CN108342488A - 一种用于检测胃癌的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测胃癌的试剂盒，其包括胃癌相关的基因突变引物：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示。本发明获得了胃癌发病相关突变位点谱和特异性标志物；通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得胃癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种用于检测胃癌的试剂盒。
背景技术
胃癌是最常见消化道恶性肿瘤肿瘤之一，是严重威胁人类健康生命的常见病、多发病。据统计，全世界每年约有90万人新诊断为胃癌，在我国，胃癌占消化道恶性肿瘤第1位，全身恶性肿瘤第3位。根据***卫生信息统计中心2001年公布的资料，恶性肿瘤是我国城市居民的第1位死因，死亡率为135.59/10万04.9％)。其中，胃癌在恶性肿瘤死因中居第3位。胃癌的发生、发展同其他恶性肿瘤一样，属多因素、多步骤、多阶段和多基因改变过程。
我国是胃癌的高发区，每年我国新发现40万胃癌患者，约占世界胃癌发病人数的42％左右。由于胃癌早期症状不明显，又缺乏特异的早期诊断方法【di Mario F etal.Non-invasive tests in gastric diseases.Dig Liver Dis40:523-530(2008)】，现有的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度与特异性不高，对胃癌具较高特异性的CA72-4也通常在胃癌的III-IV期增高。胃癌的明确诊断通常在疾病的进展期才能做出，而此时病人的平均生存期只有7～9个月【Wagner AD et al.Chemotherapy inadvanced gastric cancer：a systematic review and meta-analysis based onaggregate data.J Clin 0ncol.24:2903-2909(2006)】。近年来，某些基因的单核苷酸多态性(SNP)在恶性肿瘤易感性研究中倍受关注，研究认为亚甲基四氢叶酸还原酶基因(Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)的C677T位点(rsl801133),CYP2E1的rs2031920位点增加个体患胃癌的风险。
因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是胃癌研究的热点，如IncRNAs。但随着肿瘤分子生物学研究的深入，科学家逐渐将目光转向环状RNA(circularRNA，circRNA)，因其在致癌与肿瘤抑制途径中显露出的潜在作用而成为肿瘤研究的新热点，circRNA是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研究表明，circRNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织及时空特异性等特征，这些特点使得circRNA在疾病诊断与治疗新型方法的开发应用上具有广阔的前景。
现有技术检测胃癌易感人群，采用杂交芯片法或玻璃板芯片法，以及利用taqman探针，该方法准确率低、假阴性和假阳性率较高，且不能批量检测；另一种直接测序法，虽准确率高，但其成本高、同样不能实现批量检测，因此现有方法均无法满足大规模基因筛选的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有新的突变位点的ABCG2突变基因。
本发明另一个目的是提供检测上述突变位点的特异性引物。
本发明第三个目的是提供上述ABCG2突变基因及特异性引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第四个目的是提供一种胃癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究胃癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的突变，寻找与胃癌相关的高特异性的突变位点，并研制出可临床或人群应用的胃癌辅助诊断试剂盒，为胃癌的筛查和诊断提供支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种用于胃癌辅助诊断的ABCG2突变基因，该突变基因与ABCG2正常基因序列相比具有在SEQ ID NO：1序列的第349位点突变，突变后的序列如SEQ ID NO：2。
用于检测上述ABCG2基因的突变位点的特异性测序引物，其上游引物的序列如为SEQ ID NO.所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
用于检测上述ABCG2基因的检测方法，该方法采用Sanger测序方法，使用PCR扩增引物，对ABCG2基因进行突变检测；其中PCR扩增引物的上游引物的序列如为SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
上述的ABCG2突变基因在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
上述的引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种胃癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测ABCG2基因是否具有SEQ ID NO：2所示序列的突变。
所述的试剂盒，该试剂盒含有上述引物(上游引物的序列如为SEQ ID NO.3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示)，该试剂盒还可以含有PCR技术所需的常用试剂。
本发明解决问题的技术方案包括筛选出人群中ABCG2与胃癌发生相关的新突变，提供位点的突变后碱基序列。
诊断试剂盒制备方法
