WO2014193052A1 - 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법 - Google Patents

사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법 Download PDF

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polynucleotide
microorganisms
medium
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김선원
장희정
이현서
윤상활
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경상대학교산학협력단
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    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium

Definitions

  • the present invention relates to a Corynebacterium comprising a polynucleotide encoding a Pycos 3-epimerase enzyme and a method of producing Pycos using the same.
  • D-psicose is an epimer of carbon number 3 of fructose (D-fructose), which is sweet like ordinary sugars, but is not metabolized in the human body. It is a functional sugar that can be used as a sugar substitute functional sweetener. In addition, it has the function of reducing the abdominal obesity by inhibiting the enzyme activity involved in lipid synthesis in the liver, and is a sugar currently being studied as a therapeutic agent for diabetes and atherosclerosis.
  • Ken Izumori et al Used galacitol, D-tagatose or D-talitol by utilizing microbial cell reactions. It has been shown that it is possible to produce psychocos from. However, these substrates also have the disadvantage that they are relatively rare in nature and have a high cost.
  • D-tagatose-3-epimerase of isolated microorganism Pseudomonas cichorii ST-24 is produced and purified from recombinant E. coli.
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 2006-125971 discloses a method for producing a psychos by a psychos epimerase.
  • a Corynebacterium microorganism comprising a polynucleotide encoding an enzyme having an activity catalyzing the conversion of fructose to a psychose, wherein the polynucleotide encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • microorganism of 1 above wherein the microorganism is the polynucleotide introduced into a Corynebacterium glutamicum strain.
  • microorganism according to any one of the preceding items, wherein the polynucleotide is introduced into the microorganism by itself or using a vector.
  • the microorganisms of the present invention are capable of mass production of psychoses from fructose with high efficiency while being safe.
  • Figure 1 shows the results of measuring the amount of psychos from the Corynebacterium glutamicum transformants incorporating cyclose 3-epimerase.
  • the gray bar is the result of 24 hours of psychos production
  • the dark gray bar is the result of 48 hours of psychos production.
  • Figure 2 is a result of measuring the amount of Pseudopsis while recovering and cultured four times the Corynebacterium glutamicum transformed cells incorporating Pycos 3-epimerase.
  • Panel A shows the results of the cycle production
  • panel B shows the concentration of the cells
  • Panel C shows the results of dividing the cycles produced by the cell concentration.
  • the present invention includes a polynucleotide encoding an enzyme having an activity of catalyzing the conversion of fructose to a psychocos, wherein the polynucleotide encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, thereby safely and efficiently purifying the fructose from fructose.
  • the present invention relates to a Corynebacterium microorganism capable of mass production, and a method for producing a psychosis using the same.
  • Corynebacterium microorganism of the present invention comprises a polynucleotide encoding an enzyme having an activity that catalyzes the conversion of fructose to the psychos, the polynucleotide encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a MKHGIYYSYW EHEWSAKFGP YIEKVAKLGF DIIEVAAHHI NEYSDAELAT IRKSAKDNGI ILTAGIGPSK TKNLSSEDAA VRAAGKAFFE RTLSNVAKLD IHTIGGALHS YWPIDYSQPV DKAGDYARGV EGINGIADFA NDLGINLCIE VLNRFENHVL NTAAEGVAFV KDVGKNNVKV MLDTFHMNIE EDSFGDAIRT AGPLLGHFHT GESNRRVPGK GRMPWHEIGL ALRDINYTGA VIMEPFVKTG GTIGSDIKVW RDLSGGADIA KMDEDARNAL AFSRFVLGG.
  • Corynebacterium microorganism of the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide, for example, Corynebacterium glutamicum, preferably Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Corynebacterium glutamcium ATCC13032, taxid GenBank NID: NC_003450, ATCC13032) may be introduced into the polynucleotide.
  • Corynebacterium glutamicum preferably Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Corynebacterium glutamcium ATCC13032, taxid GenBank NID: NC_003450, ATCC13032) may be introduced into the polynucleotide.
  • Corynebacterium glutamicum ATCC13032 has been deposited with ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, USA).
  • Corynebacterium glutamicum is a GRAS (Generally Recognized as Safe) strain, and in particular, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 is an enzyme having an activity that catalyzes the conversion of fructose to psychos, when the polynucleotide comprises the polynucleotide. Can be produced with excellent efficiency, and the conversion rate of fructose to psychos is very excellent.
  • the enzyme may be an enzyme derived from Agrobacterium tumefaciens.
  • the polynucleotide encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide may be introduced by any method known in the art.
  • the polynucleotide may be introduced into the polynucleotide itself or by a vector, for example.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of delivering other nucleic acids to which it is linked. From the standpoint of nucleic acid sequences that mediate the introduction of specific genes, in the present invention, a vector is interpreted to be used interchangeably with a nucleic acid construct and a cassette.
  • Vectors include, for example, plasmids or viral derived vectors. Plasmid refers to a circular double stranded DNA ring to which additional DNA can be linked. Vectors used in the present invention include, for example, a plasmid expression vector, a plasmid shuttle vector, a virus expression vector (e.g., a replication defective retrovirus vector, a retrovirus vector, an adenovirus vector, a herpes simplex virus vector, a poxvirus vector, a lenti Viral vectors, adeno-associated viral vectors, etc.) and viral vectors capable of performing equivalent functions thereof are included, but are not limited to these.
