WO2014077645A1 - 코드화된 고분자 미세입자 - Google Patents

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WO2014077645A1
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polymer
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silica
silica shell
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권성훈
김미라
장지성
배형종
김나리
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서울대학교산학협력단
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    • G01N33/552—Glass or silica

Definitions

  • the technology disclosed herein relates to encoded polymeric microparticles, and more particularly, to encoded polymeric microparticles having excellent chemical and physical stability and capable of mass production, a preparation method thereof, and a multi-bio analysis method using the same.
  • the encoded polymeric microparticle core comprising: And a silica shell surrounding the microparticle core.
  • a mixture of a photocurable material and a linker having a functional group and an alkoxysilyl group polymerizable with the photocurable material Applying patterned energy to cure and code the mixture to obtain a coded polymeric microparticle core; And processing a silica precursor on the coded polymer microparticle core to form a silica shell on the coded polymer microparticle core.
  • a multi-bio-analysis method using encoded polymer microparticles comprising a encoded polymer microparticle core, a silica shell surrounding the microparticle core, and a biomaterial bonded to the silica shell.
  • FIG 1 shows encoded polymeric microparticles according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 2 is a process flow diagram illustrating a method for preparing encoded polymeric microparticles.
  • FIG. 3 shows a process for making encoded polymer microparticles according to one embodiment of the invention.
  • SEM scanning electron microscope
  • FIG. 6 is a photograph comparing the characteristics of the polymer microparticles (star shape) without the silica shell and the polymer microparticles (circle shape) with the silica shell.
  • FIG. 7 shows a process of performing multiple DNA hybridization assays by fixing oligonucleotides on silica coated polymer microparticle surfaces.
  • the encoded polymer microparticle 100 includes an encoded polymer microparticle core 110 and a silica shell 120 surrounding the core.
  • Core 110 may be coded in a variety of known manners.
  • the encoded polymeric microparticle core 110 may have a graphical code, a fluorescent code, or a color code.
  • the polymer constituting the polymer microparticle core 110 is preferably a photocurable polymer in that it can be variously patterned by optical lithography.
  • the photocurable polymer may mainly contain an acrylic curable material.
  • the photocurable polymer may be mixed with an acrylic photocurable material and a linker material having a functional group capable of reacting with the photocurable material and a photocurable functional group and a silica forming agent at the same time.
  • the shape of the polymer microparticle core 110 made by photocuring may have various shapes including a disc shape and a spherical shape.
  • the size of the core 110 may range from several ⁇ m to several mm.
  • the encoded polymer microparticles 100 may further include a magnetic material.
  • the microparticle core 110 may further contain magnetic nanoparticles 130 therein (B of FIG. 1).
  • a layer of magnetic nanoparticles 130 may be interposed between the microparticle core 110 and the silica shell 120 (FIG. 1C).
  • the layers of the magnetic nanoparticles 130 are interposed between the core 110 and the shell 120, the amount of the magnetic nanoparticles 130 is relatively small, and thus a stronger magnetic field is required for controlling the microparticles 100 later.
  • the encoded polymer microparticles 100 may include the magnetic nanoparticles to control the microparticles 100 by an external magnetic field. As a result, it can be efficiently used in the solution exchange process of the bioassay later, it is possible to separate the fine particles 100 can increase the accuracy and convenience of the bioassay.
  • the silica shell 120 surrounds and protects the microparticle core 110, and prevents an analytical error from being absorbed into the polymer of the microparticle core 110 by the foreign material desired to be detected.
  • the silica shell 120 provides chemical and mechanical stability of the encoded polymer microparticles 130 to help the microparticles 130 be used in various environments and solutions.
  • the encoded polymer microparticle core 110 and the silica shell 120 may be connected by -Si-O-Si- bonding. Thus, a stable structure may be formed by a solid chemical bond between the core 110 and the shell 120. Due to the presence of the silica shell 120, the surface of the polymer microparticles 100 has low binding property of the unspecified material and the bonding property with the biomaterial is improved.
  • a functional group such as a carboxyl group or an amine group may be introduced to the surface of the silica shell 120.
  • a functional group such as a carboxyl group or an amine group
  • the functional group can be covalently bonded to a variety of biomolecules widely used in the field of biomedical or clinical diagnostics.
  • any one biomaterial selected from the group consisting of antigen, antibody, DNA, RNA and oligonucleotide may be introduced to the surface of the silica shell 120.
  • Coded polymer microparticles according to an embodiment of the present invention can be prepared by the following method.
  • 2 is a process flow diagram illustrating a method for preparing encoded polymeric microparticles.
  • step S1 a mixture of a photocurable material and a linker having a functional group and an alkoxysilyl group polymerizable with the photocurable material is provided.
  • the photocurable material is a material that makes the basic skeleton structure of the fine particles by curing according to the application of energy.
  • the photocurable material is ethoxylated trimethylolpropane triacrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, methyl methacrylate, acrylamide, allylamine, polyethylene oxide, polyethylene glycol diacrylate, polypropylene glycol diacrylate, Polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylate, and combinations thereof.
  • polyethyleneglycol diacrylate which is a photocurable material, has acrylate functional groups at both ends of polyethyleneglycol, and may be crosslinked with a hydrogel having a three-dimensional structure when free radical polymerization occurs.
  • the photocurable material may be any type of material that can be changed from liquid to solid by external light.
  • the linker reacts with the photocurable material to form a copolymer, forming a skeleton of the microparticles, and allowing the alkoxysilyl group to be grafted on the surface of the encoded microparticle core.
  • the formation of the silica shell through the silica coating is not easy.
  • a linker having a photocurable material and a polymerizable functional group and an alkoxysilyl group at the same time is mixed with the photocurable material to form a mixture and hardened to graft the surface of the microparticle core. It is possible to coat the silica shell through the alkoxysilyl group.
  • the linker may be, for example, a compound represented by Formula 1 below.
  • R 1 may be hydrogen, methyl or ethyl
  • R 2 may be C 1 to C 8 linear or branched alkyl
  • L may be an alkylene or arylene having C 1 to C 12 or a structure in which the alkylene and the arylene are optionally connected.
  • Chemical Formula 1 may be 3- (trimethoxysilyl) propyl acrylate (TMSPA).
  • the mixture may further comprise an initiator and may cause free radical polymerization by an external energy source.
  • the initiator may be an azo compound or a peroxide.
  • the mixture may further include a suitable crosslinking agent, and examples thereof include N, N'-methylenebisacrylamide, methylenebismethacrylamide and ethylene glycol dimethacrylate.
