WO2014163380A1 - 샤르코-마리-투스 질환 치료제의 스크리닝 방법 및 이에 이용되는 자가분화운동신경세포 - Google Patents

샤르코-마리-투스 질환 치료제의 스크리닝 방법 및 이에 이용되는 자가분화운동신경세포 Download PDF

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patient
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screening
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김윤태
최병옥
우소연
김지연
정성철
홍영빈
박진모
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사회복지법인 삼성생명공익재단
주식회사 종근당
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing dedifferentiation-induced pluripotent stem cells and a method for screening an agent for Charco-Marie-Tooth disease using autologous cells differentiated from dedifferentiation-induced pluripotent stem cells.
  • Charcot® Marie-Tooth disease or hereditary motor sensory neuropathy refers to a condition in which motor and sensory nerves are damaged by specific gene mutations.
  • Hereditary peripheral neuropathies are classified into three classes: Hereditary motor and sensory neuropathies (HMSN), Hereditary motor neuropathies (HMN), and Hereditary sensory neuropathies (HSN). Neuropathy is one of them.
  • HMSN Hereditary motor and sensory neuropathies
  • HSN Hereditary motor neuropathies
  • HSN Hereditary motor neuropathies
  • Sharco-Marietus disease is divided into type 1, type 2 with autosomal dominant genetics, type 4 with autosomal recessive genetics, and type CMTX with X-chromosome associated genes.
  • type 1 type 2 with autosomal dominant genetics
  • type 4 with autosomal recessive genetics
  • type CMTX with X-chromosome associated genes.
  • gene mutations were named in order of 1A, IB, 1C, etc., in the order in which they were reported.
  • the targeted therapy according to the change in the molecular technique of the rare disease which is classified by the change of the diagnostic technique according to the development of molecular biology and the individualization, that is, the tai lored therapy.
  • the same drug may be a molecular genetic era in which the treatment may be significantly different even in the same stage due to the development of pharmacogenetics according to the genetic characteristics of the patient or the rare disease.
  • CMT is the most diverse of rare diseases, ranging from drug therapy to symptomatic treatment aimed at alleviating symptoms with additional treatment, and supportive therapy to control and alleviate various side effects and complications.
  • Therapeutic choice and prognosis are possible, especially since CMT is caused by abnormalities of the symptoms, so the symptoms continue to progress and are not cured. The purpose was to delay and improve the quality of life.
  • genetic and molecular biological researches have attempted biological treatment methods, and possible results have been reported.
  • due to the nature of regressive diseases the number of affected patients is limited and the research interest is limited. This is not established and the absence of clinicians and researchers who diagnose and treat centering on rare diseases is a reality (Acta Paediatri, 2012).
  • the therapeutic agents are limited to CMT type 1
  • CMT is caused by dozens of genetic mutations
  • development of a customized treatment technology for each gene defect and a model that can verify the same Introduction is urgent and there is a significant difference in the effects of CMT patients on drugs, and there are limitations in drug selection according to CMT patients and symptoms.
  • Stem cells obtained through the skin tissue obtained from the patient retains the characteristics of the patient's genetic mutation, so when differentiated into neurons, neurons having the same characteristics as the patient can be obtained. It can be used to.
  • the typical Charco-Marie-Tooth disease (CMT) of hereditary peripheral neuropathy is a monogenetic disease that regenerates in vitro differentiation of dedifferentiated stem cells derived from skin cells of the patient to reproduce the disease.
  • Models can be used to treat diseases using these disease models. You can make a new drug. Initiation muscular dystrophy ⁇ Reproduced in vitro the same symptoms as those of patients with abnormal cell differentiation using dedifferentiated stem cells derived from patients suffering from familial dysautonomia or LEOPARD syndrome. Cultured cells showed improvement when treated with experimental drugs for these diseases (Ebert AD. Et al, Nature, 2009, 457: 277-280, Lee G. et al, Nature, 2009, 461: 402-). 406, Cavajal-Vergara X.
  • inverted pluripotent stem cells and differentiated autologous cells may be useful for patients with intractable rare diseases as a method of developing patient-specific drugs in many other diseases without therapeutic drugs.
  • the present inventors have prepared a retrodifferentiation-induced pluripotent stem cells in human fibroblasts derived from CMT patients who have been studying patient-specific treatments for Charcot-Marie-Tooth disease (CMT).
  • CMT Charcot-Marie-Tooth disease
  • CMT Charcot-Marie-Tooth disease
  • Still another object of the present invention is to provide a customized therapeutic screening method for treating CMT type patients using automotor neurons of a CMT patient prepared by the method of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing motor neurons in somatic cells derived from a Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) patient.
  • CMT Charcot-Marie-Tooth disease
  • the present invention also provides a method for screening a CMT therapeutic agent candidate.
  • the present invention also provides autologous motor neurons of CMT patients differentiated from pluripotent stem cells produced by the method of the present invention.
  • the present invention provides a method for screening a customized therapeutic agent for treating CMT type patients using automotor neurons of a CMT patient prepared by the method of the present invention.
  • pluripotent stem cells from human fibroblasts derived from Char cot -Marie-Tooth disease (CMT) patients of the present invention, and differentiated from the pluripotent stem cells It is possible to confirm the efficacy of the drug through the screening method of the drug candidate Charcopomarimaritus jajahwan drug using the motor neuron, and the autologous motor neuron (moter) through the method of producing the pluripotent stem cell neurons) can be used for screening patient-specific treatments and for patient-specific treatment.
  • CMT Char cot -Marie-Tooth disease
  • FIG. 1 is a diagram showing the shape of human fibroblasts used in the present invention.
  • 2 is a diagram illustrating a method of differentiating CMT-derived pluri potent stem cells (iPSCs) into motor neurons.
  • iPSCs CMT-derived pluri potent stem cells
  • Figure 3 shows the identification of 5 / ⁇ 7 gene mutation that is the cause of CMT in CMT-derived differentiation induced pluripotent stem cells (CMT 2F-iPSC).
  • FIG. 4 is a diagram showing the form of colonies (colony) of CMT 2F PSC. The photograph was observed on the 20th day of culture, and the pluripotent fungal cell colonies of the differentiation showed dense cells.
  • Figure 6 is a diagram confirming the expression of the multipotency marker (sternness maeker) protein of CMT 2F-iPSC.
  • FIG. 7 shows the in vitro differentiation ability of embryonic bodies (EBs) derived from CMT 2F-iPSC, and the smooth muscles of nestin and mesoderm markers, which are markers of ectoderm. Confirmation of alpha-fetoprotein (AFP) expression, which is a smooth muscle actin (SMA) and endoderm marker.
  • EBs embryonic bodies
  • AFP alpha-fetoprotein
  • SMA smooth muscle actin
  • 9 shows marker protein expression and neuromuscular junction formation of motor neuron cells CMT 2F-MN differentiated from CMT2F patients;
  • 9A is a diagram confirming the expression of the marker proteins HB9, ISL1, SMI32, Tujl, MAP2 Synapsin and ChAT of CMT 2F-MN;
  • 9B is a diagram confirming the ratio of SMI32 and MPA2 positive proteins of CMT 2F-MN.
  • 9C is a diagram measuring the length of the axon projection of CMT 2F-MN.
  • FIG. 10 is a diagram confirming the formation of neuromuscular junction of CMT 2F- ⁇ .
  • Figure 11 shows the expression of acetylated a-tubulin (acetylatkm) as a CMT indicator for confirming the axonal transport efficiency with or without treatment of tuberstatin ACtubastatin A) in CMT 2F-MN Confirmed;
  • FIG. 11A is a diagram confirming the acetylation of ⁇ -tubulin in a CMT 2F-MN;
  • FIG. 11C is a diagram comparing quantification of acetylation of a-tubulin in CMT 2F- ⁇ with and without treatment of tubastatin A.
  • FIG. 12 is a diagram showing the mitochondria transport (moving mitochondria) as a CMT indicator for confirming the axon transport efficiency according to the treatment of tubastatin A in CMT 2F- ⁇ ;
  • 12A is a diagram illustrating axon mitochondria of motor neurons through mito-RED2 transformed with CMT-2F- ⁇ ;
  • FIG. 12B is a diagram comparing mitochondrial migration rate in CMT 2F-MN with or without treatment with tubastatin A; FIG. And
  • Figure 12c is a diagram showing the percentage of mitochondria migrated in CMT 2F-VIII with or without treatment with tubastatin A.
  • FIG. 13 is a view showing microfluidic cukiture for analyzing axon transport efficiency of motor neurons of CMT 2F-M by analyzing mitochondrial transport.
  • the present invention provides a method for producing motor neurons in somatic cells derived from a Char cot-Marie-Tooth disease (CMT) patient comprising the following steps. 1) obtaining human somatic cells from a Charcot® Marie-Tooth disease (CMT) patient;
  • step 3 inducing motor neurons by culturing in the presence of retinoic acid and sonic hedgehog in the reverse differentiation induced pluripotent stem cells of step 3).
  • Charcot-Marie-Tooth disease of step 1) is CMT type 1, CMT type 2, CMT type 4 or CMTX type, preferably CMT 2F.
  • the CMT 2F type is characterized in that the genes of the heat-shock potein (HSPs) 27 404 th and 545 th cytosine (cytosin) is substituted with thymin.
  • HSPs heat-shock potein
  • cytosin cytosine
  • the protein synthesized by the mutation is a variant protein in which the 135th amino acid is replaced with phenylalanine in serine from wild type HSP27 protein, or the 182th amino acid is substituted with Leucine in Proline. It is characterized by being.
  • Human somatic cells of step 1) are preferably fibroblasts, but are not limited thereto.
  • the vector used in step 2) may use a virus-mediated or non-viral vector using Sendai virus, retrovirus and lentivirus, and more preferably, Sendai virus is used.
  • a medium used for culturing human somatic cells to obtain the dedifferentiation-induced pluripotent stem cells after transformation may use a conventional medium.
  • a conventional medium for example, Eagles' MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), a-MEM (Stanner, CP. Et al., Nat. New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEMdscove, N. et al. , J. Exp. Med. 147: 923 (1978), 199 Badge (Morgan) et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med.
  • Induced pluri potent stem cell refers to a cell induced to have pluripotent differentiation ability through artificial dedifferentiation from already differentiated cells. Also known as pluripotent cell.
  • the dedifferentiation-induced pluripotent stem cells have almost the same characteristics as embryonic enjoyment cells, specifically show similar cell shapes, and gene and protein expression patterns are similar.
  • iPSCs with pluripotency differentiation can confirm the expression of pluripotency marker proteins in vitro and show teratoma formation in vivo. In particular, when the iPSC is inserted into a mouse blastocyst, chimera mice are formed, and germline transmission of genes is possible.
  • the iPSC of the present invention includes all iPSCs derived from humans, pigs, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, and the like, preferably human-derived iPSCs, most preferably CMT patients IPSC derived from.
  • the transgene of the present invention refers to a gene or genetic material that is transferred by natural migration or by genetic engineering technology from one organism to another. Specifically, it is a DNA segment containing a gene sequence that is separated from one organism and introduced into another organism.
  • the gene sequence used as the trans gene uses 0CT4, S0X2, KLF4, and c_MYC as transgenes in the vector, which are originally derived from differentiated cells to induction of pluripotent stem cells. It is necessary to dedifferentiate.
  • 'de-differentiation' refers to epigenetic retrograde processes that allow the regeneration of existing .differentiated cells to an undifferentiated state, thereby enabling the formation of new differentiated tissues.