  • virus expression vector e.g., a replication defective retrovirus vector, a retrovirus vector, an adenovirus vector, a herpes simplex virus vector, a poxvirus vector, a lenti Viral vectors, adeno-associated viral vectors, etc.
  • viral vectors capable of performing equivalent functions thereof are included, but
  • the polynucleotide may be operably linked with one or more elements consisting of a promoter and a transcription terminator.
  • the polynucleotide may be operably linked with a regulatory element.
  • the regulatory element may be selected from the group consisting of chemical inducible elements and temperature sensitive elements.
  • the chemical inducible element may be selected from the group consisting of lac operon and arabinose operon.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium according to the present invention is a ptsF (EII Fru , fruA, NCgl1861, GI: 19553141, GI: 19553141, EC 2.7), which is a PTS transport system that transports into cells while converting endogenous di-fractose into di-fractose 1-phosphate. .1.69) may be missing or inactivated gene having a homology of 80% or more, preferably the same gene may be missing or inactivated.
  • Psychoses are generated from D-fructose, so depletion or inactivation of the gene can inhibit the phosphorylation of fructose, which can significantly improve the production efficiency of psychos.
  • the ptsF gene may be encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • Amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is MNSVNNSSLV RLDVDFGDST TDVINNLATV IFDAGRASSA DALAKDALDR EAKSGTGVPG QVAIPHCRSE AVSVPTLGFA RLSKGVDFSG PDGDANLVFL IAAPAGGGKE HLKILSKLAR SLVKKDFIKA LQEATTEQEI VDVVDAVLNP APKTTEPAAA PAAAAVAESG AASTSVTRIV AITACPTGIA HTYMAADSLT QNAEGRDDVE LVVETQGSSA VTPVDPKIIE AADAVIFATD VGVKDRERFA GKPVIESGVK RAINEPAKMI DEAIAASKNP NARKVSGSGV AASAETTGEK LGWGKRIQQA VMTGVSYMVP FVAAGGLLLA LGFAFGGYDM ANGWQAIATQ FSLTNLPGNT VDVDGVAMTF ERSGFLLYFG AVLFATGQAA MGFIVAALSG YTA
  • the microorganism of the genus Corynebacterium according to the present invention has a homology of 80% or more with mtlD (NCgl0108, GI: 19551360, EC 1.1.1.67) encoding mannitol 2-dehydrogenase
  • the gene may be deleted or inactivated, and preferably, the same gene may be deleted or inactivated.
  • fructose is converted to D-mannitol by mannitol 2-dihydrogenase
  • deletion or inactivation of the gene can suppress the reduction of fructose, thereby significantly improving the production efficiency of psychos. can do.
  • the mtlD gene may be encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is MNTPLQLNTE NLQEIASTSG VQIPAFNRAD VAPGIVHFGV GGFHRAHQAM YLNELMNEGK ALDWGIIGMG VMPSDVRMRD ALASQDHLYT LTTKAPDGTL DQKIIGSIID YVFAPEDPAR AVATLAQDSI RIVSLTVTEG GYNIDPATED FDHTNPRIVA DREALQAGDT STLQTFFGLI TAALISRKES GSTPFTIMSC DNIQGNGDLA KRFFLAFAHS VSSELGEWVE NNVAFPNSMV DRITPETTDG DRDDIKEIGY IDAWPVVSED FTQWVLEDAF TQGRPAYEEV GVQVVSDVEP YELMKLRLLN ASHQGLCYFG HLAGHHMVHD VMADTRFQDF LLAYMEREAT PTLKELPGVD LDAYRRQLIA RFGNAAVKDT VPRLCAESSD RIPKWLLPVV
  • the term “deleted” or “inactivated” means that the expression of the gene is reduced or not expressed.
  • the “inactivation” can be made by methods known in the art. For example, it may be inactivated by homologuous recombination. The homologous recombination may be mediated by, for example, transposon mutagenesis or P1 transduction.
  • the microorganism itself can obtain advantages such as enzyme immobilization as an enzyme carrier or a container containing the enzyme.
  • enzyme immobilization as an enzyme carrier or a container containing the enzyme.
  • the enzyme requires a secondary process of immobilization on the carrier in order to create an environment in which the activity can be maintained for a long time, but in the case of microorganisms, it is possible to reuse it by preventing the enzyme activity from rapidly degrading by sufficiently serving as a carrier. Do it.
  • the present invention shows a remarkably improved effect compared to the conventional method for producing a psychos using an enzyme or the like.
  • the present invention also provides a method for producing a psychos.
  • the microorganism is cultured in a medium containing fructose.
  • the culture conditions of the microorganisms are not particularly limited, and conditions used for culturing the transformant of the genus Corynebacterium known in the art may be used.
  • the culture temperature may be 26 to 38 °C.
  • the medium may be a nutrient medium containing yeast extract and nitrogen sources, such as 2YT medium, LB medium, TB medium.
  • carbon sources including glucose, glycerol and the like
  • Nitrogen sources including ammonia, urea, and the like
  • Essential metal ions such as sodium, potassium, calcium, magnesium, and manganese
  • It may be a life medium (defined medium) commonly used in the art including vitamins and the like.
  • the fructose concentration contained in the medium is not particularly limited, and may be included, for example, at a concentration of 1% (w / v) to 80% (w / v), preferably 1% (w / v) to 50%. (w / v).
  • the culture can be continuous, semi-continuous, or batch type culture.
  • the culturing may be carried out by further adding a substance that induces the expression of a polynucleotide encoding an enzyme having an activity of catalyzing the conversion of fructose to sicose.
