CN113646441A - 在流通池中的固定 - Google Patents
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Abstract
在一个示例中，使用第一流体和第二流体将靶材料固定在流通池的两个相对的测序表面上。该第一流体的密度小于靶材料密度，并且该第二流体的密度大于该靶材料密度；或者该第二流体的密度小于该靶材料密度，并且该第一流体的密度大于该靶材料密度。将该第一流体(包含该靶材料)引入该流通池中，由此该靶材料中的至少一些靶材料通过该测序表面中的一个测序表面上的捕获位点固定。移除该第一流体和未固定的靶材料。将该第二流体(包含该靶材料)引入该流通池中，由此该靶材料中的至少一些靶材料通过该测序表面中的另一个测序表面上的捕获位点固定。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月11日提交的美国临时申请序列号62/946,717的权益，该临时申请的内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
流通池用于多种方法和应用，诸如基因测序、基因分型等。在一些方法和应用中，希望由双链DNA(dsDNA)靶分子生成片段化和带标签的DNA分子的文库。通常，目的是由较大dsDNA分子生成较小DNA分子(例如，DNA片段)以用作DNA测序反应中的模板。这些模板可使得能够获得短读取长度。在数据分析过程中，可以将重叠短序列读段进行比对，以重建较长的核酸序列。在一些情况下，可以使用预测序步骤(诸如对特定核酸分子进行条形码编码)来简化数据分析。
发明内容
本文所述的一些示例性试剂盒和方法适于将一种或多种靶材料固定在流通池的相对表面上。该方法的一些示例实现顺序固定，并且该方法的其他示例实现同时固定。
本文所公开的第一方面是一种方法，该方法包括将靶材料固定在流通池的两个相对的测序表面中的每个测序表面处，其中该固定涉及：将其中包含靶材料的第一部分的第一流体引入流通池中，由此靶材料中的至少一些靶材料被两个相对的测序表面中的一个测序表面上的捕获位点固定；从所述流通池中移除所述第一流体和任何未固定的靶材料；以及将其中包含靶材料的第二部分的第二流体引入流通池中，由此靶材料中的至少一些靶材料被两个相对的测序表面中的另一个测序表面上的捕获位点固定；其中二者择一：第一流体的密度小于靶材料的密度，并且第二流体的密度大于靶材料的密度；或者第二流体的密度小于靶材料的密度，并且第一流体的密度大于靶材料的密度。
本文所公开的第二方面是一种试剂盒，该试剂盒包括：其中包含靶材料的制备流体；第一引入流体，所述第一引入流体的密度小于所述靶材料的密度；和第二引入流体，该第二引入流体的密度大于靶材料的密度。
本文所公开的第三方面是一种方法，该方法包括通过以下方式将靶材料固定在流通池的两个相对的测序表面中的每个测序表面处：将包含靶材料的流体引入流通池中，其中该靶材料包括：磁性固体支持物；和附接到该磁性固体支持物的测序就绪核酸片段或模板链；并且该流体的密度至少大致等于该磁性固体支持物的密度；允许所述靶材料中的一些靶材料被所述两个相对的测序表面中的一个测序表面上的捕获位点固定；以及向两个相对的测序表面中的另一个测序表面施加磁力，从而将靶材料中的另一些靶材料拉到两个相对的测序表面中的另一个测序表面，在那里它们被两个相对的测序表面中的另一个测序表面上的捕获位点固定。
本文所公开的第四方面是一种方法，该方法包括通过以下方式同时将第一靶材料固定在流通池的两个相对的测序表面中的第一测序表面处和将第二靶材料固定在两个相对的测序表面中的第二测序表面处：将包含第一靶材料和第二靶材料的靶流体引入流通池中，其中：靶流体的载流体具有流体密度；所述第一靶材料的第一密度小于所述流体密度；并且第二靶材料的第二密度大于该流体密度。
本文所公开的第五方面是一种靶流体，该靶流体包含具有流体密度的载流体；第一靶材料，所述第一靶材料的第一密度小于所述流体密度；和第二靶材料，该第二靶材料的第二密度大于该流体密度。
本文所公开的第六方面是一种方法，该方法包括：将第一靶材料和第二靶材料引入包括两个相对的测序表面的流通池，其中第一靶材料具有不同于第二靶材料的至少一种特性，其中所述至少一种特性选自密度、电荷、磁性以及它们的组合；以及使第一靶材料和第二靶材料暴露于至少一种条件，从而使第一靶材料被两个相对的测序表面中的第一测序表面上的捕获位点固定，并且第二靶材料被两个相对的测序表面中的第二测序表面上的捕获位点固定。
应当理解，这些方面中的任一个方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面和/或第四方面和/或第五方面和/或第六方面的特征的任何组合可与本文所公开的任何示例组合，以实现如本公开所述的有益效果，包括例如靶材料在流通池中的整个测序表面上的更均匀分布。
本文所述的另一个示例适于在流通池上扩增期间减少或防止模板链的迁移。
因此，本文所公开的第七方面是一种方法，该方法包括：将测序就绪核酸片段引入流通池，从而将这些测序就绪核酸片段中的至少一些测序就绪核酸片段接种到流通池的测序表面上的相应引物；从所述流通池中移除未接种的测序就绪核酸片段；将含有液体形式的温度响应材料的扩增混合物引入所述流通池中；使所述液体形式的所述温度响应材料胶凝；引发所述已接种的测序就绪核酸片段的扩增以生成模板链，由此所述凝胶形式的所述温度响应材料减少所述模板链的扩散；使所述凝胶形式的所述温度响应材料液化；以及从流通池中移除液体形式的温度响应材料。
应当理解，第七方面的任何特征可以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第七方面的特征的任何组合可与本文所公开的任何其他方面和/或任何示例组合，以实现如本公开所述的有益效果，包括例如靶材料在流通池中的整个测序表面上的更均匀分布和在流通池上扩增期间模板链的减少的迁移。
附图说明
通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。
图1A至图1C是本文所公开的靶材料的不同示例的示意图；
图2A是流通池的示例的顶视图；
图2B是沿图2A的2B-2B线截取的流动通道和非图案化测序表面的示例的放大剖视图；
图2C是沿图2A的2C-2C线截取的流动通道和图案化测序表面的示例的放大剖视图；
图2D是沿图2A的2D-2D线截取的流动通道和图案化测序表面的另一个示例的放大剖视图；
图3A和图3B一起描绘了本文所公开的方法的一个示例；
图4A和图4B一起描绘了本文所公开的方法的另一个示例；
图5A和图5B一起描绘了本文所公开的方法的又一个示例；
图6A和图6B一起描绘了本文所公开的方法的再一个示例；
图7A和图7B一起描绘了本文所公开的方法的另外的示例；
图8A和图8B一起描绘了本文所公开的方法的又一个示例；
图9A至图9C一起描绘了用于减少扩增期间模板链的扩散和对流的方法的示例；
图10A和图10B是固定在包括图案化测序表面的流通池的顶部测序表面(图10A)和底部测序表面(图10B)上的复合物的明视场图像；
图11A是进行测序后流通池的一个泳道的顶部和底部测序表面的分子覆盖率直方图；
图11B是描绘在进行测序后一个泳道的顶部和底部测序表面的大于Q30的质量评分百分比(Y轴)对比测序循环数(X轴)的曲线图；
图12A和图12B是描绘用不同浓度(μM，X轴)的炔烃-生物素处理的流通池的底部表面(图12A)和顶部表面(图12B)上的复合物装载量(小珠数/mm2，Y轴)的柱形图，其中复合物装载使用两种不同的引入液体进行；
图13A和图13B是描绘在沿着两个不同流通池通道的长度(X轴)的底部表面和顶部表面上的靶复合物装载量和实际复合物装载量(小珠数/mm2，Y轴)的曲线图；以及
图14是描绘在沿着一个流通池通道的长度(X轴)的底部表面和顶部表面上的靶/预期复合物装载量和实际复合物装载量(小珠数/mm2，Y轴)以及每个表面的线性拟合的曲线图。
具体实施方式
一些测序技术利用测序就绪核酸片段。在一些示例中，每个测序就绪核酸片段包括遗传物质的一部分(片段)，以及在3'端和5'端的接头。测序就绪核酸片段可结合至固体支持物，形成复合物。在这些示例中，可能期望使用固体支持物，因为它可保存从其生成片段的较长遗传物质的邻近性信息。其他测序技术利用成簇的固体支持物，该成簇的固体支持物包括附接到固体支持物的模板链的簇。在这些示例中，可能期望使用固体支持物，因为扩增(模板链的形成)可在流通池之外进行，因此流通池化学性质得以简化，因为它不包括扩增引物。然而，当这些靶材料(例如，复合物或成簇固体支持物)用于具有彼此相对定位的两个测序表面(例如，上表面/顶表面和下表面/底表面)的流通池中时，已发现靶材料具有下沉到定位在流通池底部的测序表面的趋势。当其他靶材料(诸如蛋白质生物标志物、微生物组、裂解物等)在具有相对表面的流通池中时，可能会出现类似的问题。
本文所公开的方法的一些示例提供靶材料在两个相对的测序表面上的更平衡的固定。在一些示例中，相同类型的靶材料在两个相对的测序表面上的固定。在其他示例中，将两种不同的靶材料(具有至少一种不同的特性)分别固定在两个相对的测序表面上。
本文所公开的方法的一个示例利用具有不同密度的流体的组合。一种流体密度使得靶材料(例如，复合物、成簇固体支持物)能够迁移到测序表面中的一个测序表面并固定在该测序表面处，而另一种流体密度使得靶材料能够迁移到测序表面中的另一个测序表面并固定在该测序表面处。
该方法的另一个示例利用流体、基本上均匀的磁力和磁响应靶材料(例如，固体支持物)的组合。在该示例中，流体被选择成具有与磁响应靶材料大致相同的密度。在该流体中，靶材料中的一些靶材料下沉(并且固定在测序表面中的一个测序表面处)，而靶材料中的另一些靶材料漂浮。当将基本上均匀的磁力施加到测序表面中的另一个测序表面时，漂浮的靶材料迁移到测序表面中的另一个测序表面并固定在该测序表面处。
本文所公开的方法的又一个示例利用具有不同密度的两种不同靶材料。两种靶材料均包含在相同的流体中。一种靶材料(相对于流体)的密度使得靶材料(例如，复合物、成簇固体支持物)能够迁移到测序表面中的一个测序表面并固定在该测序表面处，并且另一种靶材料(相对于流体)的密度使得靶材料能够迁移到测序表面中的另一个测序表面并固定在该测序表面处。
本文所公开的方法的又一个示例利用具有至少一种不同特性(诸如密度、电荷、磁性或它们的组合)的两种不同靶材料。暴露于至少一种条件导致不同的靶材料迁移至相对的测序表面中的相应测序表面。
靶材料(例如，复合物、成簇固体支持物)在两个测序表面上的固定提高了流通池的整体利用率。
固定化靶材料在两个测序表面上更平衡的分布可导致使用流通池获得的下游度量的改善。在一个示例中，固定化靶材料在两个测序表面上更平衡的分布可导致改善的测序度量。在一个示例中，靶材料可包括复合物，并且当复合物更均匀地分布在流通池的两个测序表面上时，从复合物释放的文库片段也更均匀地接种在相应的测序表面上。这导致相对于形成簇的复合物的位置相对局部化的各个簇的形成。在另一个示例中，靶材料可包括成簇固体支持物。当成簇固体支持物更均匀地分布在流通池的两个测序表面上时，成簇模板链也更均匀地分布。在测序过程中，当将核苷酸掺入簇的相应模板链中时，各个簇产生荧光信号的“空间云”。均匀分布可改善空间云的可读性。
此外，装载两个测序表面会生成更多的区域来生成这些空间云。
定义
除非另外指明，否则本文所用的术语应理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数两者，除非上下文另有明确指示。如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“示例”等意指结合该示例描述的特定要素(例如，特征、结构、组成、构型和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可或可不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。
在本公开(包括权利要求)通篇中使用的术语“基本上”和“约”用于描述和说明有小波动，诸如由于处理中的变化引起的。例如，这些术语可以指小于或等于规定值的±10％，诸如小于或等于规定值的±5％，诸如小于或等于规定值的±2％，诸如小于或等于规定值的±1％，诸如小于或等于规定值的±0.5％，诸如小于或等于规定值的±0.2％，诸如小于或等于规定值的±0.1％，诸如小于或等于规定值的±0.05％。
接头：可以例如通过连接或标记与核酸分子融合的线性寡核苷酸序列。合适的接头长度可在约10个核苷酸至约100个核苷酸或约12个核苷酸至约60个核苷酸或约15个核苷酸至约50个核苷酸的范围内。接头可包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些示例中，接头可以包括与引物(例如，包括通用核苷酸序列(诸如P5或P7序列)的引物)的至少一部分互补的序列。例如，在片段的一个末端处的接头包括与第一流通池或固体支持物引物的至少一部分互补的序列，并且在片段的另一个末端处的接头包括与第二流通池或固体支持物引物的至少一部分相同的序列。互补接头可与第一流通池或固体支持物引物杂交，并且该相同接头是用于其互补拷贝的模板，该互补拷贝可在簇生成期间与第二流通池或固体支持物引物杂交。在一些示例中，接头可以包括测序引物序列或测序结合位点。可将不同接头的组合掺入核酸分子(诸如DNA片段)中。
大致等于：至少大致等于是指一种组分(例如，流体)的密度在另一种组分(例如，固体支持物)的密度的0.08g/cm3内。在一些情况下，两种组分的密度相等。
捕获位点或化学捕获位点：已经用允许靶材料(例如，复合物、成簇固体支持物、蛋白质生物标志物等)定位的化学特性改性的流通池表面的一部分。在一个示例中，捕获位点可包括化学捕获剂(即，能够附接、保留或结合靶分子(例如，复合物、成簇固体支持物、蛋白质生物标志物等)的材料、分子或部分)。一个示例性化学捕获剂包括能够结合靶材料(或结合附接到靶材料的连接部分)的受体-配体结合对的成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)的成员。化学捕获剂的再一个示例是能够与靶材料形成静电相互作用、氢键或共价键(例如，硫醇-二硫化物交换、点击化学、Diels-Alder等)的化学试剂。
