WO2015088005A1 - スフェロイド内酸素濃度測定試薬およびこれを用いたスフェロイド内酸素濃度測定方法 - Google Patents

スフェロイド内酸素濃度測定試薬およびこれを用いたスフェロイド内酸素濃度測定方法 Download PDF

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spheroid
btp
oxygen concentration
cells
spheroids
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伊藤学
新井一也
田中覚
飛田成史
吉原利忠
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Ｓｃｉｖａｘライフサイエンス株式会社
国立大学法人群馬大学
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a reagent for visualizing and quantifying oxygen concentration in spheroids in real time and a method for measuring oxygen concentration in spheroids using the reagent.
  • mice cultured by cell culture technology in drug development and molecular biology research are used as simulators for drug pharmacological activity evaluation and toxicity tests.
  • spheroid culture which is a three-dimensional tissue having a function equivalent to that in a living body, has attracted attention.
  • seeding a plurality of single cells in a funnel having a bottom surface and culturing spheroids by aggregating and dispersing the single cells on the bottom surface (Patent Document 1), or a casting liquid surface of a predetermined polymer mixture
  • Patent Document 2 There is a type in which spheroids are cultured on a honeycomb structure obtained by condensing water and evaporating minute water droplets generated by the dew condensation.
  • Patent Document 3 a cell culture structure, a cell culture container, a structure with spheroids, and a container with spheroids that are controlled in shape, size, and material, and a controlled spheroid culture attached to the culture bottom surface. It has been successful (Patent Document 3).
  • the method (3) using a nitroimidazole drug utilizes the fact that nitroimidazole is reduced in hypoxic cells and bound to intracellular proteins and trapped. Since this method requires time for the metabolism of the drug, it has a disadvantage that data cannot be obtained until several hours have elapsed after the drug administration.
  • the method (4) is a method for quantifying the oxygen concentration by utilizing the fact that the phosphorescence lifetime of the water-soluble porphyrin derivative or ruthenium complex changes depending on the blood oxygen concentration (it is quenched). This method has the great advantage of being able to visualize the oxygen partial pressure in the tissue non-invasively, but since the reagent is water-soluble, the data obtained is limited to the blood oxygen concentration.
  • JP-A-6-327462 JP 2002-335949 A Japanese Patent No. 4159103 JP 2010-44059 A
  • oxygen concentration measurement in planar cell culture is performed in real time because the hypoxic state in the cell is quickly eliminated when moving from a hypoxic culture environment to a measurement environment under an oxygen atmosphere. There was a difficult task. In addition, it has been difficult to measure the oxygen concentration in the spheroid culture by a method that is non-invasive and non-toxic to spheroids in real time.
  • an object of the present invention is to provide an oxygen concentration measurement reagent having low toxicity to spheroids and an oxygen concentration measurement method using the same in spheroid culture as a biological tissue simulator.
  • the present inventors have selected from among a plurality of compounds that emit phosphorescence depending on the oxygen concentration, C-cis, N-trans, bis [2- (2′-benzothienyl) -pyridinato-N, C3, which is an iridium complex. It has been found that '] iridium (acetylacetonate) (hereinafter referred to as BTP) is a compound that is more effective in measuring the oxygen concentration in spheroids than other iridium complexes of derivatives and is less toxic.
  • BTP iridium (acetylacetonate)
  • concentration more than fixed is required, and it discovered that the said required density
  • a processing time of a certain time or more is required, and it has been found that there is a correlation between the processing time and the size of the spheroid.
  • the upper limit concentration at which BTP exhibits cytotoxicity was found. Then, the inventors have found a method for measuring the oxygen concentration in the spheroid using changes in phosphorescence intensity and phosphorescence lifetime emitted by BTP as indicators, and have completed the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • the spheroid oxygen concentration measuring reagent of the present invention is characterized by containing BTP.
  • the method for measuring oxygen concentration in spheroids of the present invention comprises (a) a step of culturing cells on a culture substrate capable of forming spheroids, (b) a step of bringing the cells into contact with BTP, and (c) phosphorescence. And a step of evaluating the oxygen concentration in the spheroid using the change as an index.
  • BTP is added to a final concentration of 2.5 ⁇ M or more after culturing until the spheroid size is 100 ⁇ m or more, and the spheroid is cultured for more than 1 hour.
  • BTP is added so that the final concentration becomes 1 ⁇ M or more, or after culturing until the spheroid size becomes 500 ⁇ m or more, BTP becomes a final concentration of 2.5 ⁇ M or more. It is preferable to add such that.
  • the oxygen concentration in spheroids is measured in real time, and the oxygen concentration change in the microenvironment of the cancer tissue affects. The impact can be evaluated. This can contribute to elucidation of cancer mechanisms.
  • the graph which shows the cytotoxicity of BTP with respect to a spheroid The results of HT-29 cell spheroids are shown in (a), MiaPaCa2 cell spheroids in (b), and Panc-1 cell spheroids in (c).
  • the vertical axis indicates the cell viability when the concentration is 0 ⁇ M, and the horizontal axis indicates the BTP concentration.
  • the results of HT-29 cell spheroids are shown in (a), MiaPaCa2 cell spheroids in (b), and Panc-1 cell spheroids in (c).
  • the vertical axis represents the cell viability when the concentration is 0 ⁇ M
  • the horizontal axis represents the BTP-NH 2 concentration.
  • the results of HT-29 cell spheroids are shown in (a), MiaPaCa2 cell spheroids in (b), and Panc-1 cell spheroids in (c).
  • the vertical axis indicates the cell viability when the concentration is 0 ⁇ M
  • the horizontal axis indicates the BTP-NMe 2 concentration.
  • the third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b).
  • the magnification is 200 times.
  • the third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b).
  • the magnification is 200 times.
  • the third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b).
  • the magnification is 200 times.
  • the third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b).
  • the magnification is 200 times.
  • the third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b).
  • the magnification is 200 times.
  • Bright-field image in the BTP-NH 2 different concentrations and a fluorescent observation image The third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b). The magnification is 200 times.