  • the substance inducing the expression of the polynucleotide is not particularly limited and may be a substance commonly used in the art.
  • the cycos is recovered from the culture of the microorganism.
  • the method for recovering the psychocos is not particularly limited and may be based on methods known in the art, and examples thereof include centrifugation, filtration, crystallization, ion exchange chromatography, and the like.
  • the culture may be carried out by centrifugation to separate the culture from the microorganism, and by separating the psychose from the culture by the recovery method.
  • the method for producing a psychos of the present invention before the step of culturing the microorganisms in the medium containing fructose, the enzyme having an activity that catalyzes the conversion of fructose to psychos by culturing the microorganisms in a medium not containing fructose Expressing a polynucleotide encoding a nucleotide; And recovering the microorganisms from the culture of the microorganisms.
  • the medium not containing fructose may be the same category of medium as the medium containing fructose, except that the fructose is not included.
  • the method for recovering the microorganism from the culture of the microorganism is not particularly limited, and a method known in the art may be used, and examples thereof include centrifugation and filtration.
  • the microorganisms recovered by this method can be used at a desired concentration, for example in a concentrated state.
  • the transformant of Corynebacterium glutamicum can be inoculated and cultured in a medium containing the fructose at high concentration. Therefore, the microorganism used in the culturing in the medium containing fructose may be the recovered microorganism.
  • the recovered microorganism has a turbidity (measured at 600 nm absorbance, OD 600 ) of cells in a medium containing fructose in a range of 0.01 to 300, for example, 1 to 300, 10 to 300, 20 to 300, 5 to 300, or It can be inoculated at a concentration such that 40 to 300.
  • a cell containing a high concentration of the enzyme it is possible to efficiently convert fructose to a psychos in a medium containing high concentration of fructose in the medium.
  • the fructose when the recovered cells are used, the fructose may be included in the medium at a concentration of, for example, 1% (w / v) to 80% (w / v). Within this range, for example, 1% (w / v) to 35% (w / v), 10% (w / v) to 80% (w / v), 20% (w / v) to 80% (w / v), 30% (w / v) to 80% (w / v), 30% (w / v) to 80% (w / v) and the like.
  • the method for producing a psychosis of the present invention may further include recovering the microorganism from the culture of the microorganism, and culturing the separated microorganism in a medium containing fructose again.
  • the isolated microorganisms can be used for the production of 2 to 10 times, preferably 3 to 10 times, more preferably 4 to 10 times.
  • the isolated microorganism may be inoculated at a concentration such that, for example, OD 600 is 5 to 150 in the medium. Within this range, for example, 5 to 150, 10 to 150, 20 to 150, 10 to 100, 20 to 100, 20 to 80, 20 to 40, 40 to 100, and the like.
  • a microorganism containing a high concentration of the enzyme can inhibit the growth of microorganisms in a high concentration of fructose, it is possible to efficiently convert fructose to a psychos in a medium containing a high concentration of fructose in the medium.
  • the fructose is 1% (w / v) to 80% (w / v), 1% (w / v) to 35% (w / v) , 10% (w / v) to 80% (w / v), 20% (w / v) to 80% (w / v), or 30% (w / v) to 80% (w / v) or It may be included in the medium at a concentration of 30% (w / v) to 50% (w / v).
  • the pCES208 J. Microbiol. Biotechnol., 18: 639-647, 2008
  • E. coli-Corinebacterium shuttle vector was modified and used to construct a pSGT208 shuttle vector in which a terminator and a lac promoter were inserted.
  • the primers 1 and 2 were used to amplify the dpe gene from the Agrobacterium tumefaciens genome, cut it with restriction enzymes KpnI and BamHI, insert the same site of the pSGT208 shuttle vector, and then synthesize the Pycos 3-epimerase.
  • a pS208-dpe recombinant shuttle vector was constructed.
  • Recombinant vectors pS208-dpe, pS208cT-dpe and pSGT208 vector as a negative control thereof were introduced into the wild type Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and transformed into fructose. It was used for the production of the psychos. Transformation followed the method specified in the Handbook of Corynebacterium glutamicum (Lothar Eggeling et al., ISBN 0-8493-1821-1, 2005 by CRC press).
  • the primers used are listed in Table 1 below.
  • the Corynebacterium glutamicum transformant prepared in Example 1 was inoculated in 5 ml of LB medium (Difco) containing 20 ⁇ g / ml of kanamycin and subjected to 30 ° C. and 250 rpm conditions.
  • the main culture was incubated for 36 hours at 30 ° C. and 180 rpm at a volume of 50 ml in a slotted 300 ml Erlenmeyer flask to induce sufficient cell mass and sufficient expression of protein.
  • the obtained culture solution was centrifuged to remove the supernatant and the cells were recovered, and the cell concentration was resuspended at 65 OD 600 in the same medium as above containing 40% (w / v) fructose as a substrate.
  • the cells were cultured at 180 rpm.
  • the measurement result is shown in FIG.
  • the gray bar is the result of 24 hours of psychos production
  • the dark gray bar is the result of 48 hours of psychos production.
  • the cells were incubated for 24 hours in the presence of fructose, and the cells were separated from the culture. Then, the process of culturing the cells for 24 hours in the presence of fructose was repeated four times.
  • Panel A shows the results of the cycle production
  • panel B shows the concentration of the cells
  • Panel C shows the results of dividing the cycles produced by the cell concentration.
  • the cell concentration (Panel B of FIG. 2) tended to decrease as the number of reactions increased, which was caused by the centrifugation of the cell reaction solution to separate the reaction supernatant and the cell. This is because of the loss.