复合物：载体，诸如固体支持物，以及附接到载体的即用测序核酸片段。载体还可包括结合对的一个成员，其另一个成员是捕获位点的一部分。
成簇固体支持物：载体，诸如固体支持物，其具有与其附接的多个扩增模板链。多个扩增模板链可被称为“簇”。
沉积：任何合适的施加技术，其可为手动的或自动的，并且在一些情况下，导致表面特性的改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮刀涂布、搅打分配、流动通过涂布(flow through coating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。
凹入部：是指基底或图案化树脂中的离散凹面特征部，该离散凹面特征部具有至少部分地被基底或图案化树脂的间隙区域包围的表面开口。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。例如，凹入部可以是一个孔或两个互连的孔。凹入部还可具有更复杂的结构，诸如脊、台阶特征部等。
每个：当参考项目的集合使用时，每个识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
外部固定剂：与已经引入流通池的复合物不可混溶的气体、液体或粘性介质。气体外部固定剂可用于在络合物或样品周围产生液滴。气体外部固定剂的示例是以合适的流速引导通过流通池的空气。例如，空气可用于从流通池抽吸流体，其在固定在流通池内的复合物周围形成液体的液滴。所形成的液滴用作扩散屏障。液体或粘性介质用于使从复合物释放的测序文库扩散最小化。外部固定剂可以形成扩散屏障，因为测序文库或任何其他多核苷酸在外部固定剂中几乎没有溶剂化。液体形式的示例性外部固定剂包括疏水性油，诸如矿物油、硅油、全氟化油、氟化碳油(例如，FC40)或它们的组合。粘性介质形式的示例性外部固定剂包括含有聚合物(例如，聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等)、葡聚糖、蔗糖、甘油等的缓冲液。在一些示例中，粘性介质是温度响应性凝胶。温度响应性凝胶在非接种温度下是非粘性的，并在接种温度下变成粘性介质。温度响应性凝胶的示例包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(PEO-PPO-PEO)/合成锂皂石纳米颗粒复合物。
流通池：具有其中可进行反应的室(例如，流动通道)、用于将试剂递送到室的入口以及用于从室中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，室使得能够检测在该室中发生的反应。例如，室可包括允许对阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。
流动通道：限定在两个粘结的或以其他方式附接的部件之间的区域，该区域可选择性地接纳液体样品。在一些示例中，流动通道可限定在两个图案化或非图案化的测序表面之间，并且因此可与测序表面的一个或多个部件流体连通。
片段：遗传物质的一部分或片(例如，DNA、RNA等)。邻近性保留文库片段是已被片段化的较长核酸样品的较小片，其中该较长核酸样品的邻近性信息已被保留在片段中。
核酸分子或样品：任何长度的核苷酸的聚合物形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。该术语可指单链或双链多核苷酸。
“模板”核酸分子(或链)可指待分析的序列。模板链的簇包括文库片段的扩增子。
核酸样品中的核苷酸可包括天然存在的核酸及其功能类似物。功能类似物的示例能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核苷酸通常具有含有磷酸二酯键的主链。类似结构可以具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种。天然存在的核苷酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于DNA中)或核糖(例如，存在于RNA中)。类似结构可以具有替代的糖部分，包括本领域已知的多种糖部分中的任一种。核苷酸可以包括天然或非天然碱基。天然DNA可以包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种，并且天然RNA可以包括腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种。可使用任何非天然碱基，诸如锁核酸(LNA)和桥核酸(BNA)。
引物：可与靶序列杂交的核酸分子，诸如附接到文库片段的接头。例如，扩增引物可以用作模板扩增和簇生成的起始点。又如，合成的核酸(模板)链可包括引物(例如，测序引物)可以与之杂交的位点，以便引发与合成的核酸链互补的新链的合成。任何引物可以包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些示例中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包括多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。
测序就绪核酸片段：遗传物质在3'端和5'端具有接头的一部分。在测序就绪核酸片段中，每个接头包括已知的通用序列(例如，其与流通池上的引物的至少一部分互补或相同)和测序引物序列。两个接头还可包括索引(条形码或标签)序列。在一个示例中，一侧(例如，包括P5'或P5序列)可包含小珠索引，并且另一侧(包括P7或P7'序列)可包含样品索引。可通过***转座子将测序就绪核酸片段结合至固体支持物，其中将***的DNA分子固定至固体支持物(例如，小珠)的表面；或通过结合对或其他可裂解的接头直接固定；或通过杂交结合，其中互补接头序列存在于固体支持物的表面上。
测序表面：可进行测序的流通池的表面。在一些示例中，测序表面包括具有接枝到其上的一种或多种类型的扩增引物的聚合物水凝胶。在这些示例中，测序表面还可包括捕获位点以将复合物固定在扩增引物处或附近。在其他示例中，测序表面包括用于固定成簇固体支持物的捕获位点。
固体支持物：由刚性或半刚性材料制成的小主体，其形状的特征在于例如球形、椭圆形、微球形或其他公认的颗粒形状，无论是具有规则还是不规则的尺寸。在一些示例中，固体支持物可以具有与其附接的测序文库。在其他示例中，固体支持物可具有与其附接的模板链的簇。
靶材料：待固定在流通池表面上的任何物质。
转座体：在整合作用酶(例如，整合酶或转座酶)和包含整合识别位点(例如，转座酶识别位点)的核酸之间形成的复合物。
在本文所公开的示例中，将靶材料引入包括两个相对的测序表面的流通池中。现在将描述靶材料和流通池，之后是用于将靶材料固定在两个相对的测序表面中的每个测序表面上的方法的不同示例。
靶材料
示例性靶材料11在图1A至图1C中示出。在本文所公开的示例中，可利用待固定在流通池的表面上的任何靶材料11。例如，靶材料11可为如本文所定义的复合物10A、10B(参见图1A和图1B)、如本文所定义的成簇固体支持物13(参见图1C)、来自特定样品的其他DNA文库、细胞、结合至固体支持物的寡核苷酸缀合蛋白、蛋白质生物标志物、微生物组等。以下描述提供了复合物10A、10B和成簇固体支持物13的一些示例。
复合物
一些示例性复合物10A和10B分别在图1A和图1B中示出。在本文所公开的方法的示例中，复合物10A、10B包括固体支持物12、12'以及附接到固体支持物12、12'的测序就绪核酸片段14、14'、14”。
在利用具有不同密度的流体或具有不同密度的靶材料11或不带电靶材料11的组合的方法的示例中，固体支持物12可为但不限于水凝胶；玻璃(例如，可控孔玻璃珠)；塑料，诸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯与另一种材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(得自The Chemours Co的
)；多糖或交联多糖，诸如琼脂糖、
珠(琼脂糖的交联珠状形式，可得自Cytivia)或
珠(葡聚糖的交联珠状形式，可得自Cytivia)；尼龙；硝化纤维；树脂；二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅；碳纤维；金属；无机玻璃；光纤束；或多种其他聚合物。固体支持物12的一些示例可具有固体小珠、多孔小珠或空心小珠的形式。
在利用流体和磁力的组合的方法的示例中，固体支持物12'为磁响应材料。“磁响应”材料对磁场有响应。磁响应固体支持物的示例包括磁响应材料或由磁响应材料构成。磁响应材料的示例包括顺磁材料、铁磁材料、亚铁磁材料和变磁材料。合适的顺磁材料的示例包括铁、镍和钴，以及金属氧化物，诸如Fe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3和CoMnP。一个可商购获得的示例包括得自ThermoFisher Scientific的DYNABEADSTMM-280链霉抗生物素蛋白(涂覆有链霉抗生物素蛋白的超顺磁珠)。在一些示例中，磁响应材料嵌入聚合物小珠的外壳中。在其他示例中，磁响应材料呈小珠形式并且涂覆有钝化材料，诸如氧化硅或亚硝酸硅。在利用两种不同的靶材料11的示例性方法中，靶材料11中的一种靶材料可包括本文所公开的任何磁响应固体支持物12'。
在利用电场进行固定的方法的示例中，靶材料11的固体支持物12可带正电或带负电。在这些示例中，可使用针对固体支持物12所述的任何示例，并可对其进行涂覆或官能化以赋予所需的电荷。可使用小分子或聚合物赋予固体支持物12电荷。例如，任何固体支持物12(例如，聚苯乙烯、二氧化硅等)可用胺官能化以使它们带正电。可使用任何伯胺、仲胺或叔胺。合适的胺的示例包括氨基硅烷、聚赖氨酸或脱乙酰壳多糖。又如，任何固体支持物12(例如，聚苯乙烯、二氧化硅、
等)可用羧基或硫酸根基团官能化以使它们带负电。再如，任何固体支持物12(例如，聚苯乙烯、二氧化硅、
等)可用聚谷氨酸涂覆以使它们带负电。
虽然未在图1A和图1B中示出，但固体支持物12、12'可用结合对的一个成员官能化。“结合对”是指能够彼此附接的两种试剂(例如，材料、分子、部分)。在该示例中，固体支持物12、12'上的成员是与位于流通池的测序表面上的另一个成员的结合对。在其他示例中，固体支持物12、12'可能能够与流通池的测序表面化学缀合。
固体支持物12、12'的官能化可涉及用结合对成员涂覆固体支持物12、12'，或在结合对成员与固体支持物12、12'表面处的官能团之间形成键。一个示例性结合对成员包括能够结合位于流通池的测序表面上的其他结合对成员的受体-配体结合对的成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)的成员。结合对成员也可以是能够形成静电相互作用、氢键或共价键(例如，硫醇-二硫化物交换、点击化学、Diels-Alder等)的化学试剂。任何形式的化学偶联也可将固体支持物12、12'附接到流通池的测序表面。在许多情况下，可逆的或可裂解的相互作用是期望的，使得固体支持物12、12'可在测序之前移除。
在复合物10A、10B的示例中，测序就绪核酸片段14、14'、14”附接到固体支持物12、12'。每个测序就绪核酸片段14、14'、14”包括在3'端和5'端具有接头(例如，18、18'、18”、22、22'、22”)的较长遗传物质片段的一部分(例如，片段16、16'、16”)。可使用任何文库制备技术来制备测序就绪片段14、14'、14”，该文库制备技术片段化较长遗传物质片段并且将所需接头18、18'、18”、22、22'、22”掺入片段16、16'、16”的末端。一些合适的文库制备技术参考图1A和图1B进行描述。然而，应当理解，也可使用其他文库制备技术。
图1A描绘了复合物10A的示例，该复合物包括测序就绪核酸片段14、14'，该测序就绪核酸片段包括来自较大核酸样品的片段16、16'，其邻近性在固体支持物12、12'上得以保留。本文描述了用于制备复合物10A的一种示例性方法，但应当理解，可使用其他方法，只要能将测序就绪核酸片段14、14'附接到固体支持物12、12'即可。
在用以形成图1A所示的复合物10A的一种示例性方法中，接头序列18、18'通过结合对的一个成员20结合到固体支持物12、12'。在一个示例中，该接头序列18、18'可包括第一测序引物序列(例如，读段1测序引物序列)和第一序列(P5')，该第一序列与流通池(如图2A、图2B和图2C所示)上的扩增引物中的一个扩增引物(例如，P5)的至少一部分互补。接头序列18、18'还可包括索引或条形码序列。接头序列18、18'结合到结合对的一个成员20(例如，生物素)，使得其可结合到固体支持物12、12'的表面，该固体支持物包括结合对的另一个成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等)。在该示例中，固体支持物12、12'上的结合对的成员可为多官能的，因为其可i)结合到用于附接测序就绪核酸片段14、14'的成员20，以及ii)结合到流通池的测序表面。在其他示例中，固体支持物12、12'可用两种不同的结合对成员官能化，例如i)其中一种可结合到用于附接测序就绪核酸片段14、14'的成员20，并且ii)其中另一种可结合到流通池的测序表面。
