WO2014087863A1 - 抗ｆｏｌｒ１抗体 - Google Patents

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宗稔 安藤
博司 安藤
まり子 中野
直哉 亀山
麗夫 久保田
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協和発酵キリン株式会社
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention binds to Folate receptor ⁇ (hereinafter referred to as FOLR1), and is antibody-dependent cytotoxicity (hereinafter referred to as ADCC activity) and / or complement-dependent cytotoxicity (Complement- A monoclonal antibody that exhibits dependent cytotoxity (hereinafter referred to as CDC activity) or the antibody fragment, a DNA encoding the antibody or the antibody fragment, a vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the vector,
  • the present invention relates to a method for producing the antibody or the antibody fragment using a transformant, and a therapeutic agent and a diagnostic agent containing the antibody or the antibody fragment as an active ingredient.
  • FOLR1 is a GPI-anchored membrane protein having high affinity for folic acid and has an important function for cell growth and survival (Non-patent Document 1). In normal tissues, FOLR1 is expressed locally in the kidney, lung, intestine and the like (Non-patent Document 2).
  • the expression site is the luminal side.
  • the expression of FOLR1 in cancer tissue is not limited to the luminal side, but ovarian cancer (Non-patent document 2, Non-patent document 3, Non-patent document 4), kidney cancer (non-patent document 2), lung cancer (non-patent document 2).
  • Non-patent document 3 ovarian cancer
  • breast cancer non-patent document 2
  • mesothelioma non-patent document 4
  • FOLR1 expression level affects malignancy, progression, and prognosis (Non-patent Documents 5 and 6). Furthermore, it is also known that soluble FOLR1 contained in the serum of ovarian cancer patients is significantly increased compared to healthy individuals (Non-patent Document 7). Thus, FOLR1 is a molecule expected as a cancer therapeutic target.
  • LK26 is known as a mouse monoclonal antibody against FOLR1 (Patent Document 1). This LK26 was humanized by CDR transplantation for administration to patients as a cancer therapeutic antibody (Patent Document 2). However, there was a marked decrease in affinity with humanization.
  • MORAb-003 has no activity to inhibit the binding of folic acid, 5-methyltetrahydrofolate (5-MTHF), or pemetrexed to FOLR1-positive cells, and the antibody alone has no activity to suppress the growth of FOLR1-positive cells.
  • folic acid 5-methyltetrahydrofolate
  • 5-MTHF 5-methyltetrahydrofolate
  • Examples of drugs that target FOLR1 as a cancer treatment target include EC-145 obtained by conjugating an anticancer drug to folic acid in addition to the above-described antibodies.
  • a drug in which an anticancer drug is conjugated to folic acid exhibits a medicinal effect based on the property that FOLR1 takes up folic acid. Therefore, a drug in which an anticancer drug is conjugated to folic acid is considered to be ineffective for cancer cells having low folic acid uptake activity even if the cancer cells in the body express FOLR1.
  • ovarian cancer is likely to be accompanied by ascites retention due to peritoneal dissemination, and in platinum-resistant ovarian cancer, the decrease in QOL (Quality of Life) associated with ascites retention is a problem.
  • QOL Quality of Life
  • An anti-FOLR1 antibody whose antibody has greatly increased ADCC activity and / or CDC activity is a therapeutic antibody for cancer characterized in that FOLR1 is expressed in cancer cells, including platinum-resistant ovarian cancer which is difficult to treat As expected.
  • the present invention provides an antibody or an antibody fragment thereof that exhibits antitumor activity in vitro and in vivo against a cell line derived from platinum-resistant ovarian cancer. Furthermore, the present invention relates to a DNA encoding the antibody or the antibody fragment, a vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the vector, and a method for producing the antibody or the antibody fragment using the transformant. The present invention provides a therapeutic agent and a diagnostic agent comprising the antibody or the antibody fragment as an active ingredient.
  • the gist of the present invention is as follows. (1) competes with one antibody selected from the following (a) to (c), specifically recognizes human FOLR1, binds to the same epitope as that present in human FOLR1 to which the antibody binds, And a monoclonal antibody or an antibody fragment thereof exhibiting antitumor activity.
  • CDR Complementary determining region
  • H chain Complementary determining region
  • CDR1 to 3 are respectively SEQ ID NO: 30, wherein CDR1 to CDR3 comprise the light chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 33, 34, and 35 (hereinafter referred to as L chain), respectively.
  • Cysteine in the amino acid sequence represented by No. 32 is threonine, methionine, isoleucine, valine, phenylalani Or an antibody substituted with glutamine (c) an antibody comprising the heavy chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 98 and comprising the light chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 94 (2
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to (1) which is a recombinant antibody.
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment according to (2) which is a recombinant antibody selected from a human chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody.
  • CDR1-3 comprise the heavy chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 30, 31, 32, respectively, and CDR1-3 comprise SEQ ID NOs: 33, 34, respectively.
  • cysteine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 (CDR3 of antibody H chain) is threonine, methionine, isoleucine, valine, phenylalanine, or Antibody substituted with glutamine (c) comprising the heavy chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 98, and represented by SEQ ID NO: 94
  • An antibody comprising an L chain of an antibody comprising an amino acid sequence (5) The monoclonal antibody according to any one of (1) to (4), which binds to the amino acid sequence of human FOLR1 represented by SEQ ID NO: 1, and the antibody fragment .
  • An antibody selected from a peptide comprising Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single-chain antibody (scFv), dimerized V region (diabody), disulfide stabilized V region (dsFv) and CDR The antibody fragment according to any one of (1) to (4), which is a fragment.
  • the transformant according to (9) is cultured in a medium, and the monoclonal antibody or the antibody fragment according to (1) or (4) is produced and accumulated in the culture.
  • (11) A method for treating a disease involving human FOLR1-positive cells, comprising administering the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (4).
  • (12) A therapeutic agent for a disease involving human FOLR1-positive cells, comprising the monoclonal antibody or the antibody fragment according to any one of (1) to (4) and a pharmacologically acceptable carrier.
  • Diagnosis of a disease involving human FOLR1-positive cells comprising detecting or measuring human FOLR1-positive cells using the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (4) Method.
  • a diagnostic agent for a disease involving human FOLR1-positive cells comprising the monoclonal antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (4).
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of human FOLR1 or its three-dimensional structure.
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention has high ADCC activity and CDC activity, and also exhibits antitumor activity against a cell line derived from platinum-resistant ovarian cancer.
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention also has ADCC activity in FOLR1 low-expressing cells. Furthermore, the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention also has ADCC activity in cancer cells that express FOLR1, which are present in ascites. In addition, the monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention has ADCC activity against cancer cells expressing FOLR1, even if its folate uptake activity is reduced.
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention does not inhibit the binding of folic acid to FOLR1.
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention that specifically binds to human FOLR1 and has high ADCC activity and CDC activity is useful for treatment and diagnosis of diseases involving human FOLR1-positive cells.
  • the present invention also provides DNA encoding the antibody, a vector containing the DNA, a transformant obtained by introducing the vector, a method for producing the antibody or the antibody fragment using the transformant, the antibody or It is possible to provide therapeutic agents and diagnostic agents containing the antibody fragment as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows the RA15-7 antibody heavy chain variable region not containing a signal sequence and each humanized RA15-7 antibody modified heavy chain variable region (HV0, HV2, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, HV10). Amino acid sequence is shown.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequences of the RA15-7 antibody light chain variable region not containing a signal sequence and each humanized RA15-7 antibody variant light chain variable region (LV0, LV2, LV3, LV4, LV6).
  • FIG. 3 shows the affinity evaluation results (surface plasmon resonance method) of the HV7LV3-CDRH3-Cys101 modified antibody for FOLR1-mycHis when the affinity of the ChRA15-7Acc antibody is 100.
  • FOLR1-Fc black circle
  • cynomolgus monkey FOLR1-Fc white circle
  • FOLR2-Fc black triangle
  • FOLR3-Fc ⁇
  • the reactivity evaluation result (ELISA) of each antibody (DNPDF, MORAb-003DF, ChRA15-7DF, HuRA15-7CTDF) is shown.
  • the vertical axis represents absorbance
  • the horizontal axis represents antibody concentration (ng / mL).
  • FIG. 5 (a) and 5 (b) show the HuRA15-7CTAcc antibody (black circle), HuRA15-7Acc antibody (black square), and ChRA15-7Acc antibody (black triangle) against platinum-resistant ovarian cancer cell lines SKOV-3 or OVCAR-3. ) ADCC activity evaluation results.
  • the vertical axis represents ADCC activity (%), and the horizontal axis represents antibody concentration (ng / mL).
  • 6 (a) and 6 (b) show CDC activity against ovarian cancer cell line IGR-OV1.
  • the vertical axis represents CDC activity (%), and the horizontal axis represents antibody concentration ( ⁇ g / mL).
  • FIG. 6 (a) shows the CDC activity evaluation results of HuRA15-7CTAcc antibody (black circle), HuRA15-7CTDF antibody (white circle), ChRA15-7Acc antibody (black triangle), and ChRA15-7DF antibody (white triangle).
  • FIG. 6 (b) shows the CDC activity evaluation results of the HuRA15-7 CTAcc antibody (black circle) and the MORAb-003 antibody (black triangle).
  • FIGS. 7 (a), (b), and (c) show HuRA15-7 CTAcc antibody (black circle), MORAb-003Acc antibody (white triangle) against ovarian cancer cell lines IGR-OV1, SKOV-3, or OVCAR-3, 2 shows ADCC activity evaluation results of MORAb-003 antibody (black triangle).
  • FIG. 8 shows the results of evaluating the accumulation of HuRA15-7CTDF-770 antibody (black circle) and MORAb-003DF-770 antibody (black triangle) against platinum-resistant ovarian cancer cell line SKOV-3 which was transplanted subcutaneously into mice. Show.
  • the vertical axis represents the ratio of the fluorescence intensity of each antibody to the fluorescence intensity of the internal standard DNPDF-680 antibody at the tumor site, and the horizontal axis represents the time (day) after administration.
  • FIG. 9 shows ADCC activity evaluation results of HuRA15-7CTACc antibody (black circle), HuRA15-7CRAcc antibody (white circle), and MORAb-003DF antibody (black triangle) against platinum-resistant ovarian cancer cell line OVCAR-3.
  • the vertical axis represents ADCC activity (%), and the horizontal axis represents antibody concentration (ng / mL).
  • FIG. 10 shows that FOLR1 expressed in ovarian cancer cell lines IGR-OV1, SKOV-3, OVCAR-3, or MCAS is analyzed by flow cytometry using LK26 antibody, using mouse IgG2a as a negative target. The result of quantifying the number of FOLR1 molecules expressed on the ovarian cancer cell line is shown.
  • the vertical axis represents the number of FORL1 expressing molecules per cell.
  • Figures 11 show HuRA15-7 CTAcc antibody (black circle), MORAb-003 antibody (black triangle), and negative for cell populations in ovarian cancer ascites
  • the cytotoxic activity with respect to a FOLR1 positive cell when a DNPDF antibody (x) is added as a subject is shown.
  • the vertical axis represents cytotoxic activity (%), and the horizontal axis represents antibody concentration (ng / mL).
  • FZ12, FZ21, FZ26, and FZ44 each represent a donor of ovarian cancer ascites.
  • 12 (a) and 12 (b) show the results of analyzing the FOLR1 expression level and folic acid uptake amount of various ovarian cancer cell lines.
  • FIG. 12 (a) shows the results of analyzing the FOLR1 expression level by flow cytometry using the HuRA15-7CTACc antibody.
  • FIG. 12 (b) shows the results of analyzing the folate uptake amount by flow cytometry using labeled folic acid.
  • the vertical axis represents the relative MFI value for negative subjects, and the horizontal axis represents the analyzed ovarian cancer cell line.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM_016725 and having the function of human FOLR1, SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by GenBank accession number NM_016725 60% or more, preferably a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added and having the function of human FOLR1, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM_016725
  • Comprises a polypeptide having an amino acid sequence having a homology of 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably an amino acid sequence having a homology of 95% or more, and human FOLR1 Polypeptide having the ability comprises an amino acid sequence consisting of a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM_016725, and the like polypeptides and the like having the function of human FOLR1.
  • human FOLR1 The function of human FOLR1 is to cause endocytosis by binding to a ligand (for example, folic acid) and to take up folic acid into the cell.
  • a ligand for example, folic acid
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. It is.
  • Examples of the gene encoding human FOLR1 include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM_016725.
  • a gene comprising a DNA encoding a polypeptide comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM_016725, and having a function of human FOLR1 A nucleotide sequence having at least 60% homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM — 016725, preferably a nucleotide sequence having 80% or more homology, more preferably 95% or more homology
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM — 016725 was used as a probe, colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot -It means a hybridizable DNA obtained by a hybridization method or a DNA microarray method.
  • 0.7 to 1.0 mol / L of sodium chloride is present using a DNA or DNA derived from hybridized colonies or plaques, or a filter or slide glass on which a PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • a DNA or DNA derived from hybridized colonies or plaques or a filter or slide glass on which a PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • SSC solution composition of 1 times concentration SSC solution is 150 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L sodium citrate
  • the hybridizable DNA is DNA having at least 60% homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM — 016725, preferably DNA having 80% homology, more preferably Mention may be made of DNA having a homology of 95% or more.
  • the gene used in the present invention includes a gene in which a small-scale mutation has occurred in the nucleotide sequence due to such polymorphism, and is also included in the gene encoding FOLR1 of the present invention.
  • the numerical value of homology in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art unless otherwise specified, but the base sequence may be BLAST [J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)], for amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997), Genome Res. 7, 649 (1997), http: // www. ncbi. nlm. nih. gov / Education / BLASTinfo / information3. numerical values calculated using default parameters in [html].
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 if it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • 11 residues when -W (wordsize) is a base sequence
  • amino acid sequence In the case of -y [Dropoff (X) for blast extensions in bits] is 20 for blastn, 7 for programs other than blastn, -X (X dropoff value f If the rapped alignment in bits) is 15 and Z (final X dropoff value for gapd alignment in bits) is blastn, then it is 50, and if it is a program other than blastn, it is http://www.vn.cn. blast / html / blastcgi
  • a polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM_016725
  • a part of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is deleted, It can be produced by culturing a transformant introduced with an expression vector containing.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or GenBank accession number NM_016725 is also used for the above-mentioned site-specific mutagenesis method, Can be used.
  • polypeptide having a substituted or added amino acid sequence can also be produced by a chemical synthesis method such as the fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) method or the t-butyloxycarbonyl (tBoc) method.
  • Fmoc fluorenylmethyloxycarbonyl
  • tBoc t-butyloxycarbonyl
  • the monoclonal antibody of the present invention (hereinafter also referred to as the antibody of the present invention) or the antibody fragment is an antibody or the antibody fragment that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of human FOLR1 or the three-dimensional structure thereof, Has antitumor activity.
  • the three-dimensional structure of human FOLR1 in the present invention has a structure equivalent to the structure that human FOLR1 including the amino acid sequence represented by the first to 257th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 can take in the natural state. Any structure may be used.
  • the three-dimensional structure that human FOLR1 can take in the natural state refers to the natural three-dimensional structure of human FOLR1.
  • antitumor activity in the present invention examples include ADCC activity and CDC activity.
  • the ADCC activity in the present invention means that an antibody bound to human FOLR1 on the cell surface mainly binds to Fc ⁇ RIIIa on the surface of natural killer cells (hereinafter referred to as NK cells) via the Fc portion.
  • NK cells natural killer cells
  • the antibody of the present invention has ADCC activity not only in FOLR1 high-expressing cells but also in low-expressing cells.
  • the antibody of the present invention exhibits higher ADCC activity against FOLR1 low-expressing cells than conventional anti-FOLR1 monoclonal antibodies.
  • the expression level of FOLR1 in cells can be confirmed by Western blotting, known immunological detection methods, fluorescent cell staining methods, and the like.
  • the ADCC activity of the antibody of the present invention does not depend on the amount of cellular folate uptake.
  • the antibody of the present invention also has ADCC activity against FOLR1-expressing cells with low folate uptake.
  • the amount of folic acid taken up in cells can be confirmed, for example, by using folic acid labeled with a label used in a normal immunological detection or measurement method.
  • the labeling substance include enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase or luciferase, luminescent substances such as acridinium ester or lophine, fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), radioactive substances And isotopes.
  • the CDC activity in the present invention means that an antibody bound to human FOLR1 on the cell surface binds to C1q, which is a component of C1 of the complement system, via the Fc portion.
  • C1q which is a component of C1 of the complement system
  • each complement component of C1 to C9 Activated, and finally C5 to C9 form a pore-forming polymer called a membrane attack complex on the cell membrane to cause cell lysis
  • Specific examples of the antibody include the following monoclonal antibody (i) or (ii) and the antibody fragment.
  • CDRs 1 to 3 each contain the heavy chain of an antibody comprising amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, and CDRs 1 to 3 represent amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 33, 34, and 35, respectively.
  • Antibody comprising the L chain of the antibody comprising (ii) CDR1-3 comprises the H chain of the antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 30, 31, 32, respectively, and CDR1-3 comprise SEQ ID NOs: 33, 34, An antibody comprising an L chain of an antibody comprising the amino acid sequence represented by 35, wherein the cysteine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 (antibody H chain CDR3) is threonine, methionine, isoleucine, valine, phenylalanine, or glutamine Antibody replaced with
  • the monoclonal antibody of the present invention include the following monoclonal antibody (a) and the antibody fragment.
  • the monoclonal antibody of the present invention competes with the monoclonal antibody, specifically recognizes the amino acid sequence of human FOLR1 or the three-dimensional structure thereof, and is the same epitope as the epitope present in human FOLR1 to which the monoclonal antibody binds. And monoclonal antibodies and antibody fragments that bind to.
  • an antibody that competes with a monoclonal antibody refers to an antibody that has an epitope (also referred to as an antigenic determinant) in human FOLR1 that is the same or partially the same as the monoclonal antibody of the present invention and binds to the epitope.
  • the antibody that binds to the same epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds refers to an antibody that recognizes and binds to the same sequence as the amino acid sequence of human FOLR1 recognized by the monoclonal antibody of the present invention.
  • the binding of the monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment to the amino acid sequence of human FOLR1 or the three-dimensional structure thereof means that an enzyme immunoassay (ELISA) using a solid phase of human FOLR1, ELISA, It can be confirmed by methods such as immunohistochemical staining (IHC), known immunological detection methods for cells expressing human FOLR1, and fluorescent cell staining methods for examining the binding properties of a specific antigen and an antibody to the specific antigen.
  • IHC immunohistochemical staining
  • IHC immunohistochemical staining
  • known immunological detection methods for cells expressing human FOLR1 known immunological detection methods for cells expressing human FOLR1
  • fluorescent cell staining methods for examining the binding properties of a specific antigen and an antibody to the specific antigen.
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention binds to the amino acid sequence of human FOLR1 or its three-dimensional structure by surface plasmon resonance using a Biacore system (manufactured by GE Healthcare) or the like.
  • a Biacore system manufactured by GE Healthcare
  • the antibody or the antibody fragment is allowed to flow, bind in an appropriate amount, and multiple concentrations of FOLR1 or a fusion thereof are flowed to measure binding and dissociation. It is preferable to do this.
  • the cell expressing human FOLR1 may be any cell as long as it expresses FOLR1, for example, a cell naturally existing in the human body, a cell line established from a cell naturally existing in the human body, or a gene Examples thereof include cells obtained by recombinant technology.
  • Examples of cells that naturally exist in the human body include cells in which the FOLR1 is expressed in cancer patients, and specifically include ovarian cancer cells, kidney cancer cells, endometrial cancer cells, lung cancer cells. Breast cancer cells, bladder cancer cells, pancreatic cancer cells, colon cancer cells, etc. [Anal Biochem, 2005.338 (2): p. 284-93. ].
  • Examples of cell lines established from cells naturally present in the human body include, for example, FOLR1 among cell lines obtained by establishing cells expressing the FOLR1 obtained from the above cancer patients. An expressing cell line can be mentioned.
  • ovarian cancer-derived cell lines SKOV-3 [American Type Culture Collection (hereinafter referred to as ATCC) number: HTB-77], TOV-112D (ATCC number: CRL-11731), which are cell lines established from humans, ES-2 (ATCC number: CRL-1978), OV-90 (ATCC number: CRL-11732), PA-1 (ATCC number: CRL-1572), Caov-3 (ATCC number: HTB-75), OVISE ( JCRB cell number: JCRB1043), MCAS (JCRB cell number: JCRB0240), NIH: OVCAR-3 (ATCC number: HTB-161), IGR-OV1 (National Cancer Institute), or RMG-1 (JCRB cell) No.: JCRB0172) and the like.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • ES-2 ATCC number: CRL-1978
  • OV-90 ATCC number: CRL-11732
  • PA-1 ATCC number: CRL-1572
  • Caov-3 ATCC number: HTB-
  • the cells obtained by gene recombination technology include, for example, cells expressing FOLR1 obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding FOLR1 into insect cells or animal cells. Etc.
  • Examples of the monoclonal antibody of the present invention include an antibody produced by a hybridoma, or a recombinant antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene.
  • a monoclonal antibody is an antibody that is secreted by an antibody-producing cell of a single clone, recognizes only one epitope (also referred to as an antigenic determinant), and has a uniform amino acid sequence (primary structure) constituting the monoclonal antibody. It is a feature.
  • epitopes include a single amino acid sequence that is recognized and bound by a monoclonal antibody, a three-dimensional structure composed of amino acid sequences, a three-dimensional structure composed of amino acid sequences bound to sugar chains, and a three-dimensional structure composed of amino acid sequences bound to sugar chains.
  • the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds is preferably contained in the 55th to 62nd amino acid sequences of the amino acid sequence of human FOLR1 represented by SEQ ID NO: 1 (NCBI Reference Sequence: NM — 06725.1).
  • the amino acid sequence of the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds preferably contains at least one amino acid selected from the 55th to 62nd amino acids of SEQ ID NO: 1, and the 55th, 56th, 57th, 58th, More preferably, it contains at least one amino acid selected from the 59th, 60th, 61st, and 62nd amino acids.
  • the amino acid sequence of the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds contains at least two or more consecutive amino acids selected from the 55th to 62nd amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 among the amino acid sequences of human FOLR1.
  • it contains at least one amino acid selected from the 55th, 56th, 57th, 58th, 59th, 60th, 61st, and 62nd amino acids, and the 55th to 62nd amino acids of SEQ ID NO: 1. More preferably, it comprises at least two consecutive amino acids selected from the sequence.
  • amino acid sequence of the epitope to which the monoclonal antibody of the present invention binds includes the amino acid sequence containing the 55th to 62nd amino acids of SEQ ID NO: 1.
  • the hybridoma is prepared by, for example, preparing a cell expressing the above-mentioned human FOLR1 as an antigen, inducing an antibody-producing cell having antigen specificity from an animal immunized with the antigen, and further, the antibody-producing cell, myeloma cell, Can be prepared by fusing.
  • the anti-FOLR1 monoclonal antibody can be obtained by culturing the hybridoma or administering the hybridoma cell to an animal to cause the animal to undergo ascites tumor, and separating and purifying the culture medium or ascites.
  • Any animal can be used as the animal to immunize with the antigen as long as it can produce a hybridoma.
  • a mouse, a rat, a hamster, a chicken or a rabbit is used.
  • An antibody produced by a hybridoma prepared by obtaining a cell capable of producing an antibody from such an animal, immunizing the cell in vitro, and then fusing it with a myeloma cell is also an antibody of the present invention. Is included.
  • the recombinant antibody includes an antibody produced by genetic recombination, such as a human chimeric antibody, a human CDR-grafted antibody, a human antibody or an antibody fragment.
  • a recombinant antibody having characteristics of a monoclonal antibody, low antigenicity, and extended blood half-life is preferable as a therapeutic agent.
  • Examples of the recombinant antibody include those obtained by modifying the monoclonal antibody of the present invention using a gene recombination technique.
  • the human chimeric antibody refers to an antibody comprising VH and VL of a non-human animal antibody and a heavy chain constant region (hereinafter referred to as CH) and light chain constant region (hereinafter referred to as CL) of a human antibody.
  • CH heavy chain constant region
  • CL light chain constant region
  • the human chimeric antibody of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of human FOLR1 or its three-dimensional structure, Each of these can be inserted into an animal cell expression vector having genes encoding CH and CL to construct a human chimeric antibody expression vector, which is introduced into animal cells for expression and production.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any CH as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but preferably the hIgG class is used, and hIgG1, hIgG2, hIgG3 belonging to the hIgG class or Any of the subclasses such as hIgG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the human chimeric antibody of the present invention includes a chimeric antibody comprising VH of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 and comprising VL of an antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29. Can be mentioned.
  • the chimeric antibody of the present invention competes with the monoclonal antibody of the present invention, specifically recognizes the amino acid sequence of human FOLR1 or its three-dimensional structure, and has an epitope present in human FOLR1 to which the monoclonal antibody binds. Mention may be made of chimeric antibodies that bind to the same epitope.
  • the human CDR-grafted antibody is sometimes referred to as a humanized antibody, and refers to an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of non-human animal antibodies to appropriate positions of the human antibodies VH and VL.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention has an amino acid sequence of human FOLR1, or a VH and VL CDR amino acid sequence of a monoclonal antibody of a non-human animal that specifically recognizes and binds to its three-dimensional structure.
  • a cDNA encoding the V region transplanted into the VH and VL framework regions (hereinafter referred to as FR) of the human antibody is constructed, and inserted into expression vectors for animal cells having genes encoding the CH and CL of the human antibody, respectively. Then, a human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed and introduced into animal cells to be expressed and produced.
  • FR VH and VL framework regions
  • the CH of the human CDR-grafted antibody may be any as long as it belongs to hIg, but preferably the hIgG class is used, and any subclass such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, or hIgG4 belonging to the hIgG class should be used. Can do.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody may be any CL as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention includes VH of an antibody in which CDR1 to 3 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 30 to 32, and CDR1 to 3 include SEQ ID NOs: 33 to 35. And humanized antibodies that contain the VL of the antibody comprising the amino acid sequence represented.
  • humanized antibody of the present invention include humanized antibodies containing at least one of the following (a) VH and (b) VL.
  • A The amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, or the 18th Leu, 30th Ser, 37th Val, 40th Ala, 41st Pro, 44th Gly, 45th of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 VH of an antibody comprising an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from Leu, 48th Val, 76th Asp, and 95th Val is substituted with another amino acid residue
  • B From the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101, or the 15th Val, 43th Ala, 45th Lys, 71st Phe, 85th Thr, and 87th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 VL of an antibody comprising an amino acid sequence in which at least one selected amino acid residue is replaced with another amino acid residue
  • (1) 18th Leu, 30th Ser, 37th Val, 40th Ala, 41st Pro, 44th Gly, 45th Leu, 48th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 , 76, Asp, and 95th Val include VH containing an amino acid sequence substituted with another amino acid residue (2) 37th Val, 40th Ala, 41st Pro, 44th Gly, 45th Leu, 48th Val, 76th Asp, and 95th in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 VH in which Val contains an amino acid sequence substituted with another amino acid residue (3) 30th Ser, 40th Ala, 44th Gly, 45th Leu, 48th Val, 76th Asp, and 95th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 are the other VH comprising an amino acid sequence substituted with an amino acid residue (4) 37th Val, 40th Ala, 41st Pro, 45th Leu, 48th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 are the other VH comprising an amino acid
  • VH containing a modified amino acid sequence An amino acid sequence in which the 37th Val, the 40th Ala, the 41st Pro, the 45th Leu, and the 48th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 are substituted with other amino acid residues VH included (6) VH including an amino acid sequence in which the 40th Ala, 41st Pro, 45th Leu, and 95th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 are substituted with other amino acid residues (7) VH including an amino acid sequence in which the 41st Pro, 45th Leu, and 95th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 are substituted with other amino acid residues (8) VH including an amino acid sequence in which 40th Ala and 95th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 are substituted with other amino acid residues As the amino acid sequence of VH, for example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, the 18th Leu is Met, the 30th Ser is Thr, the 37th Val is
  • amino acid sequence of VH into which 10 modifications have been introduced for example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, the 18th Leu is Met, the 30th Ser is Thr, the 37th Val to Ile, 40th Ala to Pro, 41st Pro to Ala, 44th Gly to Ala, 45th Leu to Pro, 48th Val to Leu, 76th Asp
  • amino acid sequence in which Asn and 95th Val are replaced with Thr can be mentioned.
  • amino acid sequence of VH into which nine modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (10).
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 the 18th Leu is Met, the 30th Ser is Thr, the 37th Val is Ile, the 40th Ala is Pro, and the 41st Pro is Ala.
  • the 45th Leu is replaced with Pro
  • the 48th Val is replaced with Leu
  • the 76th Asp is replaced with Asn
  • the 95th Val is replaced with Thr.
  • the th Leu is Met
  • the 37th Val is Ile
  • the 40th Ala is Pro
  • the 41st Pro is Ala
  • the 44th Gly is A.
  • the amino acid sequence in which the 45th Leu is replaced with Pro, the 48th Val is replaced with Leu, the 76th Asp is replaced with Asn, and the 95th Val is replaced with Thr.
  • amino acid sequence of VH into which 8 modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (11).
  • 37th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Ile, 40th Ala is Pro, 41st Pro is Ala, 44th Gly is Ala, 45th Leu is Pro
  • the 18th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is represented by Met, Ser in Thr, 37th Val in Ile, 44th Gly in Ala, 45th Leu in Pro, 48th Val in Leu, 76th Asp in Asn, and 95th
  • the amino acid sequence in which Val is replaced with Thr (3)
  • the 18th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Met, the 30th Ser is Thr, 37 An amino acid in which the first Val is Ile, the 41st Pro is Ala, the 45th Le
  • Sequence (4) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, the 18th Leu is Met, the 30th Ser is Thr, the 37th Val is Ile, the 41st Pro is Ala, and the 44th Gly is Ala.
  • the 18th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is represented by Met, The th Ser, Thr, 37th Val to Ile, 41st Pro to Ala, 44th Gly to Ala, 45th Leu ro, the 48th Val is replaced with Leu, and the 76th Asp is replaced with Asn.
  • the 18th Leu is Met
  • the 30th Ser is Thr
  • the 37th Val is Ile
  • the 40th Ala is Pro
  • the 44th Gly is Ala
  • 48th Val is replaced with Leu
  • 76th Asp is replaced with Asn.
  • the 18th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Met
  • the 30th Ser is Thr.
  • Substituted amino acid sequence (10) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, the 18th Leu is Met, the 30th Ser is Thr, and the 37th Va Is replaced by Ile, 40th Ala as Pro, 41st Pro as Ala, 45th Leu as Pro, 48th Val as Leu, and 76th Asp as Asn.
  • the 18th Leu is Met
  • the 30th Ser is Thr
  • the 37th Val is Ile
  • the 40th Ala is Pro
  • the 41st Pro is Ala
  • the 45th Leu is replaced with Pro
  • 48th Val is replaced with Leu.
  • amino acid sequence of VH into which seven modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (5).
  • the 30th Ser in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Thr, the 40th Ala is Pro, the 44th Gly is Ala, the 45th Leu is Pro, and the 48th Val is Leu.
  • the amino acid sequence in which the 76th Asp is replaced with Asn and the 95th Val is replaced with Thr (2)
  • the 40th Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is the Pro
  • the 41st Pro is the Ala
  • 48th Val is replaced with Leu
  • 76th Asp is replaced with Asn
  • 95th Val is replaced with Thr (3) amino acid of SEQ ID NO: 100
  • the 37th Val in the sequence is Ile
  • the 40th Ala is Pro
  • the 41st Pro is Ala
  • the 45th Leu Pro
  • the amino acid sequence in which the Val of the eye is replaced with Leu
  • the 76th Asp is replaced with Asn
  • the 95th Val is replaced with Thr
  • the 37th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is represented by Ile
  • 41st Pro is
  • amino acid sequence of VH into which six modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (6).
  • the 37th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Ile, the 40th Ala is Pro, the 41st Pro is Ala, the 45th Leu is Pro, and the 48th Val is Leu.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 40th Ala in Pro, 41st Pro in Ala, 45th Leu in Pro, 48th
  • the 37th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is set to Ile, and the 41st Pro is set to Leu, 76th Asp to Asn, and 95th Val to Thr.
  • amino acid sequence of VH into which five modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (6).
  • the 37th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Ile, the 40th Ala is Pro, the 41st Pro is Ala, the 45th Leu is Pro, and the 48th Val is Leu.
  • amino acid sequence of VH into which four modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (7).
  • Amino acid sequence in which 40th Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is replaced with Pro, 41st Pro is replaced with Ala, 45th Leu is replaced with Pro, and 95th Val is replaced with Thr (2) The amino acid sequence in which the 41st Pro in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is replaced with Ala, the 45th Leu is replaced with Pro, the 48th Val is replaced with Leu, and the 95th Val is replaced with Thr (3) SEQ ID NO: 100 In the amino acid sequence of the amino acid sequence, 40th Ala is replaced with Pro, 41st Pro is replaced with Ala, 45th Leu is replaced with Pro, and 95th Val is replaced with Thr (4) amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 The 37th Val is Ile, the 41st Pro is Ala, the 45th Leu is Pro, and the 95th Val is Thr.
  • Substituted amino acid sequence (5) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, the 37th Val is replaced with Ile, the 40th Ala is replaced with Pro, the 45th Leu is replaced with Pro, and the 95th Val is replaced with Thr.
  • Sequence (6) An amino acid sequence in which the 37th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is replaced with Ile, the 40th Ala is replaced with Pro, the 41st Pro is replaced with Ala, and the 95th Val is replaced with Thr (7 )
  • the 37th Val is replaced with Ile
  • the 40th Ala is replaced with Pro
  • the 41st Pro is replaced with Ala
  • the 45th Leu is replaced with Pro.
  • amino acid sequence of VH into which three modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (6).
  • Amino acid sequence in which the 41st Pro in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is replaced with Ala, the 45th Leu is replaced with Pro, and the 95th Val is replaced with Thr (2) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 The amino acid sequence in which the 37th Val is replaced with Ile, the 45th Leu is replaced with Pro, and the 95th Val is replaced with Thr.
  • the 40th Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is represented as Pro and the 45th Amino acid sequence in which Leu is replaced with Pro and 95th Val is replaced with Thr (4) 41st Pro in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Ala, 45th Leu is Pro, and 95th Val is Amino acid sequence substituted with Thr (5)
  • the 44th Gly in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Ala, and the 45th Leu is Pro Amino acid sequence in which the 95th Val is replaced with Thr (6)
  • the 45th Leu is replaced with Pro
  • the 48th Val is replaced with Leu
  • the 95th Val is replaced with Thr.
  • amino acid sequence of VH into which two modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (9).