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Abstract

본 발명은 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩함으로써, 안전하면서도 높은 효율로 과당으로부터 사이코스를 대량 생산할 수 있는, 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법
본 발명은 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법에 관한 것이다.
사이코스 (D-psicose)는 과당 (D-fructose)의 3번 탄소의 에피머 (epimer)로써 일반 당류들처럼 감미를 가지지만 인체 내에서 대사가 되지 않아서 거의 칼로리는 제로에 가까워 당뇨 및 비만환자에게 설탕 대체 기능성 감미료로 사용될 수 있는 기능성 당이다. 또한 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제해서 복부비만을 감소시키는 기능을 가지고 있고 당뇨병과 동맥경화 치료제로 현재 연구 중에 있는 당이다.
이처럼 사이코스는 감미료로 각광받으면서 식품 산업 분야에 있어 사이코스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 점점 높아지고 있다. 사이코스는 천연물질 내에는 당밀 처리 과정 또는 포도당 이성화 반응과정 중에 매우 소량 존재하기에 기존의 사이코스 생산은 주로 화학적 과정을 거쳐 이루어졌다. 빌릭 (Bilik)등은 몰리브딕산(molybdic acid) 이온의 촉매작용을 활용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 기술을 개발하였다. 맥도날드 (McDonald)는 1,2:4,5-디-o-이소프로필리덴-베타-D-프락토피라노즈 (1,2:4,5-di-o-isppropylidene-bata-D-fructopyranose)로부터 3단계의 화학적 처리과정으로 사이코스를 생산하였다. 또한, 도너 (Doner)는 에탄올과 트리에틸아민과 함께 과당을 가열하는 방법으로 사이코스를 생산하였다. 그러나, 이들 화학적 방법에 의한 사이코스 생산은 비용이 많이 소모되는 반면 그 생산효율은 낮고 또한 부산물의 과량 발생한다는 문제점이 있다.
생물학적 방법에 의한 사이코스 생산방법으로 이즈모리 (Ken Izumori)등은 미생물 세포반응을 활용하여 갈락시톨 (galacitol), 디-타가토스 (D-tagatose) 또는 디-탈리톨 (D-talitol) 등으로부터 사이코스를 생산할 수 있다는 것을 보였다. 그러나, 이 기질들 또한 자연계에서 비교적 희귀한 당 또는 당알코올로 그 원가가 높다는 단점이 있다.
효소 전환방법으로는 분리미생물 슈도모나스 치코리 ST-24 (Pseudomonas cichorii ST-24)의 디-타가토스-3-에피머화 효소 (D-tagatose-3-epimerase)를 재조합 대장균에서 생산하고 정제하여 과당을 사이코스로 효소 전환하는 방법이 있으며, 이즈모리 등은 디-타가토스-3-에피머화 효소를 고정화시킨 반응시스템으로 약 25%의 전환율로 사이코스를 생산한 바 있다.
이러한 종래 기술에 의하면, 과당으로부터 사이코스를 생산하기 위해서 효소를 정제하고 그 정제된 효소를 고정화하여 사이코스 생산성을 높이는 방향으로 연구되어왔다. 이처럼 효소를 정제하는 과정에는 시간 및 비용이 많이 요구되는 것이 현실이다.
따라서, 효소 정제의 과정을 생략하여 제조원가가 낮고 사이코스를 높은 효율로 생산할 수 있는 균주 및 이를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법이 요구되고 있다.
한국공개특허 제2006-125971호에는 사이코스 에피머화 효소에 의한 사이코스의 생산 방법이 개시되어 있다.
<선행기술문헌>
<특허문헌>
한국공개특허 제2006-125971호
본 발명은 고효율의 사이코스 생성 효율을 갖는, 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 그로부터 안전하면서도 높은 효율로 사이코스를 대량생산할 수 있는 사이코스의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 것인, 코리네박테리움속 미생물.
2. 위 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 것인 미생물.
3. 위 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 것인 미생물.
4. 위 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 미생물 내에 그 자체로 또는 벡터를 이용하여 도입되는, 미생물.
5. 위 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자 및 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자 중 적어도 하나를 결손 또는 불활성화시킨, 미생물.
6. 위 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ptsF 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 mtlD 중 적어도 하나를 결손 또는 불활성화시킨, 미생물.
7. 위 1 내지 3 중 어느 한 항의 미생물을 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물의 배양물로부터 사이코스를 회수하는 단계를 포함하는 사이코스의 생산 방법.
8. 위 7에 있어서, 과당은 1%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도인, 방법.
9. 위 7에 있어서, 상기 배지는 영양배지 또는 구명배지인, 방법.
10. 위 7에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계 이전에 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 미생물을 과당을 포함하지 않는 배지에서 배양하여 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및 상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.
11. 위 10에 있어서, 상기 회수한 미생물을 과당을 포함하는 배지에 OD600이 0.01 내지 300이 되도록 하는 농도로 접종하여 배양하는, 방법.
12. 위 11에 있어서, 과당을 포함하는 배지의 과당 농도는 1%(w/v) 내지 80%(w/v)인, 방법.
13. 위 7에 있어서, 상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하여, 분리된 미생물을 다시 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
14. 위 13에 있어서, 상기 분리된 미생물을 과당을 포함하는 배지에 OD600이 5 내지 150이 되도록 하는 농도로 접종하여 배양하는, 방법.