  • the reverse differentiation is a process for returning differentiated cells having differentiation capacity of 0% or more to less than 100% to an undifferentiated state, which are all included therein, for example, differentiated cells having 0% differentiation capacity. It may also include the process of undifferentiating the into differentiated cells having a differentiation capacity of 1%.
  • step 3) is preferably the following (3-1) to (3-2) to differentiate the prepared differentiated induced pluripotent stem cells into motor neurons, but is not limited thereto;
  • the neurotrophin (neurotrophin) of step 4) is the neuronal factor (Nerve growth factor; NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Neutrophin (neurotrophin-3; NT-3) And a glia cell-derived neurotrophic factor (Glial eel 1 -derived neurotrophic factor; GDNF), but is not limited thereto.
  • the inventor's stone has four transcription factors (Klf4, 0ct3 / 4, from fibroblasts obtained from a skin biopsy of a CMT 2F patient comprising a mutation of S135F or P182L of the HSP27 gene).
  • Sox2 and c-Myc were used to produce induced pur i potent stem cells (iPSCs) and embryoid bodies (see FIG. 4), wherein the iPSCs included mutations in S135F or P182L.
  • Figure 3 Since it expresses multipotent marker genes and proteins, it was confirmed that it can be used as a pluripotent stem cell model of CMT disease (see FIGS.
  • CMT 2F-iPSCs into motor neurons from CMT 2F-iPSCs based on known methods to use CMT 2F-iPSCs as a model of peripheral neuropathy (Amoroso ⁇ , et al, JNeurosci 2013; 33: 574-586 (see FIG. 2), the efficiency of differentiation into motor neurons was confirmed by confirming marker protein expression and neuromuscular junction formation of the differentiated motor neurons (see FIGS. 9 and 10). ).
  • CPS-derived iPSCs model of the present invention exhibits the same mutations as the genetic mutations of CMT patients and not only shows multipotency, but also effectively differentiates into autologous motor neurons through neurospheres.
  • the method of manufacturing iPSCs model can be usefully used in the method used for analytical research for CMT.
  • the present invention provides a method for screening a composition for preventing and treating Sharco-Marie-Tooth disease, which comprises the following steps.
  • step 3 selecting a candidate for increase or decrease by comparing the level of the CMT indicator of step 2) with the control group.
  • the present invention also provides a customized therapeutic screening method for treating CMT type patients.
  • Cells differentiated from dedifferentiation-induced pluripotent stem cells prepared by dedifferentiating from the cells of the CMT patient can be prepared by the method of steps 1) to 2) and (3-1) to (3-2).
  • Motor neurons differentiated from CMT-derived iPSCs of the invention can be used to screen for candidate drugs for CMT disease.
  • the candidate drug preferably includes, but is not limited to, histone deacetylase 6 (HDAC6) inhibitors Trichostatin, Tuvacin and Tuvastatin A.
  • HDAC6 histone deacetylase 6
  • the drug concentration of dose-dependent treatment of the candidate drug in the normal control group and CMT-derived neurons can be determined to determine the drug concentration at which the survival of the cell is not inhibited. have.
  • the CMT indicator is preferably a marker of axonal movement (axonal transport), specifically, the acetylation of alpha-tubulin (ace tylated a -tubulin), mitochondrial unsongryang (moving mitochondria) or the electrical physiological indicator of the action potential amplitude (action potential ampHtude) is more preferably any one or more selected from the group consisting of, more specifically, it is most preferably either or both of acetylated a (tubulin) or mitochondria (moving mitochondria), It is not limited to this.
  • the amount of acetylated alpha-tubulin (acetylated ⁇ -Uibulin) is increased in the cells treated with the CMT drug candidate, it may be confirmed that the drug candidate is effective for treating CMT. At this time, the amount of acetylated alpha-tubulin was higher than without treatment with the drug candidate. When it is increased by 20% or more, preferably 30% or more, more preferably 35% or more can be confirmed that the therapeutic effect.
  • the candidate drug is said to be effective in treating CMT when the mitochondria and act ion potent ial amplitudes in the cells treated with the candidate CMT drug have been restored to the level of neurons derived from the normal control group. Can be.
  • the measurement of the protein expression change can be carried out through various methods known in the art.
  • enzyme immunoassay ELISA
  • western blot ICC
  • the measurement of gene expression change is RT-PCR (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), Northern blotting (Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA microarrays (Sambrook et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (200D), etc.) Can be.
  • Charcoal-Maritus disease of step 1) is CMT type 1, CMT2 type, CMT4 type or CMTX type, preferably CMT 2F type.
  • the CMT 2F type is characterized in that the 404 th and 545 th cytosine gene of the heat-activated protein 27 is mutated substituted with thymine.
  • the protein synthesized due to the mutation is characterized in that the variant protein in which the 135th amino acid is substituted from serine to phenylalanine from the wild-type HSP27 protein or the 182th amino acid is substituted for leucine in plin.
  • the present inventors have identified neurons differentiated from iPSCs derived from CMT patients through micro-leubulin track and function identification associated with dysfunction of the axonal transport system, which is a major symptom in CMT 2F.
  • the acetylation level of ⁇ -leuulin and the mitochondria transport amount (moving mitochondria) As a result of confirming the axon transport efficiency of the motor neurons of CMT 2F- ⁇ , CMT 2F- ⁇ was confirmed to decrease the acetylation level of ⁇ -tubulin compared to the normal control WA09_MN (see Fig.
  • iPSCs derived from CMT patients of the present invention can produce automotor neurons via neurospheres while maintaining mutations in the CMT-causing gene, and the prepared autologous motor neurons do not directly administer CMT therapeutic candidates to patients.
  • patients can choose the patient-specific drug that is the most effective drug regardless of the efficacy of the drug. You can determine in advance which drug is least cytotoxic.
  • the present invention will be described in detail by way of examples.
  • Skin biopsy is a safe, low-invasive and economical method for the pathological diagnosis of skin lesions.
  • CMT 2F patients and normal groups including mutations of S135F or P182L of the HSP27 gene were linked (Ewha Mans University, Mokdong Hospital, Korea).
  • Skin biopsies were performed using a group of 4 mm diameter circular blades after local anesthesia for normal and CMT patients. 10 mg / collagenase type of skin tissue obtained by the above method IVClnvitrogen, USA), 50 M / mi di spase (Roche), 0.05% tr ipsin / EDTA containing in the reaction was added to DMEM medium for 40 minutes at 37 ° C.
  • the cell suspension thus obtained was filtered through a nylon cell strainer having a size of 70! M to obtain cells.
  • the obtained fibroblasts were cultured in DMEM medium containing 20% fetal bovine serum (FBS) and 100 ug / n penicillin / streptomycin. Each sample was classified as shown in Table 1 below.
  • iPSCs for neuronal differentiation from fibroblasts of CMT patient skin biopsies obtained in Example 1.
  • Transfection was performed using Sendai virus system (Cell biolabs, USA) containing Klf4, 0ct3 / 4, Sox2, c-Myc).
  • the vector of the Sendai virus used will not be inserted into the host genome and will disappear after several passages, resulting in more stable iPSCs.
  • the amount of sendaivirus was set to M0I (multiplicity of infection) 3 and after overnight infection with Sendaivirus, the skin biopsy of the CMT patient was performed.
  • Fibroblast culture medium was replaced with DMEM medium containing 10% fetal calf serum and incubated for 6 eggs to stabilize.
  • the cells were then transferred to SNL feeder cells (mouse embryonic fibroblasts (MEF) treated with mitomycin C (Invitrogen), SNL feeder cells (Cell Biolads, USA) and added 4 ng / m £ bFGF. / iPSC medium (KnockOut TM, USA) and incubated with fresh medium every day. About 30 days after Sendaivirus infection, cell colonies were selected and isolated according to the type of iPSC. The isolated iPSCs were analyzed for nucleotide sequences to determine whether they maintained the causal mutation of CMT.
  • iPSCs derived from CMT patients showed 404OT or 5450T mutations in 5 7 genes, and the HSP27 protein synthesized therefrom. It was confirmed to form variants substituted with S135F or P182L (Table 1 and FIG. 3).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • fibroblasts fibroblasts isolated from normal control and CMT patients were formed of normal human pluripotent cells with individual cells showing flat pebble shapes and sharp edges. It was confirmed that the form (Fig. 4).
  • CMT 2F-iPSCs show multipotency
  • expression of endogenous KLF4, 0CT4, S0X2 and c-Myc genes was confirmed in developmentally induced CMT 2F-iPSCs.
  • CMT 2F-iPSC or the normal control M09_hESC generated in ⁇ Example 2> was repeatedly cultured with 10 cell passages (eel hilar passage), and then obtained to obtain a trizol (TRIzol; Gibco, USA) )
  • total RNA of CMT 2F-iPSC or WA09_hESC was extracted according to the manufacturer's protocol.
  • RNA l ⁇ g and AMV reverse transcriptase ( ⁇ reverse transcriptase; Promega Inc., USA) using oligonucleotides (oliT dT), the forward primer and reverse primer described in Table 2 below CDNAs of KLF4, 0CT4, 56? and c-Myc genes were synthesized and amplified The expression of the gene was confirmed at the mRNA level by electrophresis.
  • Table 2 Table 2
  • stemEA marker proteins SSEA4 and NAN0G proteins was further confirmed.
  • Anti-SSEA4 antibody mouse IgG3, 1: 100 dilution; MC-813-70, DSHB, USA
  • anti-NAN0G antibody mouse IgGl, 1: 500 dilution; NNG-811, Abeam, USA
  • Cy3-linked goat-derived anti-mouse IgG secondary antibody and DAPI control chromosome were used for visualization.
  • the differentiation was induced to form an embryoid body (EB) from CMT 2F-iPSC, followed by ectoderm and mesoderm. And induced differentiation into tissues of endoderm origin.
  • EB embryoid body
  • the cell colonies of the CMT 2F-iPSC or the normal control WA09_hESC generated or induced in ⁇ Example 2> were transferred to an uncoated Petri dish where cells did not adhere well to the bottom of the ESC / iPSC medium (KnockOut TM, Gibco). Inc., USA) was incubated for 8 days with replacing it once to obtain floating cells as embryoid bodies (EB). Transfer the obtained embryoid body to a gelatin-coated slide culture vessel (chamber slide, Lab— Tek) and incubated for additional 8 days in 10% FBS / DMEM medium to induce differentiation into cells of ectoderm, mesoderm and endoderm origin. It was.
  • EB embryoid bodies
  • Primary antibodies include anti-alpha fetoprotein At, ant i -AFP Ab, mouse IgG2b, 1: 100; 2A9, Abeam, USA), anti-alpha smooth muscle actin Ab (mouse IgG2a, 1: 100 dilution; 1A4, Abeam, USA) and anti-Nestine antibodies (anti-Nest in Ab, mouse IgGl, 1: 1000 dilution; 10C2, Abeam, USA)
  • the secondary antibody was reacted with a goat-derived anti-mouse IgG antibody conjugated with FTTC, and then mounted with a solution containing chromosomes relative to DAPr and analyzed by confocal microscopy.
  • the compensation body is eu alpha fetoprotein (a -fetoprotein; AFP) (endoderm (endoderm)), smooth muscle actin ( It was confirmed that smooth muscle act in; SMA (mesoderm) and Nestin (Ectoderm) differentiated without abnormalities in both normal and CMT patient group cells (FIG. 7).
  • AFP alpha fetoprotein
  • SMA meoderm
  • Nestin Ectoderm
  • the CMT 2F-iPSC (S135F and P182L) or the normal control WA09 ⁇ hESC induced by the same method as described in Example 2 was detached into a small cell group, and then 1.0X10 6
  • the cells were counted and mixed at a ratio of matrigel and l: l (v: v).
