WO2015003581A1 - 抑制hiv感染的二价多肽 - Google Patents

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WO2015003581A1
WO2015003581A1 PCT/CN2014/081616 CN2014081616W WO2015003581A1 WO 2015003581 A1 WO2015003581 A1 WO 2015003581A1 CN 2014081616 W CN2014081616 W CN 2014081616W WO 2015003581 A1 WO2015003581 A1 WO 2015003581A1
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seq
formula
polypeptide
aca
pharmaceutically acceptable
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刘克良
凌彦博
姜喜凤
薛慧芳
王昆
蔡利锋
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中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention belongs to the field of biomedicine and relates to a polypeptide against HIV infection. Specifically, the present invention relates to a bivalent polypeptide represented by Formula I or Formula II, a derivative thereof, a stereoisomer thereof, or no physiological toxicity thereof. Salt.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition comprising a bivalent polypeptide of formula I or formula II, a derivative thereof, a stereoisomer thereof, or a salt thereof which is not physiologically toxic, and a bivalent polypeptide of formula I or formula Use of a derivative thereof, a stereoisomer thereof, or a physiologically toxic salt thereof for the preparation of a medicament for treating or preventing a disease associated with HIV infection, particularly Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) .
  • AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • HIV-1 HIV-1
  • HIV-2 HIV-1 is one of the more popular ones.
  • Env The infection of human host cells by HIV-1 virus requires a process of fusion of the viral membrane with the target cell membrane. Such a process needs to be enveloped by a viral glycoprotein (Env).
  • Env consists of two parts, a surface subunit gpl20 that binds to the host cell, and a transmembrane subunit gp41 that binds to the host to mediate membrane fusion.
  • Gp41 is inserted into a host cell through its amino-terminal fusion peptide to promote the fusion process of the viral membrane with the target cell membrane.
  • the completion of the fusion state requires the viral gp41 N-terminal repeat (N-HR) and C-terminal repeat (C-HR) folding A six-helix bundle (6-HB) is formed.
  • Inhibitors of the glycoprotein gp41 acting on the HIV-1 virus surface are also known as fusion inhibitors, of which T-20 is currently the only polypeptide-based HIV fusion inhibitor for clinical use.
  • the peptide or small molecule fusion inhibitor of this fusion link competitively binds to the gp41 target exposed in the process to inhibit the formation of the virus itself 6-HB, thereby inhibiting the virus from invading the human immune cells.
  • the trivalent HIV inhibitor designed by Hirokazu et al., with a C34-based sequence, has a cell fusion IC 5Q value of 1.3 nm, which is about 34-fold more active than the starting sequence (W. Nomura, C Hashimoto, A. Ohya, K. Miyauchi, E. Urano, T. Tanaka, T. Narumi, T. Nakahara, J. a. Komano, N. Yamamoto, H. Tamamura, ChemMedChem 2012, 7, 205-208. ). Summary of the invention
  • the object of the present invention is to find a bivalent anti-HIV substance having a relatively high biological activity starting from a shorter sequence.
  • the bivalent polypeptide of the formula I or formula, or a derivative thereof, a stereoisomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof has good activity for inhibiting target cells infected with HIV, and thus can be used as a medicament for treating or preventing HIV. Infection, thus completing the present invention.
  • a first aspect of the invention relates to a bivalent polypeptide, derivative, stereoisomer or pharmaceutically acceptable salt thereof, of formula I or formula II: among them
  • C is L-form or D-type cysteine
  • Z is a polypeptide sequence of L-form or D-form
  • a disulfide bond is used between the two monovalent polypeptide chains.
  • the composition of the non-natural amino acid is selected from the group consisting of ⁇ -alanine (BAla), 6-aminocaproic acid (Aca), and triethylene glycol (ethylene group having one end amino group and one end carboxyl group).
  • BAla ⁇ -alanine
  • Aca 6-aminocaproic acid
  • triethylene glycol ethylene group having one end amino group and one end carboxyl group.
  • Teg NH 2 -CH 2 CH 2 -0-CH 2 CH 2 -0-CH 2 CH 2 -0-CH 2 CH 2 -0-CH 2 CH 2 -COOH.
  • Z is selected from the group consisting of:
  • the bivalent polypeptide of Formula I or Formula II is selected from the group consisting of:
  • a disulfide bond is used between the two monovalent polypeptide chains.
  • the natural amino acid includes alanine (Ala), cineine (Val), leuco acid (Leu), isoleucine (ne), proline (Pro), phenylalanine. (Phe), tryptophan (Trp), melitic acid (Met), saccharate (Gly), serine (ser), threonine (Thr), half; acid (Cys), tyrosine (Tyr ), Asn, Gin, Lys, Arginine (Arg), Histidine (His), Aspartic Acid (Asp), Acid (Glu).