15. 위 13에 있어서, 과당을 포함하는 배지의 과당 농도는 10%(w/v) 내지 80%(w/v)인, 방법.
본 발명의 미생물은 안전하면서도 높은 효율로 과당으로부터 사이코스를 대량 생산할 수 있다.
도 1은 사이코스 3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체로부터 사이코스 생산량을 측정한 결과이다. 회색막대는 24시간의 사이코스 생산결과이며, 진회색막대는 48시간의 사이코스 생산결과이다.
도 2는 사이코스 3-에피머라제를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환 균체를 4회 회수하여 재배양하면서 사이코스 생산량을 측정한 결과이다. 패널 A는 사이코스 생산량을 나타낸 결과이며, 패널 B는 균체의 농도를 나타낸 결과이며, 패널 C는 사이코스 생산량을 균체 농도의 값으로 나누어 표현한 결과이다.
본 발명은 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩함으로써, 안전하면서도 높은 효율로 과당으로부터 사이코스를 대량 생산할 수 있는, 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법에 관한 것이다.
본 명세서에는 한국특허출원번호 10-2013-0060703의 명세서 및 도면에 기재되어 있는 모든 내용이 참조로 포함된다.
본 발명의 코리네박테리움속 미생물은 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩한다.
서열번호 1의 아미노산 서열은 MKHGIYYSYW EHEWSAKFGP YIEKVAKLGF DIIEVAAHHI NEYSDAELAT IRKSAKDNGI ILTAGIGPSK TKNLSSEDAA VRAAGKAFFE RTLSNVAKLD IHTIGGALHS YWPIDYSQPV DKAGDYARGV EGINGIADFA NDLGINLCIE VLNRFENHVL NTAAEGVAFV KDVGKNNVKV MLDTFHMNIE EDSFGDAIRT AGPLLGHFHT GESNRRVPGK GRMPWHEIGL ALRDINYTGA VIMEPFVKTG GTIGSDIKVW RDLSGGADIA KMDEDARNAL AFSRFVLGG이다.
본 발명의 코리네박테리움속 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 코리네박테리움 글루타미쿰, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(Corynebacterium glutamcium ATCC13032, taxid: 196627; GenBank NID: NC_003450, ATCC13032)에 상기 폴리뉴클레오티드를 도입시킨 것일 수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032는 국제 기탁 기관인 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, USA)에 기탁되어 있으므로 분양받아 사용할수 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰은 GRAS(Generally recognized as safe) 균주이고, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 우수한 효율로 제조할 수 있어, 과당의 사이코스로의 전환율이 매우 우수하다.
상기 효소는 아그로박테리움 투메파시엔스로부터 유래된 효소일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 자체로 또는 벡터에 의하여 도입되는 것일 수 있다.
용어 "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 발명에서 벡터는, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다.
벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 말한다. 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 플라스미드 셔틀벡터, 바이러스 발현벡터(예, 복제결함 레트로바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터 등) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 전사종결인자로 이루어지는 하나 이상의 요소와 작동가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 요소 (regulatory element)와 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조절 요소는 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소 (temperature sensitive element)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소 (inducible element)는 락 오페론(lac operon), 아라비노오스 오페론 (arabinose operon)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 코리네박테리움 속 미생물은 내재적 디-프락토오스를 디-프락토오스 1-포스페이트로 전환하면서 균체 내로 수송하는 PTS 수송 시스템인 ptsF(EIIFru, fruA, NCgl1861, GI:19553141, EC 2.7.1.69)와 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자를 결손 또는 불활성화한 것일 수 있고, 바람직하게는 동일 유전자를 결손 또는 불활성화시킨 것일 수 있다.
사이코스는 D-프락토오스(D-fructose)로부터 생성되므로, 상기 유전자를 결손 또는 불활성화시키면 프락토오스의 인산화를 억제할 수 있으므로, 사이코스의 생성 효율을 현저히 개선할 수 있다.
상기 ptsF 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.
서열번호 2의 아미노산 서열은 MNSVNNSSLV RLDVDFGDST TDVINNLATV IFDAGRASSA DALAKDALDR EAKSGTGVPG QVAIPHCRSE AVSVPTLGFA RLSKGVDFSG PDGDANLVFL IAAPAGGGKE HLKILSKLAR SLVKKDFIKA LQEATTEQEI VDVVDAVLNP APKTTEPAAA PAAAAVAESG AASTSVTRIV AITACPTGIA HTYMAADSLT QNAEGRDDVE LVVETQGSSA VTPVDPKIIE AADAVIFATD VGVKDRERFA GKPVIESGVK RAINEPAKMI DEAIAASKNP NARKVSGSGV AASAETTGEK LGWGKRIQQA VMTGVSYMVP FVAAGGLLLA LGFAFGGYDM ANGWQAIATQ FSLTNLPGNT VDVDGVAMTF ERSGFLLYFG AVLFATGQAA MGFIVAALSG YTAYALAGRP GIAPGFVGGA ISVTIGAGFI GGLVTGILAG LIALWIGSWK VPRVVQSLMP VVIIPLLTSV VVGLVMYLLL GRPLASIMTG LQDWLSSMSG SSAILLGIIL GLMMCFDLGG PVNKAAYLFG TAGLSTGDQA SMEIMAAIMA AGMVPPIALS IATLLRKKLF TPAEQENGKS SWLLGLAFVS EGAIPFAAAD PFRVIPAMMA GGATTGAISM ALGVGSRAPH GGIFVVWAIE PWWGWLIALA AGTIVSTIVV IALKQFWPNK AVAAEVAKQE AQQAAVNA이다.