  • the mixed Matrigel-cell complex was injected subcutaneously into the dorsal side of 5 week old female immunodeficient mice (N0D / SCID mice), and then xenograft mice were bred for 8 weeks.
  • mice were regenerated, explanted the teratoma formed, fixed in 10% Natural buffered forma ldehyde (10% NBF) overnight, and then made paraffin blotting, cut to 0.4 ⁇ ⁇ thickness hemaroxylin & Eosin (Hematoxylin and Eos in, H & E) staining was observed.
  • CMT 2F-iPSCs As a model of peripheral neuropathy, they were differentiated from CMT 2F-iPSCs into motor neurons according to known methods as described in FIG. 2 (Amoroso MW, et al, J Neurosci 2013 33: 574-586) (FIG. 2).
  • basal medium was used as ESC / iPSCs medium, Rho-associated kinase inhibitor 10 ⁇ Y27632 (Tocris Bioscience, UK), 20 ng / ml bFGF (Invitrogen, USA), 10 ⁇ M SB435142 (Stemgent) , USA), 0.2 ⁇ LDN193189 (Stemgent, USA), and penicillin with penicillin / streptomycin added were cultured in suspension for 2 days to form an embryoid body. Three days after the start of the culture, the basal medium was replaced with Neural stem cell media (Stemline;
  • the basal medium was changed to Neurobasal (Neurobasal; Invitrogen, USA) and maintained at 10 ng / m «IGF-1, 10 ng / mi GDNF, 10 ng / mi while maintaining all the added factors.
  • Neurobasal Neurobasal
  • CNTF R & D, USA
  • B27 supplement Gibco, USA
  • neurospheres were cultured to differentiate into motor neuron cells. Cells were maintained in suspension culture and cultured.
  • the cells were treated with accutase (accutase, PAA Laboratories) to disperse the cells, and then poly-L-lysine / laminin (poly Motor neurons differentiated from CMT-2F iPSCs or WA09_hESCs (CMT-2F-MN or WA09 ⁇ ⁇ ) in L-lysine / laminin-coated culture vessels or slide chambers (Nalgene Nunc, USA) Obtained.
  • accutase accutase, PAA Laboratories
  • Example ⁇ 3-1> CMT-2F- ⁇ or WA09J obtained in Example ⁇ 3-1> was performed by immunocytostaining in the same manner as in Example ⁇ 2-3> to confirm the expression of the motor neuron marker protein.
  • Primary antibodies used were anti-HB9 antibody (mouse IgGl, 1: 100 dilution; 81.5C10, DSHB, USA), anti-Islet-1 / 2 antibody (mouse IgG2b, 1:50 antibody; 39.4DS, DSHB, USA ), An anti-SMI32 antibody (mouse IgGl, 1: 500 dilution; Covance, USA), an anti-neuronal specific beta III tubulin (Tujl), which is an anti-H-non-phosphorylated neurofiber Antibodies (Rabbit IgG, 1: 1000); Abeam, USA; Anti-microtubule-associated protein 2, anti-MAP2 Antibody (Rabbit IgG, 1: 200 dilution; Millipore, Inc
  • DAPI stand Non chromosomes were used for visualization. The degree of development of motor neurons was compared by measuring the percentage of immunocytostained SMI32 / DAPI or MAP2 / DAPI positive cells and measuring the length of axons.
  • C2C12 mouse myoblasts (CRL-1772, purchased from ATCC) were cultured in DMEM medium containing 10% FBS, 1 mM glutamine and penicillin / streptomycin. When the cultured cells became 70% confluence, 1% insulin-transferrin-selenium (ITS) additive (Sigma, USA) was added to the medium to myotubes. Differentiation was induced. After 2 days of incubation, 10 ⁇ M cytosine arabinoside was added to remove the dividing cells and incubated for 2 to 4 days.
  • ITS insulin-transferrin-selenium
  • CMT-2F- or 09_MN obtained in Example ⁇ 3-1> was co-cultured with the inoculated myotubes at a ratio of 10: 1 and MN differentiation medium.
  • the co-cultured motor neurons and myotubes were stained with Alexa 488-linked ⁇ -Bungarotoxin ( ⁇ -bungarotoxin, ⁇ - ⁇ ; Invitrogen, USA) to confirm the formation of neuromuscular joints. .
  • CMT-2F- ⁇ co-cultured with the root canal cells confirmed that the neuromuscular joint was normally formed (FIG. 10).
  • Example ⁇ 3-1> After the differentiation-induced CMT-2F-MN or WA09_VIII was obtained by the method of Example ⁇ 3-1>, 5 ⁇ tuberstatin ⁇ was treated in the medium and incubated for 12 hours. Then, a-tubulin and acetylated a-leuublin were immunocytostained in the same manner as in Example ⁇ 2-3>.
  • Primary antibodies include anti-a-leuublin antibody (rabbit IgG, 1: 500 dilution; Abeam, USA) and anti-acetylated ⁇ -tubulin antibody (mouse IgG, 1: 200 dilution; Abeam, USA ) And Alexa 488-linked goat anti-rabbit IgG and Cy3-linked goat anti-mouse IgG antibodies were used as secondary antibodies.
  • CMT-2F- or 09_MN treated with 5 ⁇ tovastatin ⁇ was lSOmMNaCl
  • the membrane was anti-acetylated with ⁇ -tubulin antibody (mouse IgG2b, 1: 1000 dilution; 6-11B-1, Abeam) and anti- ⁇ -tubulin antibody (rabbit, mouse IgGl, 1: 1000 dilution; immunoblotting (i ⁇ unoblotting) using DM1A, Sigma, USA), followed by UN-SCAN-IT gel software (Silk Scientific, USA) to determine the acetylation level of ⁇ ⁇ tubulin by analyzing the band density.
  • immunocytostaining and immunoblot were performed in the same manner as above using CMT-2F-VIII or M09_MN not treated with 5 ⁇ tubastatin A.
  • CMT 2F-MN showed no decrease in the acetylation level of ⁇ -tubulin compared to the normal control group 09_MN when the tubevastatin A was not treated, but treated with 5 ⁇ tubastatin ⁇ .
  • the acetylation level of CMT2F- ⁇ ⁇ -tubulin increased to recover to a level similar to the normal control (Figs. 11a, lib and 11c).
  • microchannel plates Provided by Mok Professor, Seoul National University, Korea) Park JW et al., Nat Protoc 2006; 1: 2128-2136
  • axons grow perfectly through a micrometer-si zed groove and extend into the opposite compartment, using lipofectamine 2000 (1 ipofectamine 2000; Invitrogen, USA)
  • Mito-dsRED2 Mito-dsRED2 was transformed into the processed motor neurons.
  • tubastatin A was treated in the medium and incubated for 6 hours, and then mitochondrial images were taken using a fluorescence microscope at a rate of 121 snaps / 2 minutes, ImageJ and Kymograph was used to measure the moving velocity of the motor neuron.
  • the degree of migration is expressed as the percentage of the mitochondrial number that migrates to the total number of mitochondria.

Abstract

본 발명은 역분화 유도만능 줄기세포 및 이를 분화한 운동신경세포를 이용한 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease; CMT) 질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 CMT 환자로부터 유래된 인간 섬유아세포에서 역분화 유도만능 줄기세포를 제조하였고, 상기 역분화 유도만능 줄기세포에서 분화된 운동신경세포를 이용하여 샤르코-마리-투스 질환 치료제 후보물질의 스크리닝을 통해 약물의 효능의 유무를 확인이 가능하며, 상기 역분화 유도만능 줄기세포 제조 방법을 통한 자가(autologous) 운동신경세포(moter neurons)를 제작하여 환자 맞춤형 치료제 스크리닝 및 환자 맞춤형 치료에 이용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
샤르코 -마리 -투스 질환 치료제의 스크리닝 방법 및 이에 이용되는 자가 분화 운동신경세포
[기술분야】
본 발명은 역분화 유도만능 줄기세포 제조 방법 및 역분화 유도만능 줄기세포에서 분화한 자가 세포를 이용한 샤르코 -마리 -투스 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
샤르코-마리 -투스 질환 (Charcotᅳ Marie-Tooth disease; CMT) 또는 유전운동감각신경병은 운동신경 및 감각 신경이 특정한 유전자 돌연변이에 의해 손상되는 질환을 말한다. 유전되는 말초신경병에는 유전운동감각신경병 (Hereditary motor and sensory neuropathies; HMSN) , 유전운동신경병 (Hereditary motor · neuropathies; HMN) '및 유전감각신경병 (Hereditary sensory neuropathies; HSN)의 3개로 분류되며 유전운동감각신경병은 이중 하나이다. 1886년에 샤르코, 마리 및 투스에 의해 처음으로 보고된 후 이들의 이름을 따서 샤르코 -마리 -투스 질환 (Char cot-Marie-Tooth disease), 또는 첫 글자를 따서 CMT라고 줄여서 부른다. 그런데, 20세기 후반에 Dyck. 등이 CMT를 유전운동감각신경병으로 바꾸어서 명명하였고， 현재는 CMT와 HMSN을 함께 사용하고 있다. 샤르코 -마리ᅳ투스 질환은 유전되는 양상에 따라 상염색체 우성유전을 하는 1형， 2형 , 상염색체 열성유전을 하는 4형 및 X-염색체 연관유전을 하는 CMTX형으로 나누어진다. 그리고 같은 1형인 경우에는 유전자변이 등이 보고된 순서에 따라 1A, IB, 1C등의 차례로 명명되었다.
상기 샤르코 -마리 -투스 질환의 발생빈도는 2500명 당 한명으로 유전되는 희귀질환 가운데 높은 빈도를 보인다. 샤르코 -마리 -투스 질환 환자돌은 발과 손의 근육들이 점점 위축되어 힘이 약해지며， 발 모양과 손 모양의 변형이 발생한다. 환자들의 증상은 유전자 돌연변이의 종류에 따라 거의 정상에 가까운 가벼운 상태에서부터 아주 심하여 보행에 도움이 필요하거나 또는 휠체어에 의존해야 하는 정도까지 다양하다 . 기존의 CMT 치료는 주로 재활치료， 보조기구， 통증조절 등에 국한되었으나 관련된 유전자들의 발견은 유전상담과 가족계획을 가능하게 하였고， 이와 함깨 과학적인 근거에 기반을 둔 임상치료의 시도는 점차 발전하고 있다. 현재 유전운동감각신경병의 진행을 바꿀 수 있는 실질적인 치료나 보조는 아직 부족하나 최근의 동물실험에서는 가능성 있는 결과를 보였다. 이파 함께 최근에는 치료방법으로 유전자 치료， 세포 대체 치료 (cell replacement therapy) , 축삭이송에 관여하는 방법， 미토콘드리아의 기능교정， 면역시스템을 이용한 방법， 인테그린 (integrin)을 이용한 치료법 등이 연구되고 있다.
