmaceutical composition” in a solvent.
  • a solvent for the “solvent” in the present invention, water is usually mentioned, but pharmacologically acceptable solvents such as propylene glycol and polyethylene glycol can be partially mixed with water as long as they are not affected by the effects of the invention. .
  • it is water.
  • a solution obtained by condensing and dissolving a “lyophilized preparation” described later is also included in the “solution” in the present invention.
  • the “suspension” in the present invention is obtained by mixing and suspending each component contained in the “injectable pharmaceutical composition” in a dispersion medium.
  • a dispersion medium water is usually used, but a pharmacologically acceptable solvent such as propylene glycol and polyethylene glycol may be partially mixed with water as long as the effect of the invention is not affected. it can. Preferably it is water.
  • a product obtained by condensing and suspending a “lyophilized preparation” described later is also included in the “suspension” in the present invention.
  • the “lyophilized preparation” in the present invention is a product obtained by lyophilizing the “solution” or “suspension” in the present invention. Usually, it is performed to improve the chemical and physical stability of the peptide in the “solution” or “suspension”.
  • an appropriate amount of water is added and stirred to form a liquid or suspension, and then mixed with various adjuvants to prepare a cancer vaccine composition.
  • the “peptide” in the present invention is a cancer antigen peptide for preparing a cancer vaccine, the peptide represented by the formula (1), and Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro A peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence represented by -Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO: 1), or a salt thereof .
  • the left side of the peptide is the N-terminus, and each amino acid symbol indicates the following amino acid residue.
  • Ala or A alanine residue Arg or R: Arginine residue Asn or N: Asparagine residue Asp or D: Aspartic acid residue Cys or C: Cysteine residue Gln or Q: Glutamine residue Glu or E: Glutamic acid residue Gly or G: Glycine residue His or H: histidine residue Ile or I: isoleucine residue Leu or L: Leucine residue Lys or K: Lysine residue Met or M: methionine residue Phe or F: phenylalanine residue Pro or P: proline residue Ser or S: Serine residue Thr or T: Threonine residue Trp or W: Tryptophan residue Tyr or Y: tyrosine residue Val or V: valine residue
  • “Peptide represented by the formula (1)” refers to Cys ⁇ , which has a cysteine residue bonded to the N-terminus of Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 3).
  • Leu SEQ ID NO: 5
  • the peptide consisting of the amino acid sequence represented by Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu is a protein (specific example) of the Wilms tumor tumor suppressor gene WT1. Specifically, it consists of 9 consecutive amino acids from the N-terminal of the human WT1 protein (SEQ ID NO: 2) consisting of 449 amino acids from the 126th arginine (Arg) to the 134th leucine (Leu). It is a partial peptide (WT1 126-134 peptide).
  • the peptide is a peptide that is presented to MHC class I antigen and recognized by CTL.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence represented by Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu is 243 from 235th cysteine (Cys) from the N-terminal of WT1 protein.
  • Cys 235th cysteine
  • the peptide is a peptide that is presented to MHC class I antigen and recognized by CTL.
  • the “peptide” is a partial peptide (WT1 34-51 peptide) consisting of 18 amino acids from the 34th tryptophan (Trp) to the 51st leucine (Leu) from the N-terminus of the WT1 protein.
  • the peptide is a peptide that is presented to MHC class II antigen and induces WT1-specific helper T cells.
  • the salt of the peptide consisting of the peptide represented by the formula (1) and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt.
  • Examples of the “salt” in the present invention include acid addition salts and base addition salts.
  • the acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate and phosphate, citrate, oxalate, acetate, formate , Propionate, benzoate, trifluoroacetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, paratoluenesulfonate, and other organic acid salts.
  • inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, hydroiodide, nitrate and phosphate, citrate, oxalate, acetate, formate , Propionate, benzoate, trifluoroacetate, maleate, tartrate, methanesulfonate, benzenesulfonate, paratoluenesulfonate, and other organic acid salts.
  • Inorganic base salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, organic base salts such as triethylammonium salt, triethanolammonium salt, pyridinium salt, diisopropylammonium salt, and the like, and arginine, Examples thereof include amino acid salts such as basic or acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid.
  • a peptide represented by the formula (1) or a salt thereof, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a hydrate of the salt thereof, a solvate such as an ethanol solvate is also included in the peptide of the present invention. included. Furthermore, the peptide of the present invention also includes all diastereomers and enantiomers of the peptide represented by the formula (1), and any stereoisomers or salts thereof, and crystal forms of all embodiments.
  • the peptide represented by the formula (1) or a salt thereof can be produced by the method described in the examples of the present specification or a known method (see Patent Documents 2 to 4).
  • the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof can be produced by a known method (see Patent Document 5).
  • the peptide of this invention may be manufactured by the method normally used in the said technical field. See, for example, Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The proteins, Vol 2, Academic Press Inc. , New York, 1976; peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; peptide synthesis fundamentals and experiments, Maruzen Co., Ltd.
  • the peptide of the present invention obtained by the above method is a free form
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, the peptide of the present invention is converted into a salt.
  • the salt can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the pharmaceutical composition for injection of the present invention may contain the peptide represented by the formula (1) and one salt thereof alone, or the peptide and one or more salts thereof, or two or more salts. May be contained (hereinafter may be collectively referred to as “peptide (1)”).
  • the pharmaceutical composition for injection of the present invention may contain a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and one salt thereof alone, or the peptide and one or more kinds thereof.
  • a salt thereof or a salt of two or more kinds of the peptides may be contained (hereinafter sometimes referred to collectively as “peptide (2)”).
  • the pharmaceutical composition for injection of the present invention may contain both peptide (1) and peptide (2).
  • the content of the peptide of the present invention per weight of the liquid formulation of the present invention is The content is not particularly limited and may be any content that is pharmacologically or physically acceptable.
  • the preferable content of peptide (1) (when two or more peptides are included, the total amount thereof) is 0.5 mg to 200 mg / g, more preferably 0. Examples include 5 mg to 100 mg / g, 0.5 mg to 50 mg / g, and 1 mg to 25 mg / g, and may be selected according to the purpose.
  • the preferable content of peptide (2) (when two or more peptides are included, the total amount thereof) is, for example, 0.05 mg to 200 mg / g, more preferably 0.05 mg to 100 mg / g. , 0.05 mg to 50 mg / g, and 0.1 mg to 25 mg / g, and may be selected according to the purpose.
  • the weight ratio of peptide (1) to peptide (2) is appropriately selected within the range of 1: 0.1 to 1: 5. Can be done.
  • the content per volume of the peptide of the present invention is not particularly defined.
  • the freeze-dried preparation of the present invention is obtained by freeze-drying the liquid preparation of the present invention, and the content of the peptide only needs to satisfy the content of the liquid preparation.
  • the concentration of the present invention is increased. A liquid formulation can be obtained.
  • the pharmaceutical composition for injection of the present invention comprises the following components (b) and (c) in addition to the above-described peptide of the present invention (component (a)): (B) Trehalose or trehalose hydrate (c) It contains a pH adjuster.
  • trehalose represents a kind of disaccharide formed by combining 1,1-glycoside with glucose.
  • Trehalose may be an anhydride or a hydrate thereof.
  • Trehalose hydrate is preferred.
  • the injectable pharmaceutical composition of the present invention may contain trehalose in the form of either an anhydride or a hydrate thereof alone or in combination of two or more thereof.
  • the content per weight in the composition of trehalose is not particularly specified, but the content per weight in the liquid preparation of the present invention (if contained in two or more forms, these As a total amount) of 1 to 50 mg / g, 1 to 70 mg / g, 1 to 100 mg / g, 1 to 150 mg / g, 1 to 200 mg / g, 3 to 50 mg / g, 3 to 70 mg / g, 3 to 100 mg / g, 3 to 150 mg / g, 3 to 200 mg / g, 5 to 50 mg / g, 5 to 70 mg / g, 5 to 100 mg / g, 5 to 150 mg / g, 5 to 200 mg / g, etc. Can be mentioned.
  • the “pH adjuster” in the present invention represents a pH adjuster generally used in pharmaceutical preparations.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, disodium phosphate, dipotassium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate and trisodium phosphate, or salts thereof, nitric acid, acetic acid, Citric acid, tartaric acid, lactic acid, maleic acid, sodium acetate hydrate, anhydrous sodium acetate, sodium citrate hydrate, sodium dihydrogen citrate, sodium tartrate and other organic acids or salts thereof, sodium hydroxide, potassium hydroxide
  • inorganic bases such as aqueous ammonia, or organic bases such as trometamol, histidine, L-arginine, and meglumine.
  • citric acid lactic acid, tartaric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, sodium hydroxide and potassium hydroxide, or trimetamol, histidine, L-arginine, and meglumine, more preferably tartaric acid, hydrochloric acid, and sodium hydroxide, or Trometamol, L-arginine, and meglumine.
  • a weak acid is preferable as the acid in the pH adjuster.
  • the pH adjuster is added to adjust the pH of the liquid preparation of the present invention to a pH range that can ensure the stability of the peptide of the present invention. Since the pH range that can ensure the stability of the peptide of the present invention varies depending on the type of the peptide of the present invention contained in the liquid preparation, as described later, a pH adjuster corresponding to each is used.
  • the pH of the liquid preparation of the present invention is 1-10.
  • the pH is preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and most preferably 2 to 3 from the viewpoint of solubility and stability.
  • the pH is preferably 5 to 10 from the viewpoint of solubility.
  • the preferred pH when the liquid preparation is a liquid, the preferred pH is 1.5 to 4.5, 1.5 to 3.5, 1.5 to 3.0, 2.0 to 3.0. In the case of a suspension, preferred pH is 4 to 9, 4 to 6, 5 to 9.
  • the pH of the liquid preparation of the present invention when the injectable pharmaceutical composition of the present invention contains only the peptide (2), the pH of the liquid preparation of the present invention is 2 to 10, and more specific ranges are 2 to 3, 3 to 9, 6-9, 7. From the viewpoint of stability, the preferred pH is 5 to 10, more preferably 6 to 8.
  • the pH of the liquid preparation of the present invention is 2-10.
  • liquid preparation is a liquid preparation
  • preferred pH is 2 to 4, 2 to 3, 1.7 to 3.2, and 1.5 to 3.5 from the viewpoint of stability. Numbers in this specification are expressed by rounding off the digit one digit below. For example, if it is 2, it means 1.5 or more and less than 2.5.
  • the pH is adjusted to the desired pH by adding an inorganic acid or an organic acid, etc. Can do.
  • an inorganic acid and organic acid those described above can be used.
  • an inorganic base or an organic base can be used as the pH adjuster when the pH value is lower than the desired pH range.
  • the inorganic base and organic base those described above can be used.
  • the pharmaceutical composition for injection of the present invention contains only the peptide (2), it is preferable to use an inorganic base or an organic base as a pH adjuster.
  • the content per weight in the organic base composition is not particularly specified, but the content per weight in the liquid preparation of the present invention is 1 to 100 mg / g, 1 to 50 mg / g, 1 to 150 mg / g, 5 to 100 mg / g, 5 to 50 mg / g, 5 to 150 mg / g, 10 to 100 mg / g, 10 to 50 mg / g, 10 to 150 mg / g, and the like. .
