WO2015166790A1 - クレアチンキナーゼmbアイソザイムの測定方法及びそれに用いられるキット - Google Patents
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Definitions
- the latex nephelometry which is a method for measuring protein mass
- CK-MB is a method for quantifying CK-MB as a protein amount by an immunological technique using a monoclonal antibody specific for CK-MB.
- This method can be measured using a general-purpose automatic analyzer, is more accurate than the immunoinhibition method that measures enzyme activity, and has excellent specificity for CK-MB. It is said that it can be monitored.
- the anti-CK-B antibody according to the present invention is more preferably one that recognizes the three-dimensional structure (stereostructure) in the region of amino acids 1 to 100 from the N-terminus of the amino acid sequence of the B subunit of native CK. .
- the entire amino acid sequence of the B subunit of CK is known (NCBI Reference Sequence: NP_001814.2, SEQ ID NO: 2 in the present specification).
- the first antibody according to the present invention, the second antibody according to the present invention, and the anti-CK-B antibody according to the present invention may be collectively referred to simply as “the antibody according to the present invention”.
- the first antibody and the second antibody may be used by being immobilized (supported) on an insoluble carrier. It is convenient to use a commercially available kit that contains latex particles immobilized with the first antibody and latex particles immobilized with the second antibody as constituent reagents. Examples of such commercially available kits include L type Wako CK-MB mass (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
- latex particles are artificial carriers, and are particularly preferable from the viewpoints that the surface of the carrier is easily chemically treated according to the purpose and that non-specific reactions are unlikely to occur.
- the material is not particularly limited, and is not particularly limited as long as it is usually used in this field.
- styrene latex particles such as polystyrene latex particles, acrylic acid latex particles and the like are preferable.
- polystyrene latex particles obtained by emulsion polymerization without using an emulsifier have a strong surface hydrophobicity, so that they adsorb proteins or peptides smoothly and are based on repulsion between negative charges on the surface.
- the latex particles for immobilizing the first antibody and the latex particles for immobilizing the second antibody may be of the same particle diameter, but those having different average particle diameters selected from the above ranges are used in combination. Also good.
- the concentration of the first antibody and the second antibody in the reaction solution at the start of the reaction when the sample, the first antibody, and the second antibody are contacted and reacted in Step 1 varies depending on the concentration of CK-MB in the sample. Although not particularly limited, it is usually 0.1 to 1000 ⁇ g Ab / mL, preferably 0.5 to 1000 ⁇ g Ab / mL, more preferably 0.5 to 100 ⁇ g Ab / mL.
- the sample containing CK-MB is reacted with the anti-CK-B antibody according to the present invention by the method (i). After that, it is preferable to react the first antibody and the second antibody.
- the amount of CK-MB in the sample may be calculated by fitting to the calibration curve shown.
- the CK-MB measurement kit of the present invention only needs to contain a reagent containing the first antibody, the second antibody, and the anti-CK-B antibody of the present invention as a constituent reagent.
- a reagent containing the first antibody, the second antibody, and the anti-CK-B antibody of the present invention as a constituent reagent.
- Preferred embodiments, specific examples, concentrations, and the like of the respective constituent elements are as described in the above description regarding the CK-MB measurement method of the present invention.
- each reagent solution when the kit is composed of a plurality of reagent solutions, each reagent solution also contains reagents necessary for measuring the component to be measured. These reagents are used when the reagents are mixed. In order to start the component measurement reaction, it may be appropriately dispersed in any of the test solutions. The use concentration of the reagents constituting these reagent solutions may be appropriately selected from the range usually used in this field.
- kits of the present invention include, for example, the following configurations: (1) A first reagent comprising an anti-CK-B antibody according to the present invention, a first antibody and a second antibody. A second reagent comprising a constituent reagent, (2) Constituent reagents comprising a first reagent comprising an anti-CK-B antibody according to the present invention, a second reagent comprising a first antibody, and a third reagent comprising a second antibody Or (3) A reagent comprising a first antibody, a second antibody, and an anti-CK-B antibody according to the present invention as a constituent reagent.