  • Amino acid sequence in which the 18th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is replaced with Met, and the 95th Val is replaced with Thr (2) The 30th Ser in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Thr, And amino acid sequence (3) in which 95th Val is substituted with Thr, 37th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100, and amino acid sequence (4) in which 95th Val is replaced with Thr
  • the 40th Ala is replaced with Pro and the 95th Val is replaced with Thr.
  • the 41st Pro in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is Ala, and the 95th Val is Thr.
  • the amino acid sequence substituted with (6) The 44th Gly in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is replaced with Ala, and the 95th Val Amino acid sequence substituted with Thr (7)
  • the 45th Leu was replaced with Pro
  • the 95th Val was replaced with Thr
  • the 48th amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 The amino acid sequence in which Val is replaced with Leu and the 95th Val is replaced with Thr (9)
  • the 76th Asp is replaced with Asn and the 95th Val is replaced with Thr
  • amino acid sequence of VH into which one modification has been introduced include the following amino acid sequences (1) to (10).
  • Amino acid sequence in which the 18th Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is substituted with Met (2) Amino acid sequence in which the 30th Ser in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is substituted with Thr (3) SEQ ID NO: 100
  • An amino acid sequence in which the 37th Val in the amino acid sequence of (1) is replaced with Ile (4)
  • An amino acid sequence in which the 40th Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is replaced with Pro (5) 41 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 The amino acid sequence in which the No.
  • Pro is substituted with Ala (6)
  • Substituted amino acid sequence (8) Amino in which the 48th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 was substituted with Leu Sequence (9) 76th Asp amino acid sequence is substituted with Asn of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 (10) amino acid sequence 95 th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100 is replaced with Thr
  • the VL contained in the humanized antibody of the present invention the following (1) to (4) are preferable.
  • (1) 15th Val, 43rd Ala, 45th Lys, 71st Phe, 85th Thr, and 87th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 are substituted with other amino acid residues.
  • VL of an antibody comprising a modified amino acid sequence (2) VL of an antibody comprising an amino acid sequence in which the 15th Val, 45th Lys, 71st Phe, and 87th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 are substituted with other amino acid residues (3) VL of an antibody comprising an amino acid sequence in which the 15th Val, 71st Phe, and 87th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 are substituted with other amino acid residues (4) VL of an antibody comprising an amino acid sequence in which 45th Lys and 71st Phe in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 are substituted with other amino acid residues
  • amino acid sequence of the VL for example, the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is Leu, the 43rd Ala is Ser, the 45th Lys is Gln, the 71st Phe is Tyr, An amino acid sequence into which at least one modification selected from modifications in which the 85th Thr is substituted with Gly and the 87th Tyr with Phe is introduced.
  • the amino acid sequence of VL into which six modifications are introduced is, for example, the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 as Leu, the 43rd Ala as Ser, and the 45th Lys. Amino acid sequence in which is substituted with Gln, 71st Phe with Tyr, 85th Thr with Gly, and 87th Tyr with Phe.
  • amino acid sequence of VL introduced with five modifications include the following amino acid sequences (1) to (6).
  • the 43rd Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is Ser, the 45th Lys is Gln, the 71st Phe is Tyr, the 85th Thr is Gly, and the 87th Tyr is Phe.
  • the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is Leu
  • the 43rd Ala is Ser
  • the 71st Phe is Tyr
  • the 85th Thr is Gly
  • amino acid sequence of VL into which four modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (6).
  • Amino acid sequence in which the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is replaced with Leu, the 45th Lys with Gln, the 71st Phe with Tyr, and the 87th Tyr with Phe (2) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101, the 45th Lys is replaced with Gln, the 71st Phe is replaced with Tyr, the 85th Thr is replaced with Gly, and the 87th Tyr is replaced with Phe (3) SEQ ID NO: 101 The amino acid sequence in which the 15th Val is replaced with Leu, the 71st Phe is replaced with Tyr, the 85th Thr is replaced with Gly, and the 87th Tyr is replaced with Phe (4) amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 The 15th Val is Leu, the 45th Lys is Gln, the 85th Thr is Gly, and the 87th Tyr is Phe.
  • Substituted amino acid sequence (5) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101, the 15th Val is replaced with Leu, the 45th Lys is replaced with Gln, the 71st Phe is replaced with Tyr, and the 87th Tyr is replaced with Phe.
  • Sequence (6) An amino acid sequence in which the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is replaced with Leu, the 45th Lys with Gln, the 71st Phe with Tyr, and the 85th Thr with Gly
  • amino acid sequence of VL into which three modifications have been introduced include the following amino acid sequences (1) to (4).
  • An amino acid sequence in which the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is replaced with Leu, the 71st Phe is replaced with Tyr, and the 87th Tyr is replaced with Phe (2) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 The amino acid sequence in which the 45th Lys is replaced with Gln, the 71st Phe is replaced with Tyr, and the 87th Tyr is replaced with Phe.
  • the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is replaced with Leu.
  • amino acid sequence of VL into which two modifications are introduced include the following amino acid sequences (1) to (9).
  • An amino acid sequence in which the 45th Lys in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is replaced with Gln and the 71st Phe is replaced with Tyr (2) The 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is in Leu, And the amino acid sequence in which the 71st Phe is replaced with Tyr (3) the amino acid sequence in which the 43rd Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is replaced with Ser, and the 71st Phe is replaced with Tyr (4) The amino acid sequence in which the 71st Phe in the amino acid sequence is replaced with Tyr and the 85th Thr is replaced with Gly (5) The 71st Phe in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is the Tyr, and the 87th Tyr is the Phe.
  • amino acid sequence of VL into which one modification has been introduced include the following amino acid sequences (1) to (6).
  • Amino acid sequence in which the 15th Val in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is replaced with Leu (2) Amino acid sequence in which the 43rd Ala in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is replaced with Ser (3) SEQ ID NO: 101 The amino acid sequence in which the 45th Lys in the amino acid sequence of (1) was replaced with Gln (4) The amino acid sequence in which the 71st Phe in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 was replaced with Tyr (5) 85 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 Amino acid sequence in which the th Thr is substituted with Gly (6) Amino acid sequence in which the 87th Tyr in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 is substituted with Phe
  • humanized antibody of the present invention include a humanized antibody in which the VH of the antibody includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 98 and / or the VL of the antibody of SEQ ID NO: 94, the VH of the antibody has SEQ ID NO: 98 and / or
  • humanized antibody of the present invention is an epitope present in human FOLR1 that specifically recognizes the amino acid sequence of human FOLR1 or its three-dimensional structure in competition with the monoclonal antibody of the present invention and binds to the monoclonal antibody. And humanized antibodies that bind to the same epitope.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library and a human antibody-producing transgene produced by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering. Also included are antibodies obtained from transgenic animals.
  • the antibody naturally present in the human body can be cultured by, for example, isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, etc., and cloning the lymphocytes that produce the antibody.
  • the antibody can be further purified.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes. From the library, phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be collected using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into an early mouse embryo, and generating it.
  • human antibody-producing hybridomas are obtained and cultured using normal hybridoma production methods performed in non-human animals to produce human antibodies in the culture supernatant. It can be produced by accumulating.
  • the number of amino acids to be deleted, added, substituted and / or inserted is 1 or more, and the number is not particularly limited, but site-specific mutagenesis [Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols, Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)], and the like, and the number of deletions, additions, substitutions, or insertions.
  • the number is preferably 1 to several tens, more preferably 1 to 20, further preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to 5.
  • deletion, addition, substitution, or insertion of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the above antibody indicates the following. That is, it means that there is a deletion, addition, substitution, or insertion of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the antibody.
  • deletion, addition, substitution, or insertion may occur simultaneously, and the amino acid residue to be deleted, added, substituted, or inserted may be either a natural type or a non-natural type.
  • natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, or L-cysteine.
  • amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group C asparagine, glutamine
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G phenylalanine, tyrosine
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2 , Fab ′, single chain antibody (scFv), dimerization V region (diabody), disulfide stabilized V region (dsFv) and CDR. Examples thereof include peptides.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with papain, a proteolytic enzyme (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), about half of the N chain side of the H chain and the entire L chain are disulfides. It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000 bound by binding.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of human FOLR1 or its three-dimensional structure with papain.
  • a Fab may be produced by inserting a DNA encoding the Fab of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and expressing the vector by introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. it can.
  • F (ab ′) 2 was obtained by decomposing the lower part of two disulfide bonds in the hinge region of IgG with pepsin, a proteolytic enzyme, and was constructed by binding two Fab regions at the hinge portion. It is a fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 100,000.
  • F (ab ′) 2 of the present invention can be obtained by treating a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of human FOLR1 or its three-dimensional structure with pepsin.
  • Fab ′ described below can be produced by thioether bond or disulfide bond.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen binding activity of about 50,000 molecular weight obtained by cleaving a disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • the Fab ′ of the present invention is obtained by treating F (ab ′) 2 that specifically recognizes and binds the amino acid sequence of the human FOLR1 of the present invention or its three-dimensional structure with a reducing agent such as dithiothreitol. Can do.
  • DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic cells to express Fab ′. You can also
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P), and has antigen-binding activity.
  • P an appropriate peptide linker
  • the scFv of the present invention obtains cDNA encoding the VH and VL of the monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of the human FOLR1 of the present invention or its three-dimensional structure, and constructs a DNA encoding scFv
  • the DNA can be expressed and produced by inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • Diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL of a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of the human FOLR1 of the present invention, or its three-dimensional structure, and converts the DNA encoding scFv into a peptide
  • the amino acid sequence of the linker is constructed so that its length is 8 residues or less, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic organisms. It can be expressed and manufactured by doing.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted with the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to a known method [Protein Engineering, 7, 697 (1994)].
  • the dsFv of the present invention obtains a cDNA encoding the VH and VL of a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of the human FOLR1 of the present invention or its three-dimensional structure, and constructs a DNA encoding the dsFv
  • the DNA can be expressed and produced by inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the peptide containing CDR is configured to contain at least one region of CDR of VH or VL.
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the peptide comprising the CDR of the present invention constructs DNA encoding the CDRs of VH and VL of a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of human FOLR1 of the present invention or its three-dimensional structure, Is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism to be expressed and produced.
  • the peptide containing CDR can also be manufactured by chemical synthesis methods, such as Fmoc method or tBoc method.
  • the antibody of the present invention includes a radioisotope, a low molecular weight drug, and a high molecular weight drug for the monoclonal antibody or the antibody fragment that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of the human FOLR1 of the present invention or its three-dimensional structure.
  • a derivative of an antibody obtained by chemically or genetically coupling a protein, an antibody drug, or the like is included.
  • the derivative of the antibody in the present invention is a monoclonal antibody that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of the human FOLR1 of the present invention, or its three-dimensional structure, or the N-terminal side of the H chain or L chain of the antibody fragment or C On the terminal side, an appropriate substituent or side chain in the antibody or the antibody fragment, and also in the monoclonal antibody or the sugar chain in the antibody fragment, a radioisotope, a low molecular drug, a high molecular drug, an immunostimulant It can be produced by binding a protein or antibody drug by a chemical method [Introduction to Antibody Engineering, Jinjinshokan (1994)].
  • a DNA encoding a monoclonal antibody or antibody fragment that specifically recognizes and binds to the amino acid sequence of human FOLR1 of the present invention or its three-dimensional structure is linked to a DNA encoding a protein or antibody drug to be bound. And then inserted into an expression vector, introduced into an appropriate host cell, and expressed by a genetic engineering technique.
  • radioisotope examples include 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, and 211 At.
  • the radioisotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like. Further, a substance that chelates a radioisotope may be bound to the antibody.
  • the chelating agent include 1-isothiocyanate benzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA).
  • low molecular weight drugs examples include alkylating agents, nitrosourea agents, antimetabolites, antibiotics, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, hormone therapy agents, hormone antagonists, aromatase inhibitors, P glycoprotein inhibitors, platinum Anticancer agents such as complex derivatives, M-phase inhibitors or kinase inhibitors [Clinical Oncology, Cancer and Chemotherapy (1996)], or steroids such as hydrocortisone and prednisone, non-steroidal agents such as aspirin and indomethacin , Gold thiomalate, penicillamine and other immunomodulators, cyclophosphamide, azathioprine and other immunosuppressive agents, chlorpheniramine maleate and antihistamines such as clemacitine [inflammatory and anti-inflammatory therapy, dentistry publication Inc. (1982)].
  • anticancer agents examples include amifostine (ethiol), cisplatin, dacarbazine (DTIC), dactinomycin, mechlorethamine (nitrogen mustard), streptozocin, cyclophosphamide, ifosfamide, carmustine (BCNU), lomustine (CCNU) ), Doxorubicin (adriamycin), epirubicin, gemcitabine (gemzar), daunorubicin, procarbazine, mitomycin, cytarabine, etoposide, methotrexate, 5-fluorouracil, vinblastine, vincristine, bleomycin, daunomycin, pepromycin, estramtaxel (Taxotea), aldesleukin, asparaginase, busulfan, cal Platin, oxaliplatin, nedaplatin, cladribine, camptothecin, 10-hydroxy-7-ethyl-camp
  • Examples of a method for binding a low molecular weight drug to an antibody include, for example, a method of binding between the drug and the amino group of the antibody via glutaraldehyde, or a drug amino group and the antibody carboxyl group via a water-soluble carbodiimide. And the like.
  • polymer drug examples include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polyvinyl pyrrolidone, pyran copolymer, and hydroxypropyl methacrylamide.
  • a method of linking PEG and an antibody a method of reacting with a PEGylation modifying reagent and the like can be mentioned [Bioconjugate pharmaceutical, Yodogawa Shoten (1993)].
  • the PEGylation modifying reagent include a modifier for lysine to the e-amino group (Japanese Patent Laid-Open No. 61-178926), a modifier for the carboxyl group of aspartic acid and glutamic acid (Japanese Patent Laid-Open No. 56-23587). And a modifier for guanidino group of arginine (Japanese Patent Laid-Open No. 2-117920).
  • the immunostimulant may be, for example, a natural product known as an immunoadjuvant, and specific examples include ⁇ (1 ⁇ 3) glucan (lentinan, schizophyllan), ⁇ -galactosylceramide, etc. Is mentioned.
  • proteins include cytokines or growth factors that activate immunocytes such as NK cells, macrophages, or neutrophils, or toxin proteins.
  • cytokines or growth factors examples include IFN ⁇ , IFN ⁇ , IFN ⁇ , interleukin (hereinafter referred to as IL) -2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, granulocyte colony Examples include stimulating factor (G-CSF), granulocyte / macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), and the like.
  • toxin protein examples include ricin, diphtheria toxin, ONTAK, and the like, and also include protein toxins in which mutations are introduced into the protein to control toxicity.
  • Antibody drugs include antigens that induce apoptosis by antibody binding, antigens associated with tumor pathogenesis or antigens that regulate immune function, and antibodies against antigens involved in angiogenesis of lesion sites.
  • antigens whose apoptosis is induced by antibody binding include, for example, Cluster of differentiation (hereinafter referred to as CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76 , CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), human leukocyte antigen (HLA) -Class II, or Epidermal growth Factor (R) Etc.
  • CD Cluster of differentiation
  • CD20 CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76 , CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80
  • CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 B7.2
  • HLA human leukocyte antigen
  • R Epidermal growth Factor
  • antigens involved in tumor pathogenesis or antigens that regulate immune function include CD40, CD40 ligand, B7 family molecules (CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, or B7-H4).
  • B7 family molecule ligand CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, or BTLA
  • OX-40 OX-40 ligand
  • CD137 tumor necrosis factor (TNF) receptor family molecule (DR4, DR5, TNFR1 or TNFR2)
  • TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor (TRAIL) family molecule TRAIL family molecule receptor family (TRAIL-R1, TRAIL-R2, TR IL-R3 or TRAIL-R4)
  • receptor activator of nuclear factor kappa B (RANK) RANK
  • RANK receptor activator of nuclear factor kappa B
  • RANK nuclear factor kappa B
  • RANK RANK
  • CD-25 folate receptor 4
  • cytokine [IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5 IL-6, IL-10, IL-13, transforming growth factor (TGF) ⁇ , or TNF ⁇ , etc.] receptors for these cyto
  • VEGF vascular endelow growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • PD platelet-induced growth factor
  • TGF ⁇ TGF ⁇
  • IL-8 Ephilin
  • SDF-1 SDF-1
  • a fusion antibody with a protein or an antibody drug comprises linking a cDNA encoding a protein to a cDNA encoding a monoclonal antibody or antibody fragment, constructing a DNA encoding the fusion antibody, and expressing the DNA for prokaryote or eukaryote It is inserted into a vector and expressed by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism to produce a fusion antibody.
  • the amino acid sequence of human FOLR1 of the present invention or its three-dimensional structure is specific.
  • Antibody that recognizes and binds to the N- or C-terminal side of the H or L chain of the antibody fragment, an appropriate substituent or side chain in the antibody or the antibody fragment, and further the monoclonal antibody or the antibody As a drug to be bound to a sugar chain or the like in a fragment, a label used in a normal immunological detection or measurement method can be selected.
  • the label examples include an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase or luciferase, a luminescent substance such as acridinium ester or lophine, or a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC).
  • an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase or luciferase, a luminescent substance such as acridinium ester or lophine, or a fluorescent substance such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • RITC tetramethylrhodamine isothiocyanate
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for diseases involving FOLR1-positive cells containing the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention as an active ingredient.
  • the disease involving FOLR1-positive cells may be any disease involving cells expressing FOLR1, and includes, for example, cancer.
  • cancer examples include blood cancer, breast cancer, uterine cancer, colon cancer, esophageal cancer, stomach cancer, ovarian cancer, lung cancer, kidney cancer, rectal cancer, thyroid cancer, cervical cancer, small intestine cancer, prostate cancer, mesothelioma Tumor, pancreatic cancer and the like, preferably ovarian cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer or mesothelioma.
  • the therapeutic agent of the present invention contains the above-described monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment or derivative thereof as an active ingredient.
  • the therapeutic agent containing the antibody or the antibody fragment or derivative thereof of the present invention may contain only the antibody or the antibody fragment or derivative thereof as an active ingredient. It is desirable to provide a pharmaceutical formulation prepared by any method known in the pharmaceutical arts, mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the administration route is preferably the most effective for treatment, and includes oral administration or parenteral administration such as buccal, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular or intravenous, preferably intravenous. Internal administration can be mentioned.
  • administration forms include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 ⁇ g / kg to 10 mg / kg per day for an adult.
  • the therapeutic agent of the present invention may be used alone, or may be used in combination with at least one therapeutic agent among the aforementioned radioisotopes, low molecular weight drugs, high molecular weight drugs, proteins, or antibody drugs. .
  • the therapeutic agent used in combination with the therapeutic agent of the present invention may be administered simultaneously with the therapeutic agent of the present invention or continuously administered. Also good.
  • the present invention relates to a method for immunological detection or measurement of human FOLR1 or human FOLR1 positive cells using the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention.
  • the immunological detection or measurement method is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • immunological detection or measurement methods for FOLR1 include radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), and luminescence immunoassay ( Examples thereof include a method for detecting or measuring FOLR1 or FOLR1-positive cells by luminescent immunoassay), Western blotting, immunoprecipitation, fluorescent cell staining, immunohistochemical staining, or physicochemical method.
  • RIA radiolabeled immunoassay
  • EIA or ELISA enzyme immunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • luminescence immunoassay examples thereof include a method for detecting or measuring FOLR1 or FOLR1-positive cells by luminescent immunoassay), Western blotting, immunoprecipitation, fluorescent cell staining, immunohistochemical staining, or physicochemical method.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing a disease involving human FOLR1-positive cells, comprising detecting or measuring human FOLR1-positive cells using the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention.
  • the aforementioned known immunological detection methods can be used.
  • an immunoprecipitation method a fluorescent cell staining method, an immune tissue staining method, or the like is used.
  • fluorescent antibody staining methods such as FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) can also be used.
  • the biological sample to be used for detecting or measuring FOLR1-positive cells may include cells expressing FOLR1, such as tissue cells, blood, plasma, serum, pancreatic juice, urine, feces, tissue fluid, or culture fluid. There is no particular limitation as long as there is.
  • the number of FOLR1-positive cells observed in a biological sample to be detected or measured is diagnosed as a disease involving human FOLR1-positive cells.
  • the method used as an index can be mentioned.
  • the present invention relates to a diagnostic agent for diseases involving human FOLR1-positive cells, which contains the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention as an active ingredient.
  • the diagnostic agent of the present invention contains the above-described monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment or derivative thereof as an active ingredient.
  • the diagnostic agent of the present invention may contain a reagent for performing an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the target diagnostic method.
  • the reagent for performing the antigen-antibody reaction include a buffer and a salt.
  • Reagents for detection include reagents used in normal immunological detection or measurement methods such as labeled secondary antibodies that recognize the monoclonal antibody or the antibody fragment, or derivatives thereof, or substrates corresponding to the label. Can be mentioned.
  • Monoclonal Antibody Production Method Preparation of Antigen FOLR1 or FOLR1 serving as an antigen is expressed by using an expression vector containing cDNA encoding FOLR1 full length or a partial length thereof, E. coli, yeast, insect cells, or animal cells. It can be obtained by introducing into the above.
  • FOLR1 can be purified and obtained from cultured human tumor cells, human tissues, etc. that express FOLR1 in large amounts. Further, the tumor cultured cells or the tissue can be used as an antigen as it is.
  • a synthetic peptide having a partial sequence of FOLR1 can be prepared by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method and used as an antigen.
  • the FOLR1 used in the present invention is described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) or Current Protocols in Molecular 7 (such as Current Protocol 7).
  • DNA encoding the FOLR1 can be expressed in a host cell and produced.
  • an expression vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a portion encoding FOLR1 downstream of a promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • a transformant producing the polypeptide can be obtained by introducing the obtained expression vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Any expression vector that can be autonomously replicated in the host cell to be used or integrated into the chromosome and that contains a suitable promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide can be transcribed should be used.
  • the host cell any microorganism that belongs to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cells, or animal cells can be used so long as it can express the target gene.
  • the expression vector When a prokaryote such as Escherichia coli is used as a host cell, the expression vector is capable of autonomous replication in the prokaryote, and at the same time contains a promoter, a ribosome binding sequence, DNA containing a FOLR1 coding portion, and a transcription termination sequence.
  • a vector is preferred.
  • the expression vector does not necessarily require a transcription termination sequence, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the expression vector may contain a gene that controls the promoter.
  • the expression vector it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence (also referred to as SD sequence), which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • SD sequence also referred to as SD sequence
  • the base sequence of the DNA encoding the FOLR1 can be substituted with a base so as to be an optimal codon for expression in the host, thereby improving the production rate of the target FOLR1.
  • Any expression vector can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 above, Roche Diagnostics
  • pKK233-2 Pharmacia
  • pSE280 manufactured by Invitrogen
  • pGEMEX-1 manufactured by Promega
  • pQE-8 manufactured by Qiagen
  • pKYP10 Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-110600
  • pKYP200 Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]
  • pLSA1 Agric Biol. Chem. 53, 277 (1989)
  • pGEL1 Proc. Natl.
  • any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, or T7 promoter can be mentioned.
  • An artificially designed and modified promoter such as a tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, or let I promoter in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • Examples of host cells include E. coli XL-1 Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, or E. coli DH5 ⁇ .
  • Any method can be used for introducing an expression vector into a host cell as long as it is a method for introducing DNA into the host cell to be used.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)].
  • any expression vector can be used as long as it can function in animal cells.
  • Any promoter can be used as long as it can function in animal cells.
  • a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter. , Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter, or Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early
  • IE SV40 early promoter
  • a retroviral promoter e.g., a promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retroviral promoter.
  • Metallothionein promoter e.g., Metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter, or Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer.
  • host cells examples include human leukemia cells Namalwa cells, monkey cells COS cells, Chinese hamster ovary cells CHO cells (Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Sci.USA, 77, 4216 (1980); Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 60, 1275 (19 8); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell genetics, Appendix I, II (pp.
  • Any method can be used for introducing an expression vector into a host cell as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • electroporation method [Cytotechnology 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 227075/1990
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a microorganism having an expression vector incorporating DNA encoding FOLR1 obtained as described above, or a transformant derived from an animal cell or the like is cultured in a medium, and the FOLR1 is produced and accumulated in the culture, By collecting from the culture, FOLR1 can be produced.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • FOLR1 When expressed in cells derived from eukaryotes, FOLR1 with an added sugar or sugar chain can be obtained.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter culturing a microorganism transformed with an expression vector using isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside, etc. Indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Examples of a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host include a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (1950)], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum (FBS) or the like to these mediums.
  • RPMI 1640 medium The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]
  • Eagle's MEM medium Science 122, 501 (1952)]
  • Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)]
  • 199 medium Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73, 1 (19
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and 5% CO 2 .
  • a method for producing FOLR1 there are a method for producing it in the host cell, a method for producing it outside the host cell, and a method for producing it on the outer membrane of the host cell, and changing the structure of the host cell to be used or the FOLR1 to be produced. Thus, an appropriate method can be selected.
  • the amount of FOLR1 produced can be increased by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075).
  • the obtained FOLR1 can be isolated and purified as follows, for example.
  • the cells When FOLR1 is expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then used with an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, or dynomill. The cells are disrupted to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical), cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Methods such as electrophoresis, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose, phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, or electrophoresis such as isoelectric focusing Can be used alone or in combination to obtain purified preparations. Can.
  • a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (manufact
  • FOLR1 When FOLR1 is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cell is collected and then disrupted in the same manner as described above, and centrifuged to collect the FOLR1 insoluble substance as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble FOLR1 is solubilized with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the solubilized solution, the FOLR1 is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified polypeptide preparation can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the derivative such as FOLR1 or a sugar-modified product thereof When a derivative such as FOLR1 or a sugar-modified product thereof is secreted outside the cell, the derivative such as FOLR1 or a sugar-modified product thereof can be recovered in the culture supernatant.
  • a soluble fraction can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified preparation can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. it can.
  • FOLR1 used in the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method.
  • chemical chemistry is performed using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, Perceptive, or Shimadzu. It can also be synthesized.
  • Immunization is performed by administering the antigen subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to the animal together with an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (Keyhole Limothemoyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH Keyhole Limothemoyanin
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. An animal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of antibody producing cells for fusion.
  • tissues containing antibody-producing cells such as the spleen are removed from the immunized animal, and antibody-producing cells are collected.
  • the spleen is shredded and loosened, and then centrifuged, and the erythrocytes are removed to obtain antibody producing cells for fusion.
  • a cell line obtained from a mouse is used.
  • the myeloma cells are subcultured in normal medium [RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS, and 8-azaguanine], and subcultured into normal medium 3 to 4 days before cell fusion. On the day of fusion, secure a cell count of 2 ⁇ 10 7 or more.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • PBS disodium phosphate 1. 83 g, monopotassium phosphate 0.21 g, sodium chloride 7.65 g, distilled water 1 liter, pH 7.2
  • a mixture of polyethylene glycol-1000 (PEG-1000), MEM medium and dimethyl sulfoxide is added at 37 ° C. with stirring.
  • the cells are gently suspended in the HAT medium [normal medium supplemented with hypoxanthine, thymidine, and aminopterin] on the antibody-producing cells for fusion. This suspension is cultured for 7-14 days at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • a part of the culture supernatant is extracted, and a cell group that reacts with an antigen containing FOLR1 and does not react with an antigen not containing FOLR1 is selected by a hybridoma selection method such as a binding assay described later.
  • cloning was repeated twice by the limiting dilution method (first time was HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time normal medium was used), and a stable and strong antibody titer was observed.
  • One is selected as a monoclonal antibody-producing hybridoma.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (4) is cultured in an RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS, the supernatant is removed by centrifugation, and the suspension is suspended in a Hybridoma-SFM medium and cultured for 3 to 7 days. To do.
  • the obtained cell suspension is centrifuged, and purified using a protein A-column or protein G-column from the obtained supernatant, and the IgG fraction is collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • 5% Daigo GF21 can be added to the Hybridoma-SFM medium.
  • the antibody subclass is determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit.
  • the amount of protein is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm.
  • the monoclonal antibody is selected by a binding assay by the enzyme immunoassay shown below and a kinetic analysis by Biacore.
  • (6-a) Binding assay As an antigen, a gene-introduced cell or a recombinant obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding FOLR1 obtained in (1) into Escherichia coli, yeast, insect cells, or animal cells, etc. A protein or a purified polypeptide or partial peptide obtained from human tissue is used. When the antigen is a partial peptide, a conjugate with a carrier protein such as BSA or KLH is prepared and used.
  • a carrier protein such as BSA or KLH
  • a test substance such as serum, hybridoma culture supernatant or purified monoclonal antibody is dispensed as the first antibody and allowed to react.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radiation compound or the like is dispensed and reacted as a second antibody.
  • a reaction is performed according to the labeling substance of the second antibody, and a monoclonal antibody that specifically reacts with the immunogen is selected.
  • a monoclonal antibody that competes with the anti-FOLR1 monoclonal antibody of the present invention and binds to FOLR1 can be obtained by adding a test antibody to the above-described binding assay system and allowing it to react. That is, by screening for an antibody that inhibits the binding of a monoclonal antibody when a test antibody is added, a monoclonal antibody that competes with the acquired monoclonal antibody for binding to the amino acid sequence of FOLR1 or its three-dimensional structure is obtained. be able to.
  • an antibody that binds to the same epitope as the epitope recognized by the monoclonal antibody that binds to the amino acid sequence of FOLR1 of the present invention or its three-dimensional structure identifies the epitope of the antibody obtained by the above-described binding assay system,
  • a partial synthetic peptide of the identified epitope or a synthetic peptide mimicking the three-dimensional structure of the epitope can be prepared and immunized.
  • human FOLR1 is immobilized on a sensor chip by, for example, an amine coupling method, and then purified monoclonal antibodies having a plurality of known concentrations are flowed to measure binding and dissociation.
  • the obtained data is subjected to kinetic analysis using a software that is included with the device, using a binding binding model, and various parameters are acquired.
  • a recombinant antibody expression vector is an expression vector for animal cells in which DNAs encoding CH and CL of a human antibody are incorporated, and the expression vector for animal cells is human. It can be constructed by cloning DNAs encoding antibody CH and CL, respectively.
  • Any human antibody CH and CL can be used for the C region of a human antibody.
  • ⁇ 1 subclass CH and ⁇ class CL of human antibodies are used.
  • cDNA is used for the DNA encoding CH and CL of the human antibody, chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 [Cytotechnol. 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]
  • pSG1bd2-4 [Cytotechnol. 4, 173 (1990)]
  • pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol. 13, 79 (1993)].
  • the promoter and enhancer include the SV40 early promoter [J. Biochem. 101, 1307 (1987)], Moloney murine leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun. 149, 960 (1987)], or an immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and an enhancer [Cell, 33, 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors balance the ease of construction of recombinant antibody expression vectors, the ease of introduction into animal cells, and the balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells.
  • a vector for expressing a recombinant antibody of a type (tandem type) in which the antibody H chain and L chain are present on the same vector [J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)]
  • pKANTEX93 International Publication No. 97/10354
  • pEE18 [Hybridoma, 17, 559 (1998)]
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing non-human antibodies, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having cDNA encoding VH or VL is isolated.
  • the entire base sequence of VH or VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, respectively, and the total amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence, respectively.
  • non-human animal for producing a hybridoma cell producing a non-human antibody a mouse, rat, hamster, rabbit or the like is used, but any animal can be used as long as it can produce a hybridoma cell. .
  • RNA easy kit manufactured by Qiagen
  • oligo (dT) -immobilized cellulose column method For preparation of mRNA from total RNA, oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989)], or Oligo-dT> SurSpurP Use a kit such as (Takara Bio).
  • mRNA can be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized using mRNA extracted from a hybridoma cell as a template is incorporated.
  • ZAP ExPress [Stratesies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ ZAPIII (Stratagene), ⁇ gt10, ⁇ gt11: DNA Practical Approach, I, 49 (1985)], Lambda BlueMid (manufactured by Clontech), ⁇ Ex Cell, pT7T3-18U (manufactured by Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol. 3, 280 (1983)], or pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli into which a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector is introduced can be used as long as it can introduce, express and maintain the cDNA library.
  • XL-1 Blue MRF [Stratesies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol. 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol. 16, 118 (1966)] or JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].
  • PCR method Polymerase chain reaction method, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Lab 198). , Current Protocols, Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)] can also be used to prepare cDNA encoding VH or VL.
  • the selected cDNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and the nucleotide sequence of the cDNA is determined by a commonly used nucleotide sequence analysis method.
  • a base sequence analysis method include the dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], etc., followed by ABI PRISM 3700 (manufactured by PE Biosystems) or A.P. L. F. An automatic base sequence analyzer such as a DNA sequencer (Pharmacia) is used.
  • VH and VL of an antibody including a secretory signal sequence all amino acid sequences of known antibody VH and VL [A. L. F. DNA, US Dept. By comparing with Health and Human Services (1991)], the length of the secretory signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated, and further, the subgroup to which they belong can be known.
  • the amino acid sequences of CDRs of VH and VL are also the amino acid sequences of VH and VL of known antibodies [A. L. F. DNA, US Dept. It can be found by comparing with Health and Human Services (1991)].
  • VH and VL complete amino acid sequences for example, BLAST method [J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)] and the like, and whether the complete amino acid sequences of VH and VL are novel can be confirmed.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid, and VH and VL cDNAs designed to have appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL of the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1). Each is cloned to construct a human chimeric antibody expression vector.
  • a recombinant antibody expression vector obtained in (1) by amplifying cDNA encoding non-human antibody VH or VL by a PCR method using a synthetic DNA having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at both ends, respectively. can also be cloned.
  • a cDNA encoding VH or VL of human CDR-grafted antibody can be constructed as follows.
  • the amino acid sequence of the VH or VL FR of the human antibody to be transplanted with the VH or VL CDR amino acid sequence of the non-human antibody is selected. Any amino acid sequence can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • FR amino acid sequences of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank, or common amino acid sequences of each subgroup of FRs of human antibodies [A. L. F. DNA, US Dept. Health and Human Services (1991)] are used.
  • an FR amino acid sequence having as high a homology as possible (at least 60% or more) with the VH or VL FR amino acid sequence of the original antibody is selected.
  • the amino acid sequence of the CDR of the original antibody is transplanted to the amino acid sequence of the FR of VH or VL of the selected human antibody, and the amino acid sequence of VH or VL of the human CDR-grafted antibody is designed.
  • Frequency of codon usage of the designed amino acid sequence in the base sequence of the antibody gene [A. L. F. DNA, US Dept. Considering Health and Human Services (1991)]
  • the DNA sequence is converted into a DNA sequence, and a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL of the human CDR-grafted antibody is designed.
  • the human CDR-grafted antibody VH can be easily added to the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1).
  • cDNA encoding VL can be cloned.
  • each H chain and L chain full-length synthetic DNA synthesized as one DNA based on the designed DNA sequence can be carried out by using each H chain and L chain full-length synthetic DNA synthesized as one DNA based on the designed DNA sequence.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), the base sequence is determined by the same method as described in (2), and the desired human CDR is obtained.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH or VL of the transplanted antibody is obtained.