  • the GGSTeg means glycine glycine threonine plus Teg.
  • the above compound number [(1) ⁇ (22)] represents the compound (bivalent polypeptide).
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising at least one bivalent polypeptide of the formula I or formula ⁇ of any one of the first aspects of the invention, a derivative thereof, a stereoisomer, or a pharmaceutically acceptable An acceptable salt, and, optionally, a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • a further aspect of the invention relates to a bivalent polypeptide, derivative, stereoisomer, or pharmaceutically acceptable salt thereof of Formula I or Formula ⁇ of any one of the first aspects of the invention for the preparation of an HIV fusion inhibitor Use in.
  • a further aspect of the invention relates to an HIV fusion inhibitor comprising at least one A divalent polypeptide, derivative, stereoisomer, or pharmaceutically acceptable salt thereof of Formula I or Formula II according to any one of the first aspects of the invention.
  • a further aspect of the invention relates to a bivalent polypeptide, derivative, stereoisomer, or pharmaceutically acceptable salt thereof of Formula I or Formula ⁇ of any one of the first aspects of the invention, for use in the preparation of a therapeutic or Use in the prevention of HIV-related diseases, especially AIDS drugs.
  • Still another aspect of the present invention relates to a method of treating or preventing a disease associated with HIV infection, particularly AIDS, the method comprising administering to a subject receiving treatment or prevention an effective amount of Formula I or Formula 1 of any one of the first aspects of the present invention.
  • the HIV means HIV-1 or HIV-2, preferably HIV-1.
  • the monovalent polypeptide and the monomer of the bivalent polypeptide have the same meaning, meaning
  • the disulfide bond means -S - S -.
  • the (C-LrZ refers to 0 -L factory Z , where ⁇
  • the present inventors synthesized a bivalent polypeptide by a certain method, and a disulfide bond was used between two polypeptide chains of a bivalent molecule to synergistically act on two polypeptide sequences to enhance the target. Inhibition of activity, design of highly active HIV fusion inhibitors, explored new ideas for inhibiting HIV infection. detailed description
  • Env envelope glycoprotein
  • HIV Human Immunodeficiency Virus 1 human immunodeficiency virus
  • HIV-1 human immunodeficiency virus type I HIV-1 human immunodeficiency virus type I
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Threonine Trp Tryptophan
  • the solid phase synthetic carrier used in the examples Rink-amide resin is the product of Tianjin Nankai Synthetic Co., Ltd.; HBTU, HOBT, DIEA and Fmoc protected natural acid based acid are products of Shanghai Jill Biochemical Co., Ltd. and Chengdu Chengnuo New Technology Co., Ltd. Trifluoroacetic acid (TFA), DMF, DCM are products of Beijing Bomaijie Technology Co., Ltd.; Chromatography Pure acetonitrile is Fisher's product. Other reagents are domestically produced pure products if they are not described.
  • Peptide synthesis using standard Fmoc solid phase methods Rink-Amide resin was selected and the peptide chain was extended from the C-terminus to the N-terminus.
  • the condensing agent is HBTU/HOBt/DIEA.
  • the deprotecting agent is a piperidine/DMF solution.
  • the cleavage agent is trifluoroacetic acid (TFA), and the crude peptide is dissolved in water and stored in lyophilization. It was isolated and purified by medium pressure liquid chromatography or high pressure liquid chromatography (HPLC) with a pure peptide content of >95%.
  • Matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry MALDI-TOF-MS was used to determine the molecular weight of the peptide sequence.
  • Rink Amide resin 0.51g (0.233mmol) of Rink Amide resin was weighed into the CS Biol36 peptide synthesizer reactor, then amino acid, activator, activated base, deprotecting reagent, blocking reagent according to the concentration (protected amino acid: 0.25M DMF solution, Activator: 0.2MHBTU/HOBt in DMF solution, activated base: 0.4MDIEA in DMF solution, deprotecting agent: 20% v/v, piperidine in DMF solution, blocking reagent: 20% v/v, acetic acid Sf in DMF solution After the configuration, synthesis was carried out using a CS Biol36 polypeptide synthesizer.
  • peptide resin was washed with DCM for 3 times, then shrunk with anhydrous methanol, and dried under vacuum at room temperature to obtain a peptide resin of 2.11.
  • the dried polypeptide was placed in a 500 ml eggplant-shaped flask, and a lysing agent (v/v) was added in a ratio of 10 ml per gram of the resin.