  • the composition may contain mannitol.
  • “Mannitol” in the present invention is a kind of sugar alcohol, which is classified into hexitol and corresponds to a reduced form of mannose. Mannitol has optical isomers and includes D-form, L-form and DL-form, and any of these does not affect the effect of the present invention. Preferred is D-mannitol which is abundant in nature. In addition, mannitol has a plurality of crystal systems, and any of these does not affect the effect of the present invention.
  • the content per weight in the mannitol composition is not particularly specified, but the content per weight in the liquid preparation of the present invention is 1 to 20 mg / g, 1 to 30 mg. / G, 1-50 mg / g, 3-20 mg / g, 3-30 mg / g, 5-20 mg / g, 5-30 mg / g and the like.
  • the composition for injection of the present invention contains the peptide (2) as the component (a), the solubility of the peptide becomes unstable. Therefore, the composition preferably further contains a solubilizing agent.
  • a solubilizing agent for example, an organic acid can be used.
  • a solubilizing agent it can be quickly dissolved in the dissolving step of the peptide (2) as a liquid agent.
  • the solubilizer include citric acid, lactic acid, tartaric acid, acetic acid, and trifluoroacetic acid.
  • the content per weight in the composition of the solubilizing agent is not particularly defined, but the content per weight in the liquid preparation of the present invention is 1 to 5 mg / g, 1 -10 mg / g, 1-15 mg / g, 1-20 mg / g, 3-10 mg / g, 3-15 mg / g, 3-20 mg / g, 5-10 mg / g, 5-15 mg / g, 5-20 mg / G, 0.1-5 mg / g, 0.1-10 mg / g, 0.1-15 mg / g, 0.1-20 mg / g, 0.3-10 mg / g, 0.3-15 mg / g 0.3 to 20 mg / g, 0.5 to 10 mg / g, 0.5 to 15 mg / g, and 0.5 to 20 mg / g.
  • the composition further contains methionine from the viewpoint of the stability of the peptide when prepared as a cancer vaccine composition. It is desirable. By blending methionine, oxidation of the methionine residue contained in peptide (1) can be suppressed when it is prepared as a cancer vaccine composition.
  • methionine of the present invention is one of the essential amino acids, and is a hydrophobic amino acid containing a sulfur atom in the side chain. “Methionine” has optical isomers and includes D-form, L-form and DL-form, and any of these does not affect the effect of the present invention.
  • the content per weight in the methionine composition is not particularly specified, but preferably the content per weight in the liquid preparation of the present invention is 1 to 5 mg / g, 1 ⁇ 10 mg / g, 1 ⁇ 20 mg / g, 1 ⁇ 30 mg / g, 3 ⁇ 10 mg / g, 3 ⁇ 20 mg / g, 3 ⁇ 30 mg / g, 5 ⁇ 10 mg / g, 5 ⁇ 20 mg / g, and 5 ⁇ 30 mg / g etc. are mentioned.
  • the pharmaceutical composition for injection of the present invention includes pharmaceutical preparations such as stabilizers, solubilizers, buffers, isotonic agents, etc. Generally used additives can be used.
  • the pharmaceutical composition for injection of the present invention can be produced by a method generally used in pharmaceutical production or the like. Specifically, for example, in an environment maintained at a constant temperature of 5 to 25 ° C., water for injection is charged into an appropriate container, and the peptides and additives weighed in advance are added while gently stirring, and finally It can be prepared by adjusting to a desired pH, sterilized by filtration after the preparation, filled in a container such as a glass vial, and sealed with a rubber stopper or the like. In the case of preparing a freeze-dried preparation, the obtained liquid preparation of the present invention may be freeze-dried by a method known per se.
  • Each of the peptides of the present invention can be used alone as an antigen peptide for a cancer vaccine, but both the peptide (1) and the peptide (2) can be contained in the cancer vaccine composition.
  • Peptide (2) binds to HLA by itself, induces CTL, and also has an effect as a helper peptide when used in combination with peptide (1), so both peptide (1) and peptide (2)
  • the cancer vaccine composition containing the compound is expected to have a synergistic vaccine effect.
  • one pharmaceutical composition for injection according to the present invention containing both peptides may be mixed with an adjuvant, or two injections according to the present invention containing respective peptides.
  • the pharmaceutical composition may be mixed with an adjuvant in triplicate.
  • the liquid preparation of the present invention containing both the peptide (1) and the peptide (2) can be prepared directly (in one step) by subjecting both peptides to the above-mentioned production method. It can also be obtained by mixing and preparing both as a separate solution or suspension for production.
  • a solution or suspension containing peptide (1) is lyophilized, and a solution or suspension containing peptide (2) is added thereto to freeze containing peptide (1).
  • a method of dissolving or suspending the dry preparation is exemplified.
  • the lyophilized preparation containing peptide (2) is redissolved or resuspended in a smaller amount of water or the like than the liquid or suspension before lyophilization. It becomes cloudy, and the solution or suspension is added to the lyophilized preparation containing the peptide (1) and dissolved or suspended, so that the solution or suspension has a higher concentration than the solution or suspension before lyophilization. It can be prepared as a liquid.
  • a method for preparing a cancer vaccine using the pharmaceutical composition for injection of the present invention is not particularly limited.
  • a method for preparing a cancer vaccine by mixing with an appropriate adjuvant A method of preparing a cancer vaccine preparation by drying or the like; a method of preparing a cancer vaccine by mixing the liquid preparation of the present invention with various adjuvants by preparation at the time of use.
  • adjuvants include precipitation adjuvants and oil adjuvants.
  • Precipitating adjuvant represents an inorganic suspending agent to which a peptide is adsorbed.
  • the precipitating adjuvant examples include sodium hydroxide, aluminum hydroxide (Alum), calcium phosphate, aluminum phosphate, alum, pepes, carboxyvinyl polymer, and the like.
  • An oily adjuvant represents an oil emulsion in which an aqueous solution containing a peptide is wrapped with mineral oil to form micelles and emulsified.
  • Specific examples of the oily adjuvant include liquid paraffin, lanolin, Freund's adjuvant (complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant), montanide, W / O emulsion (see WO2006 / 078059) and the like.
  • Cancer vaccines prepared using the injectable pharmaceutical composition of the present invention are cancers with increased WT1 gene expression levels, for example, blood cancers such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma, It can be used for the prevention or treatment of solid cancer such as stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, brain tumor, etc. it can.
  • blood cancers such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, malignant lymphoma
  • solid cancer such as stomach cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer, brain tumor, etc. it can.
  • a cancer vaccine may be prepared according to the purpose.
  • parenteral administration is known as a preferable administration route for immunostimulation as a cancer vaccine.
  • intraperitoneal administration subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intravenous administration, nasal administration is known.
  • Administration transdermal administration, and the like.
  • injection administration such as subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration and the like.
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu (SEQ ID NO: 1)
  • a trehalose hydrate “Trehalose SG (produced by Hayashibara Biochemical Laboratories)” is used as a trehalose, using a peptide produced by a method described in a patent document (WO2010 / 123065).
  • D-mannitol “Mannit S (manufactured by Mitsubishi Corporation Foodtech) or D-( ⁇ )-Manitol low in endotoxins (manufactured by Merck)” was used. “Trometamol (manufactured by Nacalai Tesque)” is used as trometamol, “histidine (manufactured by Nacalai Tesque)” is used as histidine, “L-arginine hydrochloride (manufactured by Nacalai Tesque)” is used as L-arginine, and meglumine is used. “Meglumine (Nacalai Tesque)” was used.
  • “1 mol / l-hydrochloric acid (manufactured by Nacalai Tesque)” is used as hydrochloric acid
  • “1 mol / l-sodium hydroxide solution (manufactured by Nacalai Tesque)” is used as sodium hydroxide.
  • sodium dihydrogen “sodium dihydrogen phosphate dihydrate (manufactured by Nacalai Tesque)” was used.
  • “(Montanide ISA 51 VG (manufactured by SEPPIC)”) was used as a montanide.
  • Step 1 Synthesis of H-Cys (Npys) -Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH (Synthesis of C (Npys) RMFPNAPYL) Fmoc-Leu-Alko-resin (Alko is p-alkoxybenzyl alcohol) 282 mg (manufactured by Watanabe Chemical; 0.71 mmol / g, 0.2 mmol) is used as a starting material to assemble peptide chains by solid phase synthesis by the Fmoc / tBu method. went.
  • CS336X type peptide synthesizer manufactured by CS Bio was used, and the Fmoc group was deprotected by treating with 20% piperidine in DMF for 5 minutes and 20 minutes. Coupling of protected amino acids was performed by reacting with 1.05 mmol of protected amino acids, 1 mmol of HBTU, 2 mmol of DIPEA in DMF for 1 hour.
  • the obtained resin was washed with DMF and ether and dried under reduced pressure to obtain Boc-Cys (Npys) -Arg (Pmc) -Met-Phe-Pro-Asn (Trt) -Ala-Pro-Tyr (tBu) -Leu -630 mg of Alko-resin was obtained.
  • 10 ml of a mixed solution of TFA / H 2 O / TIS 95 / 2.5 / 2.5 was added and shaken at room temperature for 2 hours. After removing the resin by filtration, the reaction solution was concentrated under reduced pressure. The reaction solution was ice-cooled and 50 ml of diethyl ether was added.
  • the resulting precipitate was collected by filtration, washed with ether, and then dried under reduced pressure to obtain 217 mg of a crude peptide.
  • the obtained crude peptide solution was dissolved in a mixed solution of 20 ml of 20% aqueous acetic acid and 1 ml of acetonitrile and purified by reverse phase HPLC.
  • the reaction solution was diluted with 5 ml of 0.1% TFA water and purified by reverse phase HPLC. Pump: manufactured by Shimazu; LC-8A type column: YMC ODS-A 3 cm ⁇ ⁇ 25 cmL, 10 ⁇ m Eluent 1: H 2 O / 0.1% TFA Eluent 2: CH 3 CN / 0.1% TFA Flow rate: 20 ml / min Detection: UV220nm
  • the reaction solution was injected into a column equilibrated at a two-component concentration of 25%. Thereafter, the concentration of the two liquids was increased at a rate of 0.25% per minute.
  • Example 1 Peptide (1) as a peptide (component (a)), trehalose as a component (b) is dissolved in water for injection so as to have an amount shown in Table 1, and hydrochloric acid and / or as a pH adjuster (component (c)) Alternatively, the pH was adjusted to 1 with sodium hydroxide. After filtration through a 0.2 ⁇ m sterilizing filter, each glass vial was filled with 1 mL and sealed with a butyl rubber stopper. Thereby, the liquid agent of Example 1 was obtained.
  • Example 2 As in Example 1, peptide (1), trehalose, pH adjuster (hydrochloric acid and / or sodium hydroxide), and water for injection were prepared in the amounts shown in Table 1 or 2, filled into vials, and sealed with a butyl rubber stopper. The solutions of Examples 2, 3, 5 to 8 and 10 were obtained by sealing. As in Example 1, peptide (1), trehalose, pH adjuster (hydrochloric acid and / or sodium hydroxide), and water for injection were prepared in the amounts shown in Table 1 or 2, filled into vials, and sealed with a butyl rubber stopper. The solution of Examples 4 and 9 is obtained by sealing.