지난 수 십년간 희귀성 질환 연구의 괄목할 만한 성장에 힘입어 환자의 치료에 있어 양적, 질적인 팽대로 진단에서부터 치료까지 진료가이드라인에도 현격한 변화가 있어왔다. 특히， 분자생물학의 발달에 따른 진단기법의 변화와 그에 따른 치료의 개별화 (individualization), 즉 맞춤치료 (tai lored therapy)로 대별되는 희귀성 질환의 분자생물학적 기원의 차이에 따른 표적치료 (targeted therapy)와 이에 더하여 같은 약물이라도 환자나 희귀성 질환의 유전적 특성에 따른 약물유전체 (pharmacogenetics)의 발달로 기존의 질환이 같은 병기라도 치료가 현저히 다를 수 있는, 분자유전학적 시대라고 할 수 있다. 특히， CMT의 경우 약물요법에서부터 추가적인 치료로 증상의 완화를 목표로 하는 대증요법 (symptomatic treatment)과 각종 부작용과 합병증을 조절하고 완화시키기 위해 지지요법 (supportive therapy)에 이르기까지 희귀성 질환 중 가장 다양한 치료적 선택과 예후를 가질 수 있는 경우로， 특히 CMT는 유전자의 이상에 의해 발생하므로 증상이 계속 진행하며 완치되는 질환이 아니다ᅳ 따라서, 현재까지 일반적인 CMT 치료는 증상을 완화하고 진행을 지연시키며， 삶의 질을 향상시키는데 목적이 있었다. 현재 계속해서 유전적， 분자생물학적 연구를 통해 생물학적 치료방법이 시도되고 있으며 가능성 있는 결과들이 보고되고 있으나， 회귀성 질환의 특성상 이환된 사람들의 수가 적고 연구에 대한 관심도가 적다는 한계가 있고 아직까지 적절한 치료법이 확립되어있지 않고 희귀성 질환을 중심으로 진단 및 치료하는 의시 · 및 연구진들의 부재가 현실이다 (Acta Paediatri, 2012).
CMT 치료를 위한 약물들 가운데 프로게스테론 수용체의 길항제인 오나프리스톤 (onapristone)을 투여한 형질전환 마우스에서 Pmp22 mRNA의 과발현을 감고시키고 부작용이 없이 유전운동감각신경병의 표현형을 호전시킨 보고가. 있었고, 말초신경에서 수초형성에 필수적인 물질인 아스코르빈산 (ascorbic acid)은 CMT1A 형질전환 마우스에서 수초 제형성 및 유전 운동감각신경병의 표현형을 개선하였고， 뉴트로핀 -3(neurotrophin-3; NT-3)은 CMT1A 환자군에서 수초환된 신경섬유를 증가시켜 감각 증상 개선효과를 나타냈다고 보고되었다. 하지만, 상기 치료제들의 경우 CMT 1형에 국한되어있고， CMT는 수십여 종류의 유전자변이에 의해 발병되고 있으며， CMT의 치료를 위해서는 각 유전자의 결함에 맞는 맞춤형 치료기술개발과 이를 검증할 수 있는 모델 도입이 시급한 실정이며ᅳ CMT 환자들의 약물에 대한 효과가 현저하게 차이가 있어서 CMT 환자 및 증상에 따른 약물 선택에 있어서 제약이 있다. 환자에서 얻은 피부조직을 통해 얻어진 줄기세포는 환자의 유전적인 돌연변이의 특성을 그대로 가지고 있기 때문에， 신경세포로 분화시켰을 경우 환자와 질병 특성을 그대로 가지는 신경세포를 얻을 수 있으며, 이는 치료제 선별 또는 맞춤치료에 이용될 수 있다.
유전성말초신경병의 대표적인 샤르코 -마리 -투스 질환 (Charcot-Marie-Tooth disease; CMT)의 경우는 단일유전자 질환으로 환자의 피부세포에서 유래한 역분화 줄기세포를 체외에서 분화시켜 그 병을 재현하는 질병모델을 만돌 수 있으며， 이러한 질병모델을 사용하여 질병을 치료하는 신약을 만들 수 있다. 착수근위축증ᅳ 가족성 자율신경 실조증 (familial dysautonomia), 레오파드증후군 (LEOPARD syndrome)을 겪는 환자로부터 유래한 역분화 줄기세포를 이용해서 환자들이 보여준 세포의 이상증상과 똑같은 증상을 체외에서 재현하였으며， 체외에서 배양된 세포에 이들 질병을 위한 실험 약물을 처리했을 때 호전되는 현상을 보였다 (Ebert AD. et al , Nature, 2009, 457:277-280, Lee G. et al， Nature, 2009, 461:402-406, Cavajal-Vergara X. et al , Nature, 2010， 465:808ᅳ 812, Hanna J. et al , Scienceᅳ 2007, 318:1920-1923). 이러한 결과를 볼 때 역분화 유도만능 줄기세포 및 이를 분화한 자가세포는 치료약이 없는 많은 다른 질병들에 있어서 환자 맞춤형 신약개발의 하나의 방법으로써 난치성 희귀질환 환자들에게 도움이 될 수 있을 것이다. 이에， 본 발명자들은 사르코 -마리 -투스 질환 (Charcot-Marie-Tooth disease; CMT)의 환자 맞춤형 치료법을 연구하던 증， CMT 환자로부터 유래된 인간 섬유아세포에서 역분화 유도만능 줄기세포를 제조하였고， 상기 역분화 유도만능 줄기세포에서 분화된 운동신경세포를 이용하여 샤르코 -마리 -투스 질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 통해 약물의 효능의 유무를 확인이 가능하며， 본 발명의 제조방법을 통한 자가 (autologous ) 운동신경세포 (mot er neurons)를 제작하여 환자 맞춤형 치료제 스크리닝 및 환자 맞춤형 치료에 이용할 수 있음을 확인함으로써， 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제]
본 발명의 목적은 샤르코 -마리 -투스 질환 (Charcot-Marie-Tooth disease; CMT) 환자로부터 유래된 체세포에서 운동신경세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CMT 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 역분화 유도만능 줄기세포로부터 분화된 CMT 환자의 자가 (autologous ) 운동신경세포 (motor neurons)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 CMT 환자의 자가 운동신경세포를 이용한 CMT 유형별 환자 치료를 위한 맞춤형 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
본 발명은 샤르코 -마리 -투스 질환 (Charcot-Marie-Tooth disease; CMT) 환자로부터 유래된 체세포에서 운동신경세포의 제조방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 CMT 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 역분화 유도만능 줄기세포로부터 분화된 CMT 환자의 자가 (autologous) 운동신경세포 (motor neurons)를 제공한다.
아울러 , 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 CMT 환자의 자가 운동신경세포를 이용한 CMT 유형별 환자 치료를 위한 맞춤형 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
[유리한 효과】
본 발명의 샤르코 -마리 -투스 질환 (Char cot -Marie-Tooth disease; CMT) 환자로부터 유래된 인간 섬유아세포에서 역분화 유도만능 줄기세포를 제조할 수 있고, 상기 역분화 유도만능 줄기세포에서 분화된 운동신경세포를 이용하여 샤르코ᅳ마리ᅳ투스 잘환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 통해 약물의 효능의 유무를 확인 가능하며， 상기 역분화 유도만능 줄기세포 제조 방법을 통한 자가 (autologous) 운동신경세포 (moter neurons)를 제작하여 환자 맞춤형 치료제 스크리닝 및 환자 맞춤형 치료에 이용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】 도 1은 본 발명에서 사용된 인간 섬유아세포의 형태를 나타낸 도이다. 도 2는 CMT유래의 역분화 유도만능 줄기세포 (induced pluri potent stem cell, iPSC)에서 운동신경세포로 분화하는 방법을 나타낸 도이다.
도 3은 CMT 유래의 역분화 유도만능 줄기세포 (CMT 2F-iPSC)에서 CMT의 원인 유전자인 5/^7유전자 변이 확인을 나타낸다.
도 4는 CMT 2F PSC의 콜로니 (colony)의 형태를 나타낸 도이다. 배양 20일째 관찰한 사진이며 역분화 유도만능 즐기세포 콜로니는 속이 꽉 들어찬 밀집한 세포를 나타내었다.
도 5는 CMT 2F-iPSC의 내인성 (endogenous) 다분화능 유전자의 발현을 확인한 도이다. '
도 6은 CMT 2F-iPSC의 다분화능 마커 (sternness maeker) 단백질의 발현을 확인한 도이다.
도 7은 CMT 2F-iPSC로부터 유도된 배상체 (embryoid body, EB)의 시험관 내 Un vitro) 분화능력을 확인한 것으로， 외배엽 (ectoderm)의 마커인 네스틴 (Nestin), 중배엽 (mesoderm) 마커인 평활근액틴 (smooth muscle actin; SMA) 및 내배엽 (endoderm) 마커인 알파-페토프로테인 ( a -fetoprotein; AFP) 발현의 확인을 나타낸다.
도 8은 생체 내 (/? w'ra)에서 CMT 2F PSC의 기형종 (teratoma) 형성을 통한 분화능을 확인한 도이다.
도 9는 CMT2F환자로부터 분화된 운동신경세포 CMT 2F-MN)의 마커 단백질 발현 및 신경근육 이음부 (neuromuscular junction) 형성을 확인한 도이다; 도 9a는 CMT 2F-MN의 마커 단백질인 HB9, ISL1, SMI32, Tujl, MAP2 Synapsin 및 ChAT의 발현을 확인한 도이며;
도 9b는 CMT 2F-MN의 SMI32 및 MPA2 양성 단백질의 비율을 확인한 도이고; 및
도 9c는 CMT 2F-MN의 축삭 돌기의 길이를 측정한 도이다.
도 10은 CMT 2F-丽의 신경근육 이음부 (neuromuscular junction) 형성을 확인한 도이다. . 도 11은 CMT 2F-MN에서 투바스타틴 ACtubastatin A)의 처리 유무에 따른 축삭 운송 (axonal transport) 효율을 확인하기 위한 CMT 지표로서 아세틸화 (acetylatkm)된 α-튜블린 ( a— tubulin)의 발현을 확인한 도이다; 도 11a는 CMT 2F-MN에서 α -튜블린 ( a -tubul in)의 아세틸화를 확인한 도이며;
도 lib는 투바스타틴 A의 처리 유무에 따른 CMT 2F-丽에서 α-튜블린 ( a-tubulin)의 아세틸화를 확인한 웨스턴 블럿을 나타낸 도이고; 및 도 11c는 투바스타틴 A의 처리 유무에 따른 CMT 2F-丽에서 a-튜블린 ( a-tubulin)의 아세틸화를 정량화하여 비교한 도이다.
도 12는 CMT 2F-丽에서 투바스타틴 A의 처리 유무에 따른 축삭 운송 효율을 확인하기 위한 CMT 지표로서 미토콘드리아 운송량 (moving mitochondria)을 확인한 도이다;
도 12a는 CMT-2F-丽에 형질전환된 mito-RED2를 통해 운동 뉴런의 축삭 미토콘드리아를 관찰한 도이며;
도 12b는 투바스타틴 A의 처리 유무에 따른 CMT 2F-MN에서 미토콘드리아 이동 속도를 비교한 도이고; 및
도 12c는 투바스타틴 A의 처리 유무에 따른 CMT 2F-顧에서 이동하는 미토콘드리아의 백분율을 나타낸 도이다.
도 13은 미토콘드리아 운송량을 분석하여 CMT 2F-M 의 운동 뉴런의 축삭 운송 효율을 확인하기 위한 미소유체 배양 (Microfluidic cukiture)을 나타낸 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발땅을 상세히 설명한다. 본 발명은 하기 단계를 포함하는 사르코 -마리 -투스 질환 (Char cot-Marie-Tooth disease; CMT) 환자 유래의 체세포에서 운동신경세포의 제조방법을 제공한다. 1)샤르코 -마리 -투스 질환 (Charcotᅳ Marie-Tooth disease; CMT)환자로부터 인간 체세포를 수득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 CMT 환자 유래 인간 체세포에 0CT4, S0X2, KLF4 및 c-MYC의 트랜스유전자가 삽입된 백터를 형질전환시키고 배양하여 역분화 유도만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)를 유도하는 단계; 및
3)상기 단계 3)의 역분화 유도만능 줄기세포에 레티논산 (retinoic acid) 및 소닉 해지호그 (sonic hedgehog)의 존재하에 배양하여 운동신경세포를 유도하는 단계 .
