WO2014200180A1 - 티오레독신-결합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

티오레독신-결합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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정해용
김미정
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Definitions

  • compositions comprising thioredoxin-binding protein as an active ingredient and uses thereof
  • the present invention relates to immunopotentiation, cancer metastasis suppression, and methods for preventing and treating blood diseases, or compositions for the prevention and treatment of these, comprising thiredoxin-binding protein (TXNIP) as an active ingredient.
  • TXNIP thiredoxin-binding protein
  • Oxidative stress React ive oxygen species (ROs) in cells are either accumulated excessively or are issued due to a lack of an antioxidant defense system.
  • Oxidative stress induces a variety of pathological diseases such as diabetes, degenerative brain disease and cancer (Hole et al., 2011; Sinha et al., 2013) and found that the regulation of free radicals is an important factor in hematopoietic action It became.
  • Hematopoietic cells are susceptible to oxidative stress, and malignant hematopoietic tissue has been observed under chronic oxidative stress conditions (Ghaffari, 2008). In hematopoietic tissues, homeostatic regulation of redox status is important for normal hematopoietic processes.
  • Hematopoietic stem eel 1 is a reservoir of hematopoietic eel ⁇ 1 ineages produced throughout the life of the host.
  • the hematopoietic stem cell pools maintain their quiescence regulation and self-renewal in bone marrow (BM) (Abbas et al., 2010; Rat hi nam et al., -20111 Scheller et al. , 2008).
  • the hematopoietic stem cells maintain low intracellular free radical levels, and appropriate regulation of oxidative stress in hematopoietic stem cells is required to maintain the hematopoietic stem pool (Blank et al., 2008; Naka et al., 2008). .
  • Taoredoxin-interacting protein is a 50 kDa. Protein consisting of 397 amino acids and is included in the arrestin family. Txnip ' mice show a high incidence of hepatocellular carcinoma (Jeong et al., 2009; Kwon et al., 2011; Lee et al., 2005; Song et al., 2003), and TXNIP.
  • TXNIP tumor growth by inhibiting cell-cycle progression
  • NK cells natural killer cells
  • ⁇ 53 a tumor suppressor protein, plays a role in limiting abnormal cell expansion through growth arrest or apoptosis in response to genotoxic stress (Olovnikov et al., 2009; Sablina et al., 2005).
  • the p53 pathway is regulated by mouse double minute 2 (MDM2), which functions as the p53 target protein E3 ubiquitin ligase for proteosomal degradat ions (Sasaki et al., 2011).
  • MDM2 mouse double minute 2
  • ⁇ 53 acts on a strong pro-survival pathway by anti-apoptosis or induction of anti-oxidation gene expression (Bensaad and Vousden, 2007; Janicke et al., 2008).
  • Previous studies have revealed the anti-aging effect of TXNIP in the maintenance of hematopoietic cell pools (Jeong et al., 2009; Kim et al., 2007).
  • TXNIP-deficient mice decrease the frequency of hematopoietic stem cells in TXNIP-deficient mice decreases, myeloproliferation ability decreases, and TXNIP through bone marrow transplantation.
  • Deficient mice were found to reduce the proliferative capacity of derived bone marrow cells.
  • the level of free radicals in TXNIP knockout mice and TXNIP deficient cell lines under oxidative stress conditions increased, induced cell death, and decreased bone growth capacity of the TXNIP knockout mouse-derived cell line.
  • An object of the present invention is to provide an immunopotentiation, cancer metastasis suppression, and blood disease prevention and treatment method, or a composition for the prevention and treatment thereof, comprising a thiredoxin-binding protein (TXNIP) as an active ingredient.
  • TXNIP thiredoxin-binding protein
  • the present invention provides a gene delivery system, a cell or TXNIP protein containing the V / Thioredixin-interacting protein) gene as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition for immuno-enhancing containing.
  • the present invention provides a health food for immune enhancement containing a gene carrier, cells or TXNIP protein containing a gene as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis, comprising a gene carrier, a cell, or a TXNIP protein as an active ingredient, including the TXNIP gene.
  • the present invention provides a health food for inhibiting cancer metastasis, which contains a gene carrier, a cell or a TXNIP protein containing an vVTF gene as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of blood diseases containing a gene carrier, a cell or a TXNIP protein containing a gene as an active ingredient.
  • the present invention provides a health food for preventing and improving blood diseases containing a gene carrier, a cell containing a T TV / gene, or TXNIP protein as an active ingredient.
  • the present invention provides an immunopotentiation method comprising administering a gene carrier, cell or TXNIP protein comprising a pharmaceutically effective amount of TXNIP gene to a subject with an immune disorder.
  • the present invention also provides a method for inhibiting cancer metastasis, comprising administering a gene carrier, cell or TXNIP protein containing a pharmaceutically effective amount of TXNIP gene to a subject with metastatic cancer.
  • the present invention also provides a method for preventing cancer metastasis, comprising administering a gene carrier, cell or TXNIP protein comprising a pharmaceutically effective amount of TXNIP gene to a subject with cancer.
  • the present invention provides a method for treating a blood disease, comprising administering a gene carrier ⁇ cell or TXNIP protein containing a pharmaceutically effective amount of TXNIP gene to a subject suffering from hematological disorders.
  • the gene also contains a pharmaceutically effective amount of the TXNIP gene.
  • a method for preventing a blood disease comprising administering a vehicle, cell, or TXNIP protein to a subject.
  • the present invention provides a gene delivery system, a cell or TXNIP protein comprising a TXNIP gene for use as a pharmaceutical composition for immunopotentiation.
  • the present invention also provides a gene carrier, cell or TXNIP protein comprising a TXNIP gene for use as a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis.
  • the present invention provides a gene delivery cell or TXNIP protein comprising a TXNIP gene for use as a pharmaceutical composition for preventing cancer metastasis.
  • the present invention also provides a gene carrier, a cell or a TXNIP protein containing a TXNIP gene for use as a pharmaceutical composition for the treatment of blood diseases.
  • the present invention provides a gene carrier, cells or TXNIP protein containing a TXNIP gene for use as a pharmaceutical composition for preventing blood diseases.
  • a pharmaceutical composition for immuno-enhancing containing a gene carrier, cell or TXNIP protein as an active ingredient comprising a 73 ⁇ 4V7KThioredixin-interacting protein) gene.
  • the TXNIP gene preferably has a nucleotide sequence consisting of SEQ ID NOs: 29 and 30, but is not limited thereto.
  • the gene carrier is a vector or a recombinant virus, but is not limited thereto.
  • the vector may be a linear DNA, a plasmid DNA, or a recombinant viral vector.
  • the recombinant virus may be a retrovirus, an adenovirus, or an adeno-associated virus.
  • herpes simplex virus is preferably any one selected from the group consisting of, but not limited to.
  • the cell is a hematopoietic stem cell 0 0131; HSC) is most preferred but not limited thereto.
  • the immune augmentation is preferably by the maintenance of the homeostasis of the immune system, but is not limited thereto. In addition, it is preferred, but not limited to, the maintenance of homeostasis of hematopoietic stem cells. In addition, the immune augmentation is preferably due to the antioxidant activity by the interaction (interact ion) between TXNIP and p53, but is not limited thereto. In a specific embodiment of the present invention, the present inventors have found that the frequency of hematopoietic stem cells in TXNIP knockout mice is reduced (see FIG. 1A), the bone marrow proliferation ability of total bone marrow cells is reduced (see FIG. 1C), and TXNIP knockout mice.
  • mice showed a low survival rate (see Fig. 3E.)
  • the bone marrow proliferation ability of hematopoietic stem cells isolated from TXNIP knockout mice was reduced (see Figs. 3F and 3G), The survival rate of the TXNIP knockout mice was reduced under oxidative stress conditions (see FIG. 4A), and the survival rate of recipients transplanted with bone marrow cells derived from TXNIP knockout mice was also reduced under oxidative stress conditions (see FIG. 4B).
  • TXNIP knockout mice Under oxidative stress conditions, spleen size and cytoplasm of TXNIP knockout mice decreased (see FIG. 4C), damage to the thymus occurred (see FIG. 4E), apoptosis increased in these mice (FIG. 4D), and cancer metastasis. Was increased (see Figures 4F and 4G) and also active acids in bone marrow cells. It was confirmed that there is an inverse correlat ion between bovine and TXNIP expression levels and p53 expression and levels of free radicals in TXNIP knockout myeloid cells (see FIGS. 5A to 5D). In addition, high levels of free radicals in p53 — / _ hematopoietic stem cells (see FIG.
  • TXNIP exhibits antioxidant activity through interaction with p53 in vivo, and thus can be used as a composition for treating immuno-enhancing, cancer metastasis suppression and blood diseases.
  • Gene carriers, cells or TXNIP proteins comprising the genes of the invention
  • the vaginal composition may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function in addition to the above ingredients.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive may include starch, gelatinized starch, microcrystalline cells of loose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, hydrogen phosphate. Calcium, Lactose, Manni, Peel, Arabian Rubber, Pregelatinized Starch, Corn Starch, Powdered Cellulose, Hydroxypropyl Cellulose, Opadry, Sodium Starch Glycolate, Lead Carnauba, Synthetic Aluminum Silicate, Stearin Acids, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, white sugar, dextrose, sorbitol, talc and the like can be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may be administered in various oral and parenteral dosage forms in actual clinical administration, and when formulated, diluents such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. that are commonly used, or It can be formulated using excipients.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may comprise at least one excipient such as at least one gene carrier, cell or TXNIP protein containing the T yV / 5 gene.
  • it may be prepared by mixing starch, calcium carbonate, sucrose, lactose or gelatin.
  • Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin
  • various excipients for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, may be included. All.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending solvents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, ethylol Injectable esters such as late and the like can be used.
  • suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally according to the desired method, the external or intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intramuscular injection or intramuscular injection during parenteral administration It is desirable to choose a method. Dosage ranges according to the patient's weight, age, gender health status, diet, time of administration, method of administration, excretion and severity of disease.
  • Dosage units may contain, for example, one, two, three or four times the individual dose or one, two, one third or one quarter times.
  • Individual dosages specifically contain amounts in which the effective drug is administered at one time, which usually corresponds to all, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dose.
  • the effective dose of the composition of the present invention may be 0.0001 ⁇ 10 g / kg, specifically 0.001 ⁇ 1 g / kg, may be administered 1 to 6 times a day.
  • the dose since the dose may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention by any method.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological reaction modifiers.
  • the present invention provides a health food for immuno-enhancement containing gene delivery cell or a gene containing a gene or TXNIP protein as an active ingredient.
  • the health food of the present invention is a gene carrier, a cell or a gene comprising a gene
  • TXNIP protein may be added as it is, or used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the kind of the health food There is no particular limitation on the kind of the health food.
  • foods to which the gene carrier, cell or TXNIP protein containing the gene may be added are meat.
  • Dairy products including soups, sausages, breads, chocolates, candy, snacks, snacks, pizzas, ramen noodles, other noodles, gums, ice creams, various soups, drinks .
  • Tea, drink, alcoholic beverages and vitamin complexes and includes all the health food in the usual sense.
  • the health beverage composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional components, as in the general beverage.
  • the natural carbohydrates described above include monosaccharides such as glucose, fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as textrin and cyclodextrin, xylly, sorbitol, and erythritol. It is a sugar alcohol.
  • natural sweeteners such as tautin, stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin, aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 compositions of the present invention.
  • the health food of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, Alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like.
  • Other natural fruit juices may contain pulp for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks. These components can be used independently or in combination.
  • the proportion of such additives is not critical but is usually selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis, comprising a gene carrier, a cell, or a TXNIP protein as an active ingredient comprising a gene.
  • the present invention provides a health food for inhibiting cancer metastasis, comprising a gene carrier, a cell, or a TXNIP protein as an active ingredient.
  • the cancer includes breast cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, bone cancer, pancreatic cancer, head or neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, anal muscle cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, uterus. It is preferable to select from the group consisting of endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma and central nervous system tumor. In accordance with a preferred embodiment of the present invention, lung cancer is more preferred but not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating blood diseases containing a gene carrier, a cell or a TXNIP protein containing the gene as an active ingredient.
  • the present invention provides a health food for preventing and improving blood diseases containing a gene carrier, a cell or a TXNIP protein containing the gene as an active ingredient.
  • the blood disease is preferably one selected from the group consisting of anemia, polyemia, leukemia, myelodysplasia, myeloid fibrosis, and thrombocytopenia, but not always limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical to the "reverse face increasing method comprising administering to the individual the immune looking over a gene carrier or cells containing the effective amount of the protein TXNIP TXNIP gene.
  • the immune augmentation is preferably by the maintenance of the homeostasis of the immune system, but is not limited thereto. In addition, it is preferred, but not limited to, the maintenance of homeostasis of hematopoietic stem cells. In addition, the immune augmentation is preferably due to the antioxidant activity by the interaction (interact ion) between TXNIP and p53.
  • the present invention also provides a method for inhibiting cancer metastasis, comprising administering a gene carrier, cell or TXNIP protein comprising a pharmaceutically effective amount of TXNIP gene to a subject with metastatic cancer.
  • the present invention is a gene comprising a pharmaceutically effective amount of TXNIP gene
  • a method for preventing cancer metastasis comprising administering a delivery agent, cell, or TXNIP protein to a subject with cancer.
  • the cancer includes breast cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, bone cancer, pancreatic cancer, head or neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, anal muscle cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma and vagina.
  • Carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma and central nervous system tumor is preferably selected from the preferred embodiment of the present invention, According to the lung cancer is more preferred, but not limited thereto.
  • the present invention provides a method for treating blood diseases comprising administering a gene carrier, cell or TXNIP protein comprising a pharmaceutically effective amount of TXNIP gene to a subject suffering from a blood disease.
  • the present invention also provides a method for preventing a blood disease comprising administering to a subject a gene carrier, cell or TXNIP protein comprising a pharmaceutically effective amount of TXNIP gene.
  • the blood disease is preferably one selected from the group consisting of anemia, polyemia, leukemia, myelodysplasia, myeloid fibrosis, and thrombocytopenia, but not always limited thereto.
  • the present invention provides a gene carrier, a cell or TXNIP protein containing a TXNIP gene for use as a pharmaceutical composition for immunological enhancement. .
  • the immune augmentation is preferably by the maintenance of the homeostasis of the immune system, but is not limited thereto. In addition, it is preferred, but not limited to, the maintenance of homeostasis of hematopoietic stem cells. In addition, the immune augmentation is preferably due to the antioxidant activity by the interaction (interact ion) between TXNIP and p53, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a gene carrier, cell or TXNIP protein containing a TXNIP gene for use as a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis.
  • the present invention also provides a gene delivery cell or TXNIP protein comprising a TXNIP gene for use as a pharmaceutical composition for preventing cancer metastasis.
  • the cancer may include breast cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer, bone cancer, pancreatic cancer, head or neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, anal muscle cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma and vagina.
  • Carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, and the central nervous system tumors are preferably selected from the group consisting of, preferred embodiments of the present invention According to the lung cancer is more preferred, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a gene carrier, a cell or a TXNIP protein, including the TXNIP gene, for use as a pharmaceutical composition for the treatment of blood diseases.
  • the present invention provides a gene carrier, cell or TXNIP protein containing a TXNIP gene for use as a pharmaceutical composition for preventing blood diseases.
  • the blood disease is preferably one selected from the group consisting of anemia, polyemia, leukemia, myelodysplasia, myeloid fibrosis, and thrombocytopenia, but not always limited thereto.
  • the TXNIP mRNA or protein of the present invention can be used for diagnosing immunity enhancement, cancer metastasis suppression, and blood diseases, and, in addition, immunostimulating cancer for selecting candidate drugs that control these expression levels. It can be used for the screening of metastasis inhibitors and blood disease candidates.
  • TXNIP of the present invention regulates myeloproliferative capacity of hematopoietic stem cells (HSCs) under oxidative stress conditions, exhibits antioxidant activity in vivo, and binds free oxygen to p53 in hematopoietic cells.