- the latex reagent attached to the kit was used as the second reagent.
- the latex reagent solution contains two types of latex particles each having two types of anti-CK-MB antibodies that recognize different epitopes immobilized thereon.
- anti-CK-B antibody (CKBB Monoclonal Antibody) was also measured when CK-MB was measured using the first reagent containing anti-CK-B antibody (CKBB Monoclonal Antibody). Compared with the case of measuring CK-MB using the first reagent not containing CK, the influence of CK-BB could be remarkably suppressed.
- FIG. 2 shows the results of the anti-CK-B antibody [MAb toCK-BB (FIG. 1) or CKBB Monoclonal Antibody (FIG. 2)] according to the present invention ”.
- anti-CK-B antibodies (MAb toCK-BB and CKBB Monoclonal Antibody) according to the present invention are antibodies that recognize the region of amino acids 1 to 100 of the B subunit of CK. became.
- Measurement of CK-MB by the method of the present invention 1) Measurement sample CK-BB is contained in serum purchased from Veritas Nittobo Medical Co., Ltd. or International Bio Co., Ltd. The confirmed human serum was used as a measurement sample.
- the measurement method of CK-MB of the present invention can specifically measure CK-MB while avoiding the influence even if CK-BB coexists in the sample.
- the CK-MB measurement method of the present invention can be applied to a general-purpose automatic analyzer, it is useful in that it can be used for measurement of CK-MB in the field of clinical examination.
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Abstract
Description
(1)下記工程からなる試料中のCK-MBの測定方法;
1)試料と、CK-MBに対する第1抗体と、第1抗体とは認識するエピトープが異なるCK-MBに対する第2抗体と、CKのBサブユニットのアミノ酸配列のN末端から1~100番アミノ酸の領域を認識する抗CK-B抗体とを反応させる工程(工程1)、
2)該反応により生じた光学的変化を測定する工程(工程2)、
3)工程2で得られた結果に基づいて、該試料中のCK-MBの量を求める工程(工程3)。
(2)CKのBサブユニットのアミノ酸配列のN末端から1~100番アミノ酸の領域を認識する抗CK-B抗体で試料を処理することを特徴とする、CK-MB測定におけるCK-BBの影響回避方法。
(3)CK-MBに対する第1抗体と、第1抗体とは認識するエピトープが異なるCK-MBに対する第2抗体と、CKのBサブユニットのアミノ酸配列のN末端から1~100番アミノ酸の領域を認識する抗CK-B抗体とを含んでなる、CK-MB測定用キット。
「下記工程からなる試料中のCK-MBの測定方法;