  • BTP-NMe 2 is a bright field image and a fluorescence observation image at various concentrations.
  • the third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b).
  • the magnification is 200 times.
  • BTP-NMe 2 is a bright field image and a fluorescence observation image at various concentrations.
  • the third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b).
  • the magnification is 200 times.
  • BTP-NMe 2 is a bright field image and a fluorescence observation image at various concentrations.
  • the third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b).
  • the magnification is 200 times.
  • BTP-NMe 2 is a bright field image and a fluorescence observation image at various concentrations.
  • the third day of culture is shown in (a) and the seventh day of culture is shown in (b).
  • the magnification is 200 times.
  • the number of cells per well 3000 is shown in (a) and 750 in (b).
  • the number of cells per well 3000 is shown in (a) and 750 in (b).
  • the number of cells per well 3000 is shown in (a) and 750 in (b).
  • a spheroid refers to a cell aggregate in which cells are aggregated and aggregated three-dimensionally, for example, a cell aggregated and aggregated in a spherical or tufted shape.
  • the spheroid oxygen concentration measuring reagent of the present invention contains BTP, which is a metal complex having Ir (III) as a central metal and an aromatic molecule as a ligand.
  • the BTP can emit phosphorescence depending on the surrounding oxygen concentration. That is, when the oxygen concentration is low, high intensity phosphorescence is emitted, and when the oxygen concentration is high, low intensity phosphorescence is emitted. Therefore, if the reagent for measuring oxygen concentration in spheroids of the present invention is used, a change in oxygen concentration inside the spheroid can be evaluated in real time. In addition, since the phosphorescence emitted from the BTP is quenched according to the surrounding oxygen concentration, the oxygen concentration inside the cells and spheroids can be quantitatively measured by measuring the phosphorescence lifetime.
  • the cell to be measured is not particularly limited and may be any cell, but examples include established cultured cells and primary cultured cells. Examples include fat cells, hepatocytes, including various progenitor cells and stem cells, Kidney cells, pancreatic cells, breast cells, endothelial cells, epithelial cells, smooth muscle cells, myoblasts, cardiomyocytes, neurons, glial cells, dendritic cells, chondrocytes, osteoblasts, osteoclasts, bone cells, Examples include fibroblasts, various blood cells, other mesenchymal progenitor cells and stem cells, ES cells, and various cancer cells derived therefrom.
  • the cell is not limited to a single cell but may be an aggregate of a plurality of cell types.
  • the method for measuring oxygen concentration in spheroids of the present invention includes a step of culturing cells on a culture substrate capable of forming spheroids, a step of bringing the cells into contact with BTP, and an oxygen concentration in spheroids using a change in phosphorescence as an index. And a step of evaluating the above.
  • the culture substrate capable of forming spheroids is particularly limited as long as the adhesion to cells is suppressed as compared with the culture substrate used for normal monolayer culture.
  • those obtained by modifying the hydrophilicity or hydrophobicity of the culture substrate surface can be used.
  • the culture substrate material may be any material as long as it is non-toxic to cells, for example, “polystyrene”, “polyethylene”, “polypropylene”, “polyimide”, “polylactic acid or polylactic acid-poly Glycolic acid copolymers, biodegradable polymers such as polycaprolactone ",” polyolefin resins such as polymethylpentene ", and cyclic olefin thermoplastics such as cyclic olefin copolymer (COC) and cyclic olefin polymer (COP) "Resin", “Acrylic resin”, “Other resins such as photo-curing resin and thermosetting resin”, “Metal such as aluminum oxide", “Glass", “Quartz glass”, “Silicon”, etc. it can. Further, it is also possible to use a substrate body made of silicon, glass or the like on which a coating layer such as “resin”, “photoresist”, “metal such as aluminum oxide” is formed
  • the surface of the culture substrate can function as a cell adhesion surface
  • treatment for controlling cell adhesion such as ultraviolet irradiation, gamma ray irradiation, plasma irradiation, and coating of various substances may be performed. good.
  • a culture substrate having a predetermined uneven structure that functions as a cell adhesion surface may be used.
  • the concavo-convex structure can be various shapes such as a line shape (line and space), a pillar shape, and a hole shape, depending on the properties of the cells to be cultured, but preferably a unit structure having a predetermined planar shape. It is better to have a structure in which a plurality of are regularly arranged. For example, a plurality of unit structures whose planar shape is a polygon can be continued. At this time, regular polygons such as regular triangles, squares, regular hexagons, and circular ones are more preferable because cells can be grown on an isotropically uniform structure. It is also possible to combine a pillar-shaped or hole-shaped uneven structure with an uneven structure formed from a unit structure having a planar shape.
  • the line width of the convex portion is preferably as small as 3 ⁇ m or less, 2 ⁇ m or less, 1 ⁇ m or less, 700 nm or less, 500 nm or less, or 250 nm or less. This is because the smaller the line width, the more the cells adhered to the concavo-convex structure surface can form spheroids while growing many pseudopods.
  • the depth of the unit structure is formed in various sizes such as 1 nm or more, 10 nm or more, 100 nm or more, 200 nm or more, 500 nm or more, 1 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, depending on the properties of cells to be cultured.
  • the aspect ratio of the unevenness includes various ones such as 0.2 or more, 0.5 or more, 1 or more, 2 or more.
  • the minimum inner diameter (preferably the maximum inner diameter) of the unit structure is preferably 3 ⁇ m or less, and it is more preferable that the unit structure is smaller, such as 2 ⁇ m or less, 1 ⁇ m or less, 700 nm or less, 500 nm or less, or 250 nm or less.
  • the inner diameter means a distance between two parallel lines circumscribing the unit structure. Therefore, the minimum inner diameter means the shortest distance between two parallel lines circumscribing the unit structure, and the maximum inner diameter is the longest distance between two parallel lines circumscribing the unit structure. Say things.
  • the unit structure when the unit structure is a regular hexagon, the distance between the parallel sides facing each other is the minimum inner diameter, and the distance between the opposite vertices is the maximum inner diameter.