  • FIG. 1A is a diagram showing a decrease in the frequency of hematopoietic stem cells (HSCs) in old TXNIP knock-out mice.
  • HSCs hematopoietic stem cells
  • FIG. 1B is a diagram illustrating an experimental method of a competitive repopulation assay and a serial bone marrow transplantation assay (serial BMT assay).
  • Figure 1C is a diagram showing a decrease in myeloproliferative capacity in TXNIP knockout mice.
  • WT-Y wild young mouse
  • K0-0 TXNIP knocked out old mouse.
  • Figure 1D is a diagram showing a decrease in the regenerative capacity of the total myeloid cells received from TXNIP knockout mice.
  • FIG. 1E is a diagram showing that the proliferative capacity of a donor-derived bone marrow cell decreases in a recipient derived from TXNIP knockout mice.
  • 1F is a diagram showing a decrease in the population of hematopoietic stem and progenitor cells after TXMIP knockout mice.
  • WT wild type
  • Figure 2A is a diagram showing a significant increase in free radicals in bone marrow cells derived from TXNIP knockout mice.
  • WT-Y wild young mouse
  • WT-0 wild type old mouse
  • K0-0 TXNIP knocked out old mouse.
  • Figure 2B is a diagram showing high levels of free radicals in mice transplanted with bone marrow cells derived from TXNIP knockout mice.
  • WT wild type
  • Figure 2C is a diagram showing the high level of free radicals in bone marrow cells derived from TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • WT wild type
  • Figure 2D is a diagram showing the increase in apoptosis (apoptosis) of bone marrow cells derived from ⁇ knockout mouse under oxidative stress conditions.
  • WT wild type
  • Figure 3A is a diagram showing the experimental method of competitive bone marrow proliferation, colony forming unit-spleen (CFU-S) and radioprotection assay (radioprotection assay).
  • 3B and 3C are diagrams showing the decrease in the number of myeloid proliferation and hematopoietic stem cells of TXNIP knockout mouse-derived bone marrow cells under oxidative stress conditions.
  • WT-PBS wild type control mouse
  • WT-PA wild-quad mice treated with paraquat
  • K0-PBS TXNIP knockout control mice
  • 0-PA Paraquat treated TX TX knockout mice.
  • FIG. 3D shows a decrease in colony forming unit-spleen count of bone marrow cells derived from TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • PBS group treated with PBS
  • PA The paraquat. '
  • Figure 3E is a diagram showing the low survival rate of bone marrow cells derived from TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • WT-PBS wild type control mouse
  • WT-PA wild-type mice treated with paraquat
  • K0-PBS TXNIP knockout control mice
  • KO-PA Paraquat treated TXNIP knockout mice
  • 3F and 3G are graphs showing the reduction of myeloid proliferation and hematopoietic stem cell frequency in recipients of TXNIP knockout mouse-derived LKS cell lines under oxidative stress conditions.
  • WT-PBS wild type control mouse
  • WT-PA wild-type mice treated with paraquat
  • KO-PBS TX IP knockout control mice
  • KO-PA Paraquat treated TXNIP knockout mice.
  • 4A is a diagram showing reduced survival rate of TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • WT-PA wild rats treated with paraguat
  • KO-PA treated with paraquat in TXNIP knockout mice
  • KO-PA + NAC TXNIP knockout mice were treated with paraquat and antioxidant.
  • Figure 4B is a diagram showing the reduced survival rate of bone marrow transplanted mice derived from TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • CD45.KWT wild type CD45.1 mouse awarded wild type bone marrow
  • CD45.KK0 Wild type CD45.1 mouse awarded TXNIP knockout bone marrow.
  • Figure 4C is a diagram showing a decrease in the spleen size and cytoplasm of TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • PBS group treated with PBS
  • PA The paraquat.
  • 4D is a diagram showing increased apoptosis in TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • WT wild type
  • K0 TXNIP knockout mouse
  • PBS group treated with PBS
  • PA The paraquat.
  • 4E is a diagram showing damage to the thymus of TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • WT-PBS wild type control mouse
  • WT-PA wild-type mice treated with paraquat
  • KO-PBS TXNIP knockout control mice
  • KO-PA Paraquat treated TXNIP knockout mice.
  • 4F is a diagram showing increased cancer metastasis in TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • WT-PBS wild type control mouse
  • WT-PA wild-type mice treated with paraquat
  • KO-PBS TXNIP knockout control mice
  • KO-PA Paraquat treated TXNIP knockout mice.
  • Figure 4G shows increased lung metastasis in mice receiving total myeloid cells derived from TXNIP knockout mice.
  • WT-PBS wild type control mouse
  • WT-PA wild-type mice treated with paraquat
  • KO-PBS TXNIP knockout control mice
  • KO-PA Paraquat treated TXNIP knockout mice.
  • 5A and 5B are diagrams showing that free radicals and TXNIP levels are inverse correlation in bone marrow cells.
  • Figure 5C is a diagram showing a decrease in the expression of p53 in TXNIP knockout myeloid cells.
  • WT wild type
  • FIG. 5D is a diagram showing the increase in the level of free radicals in TXNIP knockout myeloid cells.
  • WT wild type
  • 5E is a diagram showing high levels of free radicals in p53—hematopoietic stem and progenitor cells.
  • 5F and 5G show increased levels of active oxygen in TXNIF—hematopoietic stem and progenitor cells when p53 was inhibited.
  • Txnip shRNA wild type or TXNIP knockout LKS cells treated with shRNA for Txnip /
  • p53 shRNA group treated with shRNA for p53 in wild-type or TXNIP knockout LKS cells
  • Figure 5H is a diagram showing the increase in free radical levels of hematopoietic stem cells and immune cells of p53 mice under oxidative stress conditions.
  • WT wild type
  • p53 "/ _ p53 deficiency
  • FIG. 51 shows the survival rate of ⁇ 53 — / _ mice decreased under oxidative stress.
  • WT wild type
  • Figure 5J is a diagram showing the survival rate of mice reduced when treated with p53 inhibitor in TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • 6A illustrates the location of TXNIP that binds to p53.
  • 6B is a diagram illustrating a domain of p53 that binds to TXNIP.
  • FIG. 6C is a diagram showing increased binding between TXNIP and p53 under oxidative stress conditions.
  • 6D is a diagram showing that the C247S and C267S mutations of TXNIP do not bind to p53 and do not exist in the same position.
  • 6E shows that the coupling between p53 and MDM2 is reduced by TXNIP.
  • TXNIP wild-type TXNIP
  • TXNIP Double mutation of TXNIP.
  • Figure 6F is a diagram showing the increase in intracellular p53-mediated transcriptional activity by binding between TXNIP and p53.
  • 7A and 7B confirm the expression of p53 and its target protein in hematopoietic cells.
  • 7C is a diagram showing reduced expression of p53 target protein in TXNIP deficient cell lines.
  • WT wild type
  • FIG. 7D is a diagram showing increased expression of oxidant gene mRNA in TXNIP deficient cell lines.
  • WT wild type
  • Figure 7E is a diagram showing the change in the activity of p53 in TXNIP deficient cell line under oxidative stress conditions.
  • WT wild type
  • Figure 7F is a diagram showing the recovery of hematopoietic stem cells in the bone marrow transplanted bone marrow cells transfected with wild-type TXNIP or p53.
  • WT vector transfected with wild-type bone marrow cells
  • KO group transfected with TXNIP deficient myeloid cells only
  • KO TXNIP: group transfected with wild-type TXNIP to TXNIP-deficient myeloid cells, and
  • FIG. 7G is a diagram showing the survival rate of mice transplanted with bone marrow transplanted with bone marrow cells transfected with wild-type TXNIP or p53.
  • WT / Vector group transfected with wild-type bone marrow cells
  • K0 / Vector transfected with only vector in TXNIP-deficient myeloid cells
  • K0 / Txnip (WT) wild-type TXNIP transfected into TXNIP deficient bone marrow cells
  • KO / Txnip (DM) double-mutant TXNIP transfected into TXNIP deficient myeloid cells
  • K0 / p53 group transfected with p53 in TXNIP deficient myeloid cells.
  • TXNIP knockout mice were prepared according to known methods (Lee et al., 2005), congenic CD45.1 + C57BL / 6 mice and
  • mice (B6.129S2- Trp53 tralTyj / J) was purchased from the Jackson Laboratory (USA). All mice were bred in sterile animal facilities with repeated light-darkness at 12 hour intervals, and 8-12 week old mice and 22-23 month old mice were used for the experiment. ⁇ 53 to , Txnip ⁇ ' im) and wild type (WT) mice in paraquat 40, 50 or 80 nig / kg, and N-acetyl-cysteine (NAC, Sigma-Aldr ich) , USA) 100 mg / kg or PFT- ⁇ (Sigma, USA) 5 nig / kg intraperitoneally.
  • NAC N-acetyl-cysteine
  • the femur, tibia and scia of the rat were separated, bone marrow cells were separated from the bone using a mortar and then suspended in RPMI1640 medium, and then centrifuged to remove the medium. The supernatant was removed after centrifugation by suspending the cells in PBS buffer containing FBS. Then, once again resuspended in PBS buffer containing 2% FBS, the number of cells was determined and 10 7 cells were dispensed. To stain Lineage + cells, add biotin in Mac-1, Gr-1, Terll9, NK1.1, CD2 and B220.
  • Total bone marrow cells were collected from femurs, tibia (hipbias) and scapula of mice cultured in RPMI-1640 medium containing 2% FBS (WelGENE, South Korea). Tissues of (shoulder bone) were separated and red blood cells (RBCs) were not lysed or lysed using ACK buffer [0.15 M NH 4 C1, 1.0 mM KHC0 3 , 0.1 mM EDTA (pH 7.0)]. . In addition, the cells were filtered using a filter.
  • Bone marrow cells were stained by methods well known to those skilled in the art (Jeong et al., 2009) and analyzed using FACSCanto II, and Lineage—c-Kit + Sca + (LKS) cells were FACSAria cell sorter. Each separated. MACS purification method was used for the preparation of lineage " c-kit + (LK) cells.
  • Bone marrow transplantation was performed to confirm the bone marrow proliferation ability using the cell line prepared by the method of Example ⁇ 2-1>.
  • whole bone marrow (WBM) 2.0 ⁇ 10 6 or LSK cells obtained from young or old wild-type or TXNIP knockout mice (CD45.2 + ) or their pseudogenic mice (CD45.1 + ) 5.0 x 10 3 were mixed well to prepare a mixture, which was injected into the vein of a (9 Gy) wild-type pseudo-type (CD45.1 +) recipient that was irradiated.
  • Myeloid proliferation of donor-derived cells was observed via PB staining on tail vein and bone marrow cells using antibodies to surface markers.
  • Example ⁇ 2-2> Repeated bone marrow transplantation performed in Example ⁇ 2-2> was performed twice in order to confirm the proliferative capacity of donor-derived bone marrow cells (serial BMT assay).
  • the recipient's bone marrow cells (2.0 X 10 6 ) containing donor and recipient cells were isolated and irradiated again (9 Gy) PB and myeloid cells were analyzed in the recipient 16 weeks after administration to the tail vein of the female (CD45.1).
  • Example 3> increases the radicals of bone marrow cells derived from the stem cells make radicals control effect of TXNIP ⁇ 3-1> TXNIP knockout mouse under oxidative stress conditions, the level check " After bone marrow transplantation, the level of intracellular free radicals was measured to determine whether the depletion of early hematopoietic stem cells was due to the accumulation of free radicals.
  • flow cytometry was used to measure the amount of free radicals in cells derived from young or old wild-type or TXNIP mice, where active oxygen-specific fluorescent probes (ROS—specific) were used. Fluorescent probes DCF (C6827) and DHE (D11347) (Invitrogen, USA) were used. As soon as the cells to be used for the experiment were separated, a solution prepared to have a final concentration of 5 ⁇ M DFC or 2.5 ⁇ M DHE was added to PBS containing 2% FBS and reacted for 15 minutes in a 37 ° C. incubator.
  • ROS active oxygen-specific fluorescent probes
  • the femur, tibia and scia of the rat were isolated, bone marrow cells were isolated from the bone using a mortar and suspended in RPMI1640 medium, and then centrifuged. The medium was removed and the cells were suspended in a PBS complete solution containing 2% FBS to remove the supernatant after centrifugation. Once again suspended in PBS buffer containing 2% FBS, the number of cells was determined and 10 7 cells were dispensed.
  • FIG. 2A bone marrow cells derived from old TXNIP knockout mice were found to significantly increase the level of free radicals compared to the wild type control (FIG. 2A).
  • TXNIP deficiency was confirmed to increase the free radicals caused by oxidative stress and to induce apoptosis accordingly.
  • paraquat 40 mg / kg
  • a strong oxidative stress inducer was injected into the abdominal cavity of a young mouse and bone marrow cells were isolated from the mouse.
  • Cells were analyzed using a flow cytometer with the addition of.
  • FIG. 2D apoptosis was significantly increased in bone marrow cells derived from TXNIP knockout mice (FIG. 2D), indicating that TXNIP knockout hematopoietic stem cells are more sensitive to active oxygen.
  • Example 2-2 In order to confirm the effect of oxidative stress on the bone marrow proliferation ability of hematopoietic stem cells, a competitive repopulation assay was performed by the method of Example 2-2.
  • Bone marrow cells derived from TXNIP knockout mice were found to have decreased bone marrow proliferation ability and hematopoietic stem cell frequency (FIGS. 3B and 3C).
  • Colony forming unit-spleen was performed to identify colony formation in the spleen of TXNIP knockout mice under oxidative stress.
  • FIG. 3D it was confirmed that the colony forming unit-spleen count of TXNIP knockout mouse-derived bone marrow cells was significantly reduced under oxidative stress conditions (FIG. 3D).
  • Radioprotection assay was performed to confirm the survival rate of TXNIP knockout mice under oxidative stress conditions.
  • the number was adjusted so that the survival rate of wild-type bone marrow cells is 60% or more.
  • Red blood cells were isolated from the total bone marrow cells of the donor, mice treated with wild-type PBS, mice treated with wild-type paraquat, mice treated with PBS for TXNIP knockout, and paraquat treated with TXNIP knockout.
  • Each 1.5 x 10 5 bone marrow cells isolated from the mice were injected into irradiated (9 Gy) pseudogenic (CD45.1 + ) recipients.
  • mice receiving a sufficient amount of hematopoietic stem cells from donor bone marrow cells may survive after bone marrow transplantation due to normal blood production processes.
  • recipient survival was recorded daily and labeled 1 as Kaplan-Meier survival curve.
  • TXNIP knockout mouse-derived bone marrow cells exhibited low survival under oxidative stress conditions (FIG. 3E).
  • LKS cells (CD45.2 +) were isolated from mice in order to directly confirm the bone marrow proliferation ability of hematopoietic stem cells, and a competitive bone marrow proliferation assay was performed by the method of Example ⁇ 2-2>.
  • TXNIP maintains myeloid proliferation ability of hematopoietic stem cells by regulating the level of free radicals under oxidative stress conditions.
  • TXNIP deficiency Based on the role of TXNIP in hematopoietic stem cell maintenance, the present inventors have identified the effects of TXNIP deficiency on the hematopoietic system in terms of defense against oxidative stress in vivo.
  • Example 5-5 40 mg / kg of paraquat was injected into the mouse to induce an oxidative stress environment, and the experiment was performed by the method of Example 5-5.
  • Bone marrow transplantation was performed by the method of Example 2-2 above to exclude the possibility of toxic effects in other tissues and to determine the intrinsic response of hematopoietic cells to oxidative stress. Afterwards, 40 mg / kg of paraquat was injected into mice to induce an oxidative stress environment.
  • mice receiving all bone marrow cells derived from TXNIP knockout mice died within 150 hours, but 70% of mice receiving whole bone marrow cells derived from wild type mice survived (FIG. 4B).