在该示例中，转座体复合物(未示出)也可在文库制备方法开始时结合到固体支持物12、12'。在将转座体复合物装载在固体支持物12、12'上之前，可将部分Y-接头与转座酶(例如，两个Tn5分子)混合以形成转座体复合物。部分Y-接头可包括彼此杂交的两个镶嵌末端序列。镶嵌末端序列中的一个镶嵌末端序列被称为游离的镶嵌末端序列，因为它具有两个自由端，例如能够附接到接头18、18'的一个自由端，以及能够在片段标签化期间附接到片段化DNA链16、16'的另一个自由端。镶嵌末端序列中的另一个镶嵌末端序列可附接到另一个接头(例如，22、22')，该接头包括第二测序引物序列(例如，读段2测序引物序列)、与流通池上的扩增引物中的另一个扩增引物(P7)的至少一部分相同的第二序列(P7)。在扩增期间，相同序列使得能够形成与流通池上的扩增引物中的另一个扩增引物(P7)的至少一部分互补的拷贝。接头序列22、22'在片段标签化期间不附接到片段化的DNA链16、16'。
将转座体复合物装载在固体支持物12、12'上可涉及将转座体复合物与固体支持物12、12'混合，并将该混合物暴露于用于将游离的镶嵌末端的自由端之一连接到接头序列18、18'的3'端的合适条件。各个转座体复合物可附接到固体支持物12、12'上的接头序列18、18'中的每个接头序列。
在用以形成复合物10A的该示例性方法中，然后可执行片段标签化过程。可将包括较长核酸样品(例如，DNA)的流体(例如，片段标签化缓冲液)添加到具有与其结合的接头序列18、18'和转座体复合物的固体支持物12、12'。当样品接触转座体复合物时，较长核酸样品被片段标签化。将较长核酸样品片段化成片段16、16'，并且每个片段在其5'端被加标签到部分Y-接头上(例如，通过连接游离的镶嵌末端的另一个自由端)。较长核酸样品的连续片段标签化导致转座体复合物之间的多个桥接分子。桥接分子包裹在固体支持物12、12'周围。转座体复合物作为桥接分子保持较长核酸样品的邻近性。
然后可经由十二烷基硫酸钠(SDS)处理或加热或蛋白酶K消化来去除转座酶。转座酶的移除留下附接到固体支持物12、12'的邻近性保留片段16、16'。
为了完成测序就绪片段14、14'，进行进一步延伸和连接以确保样品片段16、16'附接到序列22和22'。所得的复合物10A在图1A中示出。
每个测序就绪核酸片段14、14'包括具有在任一端附接的相应接头序列18和22或18'和22'的邻近性保留文库片段16、16'。接头序列18、18'是最初与固体支持物12、12'结合的那些接头序列，并且包括第一测序引物序列以及与流通池引物中的一个流通池引物互补的第一序列。接头序列18、18'附接到结合对的一个成员20。接头序列22、22'来自部分Y-接头，并且包括与另一个流通池引物相同的第二序列以及第二测序引物序列。因为每个测序就绪核酸片段14、14'包括用于扩增(例如，桥扩增)和测序的合适接头，所以不进行PCR扩增。因此这些片段14、14'是测序就绪的。此外，因为邻近性保留文库片段16、16'来自相同的较长核酸样品，所以原始样品的邻近性得以保留并且文库片段14、14'可适用于连锁长读段应用。
图1B示出了另一种复合物10B，其包括固体支持物12、12'以及附接到固体支持物12、12'的测序就绪核酸片段14”。在一个示例中，在管中创建无PCR的核苷酸文库，然后将该文库在管中的固体支持物12、12'上杂交。在图1B所示的示例中，将接头18”、22”添加至管中的文库片段16”，使具有结合对的一个成员20的引物与管中的接头18”杂交，然后使测序就绪核酸片段14”通过结合对的成员20与固体支持物12、12'结合。在另一个示例中，固体支持物12、12'可具有经由结合对(例如，载体12、12'上的抗生物素蛋白以及附接到引物的生物素)与其附接的引物。这些引物与附接到文库片段16”的接头18”杂交(因此引物和结合对成员位于片段的一端而非另一端)。在另一个示例中，可使用链置换酶进行延伸。这将产生完全双链的文库(例如，没有叉或Y-接头，如图1B所示)。
如所提及的，也可使用其他文库制备技术。例如，可使用基于连接的文库制备技术，其中互补接头序列固定在流通池上。又如，mRNA可通过polyA尾杂交固定至固体支持物12、12'。
成簇固体支持物
示例性的成簇固体支持物13在图1C中示出。成簇固体支持物13包括固体支持物12、12'和通过引物42或42'附接到固体支持物12、12'的模板链64。
固体支持物12、12'的任何示例均可用作成簇固体支持物13的芯。固体支持物12、12'的类型及其一种或多种特性(例如，密度、电荷、磁性等)可取决于待使用的固定方法。
虽然未在图1C中示出并且类似于图1A和图1B中所示的复合物10A和10B，但固体支持物12、12'可用结合对的一个成员官能化以附接到流通池的捕获位点。
如图1C所示，固体支持物12、12'的该示例用引物42、42'官能化。引物42、42'可以是扩增引物42、42'，其可通过在引物42、42'的5'端或其附近的单点共价附接或强非共价相互作用被固定至固体支持物12、12'。该附接使i)引物42、42'的接头特异性部分自由地退火至其同源测序就绪核酸片段，以及ii)3'羟基基团自由用于引物延伸。在5'端或靠近5'端，引物42、42'包含能够共价附接或强非共价相互作用的可化学改性的官能团。可化学改性的官能团的示例包括硫醇、叠氮基、炔烃、氨基、生物素等。
合适的引物42、42'的具体示例包括在Illumina Inc.销售的商业流通池的表面上使用的P5和P7引物，以在HiSeqTM、HiSeqXTM、MiSeqTM、MiSeqDXTM、MiNISeqTM、NextSeqTM、NextSeqDXTM、NovaSeqTM、Genome AnalyzerTM、ISEQTM和其他仪器平台上进行测序。P5引物和P7引物均可接枝到固体支持物12、12'中的每个固体支持物。
在一个示例中，将引物42、42'接枝到固体支持物12、12'可涉及泡涂，其涉及将固体支持物12、12'浸入引物溶液或混合物中，该引物溶液或混合物可包含引物42、42'、水、缓冲液和催化剂。其他接枝技术可涉及喷涂、搅打分配或将引物42、42'附接到固体支持物12、12'的另一种合适的方法。对于接枝方法中的任一种，引物42、42'与固体支持物12、12'的反应性基团反应。
在接枝期间，引物42、42'的可化学改性的官能团与固体支持物12、12'的反应性基团反应或相互作用。以下是在接枝期间可能发生的反应或相互作用的示例：使叠氮基(例如，琥珀酰亚胺基(NHS)酯)封端的引物与肼在固体支持物12、12'的表面上反应，或使炔烃封端的引物与叠氮化物在固体支持物12、12'的表面上反应，或使氨基封端的引物与固体支持物12、12'的表面上的活化羧酸酯基团或NHS酯反应，或使硫醇封端的引物与固体支持物12、12'表面上的烷基化反应物(例如，碘乙酰胺或马来酰亚胺)反应，或使亚磷酰胺封端的引物与固体支持物12、12'表面上的硫醚反应，或使生物素修饰的引物与固体支持物12、12'表面上的链霉抗生物素蛋白相互作用。一些核酸引物42、42'可在离液剂(KI、NI或NaSCN)的存在下被捕获到二氧化硅小珠上。作为一个具体示例，二苯并环辛炔(DBCO，其包括炔烃)封端的引物可用于无铜点击接枝。
为了在固体支持物12、12'上生成模板链64，可首先由任何核酸样品(例如，DNA样品或RNA样品)制备文库模板。当使用RNA样品时，首先将其转化成互补脱氧核糖核酸(cDNA)样品。这可使用逆转录进行，该逆转录利用逆转录酶。在一些示例中，使用用于逆转录和第二链合成的试剂盒。在这些示例中，可使用得自ThermoFisher Scientific的高容量cDNA逆转录试剂盒。在其他示例中，使用用于逆转录和模板转换(用于第二链)的试剂盒。在这些示例中，可使用得自New England Biolabs的模板转换RT酶混合物。
然后DNA或cDNA样品可被片段化成单链的、大小相似(例如，<1000bp)的片段。在制备期间，可将接头添加到这些片段的末端。通过减少循环扩增，可在接头中引入不同的基序，诸如测序结合位点、索引，以及与固体支持物12、12'中的引物42、42'互补或相同的区域。最终文库模板包括DNA或cDNA片段和两端的接头。在一些示例中，来自单个核酸样品的片段具有添加至其的相同接头。
可将多个文库模板引入多个固体支持物12、12'中。文库模板与固定在相应固体支持物12、12'上的两种类型的引物42、42'之一杂交。然后可执行簇生成。在簇生成的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶通过3'延伸从杂交引物复制固体支持物12、12'上的文库模板。例如通过如图1C所示的引物42使原始文库模板变性，留下固定在固体支持物12、12'上的拷贝(例如，模板链64)。等温桥扩增或一些其他形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板环回以与相邻的互补引物(例如，引物42')杂交，并且聚合酶复制所复制的模板以形成双链桥，使该双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并与相邻的互补引物42、42'杂交，并且再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在一个示例中，通过特异性碱基裂解移除反义链，留下正向模板多核苷酸链。成簇导致在固体支持物12、12'上形成若干模板多核苷酸链64。成簇的该示例是桥扩增，并且是可执行的扩增的一个示例。
流通池
流通池24的一个示例的顶视图在图2A中示出。如本文所述，流通池24包括两个测序相对的测序表面。非图案化测序表面30、30'的示例在图2B中示出，图案化测序表面32、32'的示例在图2C中示出，图案化测序表面31、31'的另一个示例在图2D中示出。非图案化测序表面30、30'和图案化测序表面32、32'包括引物42、42'，并因此可与引入待在流通池24上扩增的文库片段的靶材料11一起使用。其他测序表面(诸如图案化测序表面31、31')不包含引物42、42'，因此可与成簇固体支持物13一起使用。
每个测序表面30、30'或32、32'或31、31'由基底(在图2A中通常显示为26)支撑，并且流动通道(在图2A中通常显示为28)限定在测序表面30、30'或32、32'或31、31'之间。
基底26可为单层/单一材料。单层基底的示例在图2B中以附图标号26A和26A'示出。合适的单层基底26A、26A'的示例包括：环氧硅氧烷、玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的
)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的
)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融的二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化二钽(Ta2O5)或其他氧化钽(TaOx)、氧化铪(HfO2)、碳、金属、无机玻璃等。
基底26也可为多层结构。多层基底的示例在图2C和图2D中以附图标号26B和26B'示出。多层结构26B、26B'的一些示例包括玻璃或硅，在表面处具有氧化钽或另一种陶瓷氧化物的涂层。具体参见图2C和图2D，多层结构26B、26B'的其他示例包括其上具有图案化树脂36、36'的基础支持物34、34'。多层基底26B、26B'的其他示例可包括绝缘体上硅(SOI)基底。
在一个示例中，基底26(无论是单层还是多层)可具有在约2mm至约300mm范围内的直径，或者为最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片材或面板。在一个示例中，基底26为直径在约200mm至约300mm范围内的晶片。在另一个示例中，基底26是宽度在约0.1mm至约10mm范围内的管芯。虽然已经提供了示例性尺寸，但应当理解，可使用具有任何合适尺寸的基底26。又如，可使用作为矩形支持物的面板，该面板具有比300mm圆形晶片更大的表面积。
在图2A所示的示例中，流通池24包括流动通道28。虽然示出了若干流动通道28，但应当理解，流通池24中可包括任何数量的通道28(例如，单个通道28、四个通道28等)。在本文所公开的示例中，每个流动通道28是由两个附接的基底(例如，26A和26A'或26B和26B')限定在两个测序表面(例如，30和30'或32和32'或31和31')之间的区域。可将本文所述的流体分别经由入口和出口引入流动通道28和从该流动通道中排出。每个流动通道28可与流通池24中的每个其他流动通道28分离，使得引入任何特定流动通道28中的流体不流到任何相邻的流动通道28中。
可使用部分地取决于基底26的材料的任何合适的技术将流动通道28的一部分限定在基底26中。在一个示例中，将流动通道28的一部分蚀刻到玻璃基底26中。在另一个示例中，可使用光刻、纳米压印光刻等将流动通道28的一部分图案化成多层基底26B、26B'的树脂36、36'。在又一个示例中，可将单独材料(例如，图2B、图2C和图2D中的材料50)施加到基底26，使得单独材料限定流动通道28的壁的至少一部分。
在一个示例中，流动通道28具有矩形构型。流动通道28的长度和宽度可分别小于基底26的长度和宽度，使得基底表面的围绕流动通道28的部分可用于附接到另一基底26。在一些情况下，每个流动通道28的宽度可以为至少约1mm、至少约2.5mm、至少约5mm、至少约7mm、至少约10mm或更大。在一些情况下，每个流动通道28的长度可以为至少约10mm、至少约25mm、至少约50mm、至少约100mm或更大。每个流动通道28的宽度和/或长度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。在另一个示例中，流动通道28是正方形(例如，10mm×10mm)。