  • the method may further include adding magnetic nanoparticles to the mixture as necessary to control the encoded polymer microparticles.
  • magnetic nanoparticles may be introduced into the polymer microparticle core.
  • the patterned energy is applied in step S2 to cure and code the mixture to obtain the encoded polymeric microparticle core.
  • the patterned energy ultraviolet rays, visible rays, infrared rays, and electron beams may be included without limitation.
  • the irradiation of the patterned energy may be performed by a physical mask or a digital micromirror device (DMD) using ultraviolet light.
  • DMD digital micromirror device
  • the encoding can be performed in a variety of ways.
  • the method of encoding the microparticle core may be applied to, for example, a method of patterning a graphical code by applying an optical lithography method.
  • the shape of the graphical code may be in the shape of the microparticle itself (for example, star shape, circle shape, etc.), or may be in the form of a binary code engraved on the microparticle.
  • the encoding of the graphical code may be performed by applying a photocurable polymer to the preparation of the particles as described above and patterning it by an optical lithography method.
  • the photolithographic lithography method of Korean Patent No. 1004769, the fluid lithography method and the polymerization method of US Patent No. 7709544 may be applied, but not limited thereto, and various known lithography methods may be applied.
  • the method of encoding the microparticle core is, for example, on the photocurable polymer, the code on the particles by patterning the labels meaning '1' and '0' to be distinguished from each other according to the degree of photocuring, respectively Can be formed.
  • the above-described optical lithography method for example, when using a digital micromirror device that does not use a mask, may have the advantage of forming as many as one million or more various kinds of codes for particles containing the target material. have.
  • the encoding of the microparticle core may be achieved by including in the microparticle core phosphors of various colors that are distinguished from one another.
  • Various known techniques can be applied to incorporate various fluorescent materials into the microparticle core.
  • the method of encoding the microparticle core may be a method of forming a color code using a magnetic ink.
  • a method of using the magnetic ink as disclosed in Korean Patent Application No. 10-2010-0029613 is as follows. First, a photocurable material including magnetic nanoparticles is provided and an external magnetic field is applied to align the magnetic nanoparticles in the photocurable material. And, it may be performed by applying light from the outside to cure the photocurable material. The arrangement of the magnetic nanoparticles may be changed by the intensity of the external magnetic field to express different colors. By applying this technique, the magnetic particle may be color-coded by arranging the magnetic nanoparticles to be discriminated from each other in the microparticle core made of the photocurable polymer. The contents of this patent can be incorporated by reference herein.
  • the method may further include attaching the hydrophilic polymer-coated magnetic nanoparticles to the encoded polymer microparticle core to control the encoded polymer microparticles.
  • the encoded polymer microparticles are prepared by treating a silica precursor on the encoded polymer microparticle core to form a silica shell on the encoded polymer microparticle core.
  • the formation of the silica shell can be carried out by various known methods, for example a modified Stober method can be used.
  • the fine particles grafted with an alkoxysilyl group are added to a solution of distilled water, ethanol and NH 4 OH.
  • Tetraethylorthosilicate (TEOS) is then injected into the solution as a silica precursor and reacted to form a silica shell.
  • TEOS Tetraethylorthosilicate
  • -Si-O-Si-bonds may be formed at the core-shell interface by the reaction of the alkoxysilyl group grafted on the surface of the microparticle core with the silica precursor.
  • Polymeric microparticles are flexible, soft and easy to fabricate in a variety of structures and forms. At the same time, however, they are easily damaged mechanically and chemically. Also, in the bioassay, the absorption of small molecules into the polymer matrix can lead to detection errors. In contrast, inorganic materials such as titania and silica are generally much harder and more chemically resistant than polymer organics. However, this is also fragile and difficult to mold in various forms. Therefore, by coating the silica shell on the polymer microparticles, the advantages of the two materials can be combined to have a strong, hard, chemically stable, durable and easy to mold in various forms at the same time.
  • the silica coated coded polymeric microparticles described above can be used for multiplexed bioanalysis.
  • encoded polymer microparticles have been used for analysis of biomolecules such as DNA and proteins. This is a powerful and adaptable method because it can use almost unlimited code and provides high analysis throughput. Therefore, according to one embodiment of the present invention, the surface of the silica shell may be modified to introduce a carboxyl group or an amine group for the application of the multiple bioanalysis. The presence of these functional groups allows covalent bonding with various biomaterials.
  • the above-described manufacturing method may further comprise the step of bonding the biomaterial to the silica shell surface.
  • FIG. 3 shows a process for making encoded polymer microparticles according to one embodiment of the invention.
  • a photocurable material ethoxylated trimethylopropane triacrylate (ETPTA), a linker, TMSPA (3- (trimethoxysilyl) propylacrylate), and a photoinitiator ( 2-hydroxy-2-methylpropiophenone) is mixed in an appropriate ratio (ex. 10: 1: 1) to form a photocurable mixture.
  • ETPTA ethoxylated trimethylopropane triacrylate
  • TMSPA trimethoxysilyl propylacrylate
  • a photoinitiator 2-hydroxy-2-methylpropiophenone
  • TMSPA not only has a silane group with silicon capable of forming silica, but also serves as a seed for subsequent silica coating.
  • This compound is irradiated with patterned UV light using various known lithographic methods including photofluidless maskless lithography of FIG. 3 to produce alkoxysilane containing copolymer microparticles with a graphical code.
  • photofluidic maskless lithography OFML
  • free-floating particles can be produced continuously by in-situ photopolymerization by introducing raw materials through microfluidic channels and applying patterned energy, and using digital micro mirror devices ( Coded particles of various shapes can be easily obtained by a maskless method using DMD) as compared to other lithography methods using masks.
  • Silica coating is performed on the formed copolymer microparticles by applying a modified Stober method to form silica shells.
  • This simple coating process is very fast and is a direct and efficient way to coat silica on silane-containing microparticles. It is also a method that can process millions of silica-coated microparticles at once.
  • the thickness of the silica shell can be adjusted from several hundred nanometers to several micrometers by adjusting the reaction rate or the concentration of the silica precursor.
  • various functional groups can be introduced by using various conventional silica surface treatment methods on the fine particles having the silica shell.
  • FIG. 4 is a scanning electron microscope (SEM) image showing the growth of the silica shell on the actual particle surface.
  • SEM scanning electron microscope
  • FIG. 5 is a comparative analysis of the spectra of silica coated microparticles with an electron probe micro-analyzer (EPMA) and non-silica coated microparticles.
  • EPMA electron probe micro-analyzer
  • the polymer microparticles not coated with silica were prepared using only ETPTA and a photoinitiator without TMSPA (seed material).