  • the compounds (2) - (22) were synthesized according to the above method, and T20 and C34 were synthesized as described above.
  • a 20 ⁇ !/well cell lysate was plated onto a 96-well phosphor plate.
  • the thawed luciferaseassay buffer (Promega, Fitchburg, WI, USA) was added to the luciferaseassay substrate (Promega, Fitchburg, WI, USA) and added 40 ⁇ !/well in a 96-well phosphor plate. The luminescence was detected immediately on the microplate reader. Calculate IC 5 . value.
  • the compounds (1)-(22) are corresponding to the compound numbers in the examples and the inventions of the present invention, and T20 and C34 are control drugs.
  • the structure of C34 is
  • the structure of WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL, T20 (Fuzeon or enfuvirtide) is YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF.
  • the experimental results show that most of the compounds of the present invention can be compared with their monomers. More effectively inhibit HIV-1 mediated cell fusion,

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Abstract

本发明公开了一种式I或式II的抗HIV感染的二价多肽、其衍生物、立体异构体、或药学上可接受的盐。本发明还公开了包含所述多肽、其衍生物、立体异构体、或药学上可接受的盐的药物组合物，及其在制备治疗或预防HIV感染导致的疾病的药物中的用途。式I：(C-L1-Z)2　式II：(Z-L1-C)2

Description

抑制 H IV感染的二价多肽 技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种抗 HIV感染的多肽，具体地， 本发明涉及如式 I或式 II所示的二价多肽、其衍生物、其立体异构体、 或其无生理毒性的盐。 本发明还涉及含有式 I或式 II所述的二价多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒性的盐的药物组合物， 以及 式 I或式 Π所示二价多肽、 其衍生物、 其立体异构体、 或其无生理毒 性的盐在制备治疗或预防 HIV感染所致相关疾病尤其是获得性免疫 缺陷综合征 ( Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS ) 的药物 中的用途。 背景技术
人类免疫缺陷病毒 ( Human Immunodeficiency Virus, HIV )是一 种感染人类免疫***细胞的慢病毒（Lentivirus ) , 属反转录病毒的 一种。 普遍认为， 人类免疫缺陷病毒的感染导致艾滋病 （AIDS, Acquired Immune Deficiency Syndrome , 获得性免疫缺乏综合症, 或 译作"艾滋病"） ， 艾滋病是由后天性细胞免疫功能出现缺陷而导致严 重随机感染或继发肿瘤并致命的一种疾病。 而根据***艾滋病规划 署和世界卫生组织统计， 自 1981年首度证实以来， AIDS已夺取超过 3,000万人的性命，使它成为史上最具破坏力的流行病之一，截至 2011 年 6月底世界上约有 6,400万人感染 HIV。 HIV病毒分为两种： HIV-1, HIV-2 o HIV-1是其中较为流行的一种。 HIV-1病毒对人体宿主细胞 的感染需要经历病毒膜与靶细胞膜融合的过程。 而这样一个过程需要 由病毒包膜糖蛋白介导 (envelope glycoprotein, Env)。 Env由两部分构 成，识别与宿主细胞起结合作用的表面亚基 gpl20，和与宿主发生结合 作用来介导膜融合的跨膜亚基 gp41。 Gp41通过其氨基端融合肽*** 到宿主细胞， 促进病毒膜与靶细胞膜的融合过程。 而融合状态的完成 需要病毒 gp41 N末端重复序列 (N-HR)与 C末端重复序列（C-HR)折叠 形成六螺旋束 (6-HB)。 作用于 HIV-1病毒表面糖蛋白 gp41的抑制剂 亦被称为融合抑制抑制剂， 其中 T-20是目前唯一应用于临床的多肽 类 HIV融合抑制剂。这一融合环节的多肽或者小分子融合抑制剂，竟 争性地结合这一过程中暴露的 gp41靶标，以抑制病毒自身 6-HB的形 成， 从而达到抑制病毒入侵人体免疫细胞的目的。