(1)試料と、CK-MBに対する第1抗体と、第1抗体とは認識するエピトープが異なるCK-MBに対する第2抗体と、CKのBサブユニットのアミノ酸配列のN末端から1~100番アミノ酸の領域を認識する抗CK-B抗体とを反応させる工程(工程1)、
(2)該反応により生じた光学的変化を測定する工程(工程2)、
(3)工程2で得られた結果に基づいて、該試料中のCK-MBの量を求める工程(工程3)。」
である。
以下、本発明に係る第1抗体、本発明に係る第2抗体、本発明に係る抗CK-B抗体をまとめて、単に「本発明に係る抗体」と記載する場合がある。
(i)本発明に係る抗CK-B抗体を含有する溶液と、第1抗体と第2抗体とを含有する溶液をそれぞれ調製し、本発明に係る抗CK-B抗体溶液、第1抗体と第2抗体を含有する溶液の順に、試料と混合する方法(二試薬系)、
(ii)本発明に係る抗CK-B抗体を含有する溶液と、第1抗体を含有する溶液と、第2抗体を含有する溶液をそれぞれ調製し、試料と本発明に係る抗CK-B抗体を含有する溶液を混合してから、第1抗体を含有する溶液、第2抗体を含有する溶液を順次混合する方法(第1抗体を含有する溶液と第2抗体を含有する溶液は、どちらを先に加えてもよい。)、
(iii)第1抗体と第2抗体と本発明に係る抗CK-B抗体を含有する溶液を調製し、試料と該溶液を混合して、これらの成分を一度に作用させる方法。
(1)第1抗体固定化不溶性担体と第2抗体固定化不溶性担体とCK-MBとの反応開始後、反応液の光学的測定を適当な間隔で2回行い、その測定値の差を光学的変化とする(エンド法)。
(2)第1抗体固定化不溶性担体と第2抗体固定化不溶性担体とCK-MBとの反応開始後の反応液の光学的変化率(特に、その最大変化率)を吸光度変化とする(レート法)。
(1)本発明に係る抗CK-B抗体を含んでなる第1試薬と、第1抗体と第2抗体を含んでなる第2試薬とを構成試薬とするもの、
(2)本発明に係る抗CK-B抗体を含んでなる第1試薬と、第1抗体を含んでなる第2試薬と、第2抗体を含んでなる第3試薬とを構成試薬とするもの、又は
(3)第1抗体と第2抗体と本発明に係る抗CK-B抗体を含んでなる試薬を構成試薬とするもの。
市販のCK-MB測定キットであるLタイプワコー CK-MB mass(和光純薬工業(株)製)を用い、キットの添付文書の記載に従って、以下のとおり、測定を行った。
ヒト脳由来精製CK-BB (Merideian Life Science, Inc.)を400 ng/mLおよび2000 ng/mLとなるようにヒト血清に添加して、CK-BB試料とした。
キットに添付の緩衝液に、抗CK-B抗体として市販のマウス抗CK-BBモノクローナル抗体であるMAb to CK-BB(Merideian Life Science, Inc.製 )、又はCKBB Monoclonal Antibody(Roche Diagnostics K.K.製)を加えて、0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160μg/mL濃度の抗体含有緩衝液(第1試薬)を調製した。
キットに添付のラテックス試液を第2試薬として用いた。ラテックス試液は、認識するエピトープが互いに異なる2種類の抗CK-MB抗体をそれぞれ固定化した、2種類のラテックス粒子を含有する。
日立7170自動分析装置((株)日立ハイテクノロジーズ製)を用いて、以下の測定を行った。
抗CK-B抗体としてMAb to CK-BBを含有する第1試薬を用いた場合の結果を表1に示す。
実施例1の結果から、実施例1で使用した抗CK-B抗体(本発明に係る抗CK-B抗体)が、ラテックス比濁法によるCK-MB測定時のCK-BBの影響を回避することが確認できたので、これらの抗体の抗原性を、以下の方法で確認した。
0.1mg/mLのヒト脳由来精製CK-BB(Merideian Life Science, Inc.)2μLをSuperSepTM(電気泳動用ゲル、和光純薬工業(株),5-20%のグラジェントゲル)にアプライして、SDS-PAGE電気泳動(定電流25mA)を行った。次いで、泳動後の画分を、セミドライブロッティング法にてPVDFメンブレンに転写した。
本発明に係る抗CK-B抗体としてMAb to CK-BBを用いて得られた結果を図1に、本発明に係る抗CK-B抗体としてCK-BB Monoclonal Antibodyを用いて得られた結果を図2にそれぞれ示す。
以下の方法で、CKのBサブユニットの「N末端から1~100番アミノ酸の領域」以外の領域を認識する抗体が、CK-MBの測定におけるCK-BBの影響を回避することができるかを調べた。
実施例1と同じCK-BB試料を用いた。