  • EPMA spectra of uncoated microparticles show that only strong C and weak O are pure organic polymers.
  • the Pt signal was also slightly detected because it was sputtered with Pt coating. Looking at the bottom of Figure 5 it can be seen that the pure silica shell is well formed on the polymer microparticles.
  • the O signal is much larger than C because of silica (SiO 2 ).
  • the reason for the C signal is that the beam penetration depth of the EPMA is 1 ⁇ m and the thickness of the silica shell is less.
  • FIG. 6 is a photograph comparing the characteristics of the polymer microparticles (star shape) without the silica shell and the polymer microparticles (circle shape) with the silica shell.
  • aqueous Rhodamine B solution red fluorescence
  • 6A shows how the aqueous solution of rhodamine is absorbed into the uncoated polymer microparticles (star shape) and the silica coated polymer microparticles (circle shape), respectively.
  • the aqueous solution of rhodamine was well absorbed into the polymer hydrogel material forming the microparticles as clearly seen in the fluorescence image. It is well known that polymeric hydrogel materials absorb liquids well without any chemical or physical treatment.
  • silica coated microparticles can provide more stable and accurate results when applied to bioanalyses. Because if antigens or oligonucleotides are absorbed into the polymer matrix, this can be a source of error. In addition, in this result that no fluorescence is emitted from the image of the coated particles, it can be confirmed that due to the low non-specific binding of the silica surface, the absorption of some dye did not occur at the silica surface.
  • the microparticles were placed in 1M aqueous acetic acid and stirred. After 24 hours, the surface of the silica coated microparticles remained stable, but the surface of the uncoated microparticles was severely damaged by the acidic solution (FIG. 6C).
  • polymer hydrogels are very sensitive to external environments such as pH and temperature.
  • silica is generally much more robust and has good chemical stability than organic polymers. As a result, these silica-coated microparticles can withstand better than polymer microparticles in a variety of chemical reactions, including organic solvents and dry environments. Therefore, there are few restrictions in applying various functional groups to the particles.
  • the microparticles can have high stability and low nonspecific binding properties.
  • silica coated microparticles easily react with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) and primary amine through condensation of terminal hydroxyl groups. When these amines are subsequently reacted with succinic acid to form carboxylated surfaces, they can react with amino groups in the DNA. 5 'amino terminus DNAs are used to immobilize DNAs on the carboxylated silica surface.
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • the encoded polymeric microparticles according to one embodiment of the present invention provide useful advantages for multiplexed bioassays.
  • silica-coated microparticles were used to demonstrate 10-plex in vitro human papillomavirus (HPV) genotyping.
  • Target HPV genes were prepared by a two step PCR process.
  • 8 shows multiple HPV genotyping using silica coated coded polymeric microparticles.
  • 8A is a schematic of amplification and labeling PCR. After amplification PCR, labeling PCR for labeling label probe-complementary HPV gene sequences is performed using biotin attached dCTP.
  • 8B is a schematic diagram of 10-plexed HPV genotyping using probe attached microparticles.
  • Each target HPV gene is complementary to one of the different probes.
  • the graphical code consisting of unpolymerized pores in the microparticle structure is intended to identify the probe on the silica surface of the microparticles. Multiplexing capacity can be easily increased by changing the graphical code. After hybridization assay with the target HPV sequence, fluorescent dye labeled streptavidins are introduced to obtain a fluorescent signal.
  • FIG. 9 shows the preparation and handling of silica coated coded "magnetic" microparticles.
  • 9A illustrates a step of preparing silica coated magnetic microparticles.
  • FIG. 9B is a field emission scanning electron microscope (FE-SEM) image of magnetic microparticles before (B1) and after (B2) of a silica coating process.
  • the magnetic microparticles are obtained by attaching polyacrylic acid (PAA) coated Fe 3 O 4 nanoparticles on the surface of the silane grafted microparticles.
  • PAA coated Fe 3 O 4 nanoparticles can have a size of, for example, 80 ⁇ 10 nm.
  • FIG. 9C shows a solution exchange process through magnetic separation of carriers.
  • a mixture containing silica coated magnetic particles and biomolecules bound to these silica coated magnetic particles can be selectively separated from the solution mixture.
  • 9D are optical microscope images showing magnetic handling of magnetic particles. It can be seen that free floating magnetic microparticles move easily in the direction of an applied external magnetic field. Therefore, the magnetic handling of free-floating magnetic microparticles is useful for bioassays involving solution exchange. Moreover, magnetic separation allows for washing and concentration of the separated targets that were bound to the particles.
  • the encoded polymer microparticles are prepared using a mixture of a photocurable material and a linker having a polymerizable and alkoxysilyl group.
  • a silica precursor solution By encapsulating the thus prepared encoded polymer microparticles in a silica precursor solution, millions of encoded polymer microparticles can be silica coated at once by a simple process.
  • magnetic nanoparticles By introducing the above-mentioned magnetic nanoparticles into the polymer microparticles, handling of the particles in the bioassay becomes easy.
  • Encoded microparticles according to one embodiment of the present invention have a chemical and physical stability by having a silica shell and do not absorb external biomolecules, thereby enabling accurate analysis. Therefore, the above-described encoded polymer microparticles can be usefully used in various applications including DNA or protein based diagnosis.

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Abstract

코드화된 고분자 미세입자 코어; 및 상기 미세입자 코어를 둘러싼 실리카 쉘을 포함하는 코드화된 고분자 미세입자 및 이를 이용한 다중 바이오 분석방법이 제공된다. 또한 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼함물을 제공하는 단계; 패턴화된 에너지를 인가하여 상기 혼합물을 경화하고, 코드화함으로써 코드화된 고분자 미세입자 코어를 얻는 단계; 및 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 실리카 전구체를 처리하여 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어 위에 실리카 쉘을 형성하는 단계를 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법이 제공된다.

Description

코드화된 고분자 미세입자
본 명세서에 개시된 기술은 코드화된 고분자 미세입자에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 화학적 및 물리적 안정성이 뛰어나고 양산이 가능한 코드화된 고분자 미세입자, 이의 제조방법 및 이를 이용한 다중 바이오 분석방법에 관한 것이다.