  • the unit structure when the unit structure is rectangular, the length of the short side is the minimum inner diameter, and the length of the diagonal line is the maximum inner diameter.
  • the formation method of the concavo-convex structure may be any method, but for example, nanoimprint technology, solution casting method, etching, blasting, corona discharge and the like can be used. At this time, a method using a nanoimprint technique is preferable in that the shape and the like can be controlled more precisely.
  • the cells used for the formation of spheroids are not particularly limited and may be any cells, but examples include established cultured cells and primary cultured cells.
  • Examples include cells, osteoblasts, osteoclasts, bone cells, fibroblasts, various blood cells, other mesenchymal progenitor cells and stem cells, ES cells, and various cancer cells derived therefrom.
  • the cell is not limited to a single cell but may be an aggregate of a plurality of cell types.
  • the timing of bringing cells into contact with BTP is not particularly limited. For example, simultaneous with cell seeding, 1 day after cell seeding, 2 days later, 3 days later, 4 days later, 5 days later,
  • the BTP may be added to the culture solution after 6 days, but the timing of the addition is preferably after the spheroids are formed. Furthermore, it is preferable that the formed spheroids have a certain size.
  • the size of the spheroid can be, for example, 10 ⁇ m or more, 50 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, 200 ⁇ m or more, 250 ⁇ m or more, 300 ⁇ m or more, 400 ⁇ m or more, 500 ⁇ m or more, and particularly preferably 300 ⁇ m or more. This is because if the size of the spheroid is small, the intensity of the fluorescent light sufficient to evaluate the hypoxic state cannot be obtained. In addition, the larger spheroid size is because the oxygen environment inside and outside the spheroid is different and suitable for evaluating a hypoxic state.
  • the size of the spheroid in the present invention means the shortest distance r between the point P and the spheroid surface, where P is the point where the drug is most difficult to reach in the spheroid. Normally, it seems that the maximum r max among the shortest distances r between any point in the spheroid and the spheroid surface is applicable.
  • the time for culturing cells after contacting the cells with BTP is particularly limited as long as BTP sufficiently penetrates into the spheroids.
  • BTP exposure time is particularly limited as long as BTP sufficiently penetrates into the spheroids.
  • it can be set to 1 hour or more, 2 hours or more, 4 hours or more, 10 hours or more, or 24 hours or more.
  • the time required for BTP to sufficiently penetrate into the spheroid is smaller as the spheroid size is smaller. That is, the smaller the spheroid size, the shorter the BTP exposure time.
  • the amount of BTP when contacting cells with BTP is such that BTP penetrates sufficiently into the spheroid and does not exhibit cytotoxicity (or low cytotoxicity).
  • cytotoxicity or low cytotoxicity
  • it can add to a culture solution so that final concentration may be 0.5 micromol or more, 1 micromol or more, 2.5 micromol or more, 5 micromol or more, 10 micromol or more.
  • the size of the spheroid when adding BTP is preferably 1 ⁇ M or more.
  • the BTP to be added is 2.5 ⁇ M or more.
  • the spheroid size when adding BTP is 100 ⁇ m or more, the BTP processing time is preferably longer than 1 hour.
  • the phosphorescence intensity and phosphorescence lifetime are determined by adding BTP, culturing cells for a predetermined time, and then exciting BTP to obtain a fluorescence microscope, a fluorescence measuring apparatus, Observation and measurement can be performed using a light measurement device, a phosphorescence lifetime measurement device, or the like.
  • BTP-NH 2 , N in which a ligand having an amino group at the terminal is coordinated
  • BTP-NMe 2 coordinated with a ligand having an N-dimethylamino group was allowed to act on spheroids to investigate cytotoxicity against spheroids.
  • red phosphorescence showing low oxygen intensity in spheroids was observed.
  • NCP NanoCulture (registered trademark) Plate
  • NCP LS96
  • BTP, BTP-NH 2 and BTP-NMe 2 are added at a final concentration of 0 to It was added to the medium in the range of 10 ⁇ M and cultured for 7 days.
  • CellTiter-Glo registered trademark
  • Luminescent Cell Viability Assay Promega
  • BTP showed weak cytotoxicity with a survival rate of about 80% against 3 types of cell lines at 5 ⁇ M (FIG. 1).
  • BTP-NH 2 had a survival rate of 0% with respect to three cell lines at 5 ⁇ M (FIG. 2).
  • BTP-NMe 2 had a survival rate of about 0% for the three cell lines at 5 ⁇ M (FIG. 3).
  • the survival rate was below 50% in the two cell lines (FIGS. 3a and 3c) excluding MiaPaCa2 (FIG. 3b), indicating higher cytotoxicity than BTP. This shows that BTP is less toxic than other BTP derivatives.
  • a penetration test into spheroids was performed using BTP with low cytotoxicity. Three-dimensional culture was performed for 7 days using Prime Surface (Sumitomo Bakelite) and NCP. HT-29 cells were used as the cells, and spheroids were formed at cell numbers of 3000 cells / well and 750 cells / well. Observation was performed with a bright field and a fluorescence microscope.
  • BTP was added at a final concentration of 0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 ⁇ M, cultured for 24 hours in Prime Surface, and bright field and fluorescent microscope observations were performed.
  • 3000 cells / The spheroids formed in the wells had a spheroid size of about 500 ⁇ m, and BTP did not sufficiently penetrate into the spheroids at a BTP concentration of 1 ⁇ M or less.
  • the spheroids formed at 750 cells / well had a spheroid size of about 300 ⁇ m, and when the BTP was 0.5 ⁇ M or less, BTP did not sufficiently penetrate into the spheroids (FIG. 16).
  • BTP was added at a final concentration of 2.5 ⁇ M, cultured in Prime Surface for 1, 4, 10 and 24 hours, and observed by bright field and fluorescence microscopy.
  • spheroids formed at 3000 cells / well The spheroid size was about 500 ⁇ m, and BTP did not sufficiently penetrate into the spheroids when the culture time was 10 hours or less.