近年来， 由于 HIV疫苗研究进展緩慢以及耐药性问题日益明显， 研发新型抗 HIV药物仍是当务之急。 相比单受体 -单配体的单价相互 作用， 基于高亲和力的， 以生物多价相互作用为基础的多价抑制剂， 正成为一种设计受体抑制剂的高效策略。 Tolbert等人报道的以 PEG 作为连接臂的二价 HIV抑制剂， 其细胞融合 IC5Q值达到了 2.3nm(J. Xiao, B. S. Hamilton, T. J. Tolbert, Bioconjugate Chem. 2010， 21， 1943-1947.)» Hirokazu等人所设计的，以 C34为起始序列的三价 HIV 抑制剂， 其细胞融合 IC5Q值达到了 1.3nm，相对于起始序列， 活性提高 了约 34倍 (W. Nomura, C. Hashimoto, A. Ohya, K. Miyauchi, E. Urano, T. Tanaka, T. Narumi, T. Nakahara, J. a. Komano, N. Yamamoto, H. Tamamura, ChemMedChem 2012， 7， 205-208.)。 发明内容
本发明的目的在于寻找以较短序列为起始序列的， 具有较高生物 活性的二价抗 HIV的物质。
发明人经研究发现式 I或式 Π所示二价多肽或其衍生物、 其立体 异构体或其药用盐，具有良好的抑制 HIV感染靶细胞的活性， 因此可 作为药物治疗或预防 HIV感染， 由此完成了本发明。
本发明第一方面涉及式 I或式 II所示的二价多肽、 其衍生物、 立 体异构体或药学上可接受的盐： 式 I 式 Π 其中
C为 L型或 D型的半胱氨酸；
是连接多肽与半胱氨酸间的连接臂， 由 1~10个、 例如 1~6 个、 例如 1~4个天然或非天然的氨基酸组成， 或者 缺失； 能够 保持二价多肽的空间灵活性， 更利于二价多肽与靶蛋白或靶标结合；
Z为 L型或 D型的多肽序列；
两条单价多肽链之间采用二硫键连接。
在本发明的实施方案中， 所述组成 的非天然氨基酸选自 β-丙 氨酸 (BAla)， 6·氨基己酸 (Aca)以及一端为氨基、 一端为羧基的三缩四 乙二醇 (Teg， NH2-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-COOH) 中的一种、 两种或三种。
在本发明的实施方案中， Z选自以下多肽：
1) WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL ( SEQ ID NO: 1) ；
2) WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN( SEQ ID NO:
2) ；
( SEQ ID NO: 3 ) ；
4) WMEWDREINNYTSLIHSLIEES ( SEQ ID NO: 4) ;
5) WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS ( SEQ ID NO: 5) ；
6) IEALIRAAEQQEKNEAALREL ( SEQ ID NO: 6 ) ；
7) WEEWDKKIEEYTKKI (SEQ ID NO: 7) 。
在本发明的实施方案中， 所述式 I或式 II二价多肽选自如下的化 合物：
(1) (C-Aca-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL )2 (SEQ ID NO: 8) ；
(2) (C-BAla-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL L)2 (SEQ ID NO: 9) ；
(3) (C-BAla-Aca-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNE
寸
Figure imgf000005_0001
ϊoz αι ί "
ί
όόνννν3) ()¾3:ΙΊ:ΙΙέ- ν3)(Ι)1Λ:ΞΙ¾¾αΑ5:ΙΑςέ- ) ί
" C)2 (SEQ ID NO: 25) ；
(19)(WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-GGS Teg-C)2 ( SEQ ID NO: 26) ；
(20)
(YTSLIHSIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Aca-C)2 (SEQ ID NO: 27) ；
(21) (WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN-Aca-C)2 (SEQ ID NO: 28) ；
(22) (WMEWDREINNYTSLIHSLIEES-Aca-C)2 ( SEQ ID NO: 29) 。
两条单价多肽链之间采用二硫键连接。
在本发明中，所述天然氨基酸包括丙氨酸（ Ala)、翔氨酸（ Val)、 亮氣酸 ( Leu)、 异亮氨酸（ ne )、脯氨酸（ Pro )、 苯丙氨酸（ Phe )、 色氨酸（Trp) 、 蛋氛酸（Met) 、 甘氛酸（ Gly )、 丝氨酸（ Ser) 、 苏 氨酸（Thr) 、 半；^酸（Cys) 、 酪氨酸 (Tyr) 、 天冬 (Asn) 、 谷氛酰胺 (Gin) 、 赖氨酸（Lys)、 精氨酸（ Arg ) 、 组氨酸（ His ) 、 天冬氨酸（Asp) 、 酸（Glu) 。