  • Example 11 to 19 As in Example 1, as a component (a), a peptide represented by SEQ ID NO: 1 (WAPVLDFAPPGASAYGSL) (hereinafter referred to as peptide (2)), trehalose, a pH adjuster (hydrochloric acid and / or sodium hydroxide), and water for injection.
  • peptide (2) a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • pH adjuster hydrochloric acid and / or sodium hydroxide
  • Example 1 As in Example 1, as a component (a), a peptide represented by SEQ ID NO: 1 (WAPVLDFAPPGASAYGSL) (hereinafter referred to as peptide (2)), trehalose, a pH adjuster (hydrochloric acid and / or sodium hydroxide), and water for injection.
  • peptide (2) a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • trehalose a peptide represented by SEQ ID NO: 1
  • pH adjuster hydrochloric acid and / or sodium hydroxide
  • Example 20 to 24 In the same manner as in Example 1, peptide (1), trehalose, D-mannitol, water for injection, pH adjusting agent (hydrochloric acid and / or sodium hydroxide) were prepared in the amounts shown in Table 5, filled into vials, and butyl rubber The solution of Examples 20 to 24 was obtained by sealing with a stopper.
  • pH adjusting agent hydroochloric acid and / or sodium hydroxide
  • Example 25 Peptide (1) and trehalose are prepared in appropriate amounts in water for injection and added in the amounts shown in Table 6, and after dispersion with a stirrer, the pH is adjusted to 4 with hydrochloric acid and / or sodium hydroxide as a pH adjuster. The suspension of Example 25 was obtained.
  • Example 26 to 29 In the same manner as in Example 25, peptide (1) and trehalose were prepared in appropriate amounts in water for injection in the amounts shown in Table 6 and adjusted to the pH in Table 6 using the pH adjusting agent shown in Table 6. The suspensions of Examples 26 to 29 were obtained.
  • Example 30 Peptide (2) as a peptide (component (a)), trehalose (component (b)), and trometamol as a pH adjuster (component (c)) are dissolved in water for injection so as to have the amounts shown in Table 7. After filtration through a 0.2 ⁇ m sterile filter, each glass vial is filled with 1 mL and sealed with a butyl rubber stopper. Thereby, the liquid agent of Example 30 was obtained.
  • Examples 31 to 34 In the same manner as in Example 30, peptides (2), trehalose, pH adjuster, and water for injection were prepared in the amounts shown in Table 7, filled in vials, and sealed with butyl rubber stoppers. Got.
  • Example 35 to 37 As in Example 1, peptide (2), trehalose, solubilizing agents (citric acid, lactic acid, tartaric acid), pH adjusting agent (hydrochloric acid), and water for injection are prepared in the amounts shown in Table 8, and filled into vials. The solutions of Examples 35 to 37 were obtained by sealing with a butyl rubber stopper.
  • Example 38 As in Example 1, peptide (2), trehalose, solubilizer (tartaric acid), pH adjuster (hydrochloric acid), and water for injection were prepared in the amounts shown in Table 9 or 10, filled into vials, and butyl rubber stoppers The solution of Examples 38 to 43 was obtained.
  • Example 44 As in Example 1, peptide (2), trehalose, solubilizer (tartaric acid), pH adjuster (hydrochloric acid), and water for injection were prepared in the amounts shown in Table 11, filled into vials, and sealed with a butyl rubber stopper As a result, liquid agents of Examples 44 to 47 were obtained.
  • Example 48 As in Example 1, peptide (1), trehalose, D-mannitol, water for injection, pH adjuster (hydrochloric acid) were prepared in the amounts shown in Table 12, filled into vials, and sealed with a butyl rubber stopper. Solutions of Examples 48 to 50 were obtained.
  • Example 51 As in Example 1, peptide (1), trehalose, D-mannitol, methionine, water for injection, pH adjuster (hydrochloric acid) are prepared in the amounts shown in Table 13, filled into vials, and sealed with a butyl rubber stopper. As a result, a liquid preparation of Example 52 was obtained. As in Example 1, peptide (1), trehalose, D-mannitol, methionine, water for injection, pH adjuster (hydrochloric acid) are prepared in the amounts shown in Table 13, filled into vials, and sealed with a butyl rubber stopper. As a result, the solutions of Examples 51, 53 and 54 are obtained.
  • Examples 55 to 58 In the same manner as in Example 1, peptide (2), trehalose, tartaric acid, water for injection, and pH adjuster (hydrochloric acid) were prepared in the amounts shown in Table 14, filled into vials, and sealed with a butyl rubber stopper. 55 and 56 solutions were obtained. In the same manner as in Example 1, peptide (2), trehalose, tartaric acid, water for injection, and pH adjuster (hydrochloric acid) were prepared in the amounts shown in Table 14, filled into vials, and sealed with a butyl rubber stopper. 57 and 58 solutions are obtained.
  • Examples 59 to 66 In the same manner as in Example 1, peptide (1), peptide (2), trehalose, D-mannitol, L-methionine, tartaric acid, water for injection, and pH adjuster (hydrochloric acid) were prepared in the amounts shown in Table 15 or 16. The solution of Examples 59 to 66 is obtained by filling the vial and sealing with a butyl rubber stopper.
  • Examples 1A to 66A The solution or suspension prepared in Examples 1, 4, 6, 9, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 51, 53, 54 and 57 to 66 was filled into glass vials and then lyophilized. And lyophilize to obtain lyophilized formulations of Examples 1A, 4A, 6A, 9A, 11A, 13A, 14A, 16A, 17A, 19A, 20A, 51A, 53A, 54A and 57A-66A.
  • freeze-drying after freezing the liquid or suspension at around ⁇ 40 ° C., the inside of the cabinet is depressurized to vacuum, and at the same time, the inside temperature is raised to around ⁇ 20 ° C. and dried for about 20 hours.
  • the temperature is increased to around 30 ° C. and dried for about 12 hours.
  • the solutions prepared in Examples 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 15, 18, 21 to 50, 52, 55 and 56 they were put into a freeze dryer and freeze-dried.
  • the lyophilized formulations of Examples 2A, 3A, 5A, 7A, 8A, 10A, 12A, 15A, 18A, 21A-50A, 52A, 55A and 56A were obtained.
  • the inside of the cabinet is depressurized to vacuum, and at the same time, the inside temperature is raised to around ⁇ 20 ° C. and dried for about 20 hours.
  • the inner temperature was raised to around 30 ° C. and dried for about 12 hours.
  • Example 4 Confirmation of Specific CTL Inducing Activity Containing peptide (1), trehalose, D-mannitol, methionine, water for injection, pH adjusting agent (hydrochloric acid) having the same composition ratio as in Example 51, and adjusting the pH
  • the liquid agent of Example 67 adjusted to 2.7 was obtained. 2 mL of the solution of Example 67 was filled in a vial, placed in a freeze dryer, and freeze-dried to obtain a freeze-dried preparation of Example 67A.
  • a cancer vaccine composition was prepared by mixing with an adjuvant using the lyophilized formulation of Example 67A containing peptide (1) and the lyophilized formulation of Example 55A containing peptide (2).
  • Example 67A when the stability of the freeze-dried preparation of Example 67A was evaluated in the same manner as in Test Example 2, the relative purity (relative to the initial value) after storage at 25 ° C. for 3 months was 100%, and a stable preparation was obtained. I was able to.
  • Example 55A containing peptide (2) was redissolved in 1.2 mL of water for injection. 1 mL of the redissolved preparation was collected, added to the lyophilized preparation of Example 67A containing peptide (1), and redissolved to prepare a liquid preparation of Example 68. 0.9 mL of this solution was mixed and emulsified with 0.9 mL of adjuvant montanide to obtain a cancer vaccine composition of Example 67.
  • HLA-A * 02 01 transgenic mice
  • HLA-A * 24 02 transgenic mice
  • HLA-A * 02 01 transgenic mice
  • HLA-A * 02 01 transgenic mice
  • human MHC HLA-A * 02 01 and mouse MHC H-2D b
  • HLA-A * 24:02 transgenic mice C57BL / 6CrHLA-A2402 / K b is expressing chimeric HLA of H-2K b are HLA-A * 24:02 and murine MHC is a human MHC
  • the above-mentioned cancer vaccine composition was administered at 2 sites at 50 ⁇ L / site in the ridge skin of mice.
  • IFN ⁇ ELISPOT assay kit was used.
  • mice were euthanized with CO 2 gas, and then the spleen was removed to prepare spleen cells.
  • ELISPOT plates were treated with anti-mouse IFN ⁇ antibody and blocked on RPMI 1640 medium containing 10% FBS on the day.
  • prepared HLA-A * 02:01 transgenic mice Spleen cells 1.25 ⁇ 10 5 cells / well
  • the peptide (SEQ ID NO: 3, 5) was dissolved in DMSO to 40 mg / mL, and further diluted to 40 ⁇ g / mL in RPMI 1640 medium containing 10% FBS.
  • the diluted peptide at a final concentration of 10 ⁇ g / mL, HLA-A * 02:01 transgenic mice Spleen cells seeded in ELISPOT plates (SEQ ID NO: 3) or HLA-A * 24:02 transgenic mice Spleen Added to cells (SEQ ID NO: 5). Thereafter, in vitro peptide restimulation was applied by culturing at 37 ° C. under 5% CO 2 for 18 to 20 hours.
  • a suspension having good suspendability containing a WT1 protein-derived cancer antigen peptide and a highly stable lyophilized preparation obtained by lyophilizing the suspension.