  • the spheroids formed at 750 cells / well had a spheroid size of about 300 ⁇ m, and BTP did not sufficiently penetrate into the spheroids when the culture time was 4 hours or less (FIG. 17).
  • BTP was added at a final concentration of 2.5 ⁇ M, cultured with NCP for 1, 4, 10, 24 hours, and bright field and fluorescent microscope observations revealed that spheroids were observed in 1 hour of culture.
  • the size was less than about 50 ⁇ m, BTP penetrated into the spheroid, but when the spheroid size was about 100 ⁇ m, it was observed that BTP did not penetrate sufficiently into the spheroid. (FIG. 18).

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Abstract

　スフェロイドに対する毒性の低い酸素濃度測定試薬およびこれを用いたスフェロイド内の酸素濃度測定方法を提供する。Ｃ－ｃｉｓ，Ｎ－ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２－（２'－ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）－ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ－Ｎ，Ｃ３'］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）を含有するスフェロイド内酸素濃度測定試薬。（ａ）スフェロイド形成可能な培養基材上で細胞を培養する工程と、（ｂ）前記細胞とＣ－ｃｉｓ，Ｎ－ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２－（２'－ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）－ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ－Ｎ，Ｃ３'］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）とを接触させる工程と、（ｃ）りん光の変化を指標としてスフェロイド内の酸素濃度を評価する工程と、を含むスフェロイド内酸素濃度測定方法。

Description

スフェロイド内酸素濃度測定試薬およびこれを用いたスフェロイド内酸素濃度測定方法
　本発明は、スフェロイド内の酸素濃度をリアルタイムに可視化・定量する試薬およびこれを用いたスフェロイド内の酸素濃度測定方法に関する。
　創薬開発や分子生物学研究において細胞培養技術によって培養した細胞やマウス等の実験動物が、薬剤の薬理活性評価や毒性試験のシミュレーターとして使用されている。
　一方で、従来の平面細胞培養技術で培養した細胞では、細胞が二次元方向に広がった単層細胞であるため、生体内と同等の三次元組織を構築することができず、また、細胞が体内で有している特異的な機能を長時間維持することができず、そのことに起因してシミュレーションの精度が担保できないという問題があった。
　また、マウス等の実験動物により生体組織そのものをシミュレーターとして用いる場合、取り扱いが不便であることや、複数の細胞から構成される複雑系の組織であるため、シミュレーションのスループットや得られるデータの精度に課題があった。
　そこで近年、生体内と同等の機能を有する三次元組織であるスフェロイド培養が注目されている。例えば、底面がロート状のウェルに複数の単一細胞を播種し、底面でこの単一細胞を凝集及び分散させてスフェロイドを培養するもの（特許文献１）や、所定のポリマー混合物のキャスト液表面に水を結露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発させることにより得られるハニカム構造体上でスフェロイドを培養するものがある（特許文献２）。
　さらに、本発明者らは、形状や大きさ、材質が制御された細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体及びスフェロイド付き容器を開発し、培養底面に付着した制御されたスフェロイド培養を行うことに成功している（特許文献３）。
　スフェロイド培養においては、スフェロイド中心部と周辺部の微小環境における酸素濃度の違いが、スフェロイドの品質や、スフェロイドによる生体のがん組織等の状態の再現に影響を及ぼすことが知られており、スフェロイド培養における酸素濃度測定はスフェロイド培養研究において重要な課題となっている。
　生体組織あるいは細胞中の酸素濃度を非侵襲的にリアルタイムで検出する方法の開発は、細胞生物学や医療の分野において重要な課題となっている。生体組織中の酸素濃度を定量するための従来法としては、（１）微小電極を組織に挿入して測定する方法、（２）常磁性プローブ分子のＥＳＲ信号幅が周辺の酸素濃度に依存して変化することを利用する方法、（３）ニトロイミダゾール系低酸素組織診断薬剤を使う方法、（４）水溶性ポルフィリン誘導体、ルテニウム錯体等の発光測定に基づく酸素濃度測定法、などが知られている。（１）の微小電極を用いる方法は、電極近傍の一点における酸素分圧しか測定できない。また、侵襲性であるという欠点を持つ。（２）のＥＳＲ信号に基づく方法では、リアルタイムでの酸素濃度測定はできない。（３）のニトロイミダゾール系薬剤を用いる方法は、低酸素細胞内でニトロイミダゾールが還元されて細胞内タンパク質に結合しトラップされることを利用する。この方法では、薬剤の代謝に時間を要するため、薬剤投与後数時間経過しないとデータが得られない、という欠点をもつ。（４）の方法は、水溶性ポルフィリン誘導体やルテニウム錯体のりん光寿命が血中酸素濃度に依存して変化する（消光を受ける）ことを利用して酸素濃度を定量する方法である。この方法は、非侵襲で組織における酸素分圧を可視化できるという大きな利点を有するが、試薬が水溶性であるため、得られるデータは血中酸素濃度に限られる。
　前記方法に加えて、群馬大学飛田らは、りん光を発することが知られているイリジウム（ＩＩＩ）錯体を用いて平面培養細胞及び生体組織中における酸素濃度測定方法を開発している（特許文献４）。
特開平６－３２７４６２号公報 特開２００２－３３５９４９号公報 特許４１５９１０３号公報 特開２０１０－４４０５９号公報
　しかしながら、平面細胞培養における酸素濃度測定は、低酸素化の培養環境から酸素雰囲気下の測定環境へ移行した際に、細胞内の低酸素状態が速やかに解消するため、リアルタイムの低酸素状態の測定が難しい課題があった。加えて、スフェロイド培養における酸素濃度を、リアルタイムかつスフェロイドに非侵襲的かつ毒性を与えない方法で測定をすることは困難であった。