在本发明中，所述 GGSTeg是指甘氨酸甘氨酸苏氨酸再加上 Teg。 在本发明的实施方案中， 以上化合物的编号 [ (1) ~ (22)】即代 表该化合物 （二价多肽） 。 本发明的另一方面涉及一种药物组合物， 其含有至少一种本发明 第一方面任一项的式 I或式 Π所示的二价多肽、 其衍生物、 立体异构 体、 或药学上可接受的盐， 以及任选的， 药学上可接受的载体或赋形 剂。
本发明的还一方面涉及本发明第一方面任一项的式 I或式 Π所 示的二价多肽、 其衍生物、 立体异构体、 或药学上可接受的盐在制备 HIV融合抑制剂中的用途。
本发明的还一方面涉及一种 HIV融合抑制剂，其含有至少一种本 发明第一方面任一项的式 I或式 II所示的二价多肽、 其衍生物、 立体 异构体、 或药学上可接受的盐。
本发明的还一方面涉及本发明第一方面任一项的式 I或式 Π所 示的二价多肽、 其衍生物、 立体异构体、 或药学上可接受的盐在制备 用于治疗或预防 HIV感染相关疾病尤其是艾滋病的药物中的用途。
本发明的还一方面涉及一种治疗或预防 HIV感染相关疾病尤其 是艾滋病的方法， 所述的方法包括给予接受治疗或者预防的对象有效 量的本发明第一方面任一项的式 I或式 Π所示的二价多肽、 其衍生物、 立体异构体、 或药学上可接受的盐的步骤。
在本发明中，所述 HIV是指 HIV - 1或 HIV - 2，优选 HIV - 1。 在本发明中， 所述单价多肽和二价多肽的单体是同一含义，是指
C-Lx-Z
在本发明中， 所述二硫键是指- S - S -。
C—— L，一 Z
S
S
在本发明中， 所述 (C-LrZ 是指0一 L厂 Z， 其中 与 的^^
Z— L厂 (？
S
S
端（N端）相连， 所述 ( LrC 是指 Z—Li—C , 其中 与 Z的羧基 端 （C端）相连。 发明的有益效果
本发明人将具有一定活性的多肽序列， 通过一定方法合成二价多 肽，二价分子的两条多肽链之间采用二硫键的连接方式，使两条多肽序 列发挥协同作用，提高对靶标的抑制活性，设计出高活性 HIV融合抑 制剂， 探索出了抑制 HIV感染的新思路。 具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领 域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限 定本发明的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造 商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通 过市购获得的常规产品。 在本发明中使用的缩写具有下面的含义：
AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)艾滋病，
获得性免疫缺陷综合征
Ala (Alanine， A) 丙氨酸
Asn (Asparagine， N) 天冬酰氨
Arg (Arginine， R) 精醜象
Asp (Aspartic acid, D) 天冬氨酸
Cys (Cysteine， C) 半胱氨酸
DCM (Dichlorome thane) 二氯甲垸
DMF (Ν,Ν-Dimethyl malonate) 二甲基甲酰胺
Env(Envelope glycoprotein) 包膜糖蛋白
Fmoc (Fluorenylmethoxycarbonyl) 芴曱氧羰基
Gin (Glutamine , Q) 谷氨酰胺
Glu(Glutamic acid, E) 谷氨酸
6-HB (six- helix bundle) 六螺旋体
HIV ( Human Immunodeficiency Virus〕 1 人免疫缺陷病毒
HIV-1 人免疫缺陷病毒 I型
His(Histidine, H) 组氦酸
Ile(Isoleucine， I) 异亮氨酸
Leu(Leucine， L) 亮氨酸
Lys(Lysine, K) 赖氨酸
Met (Methionine , M) 甲硫氨酸
Ser(Serine, S) 丝氨酸
TFA(trifluoroacetic acid) 三氟乙酸 Thr(threonine , T) 苏氨酸 Trp(Tryptophan, W) 色氨酸
Tyr(Tyrosine , Y) 酪氨酸
Figure imgf000009_0001
下面的实例及生物活性实验进一步说明本发明， 但这并不意味着 对本发明的任何限制。
实施例所用固相合成栽体 Rink-amide树脂为天津南开合成责任 有限公司产品； HBTU、 HOBT、 DIEA以及 Fmoc保护的天然氣基酸 为上海吉尔生化公司以及成都诚诺新技术有限责任公司产品。 三氟乙 酸（TFA ) 、 DMF、 DCM为为北京博迈杰科技有限公司产品； 色谱 纯乙腈为 Fisher公司产品。 其它试剂如无说明均为国产分析纯产品。
以下化合物的编号与发明内容部分一致。
1： 化合物 (1) - ( 22 ) 的合成
多肽单体的合成：多肽合成采用标准的 Fmoc固相方法。选用 Rink -Amide树脂，肽链由 C端向 N端延长。缩合剂为 HBTU/HOBt/DIEA。 脱保护剂为哌啶 /DMF溶液。 裂解剂为三氟乙酸（TFA ) ， 粗肽水溶 解后冻干保存。 用中压液相色谱法或高压液相色谱法（HPLC )进行 分离纯化， 纯肽含量>95%。 基质辅助激光解析飞行时间质谱 ( MALDI-TOF-MS )确定肽序列分子量。