  • a human CDR-grafted antibody can be obtained by transplanting only non-human antibody VH and VL CDRs into human antibody VH and VL FRs. The binding activity is reduced compared to the original non-human antibody [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
  • amino acid residues directly involved in binding to the antigen amino acid residues that interact with the CDR amino acid residues, and Decreased by maintaining the three-dimensional structure of the antibody, identifying amino acid residues indirectly involved in antigen binding, and substituting those amino acid residues with the amino acid residues of the original non-human antibody Antigen binding activity can be increased.
  • the amino acid residues of FR of human antibody VH and VL can be modified by performing the PCR reaction described in (4) using the synthetic DNA for modification.
  • the base sequence is determined by the method described in (2) and it is confirmed that the target modification has been performed.
  • a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at the 5 ′ end of the synthetic DNA located at both ends are introduced into the human CDR-grafted antibody expression vector obtained in (1), and cloned so that they are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding CH or CL of the human antibody.
  • Any host cell capable of expressing the recombinant antibody can be used as the host cell into which the expression vector is introduced.
  • COS-7 cells ATCC number: CRL1651
  • CRL1651 Method of Nucleic Acids. Res. , CRC Press, 283 (1991)
  • DEAE-dextran method Methods in Nucleic Acids Res. , CRC Press (1991)
  • lipofection Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • the expression amount and antigen binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant are measured by enzyme immuno-antibody method [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-ALaboratory Cold Spring Harbor Laboratory (1988), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)] and the like.
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as a host cell into which the recombinant antibody expression vector is introduced.
  • CHO-K1 ATCC number: CCL-61
  • DUkXB11 ATCC number: CCL-9096
  • Pro-5 ATCC number: CCL-1781
  • CHO-S Life Technologies, Cat # 11619
  • mice 20 also referred to as YB2 / 0
  • mouse myeloma cell NS0 mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14
  • mouse P3-X63-Ag8653 cell ATCC number: CRL1580
  • dihydrofolate reductase gene Deficient CHO cells [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)], Lec13 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55 (1986)] that has acquired lectin resistance, CHO cells deficient in the ⁇ 1,6-fucose transferase gene (International Publication No. 2005 / 035586, WO 02/31140), rat YB2 / 3HL. P2. G11.16 Ag. 20 cells (ATCC number: CRL1662) are used.
  • a protein such as an enzyme involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose or a sugar chain modification in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of an N-glycoside-linked complex sugar chain
  • a transformant that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 sulfate (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891). ).
  • Examples of the medium for animal cell culture include RPMI1640 medium (manufactured by Invitrogen), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical), EX-CELL301 medium (manufactured by JRH), IMDM medium (manufactured by Invitrogen), Hybridoma-SFM medium ( Invitrogen) or a medium obtained by adding various additives such as FBS to these mediums.
  • the obtained transformant is cultured in a medium to express and accumulate the recombinant antibody in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like.
  • the transformed strain can increase the expression level of the recombinant antibody using a DHFR amplification system (Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891).
  • the recombinant antibody is purified from the culture supernatant of the transformed strain using a protein A-column [Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A LaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratoryLaboratory. (1988)].
  • methods used in protein purification such as gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration can be combined.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain, or the whole antibody molecule is determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and practicies, Third]. edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • the binding activity to the FOLR1-expressing cell line is as described in 1. Measurement is performed using a surface plasmon resonance method using a binding assay described in (6-a) and a Biacore system described in (6-b). In addition, the fluorescent antibody method [Cancer Immunol. Immunother. 36, 373 (1993)].
  • CDC activity or ADCC activity against an antigen-positive cultured cell line is measured by a known measuring method [Cancer Immunol. Immunother. 36, 373 (1993)].
  • Method for Controlling Effector Activity of Antibody As a method for controlling the effector activity of the anti-FOLR1 monoclonal antibody of the present invention, an N-linked complex sugar chain that binds to the 297th asparagine (Asn) of the Fc region of the antibody is used. Methods for controlling the amount of fucose (also referred to as core fucose) that binds ⁇ 1,6 to N-acetylglucosamine (GlcNAc) present (International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 2002/31140, International Publication No. 00/61739) No.), or a method of controlling by modifying amino acid residues in the Fc region of an antibody. The effector activity can be controlled by any method using the anti-FOLR1 monoclonal antibody of the present invention.
  • the effector activity refers to antibody-dependent activity caused through the Fc region of an antibody, and includes ADCC activity, CDC activity, or antibody-dependent phagocytosis by phagocytic cells such as macrophages or dendritic cells (Antibody-dependent phagocytosis). , ADP activity) and the like are known.
  • cancer cells as targets, human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) as effectors, and cancer cell-specific antibodies are mixed, incubated for about 4 hours, and then released as an indicator of cell damage.
  • the lactate dehydrogenase (LDH) that has been produced can be measured.
  • human PBMC is mixed with an antibody recognizing a blood cell-specific antigen such as CD20, and after incubation, the decrease in the number of cells by measuring free LDH or flow cytometry is measured as effector activity.
  • cancer cell-specific ascites is mixed with a cancer cell-specific antibody and incubated, and then the free LDH measurement or the decrease in the number of cells by flow cytometry can be measured as the effector activity.
  • the effector activity of the antibody can be increased or decreased.
  • expressing the antibody using CHO cells deficient in the ⁇ 1,6-fucose transferase gene An antibody to which fucose is not bound can be obtained.
  • Antibodies without fucose binding have high ADCC activity.
  • the antibody is expressed using a host cell into which an ⁇ 1,6-fucose transferase gene has been introduced.
  • an antibody to which fucose is bound can be obtained.
  • An antibody to which fucose is bound has a lower ADCC activity than an antibody to which fucose is not bound.
  • ADCC activity or CDC activity can be increased or decreased by modifying amino acid residues in the Fc region of the antibody.
  • the CDC activity of an antibody can be increased by using the amino acid sequence of the Fc region described in US Patent Application Publication No. 2007/0148165.
  • ADCC activity or CDC activity can be increased or decreased.
  • an antibody in which the effector activity of the antibody is controlled can be obtained by using the above method in combination with one antibody.
  • the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention can be used for the treatment of diseases involving FOLR1-positive cells.
  • the therapeutic agent containing the monoclonal antibody or the antibody fragment or derivative thereof of the present invention may contain only the antibody or the antibody fragment or derivative thereof as an active ingredient. It is provided as a pharmaceutical preparation produced by a method known in the technical field of pharmaceutics, mixed with one or more physically acceptable carriers.
  • Examples of the administration route include oral administration and parenteral administration such as intraoral, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal.
  • Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules.
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Manufactured using preservatives such as esters, or flavors such as strawberry flavor or peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders or granules include excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin is used as an additive.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays.
  • the injection is produced using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are produced using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat, or carboxylic acid.
  • the propellant is manufactured using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, and in which the monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment is dispersed as fine particles to facilitate absorption.
  • a carrier for example, lactose or glycerin is used. It can also be produced as an aerosol or dry powder.
  • Method for diagnosing disease using the anti-FOLR1 monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention FOLR1 is related by detecting or measuring cells expressing FOLR1 or FOLR1 using the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention. The disease can be diagnosed.
  • the diagnosis of cancer which is one of the diseases associated with FOLR1, can be performed by detecting or measuring FOLR1 as follows, for example.
  • Diagnosis can be made by detecting FOLR1 expressed in cancer cells in a patient's body, metastasis, or cancerous ascites using an immunological technique such as a flow cytometer. .
  • the immunological technique is a method for detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • a radioactive substance labeled immunoassay method an enzyme immunoassay method, a fluorescence immunoassay method, a luminescence immunoassay method, a Western blot method, a physicochemical method, or the like is used.
  • the radioactive substance-labeled immunoantibody method is, for example, a method in which an antibody of the present invention or the antibody fragment thereof is reacted with an antigen or a cell expressing the antigen and further reacted with a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment. Measure with a scintillation counter.
  • an antigen or a cell expressing the antigen is reacted with the antibody of the present invention or the antibody fragment, and further, a labeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment is reacted, and then a coloring dye. Is measured with an absorptiometer. For example, a sandwich ELISA method is used.
  • a known enzyme label [enzyme immunoassay, Medical School (1987)] can be used.
  • enzyme immunoassay Medical School (1987)
  • alkaline phosphatase label, peroxidase label, luciferase label, biotin label or the like is used.
  • the sandwich ELISA method is a method in which after binding an antibody to a solid phase, an antigen to be detected or measured is trapped, and a second antibody is reacted with the trapped antigen.
  • the ELISA method two types of antibodies or antibody fragments that recognize an antigen to be detected or measured and having different antigen recognition sites are prepared, and the first antibody or antibody fragment is pre-plated on a plate (for example, 96 Next, the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin.
  • the above-mentioned antibody-adsorbed plate is reacted with cells or a lysate thereof, tissue or a lysate thereof, cell culture supernatant, serum, pleural effusion, ascites or ocular fluid, etc.
  • the detected monoclonal antibody or antibody fragment is reacted, and a detection reaction corresponding to the labeling substance is performed.
  • the antigen concentration in the test sample is calculated from a calibration curve prepared by diluting antigens with known concentrations stepwise.
  • an antibody used for the sandwich ELISA method either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab ′, or F (ab ′) 2 may be used.
  • the combination of two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments that recognize different epitopes, or a combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody or antibody fragment.
  • the fluorescence immunoassay is measured by the method described in the literature [Monoclonal Antibodies-Principles and practices, Third edition, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)].
  • a label used in the fluorescence immunoassay for example, a known [fluorescent antibody method, Soft Science (1983)] fluorescent label can be mentioned.
  • FITC or RITC can be used.
  • Luminescent immunoassay is performed by the method described in the literature [Bioluminescence and chemiluminescence, clinical examination 42, Yodogawa Shoten (1998)].
  • Examples of the label used in the luminescence immunoassay include known phosphor labels, such as acridinium ester and lophine.
  • an antigen or cells expressing the antigen are fractionated with SDS (sodium dodecyl sulfate) -PAGE [Antibodies-A Laboratory Manual Spring Spring Laboratory (1988)], and then the gel is polyvinylidene fluoride (PVDF).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • a cell or tissue expressing a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is lysed, and 0.1 to 30 ⁇ g of protein per lane is electrophoresed by SDS-PAGE under reducing conditions.
  • the migrated protein is transferred to a PVDF membrane and reacted with PBS containing 1 to 10% BSA (hereinafter referred to as BSA-PBS) for 30 minutes at room temperature to perform a blocking operation.
  • BSA-PBS PBS containing 1 to 10% BSA
  • the monoclonal antibody of the present invention was reacted, washed with PBS containing 0.05 to 0.1% Tween-20 (hereinafter referred to as Tween-PBS), and peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG was washed with 2 at room temperature. Let react for hours.
  • the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is detected by washing with Tween-PBS and detecting the band to which the monoclonal antibody is bound using ECL Western Blotting Detection Reagents (manufactured by Amersham).
  • ECL Western Blotting Detection Reagents manufactured by Amersham.
  • an antibody used for detection by Western blotting an antibody capable of binding to a polypeptide that does not have a natural three-dimensional structure is used.
  • the physicochemical method is performed by, for example, forming an aggregate by binding the antigen FOLR1 and the monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment, and detecting the aggregate.
  • Other physicochemical methods include, for example, the capillary method, the one-dimensional immunodiffusion method, the immunoturbidimetric method, or the latex immunoturbidimetric method [Presentation of clinical testing method, Kanbara Publishing (1998)].
  • Latex immunoturbidimetry is a method in which an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m is used to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antigen or antibody. Scattered light increases and transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrating sphere turbidity, the antigen concentration or the like in the test sample is measured.
  • an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m
  • Examples of the method for determining the therapeutic efficacy of the antibody before the start of treatment using the antibody of the present invention or the antibody fragment include the following.
  • cancerous ascites is collected from the patient's body, the antibody of the present invention or the antibody fragment is added to the suspension, and antitumor activity is measured after a certain time.
  • antitumor activity is observed as a result of the measurement, it can be determined before the start of treatment that the antibody or the antibody fragment of the present invention is effective for treating a patient having ascites.
  • FOLR1 Human FOLR1
  • FOLR2 human FOLR2
  • FOLR3 human FOLR3
  • # 100015838 Open Biosystem
  • FOLR1 expression vector First, the FOLR1 gene was amplified by PCR using primers FOLR1-F (SEQ ID NO: 2) and FOLR1-R (SEQ ID NO: 3). After confirming that the amplified gene was the target sequence, it was ligated with the vector pKANTEX93 (International Publication No. 97/10354) with restriction enzymes EcoRI and KpnI recognition sequences to construct a FOLR1 gene expression vector.
  • pKANTEX93 International Publication No. 97/10354
  • DHFR gene-deficient CHO (Chinese hamster ovary) cell DG44 strain (CHO / DG44 cells) was obtained from Mitsubishi Chemical Corporation / Yokohama Research Institute, and used to construct FOLR1-expressing cells.
  • 10% inactivated dialyzed fetal bovine serum (dFBS) (GIBCO), HT supplement (GIBCO), and IMDM (GIBCO) (culture medium) supplemented with 50 ⁇ g / mL gentamicin were used.
  • the FOLR1 gene expression vector was cleaved by AatII treatment, and the obtained linear DNA was purified and dissolved in sterilized water.
  • This DNA was introduced into CHO / DG44 cells by electroporation, and cultured for about 3 days in a culture medium from which HT supplement was removed.
  • drug-resistant cells were selected with selective media [IMDM, 10% inactivated dFCS, 0.5 mg / mL G418 (Nacalai), and 50 ⁇ g / mL gentamicin].
  • the selected drug resistant cells were seeded in a 96-well plate at 75 cells / plate and further cultured in a selective medium for about 2 weeks. Each well was observed under a microscope, and single clones were sequentially expanded and cultured.
  • RNAiso Plus (Takara) was added to several mm square of frozen kidney tissue, and the tissue was ground using a homogenizer pestle (AsOne). After standing at room temperature for 5 minutes, total RNA was obtained according to the recommended protocol of RNAiso plus and dissolved in DEPC-treated water (invitrogen). Next, in order to synthesize cDNA from total RNA, reverse transcription was performed using PrimeScript II 1st strand cDNA synthesis kit (Takara) and oligo dT as primers.
  • the cynomolgus FOLR1 gene was amplified by PCR using the primers CyFOLR1-F (SEQ ID NO: 4) and CyFOLR1-R (SEQ ID NO: 5), which were designed with reference to human FOLR1 (NM_000802) and rhesus monkey FOLR1 (XM_001114655). .
  • the PCR sample was electrophoresed on a 2% agarose gel, and the amplified band was cut out and collected with a QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN).
  • QIAGEN QIAquick Gel Extraction kit
  • NA-2000 KURABO
  • FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc, and cynomolgus monkey FOLR1-Fc expression vectors FOLR1 (1-233 amino acids), FOLR2 (1-227 amino acids), FOLR3 (1-243 amino acids), and cynomolgus FOLR1 (1 Recombinant protein (hereinafter referred to as FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc, and cynomolgus FOLR1-Fc) in which Human IgG1 Fc (Hinge part and CH2-CH3 part) is added to the C-terminus of -233 amino acids) PCR was performed to construct the vector to be used.
  • FOLR1-Fc-F SEQ ID NO: 8
  • FOLR1-Fc-R SEQ ID NO: 9
  • FOLR2-Fc-F SEQ ID NO: 10
  • FOLR3-Fc-F SEQ ID NO: 12
  • FOLR3-Fc-R SEQ ID NO: 13
  • CyFOLR1-Fc-F SEQ ID NO: 14
  • CyFOLR1-Fc-R SEQ ID NO: 15
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the amplified gene was isolated using QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN), and subcloned with TA cloning kit (Invitrogen). A vector having the target sequence was selected, and the target sequence was excised with EcoRI and AhdI.
  • the Human IgG1 Fc region was excised from pKANTEX93 with AhdI and SpeI.
  • the excised target sequence and Human IgG1 Fc region were ligated to pKANTEX93 treated with EcoRI and SpeI to obtain FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc, and cynomolgus FOLR1-Fc recombinant protein expression vectors.
  • Example 7 Preparation of FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc, and cynomolgus monkey FOLR1-Fc expressing cells CHO / Ms704 cells (International Publication No. 03/85107), which were FUT8 knockout CHO / DG44 cells, were used.
  • the FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc and cynomolgus monkey FOLR1-Fc expression vectors prepared in Example 6 were used. Culture during normal passage, gene transfer, and selection of drug-resistant cells were performed in the same manner as in Example 3.
  • the selected drug-resistant cells are sequentially expanded and then the cells are washed with PBS, and the recovery medium [EX-CELL 302 Serum-Free Medium for CHO Cells (Sigma Aldrich), 6 mmol / L L-glutamine (invitrogen), and 50 ⁇ g / ML gentamicin] for 1 week.
  • the culture supernatant was collected and subjected to the next purification.
  • the culture supernatant is passed through a column, and the column is washed with PBS, and then an elution buffer (0.1 M citrate monohydrate-NaOH / pH 5.0, 3 .5, 3.0).
  • the eluted fraction was immediately neutralized with a neutralization buffer (2M Tris-HCl / pH 8.5).
  • the absorbance (280 nm) of each fraction was measured, and a continuous fraction having a high measured value was collected as an antibody fraction. Dialyzed with PBS, and passed through a 0.22 ⁇ m filter as purified protein.
  • Concentrations were calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm to 2.2 for FOLR1-Fc, 2.3 for FOLR2-Fc, 2.1 for FOLR3-Fc, and 2.2 for cynomolgus monkey FOLR1-Fc, respectively.
  • FOLR1-mycHis expression vector PCR was performed to construct a vector that expresses a recombinant protein (hereinafter referred to as FOLR1-mycHis) having a myc and His tag added to the C-terminus of FOLR1 (1-233 amino acids).
  • FOLR1-mycHis a recombinant protein having a myc and His tag added to the C-terminus of FOLR1 (1-233 amino acids.
  • FOLR1-mH-F SEQ ID NO: 16
  • FOLR1-mH-R SEQ ID NO: 17
  • the target sequence was purified from the PCR product and ligated to pKANTEX93 treated with EcoRI and SpeI to obtain a FOLR1-mycHis expression vector.
  • Example 10 Construction of FOLR1-mycHis-expressing cells CHO / DG44 cells were used for the construction of FOLR1-mycHis-expressing cells.
  • the FOLR1-mycHis expression vector prepared in Example 9 was used. Culture during normal passage, gene transfer, selection of drug-resistant cells and collection of the culture supernatant were carried out in the same manner as in Example 7.
  • FOLR1-mycHis Purification of FOLR1-mycHis was purified from the culture supernatant using Ni-NTA Agarose (invitrogen) packed in a column. First, a wash buffer (50 mmol / L NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 300 mmol / L NaCl) is passed through the column, the culture supernatant is passed through the column, the column is washed with the wash buffer, and then the elution buffer (wash buffer). To which 500 mmol / L imidazole was added).
  • a wash buffer 50 mmol / L NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 300 mmol / L NaCl
  • the absorbance (280 nm) of the eluted fraction was measured, and a continuous fraction having a high measured value was collected as a FOLR1-mycHis fraction. Dialysis was performed with PBS, and a 0.22 ⁇ m filter was used as purified FOLR1-mycHis. The concentration was calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm to 2.8.
  • Example 12 Immunization of rats Four-week-old female SD rats were immunized to obtain monoclonal antibodies against FOLR1. First, 50 ⁇ g of FOLR1-Fc was administered intraperitoneally to SD rats along with 2 mg of aluminum hydroxide adjuvant (Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) and pertussis vaccine (Nacalai). From 2 weeks after the first administration, 50 ⁇ g of FOLR1-Fc was administered three times at a frequency of once a week.
  • Example 13 Rat Antiserum Evaluation Three days after the final administration of Example 12, blood was collected from the tail vein of SD rats, and the serum antibody titer against FOLR1 was analyzed by flow cytometry. As positive and negative target cells, FOLR1-expressing CHO cells and FOLR2-expressing CHO cells were used, respectively.
  • FOLR1-expressing CHO cells and FOLR2-expressing CHO cells were detached with 0.02% EDTA solution (Nacalai), washed with PBS, and then suspended with 1% BSA / PBS. Next, it seed
  • Example 14 Preparation of hybridoma FOLR1-expressing CHO cells were boosted with 50 ⁇ g of FOLR1-Fc to SD rats showing a sufficient serum antibody titer. Three days later, the spleen was surgically removed from the SD rat and subjected to cell fusion.
  • the removed spleen was crushed with a glass slide to loosen the tissue.
  • the spleen tissue was suspended in MEM (invitrogen) and passed through a cell strainer to remove excess tissue. After removing the supernatant by centrifugation, red blood cell lysing buffer (SIGMA) was added to cause hemolysis. The reaction was stopped by adding MEM, the supernatant was removed by centrifugation, and then suspended again in MEM to obtain spleen cells.
  • MEM invitrogen
  • SIGMA red blood cell lysing buffer
  • mouse myeloma cell line P3-U1 1 / 8-fold amount of mouse myeloma cell line P3-U1 was mixed with the obtained spleen cells. After removing the supernatant by centrifugation, while heating in a 37 ° C. bath, 500 ⁇ L of PEG solution [Polyethylene glycol 1000 (Pure Chemical) and MEM 1 mL each were mixed, and DMSO (Nacalai) 350 ⁇ L was added. ] was added gently and an additional 45 mL of MEM was added.
  • PEG solution Polyethylene glycol 1000 (Pure Chemical) and MEM 1 mL each were mixed, and DMSO (Nacalai) 350 ⁇ L was added.
  • DMSO Nacalai
  • HAT medium 500 mL RPMI1640 (Wako) with 5 mL HAT solution (GIBCO), 0.5 mL 55 mmol / L 2-Mercaptoethanol (invitrogen)] Suspended in The obtained hybridoma was seeded in a 96-well plate and cultured.
  • Hybridoma screening (ABI8200 cellular detection system) After culturing the hybridoma for 10 days, the culture supernatant of each well was collected, and the reactivity to FOLR1 was analyzed by a fluorescent antibody staining method (ABI8200 cellular detection system, hereinafter referred to as FMAT). Positive target cells and negative target cells were FOLR1-expressing CHO cells and FOLR2-expressing CHO cells, respectively. First, positive target cells and negative target cells were detached with a 0.05% trypsin solution (invitrogen), seeded in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L per well, and cultured overnight.
  • trypsin solution invitrogen
  • Hybridoma screening (surface plasmon resonance method) Using the hybridoma culture supernatant after cloning, affinity for FOLR1 was measured by surface plasmon resonance.
  • Biacore T100 (GE Healthcare) was used, and a CM5 chip (GE Healthcare) was used.
  • a CM5 chip GE Healthcare
  • Mouse Antibody Capture Kit (GE Healthcare) was immobilized on a CM5 chip by an amine coupling method.
  • the hybridoma culture supernatant was run using HBS-EP + buffer (GE Healthcare), and the antibody contained in the supernatant was captured on a CM5 chip. Subsequently, FOLR1-mycHis diluted to 5 concentrations (188, 375, 750, 1500, 3000 ng / mL) was run as an analyte.
  • binding rate constant (ka) and dissociation rate constant (kd) were analyzed by the single-cycle kinetics method.
  • the kinetic constants (ka, kd, KD) were calculated by 1: 1 binding model using Biacore T-100 Evaluation software (GE Healthcare).
  • the RA15-7 culture supernatant contains an antibody having an extremely high affinity for FOLR1 compared to the existing LK26 antibody and MOv18 antibody.
  • Example 17 Reactivity evaluation of RA15-7 culture supernatant (flow cytometry) The reactivity of the antibody contained in the RA15-7 culture supernatant against the human ovarian cancer cell line PA-1 (ATCC No .: CRL-1572) to which the LK26 antibody reacts was analyzed by flow cytometry. In addition, the reactivity of the antibody contained in the RA15-7 culture supernatant was similarly analyzed using a human ovarian cancer cell line TOV-112D (ATCC number: CRL-11731), to which the LK26 antibody did not react, as a negative target.
  • TOV-112D ATCC number: CRL-11731
  • human ovarian cancer cell lines PA-1 and TOV-112D cells were detached with 0.02% EDTA solution (Nacalai), washed with PBS, and suspended in 1% BSA / PBS. Next, it seed
  • Alexa488-labeled anti-rat IgG (H + L) polyclonal antibody (Invitrogen) diluted with 1% BSA / PBS was added, and the reaction was performed at 4 ° C. for 30 minutes. After washing the cells again, the cells were suspended in 1% BSA / PBS, and the fluorescence intensity was analyzed by flow cytometry.
  • the RA15-7 culture supernatant reacted only with PA-1, but did not react with TOV-112D. Therefore, it was suggested that the antibody contained in the RA15-7 culture supernatant recognizes cancer cells that highly express FOLR1.
  • the reactivity of the RA15-7 culture supernatant against cynomolgus monkey kidney-derived cell line JTC-12 was analyzed by flow cytometry.
  • the RA15-7 culture supernatant reacted with JTC-12 cells. Therefore, it was suggested that the RA15-7 culture supernatant contains an antibody that recognizes not only human FOLR1, but also cynomolgus monkey FOLR1.
  • Example 18 Identification of subclass of antibody contained in RA15-7 culture supernatant The subclass of antibody contained in the RA15-7 culture supernatant was identified by ELISA.
  • anti-rat IgG (H + L) polyclonal antibody prepared to 50 ⁇ g / mL with PBS was dispensed at 50 ⁇ L / well into a 96-well plate for ELISA and allowed to stand at 4 ° C. overnight. The wells were washed with PBS, 1% BSA / PBS was added at 100 ⁇ L / well, and blocking was performed at room temperature for 1 hour. After washing the wells again with PBS, RA15-7 culture supernatant was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature for 2 hours.
  • each well was washed with 0.05% tween20 / PBS, diluted with 1% BSA / PBS, each HRP-labeled rat Ig isotype (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM) antibody and rat ⁇ chain specific antibody ( (Southern Biotech) was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • each HRP-labeled rat Ig isotype (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM) antibody and rat ⁇ chain specific antibody (Southern Biotech) was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • ABTS 2.2-azinobis (3-ethylbenzothiazole-6-sulfonate) ammonium, Wako] substrate solution [(1 mmol / L ABTS, 0.1 mol / L citrate buffer ( pH 4.2), 0.1% H 2 O 2 )] was added at 50 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature. After sufficient color development was confirmed, 50 ⁇ L / well of 5% SDS solution was added to stop the reaction, and the absorbance at 415 nm was measured.
  • the antibody contained in the RA15-7 culture supernatant was a rat IgG1 ⁇ antibody.
  • Example 19 Evaluation of specificity of antibody contained in RA15-7 culture supernatant (ELISA method) The reactivity of the antibodies contained in the RA15-7 culture supernatant to FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc, and cynomolgus monkey FOLR1-Fc was evaluated. First, goat anti-rat IgG (H + L) (CALTAG) diluted 1000 times with PBS was dispensed at 50 ⁇ L / well into a 96-well plate for ELISA and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • ELISA method The reactivity of the antibodies contained in the RA15-7 culture supernatant to FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc, and cynomolgus monkey FOLR1-Fc was evaluated. First, goat anti-rat IgG (H + L) (CALTAG) diluted 1000 times with PBS was dispensed at 50 ⁇ L / well into a
  • the antibody contained in the RA15-7 culture supernatant binds to human and cynomolgus monkey FOLR1-Fc but does not bind to FOLR2-Fc and FOLR3-Fc. That is, it was shown that the antibody contained in the RA15-7 culture supernatant is an antibody specific for human and cynomolgus monkey FOLR1.
  • Example 20 Purification of RA15-7 antibody Hybridoma RA15-7 was cultured for 1 week in a medium in which 5% Fetal Bovine Serum Ultra Low IgG (invitrogen) was added to Hybridoma-SFM (invitrogen). Purification of the RA15-7 antibody from the culture supernatant was performed in the same manner as in Example 8. The concentration was calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm to 1.4.
  • Example 21 Antibody binding evaluation by competitive ELISA method It was evaluated whether RA15-7 antibody, LK26 antibody, and MOv18 antibody competitively bind to FOLR1.
  • each antibody prepared to 2 ⁇ g / mL with PBS was dispensed at 50 ⁇ L / well into a 96-well plate for ELISA and allowed to stand at 4 ° C. overnight. After washing the wells with PBS, 1% BSA / PBS was added at 200 ⁇ L / well, and blocking was performed at room temperature for 1 hour. After wells were washed again with PBS, anti-FOLR1 antibody (0.012 to 3 ⁇ g / mL) and FOLR1-Fc (0.2 ⁇ g / mL) were each added at 50 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • Example 22 Cloning of RA15-7 Antibody Heavy and Light Chain Variable Region Genes Using RNAiso plus (Takara), hybridoma RA15-7 washed with PBS was lysed according to the attached document to prepare total RNA. The obtained total RNA was dissolved in DEPC treated water (invitrogen).
  • mRNA was purified from the obtained total RNA according to the attached document. Furthermore, cDNA was prepared from the purified mRNA using SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) according to the attached document.
  • the rat IgG1 heavy chain gene was converted into primers Ratk-A (SEQ ID NO: 20) and Ratk-B.
  • each rat light chain ( ⁇ chain) gene was amplified by PCR. The amplified gene was subcloned and the nucleotide sequence was analyzed.
  • the RA15-7 antibody heavy chain variable region containing the signal sequence is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.
  • the RA15-7 antibody light chain variable region containing the signal sequence is Was represented by SEQ ID NO: 24, and the amino acid sequence was represented by SEQ ID NO: 25.
  • the RA15-7 antibody heavy chain variable region not containing a signal sequence is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and the RA15 without the signal sequence. It was revealed that the ⁇ 7 antibody light chain variable region is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.
  • amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the RA15-7 antibody heavy chain are represented by SEQ ID NOs: 30, 31, and 32, respectively.
  • amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of the RA15-7 antibody light chain are represented by SEQ ID NOs: 33, 34, and 35, respectively.
  • Example 23 Construction of rat / human chimeric RA15-7 antibody expression vector
  • Rat / human chimeric RA15-7 antibody by linking RA15-7 antibody heavy chain and light chain variable region genes to human IgG1 heavy chain and ⁇ chain constant region genes
  • An expression vector was prepared.
  • PKANTEX93 containing a human IgG1 ⁇ constant region gene was used as a vector.
  • the RA15-7 antibody light chain variable region gene was amplified by PCR using primers RA15-7-VLF (SEQ ID NO: 36) and RA15-7-VLR (SEQ ID NO: 37).
  • the target sequence was purified from the PCR product and ligated to pKANTEX93 treated with EcoRI and BsiWI.
  • RA15-7 antibody heavy chain variable region gene was amplified by PCR using primers RA15-7-VHF (SEQ ID NO: 38) and RA15-7-VHR (SEQ ID NO: 39).
  • the target sequence was purified from the PCR product and ligated with RA15-7 antibody light chain variable region gene-incorporated pKANTEX93 treated with NotI and ApaI, and rat / human chimeric RA15-7 (hereinafter referred to as ChRA15-7) antibody expression A vector was used.
  • Example 24 Construction of ChRA15-7 antibody-expressing cells to which ChRA15-7 antibody and sugar chains not containing fucose have been added Construction of expression cells for ChRA15-7 antibodies to which sugar chains containing fucose have been added (hereinafter referred to as conventional type) Used CHO / DG44 cells.
  • ChRA15-7DF ChRA15-7 antibody
  • defucose type a sugar chain not containing fucose was added
  • the vector produced in Example 23 was used as the expression vector. Culture during normal passage, gene transfer, selection of drug-resistant cells, and collection of the culture supernatant were performed in the same manner as in Example 7.
  • Example 25 Purification of ChRA15-7 antibody and ChRA15-7DF antibody Purification of ChRA15-7 antibody and ChRA15-7DF antibody from the collected culture supernatant was performed in the same manner as in Example 8. Regardless of the conventional type or the differential type, the concentration was calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm to 1.37.
  • Example 26 Preparation of diffucose-type antibody expression vector adapted to CDC activity enhancement technology Reports of International Publication Nos. 2007/011041 and 2011/108502 for the purpose of producing diffucose-type antibodies adapted to CDC activity enhancement technology
  • the antibody heavy chain constant region of pKANTEX93 was modified with reference to FIG.
  • the modified base sequence and amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 40 and 41, respectively.
  • the light chain variable region and heavy chain variable region of the RA15-7 antibody and the MORAb-003 antibody International Publication No.
  • ChRA15-7Acc ChRA15-7Acc
  • MORAb-003 MORAb-003 antibody expression vectors
  • Example 27 Construction of ChRA15-7Acc antibody and MORAb-003Acc antibody-expressing cells CHO / Ms704 cells were used for the construction of ChRA15-7Acc antibody and MORAb-003Acc antibody-expressing cells.
  • the expression vectors used were the ChRA15-7Acc antibody and MORAb-003Acc antibody expression vectors prepared in Example 26. Culture during normal passage, gene transfer, selection of drug-resistant cells and collection of the culture supernatant were carried out in the same manner as in Example 7.
  • Example 28 Purification of ChRA15-7Acc antibody and MORAb-003Acc antibody Purification of ChRA15-7Acc antibody and MORAb-003Acc antibody from the collected culture supernatant was carried out in the same manner as in Example 8. Concentrations were calculated by setting the extinction coefficients at 280 nm of ChRA15-7Acc antibody and MORAb-003Acc antibody to 1.34 and 1.60, respectively.
  • Example 29 Affinity measurement of ChRA15-7Acc antibody (surface plasmon resonance method) The affinity of ChRA15-7Acc antibody and MORAb-003 antibody for FOLR1 was measured by surface plasmon resonance. Immobilizing Human Antibody Capture Kit (GE Healthcare) on a CM5 chip by the amine coupling method and FOLR1-mycHis diluted to 5 concentrations (12.3, 37, 111, 333, 1000 ng / mL) was carried out in the same manner as in Example 16 except that it was allowed to flow as an analyte.
  • Immobilizing Human Antibody Capture Kit GE Healthcare
  • FOLR1-mycHis diluted to 5 concentrations (12.3, 37, 111, 333, 1000 ng / mL
  • the affinity (calculated by KD and kd / ka) of ChRA15-7Acc antibody and MORAb-003 antibody for FOLR1-mycHis was 0.57 nmol / L and 57 nmol / L, respectively (Table 1). Therefore, it was revealed that the rat / human chimeric antibody ChRA15-7Acc prepared from the RA15-7 antibody is an antibody having a higher affinity for FOLR1 than the existing antibody MORAb-003.
  • Example 30 Binding evaluation of ChRA15-7DF antibody (Western blotting) The reactivity of ChRA15-7DF antibody and MORAb-003 antibody was evaluated using Western blotting.
