WO2014133071A1 - Ｍａｐｋシグナル伝達経路を阻害する化合物に対する応答性を予測する方法 - Google Patents

Ｍａｐｋシグナル伝達経路を阻害する化合物に対する応答性を予測する方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting responsiveness to a compound that inhibits a mitogen-activated protein kinase (hereinafter abbreviated as MAPK) signal transduction pathway in the treatment of cancer diseases.
  • MAPK mitogen-activated protein kinase
  • the present invention relates to a method for selecting patients having responsiveness, and a method for treating cancer diseases with the compound. More specifically, the present invention uses a biological sample derived from a cancer patient, and ⁇ -catenin contained in the biological sample contains (i) an active mutation and (ii) the 287th aspartic acid.
  • a patient in which ⁇ -catenin having the mutation is detected characterized by measuring whether or not the mutation has one or more mutations selected from the group consisting of substitution mutations of serine residues to serine residues Is responsive to a compound that inhibits the MAPK signaling pathway, and relates to a method for predicting responsiveness to the compound in the treatment of cancer diseases.
  • the present invention also relates to a reagent used for such a prediction method.
  • the present invention relates to a method for selecting a subject for cancer disease treatment with a compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway, comprising selecting a patient having the above-mentioned characteristics and in which ⁇ -catenin having the mutation is detected. .
  • the present invention provides a method for treating cancer diseases, comprising administering a therapeutically effective amount of a compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway to a patient having the above-mentioned characteristics and detecting ⁇ -catenin having the mutation. About.
  • the MAPK signaling pathway is a typical signaling pathway related to cell proliferation.
  • the MAPK signaling pathway is a protein kinase cascade composed of three types of kinases, MAPK, MAPK kinase (hereinafter abbreviated as MAPKK), and MAPKK kinase (hereinafter abbreviated as MAPKKKK). Is saved.
  • MAPK is composed of four types of MAPK family molecules, specifically extracellular signal-regulated protein kinases 1 and 2 (hereinafter referred to as ERK1 / 2), ERK5, Jun N-terminal kinase / It is classified into stress activated protein kinase (hereinafter abbreviated as JNK / SAPK) and p38 MAPK, and each is known to form an independent cascade.
  • ERK1 / 2 and ERK5 are independently involved in the MAPK signal transduction pathway activated mainly by stimuli such as growth factors.
  • the MAPK signaling pathway involving ERK1 / 2 is sometimes referred to as the classical MAPK signaling pathway.
  • JNK / SAPK and p38 MAPK are independently inflammatory cytokines such as interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ), or physical properties such as UV irradiation and hyperosmotic pressure stimulation. It is involved in a novel MAPK signaling pathway that is activated by chemical stress.
  • IL-1 interleukin-1
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • Raf is a MAPKKKK having serine / threonine kinase activity, and there are families such as B-Raf (hereinafter sometimes referred to as BRAF), Raf-1, A-Raf and the like. Raf is activated by Ras and activates the MAPK signaling pathway.
  • MEK is a MAPKK having a function of phosphorylating not only a tyrosine residue but also a serine residue and a threonine residue.
  • the MEK is phosphorylated and activated by Raf and specifically phosphorylates ERK1 / 2.
  • ERK is MAPK having serine / threonine kinase activity, and it is known that ERK1 and ERK2 have extremely high homology.
  • ERK1 / 2 is phosphorylated by MEK1 and MEK2 (hereinafter referred to as MEK1 / 2).
  • a growth factor such as epidermal growth factor (hereinafter abbreviated as EGF) binds to a receptor having tyrosine kinase activity on the cell membrane, a receptor tyrosine kinase (receptor tyrosine kinase).
  • EGF epidermal growth factor
  • RTK receptor tyrosine kinase
  • Grb2 is bound with guanine nucleotide exchange factor SOS (Son of Sevenless) and G protein Ras (K-ras, H-ras, and N-ras are known) guanosine diphosphate. / Guanosine triphosphate (hereinafter abbreviated as GDP / GTP) exchange reaction is promoted (Non-patent Document 3).
  • Ras is activated and Raf serine / threonine kinase is activated.
  • Raf phosphorylates MEK1 / 2 directly, and phosphorylated MEK1 / 2 phosphorylates ERK1 / 2.
  • phosphorylated ERK1 / 2 translocates into the nucleus, activates transcription of Elk-1 and cyclin D1, and leads to cell proliferation.
  • EGFR EGF receptor
  • Her2 receptor tyrosine kinases
  • the MAPK signal transduction pathway is abnormally enhanced, leading to malignancy (non-patent literature).
  • EGFR EGF receptor
  • overexpression and mutation have been observed in 50% or more of human malignant tumors. Ras active mutations are found in 30% of all malignant tumors, particularly 90% of pancreatic cancers and 50% of colorectal cancers (Non-Patent Documents 7-9).
  • BRAF active mutations are recognized in 63% of malignant melanoma, 45% of thyroid cancer, and 36% of ovarian cancer (Non-Patent Documents 10-12).
  • the active amino acid at the 600th amino acid residue is replaced by a valine residue to a glutamic acid residue (V600E), and the catalytically acting structure is changed to activate constantly. Is caused by As a result, the downstream factor is activated without being stimulated by a growth factor or the like, so that the cell grows abnormally and becomes malignant (Non-patent Document 13).
  • MEK is located downstream of Ras and Raf, has high substrate specificity, and ERK as a substrate is activated in many tumor cell types. Therefore, MEK was targeted for the purpose of suppressing cell growth. Inhibitors have been developed (Non-Patent Document 14).
  • the first MEK inhibitor developed is PD098059 (Parke-Davis). This compound showed inhibitory activity against MEK with an IC50 value of approximately 10 ⁇ mol / L.
  • U0126 (formerly DuPont Pharma) was developed. U0126 inhibited MEK1 / 2 with an IC50 value of approximately 5-7 nmol / L.
  • PD098059 and U0126 showed growth inhibitory activity in vitro but did not proceed to clinical trials (Non-patent Documents 15-16).
  • This compound has both improved selectivity and inhibitory activity compared to PD098059 and inhibited MEK1 non-competitively in adenosine triphosphate (ATP) with an IC50 value of 17 nmol / L.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Non-patent Document 18 In clinical trials, antitumor effects and decreased phosphorylation of ERK were observed in phase I clinical trials and phase II clinical trials (Non-patent Documents 19-20).
  • AZD6244 inhibits ATP non-competitively with respect to MEK with an IC50 value of approximately 12 nmol / L (Non-patent Document 21). Antitumor effects have been obtained in clinical trials and are currently in clinical trials.
  • the MEK inhibitor SMK-17 (Daiichi Sankyo Co., Ltd.) was developed with a strong MEK inhibitory activity and excellent pharmacokinetics, and confirmed MEK1 / 2-specific inhibitory activity and growth inhibitory activity. (Non-patent document 22, Patent document 1).
  • the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway is known as another signaling pathway related to biological development, cell proliferation, and carcinogenesis.
  • the tumor suppressor protein APC adenomatous polyposis coli
  • scaffold protein axin Non-patent Documents 23-25
  • glycogen synthesis Kinase-3 glycogen synthase kinase-3, hereinafter abbreviated as GSK-3
  • casein kinase 1 abbreviated as CK1
  • ⁇ -catenin is phosphorylated by GSK-3 (Non-patent Documents 23 and 26) and CK1 (Non-patent Documents 27-29).
  • Non-patent Documents 30-32 Since phosphorylated ⁇ -catenin is degraded via the ubiquitin-proteasome pathway (Non-patent Documents 30-32), ⁇ -catenin is suppressed to a low expression level. However, when Wnt binds to a complex (Fz / LRP complex) of Frizzled (hereinafter abbreviated as Fz), which is a transmembrane receptor, and LRP, which is a conjugated receptor thereof, disheveled is obtained. It is phosphorylated and GSK-3 phosphorylation activity is inhibited via axin (Non-patent Documents 33-34).
  • Fz Frizzled
  • LRP which is a conjugated receptor thereof
  • Non-patent Document 35 phosphorylation of ⁇ -catenin is inhibited, and as a result, ⁇ -catenin is accumulated in the cytoplasm without being decomposed (Non-patent Document 35). Thereafter, ⁇ -catenin moves into the nucleus and forms a complex with T cell factor (hereinafter abbreviated as TCF), which is a transcription factor (Non-patent Documents 36-37).
  • TCF T cell factor
  • Non-Patent Documents 38-39 mutations in APC and ⁇ -catenin, which are components of the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway. These mutations have been observed in 90% of colorectal cancers.
  • APC mutations are often mutations lacking a binding site for axin or ⁇ -catenin (Non-patent Document 40). As a result, a complex that phosphorylates ⁇ -catenin is not formed, ⁇ -catenin is not phosphorylated and moves into the nucleus, and the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway is constantly activated.
  • active mutations are often amino acid residues at the phosphorylation site by GSK-3, such as the 33rd serine residue (S33), the 37th serine residue (S37). ), The amino acid residue at which the 41st threonine residue (T41) or the amino acid residue at the phosphorylation site by CK1, for example, the 45th serine residue (S45) is not phosphorylated by GSK-3 or CK1 Mutation substituted for a residue.
  • ⁇ -catenin having an active mutation translocates into the nucleus without being phosphorylated by the above complex and constantly activates the Wnt / ⁇ -catenin signal transduction pathway.
  • Alessi, D.R., et al., PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. J Biol Chem, 1995. 270 (46): p. 27489-94. Favata, M.F., et al., Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. J Biol Chem, 1998. 273 (29): p. 18623-32. Friday, B.B. and A.A.
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  • Genes Dev, 2002. 16 (9): p. 1066-76 Liu, C., et al., Control of beta-catenin phosphorylation / degradation by a dual-kinase mechanism. Cell, 2002.
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  • Solit, D.B., et al., BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature, 2006. 439 (7074): p. 358-62.
  • Non-patent Document 41 the clinical response in patients with malignant melanoma having BRAF active mutations is about 10% and 11% for the MEK inhibitors PD0325901 and AZD6244, respectively, including partial response and complete response.
  • Non-Patent Documents 42-43 the clinical response in patients with malignant melanoma having BRAF active mutations is about 10% and 11% for the MEK inhibitors PD0325901 and AZD6244, respectively, including partial response and complete response.
  • a high effect has not been obtained (Non-Patent Documents 42-43).
  • An object of the present invention is to select a method for predicting sensitivity to a molecular target therapeutic agent and a patient who is judged to be highly effective by the drug in order to enable effective treatment of cancer diseases with the molecular target therapeutic agent Is to provide a way to do.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and are MEK inhibitors SMK-17 (Non-Patent Document 22, Patent Document 1) and PD184352 (Non-Patent Document 44), and BRAF selective inhibitors. It has been found that any one of SB590885 (Non-patent Documents 45-46) selectively induces apoptosis in cells having a ⁇ -catenin active mutation.
  • SMK-17 is effective in reducing tumors having ⁇ -catenin active mutations in vivo.
  • the present invention was accomplished by clarifying the relationship between the apoptosis induction and tumor reduction effect of tumor cells by inhibiting the MAPK signaling pathway and the activation of the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway.
  • the present invention relates to: 1. Using a biological sample derived from a cancer patient, ⁇ -catenin contained in the biological sample is converted into (i) an active mutation and (ii) the 287th aspartic acid residue to a serine residue. Whether or not one or more mutations selected from the group consisting of substitution mutations are measured and ⁇ -catenin having the mutation is detected is determined by a compound that inhibits the MAPK signaling pathway. Screening for cancer disease treatment with a compound that inhibits the MAPK signaling pathway, comprising screening as a cancer disease treatment target, 2.
  • ⁇ -catenin contained in the biological sample is converted into (i) an active mutation and (ii) the 287th aspartic acid residue to a serine residue. Whether or not one or more mutations selected from the group consisting of substitution mutations are measured and ⁇ -catenin having the mutation is detected is determined by a compound that inhibits the MAPK signaling pathway. Predicting responsiveness to cancer disease treatment by a compound that inhibits the MAPK signaling pathway, comprising determining responsiveness to cancer treatment 3. 2. The responsiveness to a cancer disease treatment by a compound that inhibits the MAPK signaling pathway is the reduction of cancer due to apoptosis induction in the treatment of a cancer disease by the compound.
  • ⁇ -catenin contained in the biological sample is converted into (i) an active mutation and (ii) the 287th aspartic acid residue to a serine residue. Whether or not one or more mutations selected from the group consisting of substitution mutations are measured and ⁇ -catenin having the mutation is detected is determined by a compound that inhibits the MAPK signaling pathway.
  • a method for treating cancer diseases comprising: selecting as a target for cancer disease treatment, and administering to the selected patient a therapeutically effective amount of a compound that inhibits a MAPK signaling pathway, 5.
  • the active mutation is at least one mutation selected from the following. To 4.
  • the active mutation is at least one mutation selected from the following. To 4.
  • the biological sample is a biological sample containing cancer cells or cancer tissue.
  • the compound that inhibits the MAPK signaling pathway is at least one compound selected from the group consisting of a compound that inhibits MAPKKKK, a compound that inhibits MAPKK, and a compound that inhibits MAPK.
  • the compound that inhibits the MAPK signaling pathway is at least one compound selected from the group consisting of a compound that inhibits MAPKKKK, a compound that inhibits MAPKK, and a compound that inhibits MAPK.
  • At least one compound selected from the group consisting of a compound inhibiting MAPKKK, a compound inhibiting MAPKK, and a compound inhibiting MAPK is selected from the group consisting of a compound inhibiting B-Raf and a compound inhibiting MEK1 / 2 7. at least one selected compound. the method of, 10. 10.
  • Reagent to: (A) an oligonucleotide primer that specifically binds to a nucleic acid comprising a continuous partial base sequence containing the mutation site of the gene encoding ⁇ -catenin having the mutation, (B) an oligonucleotide primer that specifically binds to a part of the complementary sequence of the base sequence in the 5 ′ region of the mutation site of the gene encoding ⁇ -catenin having the mutation, and ⁇ -catenin having the mutation
  • An oligonucleotide primer set comprising an oligonucleotide primer that specifically binds to a part of the base sequence of the 3 ′ region of the mutation site of the gene;
  • C an oligonucleotide probe that specifically binds to
  • the molecule as an active ingredient is the oligonucleotide primer (a), the oligonucleotide primer set (b), or the oligonucleotide probe (c), and the mutation is any one selected from the following: 10. said mutation.
  • Reagents (A) a substitution mutation of the 33rd serine residue, the 37th serine residue, the 41st threonine residue, or the 45th serine residue of the amino acid sequence of ⁇ -catenin, wherein the serine Substitution mutations to amino acid residues other than residues or threonine residues, (B) a deletion mutation of the 33rd serine residue, the 37th serine residue, the 41st threonine residue, or the 45th serine residue of the amino acid sequence of ⁇ -catenin, or (C) a substitution mutation of the amino acid sequence of ⁇ -catenin to the serine residue of the 287th aspartic acid residue, 12
  • the molecule that is an active ingredient is the oligonucleotide primer of (a), the oligonucleotide primer set of (b), or the oligonucleotide probe of (c), wherein the gene encoding ⁇ -catenin having the mutation is The mutation site is the
  • the molecule that is an active ingredient is the oligonucleotide primer of (a), the oligonucleotide primer set of (b), or the oligonucleotide probe of (c), wherein the gene encoding ⁇ -catenin having the mutation is
  • the mutation site and its mutation are the mutation of the 98th cytosine to adenine, the 109th thymine to cytosine, and the 110th cytosine to thymine in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • the molecule as the active ingredient is the antibody of (d) above, and the mutation is any one mutation selected from the following: Reagents: (A) a substitution mutation of the 33rd serine residue, the 37th serine residue, the 41st threonine residue, or the 45th serine residue of the amino acid sequence of ⁇ -catenin, wherein the serine Substitution mutations to amino acid residues other than residues or threonine residues, (B) a deletion mutation of the 33rd serine residue, the 37th serine residue, the 41st threonine residue, or the 45th serine residue of the amino acid sequence of ⁇ -catenin, or (C) A substitution mutation of the 287th aspartic acid residue to the serine residue in the amino acid sequence of ⁇ -catenin.
  • Reagents (A) a substitution mutation of the 33rd serine residue, the 37th serine residue, the 41st threonine residue, or the 45th serine residue of the amino acid
  • a biological sample derived from a cancer patient is used, and ⁇ -catenin contained in the biological sample contains (i) an active mutation and (ii) a serine of the 287th aspartic acid residue.
  • a method for treating cancer diseases by a compound that inhibits the MAPK signaling pathway characterized by measuring whether or not one or more mutations selected from the group consisting of substitution mutations to residues are included.
  • a method for predicting responsiveness, a method for selecting a subject for cancer disease treatment using a compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway, and a method for treating cancer disease comprising administering the compound to a patient selected by the method Can be provided.
  • the effect of a drug containing a compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway in cancer patients can be evaluated before the drug is administered.
  • the method according to the present invention it is possible to select patients who are judged to have high efficacy of the drug, and effective treatment with the drug can be performed.
  • the method according to the present invention can be performed in vitro using a biological sample derived from a cancer patient, the burden on the patient is small.
  • the method according to the present invention is useful in the therapeutic area of cancer diseases.
  • SMK-17 and U0126 which are MEK inhibitors.
  • the ⁇ -catenin active mutant cell lines SW48, colo-205, colo-201, SK-MEL-1, and HCT_116 all showed high sensitivity to SMK-17 and U0126. These cells were hyposensitive to LY294002, a PI3K inhibitor.
  • Panel A and Panel B show the results of examination by two-dimensional culture (2D culture) and three-dimensional culture (3D culture), respectively.
  • Example 1 It is a figure explaining that apoptosis induction (apoptosis induction) was observed in a cell line having a ⁇ -catenin active mutation (indicated as ⁇ -cat mutation in the figure) by SMK-17 treatment.
  • HCT_116, SW48, colo-201, and LS-174T which are cell lines having ⁇ -catenin active mutations, are treated with SMK-17 at a concentration that completely inhibits ERK phosphorylation.
  • An increase in subG1 phase cells and DNA fragmentation showing induction were observed.
  • A375 and HT29 which are cell lines having wild-type ⁇ -catenin ( ⁇ -cat wt)
  • ⁇ -cat wt ⁇ -cat wt
  • the upper panel explains the protein in which mutation was observed in the cell line used and the TCF4 transcriptional activity of the cell line.
  • the middle panel shows the ERK phosphorylation inhibitory activity of SMK-17.
  • the lower panel shows the results of detection of subG1 phase cells using a flow cytometer (FCM).
  • Example 2 The concentrations of MEK inhibitors SMK-17 and PD184352, and BRAF selective inhibitor SB590885, which completely inhibit ERK phosphorylation in HCT_116 and / or SW48, which are cell lines having ⁇ -catenin active mutations It is a figure explaining having shown apoptosis induction activity by. On the other hand, for A375, a cell line with wild-type ⁇ -catenin, these inhibitors did not induce apoptosis-inducing activity at concentrations that completely inhibited ERK phosphorylation. (Example 3) FIG.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating that the apoptosis-inducing activity of SMK-17 was significantly suppressed in cells in which ⁇ -catenin was knocked down with ⁇ -catenin siRNA.
  • Panel A shows that suppression of ⁇ -catenin expression was confirmed 48 hours after knockdown.
  • ⁇ -catenin siRNA is indicated as cat and control siRNA is indicated as ctl. Actin was used as an internal standard.
  • Panel B shows that the apoptosis-inducing activity of SMK-17 was significantly suppressed in cells knocked down by ⁇ -catenin compared to cells treated with control siRNA.
  • ⁇ -catenin siRNA is indicated as si- ⁇ -catenin and control siRNA as si-control.
  • Example 4 It is a figure explaining that the apoptosis-inducing activity of SMK-17 was suppressed by suppressing the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway by forced expression of dominant negative TCF4 (DN-TCF4).
  • Panel A shows that TCF4 transcriptional activity (TCF4 transcription activity) was inhibited by forced expression of DN-TCF4 as compared to control.
  • the left panel of Panel B shows that the number of cells in the subG1 phase was increased in the control cells by SMK-17 treatment, whereas in the cells in which DN-TCF4 was forcibly expressed, the subG1 phase observed in the control cells by SMK-17 treatment was shown. It shows that the increase in cells was suppressed.
  • the right panel B shows that treatment of cells with forced expression of DN-TCF4 with SMK-17 significantly reduced the relative number of subG1 phase cells compared to control cells. (Example 4) It is a figure explaining that the apoptosis-inducing activity of SMK-17 was observed by stimulating the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway with Wnt3a which is a Wnt ligand.
  • Panel A shows that TCF4 transcriptional activity was increased by wnt3a stimulation in cell line A375 with wild-type ⁇ -catenin.
  • Panel B shows that SMK-17 treatment induced cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (hereinafter abbreviated as PARP) under wnt3a stimulation conditions.
  • Panel C shows that SMK-17 treatment significantly increased the number of cells in the subG1 phase of A375 under wnt3a-stimulated conditions, but no increase in the number of cells in the subG1 phase was observed under wnt3a-unstimulated conditions. (Example 5) FIG.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining that apoptosis induction by SMK-17 was observed when active ⁇ -catenin was forcibly expressed in cell line A375 having wild type ⁇ -catenin.
  • active ⁇ -catenin is indicated as ABC (Active Beta-Catenin).
  • Panel A shows that the transcriptional activity of TCF4 was increased in cells in which active ⁇ -catenin was forcibly expressed.
  • Panel B shows that the number of cells in the subG1 phase was significantly increased in cells in which active ⁇ -catenin was forcibly expressed compared to control cells. (Example 5) It is a figure explaining that SMK-17 showed the tumor reduction effect in vivo.
  • FIG. 4 is a graph showing that the number of apoptosis-positive cells increased in the tumor tissue of nude mice carrying a tumor cell line SW48 having a ⁇ -catenin active mutation by administration of SMK-17.
  • nude mice carrying A375 and HT29 which are cell lines having wild-type ⁇ -catenin
  • no change in the number of apoptosis-positive cells in the tumor tissue was observed by administration of SMK-17.
  • wild-type ⁇ -catenin is indicated as ⁇ -cat wt
  • ⁇ -catenin active mutation is indicated as ⁇ -cat mutation.
  • Apoptosis-positive cells are detected by the TUNEL assay and displayed as the number of TUNEL positive cells per visual field (TUNEL positive / field).
  • the present invention inhibits the MAPK signaling pathway characterized by detecting ⁇ -catenin mutation in a biological sample derived from a cancer patient as a susceptibility factor for a compound that inhibits the MAPK signaling pathway.
  • the present invention relates to a method for predicting responsiveness to a cancer disease treatment by a compound.
  • the present invention also relates to a method for selecting a patient having responsiveness to a compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway, which has the above characteristics.