称取 Rink Amide树脂 0.51g(0.233mmol)置入 CS Biol36多肽合 成仪反应器中， 然后将氨基酸， 活化剂， 活化碱， 脱保护试剂， 封闭 试剂按浓度（保护氨基酸： 0.25M 的 DMF 溶液， 活化剂： 0.2MHBTU/HOBt的 DMF溶液，活化碱： 0.4MDIEA的 DMF溶液， 脱保护剂： 20% v/v，哌啶的 DMF溶液， 封闭试剂： 20% v/v，乙酸 Sf的 DMF溶液)配置好后， 用 CS Biol36多肽合成仪进行合成。 完成后肽 树脂用 DCM洗涤 3遍后用无水甲醇收缩， 室温真空干燥， 得肽树脂 2.11go 将干燥的多肽放入 500ml茄形瓶， 按每克树脂加入 10ml比例 加入裂解剂 （v/v，三氟乙酸：乙二硫醇:间甲盼： 水= 82.5:10:5:2.5 ) 。 冰浴搅拌条件下， 反应 2小时后， 向反应器中加入无水***充分搅拌
30分钟， 沉淀出现粗肽， G4漏斗过滤。 ***多次洗涤。 弃去乙瞇， 更换滤瓶。 向砂心漏斗中加入 30%乙酸水溶液， 充分浸泡、 洗涤固体 混合物数次， 直到粗肽产品全部溶解并转移到抽滤瓶汇中。 合并乙酸 溶液， 加入***萃取， 弃去***层， 保留乙酸溶液， 减压蒸去乙酸水 溶液中残余乙醜。 经冷冻干燥得到白色粉末。 经 RP-HPLC纯化得到 化合物 （1 ) 的单体纯品。 多肽单体的鉴定通过 MALDI-TOF质谱进 行鉴定。
二价多肽（ 1 )的合成： 将冻干的单体純品加入含 20% DMSO的 磷酸盐緩冲液（ 0.01M Na2HP04-NaH2P04，pH=7.2 )，使得多肽浓度为 2mg/ml，37。C孵育， HPLC检测反应进程。 产物经过 HPLC纯化， 冻 干后得到二价多肽（ 1 ) 即化合物（1)纯品。 二价多肽的鉴定通过 MALDI-TOF质讲进行鉴定。
按照上述方法合成化合物 （2 ) - ( 22 ) , 同时按照上述方法合 成 T20和 C34。
化合物 （1 ) - ( 22 ) 的序列分别如下：
(1) (C-Aca-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL )2 ( SEQ ID NO: 8 ) ；
(2) (C-BAla-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL L)2 ( SEQ ID NO: 9 ) ；
(3) (C-BAla-Aca-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNE QELL)2 ( SEQ ID NO: 10 ) ；
(4) (C-Aca-YTSLIHSIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN WF)2 ( SEQ ID NO: 11 ) ；
(5) (C-Aca-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN)2 ( SEQ ID NO: 12 ) ；
(6) (C-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN)2 ( SEQ ID NO: 13 ) ；
(7) (C-BAla-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN)2( SEQ /3/:/〇 9Ϊ9Ϊ80Η0ίζ1£ 18SS0SSZAV
(寸 I δζ ai ί
Figure imgf000011_0001
()8Z 60sZ ai3 ί (22) (WMEWDREINNYTSLIHSLIEES-Aca-C)2 ( SEQ 各二价多肽及多肽单体的分子量如表 1所示。 表 1 测定的多肽分子量
化合物编号 测定分子量
T20 4492.73
C34 4290.38
(1) 9010.76
(1)的单体 4506.70
(2) 8925.12
(2)的单体 4464.12
(3) 9152.43
(3)的单体 4576.40
(4) 9439.27
(4)的单体 4707.92
(5) 77782.31
(5)的单体 3383.01
(6) 7555.10
(6)的单体 3780.00
(7) 7701.30
(7)的单体 3851.90
(8) 7938.94
(8)的单体 3969.23
(9) 8079.62
(9)的单体 4038.75
(10) 6046.17
(10) 的单体 3023.76
(11) 6222.81 (11) 的单体 3111.04
(12) 6372.98
(12) 的单体 3187.29
(13) 6443.27
( 13 ) 的单体 3220.50
(14) 5341.54
(14) 的单体 2671.28
(15) 4338.1
(15) 的单体 2169.48
(16) 8760.24
(16) 的单体 4393.09
(17) 4550.21
(17) 的单体 9097.22
(18) 4505.80
(18) 的单体 9010.76
(19) 9564.23
(19) 的单体 4782.10
(20) 9412.08
(20) 的单体 4706.98
(21) 7782.31
( 21 ) 的单体 3892.91
(22) 6046.17
( 22 ) 的单体 3023.00 实施例 2: 抑制 HIV-1介导的细胞 -细胞融合活性评价 ( IC50 ) 荧光素醉报告基因表达法检测 HIV-1介导的细胞-细胞融合（H.