  • Spleens were isolated from the mice used in the experiments of Example ⁇ 6-3> to observe spleens of TXNIP knockout mice and wild-type mice under oxidative stress conditions. Specifically, 8-week-old wild-type mice and TXNIP knockout mice were administered paraquat at 40 mg / kg intraperitoneally, and after 96 hours, spleen and thymus were taken out of the mice and photographed immediately.
  • TUNEL analysis and annexin V staining were performed to confirm the occurrence of apoptosis in the spleen of TXNIP knockout mice under oxidative stress.
  • paraguat was applied to 8-week-old wild type mice and TXNIP knockout mice.
  • the spleen and thymus were removed from the mouse to measure the number of cells in the spleen, and stained with Annexin V to measure apoptosis. Some were TUNEL staining was performed by methods well known to those skilled in the art to confirm the H & E staining and apoptosis of the spleen by immobilization in 1 formalin solution.
  • Metastasis of lung cancer was measured to determine the effects of oxidative stress on the host's immune system.
  • Anti-metastatic reaction of immune cells through bone marrow cell transplantation (ant i -metastasis Lung cancer cells were used to confirm the response.
  • bone marrow cells (CD45.2) were isolated from wild-type and TXNIP knockout donor mice, and 8 weeks after the cells were injected into the tail vein of the donor mouse (CD45.1) irradiated with 9 Gy of radiation, After performing the experiment in the method of ⁇ Example 7>, 13 days later, the lungs were separated and photographed.
  • TXNIP knockout mice As a result, as shown in FIG. 4G, lung metastasis was significantly increased in mice receiving all myeloid cells derived from TXNIP knockout mice. ( Figure 4G). Therefore, the toxic effect of paraquat in TXNIP knockout mice was confirmed, and TXNIP knockout mice were found to be unable to maintain a functional immune system under oxidative stress conditions. In addition, the results indicate that TXNIP acts as an antioxidant protein regulating free radicals in all hematopoietic cells including immune cells and hematopoietic stem cells.
  • FIGS. 5A and 5B it was confirmed that in bone marrow cells, there was an inverse correlational relationship between the active oxygen and TXNIP levels (FIGS. 5A and 5B).
  • Bone marrow cells were isolated from wild type and TXNIP knockout mice aged 8-12 weeks by the method of Example ⁇ 2-1>, labeled with hematopoietic cell and marker (Lin-c-KitSca-1), and BD Cytofix / Cytoperm. The solution was fixed on ice for 30 minutes. The cells were then washed with BD Perm / Wash solution, suspended in Cytoperm Plus solution, left for 10 minutes on ice, washed once again with BD Perm / Wash solution, and washed on ice with BD Cytofix / Cytoperm solution. After fixing for minutes, the cells were washed with BD Perm / Wash solution.
  • the cells were suspended in PBS solution containing 2% FBS, and the reaction was allowed to react at room temperature for 30 minutes by adding p53 antibody with FITC. The cells were washed with PBS solution containing 2% FBS and resuspended. Cell analysis was performed by. As a result, as shown in FIGS. 5C and 5D, the expression of p53 was significantly decreased in TXNIP knockout myeloid cells (FIG. 5C), and the level of free radicals was significantly increased (FIG. 5D).
  • the results indicate that the expression of TXNIP, p53, and the regulation of free radicals are related. Also, compared to wild-type bone marrow cells, the level of p53 is small, but the level of free radicals is high in TXNIP knockout bone marrow cells. The difference was confirmed. This indicates that free oxygen is not regulated only by p53 in TNXIP knockout bone marrow cells, and it is confirmed that the level change of p53 is more sensitive in the absence of TXNIP.
  • p53 ⁇ / ⁇ Free radical levels of hematopoietic stem and progenitor cells were measured using the method of Example ⁇ 3x1>.
  • the level of free radicals was measured by double-knock-down by inhibiting p53 expression in cells in which TXNIP expression was suppressed.
  • a Platinum-E retroviral packaging cell line (Cel IBiolabs, USA) was used to produce a retrovirus capable of expressing shRNA, and shRNA used HuSH-29 shRNA (0riGene, USA).
  • the virus obtained from the cell line was infected three times for 3 days with LKS cells isolated from wild type and TXNIP knockout mice of 8 to 12 weeks of age, and the expression of genes was confirmed by real-time PCR and the level of free radicals. It was confirmed.
  • the sequence of shRNA used in the experiment is as shown below:
  • mTXNIP (SEQ ID NO: 1): 5'-G TCTMGGTGATGTTCTTAGCACTTTA-3 ', and
  • mp53 (SEQ ID NO: 2): 5'-TGGCCATCTACAAGAAGTCACAGCACATG-3 '.
  • TXNIP binds to p53 to regulate the level of free radicals in both hematopoietic stem cells and immune cells.
  • TXNIP protein that binds to p53
  • sequential mutation of TXNIP was constructed.
  • human GST-TXNIP and FLAG-TXNIP constructs were used as templates for site-directed mutagenesis of TXNIP mutants and QuickChange for the preparation of the mutants. II site-directed mutagenesis kit (CStratagene, USA) was used as the manufacturer's instructions. In addition, the primers used for the production of the mutant constructs are shown in Table 1 below.
  • the lysate of the cells was obtained after injecting the constructor into the cells.
  • Dispense 500 equivalents, each with GST-4B beads (bead) was added, and the reaction was allowed to settle for 4 hours at 4 ° C. to settle the beads, wash three times with a lysis solution, and then process the SDS loading solution and perform SDS-PAGE. Thereafter, Western blot was performed by transferring to a PVDF membrane (membrane) well known to those skilled in the art.
  • p53 fragment was amplified using pfu polymerase mix (Bionia, Korea), and cloned into the corresponding restriction enzyme site of the pCMV-Flag vector.
  • the primers used are shown below.
  • GST pulldown was performed by the method of ⁇ 11-2>.
  • Immunoprecipitation was performed to determine how the binding of ⁇ and ⁇ 53 changes under oxidative stress conditions.
  • Immunostaining was performed to confirm the binding between C247S and C267S mutations and p53 of TXNIP under oxidative stress conditions.
  • murine bone marrow-derived pro-B cells cultured in RPMI-1640 medium containing 10% FBS and mouse IL-3 ng / ra.
  • Baf3 cell lines were overexpressed with wild-type TXNIP or double mutation (DM) TXNIP and used for immunostaining.
  • the cell line was fixed and permeabi Hzed using Cytofix / Perm solution (BD Biosciences, USA), and then p53 primary antibody (Santa Cruz, USA) was added in PBS containing 2% FBS.
  • the cells were washed three times with PBS and reacted with a secondary antibody of Alexa Fluor 488 or 546 (Invitrogen, USA), and the staining results were observed using an LSM510 confocal microscope (Carl Zeiss Germany). .
  • the stability of p53 is known to be regulated by MDM2 via the degradation of ubiquitinat ion-dependent proteosomal degradat ion (Sasaki et al., 2011).
  • immunoprecipitation was performed by the method of Example 11, wherein anti-MDM2 (Santa Cruz, USA), anti-p53 ( Santa Cruz, USA) and anti-TXNIPdnvitrogen, USA) primary antibodies were used.
  • a reporter assay was performed to determine how p53 and TXNIP affect the function of p53.
  • Baf3 cell line was prepared using TXNIP or TXNIP (double mutant) using p53-Luc reporter and pRL-CMV plasmid vector and lipofectamine-plus. Transfection was carried out according to the instruction manual. Luciferase activity was observed using the p53—Lu reporter and the efficiency of transfection by transfection with a renilla luciferase-expression vector (Pr omega, USA). (efficiency) was confirmed.
  • TXNIP interferes with the binding between p53 and MDM2 to increase p53 stability and induce transcriptional activity of p53.
  • TXNIP the p53- and p53-dependent of its target gene SESNl, SESN2, expression, such as GPX-1, P 21 of the wild-type antioxidant in LKS and LK cell line
  • expression such as GPX-1, P 21 of the wild-type antioxidant in LKS and LK cell line
  • Example 11-1 immunostaining was performed according to the method of Example 11-1.
  • the cell lines were washed with PBS to perform western blot, 0.1% Nonidet P-40, 10 nig / m aprotinin, 10 rag / leupeptin, 10 mM sodium fluoride, 2 nig / nrf a-1-antitrypsin, 2 mM sodium pyrophosphate, 25 mM ⁇ -glycophosphate, 1 mM sodium orthovanadate (sodium orthovanadate) and 1 mM Lysis solution [20 mM HepesCpH 7.9), 10 mM EDTA, 0.1 M KCl, 0.3 M NaCl] added PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) was added to lyse the cells.
  • PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
  • the protein extracted from the lysed cells was centrifuged to obtain a supernatant, and the protein concentration of the supernatant was quantified by the BCA method. The same amount of protein was then separated using SDS running buffer by PAGE electrophoresis and transferred to PVDF membranes to yield 0.1% tween 20 and 5) skimmed milk. Pretreated with added PBS. The first antibody to p53, GPX-1, p21 and ⁇ -actin was treated and reacted at 4 ° C. overnight, washed with PBS and treated with a secondary antibody for 1 hour at room temperature. The film was developed using ECUPierce, USA) solution.
  • FIGS. 7A and 7B expression of p53 and its target genes, SESN1, SESN2, GPX-1, and p21 proteins, was confirmed (FIGS. 7A and 7B).
  • RT-PCR was performed according to the manufacturer's instructions using Maxime PCR premix kit (Intron biotechnology, Korea), the primers used are shown in Table 2 below.
  • Western blot was performed according to the method of Example 12 and the change of the expression of TXNIP and the resulting change of p53 according to the exposure time to the oxidative stress environment, phospho-p53 (S15) (Cell signaling, USA ), P53 (Santa Cruz, USA), TXNIPdnvitrogen, USA) and primary antibodies against GAPDH (Santa Cruz, USA) were used.
  • TXNIP knockout mouse-derived bone marrow cells In order to directly confirm the antioxidant activity by the interaction of TXNIP and p53, wild-type TXNIP, double mutant TXNIP or p53 gene was transfected into TXNIP knockout mouse-derived bone marrow cells, and these cells were described in the above Examples ⁇ 2-. 2> bone marrow transplantation was performed on the pseudogenic (CD45.1 +) recipients. Eight weeks after bone marrow transplantation, paraquat 40 mg / kg was administered to the recipient, and the frequency of hematopoietic stem cells and the method of Example ⁇ 5-3> were measured by the method of Example ⁇ 1-2>. Survival was measured by the method.
  • FIG. 7F in the case of bone marrow transplantation of the cells transfected with wild-type TXNIP or p53, the frequency of hematopoietic stem cells was restored (FIG. 7F), and as shown in FIG. 7G, the survival rate of the mice was shown. This increase was confirmed (FIG. 7G).

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Abstract

본 발명은 티오레독신-결합 단백질(thioredoxin-binding protein; TXNIP)을 유효성분으로 포함하는 면역증강, 암 전이억제, 및 혈액질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, TXNIP 결핍 마우스에서 조혈모세포의 빈도가 감소하고, 골수증식 능력이 감소하며, 골수이식을 통해 TXNIP 결핍 마우스-유래 골수세포의 증식능력이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 산화적 스트레스 조건하의 TXNIP 녹아웃 마우스 및 TXNIP 결핍 세포주에서 활성산소의 수준이 증가하고, 세포사멸을 유도하며, 상기 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 세포주의 골수증식 능력이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 산화적 스트레스 조건하의 TXNIP 녹아웃 마우스에서 암 전이가 증가하는 것을 확인하였고, p53의 발현이 감소함을 확인하였다. 또한, TXNIP 및 p53 사이에 직접적인 결합 위치를 확인하였고, 상기 결합이 산화적 스트레스 조건하에서 증가하며, 이로 인하여 p53-매개의 전사활성이 증가하고, 또한, p53-매개 항산화활성이 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체, 세포 또는 TXNIP 단백질이 면역증강, 암 전이억제, 및 혈액질환 예방 및 치료방법, 또는 이들의 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
티오레독신 -결합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도
【기술분야】
본 발명은 티오레독신 -결합 단백질 (thioredoxin-binding protein; TXNIP)을 유효성분으로 포함하는 면역증강， 암 전이억제， 및 혈액질환 예방 및 치료방법， 또 는 이들의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
산화적 스트레스 (oxidative stress) 세포 내에 활성산소 (react ive oxygen species; R0S)가 과도하게 축적 또는 항산화 방어 시스템 (antioxidant defense system)의 결핍으로 발행한다. 산화적 스트레스는 당뇨， 퇴행성 뇌질환 및 암과 같은 다양한 병리학적 질환을 유도하고 (Hole et al . , 2011； Sinha et al., 2013)， 조혈작용에 있어서， 활성산소의 조절이 중요한 요소임이 확인되었다. 조혈세포 (hematopoietic cell)는 산화적 스트레스에 취약하고， 조혈조직 (hematopoietic tissue)의 악성화가 만성 산화적 스트레스 조건하에서 관찰되었다 (Ghaffari, 2008). 조혈조직에 있어서， 산화환원 상태의 항상성 조절이 정상적인 조혈과정을 위해 중 요하다, 조혈모세포 (hematopoietic stem eel 1； HSC)는 숙주가 일생동안 생산해내는 조혈세포계 (hematopoietic eel Γ 1 ineages)의 저장소이다. 상기 조혈모세포 풀은 골수세포 (bone marrow; BM)에 있어서， 그들의 무활동 (quiescence) 조절 및 자기재 생 (self-renewal)을 유지한다 (Abbas et al. , 2010； Rat hi nam et al .， -20111 Scheller et al . , 2008). 상기 조혈모세포는 낮은 세포 내 활성산소 수준을 유지 하고 있고， 조혈모세포 풀을 유지하기 위하여 조혈모세포 내 산화적 스트레스의 적 절한 조절이 요구된다 (Blank et al. , 2008； Naka et al. , 2008). 최근의 몇몇 연 구에 의하면 조혈모세포의 기능에 있어서， 활성산소의 유도를 통해 기능 결핍에 관 여하는 동정하였다 (Ito et al. , 2004； Ito et al. , 2006； Miyamoto et al. , 2007). 타오레독신 -결합 단백질 (Thioredoxin-interacting protein; TXNIP)는 397개 의 아미노산으로 구성된 50 kDa.의 단백질로 아래스틴과 (arrestin family)에 포함 된다. Txnip' '마우스는 간세포암 (hepatocellular carcinoma)의 높은 발생율을 나 타내고 (Jeong et al. , 2009； Kwon et al. , 2011； Lee et al .， 2005； Song et al. , 2003) , TXNIP의 발현은 다양한 종류의 종양을 감소시키며， TXNIP의 과발현은 세포 주기 진행 (cell-cycle progression)을 억제함으로써 종양의 성장을 억제한다 (Han et al., 2003). Txnip ~ 마우스의 골수세포에 있어서 자연살해세포 (natural killer cell; NK cell)의 수는 감소하고， 장기간 복원된 조혈모세포 집단은 고갈된 표현형 (exhausted phenotype)을 나타내고, 빈도 (frequency)도 감소하는 것이 확인 되었다 (Jeong et al. , 2009； Lee et al. , 2005). 종양 억제단백질인 ρ53은 유전적 스트레스 (genotoxic stress)에 대한 반웅 으로 성장중지 (growth arrest) 또는 세포사멸 (apoptosis)을 통하여 비정상적 세포 의 확장 (expansion)을 제한하는 역할을 한다 (Olovnikov et al. , 2009； Sablina et al. , 2005) . p53 경로는 프로테오소말 분해 (proteosomal degradat ion)를 위해서 p53 표적 단백질인 E3 유비퀴틴 리가아제 (E3 ubiquitin ligase) 기능을 하는 MDM2(mouse double minute 2)에 의해서 조절된다 (Sasaki et al. , 2011). ρ53은 항 -세포사멸 또는 항 -산화 유전자의 발현 유도에 의해 강한 전 -생존 경로 (pro- survival pathway)에 작용한다 (Bensaad and Vousden, 2007； Janicke et al., 2008) . 이전 연구에 의하면 조혈세포 풀의 유지에 있어서, TXNIP의 항 -노화 (anti-aging) 효과에 대해 밝혀진바 있다 (Jeong et al . , 2009； Kim et al. , 2007) . 이에 본 발명자들은 항산화 스트레스를 억제하므로써 조혈세포에서 면역증 강의 효과를 나타내는 약학적 조성물을 연구하던 중, TXNIP 결핍 마우스에서 조혈 모세포의 빈도가 감소하고， 골수증식 능력이 감소하며， 골수이식을 통해 TXNIP 결 핍 마우스ᅳ유래 골수세포의 증식능력이 감소하는 것을 확인하몄다. 또한， 산화적 스트레스 조건하의 TXNIP 녹아웃 마우스 및 TXNIP 결핍 세포주에서 활성산소의 수 준이 증가하고， 세포사멸을 유도하며 , 상기 TXNIP녹아웃 마우스 유래 세포주의 골 수증식 능력이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 산화적 스트레스 조건하의 TXNIP 녹아웃 마우스에서 암 전이가 증가하는 것을 확인하였고， p53의 발현이 감소함을 확인하였다. 또한， TXNIP 및 p53 사이에 직접적인 결합 위치를 확인하였고， 상기 결합이 산화적 스트레스 조건하에서 증가하며， 이로 인하여 p53-매개의 전사활성이 증가하고， 또한, p53-매개 항산화활성이 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완 성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 티오레독신 -결합 단백질 (thioredoxin-binding protein; TXNIP)을 유효성분으로 포함하는 면역증강， 암 전이억제， 및 혈액질환 예방 및 치 료방법， 또는 이들의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 V/ Thioredixin-interacting protein) 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP단백질을 유효성분으 로 함유하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다 .