例如，当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定流动通道壁的单独材料(例如，材料50)时，每个流动通道28的深度可以小至几个单层厚。对于其他示例，每个流动通道28的深度可以为约1μm、约10μm、约50μm、约100μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约100μm的范围内。在另一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解，每个流动通道28的深度大于、小于上文指定的值或介于它们之间。例如，当使用图案化的测序表面32、32'或31、31'时，流动通道28的深度也可沿着流通池24的长度和宽度变化。
图2B示出了包括非图案化的相对测序表面30、30'的流通池24的剖视图。在一个示例中，这些表面30、30'中的每个表面可在基底26A、26A'上制备，然后基底26A、26A'可彼此附接以形成流通池24的示例。可使用任何合适的粘结材料50诸如粘合剂、有助于粘结的辐射吸收材料等将基底26A、26B粘结在一起。
在图2B所示的示例中，流动通道28的一部分限定在单层基底26A、26A'中的每个单层基底中。例如，每个基底26A、26A'可具有限定于其中的凹面区域38、38'，可在其中引入测序表面30、30'的部件。应当理解，凹面区域38、38'内未被测序表面30、30'的部件占据的任何空间可被认为是流动通道28的一部分。
测序表面30、30'包括聚合物水凝胶40、40'、附接到聚合物水凝胶40、40'的扩增引物42、42'和化学捕获位点44、44'。
聚合物水凝胶40、40'的示例包括丙烯酰胺共聚物，诸如聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。PAZAM和丙烯酰胺共聚物的一些其他形式由以下结构(I)表示：
其中：
RA选自叠氮基、任选地取代的氨基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔烃、卤素、任选地取代的腙、任选地取代的肼、羧基、羟基、任选地取代的四唑、任选地取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；
RB为H或任选地取代的烷基；
RC、RD和RE各自独立地选自H和任选地取代的烷基；
-(CH2)p-中的每一者可任选地被取代；
p为在1至50范围内的整数；
n为在1至50,000范围内的整数；以及
m为在1至100,000范围内的整数。
本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。
丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM的分子量可在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可为约312kDa。
在一些示例中，丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM为直链聚合物。在一些其他示例中，丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM为轻度交联的聚合物。
在其他示例中，聚合物水凝胶40、40'可为结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可用N,N-二甲基丙烯酰胺
替换。在该示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用
替换，其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基(而不是H，如丙烯酰胺的情况)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括
其中RD、RE和RF各自为H或C1-C6烷基，并且RG和RH各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。
作为聚合物水凝胶40、40'的另一个示例，结构(I)中重复出现的“n”特征可用包括具有结构(II)的杂环叠氮基基团的单体替换：
其中R1为H或C1-C6烷基；R2为H或C1-C6烷基；L为包括直链的连接基，其具有2至20个选自碳、氧和氮的原子以及链中的碳和任何氮原子上的10个任选取代基；E为直链，其包括1至4个选自由碳、氧和氮组成的组的原子以及链中的碳和任何氮原子上的任选取代基；A为具有附接到N上的H或C1-C4烷基的N取代的酰胺；并且Z为含氮杂环。Z的示例包括作为单个环状结构或稠合结构存在的5至10个环成员。Z的一些具体示例包括吡咯烷基、吡啶基或嘧啶基。
又如，聚合物水凝胶40、40'可包括结构(III)和(IV)中的每一者的重复出现的单元：
其中R1a、R2a、R1b和R2b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；R3a和R3b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；并且每个L1和L2独立地选自任选地取代的亚烷基连接基或任选地取代的杂亚烷基连接基。
应当理解，其他分子可用于形成聚合物水凝胶40、40'，只要它们被官能化以将寡核苷酸引物42、42'与其接枝即可。合适的聚合物层的其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的聚合物水凝胶42的另外其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括星型聚合物、星形或星型嵌段聚合物、树枝状体等。例如，单体(例如，丙烯酰胺等)可以无规或嵌段方式掺入到星形聚合物的支链(臂)中。
为了将聚合物水凝胶40、40'引入到凹面区域38、38'中，可生成聚合物水凝胶40、40'的混合物，然后将其施加到相应的基底26A、26A'(具有限定于其中的凹面区域38、38')。在一个示例中，聚合物水凝胶40、40'可存在于混合物(例如，与水的混合物或与乙醇和水的混合物)中。然后可使用旋涂、浸渍或浸涂、正压或负压下的材料流或另一种合适的技术将混合物施加到相应的基底表面(包括在凹面区域38、38'中)。这些类型的技术将聚合物水凝胶40、40'毯覆式地沉积在相应的基底26A、26A'上(例如，在凹面区域38、38'中和在与其相邻的间隙区域46、46'上)。可使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将聚合物水凝胶特定地沉积在凹面区域38、38'中而不是沉积在间隙区域46、46'上。
在一些示例中，可活化基底表面(包括凹面区域38、38')，然后可向其施加混合物(包括聚合物水凝胶40、40')。在一个示例中，可使用气相沉积、旋涂或其他沉积方法将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在基底表面上。在另一个示例中，可将基底表面暴露于等离子体灰化，以产生可以附着到聚合物水凝胶40、40'的表面活化剂(例如，-OH基团)。
取决于聚合物水凝胶40、40'的化学性质，所施加的混合物可暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。
然后可进行抛光，以便从凹面区域38、38'的周界处的间隙区域46、46'移除聚合物水凝胶40、40'，同时使在表面上的聚合物水凝胶40、40'在凹面区域38、38'中至少基本上完整。
测序表面30、30'还包括附接到聚合物水凝胶40、40'的扩增引物42、42'。
可执行接枝过程，以将扩增引物42、42'接枝到凹面区域38、38'中的聚合物水凝胶40、40'。在一个示例中，扩增引物42、42'可以通过引物42、42'的5'端处或其附近的单点共价附接或强非共价相互作用固定到聚合物水凝胶40、40'。该附接使i)引物42、42'的接头特异性部分自由地退火至其同源测序就绪核酸片段，以及ii)3'羟基基团自由用于引物延伸。任何合适的共价附接或强非共价相互作用均可用于此目的。可使用的封端的引物的示例包括炔烃封端的引物(例如，其可附接到聚合物水凝胶40、40'的叠氮化物表面部分)、或叠氮化物封端的引物(例如，其可附接到聚合物水凝胶40、40'的炔烃表面部分)、或参考成簇固体支持物13所述的任何其他封端的引物。
合适的引物42、42'的具体示例包括P5引物和P7引物。P5引物和P7引物均可接枝到聚合物水凝胶40、40'中的每个聚合物水凝胶。
在一个示例中，接枝可涉及流动通过沉积(例如，使用暂时性结合的盖)、泡涂、喷涂、搅打分配或通过将引物42、42'附接到聚合物水凝胶40、40'的另一种合适方法。这些示例性技术中的每一种技术可利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可包括引物42、42'、水、缓冲液和催化剂。采用接枝方法中的任一种方法，引物42、42'与凹面区域38、38'中的聚合物水凝胶40、40'的反应性基团反应，并且对周围基底26A、26A'不具有亲和力。因此，引物42、42'选择性地接枝到聚合物水凝胶40、40'。
在图2B所示的示例中，化学捕获位点44、44'包括附接到或施加到聚合物水凝胶40、40'的至少一部分上的化学捕获剂。可使用本文所公开的化学捕获剂的任何示例。例如，化学捕获剂可以是结合对的一个成员，其中结合对的另一成员附接到固体支持物12、12'。
在一些示例中，聚合物水凝胶40、40'的游离官能团(例如，未附接到引物42、42'的那些)可用化学捕获剂官能化，使得在聚合物水凝胶40、40'的整个表面上形成若干化学捕获位点44、44'。在一个示例中，可使用点击化学将炔烃-PEG-生物素接头或不含炔烃-生物素的叠氮基团共价附接到聚合物水凝胶40、40'上的游离叠氮化物。在另一个示例中，与扩增引物42、42'互补的引物可具有与其附接的化学捕获剂。这些互补引物可与扩增引物42、42'中的一些扩增引物杂交以形成化学捕获位点44、44'。
在另一个示例中，可使用微接触印刷、气溶胶印刷等将化学捕获剂沉积在所需位置中，以形成化学捕获位点44、44'。在又一个示例中，掩模(例如，光致抗蚀剂)可用于限定将沉积化学捕获剂的空间/位置，并因此限定将形成化学捕获位点44、44'的空间/位置。然后可沉积化学捕获剂，并且移除掩模(例如，通过剥离、溶解或另一种合适的技术)。在该示例中，化学捕获位点44、44'可包括单层或薄层化学捕获剂。
图2C示出了包括图案化的相对测序表面32、32'的流通池24的剖视图。在一个示例中，这些表面32、32'中的每个表面可在基底26B、26B'上制备，然后基底26B、26B'可彼此附接(例如，经由材料50)以形成流通池24的示例。
在图2C所示的示例中，流通池24包括多层基底26B、26B'，该多层基底中的每个多层基底包括支持物34、34'和定位在支持物34、34'上的图案化材料36、36'。图案化材料36、36'限定由间隙区域46、46'间隔的凹入部48、48'。
在图2C所示的示例中，图案化材料36、36'分别定位在支持物34、34'上。应当理解，可选择性地沉积或者可沉积并图案化以形成凹入部48、48'和间隙区域46、46'的任何材料可用于图案化材料36、36'。
例如，可经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷将无机氧化物选择性地施加到支持物34、34'。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如Ta2O5)、氧化铝(例如Al2O3)、氧化硅(例如SiO2)、氧化铪(例如HfO2)等。
又如，可将树脂施加到支持物34、34'，然后图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻(NIL)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。合适的树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷树脂(POSS)的树脂、非POSS环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的
)以及它们的组合。
如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”(作为
从Hybrid Plastics商购获得)是指作为二氧化硅(SiO2)和有机硅(R2SiO)之间的杂交中间体(例如，RSiO1.5)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的示例可以是如Kehagias等人在MicroelectronicEngineering 86(2009)第776-778页中所述的，该文献以引用方式全文并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[RSiO3/2]n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。多面体低聚倍半硅氧烷的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。本文所公开的树脂组合物可包括一个或多个不同的笼或芯结构作为单体单元。多面体结构可为T8结构，诸如：
并且由下式表示：
该单体单元通常具有八个官能团臂R1至R8。
单体单元可具有带有10个硅原子和10个R基团的笼结构，被称为T10，诸如：
或者单体单元可具有带有12个硅原子和12个R基团的笼结构，被称为T12，诸如：
基于多面体低聚倍半硅氧烷的材料可另选地包括T6、T14或T16笼结构。平均笼含量可在合成期间加以调节，并且/或者通过纯化方法控制，并且单体单元的笼尺寸分布可用于本文所公开的示例中。