또한, 본 발명에 따른 코리네박테리움 속 미생물은 만니톨 2-디하이드로게나아제(mannitol 2-dehydrogenase)를 코딩하는 mtlD (NCgl0108, GI:19551360, EC 1.1.1.67)와 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자를 결손 또는 불활성화한 것일 수 있고, 바람직하게는 동일 유전자를 결손 또는 불활성화시킨 것일 수 있다.
프락토오스는 만니톨 2-디하이드로게나아제에 의해 D-만니톨(D-mannitol)로 전환되므로, 상기 유전자를 결손 또는 불활성화 시키면 프락토오스의 감소를 억제할 수 있으므로, 사이코스의 생성 효율을 현저히 개선할 수 있다.
상기 mtlD 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.
서열번호 3의 아미노산 서열은 MNTPLQLNTE NLQEIASTSG VQIPAFNRAD VAPGIVHFGV GGFHRAHQAM YLNELMNEGK ALDWGIIGMG VMPSDVRMRD ALASQDHLYT LTTKAPDGTL DQKIIGSIID YVFAPEDPAR AVATLAQDSI RIVSLTVTEG GYNIDPATED FDHTNPRIVA DREALQAGDT STLQTFFGLI TAALISRKES GSTPFTIMSC DNIQGNGDLA KRFFLAFAHS VSSELGEWVE NNVAFPNSMV DRITPETTDG DRDDIKEIGY IDAWPVVSED FTQWVLEDAF TQGRPAYEEV GVQVVSDVEP YELMKLRLLN ASHQGLCYFG HLAGHHMVHD VMADTRFQDF LLAYMEREAT PTLKELPGVD LDAYRRQLIA RFGNAAVKDT VPRLCAESSD RIPKWLLPVV RENLAAGRDV TLSAAIVASW ARYAEGTDEQ GNPIKIVDRL SERVQENASG NRTDILSFIR DRGIFGDLVD AEPFTKAYSE TLSSLHDRGA EATIDALLTQ VTV이다.
용어 "결손" 또는 "불활성화"란 상기 유전자의 발현이 감소되거나 발현이 이루어지지 않는 것을 의미한다. 상기 "불활성화"는 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상동 재조합 (homologuous recombination)에 의하여 불활성화된 것일 수 있다. 상기 상동 재조합은 예를 들면, 전이인자 돌연변이 (transposon mutagenesis) 또는 P1 형질도입 (P1 transduction)에 의하여 매개된 것일 수 있다.
미생물은 그 자체가 효소 담체 또는 효소를 담은 용기로서 효소 고정화와 같은 장점을 얻을 수 있다. 미생물의 경우는 원심분리를 통하여 미생물만을 회수하여 재사용이 가능하지만 효소의 경우는 그렇지 못하다. 그리고 효소는 활성을 장기간 유지시킬 수 있는 환경을 조성하기 위해 담체에 고정화시키는 부차적인 과정이 필요하지만 미생물의 경우는 그 자체가 담체의 역할을 충분히 함으로써 효소의 활성이 급격히 저하되는 것을 막아 재사용이 가능하도록 한다.
따라서, 본 발명은 종래의 효소 등을 이용한 사이코스의 생산 방법에 비해 현저히 개선된 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명은 사이코스의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 사이코스의 생산 방법의 일 구현예를 그 단계별로 보다 상세히 설명한다.
먼저, 상기 미생물을 과당을 포함하는 배지에서 배양한다.
상기 미생물의 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 당 분야에 공지된 코리네박테리움 속의 형질전환체의 배양에 사용되는 조건이 사용될 수 있다. 예를 들면, 배양 온도가 26 내지 38℃일 수 있다.
상기 배지는 2YT 배지, LB 배지, TB 배지 등의 효모추출물과 질소원을 포함하는 영양배지일 수 있다.
또한, 포도당, 글리세롤 등을 포함하는 탄소원; 암모니아, 우레아(urea) 등을 포함하는 질소원; 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간 등의 필수 금속이온; 비타민 등을 포함하는 당 분야에서 통상적으로 사용되는 구명배지(defined 배지)일 수 있다.
배지에 포함되는 과당 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 1%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 1%(w/v) 내지 50%(w/v)일 수 있다.
상기 배양은 연속, 반연속, 또는 배치 (batch) 형식 배양일 수 있다.
상기 배양은 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 물질을 더 첨가하여 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는 물질은 특별히 한정되지 않으며, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 물질일 수 있다.
이후에, 상기 미생물의 배양물로부터 사이코스를 회수한다.
사이코스를 회수하는 방법은 특별히 한정되지 않고 당 분야에 공지된 방법에 의할 수 있으며, 예를 들면 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법을 들 수 있다.
구체적으로. 배양물을 원심분리하여 배양액을 미생물로부터 분리하고, 상기 회수 방법에 의하여 사이코스를 배양액으로부터 분리함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 사이코스의 생산 방법은 상기 미생물을 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계 이전에, 상기 미생물을 과당을 포함하지 않은 배지 에서 배양하여 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및 상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 과당을 포함하지 않은 배지는, 과당을 포함하지 않은 것을 제외하고는 상기 과당을 포함한 배지와 동일한 범주의 배지일 수 있다.
상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하는 방법은 특별히 한정되지 않고 당 분야에 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 원심분리, 여과 등을 들 수 있다.