상기 단계 1)의 샤르코 -마리ᅳ투스 질환 (Charcot-Marie-Tooth disease; CMT)은 CMT 1형 , CMT 2형， CMT 4형 또는 CMTX형이며， 바람직하게 CMT 2F형이다. 상기 CMT 2F형은 열활성단백질 (heat-shock potein; HSPs)27의 유전자 404 번째 및 545 번째 사이토신 (cytosin)이 티민 (thymin)으로 치환된 돌연변이 된 것을 특징으로 포함한다. 상기 돌연변이로 인해 합성된 단백질은 야생형 HSP27 단백질로부터 135 번째 아미노산이 세린 (serin)에서 페닐알라닌 (Phenyl alanin)으로 치환되거나, 182 번째 아미노산이 프를린 (Proline)에서 류신 (Leucine)으로 치환된 변이체 단백질인 것을 특징으로 포함한다.
상기 단계 1)의 인간 체세포는 섬유아세포인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
또한， 상기 단계 2)에서 이용되는 백터는 센다이 바이러스， 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 백터를 이용할 수 있고， 구체적으로 센다이바이러스를 이용하는 것이 보다 바람직하다.
또한， 형질전환 후 상기 역분화 유도만능 줄기세포를 얻기 위해 인간 체세포를 배양하기 위해 이용되는 배지는 통상적인 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어， Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), a -MEM(Stanner， CP. et al. , Nat. New Biol. 230:52(1971))， Iscove's MEMdscove, N. et al . , J. Exp. Med. 147:923(1978))， 199배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med. , 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640(Moore et al. , J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12(Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10(Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEMCDulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al . , Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 흔합물 (Barnes, D. et al. , Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/l(Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst . 22:1003(1959))， McCoy's 5A(McCoy, T.A. , et al . , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB시리즈 (Ham, R.G. et al .， In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용할 수 있으나， 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 유도 -만능 줄기세포 (induced pluri potent stem cell, iPSC)는 이미 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포를 지칭하는 것으로， 역분화 줄기세포 또는 유도만능 즐기세포라고도 한다. 상기 역분화 유도만능 줄기세포는 배아즐기세포와 거의 같은 특성을 가지며， 구체적으로는 비슷한 세포 모양올 보여주며， 유전자， 단백질 발현 패턴이 유사하다. 또한， 다능성 분화능을 가지는 iPSC는 시험관 내 (in vitro)에서 전분화능 마커 단백질의 발현을 확인할 수 있으며， 생체 내 (in vivo)에서 기형종 형성을 나타낸다. 특히 , 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 상기 iPSC를 삽입시켰을 때， 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고， 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)이 가능하다. 본 발명의 iPSC로는 인간， 원승이， 돼지， 말， 소， 양, 개， 고양이， 생쥐， 토끼 등의 모든 유래의 iPSC를 포함하나， 바람직하게는 인간 유래의 iPSC이며, 가장 바람직하게는 CMT 환자로부터 유래한 iPSC이다.
본 발명의 트랜스유전자 (transgene)는 한 생물체에서 다른 생물체로 자연적인 이동에 의하거나 유전공학 기술에 의해 옮겨지는 유전자 또는 유전 물질을 의미한다. 구체적으로， 한 생물체에서 분리하여 다른 생물체에 도입하는 유전자 서열을 포함하는 DNA세그먼트이다. 상기 트랜스 유전자로서 사용되는 유전자 서열은 백터에 트랜스유전자로서 0CT4, S0X2, KLF4및 c_MYC을 사용하며 이는 본래 분화된 세포에서 역분화 유도만능 줄기세포로 역분화시키기 위해 필요하다. 본 발명에서 '역분화'란 존재하는 .분화된 세포들올 미분화 상태로 되돌려 새로운 분화 조직 형성이 가능하도록 하는 후성학적인 역행과정을 의미하는 것으로 리프로그래밍 (reprogramminig) 과정이라고도 말하며， 세포 유전체의 후성학적인 변형 (epigenetic changes)의 가역성에 기초한 것이다. 본 발명에서의 목적에 따라， 상기 역분화란 0% 이상 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함되고 예를 들어 0%의 분화능올 가지는 분화된 세포를 1%의 분화능을 가지는 분화된 세포로 미분화시키는 과정도 이에 포함될 수 있다.
상기 단계 3) 이후에 상기 제조된 역분화 유도만능 줄기세포를 운동신경세포 (motor neurons)로 분화시키는 하기 (3-1) 내지 (3-2)인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다;
(3-1) 상기 제조된 역분화 유도만능 줄기세포를 배양하여 배상체 (Embryoid Body;EB)를 얻고 이를 신경구 (Neuroshpere)로 분화하는 단계; 및
(3-2) 상기 신경구를 운동신경세포로 분화시키는 단계 .
또한， 상기 단계 4)의 뉴트로판 (neurotrophin)은 신경성자인자 (nerve growth factor ;NGF) , 뇌ᅳ유래 신경인자 (brainᅳ derived neurotrophic factor ;BDNF), 뉴트로핀 (neurotrophin-3;NT-3) 및 글리아세포ᅳ유래 신경영양인자 (Glial eel 1 -derived neurotrophic factor ;GDNF)으로 구성된 군에서 선택하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자돌은 HSP27 유전자의 S135F 또는 P182L의 변이를 포함하는 CMT 2F 환자의 피부 생검으로부터 수득한 섬유아세포 (fibroblast)로부터 4종류의 전사인자 (Klf4, 0ct3/4, Sox2 및 c-Myc)를 사용하여 유도 -만능 줄기세포 (induced pur i potent stem cells, iPSC) 및 배상체 (embryoid body)의 제조하였으며 (도 4참조)， 상기 iPSC는 S135F또는 P182L의 변이를 포함하는 CMT 2F 환자에서 나타나는 변이를 포함하면서 (도 3 참조) 다분화능 마커 유전자 및 단백질을 발현하므로, CMT 질병의 만능 줄기세포 모델로 사용할 수 있음을 확인하였다 (도 5및 도 6참조). 또한， CMT 2F 환자 유래의 iPSC CMT 2F-iPSC)로부터 분화된 배상체는 시험관 내에서 내배엽， 중배엽 및 외배엽으로의 분화능을 나타내는 것을 확인하였고 (도 7 참조)， 생체 내에서 기형종을 형성하는 것을 확인하였다 (도 8 참조).
또한, 본 발명자들은 CMT 2F-iPSC를 말초신경병증 (peripheral neuropathy)의 모델로 사용하기 위하여， 공지된 방법에 기초하여 CMT 2F-iPSC로부터 운동 뉴런으로 분화하였으며 (Amoroso丽, et al , JNeurosci 2013； 33： 574-586) (도 2 참조)， 상기 분화된 운동 뉴런의 마커 단백질 발현 및 신경근육 이음부 (neuromuscular junction) 형성을 확인함으로써 운동 뉴런으로 분화된 효율을 확인하였다 (도 9 및 도 10 참조). 본 발명의 CMT 유래의 iPSCs 모델은 CMT 환자의 유전자 변이와 동일한 변이를 나타내면서 다분화능을 나타낼 뿐만 아니라， 효과적으로 신경구 (Neuroesphere)를 거쳐 자가 (autologous)운동신경세포 (mot er neurons)로 분화되므로， 상기 iPSCs 모델의 제조 방법은 CMT를 위한 분석 연구에 이용하는 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 하기 단계를 포함하는 샤르코 -마리 -투스 질환 예방 및 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
1) 본 발명의 제조방법으로 제조된 운동신경세포에 시험관 내 (in vitro)에서 CMT 치료제 후보 물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 치료제 후보 물질이 처리된 세포에서 CMT 지표의 수준을 측정하는 단계 ; 및
3) 상기 단계 2)의 CMT의 지표의 수준을 대조군과 비교하여 증가 또는 감소시ᅳ킨 후보물질을 선별하는 단계.
또한， 본 발명은 CMT 유형별 환자 치료를 위한 맞춤형 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 CMT 환자의 세포로부터 역분화시켜 제조된 역분화 유도만능 줄기세포로부터 분화된 세포는 상기 단계 1) 내지 단계 2) 및 (3-1) 내지 (3-2)의 방법으로 제작할 수 있다.
본 발명의 CMT 유래 iPSC로부터 분화된 운동신경세포는 CMT 질환에 대한 후보 약물을 스크리닝하기 위해， 사용될 수 있다. 상기 후보 약물은 히스톤 디아세틸라제 6(Histon deacetylase 6， HDAC6) 억제제인 트리코스타틴 (Trichostatin), 투바신 (Tubacin) 및 투바스타틴 A(tubastatin A)를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 후보 약물의 세포독성 (cytotoxicity) 수준을 측정하기 위해 정상 대조군과 CMT 유래 신경세포에 후보 약물을 농도 -의존 (dose-dependent)하게 처리하여 세포의 생존을 저해하지 않는 수준의 약물 농도를 결정할 수 있다. 세포의 생존력을 평가하기 위한 방법으로
3-(4,5-dimethylthia-zol-2-yl )-2,5-diphenyltetrazol ium bromide (MTT) test를 이용할 수 있다.
상기 방법으로 제작된 세포에 CMT 치료제 후보 물질을 처리하였을 때， 상기 CMT 지표를 측정하여 후보 물질이 CMT에 대하여 나타내는 약물 효용성을 확인할 수 있다. 상기 CMT 지표는 축삭 이동 (axonal transport)의 표지자인 것이 바람직하며， 구체적으로는 아세틸화된 알파-튜불린 (acetylated a -tubulin), 미토콘드리아 운송량 (moving mitochondria) 또는 전기 생리학적 지표인 활동전위 진폭 (action potential ampHtude)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하며， 더욱 구체적으로 알파-튜불린 (acetylated a -tubulin) 또는 미토콘드리아 운송량 (moving mitochondria) 중 어느 하나 또는 둘 다인 것이 가장 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 CMT 치료제 후보 물질이 처리된 세포에서 아세틸화된 알파-튜블린 (acetylated α-Uibulin)의 양이 증가되는 것을 확인하여 상기 치료제 후보물질이 CMT 치료에 효과적이라고 확인할 수 있다. 이때， 아세틸화된 알파-튜블린의 양은 치료제 후보물질을 처리하지 않았을 때 보다 20% 이상 증가하였을 때， 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게 35% 이상 증가하였을 때 치료효과가 있다고 확인할 수 있다.
상기 CMT 치료제 후보 물질이 처리된 세포에서 미토콘드리아 운송량 (moving mitochondria) 및 활동전위 진폭 (act ion potent ial amplitude)이 정상 대조군으로부터 유래한 신경세포 수준으로 회복되었을 때 치료제 후보 물질이 CMT 치료에 효과적이라고 말할 수 있다.
이때， 상기 단백질 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어， 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블롯 (western blot) 및 면역세포화학 (ICC)을 이용하여 실시할 수 있다. 또한， 유전자의 발현량 변화의 측정은 RT-PCR(Sambrook 등， Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) ,노던 블롯팅 (Peter B. Kaufma et al . , Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA마이크로어레이를 이용한 흔성화 반웅 (Sambrook등， Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(200D) 등을 이용하여 실시할 수 있다.