采用Sanger测序对ABCG2基因的外显子编码区进行扫描和单个突变位点检测后确定胃癌病例与健康对照中基因型分布差异的突变位点，作为胃癌诊断的指标。最后筛选出的与胃癌发病有关的突变位点组成辅助诊断试剂盒。诊断试剂可以包括该突变位点的特异性引物以及Taq酶、dNTP等试剂。
根据上述实验结果，本发明人发现了一个能用于胃癌辅助诊断的突变位点。
具体而言，该突变位点的碱基序列的改变有助于胃癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的突变位点序列改变作为胃癌辅助判断的标志物的优越性在于：
(1)突变位点是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为胃癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明获得了胃癌发病相关突变位点谱和特异性标志物；通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得胃癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
具体实施方式
实施例1血液样本DNA提取
1、材料
发明人于2015年1月至2017年12月在北京307医院收集了大量的新发胃癌患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了30例符合下列标准的样本，同时选择10例年龄在25-55岁健康人作对照进行全外显子芯片检测，样本选择标准如下：
(1)经病理学明确诊断的胃癌病例，其中有4例病人具有癌症家族史并分别标记为X1、X2、X3、X4；
(2)采血前未接受过放疗或化疗、无既往肿瘤病史；
(3)与病例年龄匹配的健康人对照并***采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
2、提取DNA
具体步骤为：
(1)向储存于2mL冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20mL混合后，用Tris-HCl溶液定容至2000mL，下同)，颠倒混勾后完全转入。
(2)去除红细胞：用溶血试剂将5mL离心管补至4mL，颠倒混勾，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4mL溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
(3)抽提DNA:向沉淀中加1mL抽提液(每300mL中含有122.5mL 0.2M氯化钠，14.4mL0.5M乙二胺四乙酸，15mL 10％十二烷基硫酸钠，148.1mL双蒸水，下同)和8微升蛋白酶K，振荡器上充分振荡混匀，37℃水浴过夜。
⑷去除蛋白质：加1mL饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5mL离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1，v/v，下同)，充分混勾后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5mL的离心管)。
(5)DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸钠60微升，再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
(6)DNA洗涤:在沉淀中加入冰无水乙醇1mL，12000rpm离心10min，弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
(7)测量浓度:通常能得到20-50ng/μL DNA，纯度(紫外2600D:2800D)在1.8-2.0。
实施例2高通量测序
1、文库构建
上海生工有限公司采用Agilent的液相芯片捕获***，对人的全外显子区域DNA进行高效富集，然后在Illumina Hiseq平台上进行高通量、高深度测序。建库和捕获实验采用Agilent SureSelect Human All ExonV5试剂盒，严格使用说明书推荐的试剂和耗材，并参照最新的经过优化的实验流程进行操作。
实验基本流程:将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为150-260bp的片段，经末端修复和加A尾后在片段两端分别连接上接头制备DNA文库。带有特异index的文库pooling后与生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将25,555个基因的40,563个外显子捕获下来，经PCR线性扩增后进行文库质检，合格即可进行上机测序。
2、库检
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至lng/μL，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nM)，以保证文库质量。
3、上机测序
库检合格，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行Illumina Hiseq平台测序。
4、数据分析与处理
外显子组测序后获得原始数据，经过去污染等数据过滤、与人类参考基因组进行比对分析，检测个体携带的变异，包括SNP(单核苷多态性)、Indels(***、缺失片段)，并完成相应的注释和统计分析工作；保留位于编码区可能影响蛋白功能以及位于侧翼区可能影响转录本剪接的突变，包括无义突变、错义突变、移码突变、***缺失以及剪切突变，将获得的突变与公共数据库dbSNP144、千人基因组计划IOOOgenome、Hapmap、YanHuang project进行比对，滤除人群中的高频突变，筛除已知的SNP及Inde 1位点，所有的突变经过MutationTaster软件预测，筛选出新的致病性突变位点。
最终确定“胃癌病例”组和“健康对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的102个突变位点为优选敏感级位点；发明人通过验证，发现最敏感的一处突变为ABCG2的第349位由T突变为G，上述突变经过生物信息学分析结果显示，该突变为移码突变，导致蛋白结构发生变化，为致病性突变。