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Abstract

　本発明は、以下の成分： （ａ）式（１）で表されるペプチド（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ－ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。）、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびそれらの塩から選択される１種以上のペプチド、 （ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物、および （ｃ）ｐＨ調整剤 を含む注射用医薬組成物である。

Description

注射用医薬組成物
　本発明は、癌免疫療法の分野に属し、細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有するＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドを含有する注射用医薬組成物に関する。
　一般にＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドとは、４４９個のアミノ酸からなるヒトのＷＴ１タンパク質（配列番号：２）由来の部分ペプチドであり、具体的にはアミノ酸数８～１２のペプチドまたはそのダイマーであり、主要組織適合抗原（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）クラスＩ抗原に提示されかつ細胞傷害性Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ－ｃｅｌｌ。以下、ＣＴＬと称する）により抗原認識されるペプチドを含有するものである。ＭＨＣは、ヒトではヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。
　ＷＴ１タンパク質由来の部分ペプチドの内、Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチド（ＷＴ１１２６－１３４ペプチド）と、Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu（配列番号：６）で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチド（ＷＴ１２３５－２４３ペプチド）のＮ末端から２番目のアミノ酸をメチオニンからチロシンに改変した改変ペプチド（即ち、Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu（配列番号：５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）とが、ＨＬＡに結合しＣＴＬを誘導するペプチドとして有用であることが報告されている（特許文献１～４参照）。しかしながら、これら２つのペプチドをシステイン残基間のジスルフィド結合を介してコンジュゲート化した改変型ペプチドは知られておらず、これに最適な癌ワクチン組成物も知られていなかった。
　一方、ＷＴ１タンパク質由来の部分ペプチドの内、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチド（ＷＴ１３４－５１ペプチド）は、それだけでもＨＬＡに結合しＣＴＬを誘導するペプチドとして有用であり、さらに上述のペプチドと併用して用いることで、ヘルパーペプチドとしての効果があることが報告されている（特許文献５参照）。しかしながら、本ペプチドを含む最適な癌ワクチン組成物は知られていなかった。
　ＷＴ１１２６－１３４ペプチドおよび／または改変ＷＴ１２３５－２４３ペプチドと、ＷＴ１３４－５１ペプチドとを含む最適な癌ワクチン組成物は、癌ワクチンとして有用であることから、これらのペプチドの安定性を確保した製剤を開発することが期待されていた。
国際公開第００／０６６０２号 国際公開第０２／０７９２５３号 国際公開第２００４／０６３２１７号 国際公開第２００７／０６３９０３号 国際公開第２０１０／１２３０６５号
　本発明の課題は、式（１）で表されるペプチドまたはTrp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるＷＴ１部分ペプチドを含有する癌ワクチン製剤の調製に用いることが可能な、該ペプチドの安定な注射用医薬組成物を提供することにある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ－ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。） 
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、式（１）で表されるペプチドまたは配列番号１で表される配列を持つＷＴ１部分ペプチドを含有する液剤において、トレハロースおよびｐＨ調整剤を含有することにより、製剤安定性に優れた液剤および／または凍結乾燥製剤を得ることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のものに関する。
項１．以下の成分を含む注射用医薬組成物
（ａ）式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ－ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。） 
で表されるペプチド、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびそれらの塩から選択される１種以上のペプチド、
（ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物、および
（ｃ）ｐＨ調整剤。
項２．成分（ａ）が式（１）で表されるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドである、項１に記載の組成物。
項３．さらにマンニトールを含むことを特徴とする、項２に記載の組成物。
項４．マンニトールがＤ－マンニトールである、項３に記載の組成物。
項５．さらにメチオニンを含むことを特徴とする、項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
項６．メチオニンがＬ－メチオニンである、項５に記載の組成物。
項７．ｐＨが１～３であることを特徴とする、項２～６のいずれか一項に記載の組成物。
項８．組成物が液剤または懸濁液剤であり、成分（ｂ）の含有量が１～１００ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２～７のいずれか一項に記載の組成物。
項９．組成物が液剤または懸濁液剤であり、マンニトールの含有量が１～５０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項３～８のいずれか一項に記載の組成物。
項１０．組成物が液剤または懸濁液剤であり、メチオニンの含有量が１～３０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項５～９のいずれか一項に記載の組成物。
項１１．成分（ａ）がTrp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドである、項１に記載の組成物。
項１２．さらに溶解補助剤を含むことを特徴とする、項１１に記載の組成物。
項１３．溶解補助剤がクエン酸、乳酸、酒石酸、酢酸、またはトリフルオロ酢酸である、項１２に記載の組成物。
項１４．溶解補助剤が酒石酸である、項１２に記載の組成物。
項１５．ｐＨが２～３であることを特徴とする、項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物。
項１６．ｐＨが５～１０であることを特徴とする、項１１に記載の組成物。
項１７．組成物が液剤または懸濁液剤であり、成分（ｂ）の含有量が１～１００ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項１１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
項１８．組成物が液剤または懸濁液剤であり、溶解補助剤の含有量が０.１～１０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項１２～１５のいずれか一項に記載の組成物。
項１９．ｐＨ調整剤として用いる酸が弱酸であることを特徴とする、項１１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
項２０．成分（ａ）が、式（１）で表されるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドと、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドとを含むことを特徴とする、項１に記載の組成物。
項２１．さらにマンニトールを含むことを特徴とする、項２０に記載の組成物。
項２２．さらにメチオニンを含むことを特徴とする、項２０または２１に記載の組成物。
項２３．さらに溶解補助剤を含むことを特徴とする、項２０～２２のいずれか一項に記載の組成物。
項２４．ｐＨが２～３であることを特徴とする、項２０～２３のいずれか一項に記載の組成物。
項２５．組成物が液剤または懸濁液剤であり、成分（ｂ）の含有量が１～１００ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２０～２４のいずれか一項に記載の組成物。
項２６．組成物が液剤または懸濁液剤であり、マンニトールの含有量が１～５０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
項２７．組成物が液剤または懸濁液剤であり、メチオニンの含有量が１～３０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２２～２６のいずれか一項に記載の組成物。
項２８．組成物が液剤または懸濁液剤であり、溶解補助剤の含有量が０．１～１０ｍｇ／ｇであることを特徴とする、項２３～２７のいずれか一項に記載の注射用医薬組成物。
項２９．項８～１０、１７、１８、および２５～２８のいずれか一項に記載の組成物を凍結乾燥した凍結乾燥製剤。
項３０．組成物が液剤、懸濁液剤、または凍結乾燥製剤であることを特徴とする、項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
項３１．組成物が液剤、または懸濁液剤であることを特徴とする、項１～７、１１～１６、１９～２４、および３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項３２．凍結乾燥製剤の形態である項２～７のいずれか一項に記載の組成物に、液剤の形態である項１１～１５のいずれか一項に記載の組成物を加えることにより製造される、項２０～２４のいずれか一項に記載の組成物。
項３３．液剤または懸濁液剤であることを特徴とする、項３２に記載の組成物。
項３４．項１～２８、および３０～３３のいずれか一項に記載の組成物を含む癌ワクチン組成物。
項３５．さらにアジュバントを含有することを特徴とする、項３４に記載の癌ワクチン組成物。
項３６．アジュバントがモンタナイドである、項３５に記載の癌ワクチン組成物。
項３７．注射用医薬組成物中における成分（ａ）：
（ａ）式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ－ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。） 
で表されるペプチド、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびそれらの塩から選択される１種以上のペプチド
の安定性を向上させる方法であって、上記成分（ａ）、ならびに以下の成分（ｂ）および（ｃ）：
（ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物
（ｃ）ｐＨ調整剤
を該組成物中に配合させることを含む、方法。
項３８．癌ワクチン組成物中におけるペプチド（ａ）：
（ａ）式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ－ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。） 
で表されるペプチド、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびそれらの塩から選択される１種以上のペプチド
の安定性を向上させる方法であって、上記成分（ａ）、ならびに以下の成分（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）：
（ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物
（ｃ）ｐＨ調整剤
（ｄ）メチオニン
を該組成物中に配合させることを含む、方法。
項３９．凍結乾燥製剤の形態である項２～７のいずれか一項に記載の組成物に、液剤の形態である項１１～１５のいずれか一項に記載の組成物を加えることを特徴とする、項２０～２４のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。
項４０．項３９に記載の方法により得られる組成物を、アジュバントに添加することを特徴とする、癌ワクチン組成物の製造方法。
項４１．成分（ｂ）の含有量が１～１００ｍｇ／ｇである、項１８に記載の組成物。
項４２．ｐＨ調整剤が塩酸および／または水酸化ナトリウムであることを特徴とする、項１～１８のいずれか一項に記載の注射用医薬組成物。
　本発明の注射用医薬組成物を用いることにより、細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を有する本発明のペプチドを安定に含有する癌ワクチン組成物を製造することができ、製剤安定性に優れた癌ワクチンを調製することができる。また、注射用医薬組成物を凍結乾燥した凍結乾燥製剤にした場合、ペプチドが安定に維持される凍結乾燥製剤を調製することができる。
図１は、試験例４の結果を示すグラフである。縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を、横軸はｉｎ　ｖｉｔｒｏでパルスしたペプチドを示す。図１の黒棒はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：３で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。 図２は、試験例４の結果を示すグラフである。縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を、横軸はｉｎ　ｖｉｔｒｏでパルスしたペプチドを示す。図２の黒棒はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス用いた由来の脾細胞を配列番号：５で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
　本明細書において、各例示の好ましい態様は、他の例示の好ましい態様と組み合わせてもよく、上述の項１～項４２に記載される対応する例示に組み込んでもよい。
　本発明における「注射用医薬組成物」とは、本発明のペプチドおよび該ペプチドを除く１以上の成分を含む組成物のことである。注射用医薬組成物とさまざまなアジュバントとを混合することで、癌ワクチン組成物を調製することができる。
　本発明の注射用医薬組成物は、溶液、懸濁液、凍結乾燥製剤等の形態で提供され得る。
　本発明における「液剤」とは、「注射用医薬組成物」に含まれる各成分を溶媒に溶解したものである。本発明における「溶媒」としては、通常水が挙げられるが、発明の効果に影響されない範囲で、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の薬理学的に許容された溶媒を水に一部混合することができる。好ましくは水である。また、後述の「凍結乾燥製剤」を復水し、溶解したものも、本発明における「液剤」に含まれる。
　本発明における「懸濁液剤」とは、「注射用医薬組成物」に含まれる各成分を分散媒に混合し、懸濁したものである。本発明における「分散媒」としては、通常水が挙げられるが、発明の効果に影響されない範囲で、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の薬理学的に許容された溶媒を水に一部混合することができる。好ましくは水である。また、後述の「凍結乾燥製剤」を復水し、懸濁したものも、本発明における「懸濁液剤」に含まれる。