또한， 본 발명은 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역 증강용 건강식품을 제공한다.
또한， 본 발명은 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억 제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 vVTF 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 전이 억 제용 건강식품을 제공한다.
또한 , 본 발명은 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성분으로 함유하는 혈액질환 예방 및 치 료용 약학적 조성 물올 제공한 다 .
또한 , 본 발명은 T TV/ 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성분으로 함유하는 혈액질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다 . 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 면역 이상이 생긴 개체에 투여하는 단계를 포함 하는 면역증강방법을 제공한다 . '
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 전이 된 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함 하는 암 전이 억 제 방법을 제공한다 .
또한 , 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 예방 방법을 제공한다 .
또한 , 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체 ᅳ 세포 또는 TXNIP 단백질을 혈액잘환쎄 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함 하는 혈액질환 치료 방법을 제공한다.
또한， 본 발땅은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈액질환 예 방 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 면역증강용 약학적 조성물로 사용하기 위한ᅳ TXNIP 유전자 를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP단백질을 제공한다.
또한， 본 발명은 암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한， TXNIP유 전자를 포함하는 유전자 전달체, 세포 또는 TXNIP 단백질을 제공한다.
또한， 본 발명은 암 전이 예방용 약학적 조성물로 사용하기 위한， TXNIP유 전자를 포함하는 유전자 전달체ᅳ 세포 또는 TXNIP단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈액질환 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한， TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 제공한다.
또한， 본 발명은 혈액질환 예방용 약학적 조성물로 사용하기 위한， TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을쎄공한다. 이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 7¾V7KThioredixin-interacting protein) 유전자를 포함하는 유 전자 전달체， 세포 또는 TXNIP단백질을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 TXNIP 유전자는 서열번호 29 및 30으로 구성된 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 유전자 전달체는 백터 또는 재조합 바이러스인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며， 상기 백터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 백터인 것이 바람직하고, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스， 아데노 바이러 스， 아데노 부속 바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로 구성된 군으로부터 선 택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 세포는 조혈모세포0 0131；01)01 ^ stem cell; HSC)인 것이 가장 바람 직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 면역증강은 면역 시스템의 항상성 유지에 의한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며， 또한， 이는 조혈모세포의 항상성 유지에 의한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 상기 면역증강은 TXNIP 및 p53 사이의 상호작용 (interact ion)에 의한 항산화 활성에 의한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 TXNIP 녹아웃 마우스에서 조혈모세포의 빈도 (frequency)가 감소하고 (도 1A 참조)， 전체 골수세포의 골수증식 능력이 감소하며 (도 1C참조)， TXNIP 녹아웃 마우스로부터 골수이식을 받은 마우스 에서도 전체 골수세포 및 조혈모세포의 빈도가 감소함을 확인하였다 (도 1D 참조; L 또한 상기 결과는 골수이식을 2번 반복한 후에도 동일한 결과를 나타내었다 (도 1E 및 1F 참조). 또한， TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포에서 활성산소의 수준이 증가하고 (도 2A 내지 2C 참조)， 이는 세포사멸을 유도함을 확인하였다 (도 2D 참조). 또한， 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스의 골수증식 능력이 감소하 고 (도 3B 및 3C 참조)， 상기 마우스 유래 골수세포의 집락형성 -비장 (colony forming unit-spleen; CFU-S)의 수가 감소하며 (도 3D 참조)， 이들 마우스는 낮은 생존율을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3E 참조). 또한， TXNIP 녹아웃 마우스로부 터 분리된 조혈모세포의 골수증식 능력이 감소하고 (도 3F 및 3G 참조)， 산화적 스 트레스 조건하에서 상기 TXNIP 녹아웃 마우스의 생존율이 감소하며 (도 4A 참조)， 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포를 이식한 수여체 의 생존율 또한 감소함을 확인하였다 (도 4B 참조). 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스의 비장크기 및 세포질이 감소하고 (도 4C 참조)， 흉선에 손상 이 발생하였으며 (도 4E 참조)， 상기 마우스에서 세포사멸이 증가하였고 (도 4D), 암 전이가 증가하는 것을 확인하였다 (도 4F 및 4G 참조). 또한， 골수세포에서 활성산 소 및 TXNIP 발현 수준 및 TXNIP 녹아웃 골수세포에서 p53 발현 및 활성산소의 수 준이 역상관관계 ( inverse correlat ion)가 있음을 확인하였다 (도 5A 내지 5D 참조) . 또한， p53— /_ 조혈모세포에서 활성산소의 수준이 높고 (도 5E 참조)， p53을 억 제하는 경우 TXNIP— /_ 조혈모세포에서 활성산소와 수준이 증가하며 (도 5F 및 5G 참조)， 산 화적 스트레스 조건하에서도 ρ53— Λ 조혈모세포에서 활성산소의 수준이 증가하는 것 을 확인하였다 (도 5Η 참쵸) . 또한， 산화적 스트레스 조건하에서 ρ53 Λ 마우스 및 ρ53 억 제제를 처 리 한 마우스의 생존율이 감소함을 확인하였다 (도 51 및 5J 참조) . 또한， TXNIP 및 p53에서 상호작용하는 위치를 확인하고 (도 6A 및 6B 참조)， 산화적 스트레스 조건하에서 상기 TXNIP 및 p53의 상호작용이 증가하며 (도 6C 참조)， p53 과 상호작용하는 TXNIP 부위에 돌연변이를 유발한 이중 돌연변이 형 TXNIP는 세포 내에서 p53과 동일한 위치 에 존재하지 않는 것을 확인하였다 (도 6D 참조) . 또한， TXNIP에 의해서 p53 및 MDM2(mouse double minute 2) 사이 의 상호작용이 감소하고 (도 6E 참조)， TXNIP 및 p53의 상호작용에 의해서 P53-매개 전사활성 이 증가함을 확인하였다 (도 5F 참조) . 또한， 조혈세포에서 p53 및 이 의 표적 단백질의 발현을 확인하고 (도 7A 및 7B 참조)， TXNIP가 결핍 된 경우， p53 표적 단백질의 발현이 감 소하며 (도 7C 참조) , 상기 TXNIP 결핍 세포주에서 산화촉진 유전자의 발현이 증가 하는 것을 확인하였다 (도 7D 참조) . 또한， TXNIP의 발현변화에 따라서 p53의 활성 에 변화가 있고 (도 7E 참조)， TXNIP 결핍 골수세포 또는 마우스에 야생형 의 p53 또 는 TXNIP를 형 질주입하였을 때， 조혈모세포의 빈도가 회복되고， 마우스의 생존율이 증가하는 것을 확인하였다 (도 7F 및 7G 참조) .
따라서， 본 발명자들은 TXNIP가 생체 내에서 p53과의 상호작용을 통해 항산 화 활성을 나타냄으로써 , 면역증강， 암 전이 억 제 및 혈액질환 치료용 조성물로 사 용될 수 있음을 확인하였다 . 본 발명 의 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백 질을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유 효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으 며， 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분， 젤라틴화 전분， 미결정셀를 로오스， 유당， 포비돈， 콜로이달실리콘디옥사이드， 인산수소칼슘， 락토스， 만니를， 엿, 아라비아고무， 전호화전분, 옥수수전분， 분말셀를로오스， 히드록시프로필셀를 로오스， 오파드라이, 전분글리콜산나트륨， 카르나우바 납， 합성규산알루미늄, 스테 아린산， 스테아린산마그네슘， 스테아린산알루미늄， 스테아린산칼슘， 백당， 덱스트 로스, 소르비틀 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 - 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉， 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데， 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제， 증량제， 결 합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제， 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포 함되며， 이러한 고형 제제는 T yV/5유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질에 작어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate) , 수크로스 (Sucrose)， 락토오스 (Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞 어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있 다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제， 동 결건조제제， 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝 솔 (witepsol), 마크로골， 트원 (tween) 61， 카카오지， 라우린지， 글리세로제라틴 등 이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며， 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사， 직장내주사， 피하주사, 정 맥주사， 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다 . 투 여량은 환자의 체중， 연령， 성별 건강상태， 식이， 투여시간， 투여방법, 배설를 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
투약 단위는， 예를 들면 개별 투약량의 1， 2， 3 또는 4배를 함유하거나 또 는 1/2， 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물 이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부， 1/2， 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/kg일 수 있고， 구체적으로 0.001 ~ 1 g/kg일 수 있으며， 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나， 투여 경로， 질병의 중증도， 성별， 체중， 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상 기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로， 또는 수술， 방사선 치료， 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 본 발명은 유전자를 포함하는 유전자 전달체ᅳ 세포 또는 TXNIP 단백 질을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 건강식품은 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는
TXNIP단백질을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있 고， 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유전자를 포함 하는 유전자 전달체, 세포 또는 TXNIP 단백질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육 류， 소시지， 빵， 초콜릿， 캔디류， 스넥류， 과자류， 피자， 라면， 기타 면류， 껌류， 아이스크림류를 포함한 낙농제품， 각종 스프, 음료수,. 차， 드링크제， 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며， 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포 도당， 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스， 슈크로스와 같은 디사카라이드， 및 텍 스트린， 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드， 자일리를， 소르비틀， 에리트리 를 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴， 스테비아 추출물과 같은 천연 감미 제나， 사카린， 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직 하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제， 비타민， 전해질， 풍미 제， 착색제, 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증 점제， pH조절제， 안정화제, 방부제， 글리세린， 알코올， 탄산음료에 사용되는 탄산 화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스 과일주스 음료 및 야채 음료 의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 흔합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100중량부 당 0.01 - 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 본 발명은 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백 질을 유효성분으로 함유하는 암 전이억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질 을 유효성분으로 함유하는 암 전이억제용 건강식품을 제공한다.
상기 암은 유방암， 간암， 위암， 결장암， 골암， 췌장암, 두부 또는 경부 암， 자궁암， 난소암， 직장암， 식도암， 소장암, 항문부근암， 결장암， 나팔관암종, 자궁 내막암종， 자궁경부암종， 질암종， 음문암종， 호지킨병， 전립선암， 방광암， 신장암， 수뇨관암， 신장세포암종， 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부 터 선택되는 것이 바람직하고， 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 폐암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
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본 발명은 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백 질을 유효성분으로 함유하는 혈액질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백 질을 유효성분으로 함유하는 혈액질환 예방 및 개선용 건강식품 "제공한다.
상기 혈액질환은 빈혈， 다혈증， 백혈병， 골수이형성증， 골수 섬유증， 혈소 판 감소증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정 하지 않는다. 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP유전자를 포함하는 유전자 전달체 세포 또는 TXNIP 단백질을 면역 이상이 생긴 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면 '역증강방법을 제공한다.
상기 면역증강은 면역 시스템의 항상성 유지에 의한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며， 또한， 이는 조혈모세포의 항상성 유지에 의한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 상기 면역증강은 TXNIP 및 p53 사이의 상호작용 (interact ion)에 의한 항산화 활성에 의한 것이 바람직하나.이에 한정하지 않는다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 전이된 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함 하는 암 전이 억제 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP단백질을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 예방 방법을 제공한다.
상기 암은 유방암， 간암， 위암， 결장암， 골암， 췌장암， 두부 또는 경부 암ᅳ 자궁암， 난소암， 직장암， 식도암， 소장암， 항문부근암， 결장암， 나팔관암종， 자궁 내막암종, 자궁경부암종, 질암종， 음문암종， 호지킨병， 전립선암， 방광암， 신장암， 수뇨관암， 신장세포암종， 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부 터 선택되는 것이 바람직하고， 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 폐암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 혈액질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함 하는 혈액질환 치료 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체, 세포 또는 TXNIP 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈액질환 예 방 방법을 제공한다.
상기 혈액질환은 빈혈， 다혈증， 백혈병， 골수이형성증， 골수 섬유증， 혈소 판 감소증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정 하지 않는다. 또한, 본 발명은 면역증강용 약학적 조성물로 사용하기 위한， TXNIP 유전자 를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP단백질을 제공한다. .
상기 면역증강은 면역 시스템의 항상성 유지에 의한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며， 또한， 이는 조혈모세포의 항상성 유지에 의한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 상기 면역증강은 TXNIP 및 p53 사이의 상호작용 (interact ion)에 의한 항산화 활성에 의한 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 본 발명은 암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한， TXNIP유 전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 제공한다.
또한， 본 발명은 암 전이 예방용 약학적 조성물로 사용하기 위한， TXNIP유 전자를 포함하는 유전자 전달체 세포 또는 TXNIP 단백질을 제공한다.
상기 암은 유방암， 간암， 위암， 결장암， 골암， 췌장암， 두부 또는 경부 암， 자궁암， 난소암， 직장암， 식도암， 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종， 자궁 내막암종， 자궁경부암종， 질암종， 음문암종, 호지킨병， 전립선암， 방광암， 신장암， 수뇨관암， 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 아루어진 군으로부 터 선택되는 것이 바람직하고， 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 폐암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 본 발명은 혈액질환 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한， TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP단백질을 제공한다.
또한， 본 발명은 혈액질환 예방용 약학적 조성물로 사용하기 위한， TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 제공한다.
상기 혈액질환은 빈혈， 다혈증， 백혈병， 골수이형성증， 골수 섬유증， 혈소 판 감소증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정 하지 않는다. 또한， 본 발명의 TXNIP mRNA 또는 단백질은 이의 발현수준은 면역증강， 암 전이억제， 및 혈액질환을 진단하는데 사용할 수 있고， 아울러， 이들 발현수준을 조 절하는 후보약물을 선별하기 위한 면역증강ᅳ 암 전이억제， 및 혈액질환 후보약물의 스크리닝에 사용될 수 있다. 【유리한 효과】
본 발명의 TXNIP가 산화적 스트레스 조건하에서 조혈모세포 (hematopoietic stem cell; HSC)의 골수증식 능력을 조절하고， 생체 내에서 항산화 활성을 나타내 며， 조혈세포 (hematopoietic cell)에서 p53과 결합하여 활성산소를 조절함으로써 면역증강, 암 전이억거]， 및 혈액질환 예방 및 치료방법， 또는 이들의 예방 및 치료 용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1A는 늙은 TXNIP 녹아웃 (knock-out) 마우스에서 조혈모세포 (hematopoietic stem cell; HSC)의 빈도 (frequency)가 감소하는 것을 나타내는 도 이다.