최근에 코드화된 고분자 미세입자는 제조가 간단하고 코드를 많이 넣기 쉬운 특성을 가지고 있어 바이오 분석물 (단백질, DNA 등) 탐지에 널리 이용되고 있다. 그러나 이 고분자 물질 자체는 물리적·화학적 내구성이 떨어져 쉽게 변형이 올 수도 있고 분석물들을 흡수해 분석 오류를 일으키는 단점이 있다. 또한, 이들과 바이오 물질과의 결합은 몇 가지 특수한 화학결합 방법으로 제한되기 때문에 다양한 화학적 결합 방법을 적용하는 데에 한계가 있다. 따라서, 코드화가 가능하며, 화학적 및 물리적 안정성이 뛰어나고 다양한 작용기의 도입과 양산이 가능한 미세입자의 개발이 필요하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 코드화된 고분자 미세입자 코어; 및 상기 미세입자 코어를 둘러싼 실리카 쉘을 포함하는 코드화된 고분자 미세입자가 제공된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼함물을 제공하는 단계; 패턴화된 에너지를 인가하여 상기 혼합물을 경화하고, 코드화함으로써 코드화된 고분자 미세입자 코어를 얻는 단계; 및 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 실리카 전구체를 처리하여 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어 위에 실리카 쉘을 형성하는 단계를 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 코드화된 고분자 미세입자 코어, 상기 미세입자 코어를 둘러싼 실리카 쉘, 및 상기 실리카 쉘에 결합된 바이오 물질을 포함하는 코드화된 고분자 미세입자를 이용한 다중 바이오 분석방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 다른 코드화된 고분자 미세입자를 나타낸다.
도 2는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법을 나타낸 공정 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 코드화된 고분자 미세입자를 만드는 과정을 나타낸다.
도 4는 실제 입자 표면에 실리카 쉘이 자라는 과정을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다.
도 5는 EPMA(electron probe micro-analyzer)로 실리카 코팅된 미세입자와 실리카 코팅되지 않은 미세입자의 스펙트럼을 비교 분석한 것이다.
도 6은 실리카 쉘을 구비하지 않은 고분자 미세입자(별 모양)와 실리카 쉘을 구비한 고분자 미세입자(원 모양)의 특성을 비교한 사진이다.
도 7은 실리카 코팅된 고분자 미세입자 표면 위에 올리고뉴클레오타이드를 고정하여 다중 DNA 혼성화 에세이를 행하는 과정을 나타낸다.
도 8은 실리카코팅된 코드화된 고분자 미세입자를 사용한 다중 HPV 지노타이핑을 나타낸다.
도 9는 실리카 코팅된 코드화된 "자성" 미세입자의 제조 및 취급을 나타낸다.
이하 도면을 참조하여 본 발명의 다양한 구현예에 대해 보다 상세히 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 구현예들은 당업자에게 개시된 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되어지는 것이다. 따라서 개시된 기술은 이하 설명된 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 일 구성요소가 다른 구성요소 "위에" 있다고 할 때, 이는 다른 구성요소 "바로 위에"에 있는 경우 뿐 아니라, 그 중간에 또 다른 구성요소가 있는 경우도 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 다른 코드화된 고분자 미세입자를 나타낸다. 도 1에 있어서, 도 1A, 도 1B 및 도 1C의 아래쪽 그림들은 각각 A-A', B-B', 및 C-C'선을 따라 절단한 단면도들이다. 도 1의 A를 참조하면, 코드화된 고분자 미세입자(100)는 코드화된 고분자 미세입자 코어(110)과 이를 둘러싼 실리카 쉘(120)을 포함한다. 코어(110)은 공지된 다양한 방식으로 코드화될 수 있다. 예를 들어 코드화된 고분자 미세입자 코어(110)는 그래피컬 코드, 형광 코드, 또는 컬러 코드를 구비할 수 있다.
한편, 고분자 미세입자 코어(110)를 이루는 상기 고분자는 광학적 리소그래피에 의해 다양하게 패터닝될 수 있다는 면에서 광경화성 고분자인 것이 바람직하다. 상기 광경화성 고분자는 아크릴계 경화성 물질을 주로 함유할 수 있다. 바람직하게는 상기 광경화성 고분자는 아크릴계 광경화성 물질 외에도 상기 광경화성 물질과 반응 및 광경화가능한 작용기와 실리카 형성이 가능한 작용기를 동시에 구비한 링커 물질이 혼합될 수 있다.
광경화에 의해 만들어진 고분자 미세입자 코어(110)의 형태는 디스크형, 구형을 포함한 다양한 형상을 가질 수 있다. 코어(110)의 크기는 수 ㎛ 내지 수 mm의 범위를 가질 수 있다.
코드화된 고분자 미세입자(100)는 자성 물질을 더 구비할 수 있다. 구체적으로 미세입자 코어(110)는 내부에 자성 나노입자들(130)을 더 함유할 수 있다(도 1의 B). 다르게는 미세입자 코어(110)와 실리카 쉘(120) 사이에 자성 나노입자들(130)의 층이 개재될 수 있다(도 1의 C). 코어(110)와 쉘(120) 사이에 자성 나노입자들(130)의 층이 개재되는 경우, 상대적으로 자성 나노입자(130)의 양이 적어 추후 미세입자(100) 제어시 더 강한 자장을 필요로 하지만 코어(110) 내부에 자성 나노입자들(130)이 함유되는 경우에 비해 광경화를 통한 패터닝 과정에서 자성나노입자들(130)에 의한 광산란 영향이 없기 때문에 미세구조 패터닝에 유리한 장점이 있다. 코드화된 고분자 미세입자(100)가 자성 나노입자들을 구비함으로써 외부 자기장으로 미세입자(100)를 제어할 수 있다. 그 결과 추후 바이오 에세이의 용액 교환 과정에 효율적으로 이용될 수 있으며, 미세입자(100)의 분리가 가능하여 바이오 어세이의 정확도 및 편리성이 증가할 수 있다.
실리카 쉘(120)은 미세입자 코어(110)를 둘러싸며 보호하고, 탐지를 원하는 외부 물질이 미세입자 코어(110)의 고분자 내로 흡수되어 분석 오류가 발생하는 것을 방지한다. 실리카 쉘(120)은 코드화된 고분자 미세입자(130)의 화학적, 기계적 안정성을 부여하여 미세입자(130)가 다양한 환경 및 용액에서 사용될 수 있도록 도와준다. 코드화된 고분자 미세입자 코어(110)와 실리카 쉘(120)은 -Si-O-Si- 결합으로 연결될 수 있다. 그리하여 코어(110)와 쉘(120) 사이의 견고한 화학결합에 의해 안정한 구조가 형성될 수 있다. 실리카 쉘(120)의 존재에 의하여 고분자 미세입자(100)의 표면은 불특정 물질의 결합성이 낮으며 바이오 물질과의 결합특성이 향상된다. 또한 실리카 쉘(120) 표면에 카르복실기(carboxyl group) 또는 아민기(amine group)와 같은 작용기가 도입될 수 있다. 상기 작용기의 도입에 의해 생물의학분야나 임상진단 분야에서 광범위하게 사용되는 다양한 생체분자들과 공유결합할 수 있다. 예를 들어 실리카 쉘(120) 표면에 항원, 항체, DNA, RNA 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 바이오 물질이 도입될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 코드화된 고분자 미세입자는 하기의 방법으로 제조될 수 있다. 도 2는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법을 나타낸 공정 흐름도이다. 도 2를 참조하면, 단계 S1에서 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼함물을 제공한다.