在本文所公开的多面体低聚倍半硅氧烷示例中的一些示例中，R1至R8或R10或R12中的至少一者包含环氧基。R1至R8或R10或R12可以相同或不同，并且在一些示例中，R1至R8或R10或R12中的至少一者包含环氧基，而R1至R8或R10或R12中的至少另一者为非环氧官能团。非环氧官能团可以是(a)与环氧基团正交反应(即，在与环氧基团不同的条件下反应)的反应性基团，其用作将树脂偶联到扩增引物、聚合物或聚合剂的手柄；或(b)调节树脂的机械或功能特性(例如，表面能调节)的基团。在一些示例中，非环氧官能团选自叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、氨基、羟基、炔基、酮、醛、酯基、烷基、芳基、烷氧基和卤代烷基。
如图2C所示，图案化材料36、36'包括分别限定于其中的凹入部48、48'和将相邻凹入部48、48'分开的间隙区域46、46'。可设想凹入部48、48'的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个示例中，凹入部48、48'设置在六边形网格中，以便紧密堆积和改善密度。其他布局可包括例如直线(矩形)布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以为呈行和列形式的凹入部48、48'的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可以为凹入部48、48'和/或间隙区域46、46'的重复布置。在另外的其他示例中，布局或图案可以是凹入部48、48'和/或间隙区域46、46'的随机布置。图案可包括点、条、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、格纹、格子、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。
凹入部48、48'的布局或图案可相对于限定区域中的凹入部48、48'的密度(例如，凹入部48、48'的数量)来表征。例如，凹入部48、48'可以大约2百万个/mm2的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm2、约1,000个/mm2、约0.1百万个/mm2、约1百万个/mm2、约2百万个/mm2、约5百万个/mm2、约1千万个/mm2、约5千万个/mm2或更大或更小的密度。还应当理解，图案化材料36、36'中的凹入部48、48'的密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。例如，高密度阵列可被表征为具有间隔小于约100nm的凹入部48、48'，中密度阵列可被表征为具有间隔约400nm至约1μm的凹入部48、48'，并且低密度阵列可被表征为具有间隔大于约1μm的凹入部48、48'。虽然已提供示例性密度，但应当理解，可使用任何合适的密度。凹入部48、48'的密度可部分地取决于凹入部48、48'的深度。在一些情况下，可能期望凹入部48、48'之间的间距甚至大于本文所列的示例。
凹入部48、48'的布局或图案也可根据或另选地根据从凹入部48、48'的中心到相邻凹入部48、48'的中心的平均节距或间距(中心到中心间距)或从一个凹入部48、48'的左边缘到相邻凹入部48、48'的右边缘的平均节距或间距(边缘到边缘间距)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大或更小。凹入部48、48'的特定图案的平均节距可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在一个示例中，凹入部48、48'具有约1.5μm的节距(中心到中心间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。
每个凹入部48、48'的尺寸可通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。
每个凹入部48、48'可具有能够限制引入流通池24中的至少一些流体的任何体积。可以选择最小或最大体积，例如以适应流通池24下游使用所期望的通量(例如复用度)、分辨率、核苷酸或分析物反应性。例如，体积可为至少约1×10-3μm3、至少约1×10-2μm3、至少约0.1μm3、至少约1μm3、至少约10μm3、至少约100μm3或更大。另选地或除此之外，体积可为至多约1×104μm3、至多约1×103μm3、至多约100μm3、至多约10μm3、至多约1μm3、至多约0.1μm3或更小。
每个凹入部开口所占据的面积可基于与上文针对体积所述的标准类似的标准来选择。例如，每个凹入部开口的面积可为至少约1×10-3μm2、至少约1×10-2μm2、至少约0.1μm2、至少约1μm2、至少约10μm2、至少约100μm2或更大。另选地或除此之外，面积可为至多约1×103μm2、至多约100μm2、至多约10μm2、至多约1μm2、至多约0.1μm2、至多约1×10-2μm2或更小。每个凹入部开口所占据的面积可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
每个凹入部48、48'的深度可大到足以容纳一部分聚合物水凝胶40、40'。在一个示例中，深度可以为至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，深度可以为至多约1×103μm、至多约100μm、至多约10μm或更小。在一些示例中，深度为约0.4μm。每个凹入部48、48'的深度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
在一些情况下，每个凹入部48、48'的直径或长度和宽度可以为至少约50nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，直径或长度和宽度可以为至多约1×103μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。在一些示例中，直径或长度和宽度为约0.4μm。每个凹入部48、48'的直径或长度和宽度可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。
在该示例中，可将测序表面32、32'的至少一些部件引入凹入部48、48'中。应当理解，凹入部48、48'内未被测序表面32、32'的部件占据的任何空间可被认为是流动通道28的一部分。
在图2C所示的示例中，聚合物水凝胶40、40'位于凹入部48、48'中的每个凹入部内。聚合物水凝胶40、40'可如参考图2B所述那样施加，使得聚合物水凝胶40、40'存在于凹入部48、48'中并且不存在于周围的间隙区域46、46'上。
在图2C所示的示例中，可将引物42、42'接枝到凹入部48、48'中的每个凹入部内的聚合物水凝胶40、40'。引物42、42'可参考图2B所述那样施加，因此该引物将接枝到聚合物水凝胶40、40'而不是接枝到周围的间隙区域46、46'。
在图2C所示的示例中，化学捕获位点44、44'包括施加到间隙区域46、46'的至少一些间隙区域上的化学捕获剂。例如，可使用微接触印刷、气溶胶印刷等将化学捕获剂沉积在间隙区域46、46'的至少一些间隙区域上，以形成化学捕获位点44、44'。在又一个示例中，掩模(例如，光致抗蚀剂)可用于限定将沉积化学捕获剂的空间/位置，并因此限定将形成化学捕获位点44、44'的空间/位置。然后可沉积化学捕获剂，并且移除掩模(例如，通过剥离、溶解或另一种合适的技术)。
在其他示例中，化学捕获位点44、44'包括附接到聚合物水凝胶40、40'的游离官能团(例如，未附接到引物42、42'的那些官能团)的化学捕获剂。在其他示例中，化学捕获位点44、44'包括附接到引物的化学捕获剂，这些引物与扩增引物42、42'中的一些扩增引物杂交。在这些示例中，化学捕获位点44、44'将存在于凹入部48、48'中而不在间隙区域46、46'上。
本文所公开的化学捕获剂的任何示例可用于图2C所示的示例中。
图2D示出了包括图案化的相对测序表面31、31'的流通池24的剖视图。在一个示例中，这些表面31、31'中的每个表面可在基底26B、26B'上制备，然后基底26B、26B'可彼此附接(例如，经由材料50)以形成流通池24的示例。多层基底26B、26B'中的每个多层基底包括支持物34、34'和定位在支持物34、34'上的图案化材料36、36'。图案化材料36、36'限定由间隙区域46、46'间隔的凹入部48、48'。
相对的测序表面31、31'不包括聚合水凝胶40、40'或引物42、42'。相反，相对的测序表面31、31'包括位于凹入部48、48'中的每个凹入部中的化学捕获位点44、44'。相应的化学捕获位点44、44'能够固定相应的成簇固体支持物13。成簇固体支持物中的每个固体支持物将模板链64的相应簇引入凹入部48、48'中的每个凹入部中。
图2D中的化学捕获位点44、44'包括本文示出的化学捕获剂的任何示例。在该示例中，可使用微接触印刷、气溶胶印刷等将化学捕获剂沉积在凹入部48、48'中，以形成化学捕获位点44、44'。在又一个示例中，掩模(例如，光致抗蚀剂)可用于阻挡间隙区域46、46'，使得化学捕获剂沉积到凹入部48、48'中而不在间隙区域46、46'上。在该示例中，然后可沉积化学捕获剂，并且移除掩模(例如，通过剥离、溶解或另一种合适的技术)。
虽然未示出，但流通池24的另一个示例将图2B的非图案化表面与图2D的捕获位点44、44'组合。在该示例中，凹面区域38、38'(类似于图2B中所示的那些)可涂覆有化学捕获剂而非涂覆有聚合物水凝胶40、40'和引物42、42'。因此，化学捕获位点44、44'可沿着凹面区域38、38'中的整个通道28形成。在该示例中，相应的化学捕获位点44、44'能够沿着相对的测序表面以随机分布固定成簇固体支持物13。
如图2B至图2D所示，基底26A和26A'或26B和26B'彼此附接，使得测序表面30和30'或32和32'或31和31'面向彼此，其间限定有流动通道28。
基底26A和26A'或26B和26B'可在一些或所有间隙区域46、46'处彼此粘结。在基底26A和26A'或26B和26B'之间形成的粘结可以是化学粘结或机械粘结(例如，使用紧固件等)。
可使用任何合适的技术诸如激光粘结、扩散粘结、阳极粘结、共晶粘结、等离子体活化粘结、玻璃料粘结或本领域已知的其他方法将基底26A和26A'或26B和26B'粘结在一起。在一个示例中，间隔层(例如，材料50)可用于粘结基底26A和26A'或26B和26B'。间隔层可以是将基底26A和26A'或26B和26B'中的至少一些部分密封在一起的任何材料50。在一些示例中，间隔层可以是有助于粘结的辐射吸收材料。
使用多种流体的方法和试剂盒
利用具有不同密度的流体的组合的方法的示例示于图3A和图3B中。
该方法通常包括：通过将其中包含靶材料11的第一部分的第一流体52(图3A)引入流通池24中来将靶材料11(诸如复合物10A、10B、成簇固体支持物13)固定在流通池24的两个相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的每个测序表面处，由此靶材料11的至少一些靶材料被两个相对的测序表面30、32或30'、32'或31、31'中的一个测序表面30或30'、32或32'、31或31'上的捕获位点44、44'固定；从流通池24中移除第一流体和任何未固定的靶材料；以及将其中包含靶材料11的第二部分的第二流体54(图3B)引入流通池24中，由此靶材料11中的至少一些靶材料被两个相对的测序表面30、32或30'、32'或31、31'中的另一个测序表面30'或30、32'或32、31或31'上的捕获位点44、44'固定；其中二者择一：第一流体52的密度小于靶材料11的密度，并且第二流体54的密度大于靶材料11的密度；或者第二流体54的密度小于靶材料11的密度，并且第一流体52的密度大于靶材料11的密度。
在执行图3A和图3B所示的方法之前，可制备或获得靶材料11。
在一个示例中，复合物10A或10B可使用核酸样品和其中包含多个固体支持物12、12'的文库制备流体来制备。在一些示例中，文库制备流体中的固体支持物12、12'中的每个固体支持物可具有例如接头(诸如接头18)和与其附接的转座体复合物，如参考图1A所述。片段标签化和文库制备可如图1A所定义进行以形成复合物10A。核酸样品、固体支持物12、12'、部分Y接头和转座酶可包含在分开的流体中，直到需要形成复合物10A。在其他示例中，文库制备流体中的固体支持物12、12'中的每个固体支持物可具有例如与其附接的寡核苷酸。在一些示例中，无PCR的核苷酸文库制备可与固体支持物12、12'分开进行，然后所制备的文库片段可在固体支持物12、12'的表面处与寡核苷酸杂交，如参考图1B所述。可使用文库制备的其他示例(例如，包括PCR)，只要片段在与固体支持物12、12'上的寡核苷酸杂交之前变性为单链片段即可。
在另一个示例中，可通过在用引物42、42'官能化的多个固体支持物12、12'的存在下扩增文库片段来制备成簇固体支持物13。
可将靶材料11(例如，复合物10A或10B，或具有与其附接到的测序就绪片段14、14'的任何其他固体支持物12、12'，或成簇固体支持物13)分成第一部分和第二部分。可将靶材料11的第一部分掺入第一流体52中，并且可将靶材料11的第二部分引入第二流体54中。