　そこで、本発明は、生体組織シミュレーターとしてのスフェロイド培養において、スフェロイドに対する毒性の低い酸素濃度測定試薬およびこれを用いた酸素濃度測定方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、酸素濃度に応じてりん光を発する複数の化合物の中から、イリジウム錯体であるＣ－ｃｉｓ，Ｎ－ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２－（２’－ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）－ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ－Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）（以下、ＢＴＰ）が、他の派生体のイリジウム錯体よりもスフェロイド内の酸素濃度測定に有効であり、なおかつ毒性の低い化合物であることを見出した。また、ＢＴＰをスフェロイドの内部へ導入するためには一定以上のＢＴＰ濃度が必要であり、当該必要濃度とＢＴＰ添加時のスフェロイドのサイズに相関関係があることを見出した。さらに、ＢＴＰをスフェロイドの内部へ導入するためには一定時間以上の処理時間が必要であり、当該処理時間とスフェロイドのサイズに相関関係があることを見出した。加えて、ＢＴＰが細胞毒性を示す上限濃度を見出した。そして、ＢＴＰが発するりん光の強度やりん光寿命の変化を指標としてスフェロイド内の酸素濃度を測定する方法を見出し、本発明を完成させた。
　本発明の要旨は以下の通りである。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定試薬は、ＢＴＰを含有することを特徴とする。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定方法は、（ａ）スフェロイド形成可能な培養基材上で細胞を培養する工程と、（ｂ）前記細胞とＢＴＰとを接触させる工程と、（ｃ）りん光の変化を指標としてスフェロイド内の酸素濃度を評価する工程と、を含むことを特徴とする。
　この場合、スフェロイドのサイズが１００μｍ以上になるまで培養した後にＢＴＰを終濃度２．５μＭ以上となるように添加し、当該スフェロイドを１時間より長く培養することが好ましい。
　また、スフェロイドのサイズが３００μｍ以上になるまで培養した後にＢＴＰを終濃度１μＭ以上となるように添加するか、スフェロイドのサイズが５００μｍ以上になるまで培養した後にＢＴＰを終濃度２．５μＭ以上となるように添加することが好ましい。
　さらに、ＢＴＰは終濃度５μＭ以下となるように培養液に添加することが好ましい。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定試薬およびスフェロイド内酸素濃度測定方法を用いることにより、例えばがん研究において、スフェロイド内の酸素濃度をリアルタイムで測定し、がん組織の微小環境における酸素濃度変化が及ぼす影響を評価することができる。これにより、がんメカニズム解明に寄与することが可能となる。
スフェロイドに対するＢＴＰの細胞毒性を示すグラフ。ＨＴ－２９細胞のスフェロイドにおける結果を（ａ）、ＭｉａＰａＣａ２細胞のスフェロイドにおける結果を（ｂ）、Ｐａｎｃ－１細胞のスフェロイドにおける結果を（ｃ）に示す。なお、縦軸は濃度０μＭを１としたときの細胞の生存率を、横軸はＢＴＰの濃度を示す。 スフェロイドに対するＢＴＰ－ＮＨ２の細胞毒性を示すグラフ。ＨＴ－２９細胞のスフェロイドにおける結果を（ａ）、ＭｉａＰａＣａ２細胞のスフェロイドにおける結果を（ｂ）、Ｐａｎｃ－１細胞のスフェロイドにおける結果を（ｃ）に示す。なお、縦軸は濃度０μＭを１としたときの細胞の生存率を、横軸はＢＴＰ－ＮＨ２の濃度を示す。 スフェロイドに対するＢＴＰ－ＮＭｅ２の細胞毒性を示すグラフ。ＨＴ－２９細胞のスフェロイドにおける結果を（ａ）、ＭｉａＰａＣａ２細胞のスフェロイドにおける結果を（ｂ）、Ｐａｎｃ－１細胞のスフェロイドにおける結果を（ｃ）に示す。なお、縦軸は濃度０μＭを１としたときの細胞の生存率を、横軸はＢＴＰ－ＮＭｅ２の濃度を示す。 ＨＴ－２９細胞におけるＢＴＰのスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 ＢＴ－４７４細胞におけるＢＴＰのスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 ＭｉａＰａＣａ２細胞におけるＢＴＰのスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 Ｐａｎｃ－１細胞におけるＢＴＰのスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 ＨＴ－２９細胞におけるＢＴＰ－ＮＨ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ－ＮＨ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 ＢＴ－４７４細胞におけるＢＴＰ－ＮＨ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ－ＮＨ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 ＭｉａＰａＣａ２細胞におけるＢＴＰ－ＮＨ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ－ＮＨ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 Ｐａｎｃ－１細胞におけるＢＴＰ－ＮＨ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ－ＮＨ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 ＨＴ－２９細胞におけるＢＴＰ－ＮＭｅ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ－ＮＭｅ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 ＢＴ－４７４細胞におけるＢＴＰ－ＮＭｅ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ－ＮＭｅ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 ＭｉａＰａＣａ２細胞におけるＢＴＰ－ＮＭｅ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ－ＮＭｅ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 Ｐａｎｃ－１細胞におけるＢＴＰ－ＮＭｅ２のスフェロイド内低酸素センシング能を示した写真図。ＢＴＰ－ＮＭｅ２各種濃度における明視野像および蛍光観察像である。培養３日目を（ａ）、培養７日目を（ｂ）に示す。なお倍率は２００倍である。 ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅで培養したＨＴ－２９細胞におけるＢＴＰのスフェロイド内浸透を示した写真図。ＢＴＰ各種濃度における明視野像及び蛍光観察像の合成画像である。ウェルあたりの細胞数３０００を（ａ）、７５０を（ｂ）に示す。 ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅで培養したＨＴ－２９細胞におけるＢＴＰの経過時間に伴うスフェロイド内への浸透を示した写真図。ＢＴＰ２．５μＭにおける明視野像及び蛍光観察像の合成画像である。ウェルあたりの細胞数３０００を（ａ）、７５０を（ｂ）に示す。 ＮＣＰで培養したＨＴ－２９細胞におけるＢＴＰの経過時間に伴うスフェロイド内への浸透を示した写真図。ＢＴＰ２．５μＭにおける明視野像及び蛍光観察像の合成画像である。ウェルあたりの細胞数３０００を（ａ）、７５０を（ｂ）に示す。