  • the present invention relates to a method for treating cancer diseases, comprising administering a compound that inhibits the MAPK signaling pathway to patients selected by the above method.
  • responsiveness to cancer disease treatment by a compound that inhibits the MAPK signaling pathway refers to sensitivity or reactivity to a compound that inhibits the MAPK signaling pathway, and more specifically, the compound It means the induction of apoptosis and the reduction of cancer.
  • apoptosis refers to a general term for programmed cell death (Non-patent Document 47).
  • Apoptosis is a controlled and regulated cell death that the cells that make up the body of a multicellular organism actively cause the individual to remain in a better state.
  • apoptosis it is known that after changes in cell membrane structure, the nucleus condenses and then DNA fragmentation occurs, and the cells are broken down into structures called small “apoptotic bodies” .
  • the DNA content of apoptotic bodies is low compared to normal cells and proliferating cells. Therefore, apoptosis can be detected by measuring the DNA content of the cells and detecting apoptotic bodies. Apoptotic bodies are detected as subG1 phase in the cell cycle measurement. The measurement of the cell cycle can be performed by a well-known method using, for example, a flow cytometer.
  • Cancer usually means a narrowly defined malignant tumor and refers to a malignant tumor that originates from epithelial cells. On the other hand, non-epithelial malignant tumors are called sarcomas. “Malignant tumor” refers to a malignant tumor that is formed by the excessive proliferation of tissues and cells autonomously against the control in vivo. Means something. Cancer can be classified into three types according to histopathological classification: adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, and transitional cell carcinoma.
  • Adenocarcinoma is a cancer derived from line tissue, such as colon cancer, breast cancer, stomach cancer, lung cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, duodenal cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, cervical cancer, uterine body cancer, etc. Can be illustrated.
  • Squamous cell carcinoma is a tumor formed by epithelial basal cells becoming malignant, atypical, pluripotent, growing in the subepithelial connective tissue, oral cancer, tongue cancer, pharynx, esophageal cancer, bronchi Examples include cancer and laryngeal cancer.
  • Transitional cell carcinoma is a cancer derived from transitional epithelial tissue, and can be exemplified by bladder cancer, renal pelvis cancer, urine liver cancer, and oral cancer.
  • sarcomas include fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteosarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, angiosarcoma, and malignant lymphoma.
  • cancer is often used synonymously with “malignant tumors”.
  • cancer and malignant tumor are used as synonyms and are interchangeable.
  • the method for predicting responsiveness to a cancer disease treatment by a compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway uses a biological sample derived from a cancer patient, and ⁇ - contained in the biological sample. Measuring whether or not catenin has a mutation, and determining that a patient in which ⁇ -catenin having the mutation is detected is responsive to cancer disease treatment by a compound that inhibits the MAPK signaling pathway Including.
  • the method for selecting a patient having responsiveness to a compound that inhibits the MAPK signaling pathway uses a biological sample derived from a cancer patient, and ⁇ -catenin contained in the biological sample is Measuring the presence or absence of a mutation, and selecting a patient in which ⁇ -catenin having the mutation is detected as a target for cancer disease treatment with a compound that inhibits the MAPK signaling pathway.
  • the method for treating cancer diseases using a compound that inhibits the MAPK signaling pathway uses a biological sample derived from a cancer patient, and whether ⁇ -catenin contained in the biological sample has a mutation. And the patient in which ⁇ -catenin having the mutation is detected is selected as a cancer disease treatment target by a compound that inhibits the MAPK signaling pathway, and the selected patient is subjected to the MAPK signaling pathway. Administration of a therapeutically effective amount of a compound that inhibits.
  • the ⁇ -catenin mutation detected as a susceptibility factor for a compound that inhibits the MAPK signaling pathway is (i) an active mutation and (ii) a serine residue of the 287th aspartic acid residue of the amino acid sequence of ⁇ -catenin. Is a substitution mutation.
  • the cancer patient is determined to be responsive to a compound that inhibits the MAPK signaling pathway, or the cancer patient is determined to be MAPK signaling pathway As a target for cancer disease treatment with a compound that inhibits.
  • a group comprising (i) an active mutation and (ii) a substitution mutation of the amino acid sequence of ⁇ -catenin to a serine residue at the 287th aspartic acid residue in a biological sample derived from a cancer patient
  • the cancer patient is administered a therapeutically effective amount of a compound that inhibits the MAPK signaling pathway.
  • active mutation of ⁇ -catenin means a mutation in which the function of ⁇ -catenin is constitutively activated in a cell, that is, the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway is constitutively activated.
  • a mutation that results in Examples of active mutations in ⁇ -catenin include mutation of amino acid residues at phosphorylation sites by serine / threonine protein kinases GSK-3 and CK1.
  • ⁇ -catenin having such an active mutation moves into the nucleus without being phosphorylated and constantly activates the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway, resulting in canceration of cells (non-patented) Reference 39).
  • Examples of phosphorylated sites by GSK-3 or CK1 include the 33rd, 37th, 41st, and 45th serine residues or threonine residues of the amino acid sequence of ⁇ -catenin.
  • Examples of the mutation of the amino acid residue at the phosphorylation site by GSK-3 include, for example, the 33rd serine residue (S33), the 37th serine residue (S37), the 41st amino acid sequence of ⁇ -catenin amino acid sequence.
  • the substitution mutation of the 45th serine residue (S45) of the amino acid sequence of ⁇ -catenin to the amino acid residue that is not phosphorylated by CK1, ie examples include substitution mutations to amino acid residues other than serine residues and threonine residues.
  • Examples of the active mutation of ⁇ -catenin include deletion of an amino acid residue at a phosphorylation site by GSK-3 or CK1, and insertion of an amino acid at the site.
  • Activating mutation of ⁇ -catenin has been reported in various cancer diseases.
  • Activating mutations in ⁇ -catenin have also been reported in many malignant tumor lines.
  • T41 of ⁇ -catenin has been reported to be substituted with alanine
  • S33 has been reported to be substituted with cysteine
  • phenylalanine has been reported to be substituted with cysteine
  • phenylalanine has been reported to be substituted with cysteine
  • phenylalanine has been reported to be substituted with cysteine
  • phenylalanine phenylalanine
  • tyrosine phenylalanine or proline
  • the nucleotide sequence of the coding region of the wild type ⁇ -catenin gene is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of wild-type ⁇ -catenin is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the position of a certain base in the base sequence of the ⁇ -catenin gene it is indicated as the position in the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the position of a certain amino acid residue in the amino acid sequence of ⁇ -catenin is indicated as the position in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • an amino acid substitution of the amino acid residue Z of the y-th amino acid residue X in the amino acid sequence may be expressed as XyZ.
  • the amino acid substitution of the 33rd serine residue to a tyrosine residue is represented as S33Y.
  • the deletion of the y-th amino acid residue X is denoted as Xydel.
  • the deletion of the 45th serine residue is indicated as S45del.
  • the substitution mutation of the nth base N to the base M is expressed as nN> M.
  • the substitution mutation of the 98th cytosine to adenine is expressed as 98C> A.
  • Activating mutations in ⁇ -catenin have been reported for colon cancer cell lines SW48 cells, HCT_116 cells, and LS-174T cells, respectively, S33Y, S45del, and S45F.
  • a mutation of S33C has been reported in SK-MEL-1 cells of the skin cancer cell line.
  • MEK inhibitors and BRAF inhibitors which are compounds that inhibit the MAPK signal transduction pathway, in the examples described later, compared to cells having wild-type ⁇ -catenin. Apoptosis was induced.
  • Non-patent Documents 50-51 Other active mutations of ⁇ -catenin were S33F and T41A in the lung cancer cell lines SW1573 and A427 cells, S37F in the duodenal cancer cell line HUTU-80 cells, and S37P in the RTCG cells of the hCG-producing ovarian adenocarcinoma cell line, respectively.
  • a mutation of S45P has been reported in NCI-H295 cells of the adrenal cortex cancer cell line (Non-patent Documents 50-51).
  • the substitution (N287S) mutation of the 287th aspartic acid residue to a serine residue is an active mutation of ⁇ -catenin.
  • the colon cancer cell lines having this substitution mutation Colo201 cell and Colo205 cell (Non-patent Document 51)
  • MEK Inhibitor treatment induced apoptosis.
  • the N287S mutation can also be used as a sensitivity factor for compounds that inhibit the MAPK signaling pathway.
  • the ⁇ -catenin mutation that can be used as a sensitivity factor for a compound that inhibits the MAPK signaling pathway in the method according to the present invention is preferably one or more mutations selected from the following: (1) Substitution mutation of the 33rd serine residue, 37th serine residue, 41st threonine residue, or 45th serine residue, other than serine residue or threonine residue A substitution mutation to an amino acid residue, (2) a deletion mutation of the 33rd serine residue, the 37th serine residue, the 41st threonine residue, or the 45th serine residue, (3) Replacement of the 287th asparagine residue with a serine residue.
  • the ⁇ -catenin mutation that can be used as a sensitivity factor for a compound that inhibits the MAPK signaling pathway in the method of the present invention is more preferably one or more mutations selected from the following: (4) a substitution mutation of the 33rd serine residue or the 45th serine residue, which is a substitution mutation to an amino acid residue other than a serine residue or a threonine residue; (5) a deletion mutation of the 45th serine residue, (6) Replacement of the 287th asparagine residue with a serine residue.
  • Detection of ⁇ -catenin mutation can be carried out by detecting ⁇ -catenin gene mutation. Detection of mutations in the ⁇ -catenin gene is preferably one or more amino acids of any one of the 33rd, 37th, 41st, 45th, and 287th amino acids of ⁇ -catenin. This is carried out by detecting the presence or absence of a missense mutation for the codon encoding the residue.
  • a “missense mutation” is a single base pair substitution that changes the genetic code such that an amino acid that is different from a normal amino acid is placed at that location.
  • the base sequence of the ⁇ -catenin gene in the test sample is compared with the base sequence of the wild-type ⁇ -catenin gene (SEQ ID NO: 1), and a nucleotide difference is detected, the ⁇ -catenin gene in the test sample Can be determined to have mutations.
  • the mutation of ⁇ -catenin gene is 98th cytosine, 109th thymine, 110th cytosine, 121st adenine, 133th thymine, 134th of ⁇ -catenin gene.
  • the 860th adenine mutation and more preferably, the gene mutations listed in Table 1.
  • Detection of mutations in the ⁇ -catenin gene can be performed using a method known per se.
  • a nucleic acid of a fragment containing the full length of a gene or a mutation site for detection is amplified, and the base sequence of the amplified nucleic acid is determined by a well-known technique.
  • Nucleic acid amplification can be performed by a nucleic acid amplification method known per se, for example, the polymerase chain reaction (abbreviated as PCR).
  • the base sequence of the obtained amplification product is determined by a DNA sequencing method such as a direct sequencing method.
  • a mutation detection method can be carried out with reference to methods described in the literature (Non-Patent Documents 50-51, etc.).
  • a hybridization method in addition to the sequencing method, a hybridization method, a restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) analysis method, and the like can be used. If the ⁇ -catenin gene amplified from the test sample does not match that of the wild type, it can be determined that the ⁇ -catenin gene of the test sample has a mutation.
  • a known single nucleotide mutation analysis method can also be used. For example, when PCR is performed, a primer comprising a complementary base sequence of a continuous partial base sequence including a mutation site is used as a primer, and the presence or absence of an amplification product is detected, thereby detecting a mutation in the ⁇ -catenin gene. Can be implemented.
  • the ⁇ -catenin gene in the test sample is amplified using such a primer, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample has the target mutation, and ⁇ -catenin in the test sample can be determined. If the gene is not amplified, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample does not have a mutation that can be detected with the primer.
  • a nucleic acid of a gene to be detected is amplified, a hybridization probe is brought into contact with the nucleic acid, and the presence or absence of hybridization between the hybridization probe and the nucleic acid is detected.
  • hybridization probe refers to a polynucleotide that can detectably distinguish two types of nucleic acids.
  • a hybridization probe a nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the base sequence of a region containing a mutation for detection is used. Hybridization can be detected by a well-known technique. If the probe hybridizes to the nucleic acid of the ⁇ -catenin gene in the test sample, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample has a mutation.
  • ⁇ -catenin mutation can also be carried out by detecting the amino acid mutation.
  • Amino acid mutations in ⁇ -catenin can be detected by immunological techniques using antibodies that specifically bind to ⁇ -catenin variants.
  • Antibodies that specifically bind to ⁇ -catenin variants are more selected than ⁇ -catenin variants other than ⁇ -catenin variants for detection, wild-type ⁇ -catenin, and proteins other than ⁇ -catenin In particular, it means an antibody that binds to a ⁇ -catenin variant that is to be detected.
  • the desired antibody is a ⁇ -catenin mutant, preferably an oligopeptide consisting of a partial amino acid sequence of a partial amino acid sequence of a ⁇ -catenin mutant and including a partial amino acid sequence at the position where the mutation exists. And can be manufactured by an existing general manufacturing method. Alternatively, a desired antibody that is commercially available can be used.
  • ⁇ -catenin mutations also activates the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway due to the active mutation, so that the reaction caused by activation of the signaling pathway, eg, TCF It can be carried out by detecting an increase in transcription activity or accumulation of ⁇ -catenin in the nucleus.
  • the method for detecting TCF transcriptional activity is known per se, and can be carried out, for example, by the top flash reporter assay used in the examples described later.
  • a method for detecting nuclear accumulation of ⁇ -catenin can be carried out by a well-known technique relating to detection of nuclear proteins, for example, a method for evaluation by immunostaining. If an increase in TCF transcriptional activity or accumulation of ⁇ -catenin in the test sample is observed, it can be determined that ⁇ -catenin in the test sample has an active mutation.
  • biological sample refers to tissue, fluid, cells, and mixtures thereof isolated from an individual, eg, tumor biopsy, spinal fluid, intrathoracic fluid, intraperitoneal fluid, lymph fluid, skin Examples include, but are not limited to, sections, blood, urine, feces, sputum, respiratory organs, intestine, genitourinary tract, saliva, milk, digestive organs, and cells collected from them.
  • the “biological sample” is preferably a sample containing cancer cells, more preferably tissue or cells obtained by excision or biopsy, or cells derived from intrathoracic fluid or intraperitoneal fluid. .
  • a more preferred biological sample is a sample containing cancer cells or cancer tissue.
  • a compound that inhibits the MAPK signaling pathway refers to a compound that decreases the function of the MAPK signaling pathway.
  • Compounds that inhibit the MAPK signaling pathway include compounds that reduce the function of components such as proteins that make up the MAPK signaling pathway, and reduce the function of the MAPK signaling pathway, such as the ability to promote cell survival and proliferation Contains compounds.
  • a compound that decreases the function of the target to act may be referred to as an “inhibitor”.
  • MAPK signaling pathways are classified into those activated by stimuli such as growth factors and those activated by inflammatory cytokines or physicochemical stress.
  • a compound that inhibits the MAPK signaling pathway is preferably a “compound that inhibits the classic MAPK signaling pathway” that is activated by a stimulus such as a growth factor.
  • the compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway is preferably a compound that inhibits a pathway upstream of MEK in the signal transduction pathway. From the compound that inhibits MAPKKKK, the compound that inhibits MAPKK, and the compound that inhibits MAPK It may be at least one compound selected from the group consisting of
  • the compound that inhibits MAPKKKK is preferably a compound that inhibits Raf, and more preferably a compound that inhibits BRAF.
  • the compound that inhibits MAPKK is preferably a compound that inhibits MEK, and more preferably a compound that inhibits MEK1 / 2.
  • the compound that inhibits MAPK is preferably a compound that inhibits ERK, and more preferably a compound that inhibits ERK1 / 2.
  • the compound that inhibits the MAPK signaling pathway is more preferably at least one compound selected from the group consisting of a compound that inhibits BRAF and a compound that inhibits MEK1 / 2, and even more preferably, MEK1 / 2 Is a compound that inhibits
  • Patent Document 2 As compounds that inhibit MEK, compounds described in WO2000 / 037141 (Patent Document 2) (PD-184352 and the like), compounds described in WO2002 / 006213 (Patent Document 3) ( PD-0325901, etc.), compounds described in WO 2003/077914 pamphlet (Patent Document 4) (selumetinib etc.), compounds described in WO 2007/014011, pamphlet (Patent Document 5). (Refametinib) etc.), compounds described in pamphlet of International Publication No. 2007/044515 (Patent Document 6) (GDC-0973: XL-518 etc.), and pamphlets described in Pamphlet of International Publication No. 2006/011466 (Patent Document 7).
  • Non-Patent Document 52 Expert Opin Ther Patents, 201 1. 21 (7): p. 1045-69.
  • Non-Patent Document 53 a compound represented by the following structural formula 1, a compound represented by the following structural formula 2, and the following structure
  • the compound represented by Formula 3 can be illustrated.
  • the compound represented by the following structural formula 1 is a MEK1 / 2 selective inhibitor and is referred to as SMK-17 (Daiichi Sankyo Co., Ltd.).
  • the compound represented by the following structural formula 2 is referred to as U0126 (Sigma).
  • the compound represented by Structural Formula 3 below shows inhibitory activity against MAPK in addition to MEK, and is referred to as PD184352.
  • Examples of compounds that inhibit BRAF include compounds represented by the following structural formula 4.
  • the compound is a BRAF selective inhibitor and is referred to as SB590885.
  • the cancer disease to which the method according to the present invention can be applied may be any cancer disease in which tumor cells in which the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway is activated can be detected, particularly tumor cells having activated ⁇ -catenin.
  • a cancer disease in which is detected is preferred.
  • cancer diseases include cancer diseases in which tumor cells having a ⁇ -catenin active mutation are detected, and cancer diseases in which tumor cells having an N287S substitution mutation are detected.
  • ⁇ -catenin active mutations and N287S substitution mutations have been detected in various cancer tissues and malignant tumor cell lines.
  • cancer diseases to which the method of the present invention can be applied include colon cancer, liver cancer, skin cancer, lung cancer, kidney cancer, prostate cancer, duodenal cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, cervical cancer, gallbladder.
  • Examples include cancer, pancreatic cancer, breast cancer, stomach cancer, oral cancer, tongue cancer, pharynx, esophageal cancer, bronchial cancer, laryngeal cancer, bladder cancer, renal pelvis cancer, and ureteral cancer.
  • a cancer patient selected as being responsive to cancer treatment with a compound that inhibits the MAPK signaling pathway is treated with a therapeutically effective amount of the compound that inhibits the MAPK signaling pathway. It can be considered that apoptosis is induced and tumor shrinkage occurs.
  • a compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway is administered to a cancer patient per se or as a composition containing the compound.
  • the composition comprises a filler, a filler, a binder, a moistening agent, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a diluent, an excipient that is usually used depending on the form of use of the preparation. It is produced as a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutical carriers such as a dosage form.
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is appropriately selected from a wide range, but is usually about 0.00001 to 70% by weight, preferably about 0.0001 to 5% by weight. .
  • the dose range is not particularly limited, and the effectiveness of the contained components, dosage form, administration route, type of disease, subject nature (such as body weight, age, medical condition and use of other medicines), and the physician's It is appropriately selected depending on the judgment.
  • a suitable dose is, for example, in the range of about 0.01 ⁇ g to 100 mg, preferably about 0.1 ⁇ g to 1 mg, per kg of the subject's body weight.
  • these doses can be varied using general routine experimentation for optimization well known in the art.
  • the above dose can be administered once to several times a day, and may be administered intermittently at a rate of once every several days or weeks.
  • the administration route can be either systemic administration or local administration.
  • an appropriate administration route is selected according to the disease, symptoms and the like.
  • parenteral routes include normal intravenous administration and intraarterial administration, as well as subcutaneous, intradermal, intramuscular administration and the like.
  • it can be administered by the oral route.
  • transmucosal administration or transdermal administration can also be performed. It can also be administered directly into the tumor.
  • the administration form can be selected from various forms according to the purpose. Typical examples include solid dosage forms such as tablets, pills, powders, powders, fine granules, granules, capsules, aqueous preparations, ethanol solution preparations, suspensions, fat emulsions, liposome preparations, Inclusion bodies such as cyclodextrin, and liquid dosage forms such as syrup and elixir are included. Depending on the route of administration, these may be oral, parenteral (instillation, injection), nasal, inhalation, vaginal, suppository, sublingual, eye drops, ear drops, ointments, creams And can be prepared, molded and prepared according to ordinary methods.
  • the present invention also relates to a reagent and a reagent kit used in the prediction method according to the present invention.
  • the reagent according to the present invention is selected from the group consisting of (i) an active mutation of ⁇ -catenin and (ii) a substitution mutation of the amino acid sequence of ⁇ -catenin to the serine residue of the 287th aspartic acid residue. It is a reagent for detecting any one mutation.
  • the reagent kit according to the present invention is a reagent kit containing any one or two or more of these reagents in a individually packaged form.
  • the reagent according to the present invention is preferably a reagent that detects one or more ⁇ -catenin mutations selected from the following: (1) Substitution mutation of the 33rd serine residue, 37th serine residue, 41st threonine residue, or 45th serine residue, other than serine residue or threonine residue A substitution mutation to an amino acid residue, (2) a deletion mutation of the 33rd serine residue, the 37th serine residue, the 41st threonine residue, or the 45th serine residue, (3) Replacement of the 287th asparagine residue with a serine residue.
  • the reagent according to the present invention is more preferably a reagent for detecting one or more ⁇ -catenin mutations selected from the following: (4) a substitution mutation of the 33rd serine residue or the 45th serine residue, which is a substitution mutation to an amino acid residue other than a serine residue or a threonine residue; (5) a deletion mutation of the 45th serine residue, (6) Replacement of the 287th asparagine residue with a serine residue.
  • the reagent according to the present invention can be exemplified by an oligonucleotide primer or an oligonucleotide probe used in the method for detecting the mutation of the ⁇ -catenin gene.
  • the reagent according to the present invention can be exemplified by an antibody used in the method for detecting the amino acid mutation of ⁇ -catenin.
  • the oligonucleotide primer may be a specific oligonucleotide primer designed to specifically amplify the base sequence of a partial region including nucleotides of all or a mutation site of the ⁇ -catenin gene or a variant thereof. It can be anything.
  • a specific oligonucleotide primer hybridizes with a target nucleic acid under the appropriate hybridization or washing conditions, that is, a nucleic acid in a partial region of the base sequence of the ⁇ -catenin gene or a variant thereof or a complementary sequence thereof. It is a probe that does not substantially hybridize to a nucleic acid that is not intended.
  • Non-Patent Document 54 Such a primer can be appropriately designed based on the base sequence information of the ⁇ -catenin gene having a mutation, and can be obtained by chemical synthesis according to a conventional method. Primer design can be carried out using a method known per se or well-known design software.