第一流体52和第二流体54具有不同的密度。在一个示例中，第一流体52的密度小于靶材料11的密度，并且第二流体54的密度大于靶材料11的密度。在一个具体示例中，第一流体52的密度小于复合物10A或10B或成簇固体支持物13的固体支持物12、12'的密度，并且第二流体54的密度大于复合物10A或10B或成簇固体支持物13的固体支持物12、12'的密度。在另一个示例中，第二流体54的密度小于靶材料11的密度，并且第一流体52的密度大于靶材料11的密度。在另一个具体示例中，第二流体54的密度小于复合物10A或10B或成簇固体支持物13的固体支持物12、12'的密度，并且第一流体52的密度大于复合物10A或10B或成簇固体支持物13的固体支持物12、12'的密度。因此，流体52、54中的每种流体的密度取决于所使用的靶材料11。在一些示例中，复合物10A或10B或成簇固体支持物13的密度大约等于复合物10A或10B或成簇固体支持物13中所用的固体支持物12、12'的密度，因此在所提供的具体示例中，流体52、54中的每种流体的密度取决于靶材料11中所用的固体支持物12、12'。
流体52、54的密度可在引入流通池24中的靶材料11(例如，复合物10A、10B或成簇固体支持物13)的捕获温度下测量。在一个示例中，捕获温度在约18℃至约40℃的范围内。
在一个示例中，流体52或54中的一种流体在捕获温度下的密度比靶材料11(例如，复合物10A或10B或成簇固体支持物13的固体支持物12、12')在捕获温度下的密度低至少0.1g/cm3，并且流体54或52中的另一流体在捕获温度下的密度比靶材料11(例如，复合物10A或10B或成簇固体支持物13的固体支持物12、12')在捕获温度下的密度高至少0.1g/cm3。在一个具体示例中，当靶材料(例如，固体支持物12、12')的密度为Xg/cm3时，流体52或54中的一种流体在捕获温度下的密度为Xg/cm3-0.1g/cm3，并且流体54或52中的另一流体在捕获温度下的密度为Xg/cm3+0.1g/cm3。
除了具有相应的密度之外，流体52、54还应与靶材料11相容。当使用复合物10A、10B时，流体52、54应与复合物10A、10B和测序表面30、30'或32、32'或31、31'相容，使得片段14、14'、14”和引物42、42'不会受到不利影响。当使用成簇固体支持物13时，流体52、54应与成簇固体支持物13相容，使得模板链64不会受到不利影响。
低密度流体52或54可为任何含水缓冲溶液(例如，弱酸及其盐之一(共轭碱)或弱碱及其盐之一(共轭酸))。可调节含水缓冲溶液中的盐浓度，使得较低密度流体52或54的密度小于靶材料11的密度(例如，复合物10A、10B或成簇固体支持物13的固体支持物12、12'的密度)。靶材料11和较低密度流体52或54之间的密度差越大，靶材料11(例如，复合物10A、10B或成簇固体支持物13)在较低密度流体52或54中的沉降时间越快。例如，较低密度流体52或54可为Tris-HCl缓冲液或0.5x柠檬酸钠盐水(SSC)缓冲液。在一个示例中，较低密度流体52或54为密度为约1g/cm3的含水缓冲溶液。该较低密度流体52或54可尤其适用于密度为约1.18g/cm3的靶材料11。
较高密度流体54或52可为盐水溶液。所选择的盐应当使得流体52或54成为“重”的，并且也应当不会不利地影响靶材料。当使用复合物10A、10B时，盐不应不利地影响复合物10A、10B或引物42、42'。当使用成簇固体支持物13时，盐不应不利地影响模板链64。可调节含水缓冲溶液中的盐浓度，使得较高密度流体54或52的密度大于靶材料11的密度。较高密度流体54或52的示例包括多钨酸钠溶液和氯化钠溶液。在一个示例中，较高密度流体54或52为密度在约2g/cm3至约3g/cm3范围内的多钨酸钠溶液。这些较高密度流体54或52可尤其适合与密度为约1.18g/cm3的靶材料11一起使用。在这些示例中，多钨酸钠溶液的浓度范围为每1毫升水约1克多钨酸钠至每1毫升水约2.52克多钨酸钠。在另一个示例中，25％(w/v)氯化钠溶液的密度为约1.2g/cm3。
在一个示例中，密度小于靶材料的密度的第一流体52或第二流体54为含水缓冲溶液，并且密度大于靶材料的密度的第二流体54或第一流体52为多钨酸钠溶液或氯化钠溶液。在另一个示例中，在捕获温度下小于靶材料的密度的第一流体52或第二流体54的密度为约1g/cm3，并且其中在捕获温度下大于靶材料的密度的第二流体54或第一流体52的密度为约2g/cm3。
如图3A所示，该方法的一个示例涉及将包含靶材料11(例如，图3A中的复合物10A)中的一些靶材料的第一流体52引入流通池24中。在该示例中，第一流体52的密度比复合物10A的固体支持物12、12'的密度更低，并且因此复合物10A迁移到或沉降在底部测序表面30'处。捕获位点44'(图3A中未示出)将复合物10A中的至少一些复合物固定在底部测序表面30'处。
应当理解，第一流体52中的一些复合物10A(或其他靶材料11)可不沉降，并且这些复合物10A(或其他靶材料)将在进一步处理之前从流通池24中移除。在从流通池24中移除第一流体52和任何未固定的靶材料(例如，复合物10A)之前，可允许经过预先确定的时间。在一个示例中，预先确定的时间可在约5分钟至约30分钟的范围内，以便获得期望数量的固定的复合物10A或其他靶材料11。也可使用更长的温育时间。
该示例性方法然后包括从流通池24洗掉第一流体52和未固定的靶材料11(例如，复合物10A)。洗涤可涉及将洗涤流体引入流通池24中。该流动可将尚未在测序表面30'处沉降并固定的任何复合物10A(或其他靶材料11)通过流通池24的出口推出。复合物10A(或其他靶材料11)和测序表面30'的捕获位点44'之间的固定机制(例如，结合对、杂交、共价键合等)可防止任何沉降和固定的复合物10A(或其他固定的靶材料11)成为出口流的一部分。此外，当引入第二流体54时，固定在两个相对的测序表面之一(例如，图3A中的测序表面30')上的靶材料11(例如，图3A中的复合物10A)保持固定在该测序表面上。
如图3B所示，方法的该示例涉及将包含靶材料11(例如，复合物10A)中的另一些靶材料的第二流体54引入流通池24中。在该示例中，第二流体54的密度比复合物10A(或其他靶材料11)的固体支持物12、12'的密度更高，并且因此复合物10A迁移到顶部测序表面30。捕获位点44(图3B中未示出)将复合物10A中的至少一些复合物固定在测序表面30处。
在进行接种、扩增和测序或测序(如下所述)之前，该示例性方法还可包括从流通池24中移除第二液体54和未固定的靶材料11。因此，该示例性方法然后可包括从流通池24洗掉第二流体54和未捕集的靶材料11(例如，未固定的复合物10A)。洗涤可如本文所述进行。该流动可将尚未在上部测序表面30处固定的任何复合物10A(或其他靶材料11)通过流通池24的出口推出。应当理解，复合物10A(或其他靶材料11)和测序表面30、30'的相应捕获位点44、44'之间的固定机制(例如，结合对、杂交、共价键合等)可防止任何固定的复合物10A(或其他固定的靶材料11)成为出口流的一部分。
当使用复合物10A或10B时，该洗涤步骤之后可以是文库片段释放和扩增(例如，其示例参考图9A至图9C进行描述)。当使用成簇固体支持物13时，该洗涤步骤之后可进行测序。
虽然图3A和图3B中所示的示例示出了较低密度流体以及随后的较高密度流体的引入，但是应当理解，可首先引入较高密度流体以将靶材料11固定在上部测序表面30上，然后可引入较低密度的流体以将靶材料11固定在下部/底部测序表面30'上。此外，应当理解，该方法可利用本文所公开的流通池24的任何示例(包括具有图案化表面32、32'的那些流通池)来执行。当使用成簇固体支持物13时，可使用没有扩增引物42、42'的流通池24，诸如参考图2D所示和所述的流通池。
用于执行参考图3A和图3B所述的方法的试剂盒可包括：其中包含靶材料11的制备流体；密度小于靶材料11的密度的第一引入流体(例如，流体52或54)；和密度大于靶材料11的密度的第二引入流体(流体54或52)。在一个示例性试剂盒中，第一引入流体为含水缓冲溶液，并且第二引入流体为多钨酸钠溶液或氯化钠溶液。在一个示例中，当第二引入流体为多钨酸钠溶液时，该多钨酸钠溶液的浓度为每1毫升水约1克多钨酸钠。在另一个示例性试剂盒中，第一引入流体在捕获温度下的密度比靶材料11在捕获温度下的密度低至少0.1g/cm3，并且第二引入流体在捕获温度下的密度比靶材料11在捕获温度下的密度高至少0.1g/cm3。在又一个示例中，第一引入流体在捕获温度下的密度为约1g/cm3，并且其中第二引入流体在捕获温度下的密度为约2g/cm3。
在一些示例中，包含靶材料11的制备流体包含固体支持物12、12'，并且试剂盒还可包括其他文库制备组分，诸如核酸样品、部分Y接头、转座酶等；它们中的每一者可包含在分开的流体中，直到需要形成靶材料11，诸如复合物10A、10B、成簇固体支持物13等。试剂盒的一些示例也可包括流通池24。试剂盒的其他示例可包括制备流体，该制备流体包含本文所公开的靶材料11的任何示例。
使用一种流体的方法和试剂盒
本文所公开的方法的其他示例在靶材料11的固定期间利用一种流体。一些方法利用一种靶材料11和不同的模态来实现在相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'上的固定。其他方法利用两种不同的靶材料11(每种靶材料具有至少一种彼此不同的特性)和相同或不同的模态来实现在相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'上的固定。本文参考图4A和图4B至图8A和图8B描述了不同的示例。
在执行图4A和图4B至图8A和图8B中所示的任何方法之前，复合物10A或10B或成簇固体支持物13可如本文所述制备。
复合物10A或10B可使用核酸样品和其中包含多个磁性固体支持物12'的文库制备流体来制备。在一些示例中，文库制备流体中的磁性固体支持物12'中的每个磁性固体支持物可具有例如接头(诸如接头18)和与其附接的转座体复合物，如参考图1A所述。片段标签化和文库制备可如图1A所定义进行以形成复合物10A。核酸样品、磁性固体支持物12'、部分Y接头和转座酶可包含在分开的流体中，直到需要形成复合物10A。在其他示例中，文库制备流体中的磁性固体支持物12'中的每个磁性固体支持物可具有例如与其附接的寡核苷酸。在一些示例中，无PCR的核苷酸文库制备可与磁性固体支持物12'分开进行，然后所制备的文库片段可在磁性固体支持物12'的表面处与寡核苷酸杂交，如参考图1B所述。可使用文库制备的其他示例(例如，包括PCR)，只要片段在与磁性固体支持物12'上的寡核苷酸杂交之前变性为单链片段即可。
可通过在用引物42、42'官能化的多个固体支持物12、12'的存在下扩增文库片段来制备成簇固体支持物13。
利用流体、基本上均匀的磁力和磁响应靶材料(诸如固体支持物12')的方法的示例示于图4A和图4B中。该方法通常包括通过将包含靶材料11的流体56引入流通池24中，将靶材料11固定在流通池24的两个相对的测序表面30、30'或32、32'中的每个测序表面处，其中流体56的密度大致等于磁性固体支持物12'的密度；允许靶材料11中的一些靶材料被两个相对测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的一个测序表面30或30'、32或32'、31或31'上的捕获位点44或44'(图4A中未示出)固定；以及向两个相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的另一个测序表面30'或30、32'或32、31'或31施加磁力，从而将靶材料11中的另一些靶材料拉到两个相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的另一个测序表面30'或30、32'或32、31'或31，在那里它们被两个相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的另一个测序表面上的捕获位点44'或44(图4B中未示出)固定。当使用复合物10A、10B并且在进行接种和扩增之前(如下所述)，该示例性方法还可包括停止施加磁力并且从流通池24中移除流体和未固定的靶材料。这些步骤之后可以是文库片段释放和扩增(例如，参考图9A至图9C进行描述)。
可将与其附接的靶材料11(例如，复合物10A、10B，或具有测序就绪片段14、14'、14”的任何其他磁性固体支持物12'，或成簇固体支持物13)掺入到流体56中。例如，约25,000个靶材料11(例如，复合物10A、10B或成簇固体支持物13)至约500,000个靶材料11可包含在微升流体中。又如，约100,000个靶材料11至约500,000个靶材料11可包含在微升流体中。根据流通池24的尺寸，可使用其他浓度。
流体56的密度可在引入流通池24中的靶材料11的捕获温度下测量。在一个示例中，捕获温度在约18℃至约40℃的范围内。
流体56被选择成具有与靶材料11的磁性固体支持物12'的密度至少大致相等的密度。在这些示例中，“至少大致等于”意指流体56的密度在磁性固体支持物12'的密度的0.08g/cm3内。在一些情况下，流体56和磁性固体支持物12'的密度相同。通过具有与磁性固体支持物12'至少大致相等的密度，流体56用作温和漂浮剂。如本文所用，术语“温和漂浮剂”是指靶材料11(例如，复合物10A、10B、成簇固体支持物13等)能够在下沉或沉降之前漂浮在其中至少一段时间的流体。在流体56中，靶材料11中的一些靶材料开始下沉并固定到流通池24中的下部/底部测序表面30'、32'、31'，而其他靶材料11保持漂浮(至少一段时间)。
流体56可为任何含水缓冲溶液。可调节含水缓冲溶液中的盐浓度，使得流体56的密度至少大致等于磁性固体支持物12'的密度。换句话讲，可调节含水缓冲溶液中的盐浓度，使得流体56的密度在磁性固体支持物12'的密度的+/-0.08g/cm3内。例如，流体56可为Tris-HCl缓冲液或0.5x柠檬酸钠盐水(SSC)缓冲液或包含约750mM NaCl的75mM柠檬酸钠溶液(pH＝7)。在一个示例中，磁性固体支撑物12'和流体56中的每一者的密度为约1.1g/cm3。
在将流体56和靶材料11引入流通池24中之后，靶材料11初始漂浮在流体56中。随着时间的推移，靶材料11中的一些靶材料将沉降到下部/底部测序表面30'、32'、31'，在此处该靶材料被固定在捕获位点44'处。示例示于图4A中，其中复合物10A中的一些复合物已沉降在下部/底部测序表面30'上。流体56有助于防止所有靶材料11在下部/底部测序表面30'、32'、31'上过快沉降。