상기 광경화성 물질은 에너지의 인가에 따른 경화에 의해 미세입자의 기본 골격 구조를 만드는 물질이다. 상기 광경화성 물질은 에톡시화 트리메틸올프로판 트리아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 아크릴아마이드, 알릴아민, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜 디아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴레이트 및 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 광경화성 물질인 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트는 폴리에틸렌글리콜 양 말단에 아크릴레이트 작용기가 있어서 자유라디칼 중합이 일어날 경우 3차원 구조의 하이드로젤로 가교될 수 있다. 기타, 광경화성 물질은 외부 광에 의해 액체에서 고체로 변할 수 있는 어떠한 형태의 물질도 가능하다.
상기 링커는 광경화성 물질과 반응하여 공중합체를 형성하면서 미세입자의 골격을 이루는 동시에 상기 코드화된 미세입자 코어의 표면에 알콕시실릴기가 그라프트되도록 한다. 광경화성 물질로만 미세입자를 제조할 경우 이후 실리카 코팅을 통한 실리카 쉘의 형성이 용이하지 않다. 반면, 본 발명의 일 구현예에 따른 제조방법과 같이 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 동시에 구비한 링커를 상기 광경화성 물질과 섞어 혼합물을 만들어 이를 경화시키면 미세입자 코어의 표면에 그라프트된 알콕시실릴기를 통해 실리카 쉘을 코팅하는 것이 가능해진다.
상기 링커는 예를 들어, 하기 화학식 1로 표현되는 화합물일 수 있다.
Figure PCTKR2013010457-appb-I000001
상기 화학식 1에서 R1은 수소, 메틸 또는 에틸이고, R2는 C1 내지 C8의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬일 수 있다. 또한 L은 C1 내지 C12를 갖는 알킬렌 또는 아릴렌이거나 상기 알킬렌과 상기 아릴렌이 임의로 연결된 구조일 수 있다. 구체적으로 상기 화학식 1은 3-(트리메톡시실릴)프로필아크릴레이트(TMSPA)일 수 있다.
상기 혼합물은 개시제를 더 포함할 수 있으며 외부의 에너지원에 의해 자유라디칼 중합을 유발할 수 있다. 개시제는 아조계 화합물 또는 과산화물이 될 수 있다. 상기 혼합물은 적당한 가교제를 더 포함할 수 있으며, 예를 들면, N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드, 메틸렌비스메타크릴아마이드 및 에틸렌글리콜디메타크릴레이트 등을 들 수 있다.
코드화된 고분자 미세입자를 제어하기 위해 필요에 따라 상기 혼합물에 자성 나노입자를 추가하는 단계가 더 포함될 수 있다. 그 결과 상기 고분자 미세입자 코어 내부에 자성 나노입자가 도입될 수 있다.
단계 S2에서 패턴화된 에너지를 인가하여 상기 혼합물을 경화하고, 코드화함으로써 코드화된 고분자 미세입자 코어를 얻는다. 상기 패턴화된 에너지로서 자외선, 가시광선, 적외선 및 전자빔 등이 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 패턴화된 에너지의 조사는 자외선을 이용하여 물리적 마스크 또는 디지털 마이크로미러 장치(DMD)에 의해 수행될 수 있다.
상기 코드화는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 일 구현예에 의하며면, 상기 미세입자 코어를 코드화하는 방법은 일 예로서, 광학적 리소그래피 방법을 적용하여 그래피컬 코드를 패터닝하는 방법을 적용할 수 있다. 그래피컬 코드의 형태는 미세입자 자체의 형상(예를 들어, 별 모양, 원 모양 등)일 수도 있고, 미세입자에 새겨진 바이너리 코드 형태일 수도 있다. 그래피컬 코드의 코드화는 상술한 바와 같이 상기 입자의 제조에 광경화성 고분자를 적용하고, 이를 광학적 리소그래피 방법으로 패터닝하는 방식으로 수행될 수 있다.
일 예로서, 한국등록특허 제1004769호의 광유체적 리소그래피 방법, 미국등록특허 제7709544호의 유체 리소그래피 법 및 중합법을 적용할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 공지의 다양한 리소그래피법이 적용될 수 있다. 상기 미세입자 코어를 코드화하는 방법은 일 예로서, 상기 광경화성 고분자 상에, 광경화의 정도에 따라 서로 구분되도록 '1' 및 '0'을 의미하는 표지를 각각 패터닝함으로써 상기 입자 상에 코드를 형성할 수 있다. 상술한 광학적 리소그래피 방법은 일 예로서, 마스크를 사용하지 않는 디지털 마이크로미러 장치 등을 이용하는 경우, 상기 타겟물질을 포함하는 입자에 대하는 많게는 백만 개 이상의 다양한 종류의 코드를 형성할 수 있는 장점을 가질 수 있다.
다른 구현예에 의하면, 상기 미세입자 코어의 코드화는 서로 구분되는 다양한 색상의 형광물질을 상기 미세입자 코어 내에 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 다양한 형광물질을 상기 미세입자 코어 내에 포함시키기 위해 공지된 다양한 기술이 적용될 수 있다.
또 다른 구현예에 의하면, 상기 미세입자 코어를 코드화하는 방법은 자성 잉크를 이용하여 컬러 코드를 형성하는 방법을 적용할 수 있다. 상기 자성 잉크를 이용하는 방법은 일 예로서, 한국특허출원 제10-2010-0029613호에 개시된 바는 이하와 같다. 먼저 자성 나노 입자를 포함하는 광경화성 물질을 제공하고 외부 자기장을 인가하여 상기 광경화성 물질 내의 상기 자성 나노 입자를 정렬시킨다. 그리고, 외부로부터 광을 인가하여 상기 광경화성 물질을 경화시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 외부 자기장의 세기에 의하여 자성 나노 입자들 간의 배열이 변화하여 서로 다른 색상을 발현할 수 있다. 이러한 기술을 적용하여 광경화성 고분자로 이루어진 미세입자 코어 내에 자성 나노 입자들을 서로 차별되도록 배열시킴으로써 상기 미세입자 코어를 컬러 코드화할 수 있다. 상기 특허의 내용은 본 명세서에 인용됨으로써 병합될 수 있다.