상기 단계 1)의 샤르코 -마리 -투스 질환은 CMT 1형， CMT2형， CMT4형 또는 CMTX형이며， 바람직하게 CMT 2F형이다. 상기 CMT 2F형은 열활성단백질 27의 유전자 404 번째 및 545 번째 사이토신이 티민으로 치환된 돌연변이 된 것을 특징으로 포함한다. 상기 돌연변이로 인해 합성된 단백질은 야생형 HSP27 단백질로부터 135 번째 아미노산이 세린에서 페닐알라닌으로 치환되거나 182 번째 아미노산이 프를린에서 류신으로 치환된 변이체 단백질인 것을 특징으로 포함한다. 본 발명의 또다른 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 CMT 2F에서 나타나는 주된 증상인 축삭 운송 (axonal transport) 시스템의 기능 장애에 연관된 마이크로 류불린 트랙와기능 확인을 통해 CMT 환자 유래의 iPSC로부터 분화된 신경세포를 CMT에 대한 약물의 효용성 평가 모델로 사용하기 위하여， α-류블린의 아세틸화 수준 및 미토콘드리아 운송량 (moving mitochondria)을 통해 CMT 2F-顺의 운동 뉴런의 축삭 운송 효율을 확인한 결과， CMT 2F-丽는 정상 대조군인 WA09_MN에 비해 α-튜블린의 아세틸화 수준이 감소하는 것을 확인하였고 (도 11참조)， 미토콘드리아 운송량 (moving mitochondria) 역시 정상 대조군에 비해 감소된 수준을 나타내는 것을 확인하였다 (도 12 참조). 그러나 : 히스톤 디아세틸라제 6(Histon deacetylase 6， HDAC6) 억제제인 투바스타틴 A(tubastatin A)을 CMT 2F-MN에 처리하였을 때， α-튜블린의 아세틸화 수준 및 미토콘드리아 운송량이 유의적으로 상승하여， 정상 대조군의 수준으로 회복되는 것을 확인하였다 (도 lib, 도 11c, 도 12b 및 도 12c 참조).
따라서， 본 발명의 CMT 환자 유래의 iPSC는 CMT 원인 유전자의 변이를 유지하면서 신경구를 거쳐 자가 운동신경세포를 제작할 수 있으며， 상기 제작된 자가 운동신경세포는 CMT 치료제 후보물질을 직접 환자에게 투여하지 않고 약물을 처리하여 나타나는 CMT 지표의 수준의 증가 또는 감소를 확인할 수 있어서， 개개인마다 상이할 수 있는 의약 물질의 효능에 관계없이 가장 우수한 효과를 보이는 약물인 환자 맞춤형 의약을 선택할 수 있고， 여러 약물 증에서 어느 약물이 가장 세포 독성이 없는지 사전에 확인할 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 피부생검 (Skin biopsy)을통한환자유래 세포분리
피부생검 (Skin biopsy)은 피부 병변의 병리학적 진단을 위해 시행되는 안전하고 저침습적이며 경제적인 방법이다. 기관생명윤리위원회 (institutional review board)의 승인을 받아， HSP27 유전자의 S135F 또는 P182L의 변이를 포함하는 CMT 2F 환자 및 정상군이 연결되었다 (이화여자대학교， 목동 병원, 한국). 피부생검은 정상군 및 CMT 환자에 대해 국소마취 후 직경 4 瞧의 원형 날이 달린 편치를 이용해 시행되었다. 상기 방법으로 얻어진 파부조직을 10 mg/ collagenase type IVClnvitrogen, 미국)， 50 M/mi di spase( Roche ) , 0.05% tr ipsin/EDTA가 포함된 DMEM 배지에 넣고 37°C에서 40분간 반웅하였다. 이렇게 얻어진 세포부유액을 70 !M 크기를 통과시키는 나일론 체 (cell strainer)로 걸러 세포를 수득하였다. 상기 수득된 섬유아세포 (fibroblast)를 20% 우태아혈청 (FBS)과 100 ug/n 페니실린 /스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 각각의 검체는 하기 [표 1]과 같이 분류하였다.
【표 1】
정상군 및 CMT 2F환자군의 검체
Figure imgf000017_0001
그 결과， 도 1에 나타낸 바와 같이， 정상군 및 CMT 환자에서 분리된 섬유아세포 (fibroblast)는 형태학적으로 동일한 것올 확인하였다 (도 1).
<실시예 2> OfT환자유래 유도 -만능 줄기세포 (induced puripotent stem cells, iPSC) 및 배상체 (embryo id body)의 제조
<2-l> CMT환자 유래의 iPSC 발생의 유도
상기 <실시예 1>에서 수득한 CMT 환자 피부 생검의 섬유아세포 (fibroblast)로부터 신경세포분화를 위한 유도만능줄기세포 (iPSCs)를 제조하기 위해 정상군 및 환자군의 섬유아세포에 4종류의 전사인자 (Klf4, 0ct3/4, Sox2, c-Myc)가 포함된 센다이 바이러스 시스템 (Cell biolabs 사, 미국)을 사용하여 형질도입 (transduction)하였다. 특히 사용한 센다이 바이러스의 백터는 호스트 게놈에 삽입되지 않고 수차례의 계대배양 후에 사라지므로 보다 안정한 iPSC를 생성할 수 있다. 센다이바이러스의 양은 M0I (multiplicity of infection) 3으로 하였고， 하룻밤 동안 (overnight) 센다이바이러스에 감염한 다음, 상기 CMT 환자 피부 생검의 섬유아세포 배양 배지를 10% 우태아혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체하고 6 알 동안 배양하여 안정화하였다. 이후 세포를 mitomycin C(Invitrogen)를 처리한 마우스 배아 섬유아세포 (mouse embryonic fibroblast, MEF)인 SNL 지지세포 (feeder cells; Cell Biolads사， 미국)으로 옮기고, 4 ng/m£의 bFGF를 첨가한 ESC/iPSC 배지 (KnockOut™ 사， 미국)와 흔합하여, 매일 새로운 배지로 교체하면서 배양하였다. 센다이바이러스 감염 후 약 30일이 지나， iPSC의 형태에 맞는 세포집락을 선택하여 분리하였다. 상기 분리한 iPSC는 염기서열을 분석하여， CMT의 원인 유전자 변이를 유지하고 있는지 확인하였다. 그 결과， 상기 [표 1], 도 3 및 도 4에서 나타난 바와 같이， CMT 환자로부터 유래된 iPSC(CMT 2F-iPSC)는 5 7유전자에서 404OT 또는 5450T 변이가 나타나， 이로부터 합성된 HSP27 단백질에서 S135F 또는 P182L로 치환된 변이체를 형성하는 것을 확인하였다 (표 1및 도 3). 또한， 정상 대조군 및 CMT 환자에서 분리된 섬유아세포 (fibroblast)를 줄기세포로 유도한 유도만능줄기세포 (iPSCs)는 개별적 세포가 평평한 조약돌 형상 및 선명한 가장자리를 나타내는 일반적인 인간 만능줄기세포 (pulripotent cell)의 형태를 나타내는 것을 확인하였다 (도 4).
<2-2> M 2F-iPSC의 내인성 (endogenous) 다분화능유전자의 발현 확인
CMT 2F-iPSC가 다분화능을 나타내는지 확인하기 위해， 발생 유도된 CMT 2F-iPSC에서 내인성 KLF4, 0CT4, S0X2및 c-Myc유전자의 발현을 확인하였다. 구체적으로， 상기 <실시예 2>에서 발생 유도한 CMT 2F-iPSC 또는 정상 대조군 M09_hESC를 10 번의 세포 계대 (eel hilar passage)를 반복하여 배양한 다음， 이를 수득하여 트리졸 (TRIzol; Gibco 사, 미국)에 현탁하고 제조사의 프로토콜에 따라 CMT 2F-iPSC 또는 WA09_hESC의 전체 RNA를 추출하였다. 그런 다음，상기 추출한 RNA l^g 및 AMV역전사 합성효소 (膽 reverse transcriptase; Promega 사, 미국)를 올리고뉴클레오티드 (olig으 dT) , 하기 [표 2]에 기재된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 흔합하여 사용하여 KLF4, 0CT4, 56 ？및 c-Myc 유전자의 cDNA를 각각 합성하고， 이를 증폭하여 전기영동 (electrophresis)로 상기 유전자의 발현을 mRNA 수준에서 확인하였다. 【표 2】
다분화능 마커 유전자의 발현 확인을 위한 프라이머의 서열
Figure imgf000019_0001
그 결과， 도 5에서 나타난 바와 같이 내인성 KLF4, 0CT4, S0X2및 c-Myc 유전자가 발현되는 것을 확인하였다 (도 5).
<2-3> C T 2F-iPSC의 다분화능마커 단백질의 발현 확인
CMT 환자 유래의 iPSCs에서 줄기세포 마커를 확인하기 위하여， 줄기세포성 마커 (stemness maeker) 단백질인 SSEA4 및 NAN0G 단백질 발현을 추가로 확인하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 2>에서 발생 유도한 CMT 2F-iPSC 또는 정상 대조군 WA09_hESC를 젤라틴이 코팅된 슬라이드 배양용기 (chamber slide, Lab-Tek ll)에 SNL세포와 흔합 배양 1주 후， 4¾ paraformaldehyde으로 고정 후， 10% normal goat serum(NGS; Gibco 사 미국) 및 Q.2 triton X— 100 처리하여 면역세포염색법으로 확인하였다. 사용한 일차 항체는 항 -SSEA4 항체 (마우스 IgG3, 1:100 희석; MC-813-70, DSHB 사， 미국)， 항 -NAN0G 항체 (마우스 IgGl, 1:500 희석; NNG-811, Abeam 사, 미국)이며， 적절한 Cy3-결합된 염소 유래 항-마우스 IgG 이차항체 및 DAPI 대비 염색체를 시각화에 이용하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이， CMT 2F-iPSC는 핵에서 발현되는 NA 0G 단백질 및 세포막 (plasma membrane)에서 발현되는 SSEA4 단백질 모두를 유의적으로 발현하는 것을 확인하였다 (도 6). <2-4> CMT 2F-iPSC로부터 배상체 및 세포조직 분화유도 확인
시험관 내 (in vitro)에서 CMT 2F-iPSC의 전분화능 (plur ipotency)를 확인하기 위하여， CMT 2F-iPSC로부터 배상체 (EB)를 형성하도록 분화를 유도한 후， 외배엽 (ectoderm), 중배엽 (mesoderm) 및 내배엽 (endoderm) 기원의 세포조직으로 분화를 유도하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 2>에서 발생 유도한 CMT 2F-iPSC 또는 정상 대조군 WA09_hESC의 세포집락을 바닥에 세포가 잘 붙지 않는 배양용기 (uncoated Petri dish)로 옮겨 ESC/iPSC 배지 (KnockOut™, Gibco 사, 미국)를 이를에 한 번씩 교체하면서 8 일 동안 배양하여 떠서 자라는 세포를 배상체 (embryoid body;EB)로서 수득하였다. 수득한 배상체를 젤라틴이 코팅된 슬라이드 배양용기 (chamber slide, Lab— Tek)로 옮겨, 10% FBS/DMEM 배지에서 추가로 8 일 동안 배양하여 외배엽, 중배엽 및 내배엽 기원의 세포조직으로 분화를 유도하였다.
또한， 상기 분화된 세포는 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 면역세포염색법을 수행하였다. 일차 항체로는 항 -알파 페토프로틴 항체 (ant i -alpha fetoprotein At), ant i -AFP Ab,마우스 IgG2b, 1:100희석 ; 2A9, Abeam사, 미국)， 항 -알파 평활근 액틴 항체 (anti-alpha smooth muscle act in Ab, 마우스 IgG2a, 1:100 희석; 1A4, Abeam 사， 미국) 및 항—네스틴 항체 (anti-Nest in Ab, 마우스 IgGl, 1:1000 희석; 10C2, Abeam 사, 미국)을 사용하였으며， 이차 항체로는 FTTC가 결합된 염소 유래 항ᅳ마우스 IgG 항체를 사용하여 반웅시킨 후 DAPr대비 염색체가 포함된 용액으로 마운트 하여 공초점 현미경으로 분석하였다. ' 그 결과， 도 7에서 나타난 바와 같이， CMT 환자 유래의 iPSC로부터 분화된 배상체를 수득하였으며， 상기 배상체는 알파ᅳ페토프로테인 ( a -fetoprotein; AFP) (내배엽 (endoderm) ) , 평활근액틴 (smooth muscle act in; SMA) (중배엽 (mesoderm)) 및 네스틴 (Nest in) (외배엽 (Ectoderm))이 정상군 및 CMT 환자군 세포 모두 이상 없이 분화되었음을 확인하였다 (도 7).