  • FOLR1-mycHis is reduced with Lane Marker Reducing Sample Buffer and Lane Marker Non-Reduce Sample Buffer (Thermo) and treated at 100 ° C. for 5 minutes to give reduced FOLR1-myChiFyRm-myCHis.
  • SDS-PAGE gel e-PAGE SDS-PAGE was carried out at a 5-fold concentration (0.5, 2.7, 13, 67, 333 ng / lane) with reduced and non-reduced FOLR1-mycHis. went.
  • the gel after migration was placed on a PVDF membrane (Millipore), and the upper and lower sides were sandwiched with a filter paper soaked in a transfer buffer (12.1 g Tris, 14.4 g glycine, 200 mL methanol / 1 L sterilized water), and transferred. .
  • PVDF membrane was blocked with 1% globulin-free BSA (Nacalai) / TBS.
  • ChRA15-7DF antibody and MORAb-003 antibody prepared to 5 ⁇ g / mL with 1% globulin-free BSA / TBS were reacted with PVDF membrane at room temperature for 1 hour.
  • both the ChRA15-7DF antibody and the MORAb-003 antibody reacted only with non-reduced FOLR1-mycHis, suggesting that they are antibodies that recognize the higher-order structure of FOLR1.
  • the MORAb-003 antibody detected 67 ng or more of non-reduced FOLR1-mycHis, whereas the ChRA15-7DF antibody detected 2.7 ng or more of non-reduced FOLR1-mycHis.
  • ChRA15-7DF antibody has a significantly higher sensitivity for detecting FOLR1-mycHis in the non-reduced state compared to the MORAb-003 antibody.
  • Target cancer cell lines [Caov-3 (ATCC number: HTB-75), PA-1 (ATCC number: CRL-1572), IGR-OV1 (National Cancer Institute), SKOV-3 (ATCC number: HTB-77) ), RMG-1 (JCRB cell number: JCRB0172), OVCAR-3 (ATCC number: HTB-161)] were peeled from the culture flask with 0.02% EDTA solution (Nacalai), and ADCC measurement medium [phenol red non- RPMI 1640 (GIBCO), 5% inactivated dFCS (GIBCO), 50 ⁇ g / mL gentamicin (Nacalai)] was prepared to 1 ⁇ 10 4 cells / 50 ⁇ L to obtain a target cell solution.
  • ADCC measurement medium phenol red non- RPMI 1640 (GIBCO), 5% inactivated dFCS (GIBCO), 50 ⁇ g / mL gentamicin (Nacalai)] was prepared to 1 ⁇ 10
  • heparinized healthy human peripheral blood was layered on a LeucoSep lymphocyte separation tube (greiner) filled with Lymphoprep (Cosmo Bio) and centrifuged at 1000 ⁇ g for 20 minutes at room temperature. After centrifugation, the serum fraction was removed and the PBMC layer was recovered. Cells were washed with ADCC measurement medium. PBMC was prepared to 2.5 ⁇ 10 5 cells / 50 ⁇ L with ADCC measurement medium to obtain an effector cell solution.
  • the antibody solution is first adjusted to 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng / mL with ADCC measurement medium so that the final concentration is 0.033, 0.33, 3.3, 33, 333 ng / mL. did.
  • the target cell solution, effector cell solution, and antibody solution prepared as described above were mixed in a U-shaped 96-well plate by 50 ⁇ L / well, respectively, to a total volume of 150 ⁇ L / well. After each well was mixed well, the cells were precipitated by centrifugation at 50 ⁇ g for 5 minutes at room temperature and reacted at 37 ° C. for 4 hours.
  • each well was well agitated, and the cells were precipitated again by centrifugation. Then, 50 ⁇ L each of the well supernatant was dispensed to a new ELISA plate. Lactate dehydrogenase (LDH) activity in the collected supernatant was measured using CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega). The operation was performed according to the attached document.
  • LDH Lactate dehydrogenase
  • the ADCC activity was calculated by first subtracting the LDH activity measurement value of the well of only the ADCC measurement medium from the LDH activity measurement value of each well to obtain the LDH activity measurement correction value of each well, and then calculating by the following formula. .
  • Exp is the LDH activity measurement correction value for each sample
  • ET spo is the LDH activity measurement correction value for the mixed well of the effector cell solution and the target cell solution
  • T total is the target cell
  • CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Attachment Lysis The LDH activity measurement correction value of the well mixed with Solution
  • D represents the LDH activity measurement correction value of Lysis Solution
  • T spo represents the LDH activity measurement correction value of the well containing only target cells.
  • the ChRA15-7DF antibody detected ADCC activity from a lower concentration than the MORAb-003 antibody, and the maximum cytotoxic activity was also high. Furthermore, the ADCA activity was detected from a lower concentration of the ChRA15-7DF antibody and the maximum cytotoxic activity was also higher than that of the defucose type MORAb-003 (MORAb-003DF) antibody.
  • ChRA15-7DF antibody has higher ADCC activity compared to the MORAb-003DF antibody in which the existing anti-FOLR1 humanized antibody (MORAb-003) is combined with the existing ADCC activity enhancement technology (defucose formation). became. At the same time, it was suggested that ChRA15-7DF antibody is more useful than MORAb-003 and MORAb-003DF as a therapeutic antibody against ovarian cancer.
  • Rat1- Three types of rat / human chimeric FOLR1-mycHis (hereinafter referred to as Rat1-) were prepared by substituting part of the base sequence of FOLR1-mycHis with rat FOLR1 (NM — 133527).
  • Rat1-mycHis Rat2-FOLR1-mycHis
  • Rat4-FOLR1-mycHis Rat4-FOLR1-mycHis
  • Rat1-FOLR1-mycHis is the amino acid sequence from 3 to 28 of the amino acid sequence of human FOLR1 represented by SEQ ID NO: 1, and the 3rd to 26th of the amino acid sequence of rat FOLR1 represented by SEQ ID NO: 102. In which the myc and His tags are added to the C-terminus.
  • Rat2-FOLR1-mycHis is the amino acid sequence 55 to 62 in the amino acid sequence of human FOLR1 represented by SEQ ID NO: 1, and 53 to 60 of the amino acid sequence of rat FOLR1 represented by SEQ ID NO: 102. In which the myc and His tags are added to the C-terminus.
  • Rat4-FOLR1-mycHis is the amino acid sequence from 91 to 95 of the amino acid sequence of human FOLR1 represented by SEQ ID NO: 1, and the 89th to 93rd of the amino acid sequence of rat FOLR1 represented by SEQ ID NO: 102. In which the myc and His tags are added to the C-terminus.
  • the nucleotide sequences of Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, and Rat4-FOLR1-mycHis are SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, and SEQ ID NO: 44, respectively, and the amino acid sequences are SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, And SEQ ID NO: 47.
  • Each gene was synthesized and replaced with the FOLR1-mycHis gene on the FOLR1-mycHis expression vector of Example 9 to construct Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, and Rat4-FOLR1-mycHis expression vectors did.
  • Example 33 Preparation of Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, and Rat4-FOLR1-mycHis expressing cells
  • Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, and Rat4-FOLR1-mycHis expressing cells Cells were used.
  • the vector produced in Example 32 was used as the expression vector. Culture during normal passage, gene transfer, selection of drug-resistant cells and collection of the culture supernatant were carried out in the same manner as in Example 7.
  • Example 34 Purification of Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, and Rat4-FOLR1-mycHis Purification of Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, and Rat4-FOLR1-mycHis was performed as in Example 11. . The concentration was calculated assuming that the extinction coefficient at 280 nm was 2.8.
  • Example 35 Epitope analysis of ChRA15-7Acc antibody (ELISA method) ChRA15-7Acc antibody, MORAb-003 antibody, and MOv18 antibody using FOLR1-mycHis produced in Example 11 and Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, Rat4-FOLR1-mycHis produced in Example 34 The reactivity of was evaluated.
  • FOLR1-mycHis, Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, and Rat4-FOLR1-mycHis adjusted to 10 ⁇ g / mL with PBS were dispensed into a 96-well plate for ELISA at 50 ⁇ L / well at 4 ° C. Left overnight. After washing the wells with PBS, 1% BSA / PBS was added at 200 ⁇ L / well, and blocking was performed at room temperature for 1 hour.
  • ChRA15-7Acc prepared with 1% BSA / PBS to 7 concentrations (14, 41, 123, 370, 1111, 3333, 10000 ng / mL) from 10000 ng / mL to 3-fold dilution.
  • Antibody, MORAb-003 antibody, and MOv18 antibody were added at 50 ⁇ L / well, and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • Rat2-FOLR1-mycHis reacted with the MORAb-003 antibody and the MOv18 antibody, but the reaction with the ChRA15-7Acc antibody was not observed.
  • Rat4-FOLR1-mycHis reacted with ChRA15-7Acc antibody and MOv18 antibody, but no reaction with MORAb-003 antibody was observed.
  • the MOv18 antibody is Rat1-FOLR1-mycHis
  • the ChRA15-7Acc antibody is Rat2-FOLR1-mycHis
  • the MORAb-003 antibody is the rat-FOLR1-mycHis sequence comprising a region in which the FOLR1-mycHis amino acid sequence is replaced with a rat type. Were shown to recognize each.
  • the MOv18 antibody is FOLR1-mycHis 3 to 28 amino acid sequence
  • the ChRA15-7Acc antibody is FOLR1-mycHis 55 to 62 amino acid sequence
  • the MORAb-003 antibody is FOLR1-mycHis 91 to 95. It was suggested to recognize the amino acid sequence including the second amino acid sequence.
  • Example 36 Design of humanized RA15-7 antibody heavy chain and light chain variable region
  • the amino acid sequence of the chain variable region framework region (FR) was selected.
  • Known human antibody heavy chain variable region sequences were searched for human antibody sequences highly homologous to the RA15-7 heavy chain FR sequence using the Ig Germline Genes database provided by The National Center for Biotechnology Information.
  • HV0 was designed by transplanting the amino acid sequences of RA15-7 heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3 shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 32 at appropriate positions of the human antibody FR sequence determined as described above.
  • amino acid sequence of the human antibody heavy chain variable region framework region (FR) for grafting the amino acid sequences of RA15-7 light chain CDR1, CDR2, and CDR3 represented by SEQ ID NOs: 33, 34, and 35, respectively, is selected. did.
  • hSGI the homology search of the FR amino acid sequence of the common sequence of subgroups I to IV (hSGI to hSGIV) of human antibody VL and the RA15-7 light chain FR sequence was performed.
  • hSGI was the most homologous human antibody light chain consensus sequence.
  • LV0 was designed by transplanting the amino acid sequences of RA15-7 light chain CDR1, CDR2, and CDR3 shown in SEQ ID NOs: 33, 34, and 35 to appropriate positions of the human antibody FR sequence determined as described above.
  • HV0LV0 humanized antibody
  • ChRA15-7 antibody composed of HV0 and LV0 designed above were constructed by computer modeling, and the structures were compared.
  • Discovery Studio Accelelrys
  • residues that are expected to contribute significantly to antigen binding activity such as retention of CDR loop structure, residues that contribute to maintenance of the entire structure by hydrophobic interaction, and molecules Residues that were exposed to the surface and expected to have a high potential antigenic risk were identified as candidate residues for modification.
  • Each humanized antibody variant was designed by substituting one or more of the selected modification candidate residues with an amino acid residue present at the same position of the ChRA15-7 antibody.
  • HV0, HV2, HV3, HV4, HV5, HV6, HV7, HV8, and HV10 were designed as the heavy chain variable region of the modified humanized RA15-7 antibody not containing a signal sequence, as shown in FIG.
  • LV0, LV2, LV3, LV4, and LV6 were designed as the light chain variable region of the humanized RA15-7 antibody variant not containing a signal sequence, as shown in FIG.
  • Example 37 Construction of humanized RA15-7 antibody variant expression vector Nucleotide sequence HV0, HV2, HV3, HV4, HV5 of the designed heavy chain and light chain variable region of each humanized RA15-7 antibody variant without signal sequence HV6, HV7, HV8, HV10, LV0, LV2, LV3, LV4 and LV6 (SEQ ID NOs: 48 to 61) were introduced into pKANTEX93 in the same manner as in the construction of the ChRA15-7 expression vector (Example 23).
  • Humanized RA15-7 antibody variant-expressing cells can be constructed by FUT8 gene double knockout CHO-K1 strain (Tsukahara et al., Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects, 175-183, 2006). Each humanized antibody variant expression vector prepared in Example 37 was introduced transiently according to the operating procedure manual of FreeStyle MAX CHO Expression System (invitrogen). These cells were cultured for about a week, and the culture supernatant was collected.
  • Example 39 Purification of Humanized RA15-7 Antibody Variant Each humanized antibody variant was purified from the culture supernatant collected in Example 38 using MabSelect SuRe (GE Healthcare). Specifically, sterilized water, 0.1 M citric acid solution (pH 3.6), and 0.2 M Na borate / 150 mmol / L NaCl solution (pH 7.5) are sequentially passed through a column packed with a carrier to equilibrate. Turned into.
  • the absorbance (280 nm) of each fraction was measured, and a continuous fraction having a high measured value was recovered as an antibody fraction.
  • Dialysis was performed with a buffer solution (10 mmol / L citric acid, 150 mmol / L NaCl, pH 6.0), and a 0.22 ⁇ m filter was used as a purified antibody of each humanized antibody variant.
  • the concentration was calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm to 1.4.
  • Example 40 Affinity measurement of humanized RA15-7 antibody variant (surface plasmon resonance method) Similar to Example 29, the affinity of each humanized antibody variant for FOLR1 was measured by the surface plasmon resonance method.
  • HV7LV3-CDRH3-Cys101 modified antibody expression vector was prepared. First, a vector incorporating the HV7 variable region gene (SEQ ID NO: 62) was used as a template. Using a point mutation introduction kit [QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies)], a gene mutation for modifying Cys101 to the target amino acid was introduced. The obtained DNA solution was transformed into XL1-Blue, and a plasmid was extracted from the formed colonies.
  • the base sequence of the HV7 variable region in which Cys101 is substituted with the target amino acid and does not include a signal sequence is Met (C101M_DNA): SEQ ID NO: 63, Gly (C101G_DNA): SEQ ID NO: 64, Asp (C101D_DNA): SEQ ID NO: 65, Ser (C101S_DNA): SEQ ID NO: 66, Tyr (C101Y_DNA): SEQ ID NO: 67, Ala (C101A_DNA): SEQ ID NO: 68, Ile (C101I_DNA): SEQ ID NO: 69, Val (C101V_DNA): SEQ ID NO: 70, Thr (C101T_DNA): SEQ ID NO: 71, Phe (C101F_DNA): SEQ ID NO: 72, Arg (C101R_DNA): SEQ ID NO: 73, Trp (C101W_DNA): SEQ ID NO: 74, Pro (C101P_DNA): SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence of the HV7 variable region in which Cys101 is substituted with the target amino acid and does not include the signal sequence is Met (C101M_AA): SEQ ID NO: 77, Gly (C101G_AA): SEQ ID NO: 78, Asp (C101D_AA): SEQ ID NO: 79, Ser (C101S_AA): SEQ ID NO: 80, Tyr (C101Y_AA): SEQ ID NO: 81, Ala (C101A_AA): SEQ ID NO: 82, Ile (C101I_AA): SEQ ID NO: 83, Val (C101V_AA): SEQ ID NO: 84, Thr (C101T_AA): SEQ ID NO: 85, Phe (C101F_AA): SEQ ID NO: 86, Arg (C101R_AA): SEQ ID NO: 87, Trp (C101W_AA): SEQ ID NO: 88, Pro (C101P_AA): SEQ ID
  • the heavy chain variable region gene HV7 of the HV7LV3 antibody expression vector was replaced with an HV7 variable region gene in which Cys101 was replaced with the target amino acid.
  • NotI and ApaI recognition regions were used for the recombination.
  • the obtained vector was used as an HV7LV3-CDRH3-Cys101 modified antibody expression vector.
  • Example 43 Construction and culture of HV7LV3-CDRH3-Cys101 modified antibody-expressing cells HV7LV3-CDRH3-Cys101 modified antibody-expressing cells were produced using the vector prepared in Example 42. Expression cells, gene transfer, and culture supernatant collection were performed in the same manner as in Example 38.
  • Example 44 Purification of HV7LV3-CDRH3-Cys101 modified antibody Purification of HV7LV3-CDRH3-Cys101 modified antibody and calculation of concentration were carried out in the same manner as in Example 39.
  • Example 45 Affinity measurement of HV7LV3-CDRH3-Cys101 modified antibody (surface plasmon resonance method) In the same manner as in Example 29, the affinity of each HV7LV3-CDRH3-Cys101 modified antibody for FOLR1 was measured by surface plasmon resonance.
  • antibodies modified to C101I, C101V, C101T, C101F, C101Q, and C101M have 73%, 55%, 88%, 80%, 64%, and 59% affinity for ChRA15-7Acc antibody, respectively. Shown (FIG. 3). This result shows that the affinity of the antibody modified to C101T (HuRA15-7CT) is improved with respect to the modified HV7LV3 humanized antibody.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of the light chain variable region of the HuRA15-7CT antibody including the signal sequence are shown in SEQ ID NOs: 91 and 92. Further, the nucleotide sequence and amino acid sequence of the light chain variable region of HuRA15-7CT antibody not containing a signal sequence are shown in SEQ ID NOs: 93 and 94, respectively.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of the heavy chain variable region of HuRA15-7CT antibody including the signal sequence are shown in SEQ ID NOs: 95 and 96, respectively.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of the heavy chain variable region of the HuRA15-7CT antibody not containing the signal sequence are shown in SEQ ID NOs: 97 and 98.
  • amino acid sequences of the heavy chain CDR1, CDR2, and CDR3 of the HuRA15-7CT antibody are shown in SEQ ID NOs: 30, 31, and 99, respectively.
  • amino acid sequences of the light chain CDR1, CDR2, and CDR3 of the HuRA15-7CT antibody are shown in SEQ ID NOs: 33, 34, and 35, respectively.
  • Example 46 Construction of diffucose-type HuRA15-7CT antibody expression vector adapted to CDC activity enhancement technology
  • Construction of defucose-type HuRA15-7CT (hereinafter referred to as HuRA15-7CTAcc) antibody expression vector adapted to CDC activity enhancement technology is a variable light chain
  • SEQ ID NO: 91 as the region
  • SEQ ID NO: 95 as the heavy chain variable region.
  • Example 47 Construction of diffucose-type HuRA15-7CT antibody-expressing cells and HuRA15-7CTACc antibody-expressing cells Defucose-type HuRA15-7CT (hereinafter referred to as HuRA15-7CTDF) antibody-expressing cells and HuRA15-7CTACc antibody-expressing cells Ms704 was used.
  • HuRA15-7CTDF Defucose-type HuRA15-7CT
  • HuRA15-7CTACc antibody-expressing cells Ms704 was used as the expression vector.
  • the HuRA15-7CT antibody expression vector prepared in Example 42 or the HuRA15-7CTACc antibody expression vector prepared in Example 46 was used. Culture during normal passage, gene transfer, selection of drug-resistant cells, and collection of the culture supernatant were performed in the same manner as in Example 7.
  • Example 48 Purification of HuRA15-7CTDF antibody and HuRA15-7CTAcc antibody The purification of HuRA15-7CTDF antibody and HuRA15-7CTAcc antibody from the culture supernatant was carried out in the same manner as in Example 8. The concentration was calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm to 1.38 for the HuRA15-7 CTDF antibody and 1.37 for the HuRA15-7 CTAcc antibody.
  • Example 49 Affinity measurement of HuRA15-7CTAcc antibody (surface plasmon resonance method) The affinity of the HuRA15-7CTAcc antibody to FOLR1 was measured by the surface plasmon resonance method in the same manner as in Example 29.
  • Example 50 Specificity evaluation of HuRA15-7CTDF antibody and ChRA15-7DF antibody (ELISA method) The reactivity of the HuRA15-7CTDF antibody, ChRA15-7DF antibody, and MORAb-003DF antibody to FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc, and cynomolgus monkey FOLR1-Fc was evaluated.
  • FOLR1-Fc, FOLR2-Fc, FOLR3-Fc, and cynomolgus FOLR1-Fc prepared to 2 ⁇ g / mL with PBS were dispensed into an ELISA 96-well plate at 50 ⁇ L / well and left overnight at 4 ° C. . After washing the wells with PBS, 1% BSA / PBS was added at 200 ⁇ L / well, and blocking was performed at room temperature for 1 hour.
  • HuRA15-7 CTDF antibody ChRA15- prepared with 7% concentration (1.4, 4.1, 12, 37, 111, 333, 1000 ng / mL) with 1% BSA / PBS
  • a 7DF antibody, a MORAb-003DF antibody, and 50 ⁇ L / well of a defucose type anti-DNP human IgG1 (DNPDF) antibody as a negative target were added, respectively, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • DNPDF defucose type anti-DNP human IgG1
  • HuRA15-7CTDF antibody, ChRA15-7DF antibody, and MORAb-003DF antibody have equivalent binding activity to human and cynomolgus monkey FOLR1-Fc, but do not bind to FOLR2-Fc and FOLR3-Fc.
  • HuRA15-7CTDF antibody, ChRA15-7DF antibody, and MORAb-003DF antibody are antibodies specific to human and cynomolgus FOLR1.
  • Example 51 Immunohistochemical staining with HuRA15-7CTACc antibody Embedded and frozen human OCT compound (cerebrum, cerebellum, heart, lung, stomach, small intestine, liver, pancreas, salivary gland, kidney, thyroid, adrenal gland, skeletal muscle , Spleen, ovary, uterus, placenta, skin, mammary gland) were performed using HuRA15-7CTACc and DNPDF as the negative target antibody.
  • HuRA15-7CTAcc antibody, MORAb-003 antibody, and DNPDF antibody prepared at 1 ⁇ g / mL were reacted at room temperature for 1 hour, and then washed with PBS.
  • Peroxidase-labeled streptavidin (Nichirei) was added, reacted for 5 minutes, and washed with PBS.
  • the stained sample was treated with 70% ethanol for 5 minutes, 95% ethanol for 5 minutes, and 100% ethanol for 5 minutes, and the treatment with 100% ethanol was repeated three times. Subsequently, the operation of treating with 100% xylene for 5 minutes was repeated three times to perform clearing. Finally, it was sealed with Enteran New (Merck).
  • tissues positive for the staining of HuRA15-7CTACc antibody were lung (alveoli), stomach (mucosa), small intestine (mucosa, mucosal muscle plate), pancreas (conduit, acinar cell), Liver (bile duct), salivary gland (acinar cells, ducts), kidney (tubules, glomeruli), adrenal glands (cortical cells, interstitial tissue), thyroid (follicles, parafollicular cells), mammary gland (acini), uterus ( Cervical epithelium), ovary (epithelium), placenta (syncytial trophoblast), skin (sweat gland), literature [Cancer Res, 992.52 (23): p. 6708-11. Int J Cancer, 2006.119 (2): p. 243-50. It was suggested that it is the same as the report of].
  • the same staining was carried out on 8 human ovarian cancer tissues (4 serous cyst carcinomas, 1 serous cystoma, 2 mucinous cystomas, 1 borderline mucinous cystoma).
  • the MORAb-003 antibody was also used for staining.
  • the dyeability of the stained sample was quantified by the H score.
  • the staining intensity of positively stained cells among cancer cells is determined in four stages, and the positive occupation ratio (%) of each score in cancer cells is determined in 5% increments, and then each score and positive are determined. The sum of the values multiplied by the occupation rate.
  • MORAb-003 was stained for 4 cases of serous cystic carcinoma, 1 case of serous cystoma and 1 case of mucinous cystic carcinoma in which staining was observed for both the MORAb-003 antibody and the HuRA15-7CTACc antibody.
  • the HuRA15-7 CTAcc antibody showed a higher H score against the antibody.
  • staining was not observed in either antibody, so the H score was 0.
  • the HuRA15-7CTACc antibody binds more strongly to FOLR1 expressed in ovarian cancer than the existing ovarian cancer therapeutic antibody MORAb-003.
  • Example 52 Evaluation of ADCC activity of rat / human chimeric antibody and humanized antibody
  • Example 31 and ChRA15-7Acc antibody, defucose HV7LV3 human IgG1 (HuRA15-7Acc) antibody adapted to CDC activity enhancement technology, and HuRA15-7CTAcc antibody Similarly, ADCC activity against ovarian cancer cell lines was evaluated.
  • Example 53 Evaluation of CDC activity of rat / human chimeric antibody and humanized antibody CDC activity against ovarian cancer cell lines was evaluated.
  • the target cancer cell line IGR-OV1 is peeled off from the culture flask with 0.02% EDTA solution (Nacalai), and CDC measurement medium [phenol red-free RPMI 1640 (GIBCO), 1.4% BSA (SIGMA)]. 1 ⁇ 10 4 cells / 50 ⁇ L was prepared as a target cell solution.
  • human serum freeze-dried product SIGMA
  • SIGMA human serum freeze-dried product
  • the antibody solution has a final concentration of 0.032, 0.16, 0.8, 4.0, 20, 100 ⁇ g / mL, such as HuRA15-7CTAcc antibody, HuRA15-7CTDF antibody, ChRA15-7Acc antibody, ChRA15- First, 7DF antibody and MORAb-003 were prepared at 0.096, 0.48, 2.4, 12, 60, and 300 ⁇ g / mL in a CDC measurement medium.
  • the target cell solution, complement solution, and antibody solution prepared as described above were each mixed in a flat-bottom 96-well plate by 50 ⁇ L / well to make a total volume of 150 ⁇ L / well. Each well was mixed well and allowed to react at 37 ° C. for 2 hours. Next, each well was stirred well, CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) was added at 30 ⁇ L / well, and the mixture was further reacted at 37 ° C. for about 1 hour. After sufficient color development was observed, the absorbance at 490 nm was measured.
  • Exp represents the absorbance correction value of each sample
  • ST represents the absorbance correction value of the mixed well of the target cell solution and complement solution.
  • the HuRA15-7CTAcc antibody and the HuRA15-7CTDF antibody showed significantly higher CDC activity than the ChRA15-7Acc antibody and the ChRA15-7DF antibody, respectively [FIG. 6 (a)]. Furthermore, the HuRA15-7CTAcc antibody showed significantly higher CDC activity than MORAb-003 [FIG. 6 (b)].
  • Example 54 Comparison of ADCC activity of HuRA15-7CTAcc antibody and existing anti-FOLR1 antibody Using the HuRA15-7CTAcc antibody, MORAb-003Acc antibody, and MORAb-003 antibody, ADCC activity against ovarian cancer cell lines was evaluated in the same manner as in Example 31.
  • the HuRA15-7CTACc antibody has a higher ADCC activity compared to the MORAb-003Acc antibody in which the existing anti-FOLR1 humanized antibody (MORAb-003) is combined with the existing ADCC activity enhancement technology (defucose). became.
  • the ADCC activity of the HuRA15-7CTAcc antibody was detected from IGR-OV1 cells at a lower concentration than the MORAb-003 antibody.
  • the ADCC activity of the MORAb-003Acc antibody against ovarian cancer cell lines decreases in the order of IGR-OV1, SKOV-3, and OVCAR-3 cells, but the ADCC activity of the HuRA15-7CTACcc antibody is not affected by any ovarian cancer cell line. was almost the same.
  • the HuRA15-7CTAcc antibody is more useful as a therapeutic antibody against platinum-resistant ovarian cancer than the existing antibody (MORAb-003) and the antibody combining the existing technology with the existing antibody (MORAb-003Acc).
  • HuRA15-7CTDF antibody The dynamics of HuRA15-7CTDF antibody and MORAb-003DF antibody were analyzed by fluorescence imaging. First, HuRA15-7CTDF antibody and MORAb-003DF antibody were labeled with XenoLight CF 770 Kit (HuRA15-7CTDF-770 antibody and MORAb-003DF-770 antibody), respectively, and DNPDF antibody was labeled with XenoLight CFTM 680 Kit as a negative target ( DNPDF-680 antibody). The binding of each labeled antibody was confirmed by flow cytometry reactivity against SKOV-3 cells. The labeling rate of each antibody was determined according to the attached document.
  • the cultured SKOV-3 cells were suspended in PBS and transplanted subcutaneously to the lateral back of BALB / cAJcl-nu / nu mice (female, 5 weeks old, CLEA Japan). When the volume of the transplanted tumor reached about 200 mm 3 , it was changed to an alfalfa-free feed and bred for another week. There were 4 mice per group, and the mice were randomly divided into 3 groups so that the mean tumor volumes were equivalent.
  • the fluorescence intensity derived from the HuRA15-7CTDF-770 antibody and MORAb-003DF-770 antibody in the photographed mice was corrected with the fluorescence intensity of each administered antibody solution. Also, using the fluorescence intensity derived from the DNPDF-680 antibody as a mouse internal standard, the ratio of the observed fluorescence intensity of HuRA15-7CTDF-770 antibody and MORAb-003DF-770 antibody was calculated, and the kinetics of each antibody was evaluated. .
  • the HuRA15-7CTDF-770 antibody was remarkably more present in the transplanted SKOV-3 tumor mass and localized for a longer time than the MORAb-003DF-770 antibody (FIG. 8).
  • the above results indicate that the antibody of the present invention exhibits remarkable accumulation and persistence against advanced cancer derived from platinum-resistant ovarian cancer cell line SKOV-3, suggesting higher antitumor activity as a cancer therapeutic antibody. It is.
  • Test items include general condition observation, body weight, food intake, body temperature, urine test (urine volume, urine specific gravity, urine protein, urine sugar, creatinine, NAG, Na, K, Cl), hematology test (leukocytes, Lymphocytes, T cells, Th cells, Tc cells, B cells, NK cells, neutrophils, monocytes, eosinophils, basophils, large unstained spheres, red blood cells, Hb concentration, Ht value, reticulocytes, platelets , PT, APTT, fibrinogen), blood biochemistry (ALT, ALP, AST, CK, CRP, IL-6, C3, C4, CH50, total bilirubin, total protein, albumin, globulin, triglyceride, total cholesterol, blood glucose BUN, creatinine, inorganic phosphorus, Ca, Na, K, Cl), autopsy, organ weight, histopathological examination.
  • urine test urine volume, urine specific gravity, urine protein, urine sugar, creatinine
  • Example 57 Preparation of HuRA15-7CRAcc antibody expression vector Using the HV7LV3 humanized antibody modified (HuRA15-7CR) antibody expression vector (Example 42) in which Cys101 was substituted with Arg, the CDC activity enhancement technology was applied in the same manner as in Example 26.
  • a defucose type HuRA15-7CR (hereinafter referred to as HuRA15-7CRAcc) antibody expression vector to which the CDC activity enhancement technology was applied was used.
  • Example 58 Construction of HuRA15-7CRAcc antibody-expressing cells CHO / Ms704 cells were used for the construction of HuRA15-7CRAcc antibody-expressing cells.
  • the HuRA15-7CRAcc antibody expression vector prepared in Example 57 was used. Culture during normal passage, gene transfer, selection of drug-resistant cells and collection of the culture supernatant were carried out in the same manner as in Example 7.
  • Example 59 Purification of HuRA15-7CRAcc antibody The purification of HuRA15-7CRAcc antibody from the collected culture supernatant was carried out in the same manner as in Example 8. The concentration was calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm of the HuRA15-7CRAcc antibody to 1.37.
  • Example 60 Affinity measurement of HuRA15-7CRAcc antibody (surface plasmon resonance method) The affinity of the HuRA15-7CRAcc antibody to FOLR1 was measured by surface plasmon resonance. The operation was performed in the same manner as in Example 29 using the HuRA15-7CTAcc antibody, the HuRA15-7CRAcc antibody, and the MORAb-003DF antibody.
  • Example 61 Evaluation of ADCC activity of HuRA15-7CRAcc antibody Using the HuRA15-7CTACc antibody, HuRA15-7CRAcc antibody, and MORAb-003DF antibody, ADCC activity against ovarian cancer cell lines was evaluated in the same manner as in Example 31.
  • Example 62 Epitope analysis of HuRA15-7CTACc antibody (ELISA method) Similar to Example 35, ChRA15-7Acc antibody, MORAb using FOLR1-mycHis produced in Example 11 and Rat1-FOLR1-mycHis, Rat2-FOLR1-mycHis, Rat4-FOLR1-mycHis produced in Example 34 The reactivity of the -003 antibody, the MOv18 antibody, and the HuRA15-7CTACc antibody was evaluated.
  • the results are shown in Table 4. A white circle indicates that a reaction was observed, and a cross indicates that no reaction was observed.
  • the HuRA15-7CTAcc antibody showed a reaction with FOLR1-mycHis, Rat1-FOLR1-mycHis, and Rat4-FOLR1-mycHis, but not with Rat2-FOLR1-mycHis. Therefore, it was suggested that the HuRA15-7CTAcc antibody recognizes the 55th to 62nd amino acid sequences of FOLR1-mycHis, similar to the ChRA15-7Acc antibody.
  • Example 63 Quantitative analysis of FOLR1 expressed on cell membrane of ovarian cancer cell line Analysis of FOLR1 expression level on ovarian cancer cell lines (IGR-OV1, SKOV-3, OVCAR-3, MCAS) using QIFIKIT (Dako) did. Cells and calibration beads were stained according to the QIFIKIT package insert using LK26 (GeneTex) as an anti-FOLR1 antibody and mouse IgG2a (Dako) as negative subjects, respectively, at a concentration of 20 ⁇ g / mL.
  • QIFIKIT QIFIKIT package insert using LK26 (GeneTex) as an anti-FOLR1 antibody and mouse IgG2a (Dako) as negative subjects, respectively, at a concentration of 20 ⁇ g / mL.
  • FOLR1 expressed on the cell membranes of IGR-OV1, SKOV-3, OVCAR-3, and MCAS is 1.17 ⁇ 10 6 , 1.10 ⁇ 10 5 , 6.63 ⁇ 105 per cell, respectively. 4 and 1.37 ⁇ 10 4 molecules were shown (FIG. 10).
  • the HuRA15-7CTACc antibody is a FOLR1 low-expressing cell (the number of FOLR1 molecules on the cell membrane is 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 ). It was revealed that ADCC activity similar to that of cells with high expression of FOLR1 (the number of FOLR1 molecules on the cell membrane was 1 ⁇ 10 6 ) was exhibited. Based on the above, it is more useful than the existing antibody (MORAb-003) and an antibody combining the existing technology (MORAb-003Acc) as a therapeutic antibody against not only cancer cells with high expression of FOLR1 but also cancer cells with low expression. It was suggested that there is.
  • Example 64 Human breast cancer tissue immunostaining As in Example 51, a human breast cancer tissue array (BioChain) was subjected to immunohistochemical staining (IHC). The array contains 35 cases of septve ductal carcinoma tissue, 2 cases of invulsive local carcinoma tissue, and 3 cases of normal tissue, respectively, with estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and Her2 yin and yang information It was accompanied.
  • ER estrogen receptor
  • PR progesterone receptor
  • Her2 yin and yang information It was accompanied.