Young: 어린 마우스， 및
Old: 늙은 마우스.
도 1B는 경쟁적 골수증식 (competitive repopulation assay) 및 단계적 골수 이식 (serial bone marrow transplantation assay; serial BMT assay)의 실험방법을 나타내는 도이다.
도 1C TXNIP 녹아웃 마우스에서 골수증식 능력이 감소하는 것을 나타내는 도이다.
WT-Y: 야생형 어린 마우스，
WT-0: 야생형 늙은 마우스，
K0-Y: TXNIP녹아웃된 아린 마우스， 및
K0-0: TXNIP녹아웃된 늙은 마우스.
도 1D는 TXNIP 녹아웃 마우스로부터 수여받은 전체 골수세포의 재생능력이 감소하는 것을 나타내는 도이다.
WT: 야생형， K0: TXNIP녹아웃，
Young: 어린 마우스, 및
Old: 늙은 마우스.
도 1E는 공여체 -유래 골수세포의 증식능력이 TXNIP 녹아웃 마우스 유래한 수여체에서 감소하는—것을 나타내는 도이다.
WT: 야생형，
K0: TXNIP녹아웃，
1st： 첫번째 골수이식 후， 및
2nd： 두번째 골수이식 후.
도 1F는 골수이식 후 조혈모세포 및 전구세포 (progenitor)의 집단이 TXNIP 녹아웃 마우스에서 감소하는 것을 나타내는 도이다.
WT: 야생형， 및
K0: TXNIP녹아웃.
도 2A는 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포에서 활성산소 수준이 현저히 증가하는 것을 나타내는 도이다.
WT-Y: 야생형 어린 마우스，
WT-0: 야생형 늙은 마우스,
K0-Y: TXNIP 녹아웃된 어린 마우스， 및
K0-0: TXNIP녹아웃된 늙은 마우스.
도 2B는 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포를 이식한 마우스에서 활성산소 의 수준이 높은 것을 나타내는 도이다.
WT: 야생형， 및
K0: TXNIP 녹아웃.
도 2C는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포에 서 활성산소의 수준이 높은 것을 나타내는 도이다. WT: 야생형， 및
ΚΟ: ΤΧΝΙΡ녹아웃.
도 2D는 산화적 스트레스 조건하에서 ΤΧΝΙΡ 녹아웃 마우스 유래 골수세포의 세포사멸 (apoptosis)이 증가함올 나타내는 도이다.
WT: 야생형， 및
K0: TXNIP녹아웃 . .
도 3A는 경쟁적 골수증식， 집락형성단위 -비장 (colony forming unitᅳ spleen; CFU-S) 및 방사선보호 분석 (radioprotection assay)의 실험방법을 나타내는 도이다. 도 3B 및 3C는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수 세포의 골수증식 및 조혈모세포 빈도가 감소함을 나타내는 도이다.
WT-PBS: 야생형 대조군 마우스，
WT-PA: 야생형 마우스에 파라콰트 (paraquat)를 처리한 군，
K0-PBS: TXNIP녹아웃 대조군 마우스， 및
0-PA: TX IP녹아웃 마우스에 파라콰트를 처리한 군.
도 3D는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포의 집락형성단위 -비장 수가 감소하는 것을 타나내는 도이다.
WT: 야생형,
K0: TXNIP녹아웃 마우스，
PBS: PBS를 처리한 군， 및
PA: 파라콰트를 처리한 군. '
도 3E는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포의 생존율이 낮음을 나타내는 도이다.
WT-PBS: 야생형 대조군 마우스， 、
WT-PA: 야생형 마우스에 파라콰트를 처리한 군，
K0-PBS: TXNIP녹아웃 대조군 마우스， 및 KO-PA: TXNIP 녹아웃 마우스에 파라콰트를 처리한 군.
도 3F 및 3G는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 LKS 세포주가 수여체에서 골수증식 및 조혈모세포 빈도가 감소함을 나타내는 도이다.
WT-PBS: 야생형 대조군 마우스，
WT-PA: 야생형 마우스에 파라콰트를 처리한 군，
KO-PBS: TX IP녹아웃 대조군 마우스， 및
KO-PA: TXNIP 녹아웃 마우스에 파라콰트를 처리한 군.
도 4A는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스의 생존율이 감소 함을 나타내는 도이다.
WT-PA: 야생형 마우스에 파라과트를 처리한 군，
KO-PA: TXNIP 녹아웃 마우스에 파라콰트를 처리한 군， 및
KO-PA+NAC: TXNIP녹아웃 마우스에 파라콰트 및 항산화제를 처리한 군. 도 4B는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수이식한 마우스의 생존율이 감소함을 나타내는 도이다.
CD45.KWT): 야생형 골수를 수여받은 야생형 CD45.1 마우스， 및
CD45.KK0): TXNIP녹아웃 골수를 수여받은 야생형 CD45.1 마우스.
도 4C는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스의 비장크기 및 세포질이 감소함올 나타내는 도이다.
WT: 야생형,
K0: TXNIP녹아웃 마우스，
PBS: PBS를 처리한 군， 및
PA: 파라콰트를 처리한 군.
도 4D는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스에서 세포사멸이 증가함을 나타내는 도이다.
WT: 야생형， K0: TXNIP 녹아웃 마우스，
PBS: PBS를 처리한 군， 및
PA: 파라콰트를 처리한 군.
도 4E는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스의 흉선에 손상이 발생함을 나타내는 도이다.
WT-PBS: 야생형 대조군 마우스,
WT-PA: 야생형 마우스에 파라콰트를 처리한 군，
KO-PBS: TXNIP 녹아웃 대조군 마우스， 및
KO-PA: TXNIP녹아웃 마우스에 파라콰트를 처리한 군.
도 4F는 산화적 스트레스 조건하의 TXNIP 녹아웃 마우스에서 암 전이가 증 가함을 나타내는 도이다.
WT-PBS: 야생형 대조군 마우스，
WT-PA: 야생형 마우스에 파라콰트를 처리한 군，
KO-PBS: TXNIP녹아웃 대조군 마우스， 및
KO-PA: TXNIP녹아웃 마우스에 파라콰트를 처리한 군.
도 4G는 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 전체 골수세포를 수여받은 마우스에서 폐 전이가 증가함을 나타내는 도이다.
WT-PBS: 야생형 대조군 마우스，
WT-PA: 야생형 마우스에 파라콰트를 처리한 군，
KO-PBS: TXNIP 녹아웃 대조군 마우스, 및
KO-PA: TXNIP 녹아웃 마우스에 파라콰트를 처리한 군.
도 5A 및 5B는 골수세포에서 활성산소 및 TXNIP 수준이 역상관관계 (inverse correlation)에 있음을 나타내는 도이다.
도 5C는 TXNIP 녹아웃 골수세포에서 p53의 발현이 감소함을 나타내는 도이 다. WT: 야생형， 및
KO: TXNIP 녹아웃.
도 5D는 TXNIP 녹아웃 골수세포에서 활성산소의 수준이 증가함을 나타내는 도이다. - WT: 야생형, 및
KO: TXNIP 녹아웃.
도 5E는 p53— 조혈모세포 및 전구세포에서 활성산소의 수준이 높음을 나타 내는 도이다.
WT: 야생형，
Txnip-7": TXNIP 결핍
p53— /_: p53 결핍. .
도 5F 및 5G는 p53을 억제한 경우 TXNIF— 조혈모세포 및 전구세포에서 활 성산소의 수준이 증가함을 나타내는 도이다.
Control: 대조군，
Txnip shRNA: 야생형 또는 TXNIP 녹아웃 LKS 세포에 Txnip에 대한 shRNA를 처리한 군/
p53 shRNA: 야생형 또는 TXNIP 녹아웃 LKS 세포에 p53에 대한 shRNA를 처리 한 군，
WT: 야생형 마우스，
WT/PFT- α： 야생형에 ρ53 억제제를 처리한 군，
KO: TXNIP 녹아웃 마우스, 및
K0/PFT- α： TXNIP 녹아웃 마우스에 p53 억제제를 처리한 군.
도 5H는 산화적 스트레스 조건하에서 p53 마우스의 조혈모세포 및 면역세 포의 활성산소 수준이 증가함을 나타내는 도이다.
WT: 야생형， 및 p53"/_: p53 결핍 .
도 51는 산화적 스트레스 조건하에서 ρ53— /_ 마우스의 생존율이 감소함을 나 타내는 도이다.
WT: 야생형， 및
p53_/": p53 결핍 .
도 5J는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스에 p53 억제제를 처리한 경우 마우스의 생존율이 감소함을 나타내는 도이다.
WT: 야생형，
KO: TXNIP녹아웃 마우스， 및
K0/PFT- α： TXNIP녹아웃 마우스에 p53 억제제를 처리한 군.
' 도 6A는 p53에 결합하는 TXNIP의 위치를 확인한 도이다.
도 6B는 TXNIP와 결합하는 p53의 도메인 (domain)을 확인한 도이다.
도 6C는 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 및 p53사이의 결합이 증가함을 나타내는 도이다.
도 6D는 TXNIP의 C247S 및 C267S 돌연변이는 p53과 결합하지 못하여 동일한 위치에 존재하지 않음을 나타내는 도이다.
도 6E는 TXNIP에 의해서 p53 및 MDM2 사이의 결합이 감소함을 나타내는 도 이다.
Vector: 대조군，
TXNIP(WT)： 야생형 TXNIP, 및
TXNIP(DW)： TXNIP의 이중 돌연변이.
도 6F는 TXNIP 및 p53 사이의 결합에 의해서 세포 내 p53—매개 전사활성이 증가함을 나타내는 도이다.
도 7A 및 7B는 조혈세포에서 p53 및 이의 표적 단백질의 발현을 확인한 도 이다. 도 7C는 TXNIP 결핍 세포주에서 p53 표적 단백질의 발현이 감소함을 나타내 는 도이다.
WT: 야생형， 및
KO: TXNIP녹아웃.
도 7D는 TXNIP 결핍 세포주에서 산화촉진 유전자 mRNA의 발현이 증가함을 나타내는 도이다.
WT: 야생형， 및
KO: TXNIP녹아웃.
도 7E는 산화적 스트레스 조건하의 TXNIP 결핍 세포주에서 p53의 활성변화 를 나타내는 도이다.
WT: 야생형， 및
KO: TXNIP녹아웃.
도 7F는 야생형 TXNIP 또는 p53을 형질주입한 골수세포를 골수이식한 마우 스에서 조혈모세포의 빈도가 회복되는 것을 나타내는 도이다.
WT(Fresh): 야생형 골수세포，
WT(Vector): 야생형 골수세포에 백터만을 형질주입한 군，
KO(Fresh)： TXNIP 결핍 골수세포 ,
KO(Vector): TXNIP 결핍 골수세포에 벡터만을 형질주입한 군，
K0(p53): TXNIP 결핍 골수세포에 p53을 형질주입한 군，
KO(TXNIP): TXNIP결핍 골수세포에 야생형 TXNIP를 형질주입한 군， 및
K0(DM)： TXNIP결핍 골수세포에 이중 돌연변이형 TXNIP를 형질주입한 군. 도 7G는 야생형 TXNIP 또는 p53을 형질주입한 골수세포를 골수이식한 마우 스의 생존율이 증가함을 나타내는 도이다.
WT/Vector: 야생형 골수세포에 백터만을 형질주입한 군
K0/Vector: TXNIP결핍 골수세포에 백터만을 형질주입한 군， K0/Txnip(WT)： TXNIP 결핍 골수세포에 야생형 TXNIP를 형질주입한 군， KO/Txnip(DM): TXNIP 결핍 골수세포에 이중 돌연변이형 TXNIP를 형질주입한 군， 및
K0/p53: TXNIP 결핍 골수세포에 p53을 형질주입한 군.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> TXNIP 결핍이 조혈모세포 (hematopoietic stem cell; HSC)에 미치는 영 향 확인
<1-1>실험동물의 준비
TXNIP 녹아웃 (knockout; K0) 마우스는 공지된 방법대로 제조하였고 (Lee et al. , 2005)， 유사유전자형의 (congenic) CD45.1+ C57BL/6 마우스 및
Figure imgf000024_0001
(B6.129S2-Trp53tralTyj/J)는 잭슨 연구소 (Jackson Laboratoryᅳ 미국)에서 구입하였다. 모든 마우스는 12시간 간격으로 빛-어둠이 반복되는 무균 동물시설에서 사육되었고， 8 내지 12주의 어린 마우스 및 22 내지 23개월의 늙은 마우스가 실험에 사용되었다. ρ53~ , Txnip^'im) 및 야생형 (wild type; WT) 마우스에 파라콰트 (paraquat) 40, 50 또는 80 nig/kg, 및 N-아세틸-시스테인 (N-acetyl-cysteine; NAC, Sigma-Aldr ich, 미국) 100 mg/kg 또는 PFT-α (Sigma, 미국) 5 nig/kg을 복강 내에 주사하였다. 모 든 실험은 실험동물연구소 (institute for l boratory animal research)의 실험동물 의 관리 및 사용을 위한 가이드 (guide for the care and use of laboratory animals)에 준수하여 수행되었다. <l-2> TXNIP결핍에 의한조혈모세포의 빈도 (frequency) 감소효과 확인
TXNIP 결핍이 조혈작용에 미치는 영향을 확인하기 위하여 어리거나 (12주) 늙은 (22 내지 23개월) Txnip+/\WV) 및 ΓΛ / Λ Ο) 마우스로부터 조혈모세포 (hematopoietic stem cell)의 빈도 (frequency)를 분석하였다.
구체적으로， 조혈줄기세포를 분석하기 위하여 쥐의 대퇴골， 경골과 좌골을 분리한 후， 막자사발을 이용하여 뼈로부터 골수세포를 분리하고 RPMI1640 배지에 현탁시킨 다음 원심분리하여 배지를 제거하고， 2% FBS가 포함된 PBS 완충용액으로 세포를 현탁시켜 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 그리고나서 다시 한 번 2% FBS가 포함된 PBS 완충용액으로 재현탁한 후 세포의 수를 결정하고 107 개의 세포 를 분주하였다. 리니지 +(Lineage+) 세포를 염색하기 위하여 바이오틴 (biot in)이 붙어 있는 Mac-1, Gr-1, Terll9, NK1.1, CD2 및 B220을 넣고ᅳ C-Kit(PE-Cy7) , Sca- KPE), CD150(PE-Cy5) , CD48(APC_Cy7)， CD34(FITC) , CD135(APC)를 같이 첨가하여 25분간 4°C에서 반응시켰으며 , 2% FBS가 포함된 PBS 완층용액으로 세포를 씻어내고 스트랩타비딘 (streptavidin)이 붙어있는 BD Horizon V450으로 25분간 4°C에서 반응 시켜 리니지 + 세포를 염색하였다. 상기 염색된 세포의 분석은 FACSanto II(BD Biosciences)를 사용하였다.
그 결과， 도 1A에 나타난 바와 같이， 늙은 야생형 마우스에서 HSC 빈도가 현저히 높고, 반면에 어린 녹아웃 마우스에서는 상대적으로 HSC 빈도가 감소한 것 을 확인하였다 (도 1A).
<실시예 2> TXNIP 결핍에 의한 경쟁적 골수증식 능력 (competitive repopulation capacity) 감소효과 확인
<2-1>골수 (bone marrow; BM) 세포의 준비
전체 골수 세포는 2% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지 (WelGENE, 대한민국)에서 배양된 마우스의 대퇴골 (femurs), 경골 (tibias 무명골 (hipbones) 및 견갑골 (shoulder bone)의 조직을 갈아서 분리하였고， 적혈구 (red blood cell; RBC)는 ACK 완충액 [0.15 M NH4C1, 1.0 mM KHC03, 0.1 mM EDTA(pH 7.0)]을 이용하여 용해되거나 용해되지 않았다. 또한， 상기 세포는 여과기를 이용하여 여과되었다. 골수 세포 는 당업계의 당업자에게 잘 알려진 방법으로 염색되었고 (Jeong et al., 2009), FACSCanto II를 이용하여 분석되었으며， Lineage— c-Kit+Sca+(LKS) 세포는 FACSAria 세포 선별기 (sorter)로 각각 분리되었다. Lineage"c-kit+(LK) 세포의 준비를 위해 서는 MACS 정제 방법을 사용하였다.