因此，在引入流体56并固定靶材料11中的一些靶材料之后，有时间将外部施加的磁力施加到流通池24中的其他测序表面30、32、31。磁力将漂浮靶材料11吸引到流通池24中的上部/顶部测序表面30、32、31。示例示于图4B中，其中复合物10A中的一些复合物已迁移到上部/顶部测序表面30。
在该示例性方法中，可允许在流体56的引入和磁力的施加之间经过预先确定的时间段。这可能是期望的，使得靶材料11中的一些靶材料沉降并固定在一个测序表面30'、32'、31'处，同时剩余的靶材料11保持漂浮在流体56中。在一个示例中，该预先确定的时间在约5分钟至约30分钟的范围内。在一些示例中，在流体56的引入和磁力的施加之间经过预先确定的时间段，并且该预先确定的时间在约5秒至约2分钟的范围内。
如图4B所示，然后通过将磁体58放置在与测序表面30、32相邻的流通池24的外表面60上来施加磁力。磁体58应具有足以吸引漂浮的靶材料11(例如，复合物10A、10B、成簇固体支持物13等)而不吸引已固定在下部/底部测序表面30'、32'、31'上的靶材料11的磁场强度。磁场强度相对较弱，但至少基本上均匀地施加在流动通道28的整个长度和宽度上。相对弱的磁场强度可在约1mT(毫特斯拉)至约100mT的范围内。在一些示例中，相对弱的磁场强度在约1mT至约10mT、或约10mT至约100mT的范围内。这使得漂浮的靶材料11能够被固定到上部/顶部测序表面30、32、31上的捕获位点44。在一些情况下，可使用更强的磁体诸如钕磁体，并且这些磁体具有约1T(特斯拉)的场强。
在一个示例中，磁体58具有与流动通道28和/或流通池24相同的长度和宽度。在一个示例中，磁体58类似于冰箱磁体，并且具有约5mT的磁场强度。在另一个示例中，磁体58是其中嵌入有小磁性颗粒的弹性体条。这些类型的柔性磁体可从例如Uline,ArnoldMagnetic Technologies(FLEXMAGTM)等商购获得。在一个示例中，磁力的施加涉及将嵌入有磁性颗粒的弹性体条放置在流通池24的外表面60上，该外表面与两个相对的测序表面中的另一个测序表面(即，不具有固定在其上的靶材料11的测序表面30)相邻。在一些示例中，磁体可手动施加。在其他示例中，磁力的施加可以是自动的，例如，当磁力被集成到测序***中时。
施加磁体58(以及因此磁力)的时间范围部分地取决于磁体的强度和复合物10A、10B在流体56中的浓度。例如，磁体58可被施加5秒至约2分钟。该方法的示例然后包括停止施加磁力。这可通过移除磁体58来实现。
应当理解，流体56中的一些靶材料11(例如，复合物10A、10B、成簇固体支持物13)可能不会固定在测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的任一个测序表面处，并且该靶材料11可在进一步处理之前从流通池24移除。因此，该示例性方法可包括从流通池24洗掉流体56和未捕集的靶材料11。洗涤可涉及将洗涤流体引入流通池24中。流动可将尚未固定在测序表面30、30'或32、32'或31、31'处的任何靶材料11通过流通池24的出口推出。靶材料11和测序表面30、30'或32、32'或31、31'的捕获位点44、44'之间的固定机制(例如，结合对、杂交、共价键合等)可防止任何固定的靶材料11成为出口流的一部分。
虽然图4A和图4B中所示的示例示出了具有测序表面30和30'的流通池24，但应当理解，该方法可用本文所公开的流通池24的任何示例执行，包括具有图案化测序表面32、32'的那些流通池。当使用包括磁响应固体支持物12'的成簇固体支持物13时，可使用没有扩增引物42、42'的流通池24，诸如参考图2D所示和所述的流通池。此外，在该方法的该示例中，可使用任何其他磁响应靶材料。
用于执行参考图4A和图4B所述的方法的试剂盒可包括：其中包含多个磁性固体支持物12'的制备流体；以及密度大致等于磁性固体支持物12'的密度的引入流体(例如，流体56)。试剂盒还可包括其他文库制备组分，诸如核酸样品、部分Y接头、转座酶等；它们中的每一者可包含在分开的流体中，直到需要形成靶材料11，诸如复合物10A、10B、成簇固体支持物13等。试剂盒的一些示例也可包括流通池24。试剂盒的其他示例可包括含有液体形式的温度响应材料的扩增混合物。
现在将描述图5A和图5B、图6A和图6B、图7A和图7B以及图8A和图8B中所示的方法。这些方法中的每种方法使用靶材料的组合(例如，11A和11B，或11C和11D等)，并且相对于每组图更详细地描述不同的靶材料组合。每组图描绘了用具有非图案化测序表面30、30'的流通池24执行的方法。然而，应当理解，可利用本文所公开的流通池24的任何示例(包括具有图案化表面32、32'的那些流通池)来执行这些方法中的任一种方法。另外，当成簇固体支持物13用作靶材料(例如，11A和11B等)时，可使用没有扩增引物42、42'的流通池24，诸如参考图2D所示和所述的流通池。
利用靶材料11A、11B的组合的方法的一个示例示于图5A和图5B中。在该示例中，靶材料11A、11B具有彼此不同且与载流体不同的密度。
该示例性方法通常包括通过将包含第一靶材料11A和第二靶材料11B的流体56'引入流通池24中，同时将第一靶材料11A固定在流通池24的两个相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的第一测序表面30或32或31处和将第二靶材料11B固定在两个相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的第二测序表面30'或32'或31'处，其中靶流体56'的载流体具有流体密度；第一靶材料11A的第一密度小于该流体密度；并且第二靶材料11B的第二密度大于该流体密度。
靶流体56'的载流体的密度可在引入流通池24中的靶材料11A、11B的捕获温度下测量。在一个示例中，捕获温度在约18℃至约40℃的范围内。
在一个示例中，一种靶材料11A的密度比捕获温度下载流体的密度低至少0.1g/cm3，并且另一种靶材料11B的密度比捕获温度下载流体的密度高至少0.1g/cm3。在一个具体示例中，当载流体在捕获温度下的密度为Xg/cm3时，靶材料11A或11B中的一者的密度为Xg/cm3-0.1g/cm3，并且靶材料11B或11A中的另一者的密度为Xg/cm3+0.1g/cm3。
靶流体56'的载流体可为本文所述的含水缓冲溶液或含水盐溶液中的任一种。可调节含水缓冲溶液或含水盐溶液中的盐浓度，使得载流体在捕获温度下的密度介于靶材料11A、11B的相应密度之间。在另一个示例中，靶流体56'的载流体为离子液体。
靶材料11A、11B可为复合物10A、10B或成簇固体支持物13。用于靶材料11A、11B的支持物12可为本文所述的任何示例，只要相应材料11A、11B的密度相对于载流体是不同的，如该示例性方法中所述。靶材料11A、11B中的每种靶材料中的固体支持物12的密度至少大致等于相应靶材料11A、11B的密度。因此，靶材料11A的固体支持物12被选择成在捕获温度下的密度比靶流体56'的载流体的密度更低，并且靶材料11B的固体支持物12被选择为在捕获温度下的密度比靶流体56'的载流体的密度更高。
如图5A所示，该方法涉及将包含靶材料11A、11B的靶流体56'引入流通池24中。可允许靶流体56'在流通池24中温育预先确定的时间。在一个示例中，预先确定的时间可在约5分钟至约30分钟的范围内，以便在测序表面30、30'上获得期望数量的固定的靶材料11A、11B。也可使用更长的温育时间。
如所提及的，靶材料11A的固体支持物12的密度在捕获温度下比载流体的密度更低，因此靶材料11A迁移或漂浮到上部测序表面30，如图5B所示。捕获位点44(图5B中未示出)将靶材料11A中的至少一些靶材料固定在上部测序表面30处。还如所提及的，靶材料11B的固体支持物12的密度在捕获温度下比载流体的密度更高，因此靶材料11B迁移或沉降到底部测序表面30'，如图5B所示。捕获位点44'(图5B中也未示出)将靶材料11B中的至少一些靶材料固定在下部/底部测序表面30'处。
由于靶材料11A、11B相对于载流体的不同密度，靶材料11A、11B的固定在将靶流体56'引入到流通池24时同时发生。因此，在图5A和图5B的方法中，第一靶材料11A中的至少一些第一靶材料通过两个相对的测序表面30中的第一测序表面上的相应捕获位点44固定，第二靶材料11B中的至少一些第二靶材料通过两个相对的测序表面30'中的第二测序表面上的相应捕获位点44'固定。
应当理解，一些靶材料11A、11B可能未固定，并且将在进一步处理之前从流通池24中移除这些靶材料11A、11B。因此，该示例性方法然后包括从流通池24洗掉靶流体56'和未固定的靶材料11A、11B的载流体。洗涤可涉及将洗涤流体引入流通池24中。流动可将尚未固定在测序表面30、30'处的任何靶材料11A、11B通过流通池24的出口推出。相应靶材料11A、11B和测序表面30、30'的捕获位点44、44'之间的固定机制(例如，结合对、杂交、共价键合等)可防止任何固定的靶材料11A、11B成为出口流的一部分。
当复合物10A或10B用作靶材料11A、11B时，该洗涤步骤之后可以是文库片段释放和扩增(例如，其示例参考图9A至图9C进行描述)。当使用成簇固体支持物13时，该洗涤步骤之后可进行测序。
用于执行参考图5A和图5B所述的方法的试剂盒可包括：靶流体56'，该靶流体包括具有流体密度的载流体；第一靶材料11A，该第一靶材料的第一密度小于该流体密度；和第二靶材料11B，该第二靶材料的第二密度大于该流体密度。
在一些示例中，第一靶材料11A和第二靶材料11B为复合物10A或10B。在这些示例中，第一靶材料11A包括第一固体支持物密度大致等于第一密度(即，小于流体密度)的第一固体支持物12，以及附接到第一固体支持物12的测序就绪核酸片段14、14'、14”；并且第二靶材料11B包括第二固体支持物密度大致等于第二密度(即，大于流体密度)的第二固体支持物12，以及附接到第二固体支持物12的测序就绪核酸片段14、14'、14”。
在其他示例中，第一靶材料11A和第二靶材料11B为成簇固体支持物13。在这些示例中，第一靶材料11A包括第一固体支持物密度大致等于第一密度(即，小于流体密度)的第一固体支持物12，以及附接到第一固体支持物12的模板链64的第一簇；并且第二靶材料11B包括第一固体支持物密度大致等于第二密度(即，大于流体密度)的第二固体支持物12，以及附接到第二固体支持物12的模板链64的第二簇。
试剂盒可另选地包括载流体、用于制备靶材料11A的试剂和材料，以及用于制备靶材料11B的试剂和材料。在该示例中，可使用相应的试剂和材料并如本文所述制备相应靶材料11A、11B，然后可将它们添加到载流体中以形成靶流体56'。
该方法的其他示例利用不同的靶材料和不同的模态来固定靶材料。这些示例通常包括将第一靶材料和第二靶材料引入流通池24，该流通池包括两个相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'，其中第一靶材料具有不同于第二靶材料的至少一种特性，其中所述至少一种特性选自密度、电荷、磁性以及它们的组合；以及使第一靶材料和第二靶材料暴露于至少一种条件，从而使第一靶材料被两个相对的测序表面30、32或31中的第一测序表面上的捕获位点44固定，并且第二靶材料被两个相对的测序表面30'、32'、31'中的第二测序表面上的捕获位点44'固定。
一个示例性方法在图6A和图6B中示出。在该示例中，靶材料11C、11D具有相反的电荷。
如图6A所示，第一靶材料11C具有负电荷，并且第二靶材料11D具有正电荷。本文所述的带电固体支持物12的任何示例均可用于该示例中。在一个示例中，带负电的第一靶材料11C选自羧化固体支持物、涂覆有聚谷氨酸的固体支持物和硫酸盐官能化的固体支持物；并且带正电的第二靶材料11D选自胺官能化的固体支持物，诸如脱乙酰壳多糖官能化的固体支持物和聚赖氨酸官能化的固体支持物。
可将靶材料11C、11D引入流通池24中的流体56”的一部分。在该示例中，用于将带电靶材料11C、11D引入流通池24中的流体56”可为电解质。例如，流体56”可以是以相同摩尔浓度(例如，各4.5mM)存在的三(羟甲基)氨基甲烷和硼酸的组合。当复合物10A、10B用作靶材料11C、11D时，可使用低盐缓冲液，诸如具有约4mM Mg2+的柠檬酸钠盐水(SSC)缓冲液(例如，约45mM)。这种类型的流体56”可使带电靶材料11C、11D上的电荷最大化，同时还允许在文库片段14、14'、14”释放时杂交。当成簇固体支持物13用作靶材料11C、11D时，水可用作流体56”。
此外，流体56”和靶材料11C、11D的密度可大致相等，使得靶材料11C、11D的密度不会干扰靶材料11C、11D的静电诱导迁移。在另一个示例中，流体56”和靶材料11C、11D的密度可不相等。在该示例中，由于所施加的电场62产生的力的强度大于由于密度差异产生的任何力。
在该示例性方法中，带电靶材料11C、11D暴露以引发同时迁移和固定的条件是施加在两个相对的测序表面30和30'、32和32'、或31和31'之间的电场62，以在两个相对的测序表面30、32、31中的第一测序表面处生成正电荷66并在两个相对的测序表面30'、32'、31'中的第二测序表面处生成负电荷68。
为了生成流通池24上的电场62，每个测序表面30,30'或32,32'或31,31'可电耦接到电源以产生吸引相应靶材料11C、11D的相应电荷66、68。在图6A和图6B所示的示例中，电场62以朝向下部/底部测序表面30'的方向施加，导致上部测序表面30带正电而下部/底部测序表面30'带负电。