  • HuRA15-7CTAcc and MORAb-003 antibodies were 56% and 27% in ER positive and / or PR positive and Her2 negative tissues, and ER positive and / or PR positive and Her2 positive tissues. 50% and 50%, 71% and 14% in ER negative and / or PR negative and Her2 positive tissues, 22% and 11% in ER negative and PR negative and Her2 negative tissues. From these results, it was revealed that the HuRA15-7CTACc antibody can stain FOLR1-positive breast cancer tissue with higher sensitivity than the MORAb-003 antibody.
  • the H scores of the samples that were stained with the HuRA15-7 CTACcc antibody were higher than the H scores of the MORAb-003 antibody for the same tissue sample. From the above, it was suggested that the HuRA15-7CTAcc antibody binds more strongly to FOLR1 expressed in breast cancer than the existing antibody MORAb-003.
  • Example 65 Autologous Depletion Test Using Ovarian Cancer Ascites Derived Cells Frozen ovarian cancer ascites-derived cells were purchased from Molecular Response (MR), and the following autologous depletion tests were performed.
  • MR Molecular Response
  • frozen ovarian cancer ascites-derived cells were thawed in a 37 ° C. water bath and suspended in a medium for ascites cells.
  • the medium for ascites cells was RPMI 1640 GlutaMax (GIBCO), 10% inactivated FCS, 1/100 amount of Penicillin & Streptomycin (GIBCO), 1/100 amount of non-essential amino acid (GIBCO), and 1/100 amount.
  • GIBCO Sodium Pyruvate
  • a cell suspension was prepared to 2 ⁇ 10 6 cells / 450 ⁇ L, and 450 ⁇ L of each well was seeded on a 24-well plate.
  • HuRA15-7CTAcc antibody, MORAb-003 antibody, and DNPDF antibody as a negative target were prepared in a medium for ascites cells so as to have a final concentration of 1 to 1000 ng / mL, and added at 50 ⁇ L / well. Thereafter, the cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • each well was mixed well by pipetting, and 250 ⁇ L was dispensed into separate tubes. Each tube was centrifuged at 200 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed. Next, the cell pellet was suspended with 2 mL of Stain Buffer (FBS) (BD Biosciences), centrifuged in the same manner, the supernatant was removed, and the cells were washed. The cell pellet was suspended in 100 ⁇ L of stain buffer (FBS), and staining for cancer cell detection and staining for a negative target were performed.
  • FBS Stain Buffer
  • CD45-PerCP BD Biosciences
  • CD14-FITC BD Biosciences
  • EpCAM-APC BD Biosciences
  • FOLR1-PE FOLR1-PE
  • each sample was measured by flow cytometry.
  • the 7-AAD negative ( ⁇ ) / CD45 ( ⁇ ) / CD14 ( ⁇ ) cell population was gated, and then the fraction excluding lymphocytes was gated by FSC and SSC.
  • the FOLR1 and EpCAM positive (+) fraction of the cancer cell detection staining sample was used as the cancer cell population. .
  • the extent to which the number of cells detected in the cancer cell fraction decreased in the sample added with HuRA15-7CTACcc antibody, MORAb-003 antibody, or DNPDF antibody is shown as cytotoxic activity (%) on the vertical axis ( FIG. 11).
  • the horizontal axis represents antibody concentration (ng / mL).
  • FZ12, FZ21, FZ26, and FZ44 in FIG. 11 represent ovarian cancer ascites donors (SPECNUM / Patient IDs 2003090712/7028, 2000080521/173089, 200960526/5208, and 2003041044/113139), respectively.
  • all samples are shown to be ovarian cancer ascites containing cancer cells resistant to cisplatin in an ex vivo drug resistance test conducted by MR.
  • ovarian cancer cell lines IGR-OV1 National Cancer Institute
  • OVISE JCRB cell number: JCRB1043
  • SKOV-3 ATCC number: HTB-77
  • Caov-3 ATCC number: HTB-75
  • RMG-1 JCRB cell number: JCRB0172
  • OV-90 ATCC number: CRL-11732
  • OVCAR-3 ATCC number: HTB-161
  • MCAS JCRB Cell number: JCRB0240
  • FOLR1 expressed on TOV-112D ATCC number: CRL-11731
  • FOLR1 is highly expressed in the order of IGR-OV1, OVISE, SKOV-3, Caov-3, RMG-1, OV-90, OVCAR-3, MCAS, and TOV-112D.
  • the same ovarian cancer cell line was cultured in a folic acid-free medium [folic acid-free RPMI 1640 (invitrogen) containing 10% inactivated dialyzed FCS] for 3 days. Thereafter, labeled folic acid was added to a final concentration of 100 nm and cultured at 37 ° C. for 3 hours.
  • the cells were washed with PBS at 37 ° C. and then cultured at 37 ° C. for 3 hours in a medium supplemented with 1 mM folic acid. After washing the cells with PBS, the cells were detached with trypsin (GIBCO) and suspended in FCM buffer. The fluorescence intensity was analyzed by flow cytometry, and the MFI value of each cell was determined. Similarly, the MFI value of the cells to which no labeled folic acid was added was determined, and the relative MFI value of the 100 nM labeled folic acid-added sample was calculated [FIG. 12 (b)].
  • the antibody of the present invention shows effective cytotoxic activity against SKOV-3 and OVCAR-3 having a low folate uptake (Example 54).
  • the above results indicate that the antibody of the present invention is effective even for cancers that do not exhibit antitumor activity due to folic acid conjugated with an anticancer agent or the like due to a small amount of folic acid uptake.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of FOLR1 SEQ ID NO: 2: base sequence of FOLR1-F SEQ ID NO: 3: base sequence of FOLR1-R SEQ ID NO: 4: base sequence of CyFOLR1-F SEQ ID NO: 5: base sequence of SEQ ID NO: CyFOLR1-R 6: nucleotide sequence of CyFOLR1_DNA SEQ ID NO: 7: amino acid sequence of CyFOLR1_AA SEQ ID NO: 8: nucleotide sequence of FOLR1-Fc-F SEQ ID NO: 9: nucleotide sequence of FOLR1-Fc-R SEQ ID NO: 10: nucleotide sequence of FOLR2-Fc-F SEQ ID NO: 11: base sequence of FOLR2-Fc-R SEQ ID NO: 12: base sequence of FOLR3-Fc-F SEQ ID NO: 13: base sequence of FOLR3-Fc-R SEQ ID NO: 14: base sequence of SEQ ID NO: CyFOLR1-Fc-F

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Abstract

　本発明は、ヒトＦＯＬＲ１発現細胞が関与する疾患に対して、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合し、さらに抗体依存的細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）などのエフェクター活性が高い抗ヒトＦＯＬＲ１抗体を提供する。本発明は、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合し、さらにＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有するモノクローナル抗体又は該抗体断片、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる該抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供することができる。

Description

抗ＦＯＬＲ１抗体
　本発明は、Ｆｏｌａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　α（以下、ＦＯＬＲ１と記す）に結合し、抗体依存的細胞傷害活性（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下ＡＤＣＣ活性と記す）及び／又は補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下、ＣＤＣ活性と記す）を発揮するモノクローナル抗体又は該抗体断片、該抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる該抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬に関する。
　ＦＯＬＲ１は、葉酸に高親和性を有するＧＰＩアンカー型の膜タンパク質であり、細胞の増殖や生存に重要な機能を有する（非特許文献１）。正常組織においてＦＯＬＲ１は、腎臓、肺、腸など、限局して発現している（非特許文献２）。
　また、その発現部位は、管腔側とされている。一方、癌組織におけるＦＯＬＲ１発現は管腔側に限局せず、卵巣癌（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、腎臓癌（非特許文献２）、肺癌（非特許文献２、非特許文献３）、乳癌（非特許文献２）、中皮腫（非特許文献４）など多くの癌種で高発現している。
　特に卵巣癌では、ＦＯＬＲ１発現量は、悪性度、進行、予後に影響することが報告されている（非特許文献５、非特許文献６）。さらに、卵巣癌患者の血清中に含まれる可溶型ＦＯＬＲ１は、健常人に比べて有意に増加していることも知られている（非特許文献７）。このようにＦＯＬＲ１は癌治療標的として、期待される分子である。
　ＦＯＬＲ１に対するマウスモノクローナル抗体として、ＬＫ２６が知られている（特許文献１）。このＬＫ２６は、癌治療抗体として患者に投与するために、ＣＤＲ移植法によるヒト化が行われた（特許文献２）。しかしながら、ヒト化に伴う顕著なアフィニティー低下が見られた。
　そこでＥｂｅｌらは、ヒト化ＬＫ２６抗体を元に、ＬＫ２６抗体と同等のＦＯＬＲ１に対するアフィニティーを有するＭＯＲＡｂ－００３抗体を作製した（非特許文献８）。ＭＯＲＡｂ－００３のｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性は、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性に基づくものと考えられている。
　しかしながら、ＭＯＲＡｂ－００３には、ＦＯＬＲ１陽性細胞に対する、葉酸、５－ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ（５－ＭＴＨＦ）、又はｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄの結合を阻害する活性はなく、抗体単独でＦＯＬＲ１陽性細胞の増殖を抑制する活性もないことが報告されている（非特許文献９）。
　ＭＯＲＡｂ－００３については、１２．５から４００ｍｇ／ｍ２を投与した第１相臨床試験で、安全性及び認容性が報告された（非特許文献１０）。さらに、プラチナ感受性再発卵巣癌患者を対象にした第２相臨床試験では、パクリタキセル及びカルボプラチンとＭＯＲＡｂ－００３を併用することで、優れた抗腫瘍活性を示すことが報告された。
　しかしながら、プラチナ耐性再発卵巣癌患者に対する臨床試験は、中間解析において、統計学的に予め設定された評価項目（無増悪生存期間、全生存期間）の改善目標に到達しない可能性が高い、として中止されている。
　ＦＯＬＲ１を癌治療標的とした薬剤としては、前記抗体以外に、例えば、葉酸に抗がん剤を接合したＥＣ－１４５等が挙げられる。葉酸に抗がん剤を接合した薬剤は、ＦＯＬＲ１が葉酸を取り込む性質に基づき薬効を発現する。従って、葉酸に抗がん剤を接合した薬剤は、体内のがん細胞がＦＯＬＲ１を発現していても、葉酸取り込み活性が低いがん細胞には無効と考えられる。
　固形癌に対する治療法と予後の改善は日進月歩している。しかしながら卵巣癌に関しては、１９８０年代にプラチナ製剤による治療法が登場して以降、顕著に予後が改善されたとは言えず（非特許文献１１）、依然として、婦人科癌による死亡の主要な原因である。この理由は、卵巣癌に、プラチナ製剤に対する耐性が生じ、再発した結果、治療が困難になることにあると考えられている。
　即ち、プラチナ製剤などの化学療法による奏効から再発までの期間を延長すること、卵巣癌のプラチナ製剤に対する耐性化を阻止すること、プラチナ製剤に対して耐性化した卵巣癌への治療法を確立すること、が卵巣癌治療の課題となっている。
　また、卵巣癌は、腹膜播種による腹水の貯留を伴い易く、プラチナ耐性卵巣癌では、特に腹水の貯留に伴うＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ）の低下が問題となることから、原発巣の癌細胞のみならず、腹膜播種や腹水に存在するがん細胞にも有効な治療薬が求められている。
　さらに、ＦＯＬＲ１が高発現していても、葉酸取り込み活性が低下しているがん細胞にも有効な治療薬が求められている。
欧州特許出願公開第０１９７４３５号明細書 米国特許第５９５２４８４号明細書
Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００６．１１９（２）：ｐ．２４３－５０． Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５．３３８（２）：ｐ．２８４－９３． Ｊ　Ｔｈｏｒａｃ　Ｏｎｃｏｌ，２０１２．７（５）：ｐ．８３３－８４０． Ｊ　Ｔｈｏｒａｃ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ　Ｓｕｒｇ，２００１．１２１（２）：ｐ．２２５－３３． Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，１９９７．７４（２）：ｐ．１９３－８． Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，１９９８．７９（２）：ｐ．１２１－６． ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２００９．４（７）：ｐ．ｅ６２９２． Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎ，２００７．７：ｐ．６． Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１２．７０（１）：ｐ．１１３－２０． Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２０１０．１６（２１）：ｐ．５２８８－９５． Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ，２０１１．１１（１０）：ｐ．７１９－２５．
　飛躍的に抗体のＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性を高めた抗ＦＯＬＲ１抗体は、治療困難なプラチナ耐性卵巣癌を始めとする、ＦＯＬＲ１ががん細胞に発現することを特徴とするがんの治療抗体として期待されている。
　本発明は、プラチナ耐性卵巣癌由来の細胞株に対してもｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を示す抗体又は該抗体断片を提供する。さらに、本発明は、該抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる該抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供する。
　本発明の要旨は以下である。
（１）以下の（ａ）～（ｃ）から選ばれる１の抗体と競合して、ヒトＦＯＬＲ１を特異的に認識し、前記抗体が結合するヒトＦＯＬＲ１に存在するエピトープと同じエピトープに結合し、かつ抗腫瘍活性を示すモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと記す）１～３がそれぞれ配列番号３０、３１、３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３、３４、３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含む抗体
（ｂ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３０、３１、３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３、３４、３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体で、配列番号３２（抗体Ｈ鎖のＣＤＲ３）で表されるアミノ酸配列中のシステインがスレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換された抗体
（ｃ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（２）遺伝子組換え抗体である、（１）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（３）ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（２）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（４）以下の（ａ）～（ｃ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
（ａ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３０～３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３～３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
（ｂ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３０、３１、３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３、３４、３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体で、配列番号３２（抗体Ｈ鎖のＣＤＲ３）で表されるアミノ酸配列中のシステインがスレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換された抗体
（ｃ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（５）配列番号１で表されるヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列に結合する、（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体及び該抗体断片。
（６）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である、（１）～（４）のいずれか１に記載の抗体断片。
（７）（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（８）（７）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（９）（８）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１０）（９）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）又は（４）に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
（１１）（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の治療方法。
（１２）（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体を含む、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の治療薬。
（１３）（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いる、ヒトＦＯＬＲ１又はヒトＦＯＬＲ１陽性細胞の免疫学的検出又は測定方法。
（１４）（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いて、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞を検出又は測定することを含む、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
（１５）（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含む、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の診断薬。
（１６）（１）～（４）のいずれか１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いて、当該抗体による治療有効性を治療開始前に判断する方法。
　本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合する。本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、高いＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有し、さらにプラチナ耐性卵巣癌由来の細胞株に対しても抗腫瘍活性を示す。
　本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、ＦＯＬＲ１低発現細胞にもＡＤＣＣ活性を有する。さらに、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、腹水に存在する、ＦＯＬＲ１を発現するがん細胞にもＡＤＣＣ活性を有する。加えて、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、ＦＯＬＲ１を発現するがん細胞に対し、その葉酸取り込み活性が低下していてもＡＤＣＣ活性を有する。
　また、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、ＦＯＬＲ１に対する葉酸の結合を阻害しない。ヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合し、かつ高いＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有する本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の治療及び診断等に有用である。
　また、本発明は、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該形質転換体を用いる該抗体又は該抗体断片の製造方法、該抗体又は該抗体断片を有効成分とする、治療薬及び診断薬を提供することができる。
図１は、シグナル配列を含まないＲＡ１５－７抗体重鎖可変領域及び各ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体重鎖可変領域（ＨＶ０、ＨＶ２、ＨＶ３、ＨＶ４、ＨＶ５、ＨＶ６、ＨＶ７、ＨＶ８、ＨＶ１０）のアミノ酸配列を示す。 図２は、シグナル配列を含まないＲＡ１５－７抗体軽鎖可変領域及び各ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体軽鎖可変領域（ＬＶ０、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４、ＬＶ６）のアミノ酸配列を示す。 図３は、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体の親和性を１００とした場合の、ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓに対するＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体の親和性評価結果（表面プラズモン共鳴法）を示す。 図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、ＦＯＬＲ１－Ｆｃ（黒丸）、カニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃ（白丸）、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ（黒三角）、及びＦＯＬＲ３－Ｆｃ（×）に対する各抗体（ＤＮＰＤＦ、ＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ）の反応性評価結果（ＥＬＩＳＡ）を示す。縦軸は吸光度、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。 図５（ａ）及び（ｂ）は、プラチナ耐性卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ－３又はＯＶＣＡＲ－３に対するＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体（黒丸）、ＨｕＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体（黒四角）、及びＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体（黒三角）のＡＤＣＣ活性評価結果を示す。縦軸はＡＤＣＣ活性（％）、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。 図６（ａ）及び（ｂ）は、卵巣癌細胞株ＩＧＲ－ＯＶ１に対するＣＤＣ活性を示す。縦軸はＣＤＣ活性（％）、横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を表す。図６（ａ）は、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体（黒丸）、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体（白丸）、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体（黒三角）、及びＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体（白三角）のＣＤＣ活性評価結果を示す。図６（ｂ）は、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体（黒丸）及びＭＯＲＡｂ－００３抗体（黒三角）のＣＤＣ活性評価結果を示す。 図７（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、卵巣癌細胞株ＩＧＲ－ＯＶ１、ＳＫＯＶ－３、又はＯＶＣＡＲ－３に対するＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体（黒丸）、ＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体（白三角）、及びＭＯＲＡｂ－００３抗体（黒三角）のＡＤＣＣ活性評価結果を示す。縦軸はＡＤＣＣ活性（％）、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。 図８は、マウスに皮下移植して進行癌としたプラチナ耐性卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ－３に対するＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ－７７０抗体（黒丸）及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ－７７０抗体（黒三角）の集積性評価結果を示す。縦軸は、腫瘍部位における内部標準ＤＮＰＤＦ－６８０抗体の蛍光強度に対するそれぞれの抗体の蛍光強度比、横軸は投与後時間（日）を表す。 図９は、プラチナ耐性卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３に対するＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体（黒丸）、ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体（白丸）、及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体（黒三角）のＡＤＣＣ活性評価結果を示す。縦軸はＡＤＣＣ活性（％）、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。 図１０は、マウスＩｇＧ２ａを陰性対象とし、卵巣癌細胞株ＩＧＲ－ＯＶ１、ＳＫＯＶ－３、ＯＶＣＡＲ－３、又はＭＣＡＳに発現するＦＯＬＲ１を、ＬＫ２６抗体を用いてフローサイトメトリーにより解析することにより、各卵巣癌細胞株上に発現するＦＯＬＲ１分子数を定量化した結果を示す。縦軸は一細胞あたりのＦＯＲＬ１発現分子数を示す。 図１１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、卵巣癌性腹水中の細胞集団に対し、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体（黒丸）、ＭＯＲＡｂ－００３抗体（黒三角）、及び陰性対象としてＤＮＰＤＦ抗体（×）を加えた時の、ＦＯＬＲ１陽性細胞への細胞障害活性を示す。縦軸は細胞障害活性（％）、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。ＦＺ１２、ＦＺ２１、ＦＺ２６、及びＦＺ４４は、それぞれ卵巣癌性腹水のドナーを示す。 図１２（ａ）及び（ｂ）は、各種卵巣癌細胞株のＦＯＬＲ１発現量及び葉酸取り込み量を解析した結果を示す。図１２（ａ）は、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体を用いてフローサイトメトリーによりＦＯＬＲ１発現量を解析した結果を示す。図１２（ｂ）は、標識化葉酸を用いてフローサイトメトリーにより葉酸取り込み量を解析した結果を示す。縦軸は陰性対象に対する相対ＭＦＩ値を、横軸は解析した卵巣癌細胞株を示す。
　本発明におけるヒトＦＯＬＲ１としては、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示されるアミノ酸配列を含み、かつヒトＦＯＬＲ１の機能を有するポリペプチド、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつヒトＦＯＬＲ１の機能を有するポリペプチド、及び配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつヒトＦＯＬＲ１の機能を有するポリペプチド、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトＦＯＬＲ１の機能を有するポリペプチドなどが挙げられる。
　ヒトＦＯＬＲ１の機能としては、リガンド（例えば、葉酸）との結合により、エンドサイトーシスを引き起こし、細胞内に葉酸を取り込むことをいう。
　配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得る方法としては、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９、（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などを用いて、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、即ち、ヒトＦＯＬＲ１をコードする遺伝子に部位特異的変異を導入する方法が挙げられる。
　欠失、置換又は付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　ヒトＦＯＬＲ１をコードする遺伝子としては、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示される塩基配列が挙げられる。配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつヒトＦＯＬＲ１の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＦＯＬＲ１の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、ならびに配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＦＯＬＲ１の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のヒトＦＯＬＲ１をコードする遺伝子に包含される。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、又は該配列を有するＰＣＲ産物又はオリゴＤＮＡを固定化したフィルター又はスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１：Ｃｏｒｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルター又はスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
　前記ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＦＯＬＲ１をコードする遺伝子に包含される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２５、３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．、７、６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）　ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５及びＺ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
　配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを得る方法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
　また、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも、前述の部位特異的変異導入法などを用いて得ることができる。
　さらに、配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、又は配列番号１又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６７２５で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法またはｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明のモノクローナル抗体（以下、本発明の抗体ともいう。）又は該抗体断片は、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合する抗体又は該抗体断片であり、抗腫瘍活性を有する。
　本発明におけるヒトＦＯＬＲ１の立体構造としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１番目から２５７番目で示されるアミノ酸配列を含むヒトＦＯＬＲ１が天然状態で取り得る構造と同等の構造を有していればいずれの構造でもよい。ヒトＦＯＬＲ１が天然状態で取り得る立体構造とは、ヒトＦＯＬＲ１の天然型の立体構造のことをいう。
　本発明における抗腫瘍活性とは、具体的には、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性が挙げられる。
　本発明におけるＡＤＣＣ活性とは、細胞表面のヒトＦＯＬＲ１に結合した抗体が、Ｆｃ部分を介して主にナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と記す）表面のＦｃγＲＩＩＩａに結合し、その結果、ＮＫ細胞から放出されるパーフォリン又はグランザイムなどの細胞傷害性分子によって生じる細胞融解反応である［Ｃｌａｒｋ　Ｍ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７）；Ｇｏｒｔｅｒ　Ａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２０，５７６（１９９９）］。
　本発明の抗体は、ＦＯＬＲ１高発現細胞のみならず、低発現細胞にもＡＤＣＣ活性を有する。また、本発明の抗体は、ＦＯＬＲ１低発現細胞に対して、従来の抗ＦＯＬＲ１モノクローナル抗体に比べてより高いＡＤＣＣ活性を示す。細胞におけるＦＯＬＲ１発現量は、ウエスタンブロット法や、公知の免疫学的検出法、蛍光細胞染色法等により確認することができる。
　具体的には、例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いる蛍光抗体染色法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］、フローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法等の方法が挙げられる。さらに本発明の抗体のＡＤＣＣ活性は、細胞の葉酸取り込み量に依存しない。本発明の抗体は、葉酸取り込み量が低いＦＯＬＲ１発現細胞に対しても、ＡＤＣＣ活性を有する。
　細胞における葉酸取り込み量は、例えば、通常の免疫学的検出又は測定法で用いられる標識体により標識された葉酸を用いて確認することができる。標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。
　本発明におけるＣＤＣ活性とは、細胞表面のヒトＦＯＬＲ１に結合した抗体が、Ｆｃ部分を介して補体系のＣ１の一成分であるＣ１ｑに結合し、その結果、Ｃ１からＣ９の各補体成分が活性化し、最終的にはＣ５からＣ９が膜侵襲複合体と呼ばれる孔形成重合体を細胞膜上で形成して細胞の溶解を引き起こす反応である［Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ．１９９９　Ｄｅｃ；２０（１２）：５７６－８２．］。
　前記抗体として、具体的には、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）のモノクローナル抗体及び該抗体断片が挙げられる。
（ｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３０、３１、３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３、３４、３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
（ｉｉ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３０、３１、３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３、３４、３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体で、配列番号３２（抗体Ｈ鎖のＣＤＲ３）で表されるアミノ酸配列中のシステインがスレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換された抗体
　また、本発明のモノクローナル抗体としてより具体的には、以下の（ａ）のモノクローナル抗体及び該抗体断片が挙げられる。
（ａ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
　さらに、本発明のモノクローナル抗体としては、前記モノクローナル抗体と競合して、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、前記モノクローナル抗体が結合するヒトＦＯＬＲ１に存在するエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体及び該抗体断片を挙げることができる。
　本発明において、モノクローナル抗体と競合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体と同一又は部分的に同一のヒトＦＯＬＲ１にエピトープ（抗原決定基ともいう）を有し、該エピトープに結合する抗体をいう。本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体とは、本発明のモノクローナル抗体が認識するヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列と同じ配列を認識し結合する抗体をいう。
　本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片が、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合することは、ヒトＦＯＬＲ１を固相化したものを用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織染色（ＩＨＣ）法、ヒトＦＯＬＲ１を発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法、蛍光細胞染色法等、特定の抗原と特定抗原に対する抗体の結合性を調べる方法により確認することができる。
　具体的には、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いる蛍光抗体染色法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］、フローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴、ＩＴＣ（ＤＫＳＨ社製）などを用いた等温滴定カロリメトリーなどの方法が挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片が、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合することを、Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴で確認する場合は、抗ＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、該抗体又は該抗体断片を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度のＦＯＬＲ１またはその融合体を流し、結合、解離を測定するのが好ましい。
　また、その他の公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
　ヒトＦＯＬＲ１を発現した細胞としては、該ＦＯＬＲ１を発現していればいずれの細胞でもよく、例えばヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株、又は遺伝子組換え技術により得られた細胞などが挙げられる。
　ヒト体内に天然に存在する細胞としては、例えば、癌患者体内において該ＦＯＬＲ１が発現している細胞が挙げられ、具体的には、卵巣癌細胞、腎臓癌細胞、子宮内膜癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、及び結腸癌細胞などが挙げられる［Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００５．３３８（２）：ｐ．２８４－９３．］。
　ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、例えば、前記の癌患者から得られた該ＦＯＬＲ１が発現している細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ＦＯＬＲ１を発現している細胞株が挙げられる。
　例えば、ヒトから樹立された細胞株である卵巣癌由来細胞株ＳＫＯＶ－３［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（以下、ＡＴＣＣと記す）番号：ＨＴＢ－７７］、ＴＯＶ－１１２Ｄ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１１７３１）、ＥＳ－２（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１９７８）、ＯＶ－９０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１１７３２）、ＰＡ－１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１５７２）、Ｃａｏｖ－３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－７５）、ＯＶＩＳＥ（ＪＣＲＢ細胞番号：ＪＣＲＢ１０４３）、ＭＣＡＳ（ＪＣＲＢ細胞番号：ＪＣＲＢ０２４０）、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－１６１）、ＩＧＲ－ＯＶ１（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、又はＲＭＧ－１（ＪＣＲＢ細胞番号：ＪＣＲＢ０１７２）などが挙げられる。
　遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、例えば、該ＦＯＬＲ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを昆虫細胞又は動物細胞などに導入することにより得られる、該ＦＯＬＲ１を発現した細胞などが挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、又は抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
　モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一であることが特徴である。
　エピトープとしては、例えば、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列、アミノ酸配列からなる立体構造、糖鎖が結合したアミノ酸配列及び糖鎖が結合したアミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
　本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープは、配列番号１で表されるヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０１６７２５．１）のうち、５５番目～６２番目のアミノ酸配列に含まれることが好ましい。
　本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列は、配列番号１の５５番目～６２番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を含むことが好ましく、５５番目、５６番目、５７番目、５８番目、５９番目、６０番目、６１番目、及び６２番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を含むことがより好ましい。
　また、本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列は、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列のうち、配列番号１の５５番目～６２番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した２以上のアミノ酸を含むことが好ましく、５５番目、５６番目、５７番目、５８番目、５９番目、６０番目、６１番目、及び６２番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を含み、かつ配列番号１の５５番目～６２番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した２以上のアミノ酸を含むことがより好ましい。
　具体的には、本発明のモノクローナル抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列としては、配列番号１の５５番目～６２番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列などが挙げられる。
　ハイブリドーマは、例えば、上記のヒトＦＯＬＲ１を発現した細胞などを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導し、さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、又は該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水がん化させ、該培養液又は腹水を分離、精製することにより抗ＦＯＬＲ１モノクローナル抗体を取得することができる。
　抗原を免疫する動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリ又はラビットなどが用いられる。また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ　ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
　本発明において遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体又は抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体は、例えば上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。
　ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）及び軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）とからなる抗体をいう。本発明のヒト型キメラ抗体は、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと記す）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
　本発明のヒト型キメラ抗体として具体的には、配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつ配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むキメラ抗体が挙げられる。
　さらに、本発明のキメラ抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、前記モノクローナル抗体が結合するヒトＦＯＬＲ１に存在するエピトープと同じエピトープに結合するキメラ抗体を挙げることができる。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト化抗体という場合もあり、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと記す）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものが用いられ、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３又はｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラス又はλクラスのものを用いることができる。
　本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、具体的には、ＣＤＲ１～３が配列番号３０～３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨを含み、かつＣＤＲ１～３が配列番号３３～３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が挙げられる。
　本発明のヒト化抗体として、具体的には、以下の（ａ）ＶＨ及び（ｂ）ＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号１００のアミノ酸配列、又は配列番号１００のアミノ酸配列の１８番目のＬｅｕ、３０番目のＳｅｒ、３７番目のＶａｌ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＧｌｙ、４５番目のＬｅｕ、４８番目のＶａｌ、７６番目のＡｓｐ、及び９５番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＨ
（ｂ）配列番号１０１のアミノ酸配列、又は配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、４３番目のＡｌａ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、８５番目のＴｈｒ、及び８７番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
　更に、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＨとしては、以下の（１）～（８）が好ましい。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕ、３０番目のＳｅｒ、３７番目のＶａｌ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＧｌｙ、４５番目のＬｅｕ、４８番目のＶａｌ、７６番目のＡｓｐ、及び９５番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＧｌｙ、４５番目のＬｅｕ、４８番目のＶａｌ、７６番目のＡｓｐ、及び９５番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒ、４０番目のＡｌａ、４４番目のＧｌｙ、４５番目のＬｅｕ、４８番目のＶａｌ、７６番目のＡｓｐ、及び９５番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４８番目のＶａｌ、及び９５番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌ、４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、及び４８番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（６）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａ、４１番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、及び９５番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（７）配列番号１００のアミノ酸配列中の４１番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、及び９５番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（８）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａ、及び９５番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
　前記ＶＨのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１００のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、又は９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　１０個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号１００のアミノ酸配列中の、１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
　９個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び７６番目のＡｓｐをＡｓｎに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号１００のアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
　８個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１１）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び７６番目のＡｓｐをＡｓｎに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び７６番目のＡｓｐをＡｓｎに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び７６番目のＡｓｐをＡｓｎに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び４８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
　７個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び７６番目のＡｓｐをＡｓｎに置換したアミノ酸配列
　６個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び４８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
　５個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び４８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
　４個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４１番目のＰｒｏをＡｌａに、及び４５番目のＬｅｕをＰｒｏに置換したアミノ酸配列
　３個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＰｒｏに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の４１番目のＰｒｏをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の４４番目のＧｌｙをＡｌａに、４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１００のアミノ酸配列中の４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
　２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の４１番目のＰｒｏをＡｌａに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１００のアミノ酸配列中の４４番目のＧｌｙをＡｌａに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１００のアミノ酸配列中の４５番目のＬｅｕをＰｒｏに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１００のアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＬｅｕに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号１００のアミノ酸配列中の７６番目のＡｓｐをＡｓｎに、及び９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
　１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１００のアミノ酸配列中の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１００のアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１００のアミノ酸配列中の３７番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１００のアミノ酸配列中の４０番目のＡｌａをＰｒｏに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１００のアミノ酸配列中の４１番目のＰｒｏをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１００のアミノ酸配列中の４４番目のＧｌｙをＡｌａに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１００のアミノ酸配列中の４５番目のＬｅｕをＰｒｏに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１００のアミノ酸配列中の４８番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号１００のアミノ酸配列中の７６番目のＡｓｐをＡｓｎに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号１００のアミノ酸配列中の９５番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
　また、本発明のヒト化抗体に含まれるＶＬとしては、以下の（１）～（４）が好ましい。