  • oligonucleotide primer for example, 10 to 60, preferably 15 to 30, more preferably hybridize to a part of the complementary sequence of the base sequence in the 5 ′ region of the mutation site of the ⁇ -catenin gene having mutation. Mention may be made of oligonucleotides consisting of 18 to 25 consecutive nucleotides. The smaller the primer size, the higher the specificity to the target base sequence to which it hybridizes, but the lower the binding affinity. Conversely, the larger the size, the higher the binding affinity but the lower the specificity. The above-mentioned sizes are suitable.
  • Such an oligonucleotide primer is preferably combined with an oligonucleotide primer comprising a continuous nucleotide of the above size that hybridizes to a part of the base sequence in the 3 ′ region of the mutation site of the ⁇ -catenin gene having mutation.
  • Used as oligonucleotide primer set By performing PCR using such a primer set, the nucleic acid in the region containing the nucleotide at the mutation site of the ⁇ -catenin gene having mutation is amplified. By determining the base sequence of the amplified product by the DNA sequencing method as described above, it can be detected whether or not the ⁇ -catenin gene in the test sample has a mutation.
  • oligonucleotide primer a nucleic acid comprising a continuous partial base sequence including a mutation site of a ⁇ -catenin gene having a mutation, or a partial base sequence of a wild-type ⁇ -catenin gene, wherein the target mutation exists
  • examples include oligonucleotides consisting of 10 to 60, preferably 15 to 30, more preferably 18 to 25 consecutive nucleotides, or their complementary oligonucleotides, which hybridize to a nucleic acid consisting of a partial base sequence containing nucleotides.
  • Such an oligonucleotide, or a complementary oligonucleotide thereof is not limited to the same nucleotide sequence of a partial region of a ⁇ -catenin gene having a mutation, and a desired mutation existing in ⁇ -catenin gene As long as it can be detected under appropriate hybridization or washing conditions, it can be an oligonucleotide with high sequence homology or its complementary oligonucleotide.
  • An oligonucleotide having high sequence homology has a sequence homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, or 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably Means one to two, more preferably one nucleotide is different.
  • mutations in the ⁇ -catenin gene can be detected. If an amplification product is recognized by the oligonucleotide primer designed based on the sequence information of the ⁇ -catenin gene having a mutation, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample has the target mutation, and the amplification product is recognized. When it is absent or small compared to the control, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample does not have a mutation detectable with the primer.
  • an amplification product is recognized by the oligonucleotide primer designed based on the sequence information of the wild type ⁇ -catenin gene, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample does not have the target mutation, and the amplification product is recognized. If not, or less than the control, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample has a mutation.
  • the oligonucleotide probe is an oligonucleotide probe specific for any one of the above mutations of the ⁇ -catenin gene.
  • a specific oligonucleotide probe is a partial region of the base sequence of a target target, that is, a ⁇ -catenin gene mutant under appropriate hybridization or washing conditions, and is a mutation of any one of the above mutations It is a probe that can hybridize with a region including nucleotides at the site of the DNA and does not substantially hybridize to a non-target nucleic acid.
  • a ⁇ -catenin gene mutant can be detected.
  • Appropriate hybridization or washing conditions can follow, for example, the method described in the book (Non-Patent Document 54).
  • Any oligonucleotide probe may be used as long as it is specifically designed to hybridize to the nucleotide sequence of the entire ⁇ -catenin gene having a mutation, preferably a partial region including the nucleotide at the mutation site. May be. For example, 15 or more, preferably 15 to 500, more preferably 18 to 200, and still more preferably 18 that hybridize to the nucleotide sequence of the region containing the nucleotide at the position where the mutation of the ⁇ -catenin gene having mutation exists.
  • Such an oligonucleotide or its complementary oligonucleotide can be appropriately designed based on the base sequence information of the ⁇ -catenin gene or wild-type catenin gene having a mutation, and can be obtained by chemical synthesis according to a conventional method.
  • Such an oligonucleotide, or a complementary oligonucleotide thereof is not limited to the same nucleotide sequence of a partial region of the ⁇ -catenin gene.
  • an oligonucleotide with high sequence homology or its complementary oligonucleotide As long as it can be detected under hybridization or washing conditions, it can be an oligonucleotide with high sequence homology or its complementary oligonucleotide.
  • An oligonucleotide having high sequence homology has a sequence homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, or 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably Means one to two, more preferably one nucleotide is different. If hybridization of an oligonucleotide probe designed based on the nucleotide sequence information of a ⁇ -catenin gene having a mutation is observed, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample has the target mutation, and hybridization is recognized.
  • the ⁇ -catenin gene in the test sample does not have the desired mutation. If hybridization of an oligonucleotide probe designed based on the nucleotide sequence information of the wild-type ⁇ -catenin gene is observed, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample does not have the target mutation, and the hybridization is If not observed, it can be determined that the ⁇ -catenin gene in the test sample has the desired mutation.
  • the oligonucleotide probe and the oligonucleotide primer contain an additional sequence, that is, a nucleotide constituting a base sequence that is not complementary to the ⁇ -catenin gene to be detected as long as it does not interfere with the specific detection of the mutation of the ⁇ -catenin gene. You may go out.
  • the oligonucleotide probe and the oligonucleotide primer may be labeled with an appropriate labeling agent, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, biotin and the like.
  • an appropriate labeling agent for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, biotin and the like.
  • labeled oligonucleotide probes and oligonucleotide primers facilitates detection of their hybridization to the target gene.
  • Preferred radioisotopes 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, 3 2P, 33 P, 35 S and which may or may not be.
  • Preferred enzymes include ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like.
  • Preferred fluorescent materials include fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like. Examples of preferable luminescent substances include luminol, luminol derivatives, luciferin, and lucigenin.
  • a quencher quenching substance that absorbs fluorescence energy emitted from the fluorescent dye may be further bound in the vicinity of a reporter fluorescent dye such as FAM trademark or VIC registered trademark . In such an embodiment, the fluorescence is detected by separating the fluorescent dye and the quencher during the detection reaction.
  • the antibody may be any antibody that specifically binds to a ⁇ -catenin mutant, and may be any isotype, but is preferably an IgG antibody. Such an antibody can be produced using a desired ⁇ -catenin mutant, specifically, a ⁇ -catenin mutant having any one of the amino acid mutations as an antigen.
  • the antigen may be a full-length protein of ⁇ -catenin mutant, or may be a partial peptide of the region including a site where an amino acid mutation exists.
  • the antigen is composed of at least 8, preferably at least 10, more preferably at least 12, even more preferably 15 or more amino acids.
  • Such full-length proteins and partial peptides include cells, cell-free synthetic products, and chemical synthesis products in which nucleic acids encoding the proteins or peptides are expressed by general genetic engineering techniques (Non-Patent Documents 54-56, etc.). Can be made. Alternatively, it can be prepared from a sample derived from the cell or living organism, and further purified from these.
  • Antibody production can be carried out using a known antibody production method.
  • an antibody can be obtained by administering an antigen to an animal alone or in combination with a carrier in the presence or absence of an adjuvant and inducing immunity such as a humoral immune response and / or a cellular immune response.
  • the carrier is not particularly limited as long as it does not itself have a harmful effect on the host and enhances antigenicity, and examples thereof include cellulose, polymerized amino acid, albumin and keyhole limpet hemocyanin.
  • Adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), Ribi (MPL), Ribi (TDM), Ribi (MPL + TDM), pertussis vaccine (Bordetella pertussis vaccine), muramyl dipeptide (MDP), aluminum An adjuvant (ALUM) and these combinations can be illustrated.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • MPL MPL
  • TDM Ribi
  • MPL + TDM Ribi
  • pertussis vaccine Bordetella pertussis vaccine
  • MDP muramyl dipeptide
  • ALUM aluminum An adjuvant
  • the antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Polyclonal antibodies can be obtained from the sera of animals that have been immunized by known antibody recovery methods. A preferred antibody recovery means is immunoaffinity chromatography.
  • Monoclonal antibodies can be prepared using a known method, for example, a hybridoma method (Non-patent Document 57). Selection of a hybridoma that produces the target antibody can be performed by, for example, screening by a known method (Non-patent Documents 58 and 59). That is, a desired antibody can be obtained by conducting a binding test between the monoclonal antibody produced by the hybridoma and the target ⁇ -catenin mutant and selecting an antibody that specifically binds to the target ⁇ -catenin mutant. it can.
  • the antibody may be either an intact antibody or an antibody fragment.
  • “Intact antibody” means an antibody composed of a tetrameric structural unit similar to a natural antibody.
  • Antibody fragment means a fragment containing a part of an intact antibody, for example, an antigen-binding region or a variable region of the intact antibody. Examples of antibody fragments include Fab fragments, Fab 1 fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fv fragments, diabodies, linear antibodies, single chain antibody molecules, and multispecific antibodies formed from antibody fragments. Can be mentioned.
  • Fab fragments are antigen-binding fragments having a single antigen-binding site, and two identical Fab fragments each having a single antigen-binding site are produced from one antibody by papain digesting the antibody. be able to.
  • An “F (ab ′) 2 fragment” is an antibody fragment that can be produced by pepsin treatment of an antibody, and can still crosslink an antigen.
  • An “Fv fragment” is an antibody fragment that contains a complete antigen recognition site and antigen binding site and consists of a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain in tight, non-covalent association. A single variable domain or half of the Fv containing only three CDRs specific for the antigen can recognize and bind to the antigen.
  • a “single chain Fv” or “sFv” antibody fragment that is a single chain antibody molecule comprises the VH and VL domains of an antibody, and these domains are present in a single polypeptide chain.
  • the Fv polypeptide can further contain a polypeptide linker between the VH and VL domains that allows the sFv to form the desired structure for antigen binding.
  • the term “diabody” refers to a small antibody fragment having two antigen-binding sites, which fragment is a heavy chain variable domain (VH) linked to a light chain variable domain (VL) by the same polypeptide chain (Vn-VL). )including. Using a short linker to allow pairing between two domains on the same chain, the domain can be paired with the complementary domain of another chain, resulting in two antigen binding sites. it can.
  • the oligonucleotide primer, oligonucleotide probe, and antibody used as the reagent according to the present invention may be provided as a nucleic acid array or an antibody array by binding on an appropriate support.
  • the support is not particularly limited as long as it can fix nucleic acids and proteins, and may have any shape and material. Specifically, a support of an inorganic material such as glass, silicon wafer, bead, resin, or metal, a support of a natural polymer material such as nitrocellulose, or a synthetic polymer material such as nylon can be exemplified.
  • the following cell lines were used: A375 cells, A2058 cells, HT29 cells, colo-205 cells, SK-MEL-1 cells, colo-201 cells, LS-174T cells, HCT_116 cells, SW620 cells, DLD- 1 cell, A549 cell, OVCAR-5 cell, AN3-CA cell, DU145 cell, NCI-N87 cell, JIMT-1 cell, SW48, SW480, A431 cell, HeLa cell, EC109 cell, Ms-1 cell, LNCaP cell, And PC-3 cells.
  • the drugs are SMK-17 (manufactured by Daiichi Sankyo Co., Ltd.) and U0126 (manufactured by Sigma) which are MEK inhibitors, LY294002 (manufactured by Sigma) which is a PI3K inhibitor, PD184352 which is a MEK and MAPK inhibitor (No. Sorafenib (sorafenib, synthesized by Daiichi Sankyo Co., Ltd.), BRAF selective inhibitor SB590885 (synthesized by Daiichi Sankyo Co., Ltd.) Was used.
  • Cell lines were cultured in RPMI 1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) under high pressure steam sterilization, filter sterilized kanamycin (manufactured by Sigma) 0.1 g / L, penicillin F 100 units / mL, L (+) -Glutamine (manufactured by Wako) 0.3 g / L, high pressure steam sterilized NaHCO 3 2.5 g / L, fetal bovine serum (FBS) added at 10%, 37 ° C., CO 2 concentration 5% Performed under conditions. In order to prevent the transformation caused by the cells becoming dense due to the culture, the cells were passaged every 3 days.
  • RPMI 1640 medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • FBS fetal bovine serum
  • a Ca 2+ , Mg 2+ -free phosphate buffer solution PBS ⁇ : NaCl 8.0 g / L, KCl 0.2 g / L, Na 2 HPO 4 0.916 g / L, KH 2 PO 4
  • the cells were washed with 0.2 g / L) and trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution (trypsin 0.75 g / L, NaCl 8.0 g / L, KCl 0.4 g / L, Na 2 HPO 4 0.0475 g).
  • EDTA trypsin 0.75 g / L, NaCl 8.0 g / L, KCl 0.4 g / L, Na 2 HPO 4 0.0475 g.
  • KH 2 PO 4 0.06 g / L, glucose 1.0 g / L, phenol red 0.02 g / L, NaHCO 3 0.35 g / L, EDTA 0.2 g
  • the cell growth inhibitory activity test was performed in both two-dimensional culture and three-dimensional culture.
  • a three-dimensional culture plate was prepared. Specifically, poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (hereinafter abbreviated as poly-HEMA, manufactured by Sigma) was added to 95% ethanol to 5 mg / mL and dissolved overnight at 37 ° C. This was used as a poly-HEMA solution. This solution was put in a 96-well plate (manufactured by Nunc) at 50 ⁇ L / well, and the plate was dried at 37 ° C. to prepare a plate for three-dimensional culture coated with poly-HEMA.
  • poly-HEMA poly (2-hydroxyethyl methacrylate)
  • Two-dimensional culture (hereinafter sometimes referred to as 2D culture) is 1 ⁇ 10 3 cells / 150 ⁇ L / well in a 96-well plate, and three-dimensional culture (hereinafter sometimes referred to as 3D culture) is 2 ⁇ 10 3.
  • Cells were seeded at cells / 75 ⁇ L / well, and drug treatment was performed the next day. The total volume was 200 ⁇ L for two-dimensional culture and 100 ⁇ L for three-dimensional culture.
  • Cell proliferation was measured by measuring the amount of intracellular ATP at the time of drug treatment and 72 hours after drug treatment.
  • the growth rate (Growth (%)) of the untreated drug sample after 72 hours was obtained by the following formulas 1 and 2. Also, the drug concentration inhibiting 50% growth was GI 50.
  • “comp day 4” is the luminescence amount of the sample 72 hours after the drug treatment
  • “blank” is the luminescence amount of the culture medium only
  • “control day 4” is the untreated drug after 72 hours.
  • the amount of luminescence of the sample, “control day 1”, represents the amount of luminescence of the sample during the chemical treatment.
  • Protein detection was performed by Western blotting as follows. First, cells were seeded in a 6-well plate (manufactured by Greiner), and the drug-treated sample was washed with PBS ⁇ containing Na 3 VO 4 (1 mM) on ice, and then an appropriate amount of RIPA buffer (25 mM HEPES, 1.mM).
  • Triton X-100 1.0% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (hereinafter abbreviated as SDS), 0.5 M NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 0.1 mM Na 3 VO 4 Leupeptin 0.1 mg / mL, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (hereinafter abbreviated as PMSF): pH 7.8) was added. After solubilizing and collecting, it was left on ice for 30 minutes. Centrifugation treatment was performed at 13,000 g for 15 minutes, and the resulting supernatant was used as a cell extract.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
  • the culture solution was collected in a 15 mL tube, washed with PBS ⁇ containing Na 3 VO 4 (1 mM), centrifuged at 1,000 g for 5 minutes, and the supernatant Was removed. Thereto was added 1 mL of PBS ⁇ to be suspended, transferred to a 1.5 mL tube, centrifuged at 13,000 g for 1 minute, and the supernatant was removed. An appropriate amount of RIPA buffer was added to the adherent cells to solubilize, and after recovery, the cells were allowed to stand on ice for 30 minutes. Centrifugation treatment was performed at 13,000 g for 15 minutes, and the resulting supernatant was used as a cell extract.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • BSA bovine serum albumin
  • skim milk 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20: pH 7.6
  • Primary antibody was added to each solution at a ratio of 1: 1000 and shaken overnight at 4 ° C.
  • the cell cycle was measured by propidium iodide (PI) staining as follows. First, cells were seeded in a 6-well plate, and drug treatment was performed 24 hours later. After recovering the culture solution and the trypsin-treated cells, centrifugation was performed at 1,000 g for 5 minutes, and the supernatant was removed. The cells were suspended by adding 1 mL of PBS ⁇ , transferred to a 1.5 mL tube, centrifuged at 13,000 g for 1 minute, and the supernatant was removed. Thereto was added 200 ⁇ L of PBS ⁇ to suspend the cells, and 1 mL of ice-cold 70% ethanol was added and vortexed, and fixed at 4 ° C.
  • PI propidium iodide
  • the top flash reporter assay was performed as follows. Cells were seeded in a 6-well plate (2 mL / well) so as to be subconfluent the next day, and gene transfer was performed the next day. 500 ⁇ L of OPTI-MEM I (NaHCO 3 2.44 g / L, OPTI-MEM I (Gibco) 13.6 g / L) was added to TCF reporter plasmid (TOPFLASH, Millipore), TK promoter-renilla luciferase reporter plasmid ( Promega) and a plus reagent (Plus Reagent, Sigma) were added and mixed by inversion.
  • Lipofectamine LTX (made by Sigma) was added, and it left still for 30 minutes at room temperature. The whole amount was added to the culture and cultured. After 24 hours, cells were replated at 2 ⁇ 10 4 cells / 75 ⁇ L / well in a white 96-well plate. The next day, the drug treatment was carried out to make a total volume of 100 ⁇ L and cultured for 24 hours. Thereafter, the culture solution in each well was removed, replaced with PBS - 100 ⁇ L / well, and frozen at ⁇ 80 ° C. However, in Colo-201 cells, it was not directly replaced with PBS ⁇ but directly frozen at ⁇ 80 ° C.
  • Dual-Glo luciferase Reagent manufactured by Promega
  • firefly luciferase firefly luciferase intensity was measured with a Wallac 1420 multilabel counter.
  • Dual-Glo Stop & Glo Reagent manufactured by Promega was added at 50 ⁇ L / well and allowed to stand for 5 minutes, and then the luminescence intensity of Renilla luciferase was measured with a Wallac 1420 multilabel counter.
  • the transcriptional activity of TCF4 was determined from the following Equation 4.
  • ⁇ -catenin knockdown was performed using siRNA. Specifically, ⁇ -catenin was knocked down by reverse transfection using Stealth RNAi (manufactured by Invitrogen). The sequence of the siRNA used is shown below: 5'-AUUACUGAGACAGACAGAAUAGCACC-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • HiPerFect Qiagen
  • siRNA diluted by x300 and siRNA at a final concentration of 5 nM, mixed gently, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • Stealth RNAi Negative control manufactured by Invitrogen
  • the above mixed solution is added to each well of a 12-well plate (manufactured by Nunc) or a 60 mm petri dish (manufactured by Greiner), and a cell suspension (1.2 ⁇ 10 5 cells / 600 ⁇ L / well for a 12-well plate) is added thereto.
  • Dominant negative-TCF4 gene transfer and active ⁇ -catenin gene transfer were performed as follows. First, cells (2 mL / well) were seeded on a 6-well plate so as to be subconfluent on the next day, and gene transfer was performed on the next day. 500 ⁇ L of OPTI-MEM I, 2.5 ⁇ g of control vector (Invitrogen) or dominant negative-TCF4 plasmid (hereinafter abbreviated as DN-TCF4, Millipore) or active ⁇ -catenin plasmid and 2 Plus Reagent .5 ⁇ L was added and mixed by inversion.
  • the drug sensitivity to the MEK inhibitor SMK-17 was compared between cell lines. Specifically, 24 types of cell lines having protein mutations involved in various signal transduction pathways related to cell proliferation were used, and the MEK inhibitor SMK-17 (Daiichi Sankyo Co., Ltd.) was cultured in two and three dimensions. ) Growth inhibitory activity was evaluated. In addition, growth inhibitory activity was similarly evaluated using MEK inhibitor U0126 as a comparative material.
  • Evaluation of the growth inhibitory activity was carried out by measuring the amount of intracellular ATP by the amount of luciferase luminescence using CellTiter-Glo. Specifically, cells are seeded, and after 24 hours, SMK-17 and U0126 are added to the culture solution to a final concentration of 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10, 30 ⁇ M Processed. Intracellular ATP was measured 72 hours after drug treatment using CellTiter-Glo. The proliferation rate was calculated from the amount of luminescence obtained, and the drug concentration (GI 50 ) that inhibits 50% proliferation was calculated. From GI 50, the correlation between the results of the two-dimensional culture and the results of the three-dimensional culture was evaluated using the Pearson product moment correlation coefficient.
  • -log (GI 50 ) is calculated from the obtained GI 50 for both drugs in the two-dimensional culture and the three-dimensional culture, and the value is calculated.
  • the fingerprint pattern (Non-patent Document 50) with the average value (MG-MID) as the origin is displayed.
  • a cell with a positive -log (GI 50 ) value was a highly sensitive cell line, and a cell with a negative value was a low sensitive cell line.
  • K-ras active mutation is not a sensitivity-defining factor for SMK-17.
  • AN3-CA, LNCaP, and PC-3 which are PTEN-deficient cell lines, were all low sensitivity cell lines. Although no significant difference was obtained in the average value of GI 50 between the PTEN-deficient cell line group and the wild-type cell line group, the BRAF active mutation and the PTEN-deficient cell line A2058 were lower than the other BRAF active mutant cell lines. The sensitivity indicated that PTEN deficiency was a negative sensitivity-defining factor for SMK-17.
  • SW48 cells showing high sensitivity to SMK-17 are cell lines in which BRAF, K-ras and PTEN are wild-type and have an active mutation of ⁇ -catenin. Therefore, when attention is focused on mutations in the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway using ⁇ -catenin as a constituent factor, the ⁇ -catenin active mutant cell lines colo-205, colo-201, and SK-MEL-1 , LS-174T, HCT_116, and SW48 were all highly sensitive strains. APC mutations have also been reported in proteins related to the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway, but among APC mutant cell lines, colo-205, colo-201, SW480, and SW620 showed high sensitivity.
  • the result of testing the significant difference in the average value of GI 50 with respect to the wild type cell line group Significant differences of p ⁇ 0.001, p ⁇ 0.05, and p ⁇ 0.01 were obtained, respectively.
  • mutations in the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway are positive sensitivity determinants of SMK-17.
  • the ⁇ -catenin active mutation is a positive sensitivity determining factor of the MEK inhibitor SMK-17.
  • Example 1 The cell cycle arrest and apoptosis inducing activity were evaluated by SMK-17, a MEK inhibitor.
  • SMK-17 a MEK inhibitor.
  • Example 2 the presence of a cell line in which SMK-17 exhibits a high growth inhibitory activity was revealed.
  • the growth inhibitory activity is thought to be due to cell cycle arrest or cell death such as apoptosis. Therefore, the effect of SMK-17 on the cell cycle and apoptosis of highly sensitive cell lines was evaluated.