实施例3sanger测序
针对ABCG2的第349位设计引物，所用引物由上海生工设计合成，如表1所示。扩增大小为360bp。
| 引物名称 | 引物序列 |
| 上游引物(SEQ ID NO：3) | atgtcttccagtaatgtcga |
| 下游引物(SEQ ID NO：4) | attacatttg acattggcag |
所用PCR的反应体系(25μL体系)为：Taq Buffer 2.5μL，DNA lμL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，10mM dNTP 0.5μL，Taq酶0.2μL，ddH2019.8μL。PCR反应程序：95℃3min，35个循环(94℃35s，60℃35s，72℃lmin)，72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测，与紫外线切胶仪下切取PCR产物凝胶并纯化。对所有的PCR产物分别以正、反向引物序列测序，并对测序结果进行进一步分析，以上实验由上海生工完成。
通过Chromas序列分析软件，将测序结果与标准序列进行比对，并结合“健康对照”组序列，寻找突变位点。Sanger测序结果显示:胃癌患者的ABCG2的第349位由T突变为G，与测序结果相符合。这进一步确认所述突变位点可用于胃癌的检测、治疗、诊断、预后评估等辅助诊断。
实施例5胃癌检测试剂盒组装及检测
基于实施例3得到的引物组组装本发明所述的用于胃癌辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括实施例1中的DNA提取试剂；还包含特异性扩增引物一组如表1所示，所述试剂盒还包括相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2,双蒸水，Taq酶等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。以另外鉴定的10个胃癌患者的DNA、5例正常人的DNA作为检测标本，通过试剂盒检测结果分析如下：
| 扩增结果 | |
| 10例胃癌患者 | 10例均为阳性，结果为360bp |
| 5例正常人 | 无扩增条带 |
此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其他组织样品，通过最精简和特异的引物对检测基因突变，判断胃癌患病情况，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断、预后和更有效的个体化治疗。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 顾超
<120> 一种用于检测胃癌的试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
atgtcttcca gtaatgtcga agtttttatc ccagtgtcac aaggaaacac caatggcttc 60
cccgcgacag cttccaatga cctgaaggca tttactgaag gagctgtgtt aagttttcat 120
aacatctgct atcgagtaaa actgaagagt ggctttctac cttgtcgaaa accagttgag 180
aaagaaatat tatcgaatat caatgggatc atgaaacctg gtctcaacgc catcctggga 240
cccacaggtg gaggcaaatc ttcgttatta gatgtcttag ctgcaaggaa agatccaagt 300
ggattatctg gagatgttct gataaatgga gcaccgcgac ctgccaattt caaatgtaat 360
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
atgtcttcca gtaatgtcga agtttttatc ccagtgtcac aaggaaacac caatggcttc 60
cccgcgacag cttccaatga cctgaaggca tttactgaag gagctgtgtt aagttttcat 120
aacatctgct atcgagtaaa actgaagagt ggctttctac cttgtcgaaa accagttgag 180
aaagaaatat tatcgaatat caatgggatc atgaaacctg gtctcaacgc catcctggga 240
cccacaggtg gaggcaaatc ttcgttatta gatgtcttag ctgcaaggaa agatccaagt 300
ggattatctg gagatgttct gataaatgga gcaccgcgac ctgccaatgt caaatgtaat 360
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
atgtcttcca gtaatgtcga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
attacatttg acattggcag 20
Claims (5)
1.一种用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括胃癌相关的基因突变引物：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA提取试剂、PCR试剂、阳性对照或阴性对照。
如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包含dNTPs，MgCl2,双蒸水，Taq酶等组分。
3.与胃癌相关的标记物，其特征在于，所述标记物如SEQ ID NO：2所示。
4.如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物对在制备诊断胃癌的试剂盒中的用途。
5.一种检测胃癌的方法，其特征在于：使用权利要求1所述的试剂盒。
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