（１）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、４３番目のＡｌａ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、８５番目のＴｈｒ、及び８７番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
（２）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、４５番目のＬｙｓ、７１番目のＰｈｅ、及び８７番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
（３）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、７１番目のＰｈｅ、及び８７番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
（４）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４５番目のＬｙｓ、及び７１番目のＰｈｅが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む抗体のＶＬ
　前記ＶＬのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、８５番目のＴｈｒをＧｌｙに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　６個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、８５番目のＴｈｒをＧｌｙに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
　５個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、８５番目のＴｈｒをＧｌｙに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、８５番目のＴｈｒをＧｌｙに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、８５番目のＴｈｒをＧｌｙに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、８５番目のＴｈｒをＧｌｙに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＳｅｒに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、及び８５番目のＴｈｒをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　４個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、８５番目のＴｈｒをＧｌｙに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、８５番目のＴｈｒをＧｌｙに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、８５番目のＴｈｒをＧｌｙに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、及び８５番目のＴｈｒをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
　３個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（４）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、及び７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
　２個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、及び７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、及び７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＳｅｒに、及び７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１０１のアミノ酸配列中の７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、及び８５番目のＴｈｒをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１０１のアミノ酸配列中の７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、及び４５番目のＬｙｓをＧｌｎに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＳｅｒに、及び４５番目のＬｙｓをＧｌｎに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、及び８５番目のＴｈｒをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４５番目のＬｙｓをＧｌｎに、及び８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
　１個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）～（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号１０１のアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＳｅｒに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号１０１のアミノ酸配列中の４５番目のＬｙｓをＧｌｎに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号１０１のアミノ酸配列中の７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号１０１のアミノ酸配列中の８５番目のＴｈｒをＧｌｙに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号１０１のアミノ酸配列中の８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
　また、本発明のヒト化抗体の具体例としては、抗体のＶＨが配列番号９８及び／又は抗体のＶＬが配列番号９４のアミノ酸配列を含むヒト化抗体、抗体のＶＨが配列番号９８及び／又は抗体のＶＬが図２で示されるいずれかのアミノ酸配列を含むヒト化抗体、又は、抗体のＶＨが図１で示されるいずれかのアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＬが配列番号９４のアミノ酸配列を含むヒト化抗体などが挙げられる。
　さらに、本発明のヒト化抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と競合して、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、前記モノクローナル抗体が結合するヒトＦＯＬＲ１に存在するエピトープと同じエピトープに結合するヒト化抗体を挙げることができる。
　ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー及びヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
　ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
　ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
　ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
　上述の抗体又は抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換又は挿入され、かつ上述の抗体又は該抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体又は該抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片に包含される。
　欠失、付加、置換及び／又は挿入されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０、６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ、３４、３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３、４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、付加、置換もしくは挿入できる程度の数である。例えば、好ましくは１～数十個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、特に好ましくは１～５個である。
　上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、置換、又は挿入されたとは、次のことを示す。即ち、抗体のアミノ酸配列中において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、付加、置換、又は挿入があることを意味する。また、欠失、付加、置換、又は挿入が同時に生じる場合もあり、欠失、付加、置換、又は挿入されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
　天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、又はＬ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
　Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
　Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
　Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
　Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２、４－ジアミノブタン酸、２、３－ジアミノプロピオン酸
　Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
　Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
　Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　本発明において、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のＦａｂは、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体をパパインで処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素であるペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有する断片である。
　本発明のＦ（ａｂ’）２は、ヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体をペプシンで処理して得ることができる。また、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合させ、作製することもできる。
　Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと記す）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のｓｃＦｖは、本発明のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
　本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は既知の方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
　本発明のｄｓＦｖは、本発明のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
　本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
　本発明の抗体には、本発明のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質、又は抗体医薬などを化学的又は遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
　本発明における、抗体の誘導体は、本発明のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片のＨ鎖又はＬ鎖のＮ末端側又はＣ末端側、抗体又は該抗体断片中の適当な置換基又は側鎖、さらにはモノクローナル抗体又は該抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、蛋白質又は抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
　また、本発明のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体又は抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質又は抗体医薬をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
　放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、又は２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
　低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤若しくはキナーゼ阻害剤などの抗がん剤［臨床腫瘍学、癌と化学療法社（１９９６）］、又はハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン若しくはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
　抗がん剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５－フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０－ヒドロキシ－７－エチル－カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３（Ｆｌｔ３）阻害剤、Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７－アリルアミノ－１７－デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール－トランスレチノイン酸、サリドマイド、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ－ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマイシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、マイタンシノイド、又はその誘導体、などが挙げられる。
　低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、又は水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
　高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと記す）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、又はヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を抗体又は抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的又は生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失又は抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのｅ－アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１－１７８９２６号公報）、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６－２３５８７号公報）、又はアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２－１１７９２０号公報）などが挙げられる。
　免疫賦活剤としては、例えば、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、又はαガラクトシルセラミドなどが挙げられる。
　蛋白質としては、ＮＫ細胞、マクロファージ、又は好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカイン若しくは増殖因子、又は毒素蛋白質などが挙げられる。
　サイトカイン又は増殖因子としては、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）などが挙げられる。
　毒素蛋白質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシン、又はＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するために蛋白質に変異を導入した蛋白毒素も含まれる。
　抗体医薬としては、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原又は免疫機能を調節する抗原、病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。
　抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記す）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）－Ｃｌａｓｓ　ＩＩ、又はＥｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）などが挙げられる。
　腫瘍の病態形成に関わる抗原又は免疫機能を調節する抗原としては、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、又はＢ７－Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、又はＢＴＬＡ）、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、又はＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｇａｎｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、又はＴＲＡＩＬ－Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ　ｋａｐｐａ　Ｂ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ－２５、葉酸受容体４、サイトカイン［ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）β、又はＴＮＦαなど］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ－３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、又はＣＴＡＣＫなど）、又はこれらのケモカインの受容体が挙げられる。
　病変部位の血管新生を阻害する抗原としては、例えば、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ－８、Ｅｐｈｉｌｉｎ、ＳＤＦ－１、又はこれらの受容体などが挙げられる。
　蛋白質又は抗体医薬との融合抗体は、モノクローナル抗体又は抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
　本発明における抗体の誘導体を、ヒトＦＯＬＲ１の免疫学的検出又は測定、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の診断に使用する場合は、本発明のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造を特異的に認識し、かつ結合するモノクローナル抗体又は該抗体断片のＨ鎖又はＬ鎖のＮ末端側又はＣ末端側、抗体又は該抗体断片中の適当な置換基又は側鎖、さらにはモノクローナル抗体又は該抗体断片中の糖鎖などに結合させる薬剤として、通常の免疫学的検出又は測定法で用いられる標識体を選択することもできる。
　標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル若しくはロフィンなどの発光物質、又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
　また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有するＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の治療薬に関する。
　ＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患としては、ＦＯＬＲ１が発現している細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば、がんが挙げられる。
　がんとしては、例えば、血液がん、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌、中皮腫又は膵臓癌などが挙げられ、好ましくは卵巣癌、腎臓癌、肺癌、乳癌、膵臓癌又は中皮種が挙げられる。
　本発明の治療薬としては、上述した本発明のモノクローナル抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体を有効成分として含有する。
　本発明の抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療薬は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
　投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内若しくは静脈内などの非経口投与が挙げられ、好ましくは静脈内投与を挙げられる。
　投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
　投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、及び体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。
　本発明の治療薬は、単独で使用しても良く、前述の放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質、又は抗体医薬のうち、少なくとも１つの治療薬を併用しても良い。本発明の治療薬とその他の治療薬との併用方法としては、本発明の治療薬と併用される治療薬が、本発明の治療薬と同時に投与されても良いし、連続的に投与されても良い。
　さらに、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いるヒトＦＯＬＲ１又はヒトＦＯＬＲ１陽性細胞の免疫学的検出又は測定方法に関する。
　本発明における、免疫学的検出又は測定方法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。ＦＯＬＲ１の免疫学的検出又は測定方法としては、具体的には、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法、又は物理化学的手法等により、ＦＯＬＲ１又はＦＯＬＲ１陽性細胞を検出又は測定する方法が挙げられる。
　また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いて、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞を検出又は測定することを含む、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の診断方法に関する。
　ＦＯＬＲ１陽性細胞を検出又は測定するには、前述の公知の免疫学的検出法を用いることができる。好ましくは、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、又は免疫組織染色法などが用いられる。また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども用いることができる。
　本発明においてＦＯＬＲ１陽性細胞を検出又は測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液、又は培養液など、ＦＯＬＲ１が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　本発明における、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の診断方法としては、例えば、検出又は測定の対象とした生体試料で観測されたＦＯＬＲ１陽性細胞数を、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患と診断する指標とする方法が挙げられる。
　本発明は、本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の診断薬に関する。
　本発明の診断薬としては、上述した本発明のモノクローナル抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体を有効成分として含有する。
　本発明の診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩などが挙げられる。検出用試薬としては、該モノクローナル抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、又は標識に対応した基質など、通常の免疫学的検出又は測定法に用いられる試薬が挙げられる。
　以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、及び疾患の診断方法について、具体的に説明する。
１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
　抗原となるＦＯＬＲ１又はＦＯＬＲ１を発現させた細胞は、ＦＯＬＲ１全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。また、ＦＯＬＲ１を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などからＦＯＬＲ１を精製し、得ることができる。また、該腫瘍培養細胞、又は該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＦＯＬＲ１の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
　本発明で用いられるＦＯＬＲ１は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＦＯＬＲ１をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
　まず、ＦＯＬＲ１をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、発現ベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られた該発現ベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
　宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＦＯＬＲ１をコードする部分を含むＤＮＡ、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。また、該発現ベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該発現ベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　該発現ベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、該ＦＯＬＲ１をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＦＯＬＲ１の生産率を向上させることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４８、６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５３、２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２、２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌又はファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔ　Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ－１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９、２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ、１７、１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６８、１１１（１９７９）］が挙げられる。
　動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ　Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ、３２９、８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡ　Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、又はｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０８、９４５（１９５８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、５５、５１３（１９６８）；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、４１、１２９（１９７３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８、１１５（１９９６）；Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４８、２６０（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６０、１２７５（１９６８）；Ｃｅｌｌ、６、１２１（１９７５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ　Ｉ、ＩＩ（ｐｐ．８８３－９００））、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などが挙げられる。
　以上のようにして得られるＦＯＬＲ１をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ＦＯＬＲ１を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＦＯＬＲ１を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたＦＯＬＲ１を得ることができる。
　誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２２、５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８、３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、７３、１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
　ＦＯＬＲ１をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。
　ＦＯＬＲ１の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、又は生産させるＦＯＬＲ１の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　ＦＯＬＲ１が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．、４、１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＦＯＬＲ１を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
　また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２－２２７０７５号公報）を利用してＦＯＬＲ１の生産量を上昇させることもできる。
　得られたＦＯＬＲ１は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
　ＦＯＬＲ１が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
　前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
　ＦＯＬＲ１が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＦＯＬＲ１の不溶体を回収する。回収した該ＦＯＬＲ１の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ＦＯＬＲ１を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
　ＦＯＬＲ１又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＦＯＬＲ１又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
　また、本発明において用いられるＦＯＬＲ１は、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル－ベガ社製、パーセプチブ社製、又は島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
　３～２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＦＯＬＲ１ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
　免疫は、動物の皮下、静脈内又は腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
　抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに５～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
（３）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８、１（１９７８）］、Ｐ３－ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ－１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６、５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９（１９７８）］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２３、１５４８（１９７９）］、又はＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５）］などを用いる。
　該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、及び８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
　沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７～１４日間培養する。
　培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＦＯＬＲ１を含む抗原に反応し、ＦＯＬＲ１を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
（５）精製モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ－カラム又はプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）モノクローナル抗体の選択
　モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、及びＢｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析により行う。
（６－ａ）バインディングアッセイ
　抗原としては、（１）で得られるＦＯＬＲ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、又はヒト組織から得た精製ポリペプチド又は部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ又はＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
　抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳ又はＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質又は放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
　また、本発明の抗ＦＯＬＲ１モノクローナル抗体と競合してＦＯＬＲ１に結合するモノクローナル抗体は、上述のバインディングアッセイ系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。すなわち、被検抗体を加えた時にモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造への結合について、取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。
　さらに、本発明のＦＯＬＲ１のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープと、同じエピトープに結合する抗体は、上述のバインティングアッセイ系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。
（６－ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅによるｋｉｎｅｔｉｃｓ解析
　Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００を用い、抗原と被験物の間の結合におけるｋｉｎｅｔｉｃｓを測定し、その結果を機器付属の解析ソフトウエアで解析をする。抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリング法により固定した後、ハイブリドーマ培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を流し、適当量結合させ、さらに濃度既知の複数濃度の抗原を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、１：１バインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
　又は、ヒトＦＯＬＲ１をセンサーチップ上に、例えばアミンカップリング法により固定した後、濃度既知の複数濃度の精製モノクローナル抗体を流し、結合、解離を測定する。得られたデータを機器付属のソフトウエアを用い、バイバレントバインディングモデルによりｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を行い、各種パラメータを取得する。
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法を示す。
（１）　遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
　ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
　動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ、２７、２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４、１７３（１９９０）］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、７９（１９９３）］などを用いる。
　動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４９、９６０（１９８７）］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ、４１、４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ、３３、７１７（１９８３）］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６７、２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号公報）、ｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１７、５５９（１９９８）］などを用いる。
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
　前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
　ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４、３（１９８７）］、又はＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、又はＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、又はＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
　ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）］、ＳｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）、又はＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ　ＥｘＰｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１７、９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ、４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘ　Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３、２８０（１９８３）］、又はｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ、３３、１０３（１９８５）］などを用いる。
　ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ－１Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５、８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９、４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６、１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１１８（１９６６）］、又はＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ、３８、２７５（１９８５）］などを用いる。
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ又は蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と記す、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７４、５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社製）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
　決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
　分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
　また、得られたＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ又はＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５、４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。
　作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
　また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
　例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
　次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡ、ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。
　また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターに容易にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
　又は、設計したＤＮＡ配列に基づき、１本のＤＮＡとして合成された各Ｈ鎖、Ｌ鎖全長合成ＤＮＡを用いることで実施できる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、９、２６６（１９９１）］。
　ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、５３５（１９７７）］又はコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト型ＣＤＲ移植抗体を取得できる。
　ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、（４）及び（５）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト型ＣＤＲ移植抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
　発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、２８３（１９９１）］。
　ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ（１９９１）］、又はリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、７４１３（１９８７）］などを用いる。
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）及び（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２－２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３、１３３（１９９０）］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２、５５（１９８６）］、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
　また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質又はＮ－グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質、又は細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ－フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下又は欠失した宿主細胞、例えばα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）などを用いることもできる。
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２－２５７８９１号公報）。
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。
　得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２－２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０（１９７０）］、又はウエスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
３．精製モノクローナル抗体又は該抗体断片の活性評価
　精製した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
　ＦＯＬＲ１発現細胞株に対する結合活性は、前述の１．（６－ａ）記載のバインディングアッセイ及び（６－ｂ）記載のＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法を用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］などを用いて測定できる。
　抗原陽性培養細胞株に対するＣＤＣ活性、又はＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６、３７３（１９９３）］により測定する。
４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
　本発明の抗ＦＯＬＲ１モノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、又は抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明の抗ＦＯＬＲ１モノクローナル抗体にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。
　エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、又はマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＰ活性）などが知られている。
　エフェクター活性の測定法として、例えば、標的として癌細胞、エフェクターとしてヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、そして癌細胞特異的な抗体を混合し、４時間程度インキュベーションした後、細胞障害の指標として遊離してきた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することができる。もしくは、ヒトＰＢＭＣに、例えばＣＤ２０の様な血液細胞特異的な抗原を認識する抗体を混合し、インキュベーションした後、遊離ＬＤＨの測定やフローサイトメトリーによる該細胞数の減少をエフェクター活性として測定することができる。もしくは、癌性腹水に癌細胞特異的な抗体を混合し、インキュベーションした後、遊離ＬＤＨの測定やフローサイトメトリーによる該細胞数の減少をエフェクター活性として測定することができる。
　抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現することで、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。
　一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させることで、フコースが結合している抗体を取得できる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
　また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。
　また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書又は米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
　さらに、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性が制御された抗体を取得することができる。
５．本発明の抗ＦＯＬＲ１モノクローナル抗体又は該抗体断片を用いた疾患の治療方法
　本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片は、ＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の治療に用いることができる。
　本発明のモノクローナル抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する治療薬は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
　投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは腹腔内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
　経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などでが挙げられる。
　乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
　カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
　非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、又は噴霧剤などが挙げられる。
　注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
　坐剤はカカオ脂、水素化脂肪、又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。
　噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。
　さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
６．本発明の抗ＦＯＬＲ１モノクローナル抗体又は該抗体断片を用いた疾患の診断方法
　本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いて、ＦＯＬＲ１又はＦＯＬＲ１が発現した細胞を検出又は測定することにより、ＦＯＬＲ１が関連する疾患を診断することができる。
　ＦＯＬＲ１が関連する疾患の一つであるがんの診断は、例えば、以下のようにＦＯＬＲ１の検出又は測定して行うことができる。
　患者体内のがん原発巣、転移巣、もしくはがん性腹水中のがん細胞に発現しているＦＯＬＲ１をフローサイトメーターなどの免疫学的手法を用いて検出することにより診断を行うことができる。
　免疫学的手法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法又は物理化学的手法などを用いる。
　放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
　酵素免疫測定法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。
　酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、又はビオチン標識などを用いる。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出又は測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出又は測定したい抗原を認識する抗体又は抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体又は抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体又は抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、又はビオチンなどで標識しておく。
　上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞又はその破砕液、組織又はその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、又は眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体又は抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体又は抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体又は抗体断片との組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識が挙げられる。例えば、ＦＩＴＣ、又はＲＩＴＣなどが挙げられる。
　発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光　臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステル、ロフィンなどが挙げられる。
　ウエスタンブロット法は、抗原又は抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜又はニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体又は抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、又はビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体又は結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞又は組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりの蛋白量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動された蛋白質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１～１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと記す）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
　ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと記す）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。ウエスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
　物理化学的手法は、例えば、抗原であるＦＯＬＲ１と本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、例えば、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法又はラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などが挙げられる。
　ラテックス免疫比濁法は、抗体又は抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原又は抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度又は積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
　本発明の抗体又は該抗体断片を用いて、当該抗体による治療有効性を治療開始前に判断する方法としては、例えば以下が挙げられる。
　まず、治療開始前に、患者体内から癌性腹水を採取し、その懸濁液に本発明の抗体又は該抗体断片を添加し、一定時間後、抗腫瘍活性を測定する。測定の結果、抗腫瘍活性が観測された場合、その腹水を有する患者の治療には、本発明の抗体又は該抗体断片が有効であると治療開始前に判断することが出来る。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２、及びＦＯＬＲ３　ｃＤＮＡの入手
　ヒトＦＯＬＲ１（以下、ＦＯＬＲ１と記す、配列番号１）、ヒトＦＯＬＲ２（以下、ＦＯＬＲ２と記す）、及びヒトＦＯＬＲ３（以下、ＦＯＬＲ３と記す）のｃＤＮＡは、それぞれＳＣ１２２８５３（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、ＳＣ１１９６６６（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、及び＃１０００１５８３８（Ｏｐｅｎ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を購入し、以降の試験に用いた。
［実施例２］
ＦＯＬＲ１発現ベクターの構築
　まず、プライマーＦＯＬＲ１－Ｆ（配列番号２）及びＦＯＬＲ１－Ｒ（配列番号３）を用いて、ＦＯＬＲ１遺伝子をＰＣＲにより増幅した。増幅遺伝子が目的の配列であることを確認した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ認識配列でベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）と連結し、ＦＯＬＲ１遺伝子発現ベクターを構築した。
［実施例３］
ＦＯＬＲ１発現細胞の造成
　ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ（チャイニーズ・ハムスター卵巣）細胞ＤＧ４４株（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）を、三菱化学株式会社・横浜総合研究所より入手し、ＦＯＬＲ１発現細胞造成に使用した。培養には１０％非働化済み透析ウシ胎児血清（ｄＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ）、ＨＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）、及び５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシンを添加したＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ）（培養培地）を用いた。
　まず、ＦＯＬＲ１遺伝子発現ベクターをＡａｔＩＩ処理によって切断し、得られた直鎖状ＤＮＡを精製し、滅菌水に溶解した。このＤＮＡをエレクトロポレーション法により、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に導入し、ＨＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを抜いた培養培地にて３日程度培養した。その後、選択培地［ＩＭＤＭ、１０％　非働化済みｄＦＣＳ、０．５ｍｇ／ｍＬ　Ｇ４１８（ナカライ）、及び５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン］で薬剤耐性細胞を選択した。選択した薬剤耐性細胞を、９６ウェルプレートに７５ｃｅｌｌｓ／プレートとなる様に播種し、さらに２週間ほど選択培地にて培養した。ウェル毎に顕微鏡下で観察し、シングルクローンとなっているものを順次拡大培養した。
［実施例４］
ＦＯＬＲ１発現の確認
　得られた薬剤耐性細胞を０．０２％　ＥＤＴＡ溶液（ナカライ）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで懸濁した。次に、１ウェルあたり２×１０５個となるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ　で２μｇ／ｍＬに調製したＬＫ２６抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。
　細胞を洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ　で１００倍に希釈したＡｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞を１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ベックマンコールター社製、ＦＣ５００ＭＰＬ）で解析した。ＦＯＬＲ１が顕著に発現するクローンを選択し、この細胞をＦＯＬＲ１発現ＣＨＯ細胞とした。
［実施例５］
カニクイザルＦＯＬＲ１のクローニング
　凍結されたカニクイザル腎臓組織より、カニクイザルＦＯＬＲ１をクローニングした。数ｍｍ角の凍結腎臓組織にＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ）を加えて、ホモジナイザーペッスル（ＡｓＯｎｅ）を用いて組織をすりつぶした。室温で５分間静置した後、ＲＮＡｉｓｏ　ｐｌｕｓの推奨プロトコルに従ってｔｏｔａｌ　ＲＮＡを取得し、ＤＥＰＣ処理水（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解した。次にｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するため、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）及びオリゴｄＴをプライマーとして用いて逆転写反応を行った。