  • cell lines in which SMK-17 showed high growth inhibitory activity namely A375 (BRAF active mutation, HT29 (BRAF active mutation, APC mutation), HCT — 116 (K-ras active mutation, ⁇ -catenin active mutation), SW48 ( ⁇ -catenin active mutation), colo-201 ( ⁇ -catenin active mutation, APC mutation), LS-174T (K-ras activity) Type mutation, ⁇ -catenin active type mutation), SW620 (K-ras active type mutation, APC mutation), SW480 (K-ras active type mutation, APC mutation), K-ras active type mutation, APC mutation A total of 9 strains of DLD-1, which are low-sensitivity cell lines, were used.
  • A375 BRAF active mutation, HT29 (BRAF active mutation, APC mutation
  • HCT — 116 K-ras active mutation, ⁇ -catenin active mutation
  • SW48 ⁇ -catenin active mutation
  • colo-201 ⁇ -catenin active mutation,
  • SMK-17 was added to the culture solution to a final concentration of 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10 ⁇ M and treated with drugs. 48 hours after the drug treatment, the cells were collected, ethanol fixed and PI stained, and the DNA content was measured with a flow cytometer. In order to measure the MEK inhibitory activity of SMK-17 in drug-treated cells, the expression of ERK, phosphorylated ERK, and actin was evaluated by Western blotting for cells 24 hours after treatment with SMK-17.
  • the expression level of the phosphorylated target molecule relative to the expression level of the target molecule was calculated, and the influence on the cell cycle at a concentration at which the expression of phosphorylation of the target molecule was suppressed by 95% or more was evaluated.
  • an increase in the subG1 phase was observed by 20% or more, it was determined that apoptosis was induced.
  • SMK-17 treatment markedly increases the subG1 phase at concentrations that completely inhibit ERK phosphorylation in HCT_116 cells, SW48 cells, colo-201 cells, and LS-174T cells having ⁇ -catenin active mutations. DNA fragmentation was observed. Specifically, in HCT_116 cells, SW48 cells, colo-201 cells, and LS-174T cells, SMK-17 at concentrations of 10 ⁇ M, 10 ⁇ M, 1.0 ⁇ M, and 10 ⁇ M, respectively, resulted in complete inhibition of ERK phosphorylation and subG1 An increase in phase and induction of apoptosis indicated by DNA fragmentation was observed.
  • SMK-17 which is a MEK inhibitor, induces apoptosis selectively in a cell line having a ⁇ -catenin active mutation.
  • MEK is a factor downstream of the MAPK signaling pathway. Therefore, MAPK signaling pathway inhibitors other than SMK-17 were used to inhibit the MAPK signaling pathway, and their apoptosis-inducing activity was examined.
  • PD184352 a MEK inhibitor, multi-kinase inhibitor, especially sorafenib (Non-Patent Document 61) that inhibits Raf, and SB590885, a BRAF selective inhibitor, ⁇ -catenin wild type cell line A375 and HT29. , APC mutant cell line DLD-1, and ⁇ -catenin activated mutant cell lines HCT — 116 and SW48.
  • PD184352 was treated with 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10 ⁇ M
  • sorafenib and SB590885 were treated with 0.3, 1.0, 3.0, 10 ⁇ M.
  • the cells were collected, ethanol fixed and PI stained, and the DNA content was measured with a flow cytometer.
  • the expression of ERK, phosphorylated ERK, MEK, phosphorylated MEK, and actin was evaluated by Western blotting for the cells 24 hours after the drug treatment.
  • the expression level of the phosphorylated target molecule relative to the expression level of the target molecule was calculated, and the influence of each inhibitor on the cell cycle at a concentration at which the expression of phosphorylation of the target molecule was suppressed by 95% or more was evaluated. When an increase in the subG1 phase was observed by 20% or more, it was determined that apoptosis was induced.
  • PD184352 in contrast to the ⁇ -catenin wild type cell lines A375 and HT29, PD184352 induced significant G1 phase arrest at concentrations that completely inhibited ERK phosphorylation, ie, 0.30 ⁇ M and 3.0 ⁇ M, respectively. Apoptosis was not induced. PD184352 induces apoptosis in A375 at a concentration higher than the concentration at which ERK phosphorylation is completely inhibited. This is also an inhibitory effect on MEK families such as MEK5 in addition to MEK1 / 2 at high concentrations of PD184352. This is a result generated to show that it was caused by factors other than inhibition of the classical MAPK signaling pathway involving MEK1 / 2. PD184352 showed no particular effect on DLD-1, an APC mutant cell line, at a concentration of 10 ⁇ M, which completely inhibits ERK phosphorylation.
  • MAPK signaling pathway inhibitors particularly classical MAPK signaling pathway inhibitors, have ⁇ -catenin activated mutant cell selective apoptosis-inducing activity, similar to SMK-17.
  • Example 1-3 From the results of Example 1-3, it was shown that the ⁇ -catenin active mutation is a sensitivity regulating factor for inducing apoptosis by a MAPK signaling pathway inhibitor. Therefore, the involvement of the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway in apoptosis induction by SMK-17 was examined by a loss-of-function test.
  • the loss-of-function test is performed by evaluating the effect of SMK-17 on the apoptosis-inducing activity in cells inactivated Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway by knockdown of ⁇ -catenin or forced expression of DN-TCF4. Carried out. As control cells, cells in which ⁇ -catenin knockdown or DN-TCF4 was not forcibly expressed were used.
  • ⁇ -catenin knockdown by siRNA was attempted for ⁇ -catenin activated mutant cell line HCT — 116 in which apoptosis is induced by SMK-17 treatment. Knockdown was performed by the reverse transfection method, and the cells were collected 24, 48, 72, and 96 hours later, and the expression level of ⁇ -catenin was detected by Western blotting. As a result, suppression of ⁇ -catenin expression was confirmed 48 hours after knockdown (Panel A in FIG. 4). Next, the apoptosis-inducing activity of SMK-17 was evaluated by treating with 3.0 ⁇ M SMK-17 48 hours after knockdown and detecting the subG1 phase using a flow cytometer 48 hours later.
  • DN-TCF4 was forcibly expressed in ⁇ -catenin active mutant cell line HCT — 116, and the apoptosis-inducing activity by SMK-17 was evaluated.
  • DN-TCF4 lacks the 1st to 31st amino acids, which is the DNA binding site of TCF4. Therefore, even when ⁇ -catenin is bound, it cannot bind to DNA and transcription by wild-type TCF4 is not promoted. . That is, the forced expression of DN-TCF4 can inactivate the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway.
  • control cells cells that were not subjected to forced expression of DN-TCF4 were used.
  • DN-TCF4 gene was introduced into HCT_116 cells, and the transcriptional activity of TCF4 was evaluated by a top flash reporter assay.
  • the top flash firefly luciferase is inserted after the DNA binding sequence of TCF4, and when TCF4 is bound, firefly luciferase is expressed. Therefore, the transcriptional activity of TCF4 can be evaluated by the amount of luminescence of firefly luciferase.
  • Renilla luciferase reporter plasmid was introduced into cells, and the value of firefly luciferase luminescence was calculated with respect to the amount of luminescence of Renilla luciferase constantly expressed by TK-promoter. Carried out.
  • SMK-17 was treated with SMK-17 at a concentration of 10 ⁇ M, and after 48 hours, the apoptosis-inducing activity of SMK-17 was evaluated by detecting the subG1 phase using a flow cytometer. As a result, the induction of apoptosis by SMK-17 was significantly suppressed in DN-TCF4 forced expression cells as compared to control cells (panel B in FIG. 5).
  • Example 1-3 From the results of Example 1-3, it was shown that the ⁇ -catenin active mutation is a sensitivity regulating factor for inducing apoptosis by a MAPK signaling pathway inhibitor. Thus, the involvement of the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway in apoptosis induction by SMK-17 was examined by a gain-of-function test.
  • a gain-of-function test was performed using either the ⁇ -catenin wild-type cell line A375, in which apoptosis was not induced by treatment with SMK-17, or forced expression of active ⁇ -catenin or the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway. It was activated by stimulation with Fnt ligand wnt3a, and the effect of SMK-17 on the apoptosis-inducing activity was evaluated.
  • wnt3a stimulation was performed on A375 cells.
  • wnt3a binds to Fz present on the membrane surface and inhibits phosphorylation of GSK-3 via axin, thereby suppressing a complex that degrades ⁇ -catenin. This can activate the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway.
  • Ant cells transfected with TopFlash and Renilla luciferase reporter plasmid were treated with wnt3a (50 ng / mL), and TCF4 transcriptional activity was evaluated 24 hours later by TopFlash reporter assay. As a result, an increase in the transcriptional activity of TCF4 was confirmed by stimulation with wnt3a (panel A in FIG. 6).
  • active ⁇ -catenin was forcibly expressed in A375 cells, and the apoptosis-inducing activity by SMK-17 was evaluated.
  • the active ⁇ -catenin that is forcibly expressed has mutations in the ⁇ -catenin phosphorylation site, ie, substitution of 37th serine with alanine (S37A) and substitution of 45th serine with alanine (S45A). Therefore, it does not undergo phosphorylation by the complex, but translocates into the nucleus to enhance the signal and activate the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway.
  • the gene of active ⁇ -catenin was introduced into A375 cells, and the transcriptional activity of TCF4 was evaluated by a top flash reporter assay. As control cells, A375 cells into which no active ⁇ -catenin was introduced were used. As a result, an increase in the transcriptional activity of TCF4 was confirmed by forced expression of active ⁇ -catenin (Panel A in FIG. 7).
  • SMK-17 (10 ⁇ M) was treated, and the apoptosis-inducing activity after 48 hours was evaluated by detecting the subG1 phase using a flow cytometer.
  • the apoptosis-inducing activity of SMK-17 was significantly promoted in cells in which activated ⁇ -catenin was forced to be expressed as compared to control cells (panel B in FIG. 7).
  • Example 5 the MEK inhibitor SMK-17 ⁇ -catenin activated mutant cell selective It was suggested that Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway is involved in apoptosis induction.
  • SMK-17 The effect of SMK-17 in vivo was evaluated. Specifically, tumor cells were cultured in vitro, collected using trypsin EDTA and PBS ⁇ on the day of transplantation to mice, resuspended in PBS ⁇ to 1 ⁇ 10 8 cells / mL, and Balb 0.1 mL each was implanted subcutaneously into the axilla region of / c-nu / nu mice (CLEA Japan). Then, as soon as tumor engraftment in the mouse was confirmed, a test solution was suspended orally in a 0.5% MC aqueous solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and orally administered at the desired dose. The tumor volume was measured.
  • a 0.5% MC aqueous solution manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the level of apoptosis of tumor cells in the tumor tissue was measured by the TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick labeling) method. This measurement was performed using a commercially available TUNEL measurement kit (manufactured by CHEMICON) according to the recommended protocol attached to the kit.
  • TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin nick labeling
  • SMK-17 showed a tumor reduction effect in vivo. Specifically, in nude mice carrying a tumor cell line SW48 having a ⁇ -catenin active mutation, a decrease in tumor volume was observed by oral administration of 200 mg / kg SMK-17. Similarly, a decrease in tumor volume was observed in nude mice carrying the tumor cell line colo205 having a ⁇ -catenin active mutation when 200 mg / kg SMK-17 was administered.
  • SMK-17 exhibits an in vivo reduction effect on tumors having ⁇ -catenin active mutations, and that the tumor reduction effect is due to the effect of causing apoptosis of the tumor cells.
  • the present invention relates to a method for predicting responsiveness to a cancer disease treatment by a compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway, and a patient judged to be highly effective in administration of a drug containing the compound.
  • the present invention provides a method for screening, and enables effective treatment of cancer diseases by a compound that inhibits the MAPK signal transduction pathway.
  • the present invention is extremely useful in the field of cancer patient treatment.
  • SEQ ID NO: 1 gene encoding wild-type ⁇ -catenin (SEQ ID NO: 2).
  • SEQ ID NO: 3 siRNA used for knockdown of ⁇ -catenin gene.

Abstract

　分子標的治療薬に対する感受性を予測する方法、および薬剤投与による奏功性が高いと判断される患者を選別する方法、並びにこれら方法に使用する試薬を提供する。具体的には、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異を有するか否かを測定することを特徴とする、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ、以下ＭＡＰＫと略称する）シグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性を予測する方法、該化合物によるがん疾患治療の対象を選別する方法、および前記方法により選別された患者に該化合物を投与することを含むがん疾患の治療方法、並びにこれら方法に使用する試薬を提供する。

Description

ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対する応答性を予測する方法
　本発明は、がん疾患の治療において、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ、以下、ＭＡＰＫと略称する）シグナル伝達経路を阻害する化合物に対する応答性を予測する方法、該化合物に対して応答性を有する患者を選別する方法、および該化合物によりがん疾患を治療する方法に関する。より詳しくは、本発明は、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異を有するか否かを測定することを特徴とし、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者をＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対して応答性があると判定することを含む、がん疾患の治療において該化合物に対する応答性を予測する方法に関する。また、本発明は、かかる予測方法に使用する使用する試薬に関する。さらに本発明は、前記特徴を有し、前記変異を有するβ－カテニンが検出された患者を選別することを含む、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象を選別する方法に関する。さらに、本発明は、前記特徴を有し、前記変異を有するβ－カテニンが検出された患者にＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物の治療有効量を投与することを含む、がん疾患の治療方法に関する。
　ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、細胞増殖に関わる代表的なシグナル伝達経路である。ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫキナーゼ（以下、ＭＡＰＫＫと略称する）、ＭＡＰＫＫキナーゼ（以下、ＭＡＰＫＫＫと略称する）の３種のキナーゼ群より構成されるプロテインキナーゼカスケードであり、真核生物に高度に保存されている。ＭＡＰＫは、哺乳類では４種のＭＡＰＫファミリー分子、具体的には細胞外シグナル制御タンパク質キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）１および２（以下、ＥＲＫ１／２と称する）、ＥＲＫ５、Ｊｕｎ　Ｎ末端キナーゼ／ストレス活性化タンパク質キナーゼ（以下、ＪＮＫ／ＳＡＰＫと略称する）、ｐ３８　ＭＡＰＫに分類されていて、それぞれが独立したカスケードを形成していることが知られている。これらＭＡＰＫファミリー分子のうちＥＲＫ１／２およびＥＲＫ５はそれぞれ独立に、主に増殖因子などの刺激により活性化されるＭＡＰＫシグナル伝達経路に関与している。ＥＲＫ１／２が関与するＭＡＰＫシグナル伝達経路は古典的ＭＡＰＫシグナル伝達経路と呼ばれることがある。一方、ＪＮＫ／ＳＡＰＫおよびｐ３８　ＭＡＰＫはそれぞれ独立に、インターロイキン－１（ＩＬ－１）や腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）などの炎症性サイトカイン、あるいは紫外線照射や高浸透圧刺激などの物理化学的ストレスによって活性化される新規ＭＡＰＫシグナル伝達経路に関与している。