　本発明における「凍結乾燥製剤」とは、本発明における「液剤」または「懸濁液剤」を凍結乾燥したものである。通常「液剤」または「懸濁液剤」におけるペプチドの化学的、物理的安定性を向上させるために行う。癌ワクチンとして使用する場合は、適量の水を添加し、攪拌することで液剤または懸濁液剤としてから、さまざまなアジュバントと混合し、癌ワクチン組成物を調製する。
　本発明における「ペプチド」とは、癌ワクチンを調製するための癌抗原ペプチドであり、式（１）で表されるペプチド、およびTrp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群より選択されるペプチド、あるいはそれらの塩のことである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ－ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。） 
　本明細書において、ペプチドは左側がＮ末端であり、各アミノ酸記号はそれぞれ以下のアミノ酸残基であることを示している。
AlaまたはＡ：アラニン残基 
ArgまたはＲ：アルギニン残基 
AsnまたはＮ：アスパラギン残基 
AspまたはＤ：アスパラギン酸残基 
CysまたはＣ：システイン残基 
GlnまたはＱ：グルタミン残基 
GluまたはＥ：グルタミン酸残基 
GlyまたはＧ：グリシン残基 
HisまたはＨ：ヒスチジン残基 
IleまたはＩ：イソロイシン残基 
LeuまたはＬ：ロイシン残基 
LysまたはＫ：リジン残基 
MetまたはＭ：メチオニン残基 
PheまたはＦ：フェニルアラニン残基 
ProまたはＰ：プロリン残基 
SerまたはＳ：セリン残基 
ThrまたはＴ：スレオニン残基 
TrpまたはＷ：トリプトファン残基 
TyrまたはＹ：チロシン残基 
ValまたはＶ：バリン残基 
　「式（１）で表されるペプチド」とは、Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：３）のＮ末端にシステイン残基を結合した、Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：４）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu（配列番号：５）で表されるペプチドのシステイン残基同士をジスルフィド結合したものである。
　Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu（配列番号：３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドとは、ウィルムス腫瘍の癌抑制遺伝子ＷＴ１の遺伝子産物であるタンパク質（具体的には、４４９個のアミノ酸からなるヒトのＷＴ１タンパク質（配列番号：２））のＮ末端から１２６番目のアルギニン（Ａｒｇ）から１３４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの９個の連続するアミノ酸からなる部分ペプチド（ＷＴ１１２６－１３４ペプチド）である。当該ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ抗原に提示されかつＣＴＬにより抗原認識されるペプチドである。
　Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu（配列番号：５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドとは、ＷＴ１タンパク質のＮ末端から２３５番目のシステイン（Ｃｙｓ）から２４３番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの９個の連続するアミノ酸からなる部分ペプチド（ＷＴ１２３５－２４３ペプチド）において、そのＮ末端から２番目のアミノ酸をメチオニン（Ｍｅｔ）からチロシン（Ｔｙｒ）に改変した改変ペプチドである。当該ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ抗原に提示されかつＣＴＬにより抗原認識されるペプチドである。
　「Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」とは、ＷＴ１タンパク質のＮ末端から３４番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から５１番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの１８個のアミノ酸からなる部分ペプチド（ＷＴ１３４－５１ペプチド）である。当該ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に提示されかつＷＴ１特異的なヘルパーＴ細胞を誘導するペプチドである。
　式（１）で表されるペプチド、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの塩としては、薬学上許容される塩であれば特に制限されない。本発明における「塩」としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。例えば、酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩などの有機酸塩が挙げられ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などの無機塩基塩、トリエチルアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、ピリジニウム塩、ジイソプロピルアンモニウム塩などの有機塩基塩などが挙げられ、さらにはアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性あるいは酸性アミノ酸といったアミノ酸塩が挙げられる。
　式（１）で表されるペプチドまたはその塩、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩の水和物、エタノール溶媒和物などの溶媒和物も、本発明のペプチドに含まれる。さらに、本発明のペプチドには、式（１）で表されるペプチドのあらゆるジアステレオマー、エナンチオマーなどの存在し得るあらゆる立体異性体またはその塩、およびあらゆる態様の結晶形も包含される。
　式（１）で表されるペプチドまたはその塩は、本明細書の実施例に記載された方法、または公知の方法で製造することができる（特許文献２～４等参照、）。一方、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはその塩は、公知の方法で製造することができる（特許文献５参照）。また、本発明のペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法によって製造され得る。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９６６；　Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，　Ｖｏｌ　２，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９７６；　ペプチド合成、丸善（株）、１９７５；　ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）１９８５；　医薬品の開発　続　第１４巻・ペプチド合成、廣川書店、１９９１等に記載されているペプチド合成方法によって合成することができる。
　上記方法で得られる本発明のペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に本発明のペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
　本発明の注射用医薬組成物は、式（１）で表されるペプチド、その１種の塩をそれぞれ単独で含有してもよいし、該ペプチドと１種以上のその塩、あるいは２種以上の該ペプチドの塩を含有してもよい（以下、包括して「ペプチド（１）」という場合がある）。同様に、本発明の注射用医薬組成物は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、その１種の塩をそれぞれ単独で含有してもよいし、該ペプチドと１種以上のその塩、あるいは２種以上の該ペプチドの塩を含有してもよい（以下、包括して「ペプチド（２）」という場合がある）。さらに、本発明の注射用医薬組成物は、ペプチド（１）とペプチド（２）の両方を含有していてもよい。
　本発明の注射用医薬組成物が液剤または懸濁液剤（以下、「本発明の液状製剤」という場合がある。）である場合、本発明のペプチドの本発明の液状製剤重量あたりの含有量は特に規定されず、薬理学的または物性的に許容される含有量であればよい。本発明のペプチドのうち、例えば、ペプチド（１）の好ましい含有量（２種以上のペプチドを含む場合はそれらの全体量として）としては、０．５ｍｇ～２００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは、０．５ｍｇ～１００ｍｇ／ｇ、０．５ｍｇ～５０ｍｇ／ｇ、および１ｍｇ～２５ｍｇ／ｇを挙げることができ、目的に応じて選択すればよい。一方、ペプチド（２）の好ましい含有量（２種以上のペプチドを含む場合はそれらの全体量として）としては、例えば、０．０５ｍｇ～２００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは、０．０５ｍｇ～１００ｍｇ／ｇ、０．０５ｍｇ～５０ｍｇ／ｇ、および０．１ｍｇ～２５ｍｇ／ｇを挙げることができ、目的に応じて選択すればよい。本発明の液状製剤がペプチド（１）とペプチド（２）の両方を含有する場合、ペプチド（１）とペプチド（２）の重量比は、１：０．１～１：５の範囲で適宜選択され得る。
　本発明の注射用医薬組成物が凍結乾燥製剤（以下、「本発明の凍結乾燥製剤」という場合がある）である場合、本発明のペプチドの体積あたりの含有量は特に規定されない。本発明の凍結乾燥製剤は本発明の液状製剤を凍結乾燥したものであり、ペプチドの含有量は該液状製剤の含有量を満たすものであればよい。尚、本発明の凍結乾燥製剤を復水する際に、凍結乾燥前の本発明の液状製剤の液量より少量の水等で溶解もしくは分散させることにより、凍結乾燥前より高濃度の本発明の液状製剤を得ることができる。
　本発明の注射用医薬組成物は、上記した本発明のペプチド（成分（ａ））に加えて、以下の成分（ｂ）および（ｃ）：
（ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物
（ｃ）ｐＨ調整剤
を含有することを特徴とする。
　本発明における「トレハロース」とは、グルコースが１，１－グリコシド結合してできた二糖の一種を表す。トレハロースとしては、無水物であっても良く、あるいはその水和物であっても良い。好ましくはトレハロース水和物である。本発明の注射用医薬組成物は、トレハロースを、無水物、その水和物のいずれか単独の形態で含有してもよいし、それらの２種以上を組み合わせて含有してもよい。本発明の注射用医薬組成物において、トレハロースの組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、本発明の液状製剤における重量あたりの含有量（２種以上の形態で含有する場合はそれらの全体量として）としては、１～５０ｍｇ／ｇ、１～７０ｍｇ／ｇ、１～１００ｍｇ／ｇ、１～１５０ｍｇ／ｇ、１～２００ｍｇ／ｇ、３～５０ｍｇ／ｇ、３～７０ｍｇ／ｇ、３～１００ｍｇ／ｇ、３～１５０ｍｇ／ｇ、３～２００ｍｇ／ｇ、５～５０ｍｇ／ｇ、５～７０ｍｇ／ｇ、５～１００ｍｇ／ｇ、５～１５０ｍｇ／ｇ、および５～２００ｍｇ／ｇ等が挙げられる。
　本発明における「ｐＨ調整剤」とは、一般に医薬品製剤に用いられるｐＨ調整剤を表す。具体的には、塩酸、硫酸、リン酸、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸三ナトリウムなどの無機酸またはその塩、硝酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、酢酸ナトリウム水和物、無水酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム水和物、クエン酸二水素ナトリウム、酒石酸ナトリウムなどの有機酸またはその塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水等の無機塩基、あるいはトロメタモール、ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、およびメグルミン等の有機塩基が挙げられる。好ましくはクエン酸、乳酸、酒石酸、塩酸、硫酸、硝酸、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウム、あるいはトリメタモール、ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、およびメグルミンであり、さらに好ましくは酒石酸、塩酸、および水酸化ナトリウム、あるいはトロメタモール、Ｌ－アルギニン、およびメグルミンである。
　また、別の観点から、成分（ａ）がペプチド（２）である場合、ｐＨ調整剤において酸としては弱酸が好ましい。
　ｐＨ調整剤は、本発明の液状製剤のｐＨを、本発明のペプチドの安定性を担保し得るｐＨ範囲に調整するために添加される。本発明のペプチドの安定性を担保し得るｐＨ範囲は、後述するとおり、液状製剤中に含有される本発明のペプチドの種類によって変動するため、それぞれに応じたｐＨ調整剤が用いられる。
　本発明の注射用医薬組成物がペプチド（１）のみを含有する場合、本発明の液状製剤のｐＨは１～１０である。液状製剤が液剤の場合、溶解度および安定性の観点から好ましいｐＨは１～４であり、さらに好ましくは１～３であり、最も好ましいのは２～３である。液状製剤が懸濁液剤の場合、溶解度の関係からｐＨ５～１０が好ましい。上記以外のその他の態様では、液状製剤が液剤の場合、好ましいｐＨとして、１．５～４．５、１．５～３．５、１．５～３．０、２．０～３．０が挙げられ、懸濁液剤の場合、好ましいｐＨとして、４～９、４～６、５～９が挙げられる。
　一方、本発明の注射用医薬組成物がペプチド（２）のみを含有する場合、本発明の液状製剤のｐＨは２～１０であり、より具体的な範囲として、２～３、３～９、６～９、７である。安定性の観点から好ましいｐＨは５～１０であり、さらに好ましくは６～８である。
　さらに、本発明の注射用医薬組成物がペプチド（１）とペプチド（２）とを含有する場合、本発明の液状製剤のｐＨは２～１０である。液状製剤が液剤の場合、安定性の観点から好ましいｐＨは２～４、２～３、１．７～３．２、および１．５～３．５が挙げられる。
　本明細書における数字は記載している数字の一つ下の桁を四捨五入して表す。例えば、２であれば１．５以上２．５未満をさす。
　本発明の液状製剤がｐＨ調整剤を含まない場合に、所望のｐＨ範囲より高いｐＨ値を示す場合、ｐＨ調整剤として無機酸もしくは有機酸などを添加することで、所望のｐＨに調整することができる。無機酸および有機酸としては、上記のものを用いることができる。
　本発明の液状製剤がｐＨ調整剤を含まない場合に、所望のｐＨ範囲より低いｐＨ値を示す場合、ｐＨ調整剤として無機塩基または有機塩基を用いることができる。無機塩基および有機塩基としては、上記のものを用いることができる。本発明の注射用医薬組成物がペプチド（２）のみを含有する場合には、ｐＨ調整剤として無機塩基または有機塩基を用いることが好ましい。具体的には、リン酸水素二ナトリウム、トロメタモール、ヒスチジン、Ｌ－アルギニン、およびメグルミン等が挙げられる。好ましくはリン酸水素二ナトリウム、トロメタモール、Ｌ－アルギニン、およびメグルミンである。本発明の注射用医薬組成物において、有機塩基の組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、本発明の液状製剤における重量あたりの含有量としては、１～１００ｍｇ／ｇ、１～５０ｍｇ／ｇ、１～１５０ｍｇ／ｇ、５～１００ｍｇ／ｇ、５～５０ｍｇ／ｇ、５～１５０ｍｇ／ｇ、１０～１００ｍｇ／ｇ、１０～５０ｍｇ／ｇ、および１０～１５０ｍｇ／ｇ等が挙げられる。
　本発明の注射用医薬組成物が成分（ａ）としてペプチド（１）を含有する場合、該組成物はマンニトールを含有してもよい。