　次に、ヒトＦＯＬＲ１（ＮＭ＿０００８０２）及びアカゲザルＦＯＬＲ１（ＸＭ＿００１１１４６５５）を参考に設計した、プライマーＣｙＦＯＬＲ１－Ｆ（配列番号４）及びＣｙＦＯＬＲ１－Ｒ（配列番号５）を用いて、カニクイザルＦＯＬＲ１遺伝子をＰＣＲにより増幅した。
　ＰＣＲサンプルを２％アガロースゲルで電気泳動し、増幅されたバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で回収した。ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴＡクローニングし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｈｉｇｈ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ）に導入し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢプレートで３７℃、一晩培養した。その後、各コロニーを培養し、プラスミドをＮＡ－２０００（ＫＵＲＡＢＯ）で抽出した後、塩基配列をそれぞれ解析した。
　その結果、クローニングされたカニクイザルＦＯＬＲ１の塩基配列は配列番号６であることが明らかとなり、この配列に基づくアミノ酸配列（配列番号７）は、アカゲザルＦＯＬＲ１（ＸＭ＿００１１１４６５５）と同一であることが明らかとなった。
［実施例６］
ＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃ発現ベクターの構築
　ＦＯＬＲ１（１－２３３アミノ酸）、ＦＯＬＲ２（１－２２７アミノ酸）、ＦＯＬＲ３（１－２４３アミノ酸）、及びカニクイサルＦＯＬＲ１（１－２３３アミノ酸）のＣ末端にＨｕｍａｎ　ＩｇＧ１　Ｆｃ（Ｈｉｎｇｅ部及びＣＨ２－ＣＨ３部）を付加した組み換えタンパク質（以下、ＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃと記す）を発現するベクターを構築するため、ＰＣＲを実施した。
　ＦＯＬＲ１－Ｆｃ発現ベクター作製用プライマーとしてＦＯＬＲ１－Ｆｃ－Ｆ（配列番号８）及びＦＯＬＲ１－Ｆｃ－Ｒ（配列番号９）、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ発現ベクター作製用プライマーとしてＦＯＬＲ２－Ｆｃ－Ｆ（配列番号１０）及びＦＯＬＲ２－Ｆｃ－Ｒ（配列番号１１）、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ発現ベクター作製用プライマーとしてＦＯＬＲ３－Ｆｃ－Ｆ（配列番号１２）及びＦＯＬＲ３－Ｆｃ－Ｒ（配列番号１３）、そしてカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃ発現ベクター作製用プライマーとしてＣｙＦＯＬＲ１－Ｆｃ－Ｆ（配列番号１４）及びＣｙＦＯＬＲ１－Ｆｃ－Ｒ（配列番号１５）を用いた。
　ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて増幅した遺伝子を単離し、ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でサブクローニングした。目的配列を有するベクターを選択し、ＥｃｏＲＩ及びＡｈｄＩで目的配列を切り出した。
　一方、ｐＫＡＮＴＥＸ９３から、ＡｈｄＩ及びＳｐｅＩでＨｕｍａｎ　ＩｇＧ１　Ｆｃ領域を切り出した。切り出した目的配列とＨｕｍａｎ　ＩｇＧ１　Ｆｃ領域を、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで処理したｐＫＡＮＴＥＸ９３に連結し、ＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃ組換えタンパク質発現ベクターとした。
［実施例７］
ＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃ発現細胞の造成
　ＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃ発現細胞の造成には、ＣＨＯ／ＤＧ４４から作製されたＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ／ＤＧ４４細胞であるＣＨＯ／Ｍｓ７０４細胞（国際公開第０３／８５１０７号）を用いた。また、発現ベクターは、実施例６で作製したＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃ発現ベクターを用いた。通常継代時の培養、遺伝子導入及び薬剤耐性細胞の選択は、実施例３と同様に行った。
　選択した薬剤耐性細胞を順次拡大培養した後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、回収培地［ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２　Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ＣＨＯ　Ｃｅｌｌｓ（シグマアルドリッチ）、６ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－グルタミン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン］で１週間培養した。培養上清を回収し、次の精製に供した。
［実施例８］
ＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃの精製
　培養上清から、カラムに充填したＰｒｏＳｅｐ－ｖＡ　Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙを用いて、ＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃを精製した。
　まず、培養上清をカラムに通し、ＰＢＳでカラムを洗浄した後、ｐＨ５．０、３．５、３．０の溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸一水和物－ＮａＯＨ／ｐＨ５．０、３．５、３．０）で順に溶出した。溶出したフラクションは速やかに中和バッファー（２Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ｐＨ８．５）で中和した。それぞれのフラクションの吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、測定値の高い連続フラクションを抗体画分として回収した。ＰＢＳで透析を行い、０．２２μｍのフィルターを通したものを精製タンパク質とした。２８０ｎｍの吸光係数をそれぞれ、ＦＯＬＲ１－Ｆｃは２．２、ＦＯＬＲ２－Ｆｃは２．３、ＦＯＬＲ３－Ｆｃは２．１、カニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃは２．２として、濃度を算出した。
［実施例９］
ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現ベクターの構築
　ＦＯＬＲ１（１－２３３アミノ酸）のＣ末端にｍｙｃ及びＨｉｓタグを付加した組み換えタンパク質（以下、ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓと記す）を発現するベクターを構築するため、ＰＣＲを実施した。ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現ベクター作製用プライマーとしてＦＯＬＲ１－ｍＨ－Ｆ（配列番号１６）及びＦＯＬＲ１－ｍＨ－Ｒ（配列番号１７）を用いた。
　ＰＣＲ産物から目的配列を精製し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで処理したｐＫＡＮＴＥＸ９３に連結し、ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現ベクターとした。
［実施例１０］
ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現細胞の造成
　ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現細胞の造成には、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた。また、発現ベクターは、実施例９で作製したＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現ベクターを用いた。通常継代時の培養、遺伝子導入、薬剤耐性細胞の選択及び培養上清の回収は実施例７と同様に行った。
［実施例１１］
ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓの精製
　培養上清から、カラムに充填したＮｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓを精製した。
　まず、洗浄バッファー（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）、３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ）をカラムに流し、培養上清をカラムに通し、洗浄バッファーでカラムを洗浄した後、溶出バッファー（洗浄バッファーに５００ｍｍｏｌ／Ｌ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅを添加したもの）で溶出した。溶出したフラクションの吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、測定値の高い連続フラクションをＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ画分として回収した。ＰＢＳで透析を行い、０．２２μｍのフィルターを通したものを精製ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓとした。２８０ｎｍの吸光係数を２．８として、濃度を算出した。
［実施例１２］
ラットへの免疫
　ＦＯＬＲ１に対するモノクローナル抗体を取得するために、４週齢の雌ＳＤラットを免疫した。まず、５０μｇのＦＯＬＲ１－Ｆｃを、２ｍｇの水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　－　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）及び百日咳ワクチン（ナカライ）と共に、ＳＤラットに腹腔内投与した。初回投与２週間後より、５０μｇのＦＯＬＲ１－Ｆｃを１週間に１回の頻度で３回投与した。
［実施例１３］
ラット抗血清評価
　実施例１２の最終投与の３日後にＳＤラットの尾静脈より採血し、ＦＯＬＲ１に対する血清抗体価をフローサイトメトリーにて解析した。陽性対象細胞及び陰性対象細胞には、それぞれＦＯＬＲ１発現ＣＨＯ細胞及びＦＯＬＲ２発現ＣＨＯ細胞を用いた。
　まず、ＦＯＬＲ１発現ＣＨＯ細胞及びＦＯＬＲ２発現ＣＨＯ細胞を０．０２％　ＥＤＴＡ溶液（ナカライ）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで懸濁した。次に、１ウェルあたり５×１０５個となるように９６ウェルプレートに播種し、１５００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行った。
　上清を除いた後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで１００から１０００倍に希釈したＳＤラット血清を細胞に添加し、４℃で３０分間の反応を行った。細胞を洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に添加し、４℃で３０分間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞を１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリーで解析した。
［実施例１４］
ハイブリドーマの作製
　ＦＯＬＲ１発現ＣＨＯ細胞に対し、十分な血清抗体価を示したＳＤラットに対し、５０μｇのＦＯＬＲ１－Ｆｃを追加免疫した。その３日後、外科的にＳＤラットから脾臓を摘出し、細胞融合に供した。
　まず、摘出した脾臓をスライドガラスですりつぶし、組織をほぐした。この脾臓組織をＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により懸濁し、セルストレーナーを通すことにより、余分な組織を除いた。遠心分離により上清を除いた後、Ｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ　ｌｙｓｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（ＳＩＧＭＡ）を加えて溶血させた。ＭＥＭを加えて反応を止め、遠心分離により上清を除いた後、再びＭＥＭで懸濁し、脾臓細胞とした。
　得られた脾臓細胞に対し、１／８倍量のマウスミエローマ細胞株Ｐ３－Ｕ１を混合した。遠心分離により上清を除いた後、３７℃の温浴の中で暖めつつ、５００μＬのＰＥＧ溶液［Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　１０００（純正化学）及びＭＥＭをそれぞれ１ｍＬずつ混合し、ＤＭＳＯ（ナカライ）を３５０μＬ加えたもの］を穏やかに添加し、さらに４５ｍＬのＭＥＭを添加した。遠心分離により上清を除いた後、細胞をＨＡＴ培地［５００ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ）に対し、５ｍＬのＨＡＴ溶液（ＧＩＢＣＯ）、０．５ｍＬの５５ｍｍｏｌ／Ｌ　２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したもの］で懸濁した。得られたハイブリドーマを、９６ウェルプレートに播種し、培養した。
［実施例１５］
ハイブリドーマスクリーニング（ＡＢＩ８２００セルラーディテクションシステム）
　ハイブリドーマを１０日間培養した後、各ウェルの培養上清を採取し、ＦＯＬＲ１に対する反応性を蛍光抗体染色法（ＡＢＩ８２００セルラーディテクションシステム、以下、ＦＭＡＴと記す）により解析した。陽性対象細胞及び陰性対象細胞は、それぞれＦＯＬＲ１発現ＣＨＯ細胞及びＦＯＬＲ２発現ＣＨＯ細胞とした。まず、陽性対象細胞及び陰性対象細胞を０．０５％トリプシン溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で剥離し、１ウェルあたりそれぞれ１×１０４個／１００μＬとなるように９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。
　次に、１０μＬのハイブリドーマ培養上清、及び、最終的に１／５０００倍となるように希釈した５０μＬのＡｌｅｘａ６４７標識抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、各ウェルに添加した。室温で３時間反応させた後、ＦＭＡＴにより蛍光強度を解析した。ＦＭＡＴによってＦＯＬＲ１陽性ＣＨＯ細胞に特異的な反応が見られたウェルのハイブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングを２回行った。
［実施例１６］
ハイブリドーマスクリーニング（表面プラズモン共鳴法）
　クローニング後のハイブリドーマ培養上清を用いて、表面プラズモン共鳴法によりＦＯＬＲ１とのアフィニティーを測定した。測定機器はＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ１００（ＧＥヘルスケア）を用い、ＣＭ５チップ（ＧＥヘルスケア）を使用した。まず、Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を、アミンカップリング法にてＣＭ５チップに固定化した。
　次に、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファー（ＧＥヘルスケア）を用いてハイブリドーマ培養上清を流し、上清に含まれる抗体をＣＭ５チップにキャプチャーさせた。続いて５段階の濃度（１８８、３７５、７５０、１５００、３０００ｎｇ／ｍＬ）に希釈したＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓをアナライトとして流した。
　アフィニティーは、Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ法にて結合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）を解析した。速度論定数（ｋａ、ｋｄ、ＫＤ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ－１００　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア）を用い、１：１　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｅｌにより算出した。
　その結果、ＬＫ２６抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）及びＭＯｖ１８抗体（ＡＬＥＸＩＳ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）のＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓに対するアフィニティー（ＫＤ、ｋｄ／ｋａにより算出）は、それぞれ６６ｎｍｏｌ／Ｌ及び９２ｎｍｏｌ／Ｌであった。一方、ハイブリドーマＲＡ１５－７クローン（以下、ＲＡ１５－７と記す）の培養上清のＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓに対するアフィニティーは、１．９ｎｍｏｌ／Ｌであった。
　従って、ＲＡ１５－７培養上清は既存のＬＫ２６抗体及びＭＯｖ１８抗体に比べて、ＦＯＬＲ１に対して極めて高いアフィニティーを示す抗体を含むことが明らかとなった。
［実施例１７］
ＲＡ１５－７培養上清の反応性評価（フローサイトメトリー）
　ＬＫ２６抗体が反応を示すヒト卵巣癌細胞株ＰＡ－１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１５７２）に対する、ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体の反応性を、フローサイトメトリーで解析した。また、ＬＫ２６抗体が反応を示さないヒト卵巣癌細胞株ＴＯＶ－１１２Ｄ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１１７３１）を陰性対象として、ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体の反応性を同様に解析した。
　まず、ヒト卵巣癌細胞株ＰＡ－１及びＴＯＶ－１１２Ｄ細胞を０．０２％　ＥＤＴＡ溶液（ナカライ）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで懸濁した。次に、１ウェルあたり２×１０５個となるように９６ウェルプレートに播種し、１５００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＲＡ１５－７培養上清を１ウェルあたり５０μＬ添加し、４℃で３０分間の反応を行った。
　細胞を洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、４℃で３０分間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞を１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリーで解析した。
　その結果、ＬＫ２６抗体と同様に、ＲＡ１５－７培養上清はＰＡ－１に対してのみ反応が見られ、ＴＯＶ－１１２Ｄには反応が見られなかった。従って、ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体は、ＦＯＬＲ１を高発現する癌細胞を認識することが示唆された。
　同様に、カニクイザル腎臓由来細胞株ＪＴＣ－１２（ＲＣＢ１４８５、ＲＩＫＥＮ　ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫ）に対するＲＡ１５－７培養上清の反応性を、フローサイトメトリーで解析した。その結果、ＬＫ２６抗体と同様に、ＲＡ１５－７培養上清はＪＴＣ－１２細胞に対して反応を示した。従って、ＲＡ１５－７培養上清はヒトＦＯＬＲ１だけでなく、カニクイザルＦＯＬＲ１も認識する抗体を含むことが示唆された。
［実施例１８］
ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体のサブクラスの同定
　ＥＬＩＳＡ法により、ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体のサブクラスを同定した。
　まず、ＰＢＳで５０μｇ／ｍＬに調製した抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに分注し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳでウェルを洗浄後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。再度ＰＢＳでウェルを洗浄した後、ＲＡ１５－７培養上清を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間反応させた。
　各ウェルを０．０５％　ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄し、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したＨＲＰ標識された各ラットＩｇアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ）抗体及びラットκ鎖特異的抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。
　各ウェルをＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＴＳ［２．２－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾール－６－スルホン酸）アンモニウム、Ｗａｋｏ］基質液［（１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＡＢＴＳ、０．１ｍｏｌ／Ｌ　クエン酸バッファー（ｐＨ４．２）、０．１％　Ｈ２Ｏ２）］を５０μＬ／ウェル加えて室温で反応させた。十分に発色が確認された後、５％　ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体はラットＩｇＧ１κ抗体であることが明らかとなった。
［実施例１９］
ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体の特異性の評価（ＥＬＩＳＡ法）
　ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体のＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃに対する反応性を評価した。
　まず、ＰＢＳで１０００倍に希釈したｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＣＡＬＴＡＧ）を、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに分注し、４℃で一晩静置した。
　ＰＢＳでウェルを洗浄後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。再度ＰＢＳでウェルを洗浄した後、ＲＡ１５－７培養上清を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。各ウェルを０．０５％　ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄し、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃを５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。
　各ウェルを０．０５％　ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍に希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＰＯＤ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェル加えて室温で反応させた。十分に発色が確認された後、５％　ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体は、ヒト及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃには結合するが、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ及びＦＯＬＲ３－Ｆｃには結合しないことが示された。即ち、ＲＡ１５－７培養上清に含まれる抗体は、ヒト及びカニクイザルＦＯＬＲ１に特異的な抗体であることが示された。
［実施例２０］
ＲＡ１５－７抗体の精製
　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に５％のＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた培地で、ハイブリドーマＲＡ１５－７を１週間培養した。培養上清からのＲＡ１５－７抗体の精製は、実施例８と同様の方法で行った。２８０ｎｍの吸光係数を１．４として、濃度を算出した。
［実施例２１］
競合ＥＬＩＳＡ法による抗体結合性評価
　ＲＡ１５－７抗体、ＬＫ２６抗体、及びＭＯｖ１８抗体が、互いにＦＯＬＲ１に対して競合的に結合するのかを評価した。
　まず、ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに調製したそれぞれの抗体を、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに分注し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳでウェルを洗浄後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。再度ＰＢＳでウェルを洗浄した後、抗ＦＯＬＲ１抗体（０．０１２～３μｇ／ｍＬ）及びＦＯＬＲ１－Ｆｃ（０．２μｇ／ｍＬ）をそれぞれ５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。
　各ウェルを０．０５％　ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄し、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで５０００倍に希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＰＯＤ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェル加えて室温で反応させた。十分に発色が確認された後、５％　ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェル加えて反応を停止し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、ＦＯＬＲ１に対する結合において、ＲＡ１５－７抗体及びＬＫ２６抗体は競合的に結合することが明らかとなった。一方、ＦＯＬＲ１に対する結合において、ＲＡ１５－７抗体及びＭＯｖ１８抗体は競合せず、ＬＫ２６抗体及びＭＯｖ１８抗体も競合しないことが明らかとなった。
［実施例２２］
ＲＡ１５－７抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のクローニング
　ＲＮＡｉｓｏ　ｐｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、添付書に従い、ＰＢＳで洗浄したハイブリドーマＲＡ１５－７を溶解し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡは、ＤＥＰＣ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗａｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解した。
　次に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ　－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｆｒｏｍ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ）（Ｔａｋａｒａ）を用いて、添付書に従い、得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。さらに、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、添付書に従い、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。
　得られたｃＤＮＡを鋳型に、プライマーＲａｔＩｇＧ１Ｈ－Ａ（配列番号１８）及びＲａｔＩｇＧ１Ｈ－Ｂ（配列番号１９）を用いて、ラットＩｇＧ１重鎖遺伝子を、プライマーＲａｔｋ－Ａ（配列番号２０）及びＲａｔｋ－Ｂ（配列番号２１）を用いて、ラット軽鎖（κ鎖）遺伝子を、それぞれＰＣＲにより増幅した。増幅した遺伝子をサブクローニングし、塩基配列を解析した。
　その結果、シグナル配列を含むＲＡ１５－７抗体重鎖可変領域は、塩基配列が配列番号２２、アミノ酸配列が配列番号２３で表され、シグナル配列を含むＲＡ１５－７抗体軽鎖可変領域は、塩基配列が配列番号２４、アミノ酸配列が配列番号２５で表されることが明らかとなった。
　また、Ｋａｂａｔら［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］の報告から、シグナル配列を含まないＲＡ１５－７抗体重鎖可変領域は、塩基配列が配列番号２６、アミノ酸配列が配列番号２７で表され、シグナル配列を含まないＲＡ１５－７抗体軽鎖可変領域は、塩基配列が配列番号２８、アミノ酸配列が配列番号２９で表されることが明らかとなった。
　また、ＲＡ１５－７抗体重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３０、３１、及び３２で表されることが明らかとなった。さらに、ＲＡ１５－７抗体軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３３、３４、及び３５で表されることが明らかとなった。
［実施例２３］
ラット／ヒトキメラ型ＲＡ１５－７抗体発現ベクターの構築
　ＲＡ１５－７抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を、ヒトＩｇＧ１重鎖及びκ鎖定常領域遺伝子に連結することにより、ラット／ヒトキメラ型ＲＡ１５－７抗体発現ベクターを作製した。ヒトＩｇＧ１κの定常領域遺伝子を含むｐＫＡＮＴＥＸ９３をベクターとして用いた。
　まず、プライマーＲＡ１５－７－ＶＬＦ（配列番号３６）及びＲＡ１５－７－ＶＬＲ（配列番号３７）を用いて、ＲＡ１５－７抗体軽鎖可変領域遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物から目的配列を精製し、ＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩで処理したｐＫＡＮＴＥＸ９３に連結した。
　同様に、プライマーＲＡ１５－７－ＶＨＦ（配列番号３８）及びＲＡ１５－７－ＶＨＲ（配列番号３９）を用いて、ＲＡ１５－７抗体重鎖可変領域遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物から目的配列を精製し、ＮｏｔＩ及びＡｐａＩで処理した、ＲＡ１５－７抗体軽鎖可変領域遺伝子組み込み済みｐＫＡＮＴＥＸ９３と連結し、ラット／ヒトキメラ型ＲＡ１５－７（以下、ＣｈＲＡ１５－７と記す）抗体発現ベクターとした。
［実施例２４］
ＣｈＲＡ１５－７抗体及びフコースを含まない糖鎖が付加されたＣｈＲＡ１５－７抗体発現細胞の造成
　フコースを含む糖鎖が付加された（以下、従来型と称する）ＣｈＲＡ１５－７抗体の発現細胞の造成にはＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた。また、フコースを含まない糖鎖が付加された（以下、デフコース型と称する）ＣｈＲＡ１５－７（以下、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦと記す）抗体の造成にはＣＨＯ／Ｍｓ７０４細胞を用いた。また、発現ベクターは、実施例２３で作製したベクターを用いた。通常継代時の培養、遺伝子導入、薬剤耐性細胞の選択及び培養上清の回収は、実施例７と同様に行った。
［実施例２５］
ＣｈＲＡ１５－７抗体及びＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体の精製
　回収した培養上清からのＣｈＲＡ１５－７抗体及びＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体の精製は、実施例８と同様の方法で行った。従来型かデフコース型かに関わらず、２８０ｎｍの吸光係数を１．３７として、濃度を算出した。
［実施例２６］
ＣＤＣ活性増強技術を適応したデフコース型抗体発現ベクターの作製
　ＣＤＣ活性増強技術を適応したデフコース型の抗体を作製することを目的に、国際公開第２００７／０１１０４１号及び国際公開第２０１１／１０８５０２号の報告を参考にｐＫＡＮＴＥＸ９３の抗体重鎖定常領域を改変した。改変後の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４０及び４１で示す。このベクターに、ＲＡ１５－７抗体及びＭＯＲＡｂ－００３抗体（国際公開第２００５／０８０４３１号）の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を導入し、ＣＤＣ活性増強技術を適応したデフコース型のＣｈＲＡ１５－７（以下、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃと記す）抗体及びＭＯＲＡｂ－００３（以下、ＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃと記す）抗体発現ベクターとした。
［実施例２７］
ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体発現細胞の造成
　ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体発現細胞の造成には、ＣＨＯ／Ｍｓ７０４細胞を用いた。また、発現ベクターは実施例２６で作製したＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体発現ベクターを用いた。通常継代時の培養、遺伝子導入、薬剤耐性細胞の選択及び培養上清の回収は実施例７と同様に行った。
［実施例２８］
ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体の精製
　回収した培養上清からのＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体の精製は、実施例８と同様の方法で行った。ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体の２８０ｎｍの吸光係数をそれぞれ１．３４及び１．６０として、濃度を算出した。
［実施例２９］
ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体のアフィニティー測定（表面プラズモン共鳴法）
　表面プラズモン共鳴法により、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３抗体のＦＯＬＲ１に対するアフィニティーを測定した。ＣＭ５チップにＨｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）をアミンカップリング法で固定化すること、及び、５段階の濃度（１２．３、３７、１１１、３３３、１０００ｎｇ／ｍＬ）に希釈したＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓをアナライトとして流すこと以外は、実施例１６と同様に行った。
　その結果、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３抗体のＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓに対するアフィニティー（ＫＤ、ｋｄ／ｋａにより算出）は、それぞれ０．５７ｎｍｏｌ／Ｌ及び５７ｎｍｏｌ／Ｌだった（表１）。従って、ＲＡ１５－７抗体から作製されたラット／ヒトキメラ型抗体ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃは、既存抗体ＭＯＲＡｂ－００３に比べて、ＦＯＬＲ１に対する高いアフィニティーを示す抗体であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例３０］
ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体の結合性評価（ウエスタンブロット法）
　ウエスタンブロット法を用いて、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３抗体の反応性を評価した。
　まず、ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓをＬａｎｅ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ及びＬａｎｅ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｎｏｎ－Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）で懸濁し、１００℃で５分間処理することにより、それぞれ還元ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ及び非還元ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓとした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルｅ－ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ）に、還元及び非還元ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓを５倍ずつ５段階の濃度（０．５、２．７、１３、６７、３３３ｎｇ／レーン）でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。
　次に、泳動が終わったゲルをＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）に重ね、上下をトランスファーバッファー（１２．１ｇ　Ｔｒｉｓ、１４．４ｇ　グリシン、２００ｍＬ　メタノール／１Ｌ滅菌水）で浸したろ紙で挟み、転写を行った。
　その後、ＰＶＤＦメンブレンを１％　グロブリンフリーＢＳＡ（ナカライ）／ＴＢＳでブロッキングを行った。次に、１％　グロブリンフリーＢＳＡ／ＴＢＳで５μｇ／ｍＬに調製したＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３抗体をＰＶＤＦメンブレンに室温で１時間反応させた。
　このＰＶＤＦメンブレンを洗浄した後、１％　グロブリンフリーＢＳＡ／ＴＢＳで希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＰＯＤ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ）を、室温で１時間反応させた。
　再びＰＶＤＦメンブレンを洗浄した後、Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ　Ｏｎｅ　Ｓｕｐｅｒ（ナカライ）を１分間反応させ、ＰＶＤＦメンブレンの蛍光をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＬＡＳ　４０００　ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア）で検出した。
　その結果、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３抗体は、いずれも非還元ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓに対してのみ反応が見られ、ＦＯＬＲ１の高次構造を認識している抗体である事が示唆された。
　また、ＭＯＲＡｂ－００３抗体は６７ｎｇ以上の非還元ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓを検出したのに対し、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体は２．７　ｎｇ以上の非還元ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓを検出した。
　即ち、ＭＯＲＡｂ－００３抗体に対してＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体は、非還元状態のＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ検出感度が顕著に高いことが示された。
［実施例３１］
ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体とＭＯＲＡｂ－００３抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性比較
　卵巣癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を評価した。標的とする癌細胞株［Ｃａｏｖ－３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－７５）、ＰＡ－１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１５７２）、ＩＧＲ－ＯＶ１（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＳＫＯＶ－３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－７７）、ＲＭＧ－１（ＪＣＲＢ細胞番号：ＪＣＲＢ０１７２）、ＯＶＣＡＲ－３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－１６１）］を、培養フラスコから０．０２％　ＥＤＴＡ溶液（ナカライ）で剥離し、ＡＤＣＣ測定培地［フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）、５％非働化済みｄＦＣＳ（ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン（ナカライ）］で１×１０４ｃｅｌｌｓ／５０μＬに調製し、ターゲット細胞溶液とした。
　次に、ヘパリン処理した健常人末梢血を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（コスモバイオ）を充填したＬｅｕｃｏＳｅｐリンパ球分離チューブ（グライナー）に重層し、１０００×ｇで２０分間、室温で遠心分離を行った。遠心分離後、血清画分を除去し、ＰＢＭＣ層を回収した。ＡＤＣＣ測定培地で細胞を洗浄した。ＰＢＭＣを、ＡＤＣＣ測定培地で２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬに調製し、エフェクター細胞溶液とした。
　抗体溶液は、最終濃度が０．０３３、０．３３、３．３、３３、３３３ｎｇ／ｍＬとなるように、まず、ＡＤＣＣ測定培地で０．１、１、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍＬに調製した。
　上記の通りに調製したターゲット細胞溶液、エフェクター細胞溶液、そして抗体溶液を、Ｕ字底の９６ウェルプレートにそれぞれ５０μＬ／ウェルずつ混合し、全量で１５０μＬ／ウェルとした。それぞれのウェルを良く混合した後、５０×ｇ、５分間、室温の遠心分離により細胞を沈殿させ、３７℃で４時間反応させた。
　次に、それぞれのウェルをよく撹拌し、再び遠心分離で細胞を沈殿させた後、ウェルの上清をそれぞれ５０μＬずつ新しいＥＬＩＳＡプレートに分取した。分取した上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性をＣｙｔｏＴｏｘ　９６　Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いて測定した。操作は添付書に従って行った。
　ＡＤＣＣ活性の算出は、まず、各ウェルのＬＤＨ活性測定値からＡＤＣＣ測定培地のみのウェルのＬＤＨ活性測定値を引き、各ウェルのＬＤＨ活性測定補正値とした後、次の式で計算を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ここで、Ｅｘｐは各サンプルのＬＤＨ活性測定補正値、ＥＴ　ｓｐｏはエフェクター細胞溶液及びターゲット細胞溶液の混合ウェルのＬＤＨ活性測定補正値、Ｔ　ｔｏｔａｌはターゲット細胞とＣｙｔｏＴｏｘ　９６　Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙ添付のＬｙｓｉｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを混合したウェルのＬＤＨ活性測定補正値、ＤはＬｙｓｉｓ　ＳｏｌｕｔｉｏｎのＬＤＨ活性測定補正値、Ｔ　ｓｐｏはターゲット細胞のみのウェルのＬＤＨ活性測定補正値を示す。
　その結果、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体は、ＭＯＲＡｂ－００３抗体より低い濃度からＡＤＣＣ活性が検出され、最大細胞傷害活性も高かった。さらに、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体は、デフコース型のＭＯＲＡｂ－００３（ＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ）抗体に比べても低い濃度からＡＤＣＣ活性が検出され、最大細胞傷害活性も高かった。
　従って、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体は、既存の抗ＦＯＬＲ１ヒト化抗体（ＭＯＲＡｂ－００３）に既存のＡＤＣＣ活性増強技術（デフコース化）を組み合わせたＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体と比べ、高いＡＤＣＣ活性を有することが明らかとなった。同時に、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体は、卵巣癌に対する治療抗体として、ＭＯＲＡｂ－００３及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦより有用であることが示唆された。
［実施例３２］
ラット／ヒトキメラ型ＦＯＬＲ１発現ベクターの構築
　抗体のエピトープ解析をするため、ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓの塩基配列の一部をラットＦＯＬＲ１（ＮＭ＿１３３５２７）に置換したラット／ヒトキメラ型ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓを３種類（以下、Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、及びＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓと記す）作製した。
　Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓは、配列番号１で表されるヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列のうち、３から２８番目のアミノ酸配列を、配列番号１０２で表されるラットＦＯＬＲ１のアミノ酸配列のうち、３から２６番目に相当するアミノ酸配列に置き換え、Ｃ末端にｍｙｃ及びＨｉｓタグを付与したものである。
　Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓは、配列番号１で表されるヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列のうち、５５から６２番目のアミノ酸配列を、配列番号１０２で表されるラットＦＯＬＲ１のアミノ酸配列のうち、５３から６０番目に相当するアミノ酸配列に置き換え、Ｃ末端にｍｙｃ及びＨｉｓタグを付与したものである。
　Ｒａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓは、配列番号１で表されるヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列のうち、９１から９５番目のアミノ酸配列を、配列番号１０２で表されるラットＦＯＬＲ１のアミノ酸配列のうち、８９から９３番目に相当するアミノ酸配列に置き換え、Ｃ末端にｍｙｃ及びＨｉｓタグを付与したものである。
　Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、及びＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓの塩基配列は、それぞれ配列番号４２、配列番号４３、及び配列番号４４、アミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５、配列番号４６、及び配列番号４７に示した。
　それぞれの遺伝子を合成し、実施例９のＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現ベクター上のＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ遺伝子と置換することで、Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、及びＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現ベクターを構築した。
［実施例３３］
Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、及びＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現細胞の造成
　Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、及びＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ発現細胞の造成には、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた。また、発現ベクターは、実施例３２で作製したベクターを用いた。通常継代時の培養、遺伝子導入、薬剤耐性細胞の選択及び培養上清の回収は実施例７と同様に行った。
［実施例３４］
Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、及びＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓの精製
　Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、及びＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓの精製は、実施例１１と同様に行った。２８０ｎｍの吸光係数は、いずれも２．８として濃度を算出した。
［実施例３５］
ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体のエピトープ解析（ＥＬＩＳＡ法）
　実施例１１で作製したＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ及び実施例３４で作製したＲａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓを用いて、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３抗体、及びＭＯｖ１８抗体の反応性を評価した。
　まず、ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに調製したＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、及びＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓを、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに分注し、４℃で一晩放置した。ＰＢＳでウェルを洗浄後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。
　再度ＰＢＳでウェルを洗浄した後、１００００ｎｇ／ｍＬから３倍希釈ずつ７段階の濃度（１４、４１、１２３、３７０、１１１１、３３３３、１００００ｎｇ／ｍＬ）に１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで調製したＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３抗体、ＭＯｖ１８抗体をそれぞれ５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。
　各ウェルを０．０５％　ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄し、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体もしくはＭＯＲＡｂ－００３抗体を反応させたウェルには１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで５０００倍に希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＰＯＤ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ）を、ＭＯｖ１８抗体を反応させたウェルには１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで４００倍に希釈したＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ｒａｂｂｉｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＰＯＤ（Ｄａｋｏ）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。
　各ウェルをＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェル加えて室温で反応させた。十分に発色が確認された後、５％　ＳＤＳ溶液を加えて反応を停止し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果を、表２に示す。白丸は反応が見られたこと、×は反応が見られなかったことを示す。ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓには、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３抗体、及びＭＯｖ１８抗体が反応した。Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓには、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３抗体は反応したが、ＭＯｖ１８抗体の反応は見られなかった。
　Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓには、ＭＯＲＡｂ－００３抗体及びＭＯｖ１８抗体は反応したが、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体の反応は見られなかった。Ｒａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓには、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＭＯｖ１８抗体は反応したが、ＭＯＲＡｂ－００３抗体の反応は見られなかった。
　以上より、ＭＯｖ１８抗体はＲａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体はＲａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、ＭＯＲＡｂ－００３抗体はＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓにおいて、ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓアミノ酸配列をラット型に置換した領域を含む配列をそれぞれ認識することが示された。
　具体的には、ＭＯｖ１８抗体はＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓの３から２８番目のアミノ酸配列、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体はＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓの５５から６２番目のアミノ酸配列、及びＭＯＲＡｂ－００３抗体はＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓの９１から９５番目のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を認識する事が示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例３６］
ヒト化ＲＡ１５－７抗体重鎖及び軽鎖可変領域の設計
　まず、配列番号３０、３１、３２でそれぞれ表されるＲＡ１５－７重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体重鎖可変領域フレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を選択した。既知のヒト抗体重鎖可変領域配列はＴｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するＩｇ　Ｇｅｒｍｌｉｎｅ　Ｇｅｎｅｓデータベースにより、ＲＡ１５－７重鎖ＦＲ配列と相同性の高いヒト抗体配列を検索した。
　その結果、ＩＧＶＨ３－７２が最も相同性の高いヒト抗体配列であったため、この抗体のＦＲを選択した。以上のようにして決定したヒト抗体ＦＲ配列の適切な位置に配列番号３０、３１、３２で示したＲＡ１５－７重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を移植することで、ＨＶ０を設計した。
　次に、配列番号３３、３４、３５でそれぞれ表されるＲＡ１５－７軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体重鎖可変領域フレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を選択した。
　Ｋａｂａｔらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧ　Ｉ～ＩＶ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ　Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。
　そこで、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩ～ＩＶ（ｈＳＧＩ～ｈＳＧＩＶ）の共通配列のＦＲのアミノ酸配列とＲＡ１５－７軽鎖ＦＲ配列の相同性検索を実施した。その結果、ｈＳＧＩが最も相同性の高いヒト抗体軽鎖共通配列であった。以上のようにして決定したヒト抗体ＦＲ配列の適切な位置に配列番号３３、３４、３５で示したＲＡ１５－７軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を移植することで、ＬＶ０を設計した。
　次に、上記で設計したＨＶ０及びＬＶ０からなるヒト化抗体（ＨＶ０ＬＶ０）及びＣｈＲＡ１５－７抗体の可変領域の予想３次元構造をコンピューターモデリングにより構築し、構造比較をした。３次元構造の構築および座標データの可視化はＤｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｒｌｙｓ）を使用した。
　３次元構造比較の結果、ＣＤＲループ構造の保持などの抗原結合活性への寄与が大きいことが予想される残基、疎水性相互作用等により全体構造の維持に寄与している残基、及び分子表面に露出し潜在的な抗原性リスクが高いと予想される残基を、改変候補残基として同定した。
　選択した改変候補残基の１つ以上をＣｈＲＡ１５－７抗体の同位置に存在するアミノ酸残基と置換することで、各ヒト化抗体改変体を設計した。シグナル配列を含まないヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体の重鎖可変領域として、図１に示すアミノ酸配列の通り、ＨＶ０、ＨＶ２、ＨＶ３、ＨＶ４、ＨＶ５、ＨＶ６、ＨＶ７、ＨＶ８、ＨＶ１０を設計した。
　同様に、シグナル配列を含まないヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体の軽鎖可変領域として、図２に示すアミノ酸配列の通り、ＬＶ０、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４、ＬＶ６を設計した。
［実施例３７］
ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体発現ベクターの構築
　設計した、シグナル配列を含まない各ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体の重鎖及び軽鎖可変領域の塩基配列ＨＶ０、ＨＶ２、ＨＶ３、ＨＶ４、ＨＶ５、ＨＶ６、ＨＶ７、ＨＶ８、ＨＶ１０、ＬＶ０、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４、及びＬＶ６（配列番号４８～６１）をＣｈＲＡ１５－７発現ベクターの構築（実施例２３）と同様に、ｐＫＡＮＴＥＸ９３に導入した。
［実施例３８］
ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体発現細胞の造成
　ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体発現細胞の造成には、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトＣＨＯ－Ｋ１株（Ｔｓｕｋａｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ　＆　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ａｓｐｅｃｔｓ，１７５－１８３，２００６）を用いた。実施例３７で作製した各ヒト化抗体改変体発現ベクターを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　ＭＡＸ　ＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の操作手順書に従って一過性に導入した。これらの細胞を、一週間程度培養し、培養上清を回収した。
［実施例３９］
ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体の精製
　実施例３８で回収した培養上清から、各ヒト化抗体改変体をＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア）を用いて精製した。具体的には、担体を充填したカラムに、滅菌水、０．１Ｍ　クエン酸溶液（ｐＨ３．６）、及び０．２Ｍホウ酸Ｎａ／１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．５）を順に流し、平衡化した。
　培養上清をカラムに通した後、０．２Ｍホウ酸Ｎａ／１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄し、０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ３．６）で溶出した。溶出したフラクションは速やかに１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。
　それぞれのフラクションの吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、測定値の高い連続フラクションを抗体画分として回収した。緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で透析を行い、０．２２　μｍのフィルターを通したものを各ヒト化抗体改変体の精製抗体とした。２８０ｎｍの吸光係数を１．４として、濃度を算出した。
［実施例４０］
ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体のアフィニティー測定（表面プラズモン共鳴法）
　実施例２９と同様に表面プラズモン共鳴法により、各ヒト化抗体改変体のＦＯＬＲ１に対するアフィニティーを測定した。
　その結果、５種のヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体（ＨＶ７ＬＶ３、ＨＶ１０ＬＶ２、ＨＶ１０ＬＶ３、ＨＶ１０ＬＶ４、及びＨＶ１０ＬＶ６）のＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓに対するアフィニティーは、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃが有するアフィニティーの約７０％を保持していることが示された。
［実施例４１］
ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体ＨＶ７ＬＶ３のＣｙｓ（ＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１）改変体の設計
　ヒト化ＲＡ１５－７抗体改変体ＨＶ７ＬＶ３の重鎖ＣＤＲ３にはＣｙｓ（Ｃｙｓ１０１）が含まれている。Ｃｙｓ１０１を他のアミノ酸に置換するにあたり、Ｃｙｓと類似の分子構造、疎水性強度、単純構造アミノ酸などの要素を考慮し、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＧｌｎの計１４種類のアミノ酸を改変候補アミノ酸として選択した。
［実施例４２］
ＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体発現ベクターの構築
　ＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体発現ベクターを作製した。まず、鋳型としてＨＶ７可変領域遺伝子（配列番号６２）を組み込んだベクターを用いた。点変異導入キット［ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）］を添付書に従って用いて、Ｃｙｓ１０１を目的のアミノ酸に改変するための遺伝子変異を導入した。得られたＤＮＡ溶液をＸＬ１－Ｂｌｕｅ　へ形質転換し、形成したコロニーより、プラスミドを抽出した。