<2-2> TXNIP결핍에 의한 경쟁적 골수증식 능력을 감소효과 확인
상기 실시예 <2-1>의 방법으로 준비된 세포주를 이용하여 골수증식 능력을 확인하기 위하여 골수이식 (bone marrow transplantation; BMT)을 수행하였다.
구체적으로， 어리거나 늙은 야생형 또는 TXNIP 녹아웃 마우스 (CD45.2+) 또 는 이의 유사유전자형의 마우스 (CD45.1+)로부터 수득한 전체 골수세포 (whole bone marrow; WBM) 2.0 x 106 또는 LSK 세포 5.0 x 103개를 잘 섞어 흔합물을 제조하고， 상기 흔합물을 방사능을 조사한 (9 Gy) 야생형인 유사유전자형 (CD45.1+) 수여체 (recipient)의 정맥 내로 주사하였다. 공여체 (donor)-유래 세포의 골수증식은 표 면 마커에 대한 항체를 이용하여 꼬리 혈관 (tail vein) 및 골수 세포에 PB 염색을 통해 관찰되었다. 비-경쟁적 이식을 위해세 야생형 또는 TXNIP 녹아웃 마우스의 전체 골수세포 2.5 X 106개를 방사능 조사한 (9 Gy) 야생형인 유사유전자형 (CD45.1+) 수여 (recipient) 마우스의 정맥 내로 주사하였고， 8주 후에 분석을 수행 하였다. 또한， PB 염색은 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 ACK 용액 (0.15 M NH4C1, 1.0 mM KHC03, 0.1 mM MEDTA, pH 7.4)를 처리하여 적혈구를 제거하고 CD45.KFITC) 및 CD45.2(APC) 항체로 2% FBS가 포함된 PBS 완충용액으로 세포를 현 탁하여 4°C에서 20분간 염색한 후， 2% FBS가 포함된 PBS 완충용액으로 세포를 세척 하고， 다시 현탁하여 유세포 분석기로 분석하였다. 그 결과, 도 1C에 나타난 바와 같이 늙은 야생형 마우스의 LKS 및 전체 골 수세포의 골수증식 능력은 약간 변화를 나타냈으나, 반면 늙은 TXNIP 녹아웃 마우 스의 LKS 및 전체 골수세포의 골수증식 능력은 현저히 감소함을 확인하였다 (도 1C). 또한， 도 1D에 나타난 바와 같이 젊거나 늙은 TXNIP녹아웃 마우스로부터 수여받은 수여체의 전체 골수세포는 조혈모세포의 빈도 및 야생형 마우스로부터 수여된 전구 세포 (progenitor)에 비하여 현저히 감소함을 확인하였다 (도 1D).
<2-3> ΊΧ ΙΡ결핍에 의한공여체 -유래 골수세포의 감소효과확인
상기 실시예 <2-2>에서 수행된 골수이식을 2번 반복하여 공여체 -유래 골수 세포의 증식 능력을 확인하기 위하여 단계적 BMT검사 (serial BMT assay)를 수행하 였다.
구체적으로， 공여체 (CD45.2)로부터 분리된 골수세포 (2.0 X 106) 및 수여체 (CD45.1)로부터 분리된 골수세포 (1.0 X 106)를 잘 섞어주고 방사선을 조사한 (9 Gy) 수여체 (CD45.1)의 꼬리 정맥에 투여한 후， 16주 후에 공여체 및 수여체의 세포가 섞여있는 수여체의 골수세포 (2.0 X 106)을 분리하여 다시 방사선을 조사한 (9 Gy) 수여체 (CD45.1)의 꼬리 정맥에 투여한 후， 16주 후에 수여체에서 PB및 골수세포를 분석하였다.
그 결과， 도 1E 및 1F에 나타난 바와 같이 공여체 -유래 골수 세포의 증식능 력이 TXNIP녹아웃 마우스 유래한 수여체에서 현저히 감소하고 (도 IE), 또한， 골수 에 존재하는 조혈모세포 또는 전구세포를 확인한 결과， TXNIP 녹아웃 마우스 유래 한 수여체에서 현저히 감소함을 확인하였다 (도 IF).
<실시예 3>산화적 스트레스조건하에서 TXNIP의 조혈세포활성산소조절효과확인 <3-1> TXNIP 녹아웃 마우스에서 유래한 골수세포의 활성산소 수준 증가 확 인 ' 골수이식 후.， 초기 조혈모세포의 고갈이 활성산소의 축적에 의한 것인지 확 인하기 위하여 세포 내 활성산소의 수준을 측정하였다.
구체적으로, 어리거나 늙은 야생형 또는 TXNIP 마우스로부터 유래한 세포에 서 세포 내 활성산소의 양을 측정하기 위하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 사 용하였고, 이때， 활성산소-특이적 형광 탐침 (ROS— specific fluorescent probe)인 DCF(C6827) 및 DHE(D11347)( Invitrogen, 미국)가사용되었다. 실험에 사용될 세포 를 분리하자마자 2% FBS를 포함하는 PBS에 최종농도가 각각 5 μΜ DFC 또는 2.5 μ M DHE가 되도록 제조된 용액을 첨가하여 37°C 배양기에서 15분 동안 반웅시켜주었 다. 활성산소-특이적 형광탐침 반웅을 하기 전 조혈줄기세포를 분석하기 위하여 쥐의 대퇴골， 경골과 좌골을 분리한 후 막자사발을 이용하여 뼈로부터 골수세포를 분리하고 RPMI1640 배지에 현탁시킨 다음, 원심분리하여 배지를 제거하고 2% FBS가 포함된 PBS 완층용액으로 세포를 현탁시켜 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 다 시 한번 2% FBS가 포함된 PBS 완충용액으로 현탁시킨 후 세포의 수를 결정하고 107 개의 세포를 분주하였다. 상기 방법으로 조혈줄기세포를 염색하고 2% FBS를 포함 하는 PBS에 최종농도가 각각 5 μΜ DFC 또는 2.5 μΜ DHE가 되도록 제조된 용액을 첨가하여 37°C 배양기에서 15분 동안 반웅시킨 후， FBS를 포함하는 PBS로 상기 세포를 세척하고 유세포 분석기를 이용하여 세포분석을 수행하였다.
그 결과， 도 2A에 나타난 바와 같이 늙은 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세 포가 야생형 대조군과 비교하여 활성산소의 수준이 현저히 증가하는 것을 확인하였 다 (도 2A).
<3-2> TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포 이식 마우스에서 활성산소 수준 증가확인
TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포를 유지하는데 있어서 증가한 활성산소 의 영향을 확인하기 위하여 전체 골수세포 (CD45.2+)를 방사선을 조사한 야생의 유 사유전자형 (CD45.1+) 수여체에 이식하고 9개월 후， 세포 내 활성산소의 수준을 상 기 실시예 <2-1〉의 방법을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이 TXNIP 녹아웃 유래 골수세포에 있어서 활성산소의 수준이 현저히 높음을 확인하였다 (도 2B). 이는 본 발명의 TXNIP가 공 지된 바와 같이 티오레독신 (thioredoxin)을 억제하는 산화촉진제 (pn)-oxidant )로서 의 기능 (Lee et al. , 2005； Patwari et al. , 2006； Schulze et al .， 2002)외쎄 다 른 메카니즘에 의해서 활성산소로부터 조혈세포를 보호하는 것을 나타낸다.
<실시예 4>조혈세포에서 TXNIP에 의한항산화 활성 확인
<4-1>산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP의 결핍에 의한 활성산소 증가 유 도효과 확인
산화적 스트레스하의 조혈세포에서 TXNIP의 항산화 기능을 확인하기 위하여 어린 마우스에서 활성산소의 수준을 측정하였다.
구체적으로， 강한 산화적 스트레스 유도물질 (inducer)인 파라콰트 (paraquat)를 어린 마우스의 복강 내에 주사한 뒤， 세포 내 활성산소의 수준을 상 기 실시예 <2-1>의 방법으로 측정하였다.
그 결과， 도 2C에 나타난 바와 같이 TXNIP 녹아웃 마우스 유래한 골수세포 에서 활성산소의 수준이 유의적으로 높은 것을 확인하였다 (도 2C). <4-2> 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP의 결핍에 의한 세포사멸
(apoptosis)유도효과 확인
TXNIP 결핍이 산화적 스트레스에 의한 활성산소를 증가시키고， 또한 이에 따른 세포사멸을 유도하는지 확인하였다.
구체적으로， 강한 산화적 스트레스 유도물질 (inducer)인 파라콰트 (paraquat , 40 mg/kg)를 어린 마우스의 복강 내에 주사한 뒤 마우스로부터 골수세포를 분리하 고ᅳ 조혈줄기세포를 염색한 후 결합 (binding) 용액에 현탁한 세포에 Annexin V(BD Bioscience)를 5 ^ 첨가하여 빛이 차단된 상온 (25°C)에서 15분간 반웅시킨 뒤， 결 합 용액을 적당히 추가하여 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석하였다.
그 결과， 도 2D에 나타난 바와 같이 TXNIP 녹아웃 마우스 유래한 골수세포 에서 세포 사멸이 현저히 증가하였고 (도 2D)， 이는 TXNIP 녹아웃 조혈모세포가 활 성산소에 더욱 민감함을 나타낸다.
<실시예 5> TXNIP가산화적 스트레스조건하에서 조혈모세포의 골수증식 능력을조 절
<5-1> 산화적 스트레스 조건하에서 ΠΝΙΡ 녹아웃 마우스의 골수증식 능력 감소확인
조혈모세포의 골수증식 능력에 있어 산화적 스트레스의 영향을 확인하기 위 하여 경쟁적 골수증식 검사 (competitive repopulation assay)를 상기 실시예 <2-2> 의 방법으로 수행하였다.
그 결과， 도 3B 및 3C에 나타난 바와 같이 산화적 스트레스 조건하에서
TXNIP녹아웃 마우스 유래 골수세포는 골수증식 능력 및 조혈모세포 빈도가 감소한 것을 확인하였다 (도 3B 및 3C)
<5-2> 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP녹아웃 마우스 비장에서의 집락 형성단위 감소확인
산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포가 비장에 서 집락형성을 확인하기 위하여 집락형성단위 -비장 (colony forming unit-spleen; CFU-S)을 수행하였다.
구체적으로， 방사선 조사 (9 Gy)한 야생형의 유사유전자형 (CD45.1+) 수여체 에 야생형 또는 TXNIP 녹아웃 마우스에 산화적 스트레스를 유발하기 위해 파라콰트 를 처리한 1 x 105개의 골수세포를 정맥에 주사하였다. 이때 대조군 마우스에는 PBS를 처리해 주었다. 상기 마우스에서 비장을 분리하여 카르노이 용액 (Camoy's solution) [60% 에탄올， 30% 클로로포름， 1OT 아세트산 (V/V)]에 고정하고， 7일 후 미세한 콜로니 (microscopic colonies)의 수를 세었다.
그 결과， 도 3D에 나타난 바와 같이 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹 아웃 마우스 유래 골수세포의 집락형성단위 -비장 수가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 3D).
<5-3>산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP녹아웃 마우스의 생존율 감소 확 인
산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스의 생존율을 확인하기 위 하여 방사선보호 분석 (radioprotection assay)을 수행하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <2-2>의 방법으로 골수이식을 수행한 뒤， 야생형 골수세포의 생존율이 60% 이상이 되도록 수를 조절하였다. 적혈구 (red blood cell; RBC)는 공여체의 전체 골수세포로부터 분리되었고, 야생형에 PBS를 처리한 마우스， 야생형에 파라콰트를 처리한 마우스， TXNIP녹아웃에 PBS를 처리한 마우스 및 TXNIP녹아웃에 파라콰트를 처리한 마우스로부터 분리한 각각의 골수세포 1.5 X 105개를 방사선 조사된 (9 Gy) 유사유전자형 (CD45.1+) 수여체에 주사하였다. 상기 실험의 결과는 정상적인 혈액생성 과정으로 인해서 공여체 골수세포로부터 층분한 양의 조혈모세포를 받은 마우스는 골수이식 후에 생존이 가능할 수 있는 이유를 나 타낸다. 또한， 수여체 생존율은 매일 기록되었고, 카플란-메이어 생존곡선 (Kaplan-Meier survival curve)로 표入 1되었다.
그 결과 도 3E에 나타난 바와 같이 야생형과 비교하여， 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수세포는 낮은 생존율을 나타내었다 (도 3E). <5-4> TXNIP녹아웃마우스로부터 분리된 조혈모세포의 골수층식 능력 감소 확인
직접적으로 조혈모세포의 골수증식 능력을 확인하기 위하여 마우스로부터 LKS세포 (CD45.2+)를 분리하고ᅳ 경쟁적 골수증식 분석을 상기 실시예 <2-2>의 방법 으로 수행하였다.
그 결과， 도 3F 및 3G에 나타난 바와 같이， 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래된 LKS 세포주가 수여체에서 골수증식 능력 및 조혈모세 포 빈도에 있어서 현저히 감소함을 확인하였다 (도 3F 및 3G).
따라서ᅳ 상기 결과는 TXNIP가 산화적 스트레스 조건하에서 활성산소의 수준 을 조절함으로써 조혈모세포의 골수증식 능력을 유지함을 나타낸다.
<실시예 6>생체 내에서 TXNIP의 항산화효과확인
<6-1>산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP녹아웃 마우스의 생존율 감소 확 인
조혈모세포 유지에서 TXNIP의 역할에 기초하여， 본 발명자들은 TXNIP 결핍 이 조혈계 (hematopoietic system)에 미치는 영향올 생체 내 산화적 스트레스에 대 한 방어적인 면에서 확인해 보았다.
구체적으로, 산화적 스트레스 환경을 유도하기 위하여 40 mg/kg의 파라콰트 를 마우스에 주입하였고, 실험은 상기 실시예 <5-3>의 방법으로 수행되었다.
그 결과， 도 4A에 나타난 바와 같이 모든 TXNIP 녹아웃 마우스는 160 시간 내에 죽었으며， 그러나 야생형 마우스는 상기 시간 내에 죽지 않았고， 2개월 이상 생존하였다. 또한， 항산화제인 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC)을 처리 한 군에서는 TXNIP 녹아웃 마우스임에도 불구하고 약 70%의 회복율을 나타냈다 (도 4A) <6-2> 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 골수를 이식 한수여체의 생존율감소 확인
다른 조직에 있어서 독성효과의 가능성을 배제하고, 산화적 스트레스에 대 한 조혈세포의 진성반웅 (intrinsic response)을 결정하기 위하여 골수이식을 상기 실시예 <2-2>의 방법으로 수행하였고， 8주 후， 산화적 스트레스 환경을 유도하기 위하여 40 mg/kg의 파라콰트를 마우스에 주입하였다.
그 결과ᅳ 도 4B에 나타난 바와 같이 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 전체 골수세 포를 받은 마우스는 150 시간 내에 죽었으나， 야생형 마우스유래 전체 골수세포를 받은 마우스는 70%가 생존하였다 (도 4B).
<6-3> 산화적 스트레스 조건이 TXNIP 녹아웃 마우스의 비장 및 흉선 (thymus)에 미치는 영향 확인
상기 실시예 <6-3>의 실험에 사용된 마우스에서 비장을 분리하여 산화적 스 트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스 및 야생형 마우스의 비장을 관찰하였다. 구체적으로， 8주령의 야생형 마우스 및 TXNIP 녹아웃 마우스에 파라콰트를 40 mg/kg으로 복강에 투여하고， 96시간 후에 마우스로부터 비장 및 흉선을 꺼내어 바로 사진 촬영하였다.