　本発明において、スフェロイドとは、３次元的に細胞同士が集合・凝集した細胞集合体を指し、例えば球状や房状に細胞同士が集合・凝集したものを指す。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定試薬は、Ｉｒ（ＩＩＩ）を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする金属錯体であるＢＴＰを含有するものである。
　当該ＢＴＰは、周辺の酸素濃度に応じてりん光を発することができる。すなわち、酸素濃度が低い場合には強度の大きいりん光を発し、酸素濃度が高い場合には強度の小さいりん光を発する。それゆえ、本発明のスフェロイド内酸素濃度測定試薬を用いれば、スフェロイドの内部の酸素濃度の変化をリアルタイムで評価することができる。なお、当該ＢＴＰが発するりん光は、周辺の酸素濃度に応じて消光されるため、りん光寿命を測定することにより、細胞及びスフェロイド内部の酸素濃度を定量的に測定することができる。
　測定対象となる細胞は、特に限定されず、いかなる細胞であっても良いが、株化培養細胞や初代培養細胞などが例示され、例えば、各種前駆細胞および幹細胞を含む、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、膵臓細胞、乳腺細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、樹状細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、各種血液系細胞、その他間葉系前駆細胞および幹細胞、ＥＳ細胞、及びこれら由来の各種がん細胞等が挙げられる。なお、細胞は単一の細胞に限らず、複数の細胞種の集合体であっても良い。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定方法は、スフェロイド形成可能な培養基材上で細胞を培養する工程と、前記細胞とＢＴＰとを接触させる工程と、りん光の変化を指標としてスフェロイド内の酸素濃度を評価する工程と、を含むことを特徴とするものである。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定方法における、スフェロイド形成可能な培養基材とは、通常の単層培養に用いられる培養基材よりも細胞との接着性が抑制されているものであれば特に限定されるものではないが、例えば、培養基材表面の親水性又は疎水性を改質したもの等を用いることができる。
　培養基材の材質は、細胞に対し無毒性のものであればどのようなものでも良く、例えば、「ポリスチレン」、「ポリエチレン」、「ポリプロピレン」、「ポリイミド」、「ポリ乳酸やポリ乳酸－ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン等の生分解性ポリマー」、「ポリメチルペンテン等のポリオレフィン樹脂」、「環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）や環状オレフィン重合体（ＣＯＰ）等の環状オレフィン系熱可塑性樹脂」、「アクリル樹脂」、「光硬化性樹脂や熱硬化性樹脂等のその他の樹脂」、「酸化アルミニウム等の金属」、「ガラス」、「石英ガラス」、「シリコン」等を用いることができる。また、シリコンやガラス等からなる基板本体の表面に、「樹脂」、「フォトレジスト」、「酸化アルミニウム等の金属」等の被覆層が形成されたものを用いることもできる。
　培養基材の表面は、細胞接着面として機能し得る限り、紫外線照射、ガンマ線照射、プラズマ照射や、種々の物質のコーティング等といった、細胞の接着性を制御するための処理が施されていても良い。
　また、細胞接着面として機能する所定の凹凸構造を有する培養基材を用いて行っても良い。
　凹凸構造としては、培養する細胞の性質に応じて、線状（ラインアンドスペース）、ピラー状、ホール状等、種々の形状とすることができるが、好ましくは、所定の平面形状からなる単位構造を規則的に複数配列した構造の方が良い。例えば、平面形状が多角形である単位構造を複数連続したものとすることができる。この時、等方的に均一な構造上で細胞を成長させることができるという点で、正三角形、正方形、正六角形等の正多角形や、円形のものがより好ましい。また、ピラー状やホール状の凹凸構造と、平面形状からなる単位構造から形成される凹凸構造とを組み合わせることも可能である。なお、培養細胞を生体内での状態に近付けるという観点からは、凸部の線幅は、３μｍ以下、２μｍ以下、１μｍ以下、７００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下というように、小さくなるほど好ましい。当該線幅が小さくなるほど、凹凸構造面に接着した細胞は、多くの仮足を成長させながらスフェロイドを形成することができると考えられるためである。
　また、単位構造の深さは、培養する細胞の性質に応じて、１ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、５００ｎｍ以上、１μｍ以上、１０μｍ以上、１００μｍ以上等種々の大きさに形成される。また、この凹凸のアスペクト比としては、０．２以上、０．５以上、１以上、２以上等種々のものがある。
　また、単位構造の最小内径（好ましくは最大内径）は、３μｍ以下であることが好ましく、２μｍ以下、１μｍ以下、７００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下というように、小さくなるほど好ましい。ここで、内径とは、単位構造に外接する２本の平行線間の距離を意味する。したがって、最小内径とは、単位構造に外接する二本の平行線間の距離のうち最も短いものを言い、最大内径とは、単位構造に外接する二本の平行線間の距離のうち最も長いものを言う。例えば、単位構造が正六角形の場合には、対向する平行な辺と辺との間の距離が最小内径となり、対向する頂点間の距離が最大内径となる。また、単位構造が長方形の場合には、短辺の長さが最小内径となり、対角線の長さが最大内径となる。