<2-5>생체 내 (In vivo))에서 CMT 2F-iPSC의 분화능 확인
생체 내에서 CMT 2F-iPSC의 분화능을 확인하기 위하여， 면역 손상된 마우스 내에서 CMT 2F-iPSC의 기형종 (teratoma) 형성을 확인하였다.
구체적으로， 상기 <실시예 2>과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도한 CMT 2F-iPSC(S135F 및 P182L) 또는 정상 대조군 WA09ᅳ hESC를 작은 세포집합군으로 분리 (detach)한 후， 1.0X106 세포로 계수 (counting)하여 매트리겔 (matrigel)과 l:l(v:v)의 비율로 흔합하였다. 상기 흔합한 매트리겔 -세포 흔합물을， 5 주령의 암컷 면역결핍 마우스 (N0D/SCID mouse)의 등쪽에 피하로 주입한 후， 이종이식 (xenograft)한 마우스를 8 주 동안 사육하몄다. 그런 다음， 사육한 마우스를 회생하여, 형성된 기형종을 외식 (explante)하여 10% Natural buffered forma ldehyde( 10% NBF)에 하룻밤 고정한 뒤 파라핀 블톡을 만들었으며， 0.4 μιη 두께로 잘라 헤마록실린 & 에오신 (Hematoxylin and Eos in, H&E)염색을 하여 관찰하였다.
그 결과， 도 8에서 나타난 바와 같이 마우스의 생체 내에 주입된 CMT 2F-1PSC는 유의적으로 기형종을 형성하였으며 조직학적으로도 내배엽, 중배엽, 외배엽 기원 조직으로 분화한 것을 확인하여， CMT 환자 유래의 iPSC가 생체 내에서도 다분화능을 나타내는 것을 확인하였다 (도 8). <실시예 3>CMT환자유래 운동뉴런 (motor neurons)의 분화유도및 효율 확인
<3-1> C T 2F-iPSC로부터 운동뉴런으로분화유도
CMT 2F-iPSC를 말초신경병증 (peripheral neuropathy)의 모델로 사용하기 위하여， 도 2에 기재된 바와 같이 공지된 방법에 따라 CMT 2F-iPSC로부터 운동 뉴런으로 분화하였다 (Amoroso MW, et al, J Neurosci 2013； 33： 574-586) (도 2). 구체적으로， 상기 <실시예 2〉과 동일한 방법을 수행하여 발생을 유도한 CMT 2F-iPSC(S135F 및 P182L) 또는 정상 대조군 09ᅳ hESC를 작은 무리 (clump)로 분리하여， 기본 배지 (basal medium)를 ESC/iPSCs 배지로 사용하고， Rho-연관 키나아제 (Rho-associated kinase) 억제제인 10 μΜ Y27632(Tocris Bioscience사， 영국)， 20 ng/ml bFGF (Invitrogen사， 미국), 10 μ M SB435142 (Stemgent 사， 미국), 0.2 μΜ LDN193189 (Stemgent 사， 미국) 및 페니실린 /스트랩토마이 신 (penicillin/streptomycin)을 첨가한 페트리 디쉬에서 2 일 동안 부유 배양하여 배상체 (embryoid body)를 형성하였다. 배양 개시 3일 후에 기본 배지를 Neural stem cell media (Stemline;
Sigma사， 미국)로 바꾸어 준 뒤 2 yg/ml heparin (Sigma 사， 미국)과 N2 suppliment (Gibco사， 미국)을 첨가하여 신경화 (neural izat ion)을 유도하였으며， 1 μΜ 레티노산 (retinoic acid; Sigma 사， 미국)， 0.4 μg/ml 아스코르브산 (ascorbic acid; Sigma사， 미국)및 10 ng/ i BDNF(R&D사， 미국)을 상기 ESC/iPSCs 배지에 첨가하여 꼬리쪽화 (caudal izat ion)를 통해 신경구 (Neurosphere)를 수득하였다.
그런 다음， 배양 개시 7 일 후에， 10 μΜ SB435142 및 0.2 μΜ LDN193189 의 첨가를 중지하였고， 소닉 해지호그 (sonic hedgehog, shh)의 작용제 (agonist)인 퍼모프아민 (purmorphamine; Stemgent 사， 미국)을 첨가하여 배양하면서 등쪽화 (ventralization)를 수행하였다.
배양 개시 17일 후에，기본 배지를 뉴로바잘 (Neurobasal; Invitrogen사， 미국)으로 변경하고, 상기 첨가한 모든 인자를 유지하면서 10 ng/m« IGF-1, 10 ng/mi GDNF, 10 ng/mi CNTF (R&D사， 미국) 및 B27 supplement (Gibco사， 미국)을 추가로 첨가하여 신경구를 운동 뉴런 세포로 분화되도록 배양하였다. 세포는 부유 배양상태로 유지하여 배양하였으며， 배양 개시 20또는 30일 후에 배양된 세포를 어큐테이즈 (accutase, PAA Laboratories)로 처리하여 세포를 흩어지게 한 후， 폴리 -L-라이신 /라미닌 (poly-L-lysine/laminin)이 코팅된 배양용기 또는 슬라이드 챔버 (slide chamber； Nalgene Nunc사， 미국)에 두어， CMT-2F iPSC또는 WA09_hESC로부터 분화된 운동뉴런 (CMT-2F-MN또는 WA09ᅳ丽)을 수득하였다.
<3-2> GMT 2F-MN의 운동마커 단백질 발현 확인
CMT 2F 환자로부터 분화된 운동 뉴런이 분화된 효율을 확인하기 위해， 운동 뉴런의 마커 단백질 발현 및 신경근육 이음부 (neuromuscular junction) 형성을 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <3-1>에서 수득한 CMT-2F-丽 또는 WA09J 은 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 면역세포염색법을 수행하여 운동 뉴런 마커 단백질의 발현을 확인였다. 사용한 일차 항체는 항 -HB9 항체 (마우스 IgGl, 1:100희석; 81.5C10, DSHB사， USA), 항 -Islet-1/2항체 (마우스 IgG2b, 1:50회석； 39.4DS, DSHB사， USA), 항 -H-비 인산화된 신경섬유 (neurofi lament H non-phosphorylated)인 항 -SMI32항체 (마우스 IgGl, 1:500희석 ; Covance사， 미국), 항ᅳ뉴런 특이적 베타 III튜불린 (Tujl)항체 (토끼 IgG, 1:1000회석 ; Abeam 사，미국)，항-미세튜브 -연관 단백질 2(anti-microtubule— associated protein 2, anti-MAP2) 항체 (토끼 IgG, 1:200 희석; Millipore 사， 미국)， 항-시냅신 (synapsin) 항체 (토끼 IgG, 1:100; Abeam 사， 미국)， 항 -콜린 아세틸트렌스퍼라제 (anti-choline acetyltransferase, anti-C T) 항체 (토끼 IgG, 1:1000회석; Abeam사， 미국)를 사용하였고, 이차 항체로는 FITC-결합된 거위 항-마우스 IgG 및 Cy3-결합된 염소 항 -토끼 IgG 및 Cy3-결합된 염소 항-마우스 IgG항체를 사용하였으며， DAPI 대비 염색체를 시각화에 이용하였다. 운동 뉴런의 발달정도는 면역세포염색된 SMI32/DAPI 또는 MAP2/DAPI 양성 세포의 백분율을 구하고, 축삭 돌기의 길이를 측정하여 비교하였다.
그 결과， 도 9에 나타낸 바와 같이， 정상 대조군 및 CMT 2F-iPSC로부터 분화된 운동 뉴런 세포는 운동 뉴런 마커 단백질인 HB9, ISL1, SMI32, Tujl, MAP2 Synapsin 및 CMT를 유의적으로 발현하는 것으로 확인하였으며 (도 9a)， 분화된 CMT 2F-顧는 정상 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않아， 발달적인 결함을 나타내지 않는 것을 확인하였다 (도 9b 및 도 9c).
<3-3> CMT 2F-MN의 신경근육 이음부 (neuromuscular junction) 형성 확인
CMT 2F 환자로부터 분화된 운동 뉴런이 분화된 효율을 확인하기 위해， 운동 뉴런의 신경근육 이음부 (neuromuscular junction) 형성을 확인하였다. 구체적으로， C2C12 마우스 근원세포 (myoblast)(CRL-1772, ATCC 구입)를 10% FBS, 1 mM 글루타민 (glutamin) 및 페니실린 /스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양한 세포가 70%의 컨플루언스 (confluence)가 되면， 1% 인술린-트랜스페린-셀레늄 (insulin-transferrin-selenium, ITS) 첨가제 (Sigma 사， 미국)을 배지에 첨가하여 근관세포 (myotube)로 분화를 유도하였다. 2 일간 배양한 후， 분열된 세포 (dividing cell)를 제거하기 위해 10 μΜ시토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside)를 첨가하여， 2내지 4일간 배양하였다. 그런 다음, 분화된 근관세포는 트립신으로 수득하여 매트리겔—코팅된 8웰 슬라이드 챔버에 1.0X104세포 /웰의 낮은 밀도로 세포를 접종하였다. 1또는 2일 후에， 상기 실시예 <3-1>에서 수득한 CMT-2F-丽또는 09_MN를 상기 접종한 근관세포와 10:1의 비율로 공동—배양 (co-culture)하고, MN 분화 배지를 첨가하였다. 1 주일 후， 상기 공동-배양한 운동 뉴런 및 근관세포를 알렉사 488-결합된 αᅳ벙가로독소 ( α-bungarotoxin, α-ΒΤΧ; Invitrogen 시， 미국)로 염색하여 형성된 신경근육 이음부의 형성을 확인하였다.
그 결과， 도 10에서 나타난 바와 같이 근관세포와 함께 공동ᅳ배양된 CMT-2F-藤는 신경근육 이음부를 정상적으로 형성하는 것을 확인하였다 (도 10).
<실시예 4> CMT유래의 운동 뉴런에 대한히스톤 디아세틸라제 6(Histon deacetylase 6, HDAC6) 억제제의 축삭운송 (axonal transport) 회복 효과확인 <4-l> CMT 2F-MN a-튜블린 ( a -tubulin)의 아세틸화 (acetyl at ion) 확인
CMT 환자 유래의 iPSC로부터 분화된 신경세포를 CMT에 대한 약물의 효용성 평가 모델로 사용하기 위하여， 히스톤 디아세틸라제 6(Histon deacetylase 6， HDAC6) 억제제인 투바스타틴 ACtubastatin A)의 처리 유무에 따른 축삭 운송 (axonal transport) 회복 효과를 확인하고자 하였다. CMT 2 아형 (subtype)은 원인 유전자에 있어서 이질성 (heterogeneity)을 가짐에도 불구하고 많은 환자에서 축상 운송 시스템 기능의 장애를 나타내며 (Gent il BJ and Cooper L, Brain Res Bull 2012； 88： 444-453) , 운송체와 운동 단백질의 상호작용에 관련이 있는 것으로 보고되어 있는 (Westermann S and Weber K. Nat Rev Mol Cel Biol 2003； 4： 938-947) a-튜블린의 아세틸화 수준을 통해 CMT 2F-丽의 운동 뉴런의 축삭 운송 효율을 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <3-1>의 방법으로 분화 유도한 CMT-2F-MN 또는 WA09_顺를 수득한 후， 5 μΜ 투바스타틴 Α을 배지에 처리하여 12 시간 동안 배양하였다. 그런 다음， 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 a-튜블린 및 아세틸화된 a-류블린을 면역세포염색하였다. 1차 항체로는 항 -a-류블린 항체 (토끼 IgG, 1:500 희석; Abeam 사， 미국) 및 항ᅳ아세틸화된 α-튜블린 항체 (마우스 IgG, 1:200희석 ; Abeam사， 미국)를 사용하였고， 2차 항체로 Alexa 488-결합된 염소 항 -토끼 IgG 및 Cy3-결합된 염소 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다.