그 결과， 도 4C에 나타난 바와 같이 산화적 스트레스에 노출된 TXNIP 녹아 웃 마우스의 비장 크기 및 세포질이 유의적으로 감소함을 확인하였다 (도 4C). 또 한, 상기 마우스의 흉선을 관찰한 결과， 도 4E에 나타난 바와 같이 산화적 스트레 스에 노출된 TXNIP 녹아웃 마우스에 있어서, 흉선에 유의적인 손상이 발생함을 확 인하였다 (도 4E).
<6-4> 산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스의 세포사멸 증가 확인
산화적 스트레스 하에서 TXNIP 녹아웃 마우스의 비장에서 세포사멸 (apoptosis)의 발생을 확인하기 위해서 TUNEL 분석 및 아넥신 V 염색 (annexin V staining)을 수행하였다.
구체적으로， 8주령의 야생형 마우스 및 TXNIP 녹아웃 마우스에 파라과트를
40 mg/kg으로 복강에 투여하고, 96시간 후에 마우스로부터 비장 및 흉선을 꺼내어 비장의 세포 수를 측정하고， 세포사멸을 측정하기 위하여 아넥신 V(Annexin V)를 염색하여 유세포 분석기로 확인하였으며， 일부는 1 포르말린 용액에 고정하여 비 장의 H&E 염색 및 세포사멸을 확인하기 위하여 TUNEL 염색을 당업계의 당업자에게 잘 알려진 방법으로 수행하였다.
그 결과， 도 4D에 나타난 바와 같아 산화적 스트레스에 노출돤 TXNIP 녹아 웃 마우스에서 세포사멸이 현저히 증가함을 확인하였다 (도 4D).
<실시예 Ί>산화적 스트레스 조건하에서 폐암 전이 증가 확인
숙주의 면역 시스템에 있어서， 산화적 스트레스의 영향을 확인하기 위하여 폐암의 전이를 측정하였다.
8-12주령의 야생형 마우스와 TXNIP 녹아웃 마우스에 B16-F10 흑색종 세포주 (melanoma cell)를 PBS 용액으로 현탁하여 마우스 한 마리당 5 x 105 세포를 꼬리 정맥으로 주사하고 이를 뒤부터 2일 간격으로 두 번 파라콰트를 20mg/kg으로 복강 주사하였다. 8일 후에 쥐의 폐를 분리하여 전이된 혹색종을 촬영하였다.
그 결과， 도 4F에 나타난 바와 같이 산화적 스트레스에 노출된 TXNIP 마우 스에서 암 전이가 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 4F).
<실시예 8> TXNIP의 결핍에 의한 암 전이 증가 확인
골수세포 이식을 통해서 면역세포의 항 -전이 반웅 (ant i -metastasis response)을 확인하기 위하여 폐암 세포를 이용하였다.
구체적으로， 야생형 및 TXNIP 녹아웃 공여 마우스로부터 골수세포 (CD45.2) 2.5 X 106개를 분리하여 9 Gy의 방사선을 조사한 수여 마우스 (CD45.1)의 꼬리 정맥 에 세포를 주입하고 8주 후， 상기 <실시예 7>의 방법으로 실험을 수행한 뒤， 13일 뒤에 폐를 분리하여 사진 촬영을 하였다.
그 결과， 도 4G에 나타난 바와 같이 TXNIP 녹아웃 마우스 유래 전체 골수세 포를 수여받은 마우스에서 폐 전이가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. (도 4G). 따라서 , TXNIP녹아웃 마우스에 있어서 파라콰트의 독성효과를 확인하였고, TXNIP 녹아웃 마우스는 산화적 스트레스 조건하에서 기능적인 면역 시스템을 유지 하지 못하는 것을 확인하였다. 또한， 상기 결과는 면역세포 및 조혈모세포를 포함 하는 전체 조혈세포에 있어서 TXNIP가 활성산소를 조절하는 항산화 단백질 역할을 하는 것을 나타낸다.
<실시예 9>골수세포에서 TXNIP단백질, 활성산소 및 p53수준의 상관관계 확인
<9-1>골수세포에서 활성산소 및 ΠΝΙΡ발현 수준의 관련성 확인
골수세포에서 활성산소 및 TXNIP 발현 수준 사이에 관련성을 확인하기 위하 여 상기 실시예 <3-1>의 방법을 사용하여 세포 내 활성산소 및 TXNIP 수준을 확인 하였다.
그 결과， 도 5A 및 5B에 나타난 바와 같아 골수세포에 있어서， 활성산소 및 TXNIP 수준 사이에 역상관관계 (inverse correlational" 있음을 확인하였다 (도 5A 및 5B).
<9-2>골수세포에서 활성산소 및 TXNIP의 발현 수준의 관련성 확인
최근 공지된 바에 의하면 종양 억제 단백질 (tumor suppressor protein)인 p53이 항산화 기능을 하고, 조혈모세포에서 과발현하는 것이 확인되었다. 따라서, 골수세포에서 TXNIP 및 p53 사이의 관련성을 확인하기 위하여 p53을 염색하여 그 수준을 확인하였고, 활성산소 수준은 상기 실시예 <3-1〉의 방법을 사용하여 측정되 었다. "
8 - 12 주령의 야생형 및 TXNIP 녹아웃 마우스로부터 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 골수세포를 분리하고， 조혈즐기세포와 마커 (Lin-c-KitSca-1)를 붙였으며， BD Cytofix/Cytoperm용액으로 얼음 위에서 30분 동안 고정하였다. 그리고나서 BD Perm/Wash 용액으로 세포를 씻어내고， Cytoperm Plus 용액으로 현탁 후 얼음에서 10분 동안 방치하였으며, 다시 한 번 BD Perm/Wash 용액으로 세포를 씻어주고， BD Cytofix/Cytoperm 용액으로 얼음 위에서 5분 동안 고정한 뒤 BD Perm/Wash 용액으 로 세포를 씻어주었다. 상기 세포를 2% FBS가 포함된 PBS용액으로 현탁하고 FITC 가 붙어있는 p53 항체를 넣어 30분 동안 상온에서 반웅시킨 후， 2% FBS가 포함된 PBS용액으로 세포를 씻어주고， 재현탁하여 유세포 분석기로 세포분석을 수행하였다. 그 결과， 도 5C 및 5D에 나타난 바와 같이 TXNIP 녹아웃 골수세포에서 p53 의 발현이 유의적으로 감소하고 (도 5C), 활성산소의 수준은 현저히 증가하는 것을 확인하였다 (도 5D).
따라서， 상기 결과는 TXNIP, p53의 발현， 및 활성산소의 조절에 관련성이 있음을 나타내고， 또한， 야생형 골수세포와 비교하였을 때 TXNIP 녹아웃 골수세포 에서 p53의 수준차는 적으나， 활성산소의 수준은 높은 차이를 나타냄을 확인하였다. 이는 TNXIP녹아웃 골수세포에서 활성산소가 p53에 의해서만 조절되지 않음을 나타 내고， TXNIP가 없을 때 p53의 수준 변화가 더욱 민감함을 확인하였다.
<실시예 10>조혈세포의 활성산소 조절에 있어서 p53의 기능 확인
<10-1> p53"/_ 조혈모세포 및 전구세포 (progenitor)에서 활성산소 수준 증가 확인
조혈세포의 활성산소 조절에 있어서 p53의 기능을 확인하기 위하여， p53ᅳ /一 조혈모세포 및 전구세포의 활성산소 수준을 상기 실시예 <3ᅳ1>의 방법을 사용하여 측정하였다.
그 결과， 도 5E에 나타난 바와 같이 p53ᅳ /_ 조혈모세포 및 전구세포가 야생 형 조혈모세포 및 전구세포에 비해서 활성산소 수준이 높은 것을 확인하였다 (도 5E).
<10-2> TXNIP 및 p53의 더블녹다운 (double knock-down)에 의한 활성산소의 증가효과확인
TXNIP의 발현이 억제된 세포에 p53의 발현을 억제시켜 더블녹다운 (double- knock-down)을 시켜 활성산소의 수준을 측정하였다.
구체적으로， shRNA를 발현할 수 있는 레트로바이러스를 생산하기 위하여 Platinum-E retroviral packaging 세포주 (Cel IBiolabs, 미국)를 사용하였고， shRNA 는 HuSH-29 shRNA(0riGene, 미국)를 이용하였다. 상기 세포주로부터 얻어진 바이 러스를 8 내지 12 주령의 야생형 및 TXNIP 녹아웃 마우스로부터 분리한 LKS 세포에 3일 동안 3회 감염시켜 유전자의 발현을 실시간 PCR(real-time PCR)로 확인하고, 활성산소의 수준을 확인하였다. 실험의 사용된 shRNA의 서열은 하기에 나타난 바 와 같다:
mTXNIP (서열번호 1): 5'-G TCTMGGTGATGTTCTTAGCACTTTA-3'， 및
mp53 (서열번호 2 )： 5 ' -TGGCCATCTACAAGAAGTCACAGCACATG-3 ' .
또한， p53 억제제인 PFT-α (Sigma, 미국)는 마우스에 5 nig/kg으로 복강주사 한 뒤, 48시간 후에 상기 실시예 <3-1〉의 방법을 사용하여 활성산소의 수준을 측정 하였다. 그 결과， 도 5F 및 5G에 나타난 바와 같이 p53 shRNA를 처리하거나， p53 특 이 억제제인 PF -α를 처리한 경우， TXNIP — 조혈모세포 및 전구세포에서 활성산소 의 수준이 더욱 증가한 것을 확인하였다 (도 5F 및 5G).
<10-3>산화적 스트레스 조건하에서 p53의 항산화효과확인
산화적 스트레스 조건하에서 p53의 항산화 효과를 확인하기 위해서 P53+ 마우스에 파라콰트를 처리한 뒤， 상기 실시예 <3-1>의 방법을 사용하여 활성산소의 수준을 측정하였다.
그 결과， 도 5H에 나타난 바와 같이 산화적 스트레스 조건하에서 p53— /_ 조 혈모세포 및 면역세포의 활성산소 수준이 증가하는 것을 확인하였다 (도 5H). <10-4>산화적 스트레스조건하에서 p53ᅳ /ᅳ마우스의 생존율 감소 확인
p53"/_ 마우스에 파라콰트 50 mg/kg를 주사하여 산화적 스트레스 환경을 만 돌어주고， 마우스의 생존율을 상기 실시예 <5-3>의 방법을 이용하여 확인하였다. 그 결과， 도 51에 나타난 바와 같이 야생형의 마우스와 비교하여， 산화적 스트레스 환경하에서 p53_/— 마우스의 생존율이 현저히 감소함을 확인하였다 (도 51).
<10-5>산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP 녹아웃 마우스에 p53 억제제 처 리에 따른마우스의 생존율 감소확인
산화적 스트레스 환경올 유도하기 위하여 파라콰트 40 nig/kg를 야생형 마우 스， Txni ^마우스 및 PFT-α를 처리한 Txni^—마우스에 주사한 후， 마우스들와 생존율을 상기 실시예 <5-3>의 방법을 이용하여 확인하였다.
그 결과， 도 5J에 나타난 바와 같이 PFT-a를 처리한 Txnip—,— 마우스가 산 화적 스트레스에 가장 민감한 것으로 확인되었다 (도 5J).
따라서， 상기 결과는 조혈모세포 및 면역세포 모두에 있어서 활성산소의 수 준을 조절하기 위해 TXNIP가 p53과 결합함을 나타낸다. <실시예 11> TXNIP및 p53의 직접적인 상호작용 (interact ion) 확인
<11-1> TXNIP의 순차적 돌연변이체 제작
p53과 결합하는 TXNIP 단백질의 결합부위를 확인하기 위하여 , TXNIP의 순차 적 돌연변이를 제작하였다.
구체적으로， 인간 GST-TXNIP 및 FLAG-TXNIP 컨스트럭트 (construct)를 TXNIP 돌연변이체 (mutant)의 부위 특이적 돌연변이 유도 (site-directed mutagenesis)를 위하여 주형으로 사용하였고 상기 돌연변이체의 제작을 위해서 QuickChange II site-directed mutagenesis kitCStratagene, 미국)를 제조사의 사용설명서대로 사 용하였다. 또한， 상기 돌연변이 컨스트럭트의 제작을 위해 사용한 프라이머는 하 기 표 1에 나타내었다.
【표 11
Figure imgf000039_0001
<ll-2> p53과 결합하는 TXNIP의 결합부위 확인
상기 실시예 <11-1>의 방법으로 제작한 컨스트럭트를 사용하여 p53과의 결 합부위를 확인하기 위하여 GST 풀다운 (pull-down)을 수행하였다.
구체적으로， 상기 컨스트력트를 세포에 주입한 후， 48시간 뒤에 세포의 용 해물 (lysate)를 얻었다. 500 에 해당하는 용해물을 분주하고， 각각 GST-4B 비드 (bead)를 넣었으며， 4°C에서 4시간 동안 반웅시켜 비드를 침강시키고， 용해 (lysis) 용액으로 3회 세척한 뒤 SDS 로딩 (loading) 용액을 처리하고 SDS-PAGE를 수행하였 다. 그 후, PVDF 막 (membrane)에 옮겨 당업자에게 잘 알려진 방법으로 웨스턴 블 랏을 수행하였다.
그 결과， 도 6A에 나타난 바와 같이 TXNIP의 247 및 267 위치의 시스테인
(cystein) 잔기가 p53과의 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다 (도 6A).
<11-3> p53의 결실 돌연변이체 (deletion mutant) 제작 및 TXNIP와의 결합부 위 확인
이번에는 TXNIP와 결합하는 p53의 부위를 확인하기 위해서 두 개의 결실 돌 연변이체를 제작하였다.
구체적으로 C-말단 또는 N-말단 p53 DNA-결합 도메인 (DNA binding-domain;
DBD)의 결실 돌연변이를 제작하기 위하여 pfu polymerase mix(바이오니아， 대한민 국)을 이용하여 p53 단편을 증폭하였고， pCMV-Flag 백터의 해당 제한효소 자리에 클로닝을 수행하였다. 이때， 사용된 프라이머는 하기에 나타내었다. TXNIP와의 결합부위를 확인하기 위하여 상기 실시예 <11-2>의 방법으로 GST 풀다운을 수행하 였다.
EcoRI/XhoI) forward (서열번호 11)： 5 ' -GCGMTTCTTCTTGCATTCTGGGACA-3 '， DBD(^ /A o/)reverse (서열번호 12): 5 ' -GCCTCGAGGCGGAGATTCTCTTCCTC-3 ' , DBD-N( /?/A¾ r)for\vard (서열번호 13): 5 ' -GCGMTTCrTCTTGCATTCTGGGACA-
3' ,
DBD-N(£a?/A o/)reverse (서열번호 14)： 5' -GCCTCGAGCAMTTTCCTTCCACTCG-
3'，
DBD-C a?/A¾¾ 0 forward (서열번호 15): 5 ' -GCGMTTCCGTGTGGAGTATTTGGAT- 3'， DBI)-C0 o?/A i/)reverse (서열번호 16)： 5' -GCCTCGAGGCGGAGATOTOTCCTC-
3'.
그 결과， 도 6Β에 나타난 바와 같이 ΤΧΝΙΡ가 5개의 시스테인 잔기를 포함하 는 ρ53의 Cᅳ말단 DNA-결합 도메인 부위와 상호작용하는 것을 확인하였다 (도 6Β).
<11-4>산화적 스트레스조건하에서 ΤΧΝΙΡ및 ρ53의 결합증가 확인
산화적 스트레스 조건하에서 ΤΧΝΙΡ 및 ρ53의 결합이 어떻게 변하는지 확인 하기 위하여 면역침강법 (immunoprecipitation)을 수행하였다.