　本発明における「マンニトール」とは、糖アルコールの一種であり、ヘキシトールに分類され、マンノースの還元体に相当するものを表す。マンニトールには光学異性体が存在し、Ｄ体、Ｌ体またはＤＬ体があるが、これらのうちのどれを使用しても本発明の効果に影響はない。好ましくは天然に多く存在するＤ－マンニトールである。また、マンニトールには複数の結晶系があるが、これらのうちのどれを使用しても本発明の効果に影響はない。本発明の注射用医薬組成物において、マンニトールの組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、本発明の液状製剤における重量あたりの含有量としては、１～２０ｍｇ／ｇ、１～３０ｍｇ／ｇ、１～５０ｍｇ／ｇ、３～２０ｍｇ／ｇ、３～３０ｍｇ／ｇ、５～２０ｍｇ／ｇ、および５～３０ｍｇ／ｇ等が挙げられる。
　本発明の注射用医薬組成物が成分（ａ）としてペプチド（２）を含有する場合、該ペプチドの溶解性が不安定になるため、該組成物は溶解補助剤をさらに含有することが好ましい。「溶解補助剤」としては、例えば有機酸を用いることができる。溶解補助剤を用いることで、液剤のペプチド（２）の溶解工程において、速やかに溶解させることができる。さらに、本発明の液状製剤を凍結乾燥した凍結乾燥製剤において、凍結乾燥製剤に注射用水を用いて、復水する場合、速やかに再溶解させることができる。溶解補助剤としては、具体的には、クエン酸、乳酸、酒石酸、酢酸、およびトリフルオロ酢酸等が挙げられる。好ましくはクエン酸、乳酸、および酒石酸であり、さらに好ましくは酒石酸である。本発明の注射用医薬組成物において、溶解補助剤の組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、本発明の液状製剤における重量あたりの含有量としては、１～５ｍｇ／ｇ、１～１０ｍｇ／ｇ、１～１５ｍｇ／ｇ、１～２０ｍｇ／ｇ、３～１０ｍｇ／ｇ、３～１５ｍｇ／ｇ、３～２０ｍｇ／ｇ、５～１０ｍｇ／ｇ、５～１５ｍｇ／ｇ、５～２０ｍｇ／ｇ、０．１～５ｍｇ／ｇ、０．１～１０ｍｇ／ｇ、０．１～１５ｍｇ／ｇ、０．１～２０ｍｇ／ｇ、０．３～１０ｍｇ／ｇ、０．３～１５ｍｇ／ｇ、０．３～２０ｍｇ／ｇ、０．５～１０ｍｇ／ｇ、０．５～１５ｍｇ／ｇ、および０．５～２０ｍｇ／ｇが挙げられる。
　本発明の注射用医薬組成物が成分（ａ）としてペプチド（１）を含有する場合、癌ワクチン組成物として調製したときの該ペプチドの安定性の観点から、該組成物はメチオニンをさらに含有することが望ましい。メチオニンを配合させることで、癌ワクチン組成物として調製したときに、ペプチド（１）に含まれるメチオニン残基の酸化を抑えることができる。
　本発明の「メチオニン」は必須アミノ酸のひとつで、側鎖に硫黄原子を含んだ疎水性のアミノ酸である。「メチオニン」には光学異性体が存在し、Ｄ体、Ｌ体またはＤＬ体があるが、これらのうちのどれを使用しても本発明の効果に影響はない。医薬品に多くの添加物としての使用前例があり、日本薬局方（第１６改正）に記載されているＬ体が好ましい。本発明の注射用医薬組成物において、メチオニンの組成物における重量あたりの含有量は特に規定はないが、好ましくは本発明の液状製剤における重量あたりの含有量としては、１～５ｍｇ／ｇ、１～１０ｍｇ／ｇ、１～２０ｍｇ／ｇ、１～３０ｍｇ／ｇ、３～１０ｍｇ／ｇ、３～２０ｍｇ／ｇ、３～３０ｍｇ／ｇ、５～１０ｍｇ／ｇ、５～２０ｍｇ／ｇ、および５～３０ｍｇ／ｇ等が挙げられる。
　また、本発明の注射用医薬組成物には、上記の成分のほか、本発明の効果に影響を与えない範囲で適宜、安定剤、可溶化剤、緩衝剤、等張化剤等、医薬品製剤に一般に用いられる添加剤を使用することができる。
　本発明の注射用医薬組成物は、医薬品製造等で一般的に用いられる方法で製造することができる。具体的には、例えば、５～２５℃の一定温度に維持された環境下で、適当な容器に注射用水を仕込み、緩やかに攪拌しながら、あらかじめ秤量されたペプチドおよび添加剤を加え、最終的に所望のｐＨに調整することにより調製することができ、調製後にフィルターろ過等により滅菌し、ガラス製バイアル等の容器に充填し、ゴム栓等で密封すればよい。凍結乾燥製剤とする場合は、自体公知の方法により、得られた本発明の液状製剤を凍結乾燥すればよい。
　本発明のペプチドは、それぞれ単独で癌ワクチン用の抗原ペプチドとして用いることも可能であるが、ペプチド（１）とペプチド（２）の両方を癌ワクチン組成物に含有させることもできる。ペプチド（２）は、自体単独でＨＬＡに結合し、ＣＴＬを誘導するとともに、ペプチド（１）と併用することでヘルパーペプチドとしての効果をも奏するので、ペプチド（１）とペプチド（２）の両方を含有する癌ワクチン組成物は、相乗的なワクチン効果が期待される。癌ワクチン組成物に両ぺプチドを配合させる場合、両ペプチドを含有する１つの本発明の注射用医薬組成物をアジュバントと混合しても良いし、それぞれのペプチドを含有した２つの本発明の注射用医薬組成物をアジュバントと三者混合しても良い。
　ペプチド（１）とペプチド（２）の両方を含有する本発明の液状製剤は、両ペプチドを上記の製法に供することで、直接（一段階で）調製することもできるし、各ペプチドを上記の製造に供して、別個の液剤または懸濁液剤として調製した後、両者を混合することにより得ることもできる。好ましい一実施態様においては、ペプチド（１）を含有する液剤または懸濁液剤を凍結乾燥し、これにペプチド（２）を含有する液剤または懸濁液剤を加えて、ペプチド（１）を含有する凍結乾燥製剤を溶解もしくは懸濁する方法が挙げられる。あるいは、各ペプチドを含有する２種の凍結乾燥製剤を調製した後、ペプチド（２）を含有する凍結乾燥製剤を凍結乾燥前の液剤または懸濁液剤よりも少量の水等で再溶解もしくは再懸濁し、該溶液または懸濁液を、ペプチド（１）を含有する凍結乾燥製剤に添加して溶解もしくは懸濁することで、凍結乾燥前の液剤または懸濁液剤よりも高濃度の液剤または懸濁液剤として調製することができる。
　本発明の注射用医薬組成物を用いて癌ワクチンを調製する方法は特に限定されないが、例えば、適切なアジュバントと混合し、癌ワクチンを調製する方法；予め適切なアジュバントと混合した後、さらに凍結乾燥等により癌ワクチン製剤を調製する方法；本発明の液状製剤を用時調製により種々のアジュバントと混合し、癌ワクチンとする方法等が挙げられる。アジュバントとしては、沈降性アジュバントおよび油性アジュバント等が挙げられる。沈降性アジュバントは、ペプチドが吸着する無機物の懸濁剤を表す。沈降性アジュバントとしては、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム（アラム、Alum）、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマー等が挙げられる。油性アジュバントは、ペプチドを含む水溶液を鉱油で包みミセルをつくり乳化する油乳剤を表す。油性アジュバントとしては、具体的には、流動パラフィン、ラノリン、フロイントアジュバント（完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント）、モンタナイド、Ｗ／Ｏエマルション（ＷＯ２００６／０７８０５９参照）等が挙げられる。
　本発明の注射用医薬組成物を用いて調製される癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫等の血液の癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、脳腫瘍等の固形癌の予防又は治療のために使用することができる。
　本発明の注射用医薬組成物は、有効成分である癌抗原ペプチドを安定に保持できることから、種々の投与形態を選択することができる。具体的には、経口、経鼻、経肺、経皮、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等が挙げられ、上記の方法により、目的に応じて癌ワクチンを調製すればよい。一般に、癌ワクチンとして、免疫賦活するのに好ましい投与経路としては非経口投与が知られており、例えば、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与のほか、経鼻投与や経皮投与等が挙げられる。このうち、好ましくは皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与等の注射的投与が挙げられる。
　以下に、実施例、比較例、試験例等を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド（２））として、特許文献（ＷＯ２０１０／１２３０６５号）に記載されている方法で製造したペプチドを用い、トレハロースとして、トレハロース水和物である「トレハロースＳＧ（林原生物化学研究所製）」を用い、Ｄ－マンニトールとして「マンニットＳ（三菱商事フードテック社製）もしくはＤ－（－）－Ｍａｎｎｉｔｏｌ　ｌｏｗ　ｉｎ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ（メルク社製）」を用いた。トロメタモールとして「トロメタモール（ナカライテスク社製）」を用い、ヒスチジンとして「ヒスチジン（ナカライテスク社製）」を用い、Ｌ－アルギニンとして「Ｌ－アルギニン塩酸塩（ナカライテスク社製）」を用い、メグルミンとして「メグルミン（ナカライテスク社製）」を用いた。乳酸として「乳酸（ナカライテスク社製）」を用い、酒石酸として「Ｌ（＋）－Ｔａｒｔａｒｉｃ　ａｃｉｄ，　ｐｏｗｄｅｒ（メルク社製）」を用い、クエン酸として「くえん酸一水和物（ナカライテスク社製）」を用いた。メチオニンとして「Ｌ－メチオニン（協和発酵バイオ社製）」を用いた。ｐＨ調整剤として、塩酸としては「１ｍｏｌ／ｌ－塩酸（ナカライテスク社製）」を用い、水酸化ナトリウムとしては「１ｍｏｌ／ｌ－水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク社製）」を用い、リン酸二水素ナトリウムとして「りん酸二水素ナトリウム二水和物（ナカライテスク社製）」を用いた。モンタナイドとして「（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　５１　ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ社製）」を用いた。
〔ペプチドの合成〕
　式（１）で表されるペプチド（ペプチド（１））の合成
工程１．　H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OHの合成
（Ｃ(Npys)ＲＭＦＰＮＡＰＹＬの合成）
　Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－Ａｌｋｏ－樹脂（Ａｌｋｏはｐ－アルコキシベンジルアルコール）２８２ｍｇ（渡辺化学製；０．７１ｍｍｏｌ／ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を出発原料としＦｍｏｃ／ｔＢｕ法による固相合成によりペプチド鎖の組上げを行った。固相合成にはＣＳ　Ｂｉｏ社製ＣＳ３３６Ｘ型ペプチド合成機を用い、Ｆｍｏｃ基の脱保護は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で５分間および２０分間処理することにより行った。保護アミノ酸のカップリングは１．０５ｍｍｏｌの保護アミノ酸、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、２ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液と１時間反応させることにより行った。得られた樹脂をＤＭＦおよびエーテルで洗浄後減圧乾燥することにより、Boc-Cys(Npys)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-樹脂６３０ｍｇを得た。このペプチド樹脂にＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ＝９５／２．５／２．５の混合液１０ｍｌを加え、室温にて２時間振とうした。樹脂を濾去後、反応液を減圧濃縮した。反応液を氷冷しジエチルエーテル５０ｍｌを加えた。生じた沈殿物を濾取しエーテルで洗浄後減圧乾燥することにより粗ペプチド２１７ｍｇを得た。得られた粗ペプチド溶液を２０％酢酸水７ｍｌとアセトニトリル１ｍｌの混合液に溶解し逆相ＨＰＬＣにて精製した。
ポンプ：Ｓｈｉｍａｚｕ製；ＬＣ－８Ａ型
カラム：ＹＭＣ　ＯＤＳ－Ａ　３ｃｍφ×２５ｃｍＬ, １０μｍ
溶出液１：Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ
溶出液２：ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２２０ｎｍ
　２液濃度１５％で平衡化させたカラムに粗ペプチド溶液を注入した。その後２液濃度を１０分間で３７％に上昇させ、その後１分間あたり０．２４％の割合で上昇させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥することにより、H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH　５３ｍｇを得た。
　質量分析：ＬＣ－ＥＳＩ／ＭＳ　ｍ／ｚ　＝１３６６．１ [Ｍ＋１]＋　（理論値＝１３６６．６）
工程２．　(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) disulfide bondの合成
〔すなわち式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ－ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。） 
で表される化合物の合成〕
　工程１で得たH-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH　５０ｍｇと公知の方法(例えばＷＯ０７／０６３９０３)で合成したH-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH（すなわちＣＹＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号：４））　４３ｍｇを混合し、ＤＭＳＯ　１ｍＬを加え、室温にて２０分間攪拌した。反応液を０．１％ＴＦＡ水　５ｍｌで希釈し逆相ＨＰＬＣにて精製した。
ポンプ：Ｓｈｉｍａｚｕ製；ＬＣ－８Ａ型
カラム：ＹＭＣ　ＯＤＳ－Ａ　３ｃｍφ×２５ｃｍＬ, １０μｍ
溶出液１：Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ
溶出液２：ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ
流速：２０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２２０ｎｍ
　２液濃度２５％で平衡化させたカラムに当該反応液を注入した。その後２液濃度を１分間あたり０．２５％の割合で上昇させた。目的物を含む画分を集め凍結乾燥した後、逆相ＨＰＬＣによる再精製、凍結乾燥を行うことにより、(H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) disulfide bond（すなわち式（１）で示されるペプチド（ペプチド（１））　２１ｍｇを得た。
　質量分析：ＬＣ－ＥＳＩ／ＭＳ　ｍ／ｚ　＝１１９１．８ [Ｍ＋２]２＋　（理論値＝１１９１．９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ－ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。） 
〔液剤または懸濁液剤の調製〕
〔実施例１〕
　ペプチド（成分（ａ））として上記ペプチド（１）、成分（ｂ）としてトレハロースを表１に記載の量となるよう注射用水に溶解させ、ｐＨ調整剤（成分（ｃ））として、塩酸および／または水酸化ナトリウムでｐＨを１に調整した。０．２μｍの滅菌フィルターを通してろ過した後、ガラス製バイアルに１ｍＬずつ充填し、ブチルゴム栓で密封した。これにより、実施例１の液剤を得た。
〔実施例２～１０〕
　実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）、注射用水を表１または２に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例２、３、５～８および１０の液剤を得た。
　実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）、注射用水を表１または２に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例４および９の液剤を得る。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
〔実施例１１～１９〕