일 구현예에서, 코드화된 고분자 미세입자를 제어하기 위해 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 친수성 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 부착시키는 단계가 더 포함될 수 있다.
다음 단계 S3에서 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 실리카 전구체를 처리하여 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어 위에 실리카 쉘을 형성함으로써 코드화된 고분자 미세입자가 제조된다. 상기 실리카 쉘의 형성은 다양한 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 수정된 Stober 방법이 사용될 수 있다.
먼저 알콕시실릴기가 그라프트된 상기 미세입자를 증류수, 에탄올 및 NH4OH의 용액에 투입한다. 다음 실리카 전구체로서 테트라에틸오르토실리케이트(TEOS)를 상기 용액에 주입하고 반응시켜 실리카 쉘을 형성한다. 그 결과 상기 미세입자 코어의 표면에 그라프트된 상기 알콕시실릴기와 상기 실리카 전구체의 반응에 의해 코어-쉘 계면에 -Si-O-Si- 결합이 형성될 수 있다.
고분자 미세입자는 유연하고(flexible), 연질이며(soft) 다양한 구조 및 형태로 제작하기 쉽다. 그러나 동시에 기계적, 화학적으로 쉽게 손상이 된다. 또한 바이오 에세이에서 작은 분자들이 고분자 매트릭스로 흡수될 경우 검출 에러로 이어질 수 있다. 이와는 대조적으로 티타니아나 실리카 같은 무기물질은 일반적으로 고분자 유기물에 비해 훨씬 더 단단하고 내화학성이 뛰어나다. 하지만 이 또한 깨지기 쉬우며 다양한 형태로 성형하는 것이 어려운 문제를 가지고 있다. 따라서 고분자 미세입자 위에 실리카 쉘을 코팅함으로써 두 물질의 장점이 합쳐져, 강하고, 단단하며 화학적으로 안정하고 내구성이 좋은 동시에 다양한 형태로 성형하기 쉬운 특징을 한꺼번에 가질 수 있다.
상술한 실리카 코팅된 코드화된 고분자 미세입자를 다중(multiplexed) 바이오분석에 이용할 수 있다. 최근의 다중 생체분석(바이오분석) 분야에서, 코드화된 고분자 미세입자가 DNA나 단백질 같은 생체분자(biomolecules)분석에 사용되고 있다. 이 방법은 거의 무한정의 코드를 사용할 수 있고 높은 분석처리량을 제공하기 때문에 강력하고 적용성이 높은 방법이다. 따라서 본 발명의 일 구현예에 따르면, 이러한 다중 바이오분석의 응용을 위해 상기 실리카 쉘 표면을 개질하여 카르복실기 또는 아민기를 도입할 수 있다. 이러한 작용기들의 존재로 다양한 바이오 물질과 공유결합할 수 있다. 또한 상술한 제조방법에는 바이오 물질을 상기 실리카 쉘 표면에 결합시키는 단계가 더 포함될 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 코드화된 고분자 미세입자를 만드는 과정을 나타낸다. 도 3을 참조하면, 그래피컬 코드(graphical code)를 가진 고분자 미세입자를 제작하기 위해, 먼저 광경화성 물질인 ETPTA(ethoxylated trimethylopropane triacrylate)와 링커인 TMSPA(3-(trimethoxysilyl)propylacrylate), 및 광개시제로서(2-hydroxy-2-methylpropiophenone)를 적정 비율(ex. 10:1:1)로 섞어 광경화성 혼합물을 만든다. TMSPA의 아크릴레이트 그룹은 고분자 매트릭스를 형성하는 광경화 반응에 참여한다. TMSPA는 이 뿐만 아니라 실리카를 형성할 수 있는 실리콘을 구비한 실란(silane) 그룹을 가지고 있어 차후 실리카를 코팅하기 위한 시드(seed) 역할을 한다. 이 화합물에 도 3의 광유체적 무마스크 리소그래피를 포함한 공지된 다양한 리소그래피 방법을 사용하여 패턴화된 UV광을 조사함으로써 그래피컬 코드를 가진 알콕시실란 함유 공중합체(copolymer) 미세입자를 만든다. 광유체적 무마스크 리소그래피(OFML)를 이용하면 미세유체 채널을 통해 원료 물질을 도입하고 패턴화된 에너지를 인가함으로써 인-시튜 광중합에 의해 연속적으로 자유부유 입자들이 제조될 수 있으며, 디지털 마이크로 미러 디바이스(DMD)를 이용한 무마스크 방식에 의해 마스크를 쓰는 다른 리소그래피 방법에 비해 간편하게 다양한 형상의 코드화된 입자들을 얻을 수 있다.
형성된 공중합체 미세입자에 수정된 스토버 방법(Stober method)을 적용해 실리카 코팅을 하여 실리카 쉘을 형성한다. 이 간단한 코팅 과정은 매우 빠르며, 실란기 함유의 미세입자에 실리카를 직접적이고 효율적으로 코팅하는 방법이다. 또한 이 방법은 수백만의 실리카 코팅 미세입자를 한번에 처리할 수 있는 방법이다. 상기 실리카 쉘의 두께는 반응속도 혹은 실리카 전구체의 농도를 조절함으로써 수백 나노미터부터 수 마이크로미터까지 조절이 가능하다. 이렇게 생성된 실리카 쉘을 구비한 미세입자에 기존의 다양한 실리카 표면처리 방법을 그대로 사용하여 여러 가지 작용기의 도입이 가능하다.
도 4는 실제 입자 표면에 실리카 쉘이 자라는 과정을 보여주는 주사전자현미경(SEM) 이미지이다. 도 4를 참조하면, 코팅이 진행되는 정도에 따라 실리카가 표면을 덮고 있는 정도가 다르다. 처음에는 시드가 되는 실리카 나노입자들이 표면에 생성된다. 이후 실리카 나노입자들이 표면에 연속적인 실리카 껍질을 형성할 때까지 합쳐진다. 도 4의 D가 완전히 실리카 껍질을 형성한 이미지이다. 여기서 실리카층의 두께는 약 150nm이다.