또한, 5 μΜ투바스타틴 Α을 처리한 CMT-2F-丽또는 09_MN는 lSOmMNaCl ,
1.0% NP-40, 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 (sodium deoxycholate) , 0.1% 소듐 도데실설페이트 (sodium dodecylsulfate)및 50 mM트리스 (Tris)를 포함하는 RIPA 용해 완충용액 (RIPA lysis buffer, pH 8.0)에 현탁하여 세포의 단백질을 포함하는 상층액을 수득하고, 12% SDS-PAGE gel에서 분리한 다음， PVDF 막으로 이동하였다. 그런 다음， 상기 막에 항체로 항 -아세틸화된 α-튜블린 항체 (마우스 IgG2b, 1:1000 희석; 6-11B-1, Abeam 사) 및 항 -α-튜블린 항체 (토끼， 마우스 IgGl, 1:1000 희석; DM1A, Sigma 사， 미국)를 사용하여 면역블럿 (i麵 unoblotting)을 수행한 다음, UN-SCAN-IT 겔 소프트웨어 (Silk Scientific 사， 미국)을 사용하여 밴드 밀도를 분석하여 αᅳ튜블린의 아세틸화 수준을 확인하였다. 음성 대조군으로, 5 μΜ 투바스타틴 Α을 처리하지 않은 CMT-2F-顧 또는 M09_MN을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 면역세포염색 및 면역블럿을 수행하였다.
그 결과， 도 11에서 나타난 바와 같이 투바스타틴 A을 처리하지 않았을 때 CMT 2F-MN는 정상 대조군인 09_MN에 비해 α-튜블린의 아세틸화 수준이 감소하는 것을 확인한 반면, 5 μΜ투바스타틴 Α를 처리하였을 때에는 CMT2F-讓 α-튜블린의 아세틸화 수준이 증가하여 정상 대조군과 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인하였다 (도 11a, 도 lib 및 도 11c).
<4-2> CMT 2F- N α-류블린의 미토콘드리아운송량 (moving mitochondria) 확인
CMT 환자 유래의 iPSC로부터 분화된 신경세포를 CMT에 대한 약물의 효용성 평가 모델로 사용하기 위하여， 도 13에서 나타난 미소유체 배양 (Microfluidic'culuture)을 통해 마이크로 HDAC6 억제제인 투바스타틴 A의 처리 유무에 따른 미토콘드리아 운송량 (moving mitochondria)을 분석하여 CMT 2F-MN의 운동 뉴런의 축삭 운송 효율을 확인하였다 (도 13)
구체적으로， 상기 실시예 <3-1>에서 수득한 CMT-2F-MN 또는 WA09JIN를 어큐테이즈를 사용하여 단일 세포로 분리한 후， 미세채널 플레이트 (microchannel plates;목 교수 제공,서울대학교，한국; Park JW et al .， Nat Protoc 2006； 1： 2128-2136)에 1.0X105세포 /플레이트의 밀도로 접종하여， 10 일 동안 뉴로바잘 및 B27 배지에서 배양하였다. 축색 돌기 (axons)가 마이크로-크기의 훔 (micrometer-si zed groove)을 통해 완벽하게 자라고 반대편 칸 (opposite compartment)으로 뻗은 후， 리포펙타민 2000(1 ipofectamine 2000； Invitrogen 사， 미국)을 사용하여 미토 -dsRED2(mito-dsRED2)를 상기 가공된 운동 뉴런에 형질전환하였다. 형질전환 2 일 내에, 5또는 10 μΜ투바스타틴 Α을 배지에 처리하여 6 시간 동안 배양한 다음， 121 스냅 / 2 분의 속도로 형광현미경을 사용해 미토콘드리아 영상을 촬영하고， ImageJ 및 카이머그래프 (Kymograph)를 사용하여 상기 운동 뉴런의 운동 속도 (moving velocity)를 측정하였다.
그 결과， 도 12， 하기 [표 3] 및 하기 [표 4]에서 나타난 바와 같이 CMT-2F-顺 또는 M09_顺에 형질전환된 mito-RED2를 통해 운동 뉴런의 축삭 미토콘드리아를 관찰하였으며，투바스타틴 A을 처리하지 않았을 때 CMT2F-讓의 미토콘드리아 이동 속도는 S135F 변이를 나타내는 CMT 2F-丽의 축삭에서 유의적으로 감소하고， P182L 변이를 나타내는 CMT 2F-蘭에서는 미토콘드리아 이동의 백분율이 감소하는 것을 확인하였다 (도 12a, 도 12b 및 도 12c). 이에 반해， 투바스타틴 A를 처리하였을 때에는 S135F-MNs 및 P182L-MNs 모두에서 미토콘드리아의 이동 속도 및 이동 횟수가 현저히 증가하여， 정상 수준으로 회복되는 것을 확인하였다 (도 12b 및 도 12c).
【표 3】
투바스타틴 A의 처리 유무에 따른 미토콘드리아의 이동 속도 비교
Figure imgf000027_0001
【표 4]
투바스타틴 A의 처리 유무에 따른 미토콘드리아의 이동 정도 비교
Figure imgf000027_0002
a 이동 정도는 전체 미토콘드리아 수에 대한 이동하는 미토콘드리아 수의 백분율로 나타낸다.

Claims

【청구의 범위】
[청구항 1】
1)샤르코 -마리 -투스 질환 (Charcot-Marie-Tooth disease; CMT)환자로부터 인간 체세포를 수득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 CMT 환자 유래 인간 체세포에 0CT4, S0X2, KLF4 및 c-MYC의 트랜스유전자가 삽입된 백터를 형질전환시키고 배양하여 역분화 유도만능 줄기세포를 유도하는 단계; 및
3)상기 단계 3)의 역분화 유도만능 줄기세포에 레티논산 (retinoic acid) 및 소닉 해지호그 (sonic hedgehog)의 존재하에 배양하여 운동신경세포를 유도하는 단계를 포함하는 CMT 환자 유래 체세포에서 운동신경세포의 제조방법.
[청구항 2】
1)샤르코 -마리 -투스 질환 (Charcot-Marie-Tooth disease; CMT)환자로부터 인간 체세포를 수득하는 단계 ;
2) 상기 단계 1)의 CMT 환자 유래 인간 체세포에 0CT4, S0X2ᅳ KLF4 및 c-MYC의 트랜스유전자가 삽입된 백터를 형질전환시키고 배양하여 역분화 유도만능 줄기세포를 유도하는 단계;
3)상기 단계 3)의 역분화 유도만능 줄기세포에 레티논산 (retinoic acid) 및 소닉 헤지호그 (sonic hedgehog)의 존재하에 배양하여 운동신경세포를 유도하는 단계 ; 및
4) 상기 단계 3)의 운동신경세포를 뉴트로핀 (neurotrophin)의 존재하에 연장 배양하는 단계를 포함하는 CMT 환자 유래 체세포에서 운동신경세포의 제조방법.
【청구항 3】
제 2항에 있어서， 상기 단계 4)의 뉴트로핀 (neurotrophin)은 신경성장인자 (nerve growth factor; NGF) , 뇌 -유래 신경인자 (brain-derived neurotrophic factor; BDNF) , 뉴트로핀 -3(neurotrophin-3; NT-3) 및 글리아세포 -유래 신경인자 (Glial cell -derived neurotrophic factor; GDNF)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4】
제 1항 또는 제 2항에 있어서， 상기 샤르코ᅳ마리 -투스 질환은 CMT 1형， CMT 2형， CMT 4형 또는 CMTX형인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 5】
제 1항 또는 제 2항에 있어서， 상기 단계 1)의 인간 체세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 6】
제 1항 또는 제 2항에 있어서， 상기 단계 2)의 백터는 센다이바이러스， 레트로바이러스 또는 렌티바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 7】
제 4항에 있어서， 상기 CMT 2F형은 열활성단백질 (heat-shock potein;
HSPs)27 단백질의 135번째 또는 182번째 아미노산이 돌연변이 된 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 8】
제 1항 또는 제 2항에 있어서， 상기 단계 3)은
(3-1) 상기 제조된 역분화 유도만능 줄기세포를 배양하여 배상체 (Embryo id Body; EB)를 얻고 이를 신경구 (Neurosphere)로 분화하는 단계 ;
(3-2) 상기 신경구를 운동신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 ,
【청구항 9】
1) 제 1항 또는 제 2항의 방법으로 제조된 운동신경세포에 시험관 내 (in vitro)에서 CMT 치료제 후보 물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 CMT 치료제 후보 물질이 처리된 세포에서 CMT 지표의 수준을 측정하는 단계 ; 및 .
3) 상기 단계 2)의 CMT 지표의 수준을 대조군과 비교하여 증가 또는 감소시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 CMT 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법 .
[청구항 10】
제 9항에 있어서， 상기 샤르코ᅳ마리 -투스 질환은 CMT 1형， CMT 2형， CMT 4형 및 CMTX형인 것을 특징으로 하는 CMT 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법 .
【청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 CMT 2F형은 열활성단백질 (heat-shock potein; HSPs)27 단백질의 135번째 또는 182번째 아미노산이 돌연변이 된 것을 특징으로 하는 CMT 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법 .
[청구항 12】
제 9항에 있어서, 상기 CMT 지표는 축삭 운송 (axonal transport) 지표인 아세틸화된 알파-류불린 (acetylated a -tubulin) 또는 미토콘드리아 운송량 (moving mitochondria) 중 어느 하나 또는 둘 다인 것을 특정으로 하는 CMT 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법 .
[청구항 13】
제 9항에 있어서， 상기 단계 3)의 축삭 운송 지표인 아세틸화된 알파-튜불린 및 미토콘드리아 운송량의 CMT 지표의 수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계인 것을 특징으로 하는 CMT 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법 . 【청구항 14】
제 9항에 있어서， 상기 단계 2)의 CMT 지표의 수준 측정은 역전사 중합효소연쇄반웅 (RT-PCR), 효소면역분석법 (ELISA), 면역조직화학 (IHC), 웨스턴 블롯 (western Mot), 유세포분석법 (FACS) 또는 전세포패치클램프분석법 (whole cell patch clamp assay)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 CMT 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법 .
【청구항 1_5】
1) 제 1항 또는 제 2항의 방법으로 제조된 운동신경세포에 시험관 내 (in vitro)에서 CMT 치료제를 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 CMT 치료제가 처리된 세포에서 CMT 지표의 수준을 측정하는 단계 ; 및
3) 상기 단계 2)의 CMT 지표의 수준을 대조군과 비교하여 증가 또는 감소시킨 CMT치료제를 선별하는 단계를 포함하는 CMT환자 치료를 위한 맞춤형 치료제 스크리닝 방법 .
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