　実施例１と同様に、成分（ａ）として配列番号：１（ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ）で示されるペプチド（以下、ペプチド（２））、トレハロース、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）、注射用水を表３または４に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例１２、１５および１８の液剤を得た。
　実施例１と同様に、成分（ａ）として配列番号：１（ＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ）で示されるペプチド（以下、ペプチド（２））、トレハロース、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）、注射用水を表３または４に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例１１、１３、１４、１６、１７および１９の液剤を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
〔実施例２０～２４〕
　実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ－マンニトール、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸および／または水酸化ナトリウム）を表５に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例２０～２４の液剤を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
〔実施例２５〕
　適量の注射用水にペプチド（１）、トレハロースを表６に記載の量で調製し、加えて攪拌機で分散後、ｐＨ調整剤として、塩酸および／または水酸化ナトリウムでｐＨを４に調整することで実施例２５の懸濁液剤を得た。
〔実施例２６～２９〕
　実施例２５と同様に、適量の注射用水にペプチド（１）、トレハロースを表６に記載の量で調製し、表６に記載のｐＨ調整剤を用いて、表６のｐＨに調整することで実施例２６～２９の懸濁液剤を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
〔実施例３０〕
　ペプチド（成分（ａ））としてペプチド（２）、トレハロース（成分（ｂ））、ｐＨ調整剤（成分（ｃ））として、トロメタモールを表７に記載の量となるよう注射用水に溶解させる。０．２μｍの滅菌フィルターを通してろ過した後、ガラス製バイアルに１ｍＬずつ充填し、ブチルゴム栓で密封する。これにより、実施例３０の液剤を得た。
〔実施例３１～３４〕
　実施例３０と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、ｐＨ調整剤、注射用水を表７に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例３１～３４の液剤を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
〔実施例３５～３７〕
　実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、溶解補助剤（クエン酸、乳酸、酒石酸）、ｐＨ調整剤（塩酸）、注射用水を表８に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例３５～３７の液剤を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
〔実施例３８～４３〕
　実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、溶解補助剤（酒石酸）、ｐＨ調整剤（塩酸）、注射用水を表９または１０に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例３８～４３の液剤を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
〔実施例４４～４７〕
　実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、溶解補助剤（酒石酸）、ｐＨ調整剤（塩酸）、注射用水を表１１に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例４４～４７の液剤を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
〔実施例４８～５０〕
　実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ－マンニトール、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１２に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例４８～５０の液剤を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
〔実施例５１～５４〕
　実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ－マンニトール、メチオニン、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１３に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５２の液剤を得た。
　実施例１と同様に、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ－マンニトール、メチオニン、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１３に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５１、５３および５４の液剤を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
〔実施例５５～５８〕
　実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、酒石酸、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１４に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５５および５６の液剤を得た。
　実施例１と同様に、ペプチド（２）、トレハロース、酒石酸、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１４に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５７および５８の液剤を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
〔実施例５９～６６〕
　実施例１と同様に、ペプチド（１）、ペプチド（２）、トレハロース、Ｄ－マンニトール、Ｌ－メチオニン、酒石酸、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を表１５または１６に記載の量で調製し、バイアルに充填し、ブチルゴム栓で密封することにより実施例５９～６６の液剤を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
〔凍結乾燥製剤の調製〕
〔実施例１Ａ～６６Ａ〕
　実施例１、４、６、９、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、５１、５３、５４および５７～６６で製造した液剤または懸濁液剤をガラスバイアルに充填後、凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥を行い、実施例１Ａ、４Ａ、６Ａ、９Ａ、１１Ａ、１３Ａ、１４Ａ、１６Ａ、１７Ａ、１９Ａ、２０Ａ、５１Ａ、５３Ａ、５４Ａおよび５７Ａ～６６Ａの凍結乾燥製剤を得る。なお、凍結乾燥は、－４０℃付近で液体または懸濁液剤を凍結させた後、庫内を真空に減圧し、同時に、庫内の温度を－２０℃付近に上昇させて２０時間程度乾燥させ、さらに、庫内の温度を３０℃付近に上昇させて１２時間程度乾燥させる条件により、実施する。
　実施例２、３、５、７、８、１０、１２、１５、１８、２１～５０、５２、５５および５６で製造した液剤をガラスバイアルに充填後、凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥を行い、実施例２Ａ、３Ａ、５Ａ、７Ａ、８Ａ、１０Ａ、１２Ａ、１５Ａ、１８Ａ、２１Ａ～５０Ａ、５２Ａ、５５Ａおよび５６Ａの凍結乾燥製剤を得た。なお、凍結乾燥は、－４０℃付近で液剤を凍結させた後、庫内を真空に減圧し、同時に、庫内の温度を－２０℃付近に上昇させて２０時間程度乾燥させ、さらに、庫内の温度を３０℃付近に上昇させて１２時間程度乾燥させる条件により、実施した。
〔試験例１〕液剤および懸濁液剤の安定性の評価
　実施例２、３、５、７、８、１０、１２、１５、１８、２１～２６、３０～３４および５２の液剤を２５℃で１週間保存後、純度を評価した。純度は、Ｃ１８逆相カラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍまたは４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）を用い、純水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸を移動相に用いた逆相高速液体クロマトグラフィー法（検出波長：２２０ｎｍ）により測定した。本法で測定したピーク面積を用いて、以下の式によりペプチド純度および開始時の純度を１００％とした場合の相対純度（対ｉｎｉｔｉａｌ値）を算出した。
　ペプチド純度（％）＝ペプチドのピーク面積／類縁物質を含む総ピーク面積×１００
　相対純度（対ｉｎｉｔｉａｌ値）（％）＝保存時点のペプチド純度／開始時のペプチド純度×１００
　結果を表１７に示す。どの製剤も２５℃１週間で８０％以上あり、安定な製剤を得ることができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
〔試験例２〕凍結乾燥製剤の安定性の評価
　実施例５Ａ、１０Ａ、１２Ａ、１５Ａ、１８Ａ、２３Ａ～２６Ａ、３０Ａ～４３Ａ、４８Ａ～５０Ａ、５２Ａ、５５Ａおよび５６Ａの凍結乾燥製剤を６０℃で２週間保存後、注射用水を加え、液剤にした後、純度を評価した。純度は試験例１と同様に測定し算出した。
　結果を表１８に示す。どの製剤も６０℃２週間で８０％以上あり、安定な製剤を得ることができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
〔試験例３〕凍結乾燥製剤の再溶解性の評価
　実施例４４Ａ～４７Ａの凍結乾燥製剤を４０℃で１ヶ月保存後、注射用水を加えて復水した時の溶解性を目視にて確認した。結果を表１９に示す。表１９の結果から、溶解補助剤である酒石酸を予め添加しておくことで再溶解性が向上することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
〔試験例４〕特異的ＣＴＬ誘導活性の確認
　実施例５１と同一の組成比からなる、ペプチド（１）、トレハロース、Ｄ－マンニトール、メチオニン、注射用水、ｐＨ調整剤（塩酸）を含み、ｐＨを２．７に調整した実施例６７の液剤を得た。実施例６７の液剤をバイアルに２ｍＬ充填し、凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥を行い、実施例６７Ａの凍結乾燥製剤を得た。ペプチド（１）を含む実施例６７Ａの凍結乾燥製剤およびペプチド（２）を含む実施例５５Ａの凍結乾燥製剤を用いて、アジュバントと混合することにより癌ワクチン組成物を調製した。また、実施例６７Ａの凍結乾燥製剤の安定性を試験例２と同様に評価したところ、２５℃で３ヶ月保存後の相対純度（対ｉｎｉｔｉａｌ値）は１００％であり、安定な製剤を得ることができた。
１）癌ワクチン組成物の調製
　ペプチド（２）を含む実施例５５Ａの凍結乾燥製剤を１．２ｍＬの注射用水で再溶解した。再溶解した製剤を１ｍＬ採取し、ペプチド（１）を含む実施例６７Ａの凍結乾燥製剤に加え、再溶解し、実施例６８の液剤を作製した。この液剤０．９ｍＬにアジュバントであるモンタナイドを０．９ｍＬ混合・乳化し、実施例６７の癌ワクチン組成物とした。
２）ＣＴＬ誘導活性評価
　上記癌ワクチン組成物のＣＴＬ誘導能を、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウスおよびＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏＣＴＬ誘導試験によって評価した。
　ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ－Ａ２．１ＤＲ１）は、マウスのＭＨＣを欠損し、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ－Ａ＊０２：０１とマウスＭＨＣであるＨ－２ＤｂのキメラＨＬＡ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ－Ａ＊０２陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；３４：３０６０－９）。一方、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス (Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＨＬＡ－Ａ２４０２／Ｋｂ)は、ヒトのＭＨＣであるＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とマウスＭＨＣであるＨ－２ＫｂのキメラＨＬＡを発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ＨＬＡ－Ａ＊２４陽性のヒトでＣＴＬを誘導し得るペプチドの選択が可能である（Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ．２００２；１００：５６５－７０）。
　上記癌ワクチン組成物を、マウスの尾根部皮内に５０μＬ／ｓｉｔｅで２箇所に投与した。癌ワクチン組成物のペプチド特異的Ｔ細胞誘導評価では、ＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔを用いた。投与１週間後に、マウスをＣＯ２ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。脾細胞調製の前日に、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを抗マウスＩＦＮγ抗体で処理し、当日に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でブロッキングした。調製したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を１．２５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、調製したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、それぞれブロッキングしたＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種した。ペプチド（配列番号：３、５）をＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍＬに溶解し、さらに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｇ／ｍＬに希釈した。希釈したペプチドを最終濃度１０μｇ／ｍＬで、ＥＬＩＳＰＯＴプレートに播種したＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞（配列番号：３）あるいはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞（配列番号：５）に添加した。その後、１８～２０時間、３７℃、５％ ＣＯ２下で培養することで、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃ.Ｔ.Ｌ.社製）によって測定した。