도 5는 EPMA(electron probe micro-analyzer)로 실리카 코팅된 미세입자와 실리카 코팅되지 않은 미세입자의 스펙트럼을 비교 분석한 것이다. 도 5를 참조하면, 실리카 코팅이 되지 않는 고분자 미세입자는 TMSPA(시드물질) 없이 ETPTA와 광개시제만으로 제작되었다. 코팅 않된 미세입자의 EPMA 스펙트럼 결과 강한 C와 약한 O만 검출되어 순수 유기 고분자임이 확인된다. Pt 신호도 약간 검출되었으나 이것은 스퍼터로 Pt 코팅을 해주었기 때문이다. 도 5의 아래쪽 그림을 보면 순수한 실리카 껍질이 고분자 미세입자 위에 잘 생성되었음을 확인할 수 있다. 여기서는 Si, O, C의 세가지 신호가 잡히며, 실리카(SiO2) 때문에 O신호가 C보다 훨씬 크게 잡힌다. C 신호가 잡힌 이유는 EPMA의 빔 투과 깊이는 1㎛이고 실리카 껍질의 두께는 그 미만이기 때문이다.
도 6은 실리카 쉘을 구비하지 않은 고분자 미세입자(별 모양)와 실리카 쉘을 구비한 고분자 미세입자(원 모양)의 특성을 비교한 사진이다.
실리카 코팅된 미세입자의 내화학성을 테스트하기위해 0.1M의 로다민(Rhodamine) B 수용액(적색 형광)을 사용했다. 도 6의 A는 로다민 수용액이 코팅되지 않은 고분자 미세입자(별 모양)와 실리카 코팅된 고분자 미세입자(원 모양)에 각각 어떻게 흡수되는지를 보여준다. 도 6의 A를 참조하면, 별 모양의 고분자 미세입자의 경우 형광이미지에서 명확히 보이듯이 로다민 수용액이 미세입자를 이루는 고분자 하이드로젤 물질에 잘 흡수되었다. 고분자 하이드로젤 물질은 어떠한 화학적 물리적 처리 없이도 액체를 잘 흡수한다는 것은 익히 알려져 있다. 그러나, 실리카 쉘(shell)을 구비한 원 모양의 미세입자의 경우, 로다민 수용액이 고분자 하이드로젤 내부로 흡수되는 것을 실리카 쉘이 막았음을 확인할 수 있다. 이는 실리카 코팅된 미세입자가 바이오 분석에 응용될 때 더 안정적이고 정확한 결과를 제공할 수 있다는 증거이다. 왜냐하면 항원이나 올리고뉴클레오티드 같은 물질들이 고분자 매트릭스 안으로 흡수되어 버린다면 이것이 분석 결과의 오류 원인이 될 수 있기 때문이다. 또한 코팅된 입자의 이미지에서 형광이 전혀 나오지 않는 이러한 결과에서, 실리카 표면의 낮은 비특이적 결합성(non-specific binding) 때문에 약간의 염료(dye)의 흡수도 실리카 표면에서 일어나지 않았음을 확인할 수 있다.
한편 두 종류(코팅된, 코팅되지 않은)의 미세입자의 팽창과 수축 특성을 물과 공기에 대한 접촉 실험을 통해 확인해보았다. 일반적으로 고분자 하이드로젤 물질은 많은 양의 물을 흡수하기 때문에 물속에서 팽창하게 된다. 도 6의 B에서 볼 수 있듯이 코팅되지 않은 미세입자는 물속에서 공기로 나왔을 때 많이 수축하지만, 실리카가 코팅된 미세입자는 물속에서 공기로 나와도 그 구조와 부피를 유지함을 확인할 수 있다.
두 종류(코팅된, 코팅되지 않은)의 미세입자의 화학적 안정성을 확인하기위해, 미세입자들을 1M의 아세트산 수용액에 넣고 교반하였다. 24시간이 지난 후 실리카 코팅된 미세입자의 표면은 안정된 상태를 유지하였으나, 코팅되지 않은 미세입자의 표면은 산성용액에 의해 심하게 손상을 입었다(도 6의 C). 일반적으로 고분자 하이드로젤은 pH, 온도 등의 외부 환경에 매우 민감하다. 이와는 반대로 실리카는 일반적으로 유기 고분자보다 훨씬 견고하고 좋은 화학적 안정성을 가지고 있다. 그렇기 때문에 이 실리카 코팅된 미세입자는 유기 용제나 건조 환경을 포함한 다양한 화학 반응에서 고분자 미세입자보다 잘 견딜 수 있다. 따라서 입자에 다양한 작용기를 적용하는 데에 제한요소가 적다.
실리카 코팅된 고분자 미세입자의 표면을 적절히 개질함으로써 특이적 작용기를 도입하여 바이오 물질과 공유결합시킬 수 있다. 그 결과 미세입자가 높은 안정성을 가지면서도 낮은 비특이적 결합성을 갖도록 할 수 있다.
도 7은 실리카 코팅된 고분자 미세입자 표면 위에 올리고뉴클레오타이드를 고정하여 다중 DNA 혼성화 에세이를 행하는 과정을 나타낸다. 도 7을 참조하면, 실리카 코팅된 미세입자가 말단의 하이드록실 그룹의 축합을 통해 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)와 일차 아민과 용이하게 반응한다. 이러한 아민을 곧이어 숙신산과 반응시켜 카르복실화된 표면으로 만들면 DNA의 아미노 그룹과 반응이 가능해진다. 5' 아미노 말단의 DNA들은 카르복실화된 실리카 표면 위에 DNA들을 고정시키는 데 사용된다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)와 N-하이드록시설포숙시닉이미드(sulfo-NHS)를 사용한 가교 결합에 의해 실리카 표면의 카르복실 그룹과 아미노-말단의 DNA의 아미노 그룹 사이에 아마이드 결합이 형성된다.
본 발명의 일 구현예에 따른 코드화된 고분자 미세입자는 다중 바이오 에세이(multiplexed bioassay)에 유용한 이점을 제공한다. 이를 확인하기 위해 실리카 코팅된 미세입자를 사용하여 10개의 구성 단위를 갖는(10-plex) in vitro 인유두종 바이러스(human papillomavirus, HPV) 지노타이핑(genotyping)을 실증하였다. 타겟 HPV 유전자를 2단계 PCR 프로세스로 준비하였다. 도 8은 실리카코팅된 코드화된 고분자 미세입자를 사용한 다중 HPV 지노타이핑을 나타낸다. 도 8의 A는 증폭 및 라벨링 PCR의 개략도이다. 증폭 PCR 이후, 바이오틴(biotin) 부착된 dCTP를 사용하여 라벨 탐침-상보적 HPV 유전자 시퀀스를 라벨링하기 위한 라벨링 PCR을 수행한다. 도 8의 B는 탐침 부착된 미세입자를 사용한 10-plexed HPV 지노타이핑의 개략도이다. 10가지 유형의 HPV 타입 특이적 올리고뉴클레오타이드 타침들을 미세입자들의 실리카 표면에 커플링시킨다. 각각의 타겟 HPV 유전자는 서로 다른 탐침들 중 하나에 상보적이다. 미세입자 구조물 내의 중합되지 않은 구멍들로 이루어진 그래피컬 코드는 미세입자의 실리카 표면 위의 탐침을 식별하기 위한 것이다. 다중 분석 용량(multiplexing capacity)은 그래피컬 코드를 변경함으로써 용이하게 증가될 수 있다. 타겟 HPV 시퀀스로 혼성화 에세이 후, 형광 염료 라벨링된 스트렙타비딘(streptavidin)들을 도입하여 형광 시그널을 얻는다.