　古典的ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、Ｒａｆ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（以下、ＭＥＫと略称する）、およびＥＲＫの３種のキナーゼが、その下流タンパク質をリン酸化することによって細胞増殖や生存を促進する（非特許文献１）。Ｒａｆはセリン／スレオニンキナーゼ活性をもつＭＡＰＫＫＫであり、Ｂ－Ｒａｆ（以下、ＢＲＡＦと称することがある）、Ｒａｆ－１、Ａ－Ｒａｆなどのファミリーが存在する。ＲａｆはＲａｓにより活性化され、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を稼動する。ＭＥＫはチロシン残基だけでなく、セリン残基やスレオニン残基もリン酸化する機能をもつＭＡＰＫＫであり、Ｒａｆによりリン酸化されて活性化し、ＥＲＫ１／２を特異的にリン酸化する。ＥＲＫはセリン／スレオニンキナーゼ活性をもつＭＡＰＫであり、極めて相同性の高いＥＲＫ１とＥＲＫ２の存在が知られている。ＥＲＫ１／２は、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２（以下、ＭＥＫ１／２と称する）によりリン酸化される。
　古典的ＭＡＰＫシグナル伝達経路では、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、以下、ＥＧＦと略称する）などの増殖因子が細胞膜上のチロシンキナーゼ活性を有する受容体に結合すると、受容体型チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ、以下、ＲＴＫと略称することがある）は二量体化して活性化される（非特許文献２）。ＲＴＫが自己リン酸化されると、そこにアダプタータンパク質であるＧｒｂ２が結合する。Ｇｒｂ２にはグアニンヌクレオチド交換因子であるＳＯＳ（Ｓｏｎ　ｏｆ　Ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）が結合しており、Ｇタンパク質であるＲａｓ（Ｋ－ｒａｓ、Ｈ－ｒａｓ、およびＮ－ｒａｓが知られている）のグアノシン二リン酸／グアノシン三リン酸（以下、ＧＤＰ／ＧＴＰと略称する）交換反応を促進する（非特許文献３）。そしてＲａｓが活性化され、Ｒａｆセリン／スレオニンキナーゼが活性化する。ＲａｆはＭＥＫ１／２を直接リン酸化し、リン酸化されたＭＥＫ１／２はＥＲＫ１／２をリン酸化する。最終的にリン酸化したＥＲＫ１／２は核内移行し、Ｅｌｋ－１やサイクリンＤ１の転写を活性化し、細胞の増殖に至る。
　腫瘍細胞においては、ＭＡＰＫシグナル伝達経路に関わる因子の変異や過剰発現が多く報告されている。ＥＧＦ受容体（以下、ＥＧＦＲと略称する）やＨｅｒ２などの受容体型チロシンキナーゼの過剰発現や変異が報告されており、その結果、ＭＡＰＫシグナル伝達経路が異常亢進し、悪性化につながる（非特許文献４－６）。特にＥＧＦＲに関しては、ヒトの悪性腫瘍の５０％以上に過剰発現や変異が認められている。Ｒａｓの活性型変異はすべての悪性腫瘍の３０％に認められており、特に膵臓がんの９０％、大腸がんの５０％に認められている （非特許文献７－９）。同様に、ＢＲＡＦの活性型変異に関しては、悪性黒色腫の６３％、甲状腺がんの４５％、卵巣がんの３６％に認められている（非特許文献１０－１２）。ＢＲＡＦの活性型変異は、活性部分である第６００番目のアミノ酸残基がバリン残基からグルタミン酸残基に置換され（Ｖ６００Ｅ）、触媒作用をする部分の構造が変化して恒常的に活性化することにより引き起こされる。その結果、増殖因子などの刺激によらずに下流の因子を活性化するため、細胞が異常増殖し、悪性化する（非特許文献１３）。
　ＭＥＫはＲａｓやＲａｆの下流に位置すること、高い基質特異性をもつこと、基質であるＥＲＫが多くの腫瘍細胞種において活性化していることから、細胞増殖抑制を目的として、ＭＥＫをターゲットとした阻害剤の開発が行われてきた（非特許文献１４）。
　最初に開発されたＭＥＫ阻害剤はＰＤ０９８０５９（Ｐａｒｋｅ－Ｄａｖｉｓ社）である。この化合物はＭＥＫに対しておよそ１０μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値で阻害活性を示した。次に、Ｕ０１２６（旧ＤｕＰｏｎｔ　Ｐｈａｍａ社）が開発された。Ｕ０１２６は、およそ５－７ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値でＭＥＫ１／２を阻害した。ＰＤ０９８０５９とＵ０１２６はインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で増殖抑制活性を示したが、臨床試験には進まなかった（非特許文献１５－１６）。
　初めてインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で増殖抑制効果が報告され、臨床試験に進んだＭＥＫ阻害剤はＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０、Ｐａｒｋｅ－Ｄａｖｉｓ社）である。この化合物はＰＤ０９８０５９と比較して選択性および阻害活性が共に改善されており、１７ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値でＭＥＫ１をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）非競合的に阻害した。さらに、臨床前の段階において、大腸がん細胞と悪性黒色腫に対する細胞増殖阻害活性が確認された（非特許文献１７）。ＰＤ１８４３５２の類縁化合物としてＰＤ０３２５９０１（Ｐｆｉｚｅｒ社）とＡＺＤ６２４４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ａｒｒａｙ　ＢｉｏＰｈａｒｍａ社）が開発された。ＰＤ０３２５９０１はＡＴＰ非競合的にＭＥＫ１／２をおよそ１ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値で阻害し、さらにｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＰＤ１８４３５２よりも強い増殖抑制活性を示した（非特許文献１８）。臨床試験においては、抗腫瘍効果や、ＥＲＫのリン酸化の減少が第Ｉ相臨床試験および第ＩＩ相臨床試験において認められた（非特許文献１９－２０）。ＡＺＤ６２４４はＭＥＫに対しておよそ１２ｎｍｏｌ／ＬのＩＣ５０値でＡＴＰ非競合的に阻害する（非特許文献２１）。臨床試験において抗腫瘍効果が得られており、現在臨床試験中である。
　ＭＥＫ阻害剤ＳＭＫ－１７（第一三共株式会社）は、強いＭＥＫ阻害活性および優れた薬物動態を指向して開発されたものであり、ＭＥＫ１／２特異的な阻害活性および増殖抑制活性が確認されている（非特許文献２２、特許文献１）。
　生体の発生、細胞増殖や発がんに関わる他のシグナル伝達経路として、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路が知られている。Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路では、リガンドであるＷｎｔが作用していない状態では、がん抑制タンパク質ＡＰＣ（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ　ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ　ｃｏｌｉ）、足場タンパク質アキシン（Ａｘｉｎ）（非特許文献２３－２５）、グリコーゲン合成キナーゼ－３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ－３、以下、ＧＳＫ－３と略称する）、およびカゼインキナーゼ１（ＣＫ１と略称する）がβ－カテニン（以下、β－ｃａｔと略称することがある）と複合体を形成し、該複合体内でβ－カテニンはＧＳＫ－３（非特許文献２３および非特許文献２６）やＣＫ１（非特許文献２７－２９）によりリン酸化される。リン酸化されたβ－カテニンはユビキチン－プロテアソーム経路を介して分解されるため（非特許文献３０－３２）、β－カテニンは低い発現レベルに抑えられている。しかし、膜貫通型受容体であるフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、以下、Ｆｚと略称する）とその共役受容体であるＬＲＰとの複合体（Ｆｚ／ＬＲＰ複合体）にＷｎｔが結合すると、ディシェブルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）がリン酸化され、アキシンを介してＧＳＫ－３のリン酸化活性が阻害される（非特許文献３３－３４）。これにより、β－カテニンのリン酸化が阻害され、その結果β－カテニンは分解されずに細胞質内に蓄積する（非特許文献３５）。その後、β－カテニンは核内に移行し、転写因子であるＴ細胞因子（以下、ＴＣＦと略称する）と複合体を形成し（非特許文献３６－３７）、最終的に細胞増殖、生存、およびアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に関わるｃ－ｍｙｃや細胞増殖を促進するサイクリンＤ１などの標的遺伝子の転写活性化を引き起こす。
　腫瘍細胞においては、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の構成因子であるＡＰＣやβ－カテニンの変異が報告されている。これらの変異は大腸がんの９０％において認められている（非特許文献３８－３９）。ＡＰＣの変異は、多くの場合アキシンやβ－カテニンとの結合部位が欠損した変異である（非特許文献４０）。その結果、β－カテニンをリン酸化する複合体が形成されず、β－カテニンはリン酸化されずに核内に移行し、恒常的にＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路が活性化される。β－カテニンの変異の中で活性型変異は、多くの場合ＧＳＫ－３によるリン酸化部位のアミノ酸残基、例えばその第３３番目のセリン残基（Ｓ３３）、第３７番目のセリン残基（Ｓ３７）、第４１番目のスレオニン残基（Ｔ４１）や、ＣＫ１によるリン酸化部位のアミノ酸残基、例えばその第４５番目のセリン残基（Ｓ４５）が、ＧＳＫ－３やＣＫ１によるリン酸化を受けないアミノ酸残基に置換された変異である。その結果、活性型変異を有するβ－カテニンは上記複合体よるリン酸化を受けずに核内に移行し、恒常的にＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化するため、細胞のがん化が生じる（非特許文献３９）。
国際公開第２００４／０８３１６７号パンフレット。 国際公開第２０００／０３７１４１号パンフレット。 国際公開第２００２／００６２１３号パンフレット。 国際公開第２００３／０７７９１４号パンフレット。 国際公開第２００７／０１４０１１号パンフレット。 国際公開第２００７／０４４５１５号パンフレット。 国際公開第２００６／０１１４６６号パンフレット。 国際公開第２００７／０９１７３６号パンフレット。 国際公開第２００５／１２１１４２号パンフレット。 国際公開第２００６／０４５５１４号パンフレット。 国際公開第２０１０／０５９５０３号パンフレット。 国際公開第２００７／０９６２５９号パンフレット。
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　近年、がん疾患の治療領域において分子標的治療薬の開発が主流となっており、その効果を確実に得られる患者を選別して薬剤を投与するという考えが定着しつつある。そのため、分子標的薬の開発時には、患者選別や副作用低減を目的とした薬剤効果の評価方法を開発することが求められている。
　例えば、ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫを活性化するＢＲＡＦの活性型変異を有する悪性腫瘍に対し抗腫瘍効果を示すと考えることができるため、当該活性型変異であるＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異を検出することにより、悪性腫瘍のＭＥＫ阻害剤に対する感受性を予測できるとする報告がある（非特許文献４１）。しかしながら、ＢＲＡＦ活性型変異を有する悪性黒色腫の患者の臨床試験における臨床応答は、ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１およびＡＺＤ６２４４それぞれに対して、部分奏功と完全奏功を合わせて１０％および１１％程度であり、高い効果は得られていない（非特許文献４２－４３）。
　本発明の課題は、分子標的治療薬によるがん疾患の有効な治療を可能にするために、分子標的治療薬に対する感受性を予測する方法、および薬剤による奏功性が高いと判断される患者を選別する方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、ＭＥＫ阻害剤であるＳＭＫ－１７（非特許文献２２、特許文献１）およびＰＤ１８４３５２（非特許文献４４）、並びにＢＲＡＦ選択的阻害剤であるＳＢ５９０８８５（非特許文献４５－４６）がいずれも、β－カテニン活性型変異を有する細胞に選択的にアポトーシスを誘導することを見出した。また、β－カテニン遺伝子のノックダウンまたはＤＮ－ＴＣＦ４の強制発現によりＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の機能を喪失させた細胞では、ＳＭＫ－１７によるアポトーシス誘導が観察されないこと、並びに活性型β－カテニンの強制発現またはｗｎｔ３ａ刺激によりＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の機能を活性化させた細胞では、ＳＭＫ－１７によりアポトーシスが誘導されたことを見出した。さらに、ＳＭＫ－１７がｉｎ　ｖｉｖｏでβ－カテニン活性型変異を有する腫瘍の縮小に効果を示すことを見出した。このように、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害による腫瘍細胞のアポトーシス誘導および腫瘍縮小効果と、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の活性化との関連を明らかにしたことにより、本発明を達成した。
　すなわち、本発明は以下に関する：
　１．がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異を有するか否かを測定し、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者を、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象として選別することを含む、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象を選別する方法、
　２．がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異を有するか否かを測定し、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者を、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性があると判定することを含む、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性を予測する方法、
　３．ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性が、該化合物によるがん疾患治療におけるアポトーシス誘導によるがんの縮小である、前記２．の方法、
　４．がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異を有するか否かを測定し、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者を、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象として選別し、該選別された患者に、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物の治療有効量を投与することを含む、がん疾患の治療方法、
　５．活性型変異が下記から選ばれる少なくともいずれか１の変異である前記１．から４．のいずれかの方法：
（１）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
（２）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の欠失変異、
　６．活性型変異が下記から選ばれる少なくともいずれか１の変異である前記１．から４．のいずれかの方法：
（３）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
（４）β－カテニンのアミノ酸配列の第４５番目のセリン残基の欠失変異、
　７．生物学的試料が、がん細胞またはがん組織を含む生物学的試料である、前記１．から６．のいずれかの方法、
　８．ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物が、ＭＡＰＫＫＫを阻害する化合物、ＭＡＰＫＫを阻害する化合物、およびＭＡＰＫを阻害する化合物からなる群より選択される少なくとも１の化合物である、前記１．から７．のいずれかの方法、
　９．ＭＡＰＫＫＫを阻害する化合物、ＭＡＰＫＫを阻害する化合物、およびＭＡＰＫを阻害する化合物からなる群より選択される少なくとも１の化合物が、Ｂ－Ｒａｆを阻害する化合物並びにＭＥＫ１／２を阻害する化合物からなる群より選択される少なくとも１の化合物である、前記８．の方法、
　１０．前記１から９のいずれかに記載の方法において、βカテニンの前記変異の有無を検出するための試薬であって、下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の分子を有効成分とする試薬：
（ａ）前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位を含む連続した部分塩基配列からなる核酸に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｂ）前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位の５´側領域の塩基配列の相補配列の一部に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、および記変異を有するβ－カテニン遺伝子の該変異部位の３´側領域の塩基配列の一部に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーからなるオリゴヌクレオチドプライマーセット、
（ｃ）前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位を含む連続した部分塩基配列からなる核酸に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ、または
（ｄ）前記変異を有するβ－カテニンに特異的に結合する抗体、
　１１．有効成分である分子が、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーセット、または前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記変異が下記から選ばれるいずれか１の変異である、前記１０．の試薬：
（Ａ）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
（Ｂ）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の欠失変異、または、
（Ｃ）β－カテニンのアミノ酸配列の第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異、
　１２．有効成分である分子が前記（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーセット、または前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列における第９８番目、第１０９番目、第１１０番目、第１２１番目、第１３３番目、第１３４番目、または第８６０番目の変異である、前記１０．の試薬、
　１３．有効成分である分子が前記（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーセット、または前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位およびその変異が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列における第９８番目のシトシンのアデニンへの変異、第１０９番目のチミンのシトシンへの変異、第１１０番目のシトシンのチミンへの変異、第１２１番目のアデニンのグアニンへの変異、第１３３番目のチミンのシトシンへの変異、第１３４番目のシトシンのチミンへの変異、または第８６０番目のアデニンのグアニンへの変異である、前記１０．の試薬、
　１４．有効成分である分子が前記（ｄ）の抗体であって、前記変異が下記から選ばれるいずれか１の変異である、前記１０．の試薬：
（Ａ）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
（Ｂ）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の欠失変異、または、
（Ｃ）β－カテニンのアミノ酸配列の第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異。
　本発明により、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異を有するか否かを測定することを特徴とする、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性を予測する方法、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象を選別する方法、および前記方法により選別された患者に該化合物を投与することを含むがん疾患の治療方法を提供することができる。
　本発明に係る方法は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物を含む薬剤のがん患者における効果の評価を、該薬剤を投与する前に実施することができる。また、本発明に係る方法により、該薬剤の奏功性が高いと判断される患者を選別することができ、該薬剤による有効な治療を実施できる。さらに本発明に係る方法は、がん患者由来の生物学的試料を用いてインビトロで実施できるため、患者への負担が少ない。このように、本発明に係る方法は、がん疾患の治療領域において有用である。
ＭＥＫ阻害剤であるＳＭＫ－１７およびＵ０１２６の腫瘍細胞増殖抑制活性を検討した結果を説明する図である。β－カテニン活性型変異細胞株であるＳＷ４８、ｃｏｌｏ－２０５、ｃｏｌｏ－２０１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、およびＨＣＴ＿１１６がいずれもＳＭＫ－１７およびＵ０１２６に対して高感受性を示した。これら細胞はＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２には低感受性であった。パネルＡおよびパネルＢはそれぞれ二次元培養（２Ｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ）および三次元培養（３Ｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ）による検討の結果を示す。（実施例１） ＳＭＫ－１７処理により、β－カテニン活性型変異（図中、β－ｃａｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎと表示する）を有する細胞株でアポトーシス誘導（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）が観察されたことを説明する図である。具体的には、β－カテニン活性型変異を有する細胞株であるＨＣＴ＿１１６、ＳＷ４８、ｃｏｌｏ－２０１、ＬＳ－１７４Ｔにおいて、ＳＭＫ－１７処理により、ＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する濃度で、アポトーシスの誘導を示すｓｕｂＧ１期細胞の増加およびＤＮＡの断片化が観察された。一方、野生型β－カテニン（β－ｃａｔ　ｗｔ）を有する細胞株であるＡ３７５およびＨＴ２９では、Ｇ１期停止細胞の著しい増加が観察されたが、ｓｕｂＧ１期細胞の著しい増加は観察されず、このことから増殖阻害（ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）のみが誘導されたことが示された。上段パネルは、用いた細胞株（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）において変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）が認められたタンパク質、および該細胞株のＴＣＦ４転写活性を説明する。中段パネルはＳＭＫ－１７のＥＲＫリン酸化阻害活性を示す。下段パネルはフローサイトメーター（ＦＣＭ）によるｓｕｂＧ１期細胞の検出結果を示す。（実施例２） ＭＥＫ阻害剤ＳＭＫ－１７およびＰＤ１８４３５２、並びにＢＲＡＦ選択的阻害剤であるＳＢ５９０８８５がいずれも、β－カテニン活性型変異を有する細胞株であるＨＣＴ＿１１６および／またはＳＷ４８において、ＥＲＫリン酸化を完全に阻害する濃度でアポトーシス誘導活性を示したことを説明する図である。一方、野生型β－カテニンを有する細胞株であるＡ３７５に対しては、これら阻害剤はＥＲＫリン酸化を完全に阻害する濃度でアポトーシス誘導活性を誘導しなかった。（実施例３） β－カテニンｓｉＲＮＡでβ－カテニンをノックダウンした細胞において、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性が有意に抑制されたことを説明する図である。パネルＡは、ノックダウンを行った４８時間後にβ－カテニンの発現抑制が確認されたことを示す。パネルＡ中で、β－カテニンｓｉＲＮＡをｃａｔ、コントロールｓｉＲＮＡをｃｔｌと表示する。アクチン（ａｃｔｉｎ）は内部標準として用いた。パネルＢは、β－カテニンをノックダウンした細胞で、コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞に比べ、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性が有意に抑制されたことを示す。パネルＢ中で、β－カテニンｓｉＲＮＡをｓｉ－β－ｃａｔｅｎｉｎ、コントロールｓｉＲＮＡをｓｉ－ｃｏｎｔｒｏｌと表示する。（実施例４） Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を、ドミナントネガティブＴＣＦ４（ＤＮ－ＴＣＦ４）の強制発現により抑制することで、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性が抑制されたことを説明する図である。パネルＡは、ＤＮ－ＴＣＦ４の強制発現によりＴＣＦ４転写活性（ＴＣＦ４　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）が、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して抑制されたことを示す。パネルＢの左図は、コントロール細胞では、ＳＭＫ－１７処理によりｓｕｂＧ１期の細胞数が増加したが、ＤＮ－ＴＣＦ４を強制発現させた細胞では、ＳＭＫ－１７処理によりコントロール細胞で観察されたｓｕｂＧ１期細胞の増加が抑制されたことを示す。パネルＢの右図は、ＤＮ－ＴＣＦ４の強制発現させた細胞をＳＭＫ－１７で処理すると、コントロール細胞と比較して、ｓｕｂＧ１期細胞の相対数が有意に減少したことを示す。（実施例４） Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を、Ｗｎｔリガンドであるｗｎｔ３ａで刺激することにより、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性が観察されたことを説明する図である。パネルＡは、野生型β－カテニンを有する細胞株Ａ３７５においてｗｎｔ３ａ刺激によりＴＣＦ４の転写活性が増加したことを示す。パネルＢは、ＳＭＫ－１７処理により、ｗｎｔ３ａ刺激条件でポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（以下、ＰＡＲＰと略称する）の切断が誘導されたことを示す。パネルＣは、ｗｎｔ３ａ刺激条件下でＳＭＫ－１７処理によるＡ３７５のｓｕｂＧ１期の細胞数が有意に増加したが、ｗｎｔ３ａ無刺激条件下ではｓｕｂＧ１期の細胞数の増加は観察されなかったことを示す。（実施例５） 野生型β－カテニンを有する細胞株Ａ３７５に活性型β－カテニンを強制発現させると、ＳＭＫ－１７によるアポトーシス誘導が観察されたことを説明する図である。図中、活性型β－カテニンをＡＢＣ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｂｅｔａ－Ｃａｔｅｎｉｎ）と表示する。パネルＡは、活性型β－カテニンを強制発現させた細胞においてＴＣＦ４の転写活性が増加したことを示す。パネルＢは、活性型β－カテニンを強制発現させた細胞において、コントロール細胞に比べ、ｓｕｂＧ１期の細胞数が有意に増加したことを示す。（実施例５） ＳＭＫ－１７がｉｎ　ｖｉｖｏで腫瘍縮小効果を示したことを説明する図である。β－カテニン活性型変異を有する腫瘍細胞株ＳＷ４８およびｃｏｌｏ２０５を担持したヌードマウスのいずれにおいても、ＳＭＫ－１７投与により腫瘍体積（図中、ＴＶと表示）の減少が観察された。一方、野生型β－カテニンを有する細胞株であるＡ３７５およびＨＴ２９を担持したヌードマウスのいずれにおいても、ＳＭＫ－１７投与により腫瘍増大抑制効果が観察されたが、腫瘍縮小効果は観察されなかった。（実施例６） ＳＭＫ－１７の投与により、β－カテニン活性型変異を有する腫瘍細胞株ＳＷ４８を担持したヌードマウスの腫瘍組織内にアポトーシス陽性細胞数が増加したことを示す図である。野生型β－カテニンを有する細胞株であるＡ３７５およびＨＴ２９を担持したヌードマウスのいずれにおいても、ＳＭＫ－１７の投与による腫瘍組織内のアポトーシス陽性細胞数の変化は観察されなかった。図中、野生型β－カテニンはβ－ｃａｔ　ｗｔ、β－カテニン活性型変異はβ－ｃａｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎと表示する。アポトーシス陽性細胞はＴＵＮＥＬアッセイで検出し、１視野あたりのＴＵＮＥＬ陽性細胞数（ＴＵＮＥＬ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ／ｆｉｅｌｄ）として表示する。（実施例６）
　本発明は、がん患者由来の生物学的試料に含まれるβ－カテニンの変異を、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対する感受性因子として検出することを特徴とする、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性を予測する方法に関する。また、本発明は、上記特徴を有する、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対して応答性を有する患者の選別方法に関する。さらに本発明は、前記方法により選別された患者にＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物を投与することを含むがん疾患の治療方法に関する。
　本明細書において「ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性」とは、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物への感受性または反応性をいい、より具体的には該化合物によるがん疾患治療におけるアポトーシス誘導およびそれによるがんの縮小を意味する。
　本明細書において「アポトーシス」とは、プログラムされた細胞死の総称をいう（非特許文献４７）。アポトーシスは、多細胞生物の体を構成する細胞が、個体をより良い状態に保つために積極的に引き起こす管理・調節された細胞死である。アポトーシスの特徴としては、細胞膜構造の変化の後に、核が凝縮し、その後ＤＮＡの断片化が生じ、細胞が小型の「アポトーシス小体」と称される構造に分解されることが知られている。アポトーシス小体のＤＮＡ含量は、正常な細胞や増殖細胞と比較して少ない。そのため、細胞のＤＮＡ含量を測定してアポトーシス小体を検出することにより、アポトーシスの検出が可能である。アポトーシス小体は、細胞周期の測定においてｓｕｂＧ１期として検出される。細胞周期の測定は、例えば、フローサイトメータを利用して周知の方法による実施できる。
　「がん」は、通常、狭義の悪性腫瘍を意味し、悪性腫瘍の中で上皮細胞から発生するものを指す。一方、非上皮性の悪性腫瘍を肉腫と呼ぶ。「悪性腫瘍」とは、組織や細胞が生体内の制御に反して自律的に過剰に増殖することによって形成される組織塊腫瘍の中で、特に浸潤性を有し、増殖・転移するなど悪性を示すものをいう。がんは病理組織学的な分類では、腺がん、扁平上皮がん、移行上皮がんの３種類に分類できる。腺がんは、線組織に由来するがんであり、大腸癌、乳癌、胃癌、肺癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、十二指腸癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮体部癌などを例示できる。扁平上皮がんは、上皮の基底細胞が悪性化し、異型性、多形成を増し、上皮下結合組織中で増殖して形成された腫瘍であり、口腔癌、舌癌、咽頭、食道癌、気管支癌、喉頭癌などを例示できる。移行上皮がんは、移行上皮組織に由来するがんであり、膀胱癌、腎盂癌、尿肝癌、口腔癌を例示できる。一方、肉腫には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、悪性リンパ腫などがある。