　　ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウスを用いたＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴ　ａｓｓａｙの結果を図１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス用いたＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴ　ａｓｓａｙの結果図２に示す。
　図１および２において、縦軸は播種細胞数中に反応した細胞数を、横軸はｉｎ　ｖｉｔｒｏでパルスしたペプチドを示す。図１の黒棒はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞を配列番号：３で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差がペプチド特異的ＣＴＬの数を示し、上記癌ワクチン組成物の投与によってマウス生体内において配列番号：３で表されるペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。図１において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：３で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。
　さらに、図２の黒棒はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス用いた由来の脾細胞を配列番号：５で表されるペプチドをパルスしながら培養した結果を示し、白棒は非パルスで培養した結果を示す。即ち、黒棒と白棒の値の差がペプチド反応性細胞の数を示し、上記癌ワクチン組成物の投与によってマウス生体内において配列番号：５で表されるペプチドに特異的なＣＴＬが誘導されたことを示す。図２において白棒の値は認められていない。このことは目的のペプチドをパルスしない場合にはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウスの脾細胞は全く反応しなかったことを示している。本試験の結果、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２遺伝子導入マウス由来の脾細胞において配列番号：５で表されるペプチドに特異的なＩＦＮγの産生が確認された。
　これにより、上記癌ワクチン組成物はｉｎ　ｖｉｖｏで配列番号：３および配列番号：５で表されるペプチド特異的なＣＴＬを誘導し得ることが明らかとなった。したがって、ペプチド（１）を含むペプチドが安定な製剤とペプチド（２）を含むペプチドが安定な製剤を再調製した製剤は、癌ワクチンとして使用できることが示唆される。
　本発明により、ＷＴ１タンパク質由来癌抗原ペプチドを含有する良好な懸濁性を持つ懸濁液剤、および懸濁液剤を凍結乾燥した安定性の高い凍結乾燥製剤を提供することが可能になり、当該ペプチドは癌ワクチンとして使用できる。
　本出願は、日本で出願された特許出願特願２０１４－１９７６６７（出願日：２０１４年９月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (22)

  1. 　以下の成分を含む注射用医薬組成物
    （ａ）式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、ＣｙｓとＣｙｓの間の結合はジスルフィド結合を表し、Ｌｅｕ－ＯＨはＬｅｕのＣ末端がフリーのカルボキシル基であることを示し、他の結合はペプチド結合を示す。） 
    で表されるペプチド、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびそれらの塩から選択される１種以上のペプチド、
    （ｂ）トレハロースまたはトレハロース水和物、および
    （ｃ）ｐＨ調整剤。
  2. 　成分（ａ）が式（１）で表されるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドである、請求項１に記載の組成物。
  3. 　さらにマンニトールを含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
  4. 　マンニトールがＤ－マンニトールである、請求項３に記載の組成物。
  5. 　さらにメチオニンを含むことを特徴とする、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 　ｐＨが１～３であることを特徴とする、請求項２～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 　成分（ａ）がTrp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドである、請求項１に記載の組成物。
  8. 　さらに溶解補助剤を含むことを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
  9. 　溶解補助剤が酒石酸である、請求項８に記載の組成物。
  10. 　ｐＨが２～３であることを特徴とする、請求項８または９に記載の組成物。
  11. 　ｐＨが５～１０であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
  12. 　ｐＨ調整剤が塩酸および／または水酸化ナトリウムであることを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 　ｐＨ調整剤として用いる酸が弱酸であることを特徴とする、請求項７～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 　成分（ａ）が、式（１）で表されるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドと、Trp-Ala-Pro-Val-Leu-Asp-Phe-Ala-Pro-Pro-Gly-Ala-Ser-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu（配列番号：１）で表されるペプチドおよびその塩から選択される１種以上のペプチドとを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  15. 　さらにマンニトールを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
  16. 　さらにメチオニンを含むことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の組成物。
  17. 　さらに溶解補助剤を含むことを特徴とする、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 　ｐＨが２～３であることを特徴とする、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 　組成物が液剤、懸濁液剤、または凍結乾燥製剤であることを特徴とする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 　凍結乾燥製剤の形態である請求項２～６のいずれか一項に記載の組成物に、液剤の形態である請求項７～１０のいずれか一項に記載の組成物を加えることにより製造される、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 　液剤または懸濁液剤であることを特徴とする、請求項２０に記載の組成物。
  22. 　請求項２～２１のいずれか一項に記載の組成物を含む癌ワクチン組成物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020067453A1 (ja) 2018-09-28 2020-04-02 大日本住友製薬株式会社 注射用組成物
WO2023013755A1 (ja) * 2021-08-06 2023-02-09 ブライトパス・バイオ株式会社 がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102646145B1 (ko) 2018-05-31 2024-03-11 주식회사 엑소코바이오 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모공 축소용 조성물
JP7079984B2 (ja) 2018-07-28 2022-06-03 エクソコバイオ インコーポレイテッド エキソソームの凍結乾燥方法
KR102163806B1 (ko) 2018-07-30 2020-10-07 주식회사 엑소코바이오 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피지분비 감소용 조성물
WO2020056249A1 (en) 2018-09-14 2020-03-19 Cara Therapeutics, Inc. Oral formulations of kappa opioid receptor agonists
CN115335072A (zh) 2020-03-18 2022-11-11 卡拉治疗学股份有限公司 κ阿片受体激动剂的寡糖配制品

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06135851A (ja) * 1992-10-26 1994-05-17 Seikagaku Kogyo Co Ltd コンドロイチナーゼ組成物およびそれを含有する注射用製剤
JP2000229882A (ja) * 1998-12-10 2000-08-22 Sankyo Co Ltd 修飾シクロデキストリン含有トロンビン水性液剤
WO2003097083A1 (fr) * 2002-05-21 2003-11-27 Daiichi Suntory Pharma Co.,Ltd. Compositions medicinales contenant de la ghreline
US20070191271A1 (en) * 2006-02-10 2007-08-16 Dow Pharmaceutical Sciences Method for stabilizing polypeptides lacking methionine
WO2010123065A1 (ja) * 2009-04-23 2010-10-28 株式会社癌免疫研究所 癌抗原ヘルパーペプチド
WO2014142102A1 (ja) * 2013-03-12 2014-09-18 大日本住友製薬株式会社 液体水性組成物
WO2014157692A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 大日本住友製薬株式会社 Ｗｔ１抗原ペプチドコンジュゲートワクチン

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5496718A (en) 1992-06-26 1996-03-05 Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896
WO2000006602A1 (fr) 1998-07-31 2000-02-10 Haruo Sugiyama Antigenes contre le cancer a base d'un produit du gene suppresseur de tumeur wt1
BRPI0208183B8 (pt) 2001-03-22 2021-05-25 Sugiyama Haruo peptídeo antígeno de câncer modificado por wt1 e vacinas para câncer
AU2004204031B2 (en) * 2003-01-15 2010-03-04 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Dimerized peptide
AU2006319892B2 (en) 2005-11-30 2012-05-10 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Novel peptide compound
US20110270212A1 (en) * 2007-10-05 2011-11-03 Medtronic, Inc. Pharmacokinetic control for optimized interferon delivery
EP2226081A4 (en) * 2007-10-25 2011-10-12 Univ Kagoshima PEPTIDE VACCINE WITH A MIMIC MOLECULE OF AMYLOID PEPTIDE
US9539299B2 (en) * 2011-10-27 2017-01-10 International Institute Of Cancer Immunology, Inc. Combination therapy with WT1 peptide vaccine and temozolomide

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06135851A (ja) * 1992-10-26 1994-05-17 Seikagaku Kogyo Co Ltd コンドロイチナーゼ組成物およびそれを含有する注射用製剤
JP2000229882A (ja) * 1998-12-10 2000-08-22 Sankyo Co Ltd 修飾シクロデキストリン含有トロンビン水性液剤
WO2003097083A1 (fr) * 2002-05-21 2003-11-27 Daiichi Suntory Pharma Co.,Ltd. Compositions medicinales contenant de la ghreline
US20070191271A1 (en) * 2006-02-10 2007-08-16 Dow Pharmaceutical Sciences Method for stabilizing polypeptides lacking methionine
WO2010123065A1 (ja) * 2009-04-23 2010-10-28 株式会社癌免疫研究所 癌抗原ヘルパーペプチド
WO2014142102A1 (ja) * 2013-03-12 2014-09-18 大日本住友製薬株式会社 液体水性組成物
WO2014157692A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 大日本住友製薬株式会社 Ｗｔ１抗原ペプチドコンジュゲートワクチン

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAIN, N. K. ET AL.: "Trehalose and protein stability", CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE, no. Suppl. 59., 2010, pages 4.9.1 - 4.9.12, XP055145633 *
JAPAN PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS COUNCIL: "Iyakuhin Tenkabutsu Jiten, first edition", part f irst edition 1994, pages: 65, XP009501416 *
See also references of EP3199175A4 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020067453A1 (ja) 2018-09-28 2020-04-02 大日本住友製薬株式会社 注射用組成物
KR20210068060A (ko) 2018-09-28 2021-06-08 다이니뽄 스미토모 세이야쿠 가부시키가이샤 주사용 조성물
JPWO2020067453A1 (ja) * 2018-09-28 2021-09-09 大日本住友製薬株式会社 注射用組成物
US20210338587A1 (en) * 2018-09-28 2021-11-04 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Injectable composition
JP7162675B2 (ja) 2018-09-28 2022-10-28 住友ファーマ株式会社 注射用組成物
WO2023013755A1 (ja) * 2021-08-06 2023-02-09 ブライトパス・バイオ株式会社 がんペプチドワクチンカクテル製剤、及びその製造方法

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