구체적으로， 세포에 ¾02를 처리한 후， 세포의 용해물을 수득하였다. 상기 용해물의 단백질을 정량하여 500 이 되도록 각각 분주한 뒤， 토끼ᅳ TXNIP rabbit- TXNIP) 항체를 첨가하고 4°C에서 1시간 동안 반응시켰고， 상기 1차 항체와 결합할 수 있는 단백질 G—아가로스 비드 (protein G-agarose bead, Roche, 미국)을 첨가하 여 4시간 동안 추가로 반웅시켰다. 모든 반응이 끝난 후， 용해 용액으로 상기 비 드를 3회 세척하고， SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 당업계에 잘 알려진 방법으로 수행 하였다.
그 결과， 도 6C에 나타난 바와 같이 ¾02를 처리하여 산화적 스트레스 환경 으로 만들어 주었을 경우 TXNIP 및 티오레독신 (thioredoxin; TRX) 사이의 결합이 해리 (dissociation)되고， TXNIP 및 p53 사이의 결합이 현저히 증가하는 것을 확인 하였다 (도 6C).
<11-5> TXNIP이중 돌연변이 및 p53의 세포 내 위치 확인
산화적 스트레스 조건하에서 TXNIP의 C247S 및 C267S 돌연변이 및 p53사이 의 결합을 확인하기 위하여 면역염색 (immunostaining)을 수행하였다.
구체적으로， 10% FBS 및 마우스 IL-3 ng/ra이 포함된 RPMI-1640 배지에서 배 양된 뮤린 골수 -유래 프로ᅳ B 세포주 (murine bone marrow-derived pro-B cell)인 Baf3세포주에 야생형 TXNIP또는 이중 돌연변이 (double mutation; DM) TXNIP를 과 발현시켜 면역염색에 사용하였다. 상기 세포주를 Cytofix/Perm 용액 (BD Biosciences, 미국)을 이용하여 고정 (fixed) 및 투과화 (permeabi Hzed)한 후， 2% FBS를 포함하는 PBS에서 p53 1차 항체 (Santa Cruz, 미국)를 첨가하여 1시간 동안 반웅시킨 후, PBS로 3번 세척하고 Alexa Fluor 488 또는 546(Invitrogen, 미국)의 2차 항체를 처리하여 반웅시켰으며， 염색 결과는 LSM510공초점 현미경 (Carl Zeiss 독일)으로 관찰하였다.
그 결과， 도 6D에 나타난 바와 같이 TXNIP의 C247S 및 C267S 돌연변이는 p53과 결합을 하지 못해， 세포 내에서 p53의 발현을 증가시키지 않음을 확인하였다 (도 6D).
<11-6> TXNIP에 의한 p53및 DM2사이의 결합감소효과확인
p53의 안정성은 유비퀴틴화-의존적 프로테오좀의 분해 (ubiquitinat ion- dependent proteosomal degradat ion)를 통해 MDM2에 의해 조절되는 것이 공지되어 있다 (Sasaki et al . , 2011). 이에， TXNIP가 p53 및 MDM2의 결합에 어떠한 영향올 미치는지 확인하기 위하여 면역침강을 상기 실시예 <11-4>의 방법으로 수행하였고， 이때， 항 -MDM2(Santa Cruz, 미국)， 항 -p53(Santa Cruz , 미국) 및 항- TXNIPdnvitrogen, 미국) 1차 항체를 사용하였다.
그 결과， 도 6E에 나타난 바와 같이 TXNIP에 의해서 p53 및 MDM2의 결합이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 6E).
<11-7 TXNIP및 p53결합 -매개 전사활성의 증가확인
P53 및 TXNIP의 결합에 의해서 p53의 기능에 어떤 영향을 미치는지 확인하 기 위해서 리포터 분석 (reporter assay)을 수행하였다.
구체적으로， 10% FBS 및 마우스 IL-3 ng/ηώ이 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양된 뮤린 골수 -유래 프로 -B 세포주인 Baf3 세포주에 TXNIP 또는 TXNIP (이중 돌 연변이체)를 p53-Luc 리포터 및 pRL-CMV 플라스미드 백터와 리포펙타민-폴러스 (lipofectamine-plus)를 사용하여 제조사의 사용설명서대로 형질감염 (transfection)하였다. 루시퍼라제 활성 ( luci f erase activity)는 p53— Luc 리포터 를 사용하여 관찰되었고， 레닐라 (renilla) 루시퍼라제 -발현 백터 (luciferase- expression vector, Pr omega, 미국)를 함께 형질감염하여 형질감염의 효율 (efficiency)을 확인하였다. 파이어폴라이 (firefly) 및 레닐라 루시퍼라제 활성은 Dual -Luc if erase Reporter Assay Sys t em (Pr omega, 미국)을사용하여 측정하였다. 그 결과， 도 6F에 나타난 바와 같이 TXNIP 및 p53 사이의 결합에 의해서 세 포 내에서 p53-매개 전사 활성이 유의적으로 증가하였다 (도 6F). ,
따라서， 상기 결과들은 TXNIP가 p53 및 MDM2 사이의 결합을 방해하여 p53 안정성을 증가시키고， p53의 전사 활성을 유도함을 나타낸다.
<실시예 12>생체 내에서 TXNIP가 p53의 항산화 효과 매개 확인
<12-1>조혈세포에서 p53및 이의 표적 단백질의 발현 확인
TXNIP가 p53-의존적 항산화 유전자의 발현을 통해서 p53의 항산화 활성을 조절할 수 있는 가능성을 확인하기 위하여 야생형의 LKS 및 LK 세포주에서 p53 및 이의 표적 유전자인 SESNl, SESN2, GPX-1, P21 등의 발현을 확인하기 위하여 면역 염색 및 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로， 면역염색은 상기 실시예 <11-5>의 방법대로 수행되었다. 또한， 웨스턴 블랏을 수행하기 위하여 세포주를 PBS로 세척하고， 0.1% Nonidet P-40, 10 nig/m 아프로티닌 (aprotinin), 10 rag/ 류펩틴 ( leupeptin)， 10 mM 불화나트륨 (sodium fluoride), 2 nig/nrf a-1-안티트립신 (a- 1— antitrypsin)， 2 mM 피로인산나트 륨 (sodium pyrophosphate) , 25 mM β-글리세로인산 나트륨 (sodium β- glycerophosphate) , 1 mM 나트륨 오르토바나데이트 (sodium orthovanadate) 및 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)가 첨가된 용해 용액 [20 mM HepesCpH 7.9), 10 mM EDTA, 0.1 M KCl, 0.3 M NaCl] 1 x RIPA완충액을 첨가하여 세포를 용균시켰 다. 상기 용균된 세포에서 추출한 단백질은 원심분리를 수행하여 상층액을 수득하 였고， BCA 방법을 이용하여 상층액의 단백질 농도를 정량하였다. 그리고나서， 동 량의 단백질을 PAGE 전기영동법으로 SDS 러닝 완충액 (running buffer)을 사용하여 분리하고， 이를 PVDF 막으로 이동시켜 0.1% 트윈 20(tween 20) 및 5)무지방 우유 (skim milk)가 첨가된 PBS로 전처리를 하였다. 그리고 p53, GPX-1, p21 및 β—액 틴에 대한 1차 항체를 처리하여 4°C에서 하룻밤 동안 반웅시키고， PBS로 세척한 뒤 2차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반웅시켰다. 막은 ECUPierce, 미국) 용액을 사용하여 현상하였다.
그 결과， 도 7A 및 7B에 나타난 바와 같이 p53 및 이의 표적 유전자인 SESN1, SESN2, GPX-1 및 p21 단백질의 발현을 확인할 수 있었다 (도 7A 및 7B).
<12-2> TXNIP결핍 세포주에서 p53표적 유전자의 발현 감소 확인
야생형 및 TXNIP가 결핍된 LKS 세포주에서 p53 표적 유전자의 mRNA 발현 수 준을 확인하기 위하여 정량적 실시간 PCR( quantitative real-time PCR) 및 RT-PCR 을 수행하였다.
구체적으로， LKS 세포로부터 TRIzol 및 RNeasy Micro kit(Qiagen, 미국)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였고, 정량적 PCR은 SYBR Premix ExTaq(Takara Bio, 일 본) 및 Thermal Cycler Dice Real-Time System TP800(Takara Bio, 일본)을 이용하 여 수행되었다. RT-PCR은 Maxime PCR premix kit(Intron biotechnology, 대한민 국)를 사용하여 제조사의 사용설명서대로 수행하였으며, 이때 사용된 프라이머는 하기 표 2에 나타난 바와 같다.
[표 2】
프라이머 이름 서열 (5'→3') 서열번호
Figure imgf000045_0001
그 결과， 도 7C에 나타난 바와 같이 야생형 LKS 세포주와 비교하여 TXNIP 결핍 세포주에서는 항산화 효과를 나타내는 p53 표적 단백질의 발현이 감소한 것을 확인하였다 (도 7C).
<12-3>丽 P 결핍 세포주에서 산화촉진 유전자 (pro-oxidant gene)의 발현 증가확인
TXNIP 결핍 세포주에서 세포사멸 (apoptosis)을 유도하는 산화촉진 유전자의 발현 변화를 확인하기 위해서 상기 실시예 <12-3>의 방법으로 mRNA의 발현 수준을 확인하였으며， 이때 사용된 프라이머는 상기 표 2에 나타내었다.
그 결과， 도 7D에 나타난 바와 같이 TXNIP 결핍 세포주에서 산화촉진 유전 자인 CDKN1A, BAX 및 PUMA의 mRNA 발현 수준이 현저히 증가하는 것을 확인하였다 (도 7D). 따라서， 상기 결과는 TXNIP 녹아웃 마우스에서 활성산소의 수준이 현저 히 증가하는 것이 p53 활성과 연관이 있을 것을 나타낸다. <12-4>산화적 스트레스조건하에서 TXNIP발현 변화에 따른 p53활성 변화 확인
산화적 스트레스 환경에 노출 시간에 따라 TXNIP의 발현 변화 및 이에 따른 p53의 활성변화를 상기 실시예 <12ᅳ1>의 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였고， 이때 phospho-p53(S15)(Cell signaling, 미국)， p53( Santa Cruz, 미국)， TXNIPdnvitrogen, 미국) 및 GAPDH( Santa Cruz, 미국)에 대한 1차 항체를 사용하였 다.
그 결과， 도 7E에 나타난 바와 같이 리니지—(lineage— ) 세포주에 있어서， 산 화적 스트레스 환경에서 TXNIP의 발현이 증가하고， p53 활성와 다른 동력학 (kinetics)을 나타냄을 확인하였다 (도 7E).
<12-5>생체 내에서 ΠΝΙΡ및 p53의 상호작용에 의한항산화활성 확인
TXNIP 및 p53의 상호작용에 의한 항산화 활성을 직접적으로 확인하기 위해 서 야생형의 TXNIP, 이중 돌연변이체 TXNIP 또는 p53 유전자를 TXNIP 녹아웃 마우 스 유래 골수세포에 형질주입하였고， 이들 세포를 상기 실시예 <2-2>의 방법으로 유사유전자형 (CD45.1+) 수여체에 골수이식을 수행하였다. 골수이식 8주 후， 상기 수여체에 파라콰트 (paraquat ) 40 mg/kg을 투여하고， 상기 실시예 <1— 2>의 방법으로 조혈모세포의 빈도 (frequency) 및 상기 실시예 <5-3>의 방법으로 생존을을 측정하 였다.
그 결과， 도 7F에 나타난 바와 같이 야생형 TXNIP 또는 p53을 형질주입한 세포를 골수이식한 마우스의 경우 조혈모세포의 빈도가 회복되었고 (도 7F), 또한， 도 7G에 나타난 바와 같이, 상기 마우스의 생존율이 증가하는 것을 확인하였다 (도 7G).
따라서， 상기 결과는 생체 내에서 p53과의 상호작용을 통하여 TXNIP가 항산 화 효과가 있음을 나타낸다 (도 7H)

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
7 V/KThioredixin— interacting protein) 유전자를 포함하는 유전자 전달체 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 약학적 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 유전자는 서열번호 29 및 30으로 구성된 염기 서열로 기재된 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 유전자 전달체는 백터 또는 재조합 바이러스인 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
[청구항 4】
제 3항에 있어서， 상기 백터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA또는 재조합 바이 러스성 백터인 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스， 아데노 바이러 스, 아데노 부속 바이러스 및 해르페스 심플렉스 바이러스로 구성된 군으로부터 선 택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
【청구항 6]
제 1항에 있어서， 상기 세포는 조혈모세포 또는 수지상 세포인 것을 특징으 로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
【청구항 7】
제 1항에 있어서， 상기 면역증강은 면역 시스템의 항상성 유지에 의한 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 면역증강은 조혈모세포 (hematopoietic stem cell)의 항상성 유지에 의한 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학적 조성물.
【청구항 9】
제 1항에 있어서， 상기 면역증강은 TXNIP 및 p53 사이의 상호작용 (interaction)에 의한 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 면역증강용 약 학적 조성물.
【청구항 10】
유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성 분으로 함유하는 면역증강용 건강식품.
【청구항 11】
유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성 분으로 함유하는 암 전이억제용 약학적 조성물.
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 암 전이억제용 약 학적 조성물.
【청구항 13】
유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성 분으로 함유하는 암 전이억제용 건강식품.
【청구항 14】
7 V/ 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성 분으로 함유하는 혈액질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 15】
제 14항에 있어서， 상기 혈액질환은 빈혈， 다혈증， 백혈병， 골수이형성증, 골수 섬유증， 혈소판 감소증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징 으로 하는 혈액질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 16】
V/尸유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질을 유효성 분으로 함유하는 혈액질환 예방 및 개선용 건강식품.
【청구항 17】
약학적으로 유효한 양의 V/P유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또 는 TXNIP단백질을 면역 이상이 생긴 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역증강방 법.
【청구항 18】
약학적으로 유효한 양의 유전자를 포함하는 유전자 전달체 , 세포 또 는 TXNIP 단백질을 전이된 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 억 제 방법 .
【청구항 19】
제 18항에 있어서， 상기 암은 폐암인 것올 특징으로 하는 암 전이 억제 방 법.
【청구항 20】
약학적으로 유효한 양의 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또 는 TXNIP단백질을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 예방 방법 .
【청구항 21】
제 20항에 있어서， 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 암 전이 예방 방 법.
【청구항 22]
약학적으로 유효한 양의 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또 는 TXNIP단백질을 혈액질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈액질환 치 료 방법 .
【청구항 23]
제 22항에 있어서ᅳ 상기 혈액질환은 빈혈， 다혈증， 백혈병, 골수이형성증， 골수 섬유증, 혈소판 감소증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것올 특징 으로 하는 혈액질환 치료 방법.
【청구항 24】
약학적으로 유효한 양의 7 ¥/^유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또 는 TXNIP단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈액질환 예방 방법 .
【청구항 25】
제 24항에 있어서， 상기 혈액질환은 빈혈， 다혈증， 백혈병 골수이형성증， 골수 섬유증， 혈소판 감소증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징 으로 하는 혈액질환 예방 방법 .
【청구항 26】
면역증강용 약학적 조성물로 사용하기 위한， ¾ 유전자를 포함하는 유전 자 전달체， 세포 또는 TXN1P단백질.
【청구항 27】
암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한， 유전자를 포함하는 유전자 전달체, 세포 또는 TXNIP단백질.
【청구항 28]
암 전이 예방용 약학적 조성물로 사용하기 위한， ίΥ/7유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP단백질.
【청구항 29】
제 27항 또는 제 28항에 있어서， 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질.
【청구항 30】
혈액질환 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한， 7 V/尸유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질.
【청구항 31]
혈액질환 예방용 약학적 조성물로 사용하기 위한， 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질.
【청구항 32】
제 30항 또는 제 31항에 있어서， 상기 혈액질환은 빈혈， 다혈증， 백혈병， 골수이형성증， 골수 섬유증, 혈소판 감소증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하 나인 것을 특징으로 하는 TXNIP 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 TXNIP 단백질.
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