상기 방법으로 회수된 미생물은 원하는 농도, 예를 들면, 고농도로 농축된 상태로 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환체는 고농도로 상기 과당을 포함하는 배지 중에 접종되어 배양될 수 있다. 따라서, 과당을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계에서 사용되는 미생물은 상기 회수된 미생물일 수 있다.
상기 회수된 미생물은 과당을 포함하는 배지에서 균체의 탁도(600nm 흡광도에서의 측정치, 이하 OD600)가 0.01 내지 300, 예를 들면 1 내지 300, 10 내지 300, 20 내지 300, 5 내지 300, 또는 40 내지 300이 되도록 하는 농도로 접종될 수 있다. 이렇게 고농도의 상기 효소를 포함하는 균체를 사용함으로써, 배지 중에서 고농도로 과당이 포함된 배지에서 효율적으로 과당을 사이코스로 전환할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 회수된 균체가 사용되는 경우, 상기 과당은 예를 들면 1%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도로 배지 중에 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 예컨대, 1%(w/v) 내지 35%(w/v), 10%(w/v) 내지 80%(w/v), 20%(w/v) 내지 80%(w/v), 30%(w/v) 내지 80%(w/v), 30 %(w/v) 내지 80 %(w/v) 등 일 수 있다.
본 발명의 사이코스의 생산 방법은 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하여, 분리된 미생물을 다시 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
분리된 미생물은 2 내지 10회, 바람직하게는 3회 내지 10회, 더욱 바람직하게는 4 내지 10회 사이코스의 생산에 사용될 수 있다. 상기 분리된 미생물은 상기 배지에서 예를 들면 OD600이 5 내지 150이 되도록 하는 농도로 접종될 수 있다. 상기 범위 내에서 예컨대, 5 내지 150, 10 내지 150, 20 내지 150, 10 내지 100, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 40, 40 내지 100 등일 수 있다.
이렇게 고농도의 상기 효소를 포함하는 미생물을 사용함으로써 고농도의 과당에서 미생물의 생육 저해를 억제할 수 있으므로, 배지 중에서 고농도로 과당이 포함된 배지에서 효율적으로 과당을 사이코스로 전환할 수 있다.
상기 분리된 코리네박테리움 글루타미쿰 균체가 사용되는 경우, 상기 과당은 1 %(w/v) 내지 80 %(w/v), 1 %(w/v) 내지 35%(w/v), 10 %(w/v) 내지 80 %(w/v), 20 %(w/v) 내지 80 %(w/v), 또는 30 %(w/v) 내지 80 %(w/v) 또는 30 %(w/v) 내지 50 %(w/v)의 농도로 배지 중에 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. 코리네박테리움 형질전환체의 제조
대장균-코리네박테이룸 셔틀벡터인 pCES208 (J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)를 변형하여 종결자(terminator)와 lac 프로모터가 삽입된 pSGT208 셔틀벡터를 제작하여 사용하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 사이코스를 생산하기 위하여 사이코스 3-에피머라제는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens str. C58; taxid:176299; GenBank NID: NC_003062, ATCC33970)의 dpe 유전자(AGR_L_260, GI:15890243)를 상기 제작한 pSGT208 셔틀벡터에 도입하여 사용하였다.
상세히 설명하면 프라이머 1과 2를 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스 게놈으로부터 dpe 유전자를 증폭하고, 이를 제한효소 KpnI와 BamHI로 절단하여 pSGT208 셔틀벡터의 동일 부위로 삽입하여 사이코스 3-에피머라제를 포함하는 pS208-dpe 재조합 셔틀벡터를 제작하였다.
이후에, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 사이코스 3-에피머라제의 발현량을 증대시키기 위하여 pS208-dpe에서 lac 프로모터를 pTrc99a에서 유래한 trc 프로모터로 교체하였으며, 이를 pS208cT-dpe로 명명하였다.
상기 제작한 사이코스 3-에피머라제를 포함하는 재조합 벡터 pS208-dpe, pS208cT-dpe와 이에 대한 음성 대조군인 pSGT208 벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 도입하여 형질전환시키고, 이를 과당으로부터 사이코스 생산에 이용하였다. 형질전환법은 Handbook of Corynebacterium glutamicum (Lothar Eggeling 등, ISBN 0-8493-1821-1, 2005 by CRC press)에 명시된 방법을 따랐다.
사용된 프라이머는 하기 표 1에 기재하였다.
표 1
Figure PCTKR2013009641-appb-T000001
실시예 2. 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환체를 이용한 과당으로부터 사이코스의 생산
고농도의 과당을 첨가할 때 균체 생육 저해의 문제를 해결하기 위해 별도로 배양한 고농도의 균체를 첨가할 수 있다면 고농도의 사이코스 생산이 가능하다.
고농도의 균체를 확보하기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체를 20㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 5 ㎖의 LB 배지(Difco)에 접종하여 30℃, 250rpm 조건으로 종배양한 후, 5g/L 포도당 및 20㎍/㎖의 카나마이신이 있는 최소 배지(1리터 당 1g K2HPO4, 10g (NH4)2SO4, 0.4g MgSO47H2O, 20mg FeSO47H2O, 20mg MnSO4H2O, 50mg NaCl, 2 g urea, 0.1 mg biotin, 0.1 mg thiamine)에 접종하여 본배양 하였다.
본배양은 홈이 파인 300 ㎖ 삼각플라스크에 50㎖ 부피로 30℃, 180 rpm 조건에서 36 시간 배양하여 충분한 균체량과 단백질의 충분한 발현을 유도하였다.