　凹凸構造の形成方法は、いかなる方法であっても良いが、例えば、ナノインプリント技術、溶液キャスト法、エッチング、ブラスト、コロナ放電等を用いることができる。この時、より精密に形状等を制御できる点で、ナノインプリント技術による方法が好ましい。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定方法において、スフェロイドの形成に用いられる細胞は、特に限定されず、いかなる細胞であっても良いが、株化培養細胞や初代培養細胞などが例示され、例えば、各種前駆細胞および幹細胞を含む、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、膵臓細胞、乳腺細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、樹状細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、線維芽細胞、各種血液系細胞、その他間葉系前駆細胞および幹細胞、ＥＳ細胞、及びこれら由来の各種がん細胞等が挙げられる。なお、細胞は単一の細胞に限らず、複数の細胞種の集合体であっても良い。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定方法において、細胞とＢＴＰとを接触させるタイミングは特に限定されず、例えば、細胞播種と同時、細胞播種後１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後にＢＴＰを培養液に添加すれば良いが、当該添加のタイミングはスフェロイドが形成された後であることが好ましい。さらに、形成されたスフェロイドのサイズがある程度の大きさを有していることが好ましい。当該スフェロイドのサイズは、例えば１０μｍ以上、５０μｍ以上、１００μｍ以上、２００μｍ以上、２５０μｍ以上、３００μｍ以上、４００μｍ以上、５００μｍ以上とすることができ、特に３００μｍ以上であることが好ましい。スフェロイドのサイズが小さいと、低酸素状態の評価を行うのに十分なりん光の強度を得ることができないためである。また、スフェロイドのサイズが大きいほうが、スフェロイド外部と内部の酸素環境が異なり、低酸素状態の評価を行うのに適しているためである。なお、本発明におけるスフェロイドのサイズとは、スフェロイドが球状ではない場合には、スフェロイド内において薬剤が最も届きにくい点をＰとしたとき、当該点Ｐとスフェロイド表面との最短距離ｒを意味する。通常は、スフェロイド内の任意の点とスフェロイド表面との最短距離ｒのうち最大のものｒｍａｘが該当すると思われる。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定方法において、細胞とＢＴＰとを接触させた後に細胞を培養する時間（すなわちＢＴＰの曝露時間）は、スフェロイド内にＢＴＰが十分に浸透する時間であれば特に限定されるものではないが、例えば１時間以上、２時間以上、４時間以上、１０時間以上、２４時間以上とすることができる。なお、スフェロイド内にＢＴＰが十分に浸透するのに要する時間は、スフェロイドのサイズが小さいほど少ない。すなわち、スフェロイドのサイズが小さいほどＢＴＰの曝露時間は少なくて良いことになる。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定方法において、細胞とＢＴＰとを接触させる際のＢＴＰ量は、スフェロイド内にＢＴＰが十分に浸透し、かつ、細胞毒性を示さない（または細胞毒性の低い）量であれば特に限定されるものではないが、例えば終濃度が０．５μＭ以上、１μＭ以上、２．５μＭ以上、５μＭ以上、１０μＭ以上となるように培養液に添加することができる。
　ここで、ＢＴＰを添加する際のスフェロイドのサイズと添加するＢＴＰ量との間には相関関係がある。前述したように、スフェロイドのサイズが小さいほど、ＢＴＰがスフェロイド内部に浸透し易いためである。例えば、スフェロイドのサイズが３００μｍ以上の場合には、添加するＢＴＰは１μＭ以上とするのが好ましい。また、スフェロイドのサイズが５００μｍ以上の場合には、添加するＢＴＰは２．５μＭ以上とするのが好ましい。
　さらに、ＢＴＰを添加する際のスフェロイドのサイズと添加するＢＴＰの処理時間の間には相関関係がある。スフェロイドのサイズが小さいほど、ＢＴＰがスフェロイド内部に浸透しやすいためである。例えば、スフェロイドのサイズが１００μｍ以上の場合にはＢＴＰの処理時間は１時間より長くすることが好ましい。
　本発明のスフェロイド内酸素濃度測定方法において、りん光の強度及びりん光寿命は、ＢＴＰを添加して所定の時間、細胞を培養した後に、ＢＴＰを励起して、蛍光顕微鏡、蛍光測定装置、りん光測定装置、りん光寿命測定装置等を用いて観察・測定することができる。
　赤色りん光を示すＢＴＰ及び、ＢＴＰの発光特性にほとんど関与しない補助配位子であるアセチルアセトン配位子に代えて、末端にアミノ基を有する配位子を配位させたＢＴＰ－ＮＨ２、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ基を有する配位子を配位させたＢＴＰ－ＮＭｅ２をスフェロイドに作用させ、スフェロイドに対する細胞毒性を調査した。あわせてスフェロイド内低酸素強度を示す赤色りん光の観察を実施した。
　細胞株は、大腸がん細胞株ＨＴ－２９、乳がん細胞株ＢＴ－４７４、膵臓がん細胞株ＭｉａＰａＣａ２及びＰａｎｃ－１の４種類を用いた。また、各種がん細胞株のスフェロイドを得るために、ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ（登録商標）Ｐｌａｔｅ（以下、ＮＣＰ）（ＳＣＩＶＡＸライフサイエンス社）を用いて３次元培養を行った。
　上記４種の細胞株について細胞懸濁液を細胞密度１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＮＣＰ（ＬＳ９６）に播種し、播種と同時にＢＴＰ、ＢＴＰ－ＮＨ２およびＢＴＰ－ＮＭｅ２を終濃度０～１０μＭの範囲で培地に添加し、７日間培養を行った。
　培養日数３日目及び７日目にＢＴＰ及びその派生体の各種濃度について、スフェロイド内の低酸素強度を調査するために蛍光顕微鏡を用いて明視野像及び蛍光観察像を取得した。蛍光顕微鏡観察には、ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＳ１００（Ｎｉｋｏｎ）及びＧ－２Ａフィルターセットを用いた。
　蛍光観察後、ＨＴ－２９、ＭｉａＰａＣａ２及びＰａｎｃ－１、３種類のそれぞれの細胞毒性を評価するために各ポイントｎ＝３についてＡＴＰアッセイを行った。ＡＴＰアッセイにはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
　ＢＴＰは５μＭでは３種類の細胞株に対しておよそ生存率８０％と弱い細胞毒性を示した（図１）。これに対して、ＢＴＰ－ＮＨ２は、５μＭでは３種類の細胞株に対して生存率０％であった（図２）。また、ＢＴＰ－ＮＭｅ２は５μＭでは３種類の細胞株に対しておよそ生存率０％であった（図３）。２μMにおいてもＭｉａＰａＣａ２（図３ｂ）を除く２種の細胞株（図３ａおよび図３ｃ）において生存率５０％を下回っており、ＢＴＰに比べて高い細胞毒性を示した。これにより、ＢＴＰは他のＢＴＰ派生体に比べて毒性が低いことがわかる。
　ＢＴＰを添加したスフェロイドの蛍光顕微鏡観察では、濃度依存的にりん光シグナルが増しており、５μＭ以上でスフェロイド内部に強いりん光シグナルを示した（図４、５、６及び７）。このシグナルはスフェロイドサイズが大きくなるに従い、また細胞間接着が強くなるに従い、強くなる傾向が観察された。
　ＢＴＰ－ＮＨ２を添加したスフェロイドの蛍光顕微鏡観察では、１μＭでスフェロイド内部にりん光シグナルを示したが、それ以上の濃度においてはその強い細胞毒性によりスフェロイドサイズが小さくなる、あるいはスフェロイドが見られなくなった（図８、９、１０及び１１）。