자성 물질을 상기 미세입자에 도입하면 캐리어 용액으로부터 원하는 입자를 자기장을 이용하여 용이하게 분리할 수 있다. 도 9는 실리카 코팅된 코드화된 "자성" 미세입자의 제조 및 취급을 나타낸다. 도 9의 A는 실리카 코팅된 자성 미세입자의 제조 단계를 나타낸다. 도 9의 B는 실리카 코팅 공정 전(B1) 및 후(B2)의 자성 미세입자의 전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM) 이미지이다. 도 9의 A 및 B를 참조하면, 상기 자성 미세입자는 실란 그라프트된 미세입자의 표면 위에 폴리아크릴산(PAA) 코팅된 Fe3O4 나노입자를 부착하여 얻어진다. PAA 코팅된 Fe3O4 나노입자는 예를 들어 80±10nm의 크기를 가질 수 있다.
도 9의 C는 캐리어의 자성 분리를 통한 용액 교환 공정을 나타낸다. 외부 자기장을 용액에 인가함으로써 실리카 코팅된 자성입자 및 이러한 실리카 코팅된 자성입자에 결합된 생체분자를 함유한 혼합물을 용액 혼합물로부터 선택적으로 분리할 수 있다.
도 9의 D는 자성 입자의 자기적 취급을 나타내는 광학 현미경 이미지들이다. 자유 부유하는 자성 미세입자들이 인가된 외부 자기장의 방향에 따라 용이하게 움직이는 것을 알 수 있다. 따라서 자유 부유(free-floating)하는 자성 미세입자의 자기적 취급은 용액 교환을 포함하는 바이오에세이에 유용하다. 더욱이 자기적 분리는 입자들에 결합되었던 분리된 타겟의 세척 및 농축이 가능하도록 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상술한 제조방법에 따르면, 광경화성 물질과 이와 중합가능하며 알콕시실릴기를 갖는 링커의 혼합물을 사용하여 코드화된 고분자 미세입자를 제조한다. 이렇게 제조된 코드화된 고분자 미세입자를 실리카 전구체 용액에 넣는 방식으로 수 백만개의 코드화된 고분자 미세입자를 간단한 공정으로 한꺼번에 실리카 코팅할 수 있다. 또한 상술한 자성 나노입자를 고분자 미세입자에 도입함으로써 바이오에세이 시에 입자의 취급이 용이해진다. 본 발명의 일 구현에에 따른 코드화된 미세입자는 실리카 쉘을 구비함으로써 화학적 및 물리적 안정성을 가지며 외부 생체분자를 흡수하지 않기 때문에 정확한 분석을 가능하게 한다. 따라서 상술한 코드화된 고분자 미세입자는 DNA나 단백질에 기반한 진단 등을 포함한 다양한 적용분야에 유용하게 이용될 수 있다.
이상에서 본 발명의 다양한 구현예들에 대해 상세히 기술하였지만, 해당 기술분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람이라면, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 여러 가지로 변형하여 실시할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (16)

  1. 코드화된 고분자 미세입자 코어; 및
    상기 미세입자 코어를 둘러싼 실리카 쉘을 포함하는 코드화된 고분자 미세입자.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 고분자는 광경화성 고분자인 코드화된 고분자 미세입자.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 미세입자 코어에 자성 나노입자들을 더 함유하는 코드화된 고분자 미세입자.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 미세입자 코어와 상기 실리카 쉘 사이에 자성 나노입자들의 층이 개재된 코드화된 고분자 미세입자.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 코드화된 고분자 미세입자 코어와 상기 실리카 쉘이 -Si-O-Si- 결합으로 연결된 코드화된 고분자 미세입자.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 실리카 쉘 표면에 카르복실기 또는 아민기가 도입된 코드화된 고분자 미세입자.
  7. 제1 항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 실리카 쉘 표면에 항원, 항체, DNA, RNA 및 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 바이오 물질이 도입된 코드화된 고분자 미세입자.
  8. 광경화성 물질, 및 상기 광경화성 물질과 중합가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커의 혼함물을 제공하는 단계;
    패턴화된 에너지를 인가하여 상기 혼합물을 경화하고, 코드화함으로써 코드화된 고분자 미세입자 코어를 얻는 단계; 및
    상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 실리카 전구체를 처리하여 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어 위에 실리카 쉘을 형성하는 단계를 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 고분자 미세입자 코어를 얻는 단계는 광유체적 무마스크 리소그라피에 의해 수행되는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  10. 제8 항에 있어서,
    상기 코드화된 미세입자 코어의 표면에 그라프트된 상기 알콕시실릴기와 상기 실리카 전구체의 반응에 의해 상기 코어와 상기 실리카 쉘 계면에 -Si-O-Si- 결합이 형성된 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  11. 제8 항에 있어서,
    상기 혼합물에 자성 나노입자를 추가하는 단계를 더 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  12. 제8 항에 있어서,
    상기 코드화된 고분자 미세입자 코어에 친수성 고분자가 코팅된 자성 나노입자를 부착시키는 단계를 더 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  13. 제8 항에 있어서,
    상기 실리카 쉘 표면을 개질하여 카르복실기 또는 아민기를 도입하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  14. 제8 항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    바이오 물질을 상기 실리카 쉘 표면에 결합시키는 단계를 더 포함하는 코드화된 고분자 미세입자의 제조방법.
  15. 코드화된 고분자 미세입자 코어, 상기 미세입자 코어를 둘러싼 실리카 쉘, 및
    상기 실리카 쉘에 결합된 바이오 물질을 포함하는 코드화된 고분자 미세입자를 이용한 다중 바이오 분석방법.
  16. 제15 항에 있어서,
    상기 미세입자 내부에 자성 나노입자가 더 포함된 다중 바이오 분석방법.
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