얻어진 상기 배양액을 원심분리하여 상층액을 제거하고 균체를 회수하여, 기질인 40%(w/v) 과당을 함유하는 상기와 동일한 최소배지에 균체농도를 65 OD600로 재현탁한 뒤, 30℃, 180rpm 조건에서 배양하였다.
과당 및 사이코스의 농도는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 측정하였다. HPLC는 SCL-10A(Shimadzu, 일본)를 사용하였으며, Kromasil 5NH2 칼럼(4.6 mm X 250 mm), 이동상은 75% 아세토니트릴을 이용하여 1.5 mL/분으로 흘리면서 40℃에서 분리한 후 RI(Reflective Index) 검출기를 이용하여 분석하였다. 상기의 조건에서 과당의 머무름시간(retention time)은 5.5분, 사이코스는 4.6분이었다.
측정 결과는 도 1에 나타내었다. 회색막대는 24시간의 사이코스 생산 결과이며, 진회색막대는 48시간의 사이코스 생산 결과이다.
도 1을 참조하면, 음성 대조군으로 pSGT208 셔틀벡터만을 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 경우 사이코스가 전혀 검출되지 않아 해당 코리네박테리움 글루타미쿰은 내재적으로 과당으로부터 사이코스를 생산하는 경로를 지니지 않은 것으로 보인다.
pS208-dpe 재조합 셔틀벡터를 사용한 실험군의 경우, 24시간에 약 7.4g/L의 사이코스를 생산하여 사이코스 3-에피머라제가 유의적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체에서 발현된 것을 확인할 수 있었으며, 이때 48시간에 약 8.7 g/L가 생산되어 24시간에 생산이 거의 종료된 것을 확인하였다.
pS208cT-dpe 재조합 셔틀벡터를 사용한 실험군의 경우, 사이코스 생산량은 크게 증가되어 24시간에 약 51.5 g/L, 48시간에 약 61.2 g/L로 나타났으며, 이는 사이코스 3-에피머라제가 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 높은 활성을 나타내고 있으며, 과당으로부터 사이코스의 전환율은 발현량에 의존적임을 나타내는 결과로 볼 수 있다.
실시예 3: 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환 균체의 반응 후 회수를 통한 과당으로부터 사이코스의 연속생산
상기 실시예 2의 결과로 보건데, 사이코스 3-에피머라제는 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체 내에서 24시간에 최대치의 활성을 나타낸 후 이후 크게 증가하지 않은 것을 알 수 있다.
이러한 결과를 토대로, 24시간 후에 사이코스 3-에피머라제가 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 얼마나 오래 유지되는지 확인하기 위하여, 과당의 존재 하에서 24시간 동안 균체를 배양하고, 배양물로부터 균체를 분리하여, 다시 과당의 존재하에서 24시간 동안 균체를 배양하는 과정을 4회 반복하였다.
배양 조건 및 분석 방법은 실시예 2와 동일하게 수행하였다.
측정 결과는 도 2에 나타내었다. 패널 A는 사이코스 생산량을 나타낸 결과이며, 패널 B는 균체의 농도를 나타낸 결과이며, 패널 C는 사이코스 생산량을 균체 농도의 값으로 나누어 표현한 결과이다.
도 2를 참조하면, 균체 농도(도 2의 패널 B)는 반응수의 증가에 따라 감소하는 경향을 보였는데, 이는 균체 반응액을 원심분리하여 반응 상층액과 균체를 분리하는 과정에서 발생하는 균체의 손실 때문으로 판단된다.
사이코스의 전환수준은 4회 반복하는 동안 약 50-60 g/L로서 큰 차이가 나지 않은 것으로 나타났으며(도 2의 패널 A), 이로서 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환체의 균체 및 균체내에서 발현된 사이코스 3-에피머라제의 활성이 수회 반복하여도 안정한 것으로 볼 수 있다. 이러한 결과는 도 2의 패널 C에서 균체 농도에 대한 사이코스 생산 수준이 줄어들지 않은 것으로 더욱 구체적으로 확인할 수 있다.

Claims (15)

  1. 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 것인, 코리네박테리움속 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 것인 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 것인 미생물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 미생물 내에 그 자체로 또는 벡터를 이용하여 도입되는, 미생물.
  5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자 및 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 유전자 중 적어도 하나를 결손 또는 불활성화시킨, 미생물.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ptsF 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 mtlD 중 적어도 하나를 결손 또는 불활성화시킨, 미생물.
  7. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 미생물을 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 미생물의 배양물로부터 사이코스를 회수하는 단계를 포함하는 사이코스의 생산 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 과당은 1%(w/v) 내지 80%(w/v)의 농도인, 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 배지는 영양배지 또는 구명배지인, 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계 이전에
    청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 미생물을 과당을 포함하지 않는 배지에서 배양하여 과당의 사이코스로의 전환을 촉매하는 활성을 가진 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및
    상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 회수한 미생물을 과당을 포함하는 배지에 OD600이 0.01 내지 300이 되도록 하는 농도로 접종하여 배양하는, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 과당을 포함하는 배지의 과당 농도는 1%(w/v) 내지 80%(w/v)인, 방법.
  13. 청구항 7에 있어서, 상기 미생물의 배양물로부터 미생물을 회수하여, 분리된 미생물을 다시 과당을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 분리된 미생물을 과당을 포함하는 배지에 OD600이 5 내지 150이 되도록 하는 농도로 접종하여 배양하는, 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 과당을 포함하는 배지의 과당 농도는 10 %(w/v) 내지 80 %(w/v)인, 방법.
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