　Ｃｙｓ１０１が目的のアミノ酸に置換された、シグナル配列を含まないＨＶ７可変領域の塩基配列は、Ｍｅｔ（Ｃ１０１Ｍ＿ＤＮＡ）：配列番号６３、Ｇｌｙ（Ｃ１０１Ｇ＿ＤＮＡ）：配列番号６４、Ａｓｐ（Ｃ１０１Ｄ＿ＤＮＡ）：配列番号６５、Ｓｅｒ（Ｃ１０１Ｓ＿ＤＮＡ）：配列番号６６、Ｔｙｒ（Ｃ１０１Ｙ＿ＤＮＡ）：配列番号６７、Ａｌａ（Ｃ１０１Ａ＿ＤＮＡ）：配列番号６８、Ｉｌｅ（Ｃ１０１Ｉ＿ＤＮＡ）：配列番号６９、Ｖａｌ（Ｃ１０１Ｖ＿ＤＮＡ）：配列番号７０、Ｔｈｒ（Ｃ１０１Ｔ＿ＤＮＡ）：配列番号７１、Ｐｈｅ（Ｃ１０１Ｆ＿ＤＮＡ）：配列番号７２、Ａｒｇ（Ｃ１０１Ｒ＿ＤＮＡ）：配列番号７３、Ｔｒｐ（Ｃ１０１Ｗ＿ＤＮＡ）：配列番号７４、Ｐｒｏ（Ｃ１０１Ｐ＿ＤＮＡ）：配列番号７５、Ｇｌｎ（Ｃ１０１Ｑ＿ＤＮＡ）：配列番号７６でそれぞれ表された。
　Ｃｙｓ１０１が目的のアミノ酸に置換された、シグナル配列を含まないＨＶ７可変領域のアミノ酸配列は、Ｍｅｔ（Ｃ１０１Ｍ＿ＡＡ）：配列番号７７、Ｇｌｙ（Ｃ１０１Ｇ＿ＡＡ）：配列番号７８、Ａｓｐ（Ｃ１０１Ｄ＿ＡＡ）：配列番号７９、Ｓｅｒ（Ｃ１０１Ｓ＿ＡＡ）：配列番号８０、Ｔｙｒ（Ｃ１０１Ｙ＿ＡＡ）：配列番号８１、Ａｌａ（Ｃ１０１Ａ＿ＡＡ）：配列番号８２、Ｉｌｅ（Ｃ１０１Ｉ＿ＡＡ）：配列番号８３、Ｖａｌ（Ｃ１０１Ｖ＿ＡＡ）：配列番号８４、Ｔｈｒ（Ｃ１０１Ｔ＿ＡＡ）：配列番号８５、Ｐｈｅ（Ｃ１０１Ｆ＿ＡＡ）：配列番号８６、Ａｒｇ（Ｃ１０１Ｒ＿ＡＡ）：配列番号８７、Ｔｒｐ（Ｃ１０１Ｗ＿ＡＡ）：配列番号８８、Ｐｒｏ（Ｃ１０１Ｐ＿ＡＡ）：配列番号８９、Ｇｌｎ（Ｃ１０１Ｑ＿ＡＡ）：配列番号９０でそれぞれ表された。
　次に、ＨＶ７ＬＶ３抗体発現ベクターの重鎖可変領域遺伝子ＨＶ７を、Ｃｙｓ１０１が目的のアミノ酸に置換されたＨＶ７可変領域遺伝子と置換した。組換えにはＮｏｔＩ、ＡｐａＩ認識領域を使用した。得られたベクターをＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体発現ベクターとした。
［実施例４３］
ＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体発現細胞の造成及び培養
　ＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体発現細胞を、実施例４２で作製したベクターを用いて行った。発現細胞、遺伝子導入、培養上清の回収は、実施例３８と同様に行った。
［実施例４４］
ＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体の精製
　ＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体の精製及び濃度の算出は、実施例３９と同様に行った。
［実施例４５］
ＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体のアフィニティー測定（表面プラズモン共鳴法）
　実施例２９と同様に表面プラズモン共鳴法により、各ＨＶ７ＬＶ３－ＣＤＲＨ３－Ｃｙｓ１０１改変抗体のＦＯＬＲ１に対するアフィニティーを測定した。
　その結果、Ｃｙｓ１０１をそれぞれＩｌｅ（Ｃ１０１Ｉ）、Ｖａｌ（Ｃ１０１Ｖ）、Ｔｈｒ（Ｃ１０１Ｔ）、Ｐｈｅ（Ｃ１０１Ｆ）、Ｇｌｎ（Ｃ１０１Ｑ）、及びＭｅｔ（Ｃ１０１Ｍ）に改変した抗体のＦＯＬＲ１－ｍｙｓＨｉｓに対するアフィニティーは、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体が有するアフィニティーの５０％以上を保持していることが示された。
　具体的には、Ｃ１０１Ｉ、Ｃ１０１Ｖ、Ｃ１０１Ｔ、Ｃ１０１Ｆ、Ｃ１０１Ｑ、及びＣ１０１Ｍに改変した抗体は、それぞれＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体の７３％、５５％、８８％、８０％、６４％、及び５９％のアフィニティーを示した（図３）。この結果は、ＨＶ７ＬＶ３ヒト化抗体改変体に対し、Ｃ１０１Ｔに改変した（ＨｕＲＡ１５－７ＣＴ）抗体のアフィニティーが向上したことを示している。
　シグナル配列を含むＨｕＲＡ１５－７ＣＴ抗体の軽鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列は、配列番号９１及び９２に示した。また、シグナル配列を含まないＨｕＲＡ１５－７ＣＴ抗体の軽鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列は、配列番号９３及び９４に示した。
　同様に、シグナル配列を含むＨｕＲＡ１５－７ＣＴ抗体の重鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列は、配列番号９５及び９６に示した。また、シグナル配列を含まないＨｕＲＡ１５－７ＣＴ抗体の重鎖可変領域の塩基配列及びアミノ酸配列は、配列番号９７及び９８に示した。
　また、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴ抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３０、３１、及び９９に示した。さらに、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴ抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３３、３４、及び３５に示した。
［実施例４６］
ＣＤＣ活性増強技術を適応したデフコース型のＨｕＲＡ１５－７ＣＴ抗体発現ベクターの構築
　ＣＤＣ活性増強技術を適応したデフコース型のＨｕＲＡ１５－７ＣＴ（以下、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃと記す）抗体発現ベクターの構築は、軽鎖可変領域として配列番号９１を、重鎖可変領域として配列番号９５を用いて、実施例２６と同様に行った。
［実施例４７］
デフコース型のＨｕＲＡ１５－７ＣＴ抗体発現細胞及びＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体発現細胞の造成
　デフコース型のＨｕＲＡ１５－７ＣＴ（以下、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦと記す）抗体発現細胞及びＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体発現細胞の造成には、ＣＨＯ／Ｍｓ７０４を用いた。発現ベクターは、実施例４２で作製したＨｕＲＡ１５－７ＣＴ抗体発現ベクター、もしくは実施例４６で作製したＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体発現ベクターを用いた。通常継代時の培養、遺伝子導入、薬剤耐性細胞の選択、培養上清の回収は実施例７と同様に行った。
［実施例４８］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体及びＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体の精製
　培養上清からのＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体及びＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体の精製は、実施例８と同様に行った。２８０ｎｍの吸光係数をＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体は１．３８、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は１．３７として、濃度を算出した。
［実施例４９］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体のアフィニティー測定（表面プラズモン共鳴法）
　実施例２９と同様に表面プラズモン共鳴法により、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体のＦＯＬＲ１に対するアフィニティーを測定した。
　その結果、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体のＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓに対するアフィニティーは、ＫＤ値が０．６５ｎｍｏｌ／Ｌであった（表３）。従って、ＭＯＲＡｂ－００３抗体（ＫＤ＝５７ｎｍｏｌ／Ｌ、実施例２９）より顕著に高いアフィニティーでＦＯＬＲ１に結合する抗体であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例５０］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体及びＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体の特異性評価（ＥＬＩＳＡ法）
　ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体、及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体のＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃに対する反応性を評価した。
　まず、ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに調製したＦＯＬＲ１－Ｆｃ、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ、ＦＯＬＲ３－Ｆｃ、及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃを、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに分注し、４℃で一晩放置した。ＰＢＳでウェルを洗浄後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。再度ＰＢＳでウェルを洗浄した後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで７段階の濃度（１．４、４．１、１２、３７、１１１、３３３、１０００ｎｇ／ｍＬ）に調製したＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体、及び陰性対象としてデフコース型抗ＤＮＰヒトＩｇＧ１（ＤＮＰＤＦ）抗体をそれぞれ５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。
　各ウェルを０．０５％　ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄し、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍に希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ｋａｐｐａ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェル加えて室温で反応させた。十分に発色が確認された後、５％　ＳＤＳ溶液を加えて反応を停止し、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
　その結果、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体、及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体は、ヒト及びカニクイザルＦＯＬＲ１－Ｆｃに対しては同等の結合活性を有するが、ＦＯＬＲ２－Ｆｃ及びＦＯＬＲ３－Ｆｃには結合しないことが示された（図４）。即ち、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体、及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体は、ヒト及びカニクイザルＦＯＬＲ１に特異的な抗体であることが示された。
［実施例５１］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体による免疫組織染色
　ＯＣＴコンパウンドに包埋され、凍結された、ヒト正常組織アレイ（大脳、小脳、心臓、肺、胃、小腸、肝臓、膵臓、唾液腺、腎臓、甲状腺、副腎、骨格筋、脾臓、卵巣、子宮、胎盤、皮膚、乳腺）に対する免疫組織染色（ＩＨＣ）を、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ及び陰性対象抗体としてＤＮＰＤＦを用いて実施した。
　まず、アセトンによる固定を－２０℃で５分間行い、風乾を１０分間行った後、０．１％　ＮａＮ３及び０．３％Ｈ２Ｏ２を含むＰＢＳによる内因性ペルオキシダーゼの失活を室温で行った。続いて、ビオチンブロッキングシステム（Ｄａｃｏ）による、内因性ビオチンの失活を行った。
　さらに、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳにてブロッキングを行った。次に、１μｇ／ｍＬに調製したＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３抗体、及びＤＮＰＤＦ抗体を、室温で１時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄を行った。ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ）を添加し、５分間反応させ、ＰＢＳで洗浄した。０．０２％　Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳで調製したＤＡＢ　Ｔａｂｌｅｔ（Ｗａｋｏ）を添加し、発色のために１０分間反応させた。マイヤーヘマトキシリン（Ｗａｋｏ）を２秒程度反応させ、流水で洗浄し、核を染めた。
　染色されたサンプルを、７０％　エタノールで５分間、９５％　エタノールで５分間、そして１００％　エタノールで５分間処理し、さらに１００％　エタノールによる処理を３回繰り返した。続いて、１００％　キシレンで５分間処理する操作を３回繰り返し、透徹を行った。最後に、エンテランニュー（メルク）で封入した。
　染色標本を観察した結果、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体の染色が陽性であった組織は、肺（肺胞）、胃（粘膜）、小腸（粘膜、粘膜筋板）、膵臓（導管、腺房細胞）、肝臓（胆管）、唾液腺（腺房細胞、導管）、腎臓（尿細管、糸球体）、副腎（皮質細胞、間質組織）、甲状腺（濾胞、傍濾胞細胞）、乳腺（腺房）、子宮（頸管上皮）、卵巣（上皮）、胎盤（合胞体性栄養膜細胞）、皮膚（汗腺）であり、文献［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，１９９２．５２（２３）：ｐ．６７０８－１１．、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００６．１１９（２）：ｐ．２４３－５０．］の報告と同様であることが示唆された。
　次に、ヒト卵巣癌組織８例（漿液性嚢胞癌４例、漿液性嚢胞腫１例、粘液性嚢胞癌２例、境界型粘液性嚢胞腫１例）について、同様の染色を実施した。また、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体及び陰性対象抗体のＤＮＰＤＦ抗体に加えて、ＭＯＲＡｂ－００３抗体も染色に使用した。
　その結果、漿液性では５例中５例（１００％）、粘液性では３例中１例（３３％）において、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３抗体による染色が可能であることが示された。また、両抗体で染色された組織サンプルは、染色された領域が同じであったことから、卵巣癌に対する両抗体の特異性は等しい事が示された。さらに、ＭＯＲＡｂ－００３抗体と比べてＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は、より強く染色できることが明らかとなった。
　次に、上記染色サンプルの染色性を、Ｈスコアにより定量化した。Ｈスコアは、癌細胞の中で陽性に染色された細胞の染色強度を４段階で判定し、各スコアの癌細胞における陽性占拠率（％）を５％刻みで求めた後、各スコアと陽性占拠率を乗算した値の総和とした。
　その結果、ＭＯＲＡｂ－００３抗体及びＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体共に染色が認められた漿液性嚢胞癌４例、漿液性嚢胞腫１例、及び粘液性嚢胞癌１例について、何れのサンプルにおいても、ＭＯＲＡｂ－００３抗体に対してＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体がより高いＨスコアを示した。一方、粘液性嚢胞癌１例及び境界型粘液性嚢胞腫１例については、どちらの抗体においても染色が認められなかったため、Ｈスコアは０であった。
　以上より、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は卵巣癌に発現するＦＯＬＲ１に対し、既存卵巣癌治療抗体ＭＯＲＡｂ－００３より強く結合することが示唆された。
［実施例５２］
ラット／ヒトキメラ型抗体及びヒト化抗体のＡＤＣＣ活性評価
　ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体、ＣＤＣ活性増強技術を適応したデフコース型ＨＶ７ＬＶ３ヒトＩｇＧ１（ＨｕＲＡ１５－７Ａｃｃ）抗体、及びＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体を用いて、実施例３１と同様に、卵巣癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を評価した。
　その結果、プラチナ耐性卵巣癌由来のＳＫＯＶ－３細胞及びＯＶＣＡＲ－３細胞に対し、ＨｕＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体のいずれのＡＤＣＣ活性もＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体と同等であることが示された（図５）。
［実施例５３］
ラット／ヒトキメラ型抗体及びヒト化抗体のＣＤＣ活性評価
　卵巣癌細胞株に対するＣＤＣ活性を評価した。
　標的とする癌細胞株ＩＧＲ－ＯＶ１を、培養フラスコから０．０２％　ＥＤＴＡ溶液（ナカライ）で剥離し、ＣＤＣ測定培地［フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）、１．４％　ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）］で１×１０４ｃｅｌｌｓ／５０μＬに調製し、ターゲット細胞溶液とした。
　次に、ヒト血清凍結乾燥品（ＳＩＧＭＡ）を精製水　１ｍＬで溶解し、さらにＣＤＣ測定培地１ｍＬ加えて補体溶液とした。抗体溶液は、最終濃度が０．０３２、０．１６、０．８、４．０、２０、１００μｇ／ｍＬとなるように、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体、ＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体、及びＭＯＲＡｂ－００３を、まず、ＣＤＣ測定培地で０．０９６、０．４８、２．４、１２、６０、３００μｇ／ｍＬに調製した。
　上記の通りに調製したターゲット細胞溶液、補体溶液、そして抗体溶液を、平底の９６ウェルプレートにそれぞれ５０μＬ／ウェルずつ混合し、全量で１５０μＬ／ウェルとした。それぞれのウェルを良く混合した後、３７℃で２時間反応させた。次に、それぞれのウェルをよく撹拌し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　９６　ＡＱｕｅｏｕｓ　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を３０μＬ／ｗｅｌｌで加え、攪拌後、さらに３７℃で１時間程度反応させた。十分な発色が見られた後、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
　ＣＤＣ活性の算出は、まず各ウェルの吸光度測定値から、ＣＤＣ測定培地と補体溶液を混合したウェルの吸光度測定値を引き、各ウェルの吸光度補正値とした後、次の式で計算を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　ここで、Ｅｘｐは各サンプルの吸光度補正値、ＳＴはターゲット細胞溶液及び補体溶液の混合ウェルの吸光度補正値を示す。
　その結果、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体及びＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体は、それぞれＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体及びＣｈＲＡ１５－７ＤＦ抗体に対し、有意に高いＣＤＣ活性を示すことが明らかとなった［図６（ａ）］。さらに、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は、ＭＯＲＡｂ－００３より有意に高いＣＤＣ活性を示した［図６（ｂ）］。
［実施例５４］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体と既存抗ＦＯＬＲ１抗体のＡＤＣＣ活性比較
　ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体、及びＭＯＲＡｂ－００３抗体を用いて、実施例３１と同様に、卵巣癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を評価した。
　その結果、プラチナ耐性卵巣癌由来のＳＫＯＶ－３細胞及びＯＶＣＡＲ－３細胞に対し、ＭＯＲＡｂ－００３及びＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体より低濃度からＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体のＡＤＣＣ活性が検出された（図７）。即ち、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は、既存の抗ＦＯＬＲ１ヒト化抗体（ＭＯＲＡｂ－００３）に既存のＡＤＣＣ活性増強技術（デフコース化）を組み合わせたＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体と比べ、高いＡＤＣＣ活性を有することが明らかとなった。
　同様に、ＩＧＲ－ＯＶ１細胞に対し、ＭＯＲＡｂ－００３抗体より低濃度からＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体のＡＤＣＣ活性が検出された。また、卵巣癌細胞株に対するＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ抗体のＡＤＣＣ活性は、ＩＧＲ－ＯＶ１、ＳＫＯＶ－３、そしてＯＶＣＡＲ－３細胞の順で低下するが、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体のＡＤＣＣ活性はいずれの卵巣癌細胞株に対しても、ほぼ同等であった。
　以上より、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は、プラチナ耐性卵巣癌に対する治療抗体として、既存抗体（ＭＯＲＡｂ－００３）及び既存抗体に既存技術を組み合わせた抗体（ＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ）より有用であることが示唆された。
［実施例５５］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体の腫瘍集積性評価
　ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体の動態を蛍光イメージングにより解析した。まず、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体をそれぞれＸｅｎｏＬｉｇｈｔ　ＣＦ　７７０　Ｋｉｔで標識し（ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ－７７０抗体及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ－７７０抗体）、陰性対象としてＤＮＰＤＦ抗体をＸｅｎｏＬｉｇｈｔ　ＣＦＴＭ　６８０　Ｋｉｔで標識した（ＤＮＰＤＦ－６８０抗体）。標識された各抗体の結合性は、ＳＫＯＶ－３細胞に対するフローサイトメトリー反応性で確認した。また、各抗体の標識化率を添付書に従って求めた。
　培養したＳＫＯＶ－３細胞をＰＢＳに懸濁し、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ－ｎｕ／ｎｕマウス（メス、５週齢、日本クレア）の側方背部に皮下移植した。移植した腫瘍の体積が約２００ｍｍ３になったところでアルファルファフリーの飼料に変更し、さらに１週間飼育した。一群あたり４匹のマウスとし、平均腫瘍体積が同等となるよう無作為にマウスを３群に分けた。
　次に、１０μｇのＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ－７７０抗体またはＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ－７７０抗体と、２μｇのＤＮＰＤＦ－６８０抗体を混合し、ＰＢＳで全量を２００μＬとしたものを、マウスの尾静脈に投与した。投与した抗体の動態は、ＩＶＩＳ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いてマウスからの蛍光強度を撮影し、評価した。投与４時間後に最初の撮影し、以後経時的に撮影した。
　撮影されたマウスのＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ－７７０抗体及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ－７７０抗体由来の蛍光強度は、各投与抗体溶液の蛍光強度で補正した。また、ＤＮＰＤＦ－６８０抗体由来の蛍光強度をマウス内部標準として、観察されたＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ－７７０抗体及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ－７７０抗体の蛍光強度との比を算出し、それぞれの抗体の動態を評価した。
　その結果、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＤＦ－７７０抗体は、ＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ－７７０抗体に比べ、移植したＳＫＯＶ－３腫瘍塊に顕著に多く、かつ長時間局在することが明らかとなった（図８）。以上の結果は、本発明の抗体が、プラチナ耐性卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ－３由来の進行癌に対し、顕著な集積性及び残存性を示し、癌治療抗体としてより高い抗腫瘍活性を示唆するものである。
［実施例５６］
カニクイザル単回投与試験
　ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体（１００　ｍｇ／ｋｇ）をカニクイザル（メス、４～６歳、３頭）に静脈内投与し、その影響を解析した。検査項目としては、一般状態観察、体重、摂餌量、体温、尿検査（尿量、尿比重、尿タンパク質、尿糖、クレアチニン、ＮＡＧ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ）、血液学的検査（白血球、リンパ球、Ｔ細胞、Ｔｈ細胞、Ｔｃ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、単球、好酸球、好塩基球、大型非染色球、赤血球、Ｈｂ濃度、Ｈｔ値、網状赤血球、血小板、ＰＴ、ＡＰＴＴ、フィブリノーゲン）、血液生化学的検査（ＡＬＴ、ＡＬＰ、ＡＳＴ、ＣＫ、ＣＲＰ、ＩＬ－６、Ｃ３、Ｃ４、ＣＨ５０、総ビリルビン、総タンパク質、アルブミン、グロブリン、トリグリセリド、総コレステロール、血糖、ＢＵＮ、クレアチニン、無機リン、Ｃａ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ）、剖検、器官重量、病理組織学的検査を実施した。
　その結果、炎症、免疫反応に関連する変化が認められたが軽微であり、また、プラセボ投与においても同様の変化が認められた。従って、いずれの検査項目においても、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体特異的な毒性は見られなかった。
［実施例５７］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体発現ベクターの作製
　Ｃｙｓ１０１をＡｒｇにアミノ酸置換したＨＶ７ＬＶ３ヒト化抗体改変（ＨｕＲＡ１５－７ＣＲ）抗体発現ベクター（実施例４２）を用い、実施例２６と同様にＣＤＣ活性増強技術を適応し、ＣＤＣ活性増強技術を適応したデフコース型のＨｕＲＡ１５－７ＣＲ（以下、ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃと記す）抗体発現ベクターとした。
［実施例５８］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体発現細胞の造成
　ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体発現細胞の造成には、ＣＨＯ／Ｍｓ７０４細胞を用いた。また、発現ベクターは実施例５７で作製したＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体発現ベクターを用いた。通常継代時の培養、遺伝子導入、薬剤耐性細胞の選択及び培養上清の回収は実施例７と同様に行った。
［実施例５９］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体の精製
　回収した培養上清からのＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体の精製は、実施例８と同様の方法で行った。ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体の２８０ｎｍの吸光係数を１．３７として、濃度を算出した。
［実施例６０］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体のアフィニティー測定（表面プラズモン共鳴法）
　表面プラズモン共鳴法により、ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体のＦＯＬＲ１に対するアフィニティーを測定した。ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体、ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体、及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体を用いて、操作は実施例２９と同様に行った。
　その結果、ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体のＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓに対するアフィニティーは、それぞれＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体が有するアフィニティーの２．６％及び１．１％であった。
［実施例６１］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体のＡＤＣＣ活性評価
　ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体、ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体、及びＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体を用いて、実施例３１と同様に、卵巣癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を評価した。
　その結果、プラチナ耐性卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ－３に対し、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体、ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体の順に、より低い抗体濃度からのＡＤＣＣ活性が示された（図９）。即ち、ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体はＭＯＲＡｂ－００３ＤＦ抗体と同等のアフィニティーを有する（実施例６０）にも関わらず、ＨｕＲＡ１５－７ＣＲＡｃｃ抗体は、ＭＯＲＡｂ－００３ＤＦより低濃度から、強いＡＤＣＣ活性を示した。以上より、抗ＦＯＬＲ１抗体が強いＡＤＣＣ活性を発揮するためには、ＦＯＬＲ１に対するアフィニティーの強さだけではなく、ＲＡ１５－７クローン由来の抗体のエピトープ（実施例３５）を認識することが重要であることが示唆された。
［実施例６２］
ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体のエピトープ解析（ＥＬＩＳＡ法）
　実施例３５と同様に、実施例１１で作製したＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ及び実施例３４で作製したＲａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓを用いて、ＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３抗体、ＭＯｖ１８抗体、及びＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体の反応性を評価した。
　その結果を、表４に示す。白丸は反応が見られたこと、×は反応が見られなかったことを示す。ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は、ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ、及びＲａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓに反応が見られ、Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓには反応が見られなかった。よって、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体はＣｈＲＡ１５－７Ａｃｃ抗体と同様に、ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓの５５から６２番目のアミノ酸配列を認識する事が示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例６３］
卵巣癌細胞株の細胞膜上に発現するＦＯＬＲ１の定量解析
　卵巣癌細胞株（ＩＧＲ－ＯＶ１、ＳＫＯＶ－３、ＯＶＣＡＲ－３、ＭＣＡＳ）の細胞膜上のＦＯＬＲ１発現量を、ＱＩＦＩＫＩＴ（Ｄａｋｏ）を用いて解析した。抗ＦＯＬＲ１抗体としてＬＫ２６（ＧｅｎｅＴｅｘ）、及び陰性対象としてマウスＩｇＧ２ａ（Ｄａｋｏ）をそれぞれ２０μｇ／ｍＬの濃度で使用し、ＱＩＦＩＫＩＴ添付文書に従って細胞及びキャリブレーションビーズを染色した。
　染色細胞は３サンプルずつ調製し、それぞれフローサイトメトリーでＭＦＩ値を検出した（図１０）。３サンプルのＭＦＩ平均値をもって、それぞれの細胞のＭＦＩ値とした。次に、それぞれの細胞及びキャリブレーションビーズのＭＦＩ値を、ヤマサ醤油株式会社が提供するＡＢＣ　ＣＡＬＣＵＬＡＴＯＲ　ｆｏｒ　ＱＩＦＩＫＩＴに入力し、それぞれの卵巣癌細胞株上に発現するＦＯＬＲ１分子数を求めた。
　その結果、ＩＧＲ－ＯＶ１、ＳＫＯＶ－３、ＯＶＣＡＲ－３、及びＭＣＡＳの細胞膜上に発現するＦＯＬＲ１は、一細胞当たり、それぞれ１．１７×１０６、１．１０×１０５、６．６３×１０４、及び１．３７×１０４分子であることが示された（図１０）。
　ここで、実施例５４（図７）の結果と合わせると、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は、ＦＯＬＲ１低発現（細胞膜上のＦＯＬＲ１分子数が１×１０４～１×１０５）の細胞であっても、ＦＯＬＲ１高発現（細胞膜上のＦＯＬＲ１分子数が１×１０６）の細胞と同様のＡＤＣＣ活性を示すことが明らかとなった。以上より、ＦＯＬＲ１が高発現の癌細胞だけでなく、低発現の癌細胞に対する治療抗体としても、既存抗体（ＭＯＲＡｂ－００３）及び既存抗体に既存技術を組み合わせた抗体（ＭＯＲＡｂ－００３Ａｃｃ）より有用であることが示唆された。
［実施例６４］
ヒト乳癌組織免疫染色
　実施例５１と同様に、ヒト乳癌組織アレイ（ＢｉｏＣｈａｉｎ）を免疫組織染色（ＩＨＣ）に供した。アレイにはｉｎｖａｓｉｖｅ　ｄｕｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ組織が３５例、ｉｎｖａｓｉｖｅ　ｌｏｂｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ組織が２例、正常組織が３例含まれており、それぞれエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、Ｈｅｒ２の陰陽の情報が付随していた。
　染色の結果、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ及びＭＯＲＡｂ－００３抗体で陽性だったのは、ＥＲ陽性かつ／もしくはＰＲ陽性かつＨｅｒ２陰性の組織で５６％及び２７％、ＥＲ陽性かつ／もしくはＰＲ陽性かつＨｅｒ２陽性の組織で５０％及び５０％、ＥＲ陰性かつ／もしくはＰＲ陰性かつＨｅｒ２陽性の組織で７１％及び１４％、ＥＲ陰性かつＰＲ陰性かつＨｅｒ２陰性の組織で２２％及び１１％であった。この結果より、ＭＯＲＡｂ－００３抗体と比べてＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は、より感度良くＦＯＬＲ１陽性の乳癌組織を染色できることが明らかとなった。
　さらに、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体で染色が見られたサンプルのＨスコアは、同じ組織サンプルに対するＭＯＲＡｂ－００３抗体のＨスコアに対し、いずれも高いスコアであった。以上より、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体は乳癌に発現するＦＯＬＲ１に対し、既存抗体ＭＯＲＡｂ－００３より強く結合することが示唆された。
［実施例６５］
卵巣癌性腹水由来細胞を用いたａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ試験
　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ社（ＭＲ社）から凍結された卵巣癌性腹水由来細胞を購入し、以下のａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ試験を実施した。
　まず、凍結卵巣癌性腹水由来細胞を３７℃の水槽で融解し、腹水細胞用培地に懸濁した。腹水細胞用培地は、ＲＰＭＩ１６４０　ＧｌｕｔａＭａｘ（ＧＩＢＣＯ）に、１０％非働化済みＦＣＳ、１／１００量のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　＆　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１／１００量のｎｏｎ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ（ＧＩＢＣＯ）、及び１／１００量のＳｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＧＩＢＣＯ）を加えたものを使用した。
　まず、細胞懸濁液を２×１０６ｃｅｌｌｓ／４５０μＬになるよう調製し、２４ウェルプレートに対し、各ウェル４５０μＬずつ播種した。次に、最終濃度が１～１０００ｎｇ／ｍＬとなるようＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３抗体、及び陰性対象としてＤＮＰＤＦ抗体を腹水細胞用培地で調製し、５０μＬ／ウェルで添加した。その後、３７℃で２４時間培養した。
　培養後、各ウェルを良くピペッティングで混和し、２５０μＬずつ別のチューブに分取した。各チューブを２００×ｇ、５分間、４℃で遠心分離を行い、上清を除去した。次に、２ｍＬのＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞ペレットを懸濁し、同様の遠心分離を行い、上清を除去し、細胞を洗浄した。細胞ペレットを、１００μＬのＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）で懸濁し、癌細胞検出用染色及び陰性対象用染色を行った。
　癌細胞検出用染色には、ＣＤ４５－ＰｅｒＣＰ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１４－ＦＩＴＣ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＥｐＣＡＭ－ＡＰＣ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＦＯＬＲ１－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。陰性対象用染色には、ＣＤ４５－ＰｅｒＣＰ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１４－ＦＩＴＣ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｍＩｇＧ１－ＡＰＣ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びｍＩｇＧ１－ＰＥ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。
　室温で３０分間反応させた後、２ｍＬのＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）で懸濁し、遠心分離による洗浄を行った。洗浄後の細胞ペレットに、１／１００量の７－ＡＡＤ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した４００μＬのＳｔａｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）を加え、懸濁し、フローサイトメトリー測定サンプルとした。
　細胞染色に使用した蛍光色素に対し、適切にコンペンセーションした後、各サンプルをフローサイトメトリーで測定した。まず、７－ＡＡＤ陰性（－）／ＣＤ４５（－）／ＣＤ１４（－）の細胞集団をゲートし、次にＦＳＣ、ＳＳＣでリンパ球を除く画分をゲートした。その細胞画分に対し、陰性対象用染色サンプルでｍＩｇＧ１－ＡＰＣ及びｍＩｇＧ１－ＰＥの検出位置を決めた後に、癌細胞検出用染色サンプルのＦＯＬＲ１及びＥｐＣＡＭ陽性（＋）画分を癌細胞集団とした。
　また、７－ＡＡＤ（－）／ＣＤ１４（－）／ＣＤ４５（＋）の画分の検出カウントが一定数になるよう測定することで、各サンプル間の癌細胞画分の細胞数変化を比較した。
　癌細胞画分に検出される細胞数が、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体、ＭＯＲＡｂ－００３抗体、もしくはＤＮＰＤＦ抗体を添加したサンプルでどの程度減少したかを、縦軸に細胞障害活性（％）として示した（図１１）。横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表す。
　ここで、図１１のＦＺ１２、ＦＺ２１、ＦＺ２６、及びＦＺ４４は、それぞれ卵巣癌性腹水のドナー（ＳＰＥＣＮＵＭ／Ｐａｔｉｅｎｔ　ＩＤが２００３０９０７１２／７０２８、２００９０８０５２１／１７３０８９、２００９０６０５２６／５２０８、及び２００３０４１０４４／１１３１３９）を示す。また、いずれのサンプルも、ＭＲ社が実施したｅｘ　ｖｉｖｏ薬剤耐性試験において、シスプラチン耐性の癌細胞を含む卵巣癌性腹水であると示されている。
　その結果、図１１に示すように、いずれのサンプルにおいても、ＭＯＲＡｂ－００３抗体に比べてＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体では、より低濃度から、より強い細胞傷害活性が検出された。
　以上より、卵巣癌患者の腹水由来細胞群にＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体を添加すると、腹水中のエフェクター細胞により、腹水中のプラチナ耐性癌細胞が殺傷されることが示された。また、ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体によるこの細胞傷害活性は、既存卵巣癌治療抗体ＭＯＲＡｂ－００３より高いことが示された。
［実施例６６］
卵巣癌細胞株のＦＯＬＲ１発現量と葉酸取り込み量の解析
　まず、卵巣癌細胞株ＩＧＲ－ＯＶ１（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＯＶＩＳＥ（ＪＣＲＢ細胞番号：ＪＣＲＢ１０４３）、ＳＫＯＶ－３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－７７）、Ｃａｏｖ－３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－７５）、ＲＭＧ－１（ＪＣＲＢ細胞番号：ＪＣＲＢ０１７２）、ＯＶ－９０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１１７３２）、ＯＶＣＡＲ－３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－１６１）、ＭＣＡＳ（ＪＣＲＢ細胞番号：ＪＣＲＢ０２４０）、及びＴＯＶ－１１２Ｄ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ－１１７３１）上に発現するＦＯＬＲ１をフローサイトメトリーで測定した。
　それぞれの細胞株を培養後、０．０２％　ＥＤＴＡ溶液（ナカライ）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＦＣＭバッファー（１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウム、５％非働化済みＦＣＳを含むＰＢＳ）に懸濁した。次に、１ウェルあたり１×１０５個となるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで１分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＦＣＭバッファーで１μｇ／ｍＬに調製したＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体を添加し、４℃で３０分間の反応を行った。
　細胞を洗浄した後、ＦＣＭバッファーで２００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を添加し、４℃で３０分間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＦＣＭバッファーで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ベックマンコールター社製、ＦＣ５００ＭＰＬ）で解析し、それぞれの細胞のＭＦＩ値を求めた。同様に、ＤＮＰＤＦ抗体で染色したそれぞれの細胞のＭＦＩ値を求め、ＤＮＰＤＦ抗体に対するＨｕＲＡ１５－７ＣＴＡｃｃ抗体での相対ＭＦＩ値を算出した［図１２（ａ）］。
　その結果、ＩＧＲ－ＯＶ１、ＯＶＩＳＥ、ＳＫＯＶ－３、Ｃａｏｖ－３、ＲＭＧ－１、ＯＶ－９０、ＯＶＣＡＲ－３、ＭＣＡＳ、及びＴＯＶ－１１２Ｄの順にＦＯＬＲ１が高発現していることが示された。
　次に、同じ卵巣癌細胞株を葉酸不含培地［１０％非働化済み透析ＦＣＳを含む葉酸不含ＲＰＭＩ１６４０（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］にて３日間培養した。その後、標識化葉酸を、最終濃度１００ｎｍとなるように添加し、３７℃で３時間培養した。
　次に、３７℃のＰＢＳで細胞を洗浄後、１　ｍＭの葉酸を加えた培地にて、３７℃で３時間培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄後、トリプシン（ＧＩＢＣＯ）で細胞を剥離し、ＦＣＭバッファーで懸濁した。蛍光強度をフローサイトメトリーで解析し、それぞれの細胞のＭＦＩ値を求めた。同様に、標識化葉酸を加えていない細胞のＭＦＩ値を求め、それに対する１００ｎＭの標識化葉酸添加サンプルの相対ＭＦＩ値を算出した［図１２（ｂ）］。
　その結果、ＦＯＬＲ１発現量と葉酸取り込み量には、相関がみられないことが示された。例えば、ＳＫＯＶ－３はＩＧＲ－ＯＶ１、ＯＶＩＳＥに次ぐＦＯＬＲ１発現量であったが、葉酸取り込み量はＩＧＲ－ＯＶ１、ＯＶＩＳＥ、Ｃａｏｖ－３、ＲＭＧ－１、及びＯＶ－９０より低かった。この結果は、抗がん剤等を接合した葉酸による治療は、ＦＯＬＲ１発現量が高いタイプの癌であっても有効でない場合があることを示している。
　一方、葉酸取り込み量の低いＳＫＯＶ－３やＯＶＣＡＲ－３に対し、本発明の抗体は、効果的な細胞傷害活性を示す（実施例５４）。以上の結果は、葉酸取り込み量が少ないために、抗がん剤等を接合した葉酸による抗腫瘍活性が現れない癌に対しても、本発明の抗体は有効であることを示している。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１２年１２月７日付けで出願された米国仮出願（６１／７３４，６１０号）および２０１２年１２月７日付けで出願された米国仮出願（６１／７３４，５４７号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号１：ＦＯＬＲ１のアミノ酸配列
配列番号２：ＦＯＬＲ１－Ｆの塩基配列
配列番号３：ＦＯＬＲ１－Ｒの塩基配列
配列番号４：ＣｙＦＯＬＲ１－Ｆの塩基配列
配列番号５：ＣｙＦＯＬＲ１－Ｒの塩基配列
配列番号６：ＣｙＦＯＬＲ１＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号７：ＣｙＦＯＬＲ１＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８：ＦＯＬＲ１－Ｆｃ－Ｆの塩基配列
配列番号９：ＦＯＬＲ１－Ｆｃ－Ｒの塩基配列
配列番号１０：ＦＯＬＲ２－Ｆｃ－Ｆの塩基配列
配列番号１１：ＦＯＬＲ２－Ｆｃ－Ｒの塩基配列
配列番号１２：ＦＯＬＲ３－Ｆｃ－Ｆの塩基配列
配列番号１３：ＦＯＬＲ３－Ｆｃ－Ｒの塩基配列
配列番号１４：ＣｙＦＯＬＲ１－Ｆｃ－Ｆの塩基配列
配列番号１５：ＣｙＦＯＬＲ１－Ｆｃ－Ｒの塩基配列
配列番号１６：ＦＯＬＲ１－ｍＨ－Ｆの塩基配列
配列番号１７：ＦＯＬＲ１－ｍＨ－Ｒの塩基配列
配列番号１８：ＲａｔＩｇＧ１Ｈ－Ａの塩基配列
配列番号１９：ＲａｔＩｇＧ１Ｈ－Ｂの塩基配列
配列番号２０：Ｒａｔｋ－Ａの塩基配列
配列番号２１：Ｒａｔｋ－Ｂの塩基配列
配列番号２２：ＲＡ１５－７ＶＨ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号２３：ＲＡ１５－７ＶＨ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号２４：ＲＡ１５－７ＶＬ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号２５：ＲＡ１５－７ＶＬ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号２６：ｎｏｎＳ＿ＲＡ１５－７ＶＨ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号２７：ｎｏｎＳ＿ＲＡ１５－７ＶＨ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号２８：ｎｏｎＳ＿ＲＡ１５－７ＶＬ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号２９：ｎｏｎＳ＿ＲＡ１５－７ＶＬ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号３０：ＲＡ１５－７ＶＨＣＤＲ１＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号３１：ＲＡ１５－７ＶＨＣＤＲ２＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号３２：ＲＡ１５－７ＶＨＣＤＲ３＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号３３：ＲＡ１５－７ＶＬＣＤＲ１＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号３４：ＲＡ１５－７ＶＬＣＤＲ２＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号３５：ＲＡ１５－７ＶＬＣＤＲ３＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号３６：ＲＡ１５－７－ＶＬＦの塩基配列
配列番号３７：ＲＡ１５－７－ＶＬＲの塩基配列
配列番号３８：ＲＡ１５－７－ＶＨＦの塩基配列
配列番号３９：ＲＡ１５－７－ＶＨＲの塩基配列
配列番号４０：ＦｃＡｃｃ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号４１：ＦｃＡｃｃ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号４２：Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号４３：Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号４４：Ｒａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号４５：Ｒａｔ１－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号４６：Ｒａｔ２－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号４７：Ｒａｔ４－ＦＯＬＲ１－ｍｙｃＨｉｓ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号４８：ＨＶ０の塩基配列
配列番号４９：ＨＶ２の塩基配列
配列番号５０：ＨＶ３の塩基配列
配列番号５１：ＨＶ４の塩基配列
配列番号５２：ＨＶ５の塩基配列
配列番号５３：ＨＶ６の塩基配列
配列番号５４：ＨＶ７の塩基配列
配列番号５５：ＨＶ８の塩基配列
配列番号５６：ＨＶ１０の塩基配列
配列番号５７：ＬＶ０の塩基配列
配列番号５８：ＬＶ２の塩基配列
配列番号５９：ＬＶ３の塩基配列
配列番号６０：ＬＶ４の塩基配列
配列番号６１：ＬＶ６の塩基配列
配列番号６２：ＨｕＲＡ１５－７ＨＶ７＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号６３：Ｃ１０１Ｍ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号６４：Ｃ１０１Ｇ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号６５：Ｃ１０１Ｄ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号６６：Ｃ１０１Ｓ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号６７：Ｃ１０１Ｙ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号６８：Ｃ１０１Ａ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号６９：Ｃ１０１Ｉ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号７０：Ｃ１０１Ｖ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号７１：Ｃ１０１Ｔ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号７２：Ｃ１０１Ｆ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号７３：Ｃ１０１Ｒ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号７４：Ｃ１０１Ｗ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号７５：Ｃ１０１Ｐ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号７６：Ｃ１０１Ｑ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号７７：Ｃ１０１Ｍ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号７８：Ｃ１０１Ｇ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号７９：Ｃ１０１Ｄ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８０：Ｃ１０１Ｓ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８１：Ｃ１０１Ｙ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８２：Ｃ１０１Ａ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８３：Ｃ１０１Ｉ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８４：Ｃ１０１Ｖ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８５：Ｃ１０１Ｔ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８６：Ｃ１０１Ｆ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８７：Ｃ１０１Ｒ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８８：Ｃ１０１Ｗ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号８９：Ｃ１０１Ｐ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号９０：Ｃ１０１Ｑ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号９１：ＨｕＲＡ１５－７ＬＶ３＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号９２：ＨｕＲＡ１５－７ＬＶ３＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号９３：ｎｏｎＳ＿ＨｕＲＡ１５－７ＬＶ３＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号９４：ｎｏｎＳ＿ＨｕＲＡ１５－７ＬＶ３＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号９５：ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＶＨ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号９６：ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＶＨ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号９７：ｎｏｎＳ＿ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＶＨ＿ＤＮＡの塩基配列
配列番号９８：ｎｏｎＳ＿ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＶＨ＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号９９：ＨｕＲＡ１５－７ＣＴＶＨＣＤＲ３＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号１００：ＨＶ０＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号１０１：ＬＶ０＿ＡＡのアミノ酸配列
配列番号１０２：Ｒａｔ　ＦＯＬＲ１のアミノ酸配列

Claims (16)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）から選ばれる１の抗体と競合してヒトＦＯＬＲ１を特異的に認識し、前記抗体が結合するヒトＦＯＬＲ１に存在するエピトープと同じエピトープに結合し、かつ抗腫瘍活性を示すモノクローナル抗体又は該抗体断片。
    （ａ）相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと記す）１～３がそれぞれ配列番号３０、３１、３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と記す）を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３、３４、３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖（以下、Ｌ鎖と記す）を含む抗体
    （ｂ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３０、３１、３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３、３４、３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体で、配列番号３２（抗体Ｈ鎖のＣＤＲ３）で表されるアミノ酸配列中のシステインがスレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換された抗体
    （ｃ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
  2. 　遺伝子組換え抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
  3. 　ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項２に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
  4. 　以下の（ａ）～（ｃ）から選ばれる１のモノクローナル抗体又は該抗体断片。
    （ａ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３０、３１、３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３、３４、３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含むモノクローナル抗体及び該抗体断片
    （ｂ）ＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３０、３１、３２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつＣＤＲ１～３がそれぞれ配列番号３３、３４、３５で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体で、配列番号３２（抗体Ｈ鎖のＣＤＲ３）で表されるアミノ酸配列中のシステインがスレオニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、又はグルタミンに置換された抗体
    （ｃ）配列番号９８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＨ鎖を含み、かつ配列番号９４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＬ鎖を含む抗体
  5. 　配列番号１で表されるヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列に結合する、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体及び該抗体断片。
  6. 　Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）及びＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の抗体断片。
  7. 　請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片をコードするＤＮＡ。
  8. 　請求項７に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  9. 　請求項８に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
  10. 　請求項９に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１又は請求項４に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を生成蓄積させ、培養物から該抗体又は該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１又は請求項４に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片の製造方法。
  11. 　請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を投与することを含む、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の治療方法。
  12. 　請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片と薬理学的に許容される担体を含む、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の治療薬。
  13. 　請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片用いる、ヒトＦＯＬＲ１又はヒトＦＯＬＲ１陽性細胞の免疫学的検出又は測定方法。
  14. 　請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片用いて、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞を検出又は測定することを含む、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の診断方法。
  15. 　請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を含む、ヒトＦＯＬＲ１陽性細胞が関与する疾患の診断薬。
  16. 　請求項１～請求項４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いて、当該抗体による治療有効性を治療開始前に判断する方法。
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