　ＢＴＰ－ＮＭｅ２を添加したスフェロイドの蛍光顕微鏡観察では、細胞傷害性のある２μＭで一部の細胞株において強いシグナルを示したが、全体としてりん光シグナルは弱い傾向にあった。また、２μＭ以上の濃度においてはその強い細胞毒性によりスフェロイドサイズが小さくなる、あるいはスフェロイドが見られなくなった（図１２、１３、１４及び１５）。
　細胞毒性の低いＢＴＰを用いてスフェロイド内への浸透試験を行った。３次元培養はＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（住友ベークライト）及びＮＣＰを用いて７日間行った。細胞はＨＴ－２９細胞を用い、３０００ｃｅｌｌｓ／ウェル、７５０ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞数でスフェロイドを形成した。観察は明視野及び蛍光顕微鏡で行った。
培養６日目に、ＢＴＰを終濃度０、０．５、１、２．５、５、１０μＭで添加し、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅで２４時間培養を行い、明視野及び蛍光顕微鏡観察を行った結果、３０００ｃｅｌｌｓ／ウェルで形成したスフェロイドは、スフェロイドのサイズが約５００μｍになっており、ＢＴＰ濃度１μＭ以下では、スフェロイド内にＢＴＰが十分浸透していなかった。一方で、７５０ｃｅｌｌｓ／ウェルで形成したスフェロイドは、スフェロイドのサイズが約３００μｍになっており、ＢＴＰ０．５μＭ以下では、スフェロイド内にＢＴＰが十分浸透していなかった（図１６）。
　同じく培養６日目に、ＢＴＰを終濃度２．５μＭで添加し、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅで１、４、１０、２４時間培養を行い、明視野及び蛍光顕微鏡観察を行った結果、３０００ｃｅｌｌｓ／ウェルで形成したスフェロイドは、スフェロイドのサイズが約５００μｍになっており、培養時間１０時間以下では、スフェロイド内にＢＴＰが十分浸透していなかった。一方で、７５０ｃｅｌｌｓ／ウェルで形成したスフェロイドは、スフェロイドのサイズが約３００μｍになっており、培養時間４時間以下では、スフェロイド内にＢＴＰが十分浸透していなかった（図１７）。
　同じく培養６日目に、ＢＴＰを終濃度２．５μＭで添加し、ＮＣＰで１、４、１０、２４時間培養を行い、明視野及び蛍光顕微鏡観察を行った結果、培養１時間において、スフェロイドのサイズが約５０μｍに満たない場合は、ＢＴＰがスフェロイド内部まで浸透していたものの、スフェロイドサイズが約１００μｍの場合には、ＢＴＰがスフェロイド内に十分浸透していないことが観察できた。（図１８）。

Claims (6)

  1. 　Ｃ－ｃｉｓ，Ｎ－ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２－（２’－ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）－ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ－Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）を含有することを特徴とするスフェロイド内酸素濃度測定試薬。
  2. 　（ａ）スフェロイド形成可能な培養基材上で細胞を培養する工程と、（ｂ）前記細胞とＣ－ｃｉｓ，Ｎ－ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２－（２’－ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）－ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ－Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）とを接触させる工程と、（ｃ）りん光の変化を指標としてスフェロイド内の酸素濃度を評価する工程と、を含むことを特徴とするスフェロイド内酸素濃度測定方法。
  3. 　前記工程（ａ）はスフェロイドのサイズが１００μｍ以上になるまでスフェロイドを培養する工程であり、前記工程（ｂ）はＣ－ｃｉｓ，Ｎ－ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２－（２’－ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）－ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ－Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）を終濃度２．５μＭ以上となるように培養液に添加し、当該スフェロイドを１時間より長く培養する工程である、ことを特徴とする請求項２記載のスフェロイド内酸素濃度測定方法。
  4. 　前記工程（ａ）はスフェロイドのサイズが３００μｍ以上になるまでスフェロイドを培養する工程であり、前記工程（ｂ）はＣ－ｃｉｓ，Ｎ－ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２－（２’－ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）－ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ－Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）を終濃度１μＭ以上となるように培養液に添加し、当該スフェロイドを所定の時間培養する工程である、ことを特徴とする請求項２記載のスフェロイド内酸素濃度測定方法。
  5. 　前記工程（ａ）はスフェロイドのサイズが５００μｍ以上になるまでスフェロイドを培養する工程であり、前記工程（ｂ）はＣ－ｃｉｓ，Ｎ－ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２－（２’－ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）－ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ－Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）を終濃度２．５μＭ以上となるように培養液に添加し、当該スフェロイドを所定の時間培養する工程である、ことを特徴とする請求項２記載のスフェロイド内酸素濃度測定方法。
  6. 　前記工程（ｂ）はＣ－ｃｉｓ，Ｎ－ｔｒａｎｓ，ｂｉｓ［２－（２’－ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙｌ）－ｐｙｒｉｄｉｎａｔｏ－Ｎ，Ｃ３’］ｉｒｉｄｉｕｍ（ａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ）を終濃度５μＭ以下となるように培養液に添加する工程を含む請求項３乃至５に記載のスフェロイド内酸素濃度測定方法。
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