　悪性腫瘍の中で肉腫の頻度は低く、そのため「がん」という語は「悪性腫瘍」と同義として用いられることが多い。本明細書において「がん」と「悪性腫瘍」とは同義語として、置換可能に用いる。
　本発明に係るＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性を予測する方法は、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが変異を有するか否かを測定し、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者を、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性があると判定することを含む。
　本発明に係るＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対して応答性を有する患者の選別方法は、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが変異を有するか否かを測定し、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者を、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象として選別することを含む。
　本発明に係るＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患の治療方法は、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが変異を有するか否かを測定し、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者を、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象として選別し、該選別された患者に、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物の治療有効量を投与することを含む。
　ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対する感受性因子として検出するβ－カテニン変異は、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）β－カテニンのアミノ酸配列の第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異である。がん患者由来の生物学的試料中に、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）β－カテニンのアミノ酸配列の第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異が検出された場合、該がん患者はＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対して応答性があると判定する、または該がん患者をＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象として選別する。あるいは、がん患者由来の生物学的試料中に、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）β－カテニンのアミノ酸配列の第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異が検出された場合、該がん患者にＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物の治療有効量を投与する。
　本明細書において「β－カテニンの活性型変異」とは、β－カテニンの機能が細胞内で恒常的に作動状態となる変異、すなわち恒常的にＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路が活性化された状態になる変異をいう。β－カテニンの活性型変異として、セリン／スレオニンプロテインキナーゼであるＧＳＫ－３やＣＫ１によるリン酸化部位のアミノ酸残基の変異を例示できる。このような活性型変異を有するβ－カテニンはリン酸化されずに核内に移行し、恒常的にＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化するため、細胞のがん化が生じる（非特許文献３９）。ＧＳＫ－３やＣＫ１によるリン酸化部として、β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目、第３７番目、第４１番目、および第４５番目のセリン残基またはスレオニン残基を例示できる。ＧＳＫ－３によるリン酸化部位のアミノ酸残基の変異として、例えば、β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基（Ｓ３３）、第３７番目のセリン残基（Ｓ３７）、第４１番目のスレオニン残基（Ｔ４１）の、ＧＳＫ－３によるリン酸化を受けないアミノ酸残基への置換変異、すなわちセリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異を挙げることができる。ＣＫ１によるリン酸化部位のアミノ酸残基の変異として、例えば、β－カテニンのアミノ酸配列の第４５番目のセリン残基（Ｓ４５）の、ＣＫ１によるリン酸化を受けないアミノ酸残基への置換変異、すなわちセリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異を挙げることができる。また、β－カテニンの活性型変異として、ＧＳＫ－３またはＣＫ１によるリン酸化部位のアミノ酸残基の欠失や該部位へのアミノ酸の挿入を挙げることができる。
　β－カテニンの活性型変異は、多種のがん疾患で報告されている。例えば、大腸癌、散発性子宮体癌、類腱腫（ｄｅｓｍｏｉｄ　ｔｕｍｏｒ）、肝細胞癌、肝芽細胞腫、腎芽腫（ウイルムス腫瘍）、散発性髄芽腫、卵巣類内膜癌（ｏｖａｒｉａｎ　ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｄ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前立腺がん、および甲状腺癌で、β－カテニンのＳ３３、Ｓ３７、Ｔ４１、およびＳ４５のいずれか１種またはそれらの２種以上の置換変異が認められている（非特許文献４８）。
　β－カテニンの活性型変異はまた、多くの悪性腫瘍株で報告されている。例えば、β－カテニンのＴ４１はアラニンへの置換が報告されており、Ｓ３３はシステイン、フェニルアラニン、およびチロシンへの置換、Ｓ３７およびＳ４５はフェニルアラニンやプロリンへの置換が報告されている（非特許文献４９）。
　野生型β－カテニン遺伝子のコード領域の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。また、野生型β－カテニンのアミノ酸配列を配列番号２に示す。本明細書においてβ－カテニン遺伝子の塩基配列中のある塩基の位置をいうときは、配列番号１に記載の塩基配列中の位置として表示する。本明細書においてβ－カテニンのアミノ酸配列中のあるアミノ酸残基の位置をいうときは、配列番号２に記載のアミノ酸配列中の位置として表示する。
　本明細書において、アミノ酸配列の変異を表すときに一文字表記を使用し、アミノ酸配列の第ｙ番目のアミノ酸残基Ｘのアミノ酸残基Ｚへのアミノ酸置換を、ＸｙＺと表示することがある。例えば、第３３番目のセリン残基のチロシン残基へのアミノ酸置換を、Ｓ３３Ｙと表示する。また、第ｙ番目のアミノ酸残基Ｘの欠失をＸｙｄｅｌと表示する。例えば、第４５番目のセリン残基の欠失をＳ４５ｄｅｌと表示する。
　また本明細書において、塩基配列の変異を表すときに、塩基配列中の開始コドンの最初の塩基を第１番目として、第ｎ番目の塩基Ｎの塩基Ｍへの置換変異をｎＮ＞Ｍと表示することがある。例えば、第９８番目のシトシンのアデニンへの置換変異は９８Ｃ＞Ａと表示する。
　悪性腫瘍株で検出されたβ－カテニンの活性型変異およびＮ２８７Ｓ変異の例を表１に示す。
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　β－カテニンの活性型変異は、大腸癌細胞株のＳＷ４８細胞、ＨＣＴ＿１１６細胞、およびＬＳ－１７４Ｔ細胞でそれぞれＳ３３Ｙ、Ｓ４５ｄｅｌ、およびＳ４５Ｆの変異が報告されている。また、皮膚癌細胞株のＳＫ－ＭＥＬ－１細胞でＳ３３Ｃの変異が報告されている。これら細胞株は、後述する実施例において、野生型β－カテニンを有する細胞と比較して、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物であるＭＥＫ阻害剤やＢＲＡＦ阻害剤による処理に高い応答性を示し、アポトーシスが誘導された。
　β－カテニンの活性型変異は、その他、肺癌細胞株のＳＷ１５７３細胞およびＡ４２７細胞でそれぞれＳ３３ＦおよびＴ４１Ａ、十二指腸癌細胞株のＨＵＴＵ－８０細胞でＳ３７Ｆ、ｈＣＧ産生卵巣腺癌細胞株のＲＴＳＧ細胞でＳ３７Ｐ、副腎皮質癌細胞株のＮＣＩ－Ｈ２９５細胞でＳ４５Ｐの変異が報告されている（非特許文献５０－５１）。
　一方、第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換（Ｎ２８７Ｓ）変異は、β－カテニンの活性型変異であることは報告されていない。しかし、後述する実施例に示したとおり、この置換変異を有する大腸癌細胞株であるｃｏｌｏ２０１細胞およびｃｏｌｏ２０５細胞（非特許文献５１）で、β－カテニンの活性型変異を有する細胞と同様に、ＭＥＫ阻害剤処理によりアポトーシスが誘導された。このことから、Ｎ２８７Ｓ変異も、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対する感受性因子として利用することができる。
　本発明に係る方法で、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対する感受性因子として利用できるβ－カテニン変異は、好ましくは下記から選ばれる１以上の変異である：
（１）第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
（２）第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の欠失変異、
（３）第２８７番目のアスパラギン残基のセリン残基への置換。
　本発明に係る方法で、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物に対する感受性因子として利用できるβ－カテニン変異は、より好ましくは下記から選ばれる１以上の変異である：
（４）第３３番目のセリン残基または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
（５）第４５番目のセリン残基の欠失変異、
（６）第２８７番目のアスパラギン残基のセリン残基への置換。
　β－カテニンの変異の検出は、β－カテニン遺伝子の変異を検出することにより実施できる。β－カテニン遺伝子の変異の検出は、好ましくはβ－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目、第３７番目、第４１番目、第４５番目、および第２８７番目のいずれか１種または２種以上のアミノ酸残基をコードするコドンについて、ミスセンス変異の有無を検出することにより実施する。「ミスセンス変異」は単一塩基対の置換であって、該当箇所で正常なアミノ酸とは異なるアミノ酸が配置されるように遺伝暗号を変化させるものを意味する。被検試料中のβ－カテニン遺伝子の塩基配列を、野生型β－カテニン遺伝子の塩基配列（配列番号１）と比較し、ヌクレオチドの相違が検出されれば、被検試料中のβ－カテニン遺伝子は変異を有すると決定できる。
　β－カテニン遺伝子の変異は、より好ましくは、β－カテニン遺伝子の第９８番目のシトシン、第１０９番目のチミン、第１１０番目のシトシン、第１２１番目のアデニン、第１３３番目のチミン、第１３４番目のシトシン、第８６０番目のアデニンの変異、さらに好ましくは、表１に記載の遺伝子変異を挙げることができる。
　β－カテニン遺伝子の変異の検出は、自体公知の方法を使用して実施できる。例えば、遺伝子の全長または検出目的の変異部位を含む断片の核酸を増幅し、増幅した核酸の塩基配列を周知技術により決定する。核酸の増幅は、自体公知の核酸増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲと略称する）により行うことができる。得られた増幅産物の塩基配列を、例えばダイレクトシークエンシング法などのＤＮＡシークエンシング法により決定する。このような変異の検出方法は、文献（非特許文献５０－５１等）に記載の方法を参考にして実施可能である。配列決定法として、シークエンシング法以外に、ハイブリダイゼーション法および制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法などが利用できる。被検試料から増幅されたβ－カテニン遺伝子が野生型のものと一致しなければ、被検試料のβ－カテニン遺伝子は変異を有すると決定できる。また、公知の１塩基変異解析方法を利用することもできる。例えば、ＰＣＲを行うときに、プライマーとして、変異部位を含む連続した部分塩基配列の相補的塩基配列からなるプライマーを使用し、増幅産物の有無を検出することで、β－カテニン遺伝子の変異の検出を実施できる。このようなプライマーを使用して被検試料中のβ－カテニン遺伝子が増幅されれば、被検試料中のβ－カテニン遺伝子は目的の変異を有すると決定でき、被検試料中のβ－カテニン遺伝子が増幅されなければ、被検試料中のβ－カテニン遺伝子は該プライマーで検出し得る変異を有さないと決定できる。ハイブリダイゼーション法では、検出目的の遺伝子の核酸を増幅し、ハイブリダイゼーションプローブを該核酸と接触させて、ハイブリダイゼーションプローブと該核酸とのハイブリダイゼーションの有無を検出する。「ハイブリダイゼーションプローブ」とは、２種類の核酸を検出可能に区別することができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションプローブとして、検出目的の変異を含む領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸断片を使用する。ハイブリダイゼーションの検出は周知技術により実施することができる。被検試料中のβ－カテニン遺伝子の核酸に、プローブがハイブリダイゼーションすれば、被検試料中のβ－カテニン遺伝子は変異を有すると決定できる。
　β－カテニンの変異はまた、そのアミノ酸の変異を検出することにより実施できる。β－カテニンのアミノ酸の変異は、β－カテニン変異体に特異的に結合する抗体を使用して免疫学的手法により検出できる。β－カテニン変異体に特異的に結合する抗体とは、検出目的のβ－カテニン変異体以外のβ－カテニン変異体、野生型β－カテニン、およびβ－カテニン以外のタンパク質と比較してより選択的に、検出目的のβ－カテニン変異体二結合する抗体を意味する。免疫学的手法として、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法）、ウエスタンブロッティング、免疫組織染色、フローサイトメトリー解析などを例示できる。所望の抗体は、β－カテニン変異体、好ましくはβ－カテニン変異体の部分アミノ酸配列であって変異が存在する位置のアミノ酸残基を含む一部の領域のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。あるいは、市販されている所望の抗体を使用することもできる。
　β－カテニンの変異、特に活性型変異の検出は、また、該活性型変異よってＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路が活性化することから、該シグナル伝達経路の活性化により引き起こされる反応、例えばＴＣＦ転写活性の亢進やβ－カテニンの核内蓄積を検出することにより実施できる。ＴＣＦ転写活性の検出方法は、自体公知であり、例えば、後述する実施例で用いたトップフラッシュ　レポーターアッセイ（ＴＯＰＦＬＡＳＨ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ａｓｓａｙ）により実施できる。β－カテニンの核内蓄積の検出方法は、核内タンパク質の検出に係る周知技術、例えば、免疫染色で評価する方法により実施できる。被検試料中のＴＣＦ転写活性の増加やβ－カテニンの核内蓄積が観察されれば、被検試料中のβ－カテニンは活性型変異を有すると決定できる。
　本明細書において「生物学的試料」は、個体から単離された組織、液体、細胞、およびそれらの混合物をいい、例えば腫瘍生検、髄液、胸腔内液、腹腔内液、リンパ液、皮膚切片、血液、尿、糞便、痰、呼吸器、腸管、尿生殖器管、唾液、乳、消化器官、およびこれらから採取された細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。「生物学的試料」は、がん細胞を含む試料であることが好ましく、より好ましくは切除や生検により得られた組織や細胞、あるいは胸腔内液や腹腔内液に由来する細胞を例示できる。さらに好ましい生物学的試料は、がん細胞またはがん組織を含む試料である。
　本明細書において「ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物」とは、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の機能を低下させる化合物をいう。ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物には、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を構成するタンパク質などの構成要素の機能を低下させる化合物、およびＭＡＰＫシグナル伝達経路の機能、例えば細胞の生存および増殖の促進機能を低下させる化合物を含む。ここで、作用する対象の機能を低下させる化合物を「阻害剤」と称することがある。
　ＭＡＰＫシグナル伝達経路は、増殖因子などの刺激により活性化されるもの、および炎症性サイトカインや物理化学的ストレスによって活性化されるものに分類される。本明細書において「ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物」は、好ましくは増殖因子などの刺激により活性化される「古典的ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物」である。
　ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物は、該シグナル伝達経路中のＭＥＫより上流の経路を阻害する化合物であることが好ましく、ＭＡＰＫＫＫを阻害する化合物、ＭＡＰＫＫを阻害する化合物、およびＭＡＰＫを阻害する化合物からなる群より選択される少なくとも１の化合物であり得る。ＭＡＰＫＫＫを阻害する化合物は、好ましくはＲａｆを阻害する化合物であり、さらに好ましくはＢＲＡＦを阻害する化合物である。ＭＡＰＫＫを阻害する化合物は、好ましくはＭＥＫを阻害する化合物であり、さらに好ましくはＭＥＫ１／２を阻害する化合物である。ＭＡＰＫを阻害する化合物は、好ましくはＥＲＫを阻害する化合物であり、さらに好ましくはＥＲＫ１／２を阻害する化合物である。すなわち、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物は、より好ましくは、ＢＲＡＦを阻害する化合物およびＭＥＫ１／２を阻害する化合物からなる群より選択される少なくとも１の化合物であり、さらにより好ましくはＭＥＫ１／２を阻害する化合物である。
　ＭＥＫを阻害する化合物としては、国際公開第２０００／０３７１４１号パンフレット（特許文献２）に記載の化合物（ＰＤ－１８４３５２等）、国際公開第２００２／００６２１３号パンフレット（特許文献３）に記載の化合物（ＰＤ－０３２５９０１等）、国際公開第２００３／０７７９１４号パンフレット（特許文献４）に記載の化合物（セルメチニブ（ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）等）、国際公開第２００７／０１４０１１号パンフレット（特許文献５）に記載の化合物（レファメチニブ（ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ）等）、国際公開第２００７／０４４５１５号パンフレット（特許文献６）に記載の化合物（ＧＤＣ－０９７３：ＸＬ－５１８等）、国際公開第２００６／０１１４６６号パンフレット（特許文献７）に記載の化合物（ＲＯ－４９８７６５５等）、国際公開第２００７／０９１７３６号パンフレット（特許文献８）に記載の化合物（ＲＯ－５１２６７６６等）、国際公開第２００５／１２１１４２号パンフレット（特許文献９）に記載の化合物（ＧＳＫ－１１２０２１２：トラメチニブ（ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）等）、国際公開第２００６／０４５５１４号パンフレット（特許文献１０）に記載の化合物（ＡＳ－７０３０２６等）、国際公開第２０１０／０５９５０３号パンフレット（特許文献１１）に記載の化合物（ＴＡＫ－７３３等）、国際公開第２００７／０９６２５９号パンフレット（特許文献１２）に記載の化合物（ＲＯ－５０６８７６０等）、Expert Opin Ther Patents, 2008. 18(6): p. 603-27.（非特許文献５２）に記載の化合物、Expert Opin Ther Patents, 2011. 21(7): p. 1045-69.（非特許文献５３）に記載の化合物、さらには、下記構造式１で表される化合物、下記構造式２で表される化合物、および下記構造式３で表される化合物を例示できる。下記構造式１で表される化合物はＭＥＫ１／２選択的阻害剤であり、ＳＭＫ－１７（第一三共株式会社）と称する。下記構造式２で表される化合物は、Ｕ０１２６（Ｓｉｇｍａ社）と称する。下記構造式３で表される化合物は、ＭＥＫに加えてＭＡＰＫにも阻害活性を示し、ＰＤ１８４３５２と称される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
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　ＢＲＡＦを阻害する化合物として下記構造式４で表される化合物を例示できる。該化合物は、ＢＲＡＦ選択的阻害剤であり、ＳＢ５９０８８５と称する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本発明に係る方法を適用できるがん疾患は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路が活性化された腫瘍細胞が検出されるがん疾患であればよく、特に活性化β－カテニンを有する腫瘍細胞が検出されるがん疾患が好ましい。このようながん疾患として、β－カテニン活性型変異を有する腫瘍細胞が検出されるがん疾患や、Ｎ２８７Ｓ置換変異を有する腫瘍細胞が検出されるがん疾患を例示できる。β－カテニン活性型変異やＮ２８７Ｓ置換変異は、多様ながん組織や悪性腫瘍細胞株で検出されている。本発明に係る方法を適用できるがん疾患として、具体的には、大腸癌、肝臓癌、皮膚癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、十二指腸癌、卵巣癌、子宮体癌、子宮頚癌、胆嚢癌、膵臓癌、乳癌、胃癌、口腔癌、舌癌、咽頭、食道癌、気管支癌、喉頭癌、膀胱癌、腎盂癌、および尿管癌などを例示できる。好ましくは、大腸癌、肝臓癌、皮膚癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、十二指腸癌、卵巣癌、および子宮体癌である。
　本発明に係る方法で、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん治療に応答性があるとして選別されたがん患者は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物の治療有効量の投与により、腫瘍にアポトーシスが誘導され、腫瘍の縮小が生じると考えることができる。
　ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物は、それ自体またはそれを含む組成物としてがん患者に投与される。当該組成物は、有効成分のほか、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、希釈剤、賦形剤などの医薬用担体を１種または２種以上含有する医薬組成物として製造される。医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１～７０重量％、好ましくは０．０００１～５重量％程度の範囲とするのが適当である。
　用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断などに応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ～１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ～１ｍｇ程度の範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を使用してこれらの用量を変更できる。上記投与量は１日１回～数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
　投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内などへの投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。また、腫瘍内への直接投与も可能である。
　投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリンなどの包接体、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
　本発明はまた、本発明に係る上記予測方法に使用する試薬および試薬キットに関する。本発明に係る試薬は、（ｉ）β－カテニンの活性型変異および（ｉｉ）β－カテニンのアミノ酸配列の第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択されるいずれか１の変異を検出する試薬である。本発明に係る試薬キットは、このような試薬のうちいずれか１または２以上の試薬を個別に包装された形態で含む試薬キットである。
　本発明に係る試薬は、好ましくは下記から選ばれる１以上のβ－カテニン変異を検出する試薬である：
（１）第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
（２）第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の欠失変異、
（３）第２８７番目のアスパラギン残基のセリン残基への置換。
　本発明に係る試薬は、より好ましくは下記から選ばれる１以上のβ－カテニン変異を検出する試薬である：
（４）第３３番目のセリン残基または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
（５）第４５番目のセリン残基の欠失変異、
（６）第２８７番目のアスパラギン残基のセリン残基への置換。
　本発明に係る試薬は、より具体的には、β－カテニン遺伝子の上記変異を検出する方法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブを例示できる。また、本発明に係る試薬は、β－カテニンの上記アミノ酸変異を検出する方法で使用される抗体を例示できる。
　オリゴヌクレオチドプライマーは、β－カテニン遺伝子またはその変異体の全部若しくは変異部位のヌクレオチドを含む一部の領域の塩基配列を特異的に増幅し得るように設計された特異的なオリゴヌクレオチドプライマーであればいかなるものであってもよい。特異的なオリゴヌクレオチドプライマーとは、適当なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下において、目的とする標的、すなわちβ－カテニン遺伝子またはその変異体の塩基配列若しくはその相補配列の部分領域の核酸とハイブリダイズすることができ、目的としない核酸には実質的にハイブリダイズしないプローブである。適当なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件は、例えば成書に記載の方法（非特許文献５４）などに従うことができる。このようなプライマーは、変異を有するβ－カテニン遺伝子の塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って化学合成により取得できる。プライマーの設計は自体公知の方法や、良く知られている設計用ソフトウエアを使用して実施できる。
　オリゴヌクレオチドプライマーとして、例えば、変異を有するβ－カテニン遺伝子の変異部位の５´側領域の塩基配列の相補配列の一部にハイブリダイズする１０～６０個、好ましくは１５～３０個、より好ましくは１８～２５個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。プライマーのサイズが小さいほど、それがハイブリダイズする標的塩基配列への特異性が高くなるが結合親和性は低くなり、逆にそのサイズが大きいほど結合親和性は高くなるが特異性は低くなるため、上記のサイズのものが適当である。このようなオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、変異を有するβ－カテニン遺伝子の変異部位の３´側領域の塩基配列の一部にハイブリダイズする上記サイズの連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて、オリゴヌクレオチドプライマーセットとして使用される。このようなプライマーセットを使用してＰＣＲを行うことにより、変異を有するβ－カテニン遺伝子の変異部位のヌクレオチドを含む領域の核酸を増幅される。増幅産物の塩基配列を、上記のようなＤＮＡシークエンシング法により決定することにより、被検試料中のβ－カテニン遺伝子が変異を有するか否かを検出することができる。
　オリゴヌクレオチドプライマーとしてまた、変異を有するβ－カテニン遺伝子の変異部位を含む連続した部分塩基配列からなる核酸、または野生型β－カテニン遺伝子の部分塩基配列であって、目的とする変異の存する位置のヌクレオチドを含む部分塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、１０～６０個、好ましくは１５～３０個、より好ましくは１８～２５個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドを例示できる。このようなオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドは、変異を有するβ－カテニン遺伝子の一部の領域の塩基配列と同一のものに限定されず、β－カテニン遺伝に存在する目的の変異を、適当なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で検出するものである限りにおいて、高い配列相同性を有するオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチドであることができる。高い配列相同性を有するオリゴヌクレオチドとは、配列相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であるか、あるいは１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～２個、さらに好ましくは１個のヌクレオチドが相違するものをいう。このようなプライマーを使用して、核酸の増幅を行い、増幅産物の有無を検出することで、β－カテニン遺伝子の変異の検出を実施できる。変異を有するβ－カテニン遺伝子の配列情報に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーにより増幅産物が認められれば被検試料中のβ－カテニン遺伝子は目的の変異を有すると決定でき、増幅産物が認められないか、対照と比較して少ないときは、被検試料中のβ－カテニン遺伝子は該プライマーで検出し得る変異を有さないと決定できる。野生型β－カテニン遺伝子の配列情報に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーにより増幅産物が認められれば被検試料中のβ－カテニン遺伝子は目的の変異を有さないと決定でき、増幅産物が認められないか、対照と比較して少ないときは、被検試料中のβ－カテニン遺伝子は変異を有すると決定できる。