Nishikawa, S. Oishi, M. Fujita, K. Watanabe, R. Tokiwa, H. Ohno, E.
Kodama, K. Izumi, K. Kajiwara, T. Naitoh, M. Matsuoka, A. Otaka, N.
Fujii, Bioorg. Med. Chem.2008， 16, 9184-9187 ) ： 在 96孔板上， 取含 有 CD4受体和 CXCR4辅助受体的 TZM-bl靶细胞（来自纽约血液中 心） 悬浮液稀幹至 50万 /ml, 铺入 96孔细胞培养板， 50μ1/孔， 培养 24h。 取待测化合物， （1-10)列依次稀释四倍， 起始浓度为 1μΜ， 11 列和 12列为空白溶剂； DMSO含量 =6%。 取 HL2/3细胞（来自纽约 血液中心）悬浮液稀释至 100万 /ml,加入细胞板的（l-ll)x(A-H), 50μ1/ 孔， 第 12x(A-H)补加 50μ!/孔培养基。立即取 20μ!/孔待测 IC5Q的样品 加入细胞板， 加入顺序依次为 HL2/3细胞， 待测化合物， TZM-bl细 胞， 培养 6h。 去除细胞板中每孔中的培养基（ 120μ1/孔） ， 以 PBS洗 2次， 150μ1/次。加入稀释后的裂解液（ lx ) ( Promega, Fitchburg, WI, USA) , 50μ!/孔， 裂解 5min。 取 20μ!/孔细胞裂解液铺在 96孔磷光 板上。 将融化后的 luciferaseassay緩冲液 (Promega, Fitchburg, WI, USA)加入 luciferaseassay底物 (Promega, Fitchburg, WI, USA)中混匀， 加 40μ!/孔于 96孔磷光板中。立即在酶标仪上检测发光。计算 IC5。值。
按照上述方法， 活性测定结果见下面的表 2。 表 2: 抑制 HIV-1介导的细胞融合活性（ IC50 )
化合物编号 抑制活性（IC5()) (nM)
T20 1.65±0.22
C34 1.11±0.14
(1) 1.79±1.00
(1) 的单体 1.47±0.97
(2) 6.4±2.1
(2) 的单体 43.7±2.2
(3) 27.9±3.5
(3) 的单体 127±17
(4) 1.92±0.26
(4) 的单体 13.56±2.00
(5) 5.71±1.45
(5) 的单体 49.02±2.91
(6) 14.63±2.60
(6) 的单体 41.65±3.28
(7) 8.95±1.72
(7) 的单体 19.7±1.8 (8) 2.54±0.58
(8) 的单体 15.41±2.76
(9) 3.08±0.89
(9) 的单体 14.67±2.31
(10) 279±102
(10)的单体 561±122
(11) 4.9±3.9
(11)的单体 38.6±4.1
(12) 3.8±1.5
(12)的单体 214±23
(13) 5.4±0.6
(13)的单体 41.4±7.2
(14) 38.5±4.5
(14)的单体 35.0±12.4
(15) 9550±1279
(15)的单体 9721±1146
(16) 1.98±0.14
(16)的单体 11.25±0.25
(17) 1.53±0.18
(17)的单体 3.97±0.24
(18) 1.46±0.15
(18)的单体 3.25±0.65
(19) 12.4+2.7
(19)的单体 3.9±1.2
(20) 5.77+0.41
(20)的单体 41.79±3.28
(21) 250.38±57.96
(21)的单体 202.72±21.95
(22) 167±162
(22)的单体 179±98
其中， 化合物 (1)-(22)^别与本发明实施例及发明内容中化合物编号相对应， T20和 C34是对照药物. C34的结构为
WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL, T20(Fuzeon或称 enfuvirtide) 的结构为 YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF. 实验结果表明，本发明的大部分化合物与它们的单体相比， 能够 更有效地抑制 HIV-1 介导的细胞融合,
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人 员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修 改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

& 利 要 求
1.式 I或式 II所示的二价多肽、 其衍生物、 立体异构体或药学上 可接受的盐， 式 I， 式 π，
其中
C为 L型或 D型的半胱氨酸；
是连接多肽与半胱氛酸间的连接臂， 由 1 ~ 10个、 例如 1 ~ 6 个、 例如 1 ~ 4个天然或非天然的氛基酸组成， 或者 缺失；
Z为 L型或 D型的多肽序列；
两条单价多肽链之间采用二硫键连接。
2.权利要求 1的式 I或式 II所示的二价多肽、 其衍生物、 立体异 构体或药学上可接受的盐， 其中组成 的非天然氛基酸选自 β-丙氨 酸 (βΑ)， 6-氨基己酸 (Aca)以及一端为氨基、 一端为羧基的三缩四乙二 醇（Teg , NH2-CH2 CH2-O CH2 CH2-0- CH2CH2-0- CH2CH2- COOH)中 的一种、 两种或三种
3.权利要求 1或 2的式 I或式 II所示的二价多肽、其衍生物、立 体异构体或药学上可接受的盐， 其中 Z选自：
1) WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL ( SEQ ID NO: 1 ) ；
2) WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN ( SEQ ID NO:
2 ) ；
( SEQ ID NO: 3 ) 4) WMEWDREINNYTSLIHSLIEES ( SEQ ID NO: 4 ) ；
5) WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS ( SEQ ID NO: 5 ) ；
6) IEALIRAAEQQEKNEAALREL ( SEQ ID NO: 6 ) ；
7) WEEWDKKIEEYTKKI ( SEQ ID NO: 7 ) 。
4.权利要求 1 - 3任一项的式 I或式 II所示的二价多肽、其衍生物、 立体异构体或药学上可接受的盐， 其选自：
(1) (C-Aca-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL )2 ( SEQ ID NO: 8 ) ；
(2) (C-BAla-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL L)2 ( SEQ ID NO: 9 ) ；
(3) (C-BAla-Aca-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNE QELL)2 ( SEQ ID NO: 10 ) ；
(4) (C-Aca-YTSLIHSIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN WF)2 ( SEQ ID NO: 11 ) ；
(5) (C-Aca-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN)2 ( SEQ ID NO: 12 ) ；
(6) (C-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN)2 ( SEQ ID NO: 13 ) ；
(7) (C-BAla-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN)2( SEQ ID NO: 14 ) ；
(8) (C-Teg-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN)2 ( SEQ ID NO: 15 ) ；
(9) (C-Teg-BAla-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN)2 ( SEQ ID NO: 16 ) ；
(10) (C-Aca-WMEWDREINNYTSLIHSLIEES)2 ( SEQ ID NO:
17 ) ；
(11) (C- Aca- WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS)2 ( SEQ ID NO: (12) (C-Teg-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS)2 ( SEQ ID NO: 19 ) ；
(13) (C-Teg-BAla-WEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS)2( SEQ ID NO: 20 ) ；
(14) (C-Aca-IEALIRAAEQQEKNEAALREL)2 ( SEQ ID NO: 21 ) ；
(15) (C-Aca-WEEWDKKIEEYTKKI)2 ( SEQ ID NO: 22 ) ；
( SEQ ID NO: 23 ) ；
(17)(WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-R-C) 2 ( SEQ ID NO: 24 ) ；
C)2 ( SEQ ID NO: 25 ) ；
(19)(WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-GGS Teg-C)2 ( SEQ ID NO: 26 ) ；
(20)
(YTSLIHSIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Aca-C)2 ( SEQ ID NO: 27 ) ；
(21) (WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN-Aca-C)2 ( SEQ ID NO: 28 ) ；
(22) (WMEWDREINNYTSLIHSLIEES-Aca-C)2 ( SEQ ID NO: 29 ) 。
5.药物组合物， 其含有至少一种权利要求 1-4中任一项式 I或式 II所示的二价多肽、 其衍生物、 立体异构体或药学上可接受的盐， 以 及任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
6.权利要求 1-4任一项的式 I或式 II所示的二价多肽、其衍生物、 立体异构体或药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防 HIV感染相 关疾病 (如艾滋病)的药物中的用途。
7.权利要求 1-4任一项的式 I或式 II所示的二价多肽、其衍生物、 立体异构体或药学上可接受的盐在制备 HIV融合抑制剂中的用途。
8. HIV融合抑制剂， 其含有至少一种权利要求 1-4任一项的式 I或式 II所示的二价多肽、 其衍生物、 立体异构体或药学上可接受的 盐。
9. 一种治疗或预防 HIV感染相关疾病尤其是艾滋病的方法， 所 述的方法包括给予接受治疗或者预防的对象有效量的权利要求 1-4任 一项的式 I或式 II所示的二价多肽、 其衍生物、 立体异构体、 或药学 上可接受的盐的步骤。
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