キット(Lタイプワコー CK-MB mass)に添付の緩衝液に、下記の、各々異なる領域を認識する市販の抗CK-B抗体を加えて、5 μg/mL濃度の抗体含有緩衝液(第1試薬)をそれぞれ調製した。各抗体の「抗原」は、各抗体の添付文書の抗原領域に関する記載に基づく。
抗体b:CKのBサブユニットのN末端から350番~C末端アミノ酸までのアミノ酸配列を認識する抗CK-B抗体(ウサギ抗CK-BBポリクローナル抗体、Abcam plc製)
抗体c:CKのBサブユニットのN末端から165~357番アミノ酸までのアミノ酸配列を認識する抗CK-B抗体(ウサギ抗CK-BBポリクローナル抗体、Abcam plc製)
抗体d: MAb to CK-BB(Merideian Life Science, Inc.製、実施例1で使用した本発明に係る抗CK-B抗体。)。
実施例1で使用したと同じキットに添付のラテックス試液を第2試薬として用いた。
実施例1で使用したと同じ機器を用い、同じ方法で、CK-MBの測定を行った。
結果を表3に示す。
実施例1で使用したのと同じ市販のCK-MB測定キットであるLタイプワコーCK-MB mass(和光純薬工業(株))を用い、キットの添付文書の記載の方法に従って、以下の測定を行った。
1)測定試料
(株)ベリタス・ニットーボーメディカル(株)や国際バイオ(株)から購入した血清の中でCK-BBが含まれていることを確認したヒト血清を測定試料として用いた。
キットに添付の緩衝液に、本発明に係る抗CK-B抗体(Mab to CK-BB又はCK-BB Monoclonal Antibody)を加えて、5 μg/mL濃度の抗体含有緩衝液(第1試薬)を調製した。
実施例1と同じ、キットに添付のラテックス試液を第2試薬として用いた。
LABOSPECT008自動分析装置((株)日立ハイテクノロジーズ製)を用い測定を行った。上記1)のCK-MB含有試料7μLに、上記2)で調製した第1試薬100 μLを混合し、37℃で5分保温後、第2試薬 33 μLを添加してさらに5分保温した。ラテックス 試液添加後30秒後から5分後までの660 nmでの吸光度変化を測定した。
同じ試料中のCK-MBを、電気化学発光免疫測定法によるCK-MB測定用キットであるエクルーシス試薬 CK-MBII(ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製)を用い、cobas8000((ロシュ・ダイアグノスティクス株式会社製)を用いて測定した。
結果を下記表4に示す。
Claims (12)
- 下記工程からなる試料中のCK-MBの測定方法;
(1)試料と、クレアチンキナーゼMBアイソザイム(以下、「CK-MB」と略記する。)に対する第1抗体と、第1抗体とは認識するエピトープが異なるCK-MBに対する第2抗体と、クレアチンキナーゼのBサブユニットのアミノ酸配列のN末端から1~100番アミノ酸の領域を認識する抗CK-B抗体とを反応させる工程(工程1)、
(2)該反応により生じた光学的変化を測定する工程(工程2)、
(3)工程2で得られた結果に基づいて、当該試料中のCK-MBの量を求める工程(工程3)。 - 工程1が、試料と当該抗CK-B抗体とを反応させた後、第1抗体及び第2抗体を反応させることによりなされる請求項1に記載の方法。
- 当該抗CK-B抗体が認識する領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を持つものである、請求項1に記載の方法。
- 光学的変化が吸光度変化、濁度変化、又は散乱光強度変化である、請求項1に記載の方法。
- 第1抗体及び/又は前記第2抗体が不溶性担体に固定化されている、請求項1に記載の方法。
- 不溶性担体がラテックス粒子である、請求項5に記載の方法。
- クレアチンキナーゼのBサブユニットのアミノ酸配列のN末端から1~100番アミノ酸の領域を認識する抗CK-B抗体で試料を処理することを特徴とする、CK-MB測定におけるクレアチンキナーゼBBアイソザイムの影響回避方法。
- CK-MBに対する第1抗体と、第1抗体とは認識するエピトープが異なるCK-MBに対する第2抗体と、クレアチンキナーゼのBサブユニットのアミノ酸配列のN末端から1~100番アミノ酸の領域を認識する抗CK-B抗体とを含んでなる、CK-MB測定用キット。
- 当該抗CK-B抗体を含んでなる第1試薬と、第1抗体と第2抗体を含んでなる第2試薬を含んでなる、請求項8に記載のキット。
- 当該抗CK-B抗体が認識する領域が、配列番号1で表されるアミノ酸配列を持つものである、請求項8に記載のキット。
- 第1抗体及び/又は前記第2抗体が不溶性担体に固定化されている、請求項8に記載のキット。
- 不溶性担体がラテックス粒子である、請求項11に記載のキット。
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