　オリゴヌクレオチドプローブは、β－カテニン遺伝子の上記変異のうちいずれか１の変異に特異的なオリゴヌクレオチドプローブである。特異的なオリゴヌクレオチドプローブとは、適当なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下において、目的とする標的、すなわちβ－カテニン遺伝子変異体の塩基配列の部分領域であって、上記変異のうちいずれか１の変異が存する部位のヌクレオチドを含む領域とハイブリダイズすることができ、目的としない核酸には実質的にハイブリダイズしないプローブである。このようなオリゴヌクレオチドプローブの、標的遺伝子へのハイブリダイゼーションを検出することにより、β－カテニン遺伝子変異体を検出することができる。適当なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件は、例えば成書に記載の方法（非特許文献５４）などに従うことができる。
　オリゴヌクレオチドプローブは、変異を有するβ－カテニン遺伝子の全部、好ましくは変異部位のヌクレオチドを含む一部の領域の塩基配列に特異的にハイブリダイゼーションするように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、変異を有するβ－カテニン遺伝子の変異が存する位置のヌクレオチドを含む領域の塩基配列にハイブリダイズする、１５個以上、好ましくは１５～５００個、より好ましくは１８～２００個、さらに好ましくは１８～５０個の連続したヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドである。プローブのサイズが小さいほど、それがハイブリダイズする標的塩基配列への特異性が高くなるが結合親和性は低くなり、逆にそのサイズが大きいほど結合親和性は高くなるが特異性は低くなるため、上記のサイズのものが適当である。このようなオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドは、変異を有するβ－カテニン遺伝子または野生型－カテニン遺伝子の塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って化学合成により取得できる。このようなオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドは、β－カテニン遺伝子の一部の領域の塩基配列と同一のものに限定されず、β－カテニン遺伝子に存在する目的の変異を、適当なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で検出するものである限りにおいて、高い配列相同性を有するオリゴヌクレオチド、またはその相補的オリゴヌクレオチドであることができる。高い配列相同性を有するオリゴヌクレオチドとは、配列相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であるか、あるいは１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～２個、さらに好ましくは１個のヌクレオチドが相違するものをいう。変異を有するβ－カテニン遺伝子の塩基配列情報に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションが認められれば被検試料中のβ－カテニン遺伝子は目的の変異を有すると決定でき、ハイブリダイゼーションが認められなければ被検試料中のβ－カテニン遺伝子は目的の変異を有さないと決定できる。野生型β－カテニン遺伝子の塩基配列情報に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションが認められれば被検試料中のβ－カテニン遺伝子は目的の変異を有さないと決定でき、ハイブリダイゼーションが認められなければ被検試料中のβ－カテニン遺伝子は目的の変異を有すると決定できる。
　オリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーは、β－カテニン遺伝子の変異の特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列、すなわち検出対象のβ－カテニン遺伝子と相補的でない塩基配列を構成するヌクレオチドを含んでいてもよい。
　また、オリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなどで標識されていてもよい。標識化したオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、標的遺伝子へのそれらのハイブリダイゼーションの検出が容易になる。好ましい放射性同位元素として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなどを例示できる。好ましい酵素として、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などを例示できる。好ましい蛍光物質として、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどを例示できる。好ましい発光物質として、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどを例示できる。あるいは、ＦＡＭ商標やＶＩＣ登録商標などのレポーター蛍光色素の近傍に該蛍光色素の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光色素とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
　抗体は、β－カテニン変異体に特異的に結合する抗体であればいかなるものであってもよく、またそのアイソタイプもいずれのものであってもよいが好ましくはＩｇＧ抗体である。このような抗体は、所望のβ－カテニン変異体、具体的には上記いずれかのアミノ酸変異を有するβ－カテニン変異体を抗原として用いて作製することができる。抗原は、β－カテニン変異体の全長タンパク質でもよく、その部分ペプチドであってアミノ酸変異が存する部位を含む領域のペプチドであってもよい。抗原は、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。このような全長タンパク質および部分ペプチドは、該タンパク質またはペプチドをコードする核酸を一般的遺伝子工学的手法（非特許文献５４－５６など）で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物として作製できる。または、該細胞や生体生物由来の試料から調製したものであることができ、これらからさらに精製されたものであってもよい。
　抗体の製造は、自体公知の抗体作製法を利用して実施できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、液性免疫応答および／または細胞性免疫応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体はそれ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめる担体であれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等が例示できる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせを例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
　抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。モノクロ－ナル抗体は、公知方法、例えばハイブリドーマ法を用いて作製することができる（非特許文献５７）。目的の抗体を産生するハイブリドーマの選別は、例えば公知方法によりスクリーニングすることにより実施できる（非特許文献５８、５９）。すなわち、ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体と目的のβ－カテニン変異体との結合試験を行い、目的のβ－カテニン変異体と特異的に結合する抗体を選択することにより、所望の抗体を得ることができる。
　抗体は、無傷抗体（ｉｎｔａｃｔ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）または抗体断片のいずれであってもよい。「無傷抗体」とは、天然の抗体と同様の四量体の構造単位からなる抗体を意味する。「抗体断片」とは、無傷抗体の一部、例えば無傷抗体の抗原結合領域または可変領域等を含む断片を意味する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ１断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。「Ｆａｂ断片」は単一の抗原結合部位を有する抗原結合断片であり、抗体をパパイン分解することにより、１つの抗体から各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一のＦａｂ断片を作製することができる。「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、抗体をペプシン処理することにより作製することができる抗体断片であり、依然として抗原を架橋することが可能である。「Ｆｖ断片」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する抗体断片であり、密接に非共有結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体から成る。単一の可変ドメイン、または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含有するＦｖの半分は、抗原を認識し、結合することができる。一本鎖抗体分子である「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、かつこれらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在することを特徴とするものである。ＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含有することができる。「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、この断片は同じポリペプチド鎖（Ｖｎ－ＶＬ）で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短かいリンカーを用いることで、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を生じさせることができる。
　本発明に係る試薬として使用されるオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、および抗体は、適切な支持体の上に結合させて核酸アレイや抗体アレイとして提供されたものであってもよい。支持体としては、核酸やタンパク質を固定できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であっても良い。具体的には、ガラス、シリコンウエハウ、ビーズ、樹脂、金属などの無機素材の支持体、またニトロセルロースなどの天然高分子材料やナイロンなどの合成高分子材料の支持体を例示できる。
　以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
　まず、実施例で用いた材料および方法を説明する。
　実施例では次の細胞株を用いた：Ａ３７５細胞、Ａ２０５８細胞、ＨＴ２９細胞、ｃｏｌｏ－２０５細胞、ＳＫ－ＭＥＬ－１細胞、ｃｏｌｏ－２０１細胞、ＬＳ－１７４Ｔ細胞、ＨＣＴ＿１１６細胞、ＳＷ６２０細胞、ＤＬＤ－１細胞、Ａ５４９細胞、ＯＶＣＡＲ－５細胞、ＡＮ３－ＣＡ細胞、ＤＵ１４５細胞、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞、ＪＩＭＴ－１細胞、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、Ａ４３１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＥＣ１０９細胞、Ｍｓ－１細胞、ＬＮＣａＰ細胞、およびＰＣ－３細胞。
　薬剤は、ＭＥＫ阻害剤であるＳＭＫ－１７（第一三共株式会社製）およびＵ０１２６（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２（Ｓｉｇｍａ社製）、ＭＥＫおよびＭＡＰＫ阻害剤であるＰＤ１８４３５２（第一三共株式会社にて合成）、マルチキナーゼ阻害剤であるソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、第一三共株式会社にて合成）、ＢＲＡＦ選択的阻害剤であるＳＢ５９０８８５（第一三共株式会社にて合成）を用いた。
　細胞株の培養は、ＲＰＭＩ　１６４０培地（日水製薬株式会社製）を高圧蒸気滅菌したものに、フィルター滅菌したカナマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）　０．１ｇ／Ｌ、ペニシリン　Ｆ　１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、Ｌ（＋）－グルタミン（Ｗａｋｏ社製）　０．３ｇ／Ｌ、高圧蒸気滅菌したＮａＨＣＯ３　２．５ｇ／Ｌ、牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％加えた培養液を用い、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で行った。培養により、細胞が過密になることで起こる形質転換を防ぐため、３日おきに継代を行った。培養液を除去した後、Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋不含リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ－：ＮａＣｌ　８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ　０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４　０．９１６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　０．２ｇ／Ｌ）で細胞を洗浄し、トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液　（トリプシン　０．７５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ　８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ　０．４ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４　０．０４７５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４　０．０６ｇ／Ｌ、グルコース　１．０ｇ／Ｌ、フェノールレッド　０．０２ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３　０．３５ｇ／Ｌ、ＥＤＴＡ　０．２ｇ／Ｌ）処理で細胞を剥がし、継代を行った。
　細胞増殖抑制活性試験は、二次元培養および三次元培養の両方で行った。まず、三次元培養用プレートを作製した。具体的には、ポリ（２－ヒドロキシエチル　メタクリレート）（以下、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡと略称する、Ｓｉｇｍａ社製）を５ｍｇ／ｍＬになるように９５％エタノールに加え、３７℃で一晩溶解させた。これをｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ溶液とした。この溶液を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μＬ／ｗｅｌｌで入れ、３７℃でプレートを乾燥し、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡでコートした三次元培養用のプレートを作製した。
　二次元培養（以下、２Ｄ　ｃｕｌｔｕｒｅと称することがある）は、９６ウェルプレートに１×１０３細胞／１５０μＬ／ｗｅｌｌで、三次元培養（以下、３Ｄ　ｃｕｌｔｕｒｅと称することがある）は２×１０３細胞／７５μＬ／ｗｅｌｌで細胞を播種し、翌日に薬剤処理を行った。二次元培養は全量を２００μＬ、三次元培養は１００μＬとした。薬剤処理時および薬剤処理７２時間後に細胞内ＡＴＰ量の測定を行うことにより細胞増殖を測定した。具体的には、二次元培養においては培養液を１００μＬ／ｗｅｌｌ除去した後ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ、三次元培養においてはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを５０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。添加した後、プレートを２分間シェーカーで振盪し、１０分間室温に静置した。各ウェルの全量をそれぞれ白色の９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に移し、ワラック　１４２０　マルチラベル　カウンター（Ｗａｌｌａｃ　１４２０　ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ　ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）で発光強度を測定した。得られた発光量から、７２時間後における薬剤未処理のサンプルに対する増殖率（Ｇｒｏｗｔｈ（％））を、下記数式１および数式２により求めた。また、５０％増殖を阻害する薬剤濃度をＧＩ５０とした。なお、式１および式２中、「ｃｏｍｐ　ｄａｙ４」は薬剤処理して７２時間後のサンプルの発光量、「ｂｌａｎｋ」は培養液のみの発光量、「ｃｏｎｔｒｏｌ　ｄａｙ４」は７２時間後における薬剤未処理のサンプルの発光量、「ｃｏｎｔｒｏｌ　ｄａｙ１」は薬剤処理時のサンプルの発光量を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　２Ｄ　ｃｕｌｔｕｒｅでの結果と３Ｄ　ｃｕｌｔｕｒｅでの結果の間の相関を、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の積率相関係数で評価した。
　得られた積率相関係数から有意性検定を行った。帰無仮説Ｈ０を「母相関係数＝０」すなわち「相関関係がない。」と仮定し、これが棄却されない場合は、相関関係はないといえる。逆に棄却された場合、相関関係があるといえる。標本数をｎ、標本相関係数をｒとすると、検定統計量ｔ０は下記数式３で表される。これは自由度がｎ－２のｔ分布に従いｔ０＞ｔ（ｎ－２，α）ならば帰無仮説を棄却する。ここで、αは危険度を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　タンパク質の検出はウエスタンブロッティングにより次のように行った。まず、６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に細胞を播種し、薬剤処理したサンプルを氷上でＮａ３ＶＯ４（１ｍＭ）を含むＰＢＳ－で洗浄した後、適当量のＲＩＰＡバッファー（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、１．０％　デオキシコール酸ナトリウム、０．１％　ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略称する）、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ＮａＦ、０．１ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４、ロイペプチン　０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍＭ　フッ化フェニルメチルスルホニル（以下、ＰＭＳＦと略称する）：ｐＨ７．８）を加えた。可溶化し回収した後、氷上に３０分間静置した。１３，０００ｇで１５分間の遠心分離処理を行い、得られた上清を細胞抽出液とした。
　浮遊細胞およびアポトーシス関連タンパク質の検出においては、培養液を１５ｍＬチューブに回収しＮａ３ＶＯ４（１ｍＭ）を含むＰＢＳ－で洗浄した後、１，０００ｇで５分間の遠心分離処理を行い、上清を除去した。そこに、１ｍＬのＰＢＳ－を加えて懸濁し、１．５ｍＬチューブに移した後、１３，０００ｇで１分間の遠心分離処理を行い、上清を除去した。接着細胞に適当量のＲＩＰＡバッファーを加えて可溶化し、回収した後氷上に３０分間静置した。１３，０００ｇで１５分間の遠心分離処理を行い、得られた上清を細胞抽出液とした。
　タンパク質濃度を揃えた後、細胞抽出液に半分量の３×ＳＤＳサンプルバッファー（１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、３０％　グリセロール、３％　ＳＤＳ、ブロモフェノールブルー　１．５ｍｇ／１００ｍＬ、１００ｍＭ　２－メルカプトエタノール：ｐＨ６．８）を加え、１００℃で５分間煮沸した。これをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）用サンプルとした。
　ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｐ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡと略称する）もしくはスキムミルクを含むＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ溶液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１３７ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０：ｐＨ７．６）にて３０分間ブロッキングした。一次抗体をそれぞれの溶液に１：１０００の割合で添加し、４℃で一晩振盪した。ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、抗ウサギ　ホースラディシュパーオキシダーゼ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）または抗マウス　ホースラディシュパーオキシダーゼ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を含む二次抗体溶液（１：５０００、３％　スキムミルク）に浸し、室温で１時間振盪した。ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄後、電気化学発光（ＥＣＬ）発色液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）により発色し、ＬＡＳ１０００（Ｆｕｊｉ　ｆｉｌｍ社製）で検出した。ここで電気泳動には泳動バッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ：２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％　ＳＤＳ）を用いた。転写には転写用バッファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｂｕｆｆｅｒ：２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ　グリシン、２０％　メタノール）を用いた。
　細胞周期の測定はヨウ化プロピディウム（ＰＩ）染色により次のように行った。まず、６ウェルプレートに細胞を播種し２４時間後、薬剤処理を行った。培養液とトリプシン処理した細胞を回収した後、１，０００ｇで５分間の遠心分離処理を行い、上清を除去した。１ｍＬのＰＢＳ－を加えて細胞を懸濁し、１．５ｍＬチューブに移した後、１３，０００ｇで１分間の遠心分離処理を行い、上清を除去した。そこに２００μＬのＰＢＳ－を加えて細胞を懸濁し、氷冷した７０％　エタノールを１ｍＬ加えてボルテックスし、４℃で固定化した。
　固定化した細胞を１，０００ｇで５分間の遠心分離処理を行い、上清を除去した。そこに、ＲＮａｓｅを１０μｇ／ｍＬ含むＰＢＳ－溶液を１ｍＬ加えて懸濁した後、３７℃で２０分間静置した。そして５分間の遠心分離処理を行った後、上清を除去しＰＩ（５０μｇ／ｍＬ、Ｗａｋｏ社製）を含むＰＢＳ－溶液を５００μＬ添加し懸濁した。これを全量ナイロンメッシュ（Φ＝４２μｍ）に通しサンプルとした。細胞内のＤＮＡ含有量をフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）のＰＭＴ４で検出し、細胞周期を測定した。
　トップフラッシュ　レポーターアッセイは次のように行った。６ウェルプレート（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）に翌日サブコンフルエントになるように細胞を播種し、翌日遺伝子導入を行った。５００μＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ　Ｉ（ＮａＨＣＯ３　２．４４ｇ／Ｌ、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ　Ｉ（Ｇｉｂｃｏ社製）　１３．６ｇ／Ｌ）にＴＣＦレポータープラスミド（ＴＯＰＦＬＡＳＨ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ＴＫプロモーター－レニラ　ルシフェラーゼ　レポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、プラス試薬（Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、転倒混和した。室温で５分間静置した後、リポフェクトアミンＬＴＸ（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、室温で３０分間静置した。全量を培養液に添加し培養した。２４時間後、白色の９６ウェルプレートに２×１０４細胞／７５μＬ／ｗｅｌｌで細胞を再播種した。翌日薬剤処理を行い、全量を１００μＬとし、２４時間培養した。その後、各ウェルの培養液を除去し、ＰＢＳ－　１００μＬ／ｗｅｌｌで置換し、－８０℃で凍結した。ただし、ｃｏｌｏ－２０１細胞においてはＰＢＳ－で置換せず、直接－８０℃で凍結した。
　アッセイ時に細胞を融解し、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、５分静置した後、Ｗａｌｌａｃ　１４２０　ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ　ｃｏｕｎｔｅｒでホタル　ルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の発光強度を測定した。次にＤｕａｌ－Ｇｌｏ　Ｓｔｏｐ　＆　Ｇｌｏ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、５分静置した後、Ｗａｌｌａｃ　１４２０　ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ　ｃｏｕｎｔｅｒでレニラ　ルシフェラーゼ（ｒｅｎｉｌｌａ　ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の発光強度を測定した。得られたデータから、ＴＣＦ４の転写活性（ＴＣＦ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を下記数式４より求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　β－カテニンのノックダウンをｓｉＲＮＡを用いて行った。具体的には、Ｓｔｅａｌｔｈ　ＲＮＡｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、リバーストランスフェクション法によりβ－カテニンのノックダウンを行った。用いたｓｉＲＮＡの配列を以下に示す：５’－ＡＵＵＡＣＵＡＧＡＧＣＡＧＡＣＡＧＡＵＡＧＣＡＣＣ－３’（配列番号３）
　１００μＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ　Ｉに、×３００希釈したＨｉＰｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）および最終濃度５ｎＭのｓｉＲＮＡを加え、穏やかに混和し、室温で１０分間静置した。またコントロールとしてＳｔｅａｌｔｈ　ＲＮＡｉ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。１２ウエルプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルまたは６０ｍｍ　シャーレ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に上記混合溶液を添加し、そこに細胞懸濁液（１２ウエルプレートについては１．２×１０５細胞／６００μＬ／ｗｅｌｌ、そして６０ｍｍ　シャーレについては１．３×１０５細胞／２．４ｍＬ／ｄｉｓｈ）を播種した。翌日、新しい培養液に置換し、ウエスタンブロッティングによりトランスフェクション効率を測定し、またフローサイトメーターにより細胞周期を測定することによりアポトーシス誘導活性の評価を行った。
　ドミナントネガティブ－ＴＣＦ４の遺伝子導入および活性型β－カテニンの遺伝子導入は次のように行った。まず、６ウェルプレートに翌日サブコンフルエントになるように細胞（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）を播種し、翌日遺伝子導入を行った。５００μＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ　Ｉにコントロールベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）またはドミナントネガティブ－ＴＣＦ４プラスミド（以下、ＤＮ－ＴＣＦ４と略称する、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）または活性型β－カテニンプラスミドを２．５μｇ、Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｇｅｎｔを２．５μＬ加え、転倒混和した。室温で５分間静置した後、リポフェクトアミンＬＴＸを１０μＬ加え、室温で３０分間静置した。全量を培養液に添加し培養した。２４時間後、細胞を再播種し、各種アッセイを行った。
　ＭＥＫ阻害剤ＳＭＫ－１７に対する薬剤感受性について、細胞株間における比較を行った。具体的には、細胞増殖に係る種々の情報伝達経路に関与するタンパク質の変異を有する２４種類の細胞株を用い、二次元および三次元培養でＭＥＫ阻害剤ＳＭＫ－１７（第一三共株式会社）の増殖抑制活性を評価した。また、比較材料として、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６を用いて、同様に増殖抑制活性を評価した。
　増殖抑制活性の評価は、細胞内ＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いてルシフェラーゼ発光量で測定することにより実施した。具体的には、細胞を播種し、２４時間後にＳＭＫ－１７およびＵ０１２６を最終濃度０．１、０．３、１．０、３．０、１０、３０μＭとなるように培養液に加えて薬剤処理を行った。薬剤処理して７２時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いて細胞内ＡＴＰ量を測定した。得られた発光量から増殖率を算出し、さらに５０％増殖を阻害する薬剤濃度（ＧＩ５０）を算出した。ＧＩ５０から二次元培養による結果と三次元培養による結果の相関関係をピアソンの積率相関係数を用いて評価した。各薬剤に関して二次元培養と三次元培養との間の積率相関係数ｒを求めたところ、ＳＭＫ－１７はｒ＝０．８８、Ｕ０１２６はｒ＝０．７２であった。この積率相関係数から有意性検定を行ったところ、それぞれの検定統計量は、ＳＭＫ－１７がｒ＝８．０、Ｕ０１２６がｒ＝４．５となった。なお、標本数ｎは２１である。ここでｔ（１９，０．０１）＝２．９より、両化合物共に、帰無仮説が棄却され、二次元培養と三次元培養の間に相関関係が示された。
　次に、各細胞株が有する遺伝子変異と薬剤感受性を比較するために、二次元培養、三次元培養に関して両薬剤について、得られたＧＩ５０から－ｌｏｇ（ＧＩ５０）を算出し、その値を、平均値（ＭＧ－ＭＩＤ）を原点としたフィンガープリントパターン（非特許文献５０）で表示した。ここで、各細胞株に関して、－ｌｏｇ（ＧＩ５０）の値が正であるものは高感受性細胞株、負であるものは低感受性細胞株とした。また、ＢＲＡＦ、Ｋ－ｒａｓ、ＰＴＥＮ、β－カテニン、およびＡＰＣの変異に関して、それぞれ変異型細胞株群と野生型細胞株群に分け、その２群のＧＩ５０の平均値の有意差をｔ検定により評価した。
　図１に示したように、ＳＭＫ－１７による増殖抑制活性試験の結果、ＭＥＫの上流に存在するＢＲＡＦの活性型変異細胞株であるＡ３７５、ＨＴ２９、ｃｏｌｏ－２０５やｃｏｌｏ－２０１はいずれも高感受性を示した。
　さらに、ＢＲＡＦ活性型変異細胞株群と野生型細胞株群におけるＧＩ５０の平均値にｐ＜０．００１の有意差が得られた。このことから、ＰＤ１８４３５２などの既存のＭＥＫ阻害剤と同様、ＢＲＡＦ活性型変異はＳＭＫ－１７の正の感受性規定因子であることが示唆された。次に、ＢＲＡＦの上流に位置するＫ－ｒａｓの活性型変異細胞株においては、ＬＳ－１７４Ｔ細胞、ＨＣＴ＿１１６細胞、ＳＷ４８０細胞、ＳＷ６２０細胞は高感受性株であったのに対し、Ａ５４９細胞、ＯＶＣＡＲ－５細胞、ＤＬＤ－１細胞は低感受性株であった。また、Ｋ－ｒａｓ活性型変異細胞株群と野生型細胞株群におけるＧＩ５０の平均値に有意差は得られなかった。このことから、Ｋ－ｒａｓ活性型変異はＳＭＫ－１７の感受性規定因子ではないことが示唆された。一方で、ＰＴＥＮ欠損細胞株であるＡＮ３－ＣＡ、ＬＮＣａＰ、ＰＣ－３はいずれも低感受性細胞株であった。ＰＴＥＮ欠損細胞株群と野生型細胞株群におけるＧＩ５０の平均値に有意差は得られなかったが、ＢＲＡＦ活性型変異およびＰＴＥＮ欠損細胞株Ａ２０５８が、その他のＢＲＡＦ活性型変異細胞株よりも低感受性であったことから、ＰＴＥＮ欠損はＳＭＫ－１７の負の感受性規定因子であることが示唆された。また、ＢＲＡＦ、Ｋ－ｒａｓ、ＰＴＥＮに関して野生型の細胞株（Ａ４３１、ＤＵ１４５、ＥＣ１０９、ＨｅＬａ、Ｍｓ－１、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＪＩＭＴ－１）は低感受性細胞株であったことから、これらの細胞株はＭＡＰＫシグナル伝達経路には依存せずに細胞増殖することが示唆された。一方で、ＢＲＡＦ、Ｋ－ｒａｓ、ＰＴＥＮに関して野生型の細胞株のほとんどが低感受性細胞株であるにもかかわらず、ＢＲＡＦ、Ｋ－ｒａｓ、ＰＴＥＮが野生型であるＳＷ４８細胞がＳＭＫ－１７に対して高感受性を示した。
　ＳＭＫ－１７に対して高感受性を示したＳＷ４８細胞は、ＢＲＡＦ、Ｋ－ｒａｓ、ＰＴＥＮが野生型であり、β－カテニンの活性型変異を有する細胞株である。このことから、β－カテニンを構成因子とするＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路上の変異に着目すると、β－カテニン活性型変異細胞株であるｃｏｌｏ－２０５、ｃｏｌｏ－２０１、ＳＫ－ＭＥＬ－１、ＬＳ－１７４Ｔ、ＨＣＴ＿１１６、ＳＷ４８はいずれも高感受性株であった。Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路に関るタンパク質においては、ＡＰＣ変異も報告されているが、ＡＰＣ変異細胞株のうち、ｃｏｌｏ－２０５、ｃｏｌｏ－２０１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０は高感受性を示した。さらに、β－カテニン活性型変異細胞株群、ＡＰＣ変異細胞株群、β－カテニン活性型およびＡＰＣ変異細胞株群に関して、野生型細胞株群に対するＧＩ５０の平均値の有意差を検定した結果、それぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１の有意差が得られた。このことから、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路上の変異はＳＭＫ－１７の正の感受性規定因子であることが示唆された。
　次に、ＳＭＫ－１７と同様のＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６に関しては、２４種類の細胞株のうち２３種類の細胞株がＳＭＫ－１７と同様の薬剤感受性の傾向を示した。また、ＳＭＫ－１７とＵ０１２６のそれぞれのＧＩ５０を用いて相関関係を評価したところ、ｒ＝０．８２、ｔ０＝６．９となった。ここでｔ（２２，０．０１）＝２．８より、帰無仮説が棄却され、相関関係が得られた。さらに、ＢＲＡＦ活性型変異、β－カテニン活性型変異、ＡＰＣ変異、β－カテニン活性型およびＡＰＣ変異に関して、野生型細胞株群に対するＧＩ５０の平均値にそれぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１の有意差が得られた。このことから、Ｕ０１２６においてもＳＭＫ－１７と同様、ＢＲＡＦ活性型変異およびＷｎｔシグナル伝達系路上の変異は正の、ＰＴＥＮ欠損は負の感受性規定因子であることが示唆された。
　以上の結果から、β－カテニン活性型変異はＭＥＫ阻害剤ＳＭＫ－１７の正の感受性規定因子であることが明らかになった。
　ＭＥＫ阻害剤であるＳＭＫ－１７による細胞周期停止およびアポトーシス誘導活性評価を行った。実施例１において、ＳＭＫ－１７が高い増殖抑制活性を示す細胞株の存在が明らかになった。増殖抑制活性は、細胞周期の停止またはアポトーシスなどの細胞死によるものと考えられる。そこでＳＭＫ－１７が高感受性細胞株の細胞周期およびアポトーシスに与える影響について評価を行った。
　ＳＭＫ－１７による細胞周期停止およびアポトーシス誘導活性の評価には、ＳＭＫ－１７が高い増殖抑制活性を示した細胞株、すなわちＡ３７５（ＢＲＡＦ活性型変異）、ＨＴ２９（ＢＲＡＦ活性型変異、ＡＰＣ変異）、ＨＣＴ＿１１６（Ｋ－ｒａｓ活性型変異、β－カテニン活性型変異）、ＳＷ４８（β－カテニン活性型変異）、ｃｏｌｏ－２０１（β－カテニン活性型変異、ＡＰＣ変異）、ＬＳ－１７４Ｔ（Ｋ－ｒａｓ活性型変異、β－カテニン活性型変異）、ＳＷ６２０（Ｋ－ｒａｓ活性型変異、ＡＰＣ変異）、ＳＷ４８０（Ｋ－ｒａｓ活性型変異、ＡＰＣ変異）に加えて、Ｋ－ｒａｓ活性型変異、ＡＰＣ変異を有し、低感受性細胞株であるＤＬＤ－１の計９株を用いた。細胞を播種し、２４時間後にＳＭＫ－１７を最終濃度０．１、０．３、１．０、３．０、１０μＭになるように培養液に加え薬剤処理した。薬剤処理して４８時間後に細胞を回収し、エタノール固定およびＰＩ染色を行い、フローサイトメーターによりＤＮＡ含有量を測定した。また、薬剤処理した細胞におけるＳＭＫ－１７のＭＥＫ阻害活性を測定するために、ＳＭＫ－１７処理２４時間後の細胞について、ＥＲＫ、リン酸化ＥＲＫ、およびアクチンの発現をウエスタンブロッティングにより評価した。また、標的分子の発現量に対するリン酸化標的分子の発現量を算出し、標的分子のリン酸化の発現を９５％以上抑制する濃度における細胞周期への影響を評価した。そして、ｓｕｂＧ１期の増加が２０％以上認められた場合、アポトーシスが誘導されたものと判定した。
　β－カテニン活性型変異を有するＨＣＴ＿１１６細胞、ＳＷ４８細胞、ｃｏｌｏ－２０１細胞、ＬＳ－１７４Ｔ細胞に対してはＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する濃度において、ＳＭＫ－１７処理により著しくｓｕｂＧ１期が増加し、ＤＮＡの断片化が観察された。具体的には、ＨＣＴ＿１１６細胞、ＳＷ４８細胞、ｃｏｌｏ－２０１細胞、ＬＳ－１７４Ｔ細胞において、それぞれ１０μＭ、１０μＭ、１．０μＭ、１０μＭの濃度のＳＭＫ－１７により、ＥＲＫリン酸化の完全な阻害、並びにｓｕｂＧ１期の増加およびＤＮＡの断片化が示すアポトーシスの誘導が観察された。
　一方、ＳＭＫ－１７処理により、ＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する濃度において、Ａ３７５細胞、ＨＴ２９細胞、ＳＷ４８０細胞では、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期の割合が大きく減少し、著しいＧ１期停止が観察されたが、ＤＮＡの断片化は認められなかった。具体的には、Ａ３７５細胞、ＨＴ２９細胞、ＳＷ４８０細胞において、それぞれ１．０μＭ、３．０μＭ、３．０μＭの濃度のＳＭＫ－１７により、ＥＲＫリン酸化の完全な阻害および細胞周期停止が観察された。ＳＷ６２０細胞およびＤＬＤ－１細胞に対しては、ＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する１．０μＭの濃度のＳＭＫ－１７を処理しても、細胞周期への影響は観察されなかった。
　代表的な結果を図２に示す。上記結果から、ＭＥＫ阻害剤ＳＭＫ－１７は、β－カテニン活性型変異を有する細胞株選択的にアポトーシスを誘導することが明らかになった。
　ＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤によるアポトーシス誘導活性の評価を行った。実施例２においてＭＥＫ阻害剤であるＳＭＫ－１７がβ－カテニン活性型変異を有する細胞株選択的にアポトーシスを誘導することが明らかになった。ＭＥＫはＭＡＰＫシグナル伝達経路の下流の因子である。そこで、ＳＭＫ－１７以外のＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤によりＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害し、そのアポトーシス誘導活性を検討した。
　検討は、ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ１８４３５２、マルチキナーゼ阻害剤であり、特にＲａｆを阻害するソラフェニブ（非特許文献６１）、ＢＲＡＦ選択的阻害剤であるＳＢ５９０８８５について、β－カテニン野生型細胞株Ａ３７５およびＨＴ２９、ＡＰＣ変異細胞株ＤＬＤ－１、並びにβ－カテニン活性型変異細胞株ＨＣＴ＿１１６およびＳＷ４８を用いて行った。ＰＤ１８４３５２は０．１、０．３、１．０、３．０、１０μＭ、ソラフェニブおよびＳＢ５９０８８５は０．３、１．０、３．０、１０μＭで処理した。薬剤処理して４８時間後に細胞を回収し、エタノール固定およびＰＩ染色を行い、フローサイトメーターによりＤＮＡ含有量を測定した。また、薬剤処理した細胞における標的分子阻害活性を測定するために、薬剤処理２４時間後の細胞について、ＥＲＫ、リン酸化ＥＲＫ、ＭＥＫ、リン酸化ＭＥＫ、およびアクチンの発現をウエスタンブロッティングにより評価した。また、標的分子の発現量に対するリン酸化標的分子の発現量を算出し、標的分子のリン酸化の発現を９５％以上抑制する濃度における各阻害剤の細胞周期への影響を評価した。そして、ｓｕｂＧ１期の増加が２０％以上認められた場合、アポトーシスが誘導されたものと判定した。
　図３に示すように、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ１８４３５２を処理したところ、β－カテニン活性型変異細胞株であるＨＣＴ＿１１６およびＳＷ４８において、ＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する濃度、すなわちそれぞれ３．０μＭおよび３．０μＭでアポトーシスが誘導された。このことからＰＤ１８４３５２もＳＭＫ－１７と同様、ＭＥＫを阻害すること、およびβ－カテニン活性型変異細胞選択的にアポトーシスを誘導することが明らかになった。
　また、ＢＲＡＦ選択的阻害剤であるＳＢ５９０８８５を処理したところ、β－カテニン活性型変異細胞株であるＨＣＴ＿１１６において、ＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する濃度である１０．０μＭでアポトーシスが誘導された。一方、β－カテニン野生型細胞株であるＡ３７５に対しては、ＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する濃度である１．０μＭで、Ｇ１期停止が誘導されたがアポトーシスは誘導されなかった。このことからＳＢ５９０８８５はβ－カテニン活性型変異細胞選択的にアポトーシスを誘導することがわかった。
　一方、β－カテニン野生型細胞株であるＡ３７５およびＨＴ２９に対して、ＰＤ１８４３５２はＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する濃度、すなわちそれぞれ０．３０μＭおよび３．０μＭにおいて著しいＧ１期停止を誘導したが、アポトーシスは誘導しなかった。ＰＤ１８４３５２はＡ３７５において、ＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する濃度より高い濃度でアポトーシスを誘導しているが、これはＰＤ１８４３５２が高濃度ではＭＥＫ１／２以外にＭＥＫ５などのＭＥＫファミリーに対しても阻害効果を示すために生じた結果であり、ＭＥＫ１／２が関与する古典的ＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害以外の要因で引き起こされたと考えられる。ＰＤ１８４３５２は、ＡＰＣ変異細胞株であるＤＬＤ－１に対してはＥＲＫのリン酸化を完全に阻害する濃度である１０μＭで特に影響を示さなかった。
　次に、Ｒａｆ阻害剤であるソラフェニブを処理したところ、いずれの細胞株においてもＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化の完全な阻害効果は得られなかった。そのため、ソラフェニブによるアポトーシス誘導活性の評価は不可能であると判断した。
　上記結果から、ＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤、特に古典的ＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＭＫ－１７と同様、β－カテニン活性型変異細胞選択的なアポトーシス誘導活性を有することが判明した。
　実施例１－３の結果から、β－カテニン活性型変異は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤によるアポトーシス誘導の感受性規定因子であることが示された。そこで、ＳＭＫ－１７によるアポトーシス誘導におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の関与について、機能喪失（ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）試験により検討を行った。
　機能喪失試験は、β－カテニンのノックダウンあるいはＤＮ－ＴＣＦ４の強制発現によりＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を不活性化した細胞において、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性に与える影響を評価することにより実施した。コントロール細胞として、β－カテニンのノックダウンあるいはＤＮ－ＴＣＦ４の強制発現を行っていない細胞を用いた。
　まず、ＳＭＫ－１７処理によりアポトーシスが誘導されるβ－カテニン活性型変異細胞株ＨＣＴ＿１１６に対して、ｓｉＲＮＡによるβ－カテニンのノックダウンを試みた。リバーストランスフェクション法によりノックダウンを行い、２４、４８、７２、９６時間後に細胞を回収し、β－カテニンの発現量をウエスタンブロッティングにより検出した。その結果、ノックダウンを行った４８時間後にβ－カテニンの発現抑制が確認された（図４のパネルＡ）。次に、ノックダウンを行った４８時間後に３．０μＭのＳＭＫ－１７で処理し、４８時間後にフローサイトメーターを用いてｓｕｂＧ１期を検出することにより、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性を評価した。
　その結果、コントロール細胞に比べ、β－カテニンをノックダウンした細胞では、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性が有意に抑制された（図４のパネルＢ）。
　次にβ－カテニン活性型変異細胞株ＨＣＴ＿１１６にＤＮ－ＴＣＦ４を強制発現させ、ＳＭＫ－１７によるアポトーシス誘導活性を評価した。ＤＮ－ＴＣＦ４はＴＣＦ４のＤＮＡ結合部位である第１番目から第３１番目のアミノ酸が欠損しているため、β－カテニンが結合してもＤＮＡに結合出来ず、野生型のＴＣＦ４による転写が促進されない。すなわち、ＤＮ－ＴＣＦ４の強制発現により、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を不活性化状態にすることが出来る。コントロール細胞として、ＤＮ－ＴＣＦ４の強制発現を行っていない細胞を用いた。
　具体的には、上記ｓｉＲＮＡ導入方法と同様、ＨＣＴ＿１１６細胞に対してＤＮ－ＴＣＦ４の遺伝子導入を行い、ＴＣＦ４の転写活性をトップフラッシュ　レポーターアッセイにより評価した。トップフラッシュはＴＣＦ４のＤＮＡ結合配列の後にホタル　ルシフェラーゼが挿入されており、ＴＣＦ４が結合するとホタル　ルシフェラーゼが発現するため、ＴＣＦ４の転写活性をホタル　ルシフェラーゼの発光量により評価することができる。また、細胞株間比較の補正のために、細胞にレニラ　ルシフェラーゼ　レポーター　プラスミドを遺伝子導入し、ＴＫ－プロモータにより恒常的に発現するレニラ　ルシフェラーゼの発光量に対するホタル　ルシフェラーゼの発光量を算出した値で細胞株間比較を実施した。
　トップフラッシュ　レポーターアッセイを行った結果、ＤＮ－ＴＣＦ４の強制発現によるＴＣＦ４の転写活性の抑制が確認された（図５のパネルＡ）。次に、１０μＭの濃度のＳＭＫ－１７で処理し、４８時間後にフローサイトメーターを用いてｓｕｂＧ１期を検出することにより、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性を評価した。その結果、コントロール細胞に比べ、ＤＮ－ＴＣＦ４強制発現細胞では、ＳＭＫ－１７によるアポトーシス誘導が有意に抑制された（図５のパネルＢ）。
　実施例１－３の結果から、β－カテニン活性型変異は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤によるアポトーシス誘導の感受性規定因子であることが示された。そこで、ＳＭＫ－１７によるアポトーシス誘導におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の関与について、機能獲得（ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）試験により検討を行った。
　機能獲得試験は、ＳＭＫ－１７を処理してもアポトーシスが誘導されないβ－カテニン野生型細胞株Ａ３７５を用いて、活性型β－カテニンを強制発現させるか、またはＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路をＦｚのリガンドであるｗｎｔ３ａにより刺激することにより活性化し、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性に与える影響を評価した。
　まず、Ａ３７５細胞に対して、ｗｎｔ３ａの刺激を行った。ｗｎｔ３ａは膜表面に存在するＦｚに結合し、アキシンを介してＧＳＫ－３のリン酸化を阻害することにより、β－カテニンを分解する複合体を抑制する。これによってＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化することが出来る。具体的には、トップフラッシュおよびレニラ　ルシフェラーゼ　レポータープラスミドを遺伝子導入したＡ３７５細胞にｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）を処理し、２４時間後ＴＣＦ４の転写活性をトップフラッシュ　レポーターアッセイにより評価した。その結果、ｗｎｔ３ａ刺激によりＴＣＦ４の転写活性の増加が確認された（図６のパネルＡ）。
　また、ｗｎｔ３ａで刺激した細胞にＳＭＫ－１７（１０μＭ）を処理し、２４時間後のＰＡＲＰの切断をウエスタンブロッティングで測定し、さらに４８時間後のアポトーシス誘導活性を、フローサイトメーターを用いてｓｕｂＧ１期を検出することにより評価した。コントロール細胞として、ｗｎｔ３ａによる刺激をしないＡ３７５細胞を用いた。その結果、ＳＭＫ－１７単剤ではＰＡＲＰの切断が観察されなかったのに対し、ｗｎｔ３ａ刺激条件ではＰＡＲＰの切断が誘導された（図６のパネルＢ）。また、コントロール細胞に比べ、ｗｎｔ３ａ刺激細胞ではＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性が有意に促進した（図６のパネルＣ）。
　次にＡ３７５細胞に活性型β－カテニンを強制発現させ、ＳＭＫ－１７によるアポトーシス誘導活性を評価した。強制発現される活性型β－カテニンは、β－カテニンリン酸化部位に変異、すなわち第３７番目のセリンのアラニンへの置換（Ｓ３７Ａ）および第４５番目のセリンのアラニンへの置換（Ｓ４５Ａ）を有しているため、複合体によるリン酸化を受けず、核内に移行してシグナルを亢進させＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路を活性化させる。Ａ３７５細胞に対して活性型β－カテニンの遺伝子導入を行い、ＴＣＦ４の転写活性をトップフラッシュ　レポーターアッセイにより評価した。コントロール細胞として、活性型β－カテニンを遺伝子導入していないＡ３７５細胞を用いた。その結果、活性型β－カテニンの強制発現によりＴＣＦ４の転写活性の増加が確認された（図７のパネルＡ）。
　また、ＳＭＫ－１７（１０μＭ）を処理し、４８時間後のアポトーシス誘導活性を、フローサイトメーターを用いてｓｕｂＧ１期を検出することにより評価した。その結果、コントロール細胞に比べ、活性型β－カテニン強制発現細胞では、ＳＭＫ－１７のアポトーシス誘導活性が有意に促進された（図７のパネルＢ）。
　実施例４および実施例５の機能喪失（ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）試験および機能獲得（ｇａｉｎ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）試験の両方において、ＭＥＫ阻害剤ＳＭＫ－１７のβ－カテニン活性型変異細胞選択的なアポトーシス誘導にはＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路が関与していることが示唆された。
　ＳＭＫ－１７のｉｎ　ｖｉｖｏでの効果を評価した。具体的には、腫瘍細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養し、マウスへの移植当日にトリプシンＥＤＴＡおよびＰＢＳ－を用いて回収し、１×１０８細胞／ｍＬになるようにＰＢＳ－に再懸濁し、Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス（日本クレア）の腋窩部皮下に０．１ｍＬずつ移植した。その後、マウスでの腫瘍生着を確認しだい、被験化合物を０．５％　ＭＣ水溶液（和光純薬社製）に懸濁した投与液を目的の用量で経口投与し、経時的に電子ノギス（ミツトヨ社製）で腫瘍体積を計測した。
　腫瘍組織における腫瘍細胞のアポトーシスのレベルは、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄＵＴＰ－ｂｉｏｔｉｎ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ）法により測定した。本測定は市販のＴＵＮＥＬ測定キット（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を用いてキット添付の推奨プロトコールにて実施した。
　図８に示すように、ＳＭＫ－１７はｉｎ　ｖｉｖｏで腫瘍縮小効果を示した。具体的には、β－カテニン活性型変異を有する腫瘍細胞株ＳＷ４８を担持したヌードマウスで、２００ｍｇ／ｋｇのＳＭＫ－１７の経口投与により、腫瘍体積の減少が観察された。同様に、β－カテニン活性型変異を有する腫瘍細胞株ｃｏｌｏ２０５を担持したヌードマウスで、２００ｍｇ／ｋｇのＳＭＫ－１７の投与により、腫瘍体積の減少が観察された。
　一方、β－カテニンが野生型である腫瘍細胞株Ａ３７５またはＨＴ２９を担持したヌードマウスでは、２００ｍｇ／ｋｇのＳＭＫ－１７の投与により、腫瘍体積増大の抑制効果が観察されたが、腫瘍縮小効果は認められなかった。
　また、ＳＷ４８細胞を担持したヌードマウスでは、ＳＭＫ－１７の投与により腫瘍組織内のアポトーシス陽性細胞数が増加したことが明らかになった（図９）。一方、Ａ３７５細胞またはＨＴ２９細胞を担持したヌードマウスでは、ＳＭＫ－１７を投与しても腫瘍組織内のアポトーシス陽性細胞数に変化は観察されなかった。
　上記結果から、ＳＭＫ－１７はｉｎ　ｖｉｖｏでβ－カテニン活性型変異を有する腫瘍の縮小効果を示すこと、およびその腫瘍縮小効果は当該腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす効果によることが判明した。
　以上説明したとおり、本発明は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性を予測する方法、および、該化合物を含む薬剤の投与の奏功性高いと判断される患者を選別する方法を提供するものであり、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患の有効な治療を可能にする。このように、本発明は、がん患者の治療分野において極めて有用である。
配列番号１：野生型β－カテニン（配列番号２）をコードする遺伝子。
配列番号３：β－カテニン遺伝子のノックダウンに使用したｓｉＲＮＡ。

Claims (14)

  1. がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異を有するか否かを測定し、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者を、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ、以下ＭＡＰＫと略称する）シグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象として選別することを含む、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象を選別する方法。
  2. がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異を有するか否かを測定し、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者を、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性があると判定することを含む、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性を予測する方法。
  3. ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療への応答性が、該化合物によるがん疾患治療におけるアポトーシス誘導によるがんの縮小である、請求項２に記載の方法。
  4. がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるβ－カテニンが、（ｉ）活性型変異および（ｉｉ）第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異からなる群より選択される１種または２種以上の変異を有するか否かを測定し、該変異を有するβ－カテニンが検出された患者を、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物によるがん疾患治療の対象として選別し、該選別された患者に、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物の治療有効量を投与することを含む、がん疾患の治療方法。
  5. 活性型変異が下記から選ばれる少なくとも１の変異である請求項１から４のいずれか１項に記載の方法：
    （１）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
    （２）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の欠失変異。
  6. 活性型変異が下記から選ばれる少なくとも１の変異である請求項１から４のいずれか１項に記載の方法：
    （３）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
    （４）β－カテニンのアミノ酸配列の第４５番目のセリン残基の欠失変異。
  7. 生物学的試料が、がん細胞またはがん組織を含む生物学的試料である、請求項１－６のいずれか１項に記載の方法。
  8. ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害する化合物が、ＭＡＰＫキナーゼキナーゼ（以下、ＭＡＰＫＫＫと略称する）を阻害する化合物、ＭＡＰＫキナーゼ（以下、ＭＡＰＫＫと略称する）を阻害する化合物、およびＭＡＰＫを阻害する化合物からなる群より選択される少なくとも１の化合物である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ＭＡＰＫＫＫを阻害する化合物、ＭＡＰＫＫを阻害する化合物、およびＭＡＰＫを阻害する化合物からなる群より選択される少なくとも１の化合物が、Ｂ－Ｒａｆを阻害する化合物並びにＭＥＫ１／２を阻害する化合物からなる群より選択される少なくとも１の化合物である、請求項８に記載の方法。
  10. 請求項１から９のいずれか１項に記載の方法において、βカテニンの前記変異の有無を検出するための試薬であって、下記の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の分子を有効成分とする試薬：
    （ａ）前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位を含む連続した部分塩基配列からなる核酸に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、
    （ｂ）前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位の５´側領域の塩基配列の相補配列の一部に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、および記変異を有するβ－カテニン遺伝子の該変異部位の３´側領域の塩基配列の一部に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーからなるオリゴヌクレオチドプライマーセット、
    （ｃ）前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位を含む連続した部分塩基配列からなる核酸に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ、または
    （ｄ）前記変異を有するβ－カテニンに特異的に結合する抗体。
  11. 有効成分である分子が、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーセット、または前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記変異が下記から選ばれるいずれか１の変異である、請求項１０に記載の試薬：
    （Ａ）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
    （Ｂ）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の欠失変異、または、
    （Ｃ）β－カテニンのアミノ酸配列の第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異。
  12. 有効成分である分子が、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーセット、または前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列における第９８番目、第１０９番目、第１１０番目、第１２１番目、第１３３番目、第１３４番目、または第８６０番目である、請求項１０に記載の試薬。
  13. 有効成分である分子が、前記（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマー、前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーセット、または前記（ｃ）のオリゴヌクレオチドプローブであって、前記変異を有するβ－カテニンをコードする遺伝子の該変異部位、およびその変異が、配列表の配列番号１に記載の塩基配列における第９８番目のシトシンのアデニンへの変異、第１０９番目のチミンのシトシンへの変異、第１１０番目のシトシンのチミンへの変異、第１２１番目のアデニンのグアニンへの変異、第１３３番目のチミンのシトシンへの変異、第１３４番目のシトシンのチミンへの変異、または第８６０番目のアデニンのグアニンへの変異である、請求項１０に記載の試薬。
  14. 有効成分である分子が、前記（ｄ）の抗体であって、前記変異が下記から選ばれるいずれか１の変異である、請求項１０に記載の試薬：
    （Ａ）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の置換変異であって、セリン残基やスレオニン残基以外のアミノ酸残基への置換変異、
    （Ｂ）β－カテニンのアミノ酸配列の第３３番目のセリン残基、第３７番目のセリン残基、第４１番目のスレオニン残基、または第４５番目のセリン残基の欠失変異、または、
    （Ｃ）β－カテニンのアミノ酸配列の第２８７番目のアスパラギン酸残基のセリン残基への置換変異。
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