靶材料11C、11D的固定在流通池24中的流体56”暴露于电场62时同时发生。这是由于靶材料11C、11D的正电荷和负电荷以及它们对所施加的电场62的相应响应。带负电的靶材料11C迁移至现在带正电的测序表面30，在此处它被上部测序表面30的捕获位点44(图6B中未示出)固定。带正电的靶材料11D迁移至现在带负电的测序表面30'，在此处它被下部/底部测序表面30'的捕获位点44(图6B中未示出)固定。
电场62可被施加预先确定的时间。在一个示例中，预先确定的时间可在约1分钟至约30分钟的范围内，以便在相应的测序表面30、30'上获得期望数量的固定的靶材料11C、11D。在其他示例中，电场62可施加约1分钟至约2分钟、或约1分钟至约5分钟、或约5分钟至约30分钟等范围内的时间。
应当理解，一些靶材料11C、11D可能未固定，并且将在进一步处理之前从流通池24中移除这些靶材料11C、11D。可在移除未固定的靶材料11C、11D之前停止电场62。因此，该示例性方法可包括移除电场62，并且随后从流通池24洗掉流体56”和未固定的靶材料11C、11D。洗涤可涉及将洗涤流体引入流通池24中。流动可将尚未固定在测序表面30、30'处的任何靶材料11C、11D通过流通池24的出口推出。相应靶材料11C、11D和测序表面30、30'的捕获位点44、44'之间的固定机制(例如，结合对、杂交、共价键合等)可防止任何固定的靶材料11C、11D成为出口流的一部分。
当复合物10A或10B用作靶材料11C、11D时，该洗涤步骤之后可以是文库片段释放和扩增(例如，其示例参考图9A至图9C进行描述)。当使用成簇固体支持物13时，该洗涤步骤之后可进行测序。
另一个示例性方法在图7A和图7B中示出。在该示例中，靶材料11E、11F在磁性和密度方面不同。
在该示例中(如图7A所示)，将靶材料11E、11F在具有第一密度的流体56”'中引入流通池24中。如下文更详细地描述的，相对于该第一密度(即，在靶材料11E、11F的捕获温度下流体56”'的密度)来选择靶材料11E、11F中的每种靶材料的密度。捕获温度在约18℃至约40℃的范围内。
在图7A和图7B所示的示例中，第一靶材料11E是磁性的，并且第二靶材料11F是非磁性的且密度具有大于第一密度(即，捕获温度下流体56”'的密度)。
在该示例中，第一靶材料11E包括本文所公开的任何磁响应固体支持物12'。另外，流体56”'和靶材料11E的密度可大致相等，使得靶材料11E的密度不会干扰靶材料11E的磁诱导迁移。在另一个示例中，流体56”'和靶材料11E的密度可不相等。在该示例中，由于所施加的磁场70产生的力的强度大于由于密度差异产生的任何力。
同样在该示例中，第二靶材料11F包括本文公开的不具有磁响应性的任何固体支持物12。固体支持物12以及因此靶材料11F的密度大于流体56”'在捕获温度下的密度。因此，靶材料11F对所施加的磁场无响应，并且由于其比流体56”'重而能够迁移到或沉降在底部测序表面30'上。
在该示例性方法中，将包括靶材料11E、11F的流体56”'引入流通池24中(图7A)，并且靶材料11E、11F暴露以引发同时迁移和固定的条件是施加磁力70(图7B)。流体56”'的密度也可被认为是影响迁移和固定的条件。
可如参考图4A和图4B所述施加磁力(或磁场70，如图7B所示)。在图7B所示的示例中，在上部测序表面30的方向上施加磁力/场70，使得磁响应(第一)靶材料11E在相同方向上朝上部测序表面30迁移。捕获位点44(图7A或图7B中未示出)将靶材料11E中的至少一些靶材料固定在上部测序表面30处。同时，靶材料11F的固体支持物12不具有磁响应性并且在捕获温度下比流体56”'重。因此，靶材料11F迁移到或沉降在底部测序表面30'上，如图7B所示。捕获位点44'(图7A或图7B中也未示出)将靶材料11F中的至少一些靶材料固定在下部/底部测序表面30'处。
磁力/磁场70可被施加预先确定的时间。在一个示例中，预先确定的时间可在约5分钟至约30分钟的范围内，以便在测序表面30上获得期望数量的固定的靶材料11E。
靶材料11E、11F的固定在将靶流体56”'引入流通池24时以及在由于靶材料11E、11F的特性(密度和磁性两者)而暴露于磁场70时同时发生。在图7A和图7B的方法中，第一靶材料11E中的至少一些第一靶材料通过两个相对的测序表面30中的第一测序表面上的相应捕获位点44固定，第二靶材料11F中的至少一些第二靶材料通过两个相对的测序表面30'中的第二测序表面上的相应捕获位点44'固定。
应当理解，一些靶材料11E、11F可能未固定，并且将在进一步处理之前从流通池24中移除这些靶材料11E、11F。可在移除未固定的靶材料11E、11F之前停止磁力/磁场70。因此，该示例性方法可包括移除磁力/磁场70，并且随后从流通池24洗掉流体56”'和未固定的靶材料11E、11F。洗涤可涉及将洗涤流体引入流通池24中。流动可将尚未固定在测序表面30、30'处的任何靶材料11E、11F通过流通池24的出口推出。相应靶材料11E、11F和测序表面30、30'的捕获位点44、44'之间的固定机制(例如，结合对、杂交、共价键合等)可防止任何固定的靶材料11E、11F成为出口流的一部分。
当复合物10A或10B用作靶材料11E、11F时，该洗涤步骤之后可以是文库片段释放和扩增(例如，其示例参考图9A至图9C进行描述)。当成簇固体支持物13用作靶材料11E、11F时，该洗涤步骤之后可进行测序。
还可执行图7A和图7B所示的示例性方法，使得磁响应靶材料11E固定在下部/底部测序表面30'上，而非磁响应靶材料11F固定在上部测序表面30上。在该示例中，非磁响应靶材料11F包括固体支持物12，该固体支持物被选择成在捕获温度下的密度小于流体56”'的密度。在该示例中，靶材料11E对磁力/磁场(在底部测序表面30'的方向上施加)有响应并被吸引到底部测序表面30'，而靶材料11F对所施加的磁场无响应并由于其比流体56”'轻而能够漂浮或迁移到上部测序表面30。
另一个示例性方法在图8A和图8B中示出。在该示例中，靶材料11G、11H在电荷和密度方面不同。
在该示例中，将靶材料11G、11H在具有第一密度的流体56””中被引入流通池24中。如下文更详细地描述的，相对于该第一密度(即，在靶材料11G、11H的捕获温度下流体56””的密度)来选择靶材料11G、11H中的每种靶材料的密度。捕获温度在约18℃至约40℃的范围内。
在这些示例中，流体56””是电解质。
在图8A和图8B所示的示例中，第一靶材料11G是带负电的，并且第二靶材料11H是中性的(不带电荷)且密度大于第一密度(即，捕获温度下流体56””的密度)。在该示例中，第一靶材料11G包括本文所公开的带负电的任何固体支持物，诸如羧化固体支持物、涂覆有聚谷氨酸的固体支持物或硫酸盐官能化的固体支持物。此外，流体56””的密度和靶材料11G的密度可大致相等，使得靶材料11G的密度不会干扰带负电的靶材料11G的静电诱导迁移。另选地，靶材料11G的密度可小于流体56””的密度，并且密度和电荷均可有助于靶材料11G的迁移。
在图8A和图8B所示的方法的其他示例中，第一靶材料11G是带负电的，并且第二靶材料11H是中性的(不带电荷)且密度大于第一密度(即，捕获温度下流体56”'的密度)。在该示例中，第一靶材料11G包括本文所公开的带正电的任何固体支持物，诸如胺官能化的固体支持物(例如，脱乙酰壳多糖或聚赖氨酸官能化的固体支持物)。此外，流体56””的密度和靶材料11G的密度可大致相等，使得靶材料11G的密度不会干扰带正电的靶材料11G的静电诱导迁移。另选地，靶材料11G的密度可小于流体56””的密度，并且密度和电荷均可有助于靶材料11G的迁移。
在图8A和图8B所示的示例性方法中，第二靶材料11H包括本文所公开的不带电的任何固体支持物12。固体支持物12以及因此靶材料11H的密度大于流体56””在捕获温度下的密度。因此，靶材料11H对所施加的电场62无响应，并且由于其比流体56””重而能够迁移到或沉降在底部测序表面30'上。
将包括靶材料11G、11H的流体56””引入流通池24中，并且靶材料11G、11H暴露以引发同时迁移和固定的条件是施加电场62。流体56””的密度也可被认为是影响迁移和固定的条件。
可如参考图6A和图6B所述施加电场62。在图8A所示的示例中(当靶材料11G带负电时)，电场62以朝向下部/底部测序表面30'的方向施加。这导致上部测序表面30带正电，而下部/底部测序表面30'带负电。在该示例中，带负电的靶材料11G迁移至现在带正电的测序表面30，在此处它被上部测序表面30的捕获位点44(图8A或图8B中未示出)固定。同时，靶材料11H的固体支持物12不带电荷并且在捕获温度下比流体56””重。因此，靶材料11H迁移到或沉降在底部测序表面30'上，如图8B所示。捕获位点44'(图8A或图8B中也未示出)将靶材料11H中的至少一些靶材料固定在下部/底部测序表面30'处。
如上所述，在图8A和图8B所示的方法的其他示例中，靶材料11G带正电。在该示例中，电场62在朝向上部测序表面30的方向上施加(即，在与图8A和图8B所示的方向相反的方向上施加)。这导致下部测序表面30'带正电，而上部测序表面30带负电。在该示例中，带正电的靶材料11G迁移至现在带负电的上部测序表面30，在此处它被上部测序表面30的捕获位点44固定。同时，靶材料11H的固体支持物12不带电荷并且在捕获温度下比流体56””重。因此，靶材料11H迁移到或沉降在底部测序表面30'上，类似于图8B。捕获位点44'(图8B中也未示出)将靶材料11H中的至少一些靶材料固定在下部/底部测序表面30'处。
在由图8A和图8B表示的示例中的任一个示例中，电场62可被施加预先确定的时间。在一个示例中，预先确定的时间可在约1分钟至约30分钟的范围内，以便在带相反电荷的测序表面30或30'上获得期望数量的固定的带电靶材料11G。
靶材料11G、11H的固定在将靶流体56””引入流通池24时以及在由于靶材料11G、11H的特性(密度和电荷两者)而暴露于磁场62时同时发生。在图8A和图8B的方法中，第一靶材料11G中的至少一些第一靶材料通过两个相对的测序表面30中的第一测序表面上的相应捕获位点44固定，第二靶材料11H中的至少一些第二靶材料通过两个相对的测序表面30'中的第二测序表面上的相应捕获位点44'固定。
应当理解，一些靶材料11G、11H可能未固定，并且将在进一步处理之前从流通池24中移除这些靶材料11G、11H。可在移除未固定的靶材料11G、11H之前停止电场62。因此，该示例性方法可包括移除电场62，并且随后从流通池24洗掉流体56””和未固定的靶材料11G、11H。洗涤可涉及将洗涤流体引入流通池24中。流动可将尚未固定在测序表面30、30'处的任何靶材料11G、11H通过流通池24的出口推出。相应靶材料11G、11H和测序表面30、30'的捕获位点44、44'之间的固定机制(例如，结合对、杂交、共价键合等)可防止任何固定的靶材料11G、11H成为出口流的一部分。
当复合物10A或10B用作靶材料11G、11H时，该洗涤步骤之后可以是文库片段释放和扩增(例如，其示例参考图9A至图9C进行描述)。当成簇固体支持物13用作靶材料11G、11H时，该洗涤步骤之后可进行测序。
还可执行图8A和图8B所示的示例性方法，使得靶材料11G不带电且密度小于靶流体56””的密度。在该示例中，靶材料11H带正电。在该示例中，带正电的靶材料11H对电场62(沿底部测序表面30'的方向施加)有响应并且被吸引到底部测序表面30'。同样在该示例中，靶材料11G对所施加的磁场无响应，并且由于其比流体56”'轻而能够漂浮或迁移到上部测序表面30。
应当理解，可组合其他正交模态以便固定两种不同的靶材料11。每种靶材料11可对正交模态中的一种正交模态而不是另一种正交模态有响应，这允许模态独立地影响靶材料11中的一种靶材料。例如，不带电的磁响应靶材料11可与带电的非磁性靶材料11组合。在该示例中，可在一个方向上施加磁场70以引导不带电的磁响应靶材料11迁移到相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的一个测序表面30、32、31，并且可在相反方向上施加电场62以引导带电的非磁性靶材料迁移到相对的测序表面30、30'或32、32'或31、31'中的另一个测序表面30'、32'、31'。虽然已提供了若干示例，但可以设想，可利用其他靶材料组合和模态。
复合物的文库片段释放和测序
当靶材料11固定在流通池24的两个相对表面30和30'或32和32'或31和31'上时，流通池24准备好用于下游分析。
在利用固定在两个相对的测序表面30和30'或32和32'上的复合物10A、10B的示例中，流通池24准备好进行文库片段释放、扩增和测序。
在固定和移除未固定的靶材料(例如，复合物10A、10B)后，该方法的示例包括引发测序就绪核酸片段14、14'、14”从固定的复合物10A、10B的固体支持物12或12'的释放，从而将至少一些测序就绪核酸片段14、14'、14”接种到两个相对的测序表面30、30'或32、32'的相应引物42、42'；以及移除固体支持物12或12'和未接种的测序就绪核酸片段14、14'、14”。这些步骤之后可以是本文所述的任何扩增技术，包括参考图9A至图9C所述的扩增技术。
在片段14、14'、14”释放之前，可将外部固定剂引入流通池24中。在一个示例中，外部固定剂为空气，或与已引入流通池24的靶材料11(具体地，复合物10A、10B)不可混溶的液体介质或粘性介质。空气可用于将洗涤流体抽吸出流通池24，这可产生围绕复合物10A、10B的液滴并在复合物10A、10B中的每种复合物周围形成扩散屏障。液体或粘性外部固定剂至少部分地围绕固定在流通池24内的复合物10A、10B。当测序就绪核酸片段14、14'、14”从固体支持物12或12'释放时，外部固定剂可有助于使片段14、14'、14”的扩散最小化。当外部固定剂为温度响应材料时，将温度升高到接种温度可能会使试剂变得粘性更大，并且为可进一步使文库扩散最小化的形式。
然后可引发从固体支持物12或12'释放测序就绪核酸片段14、14'、14”。在一个示例中，可将裂解剂引入流通池24中，并且可施加刺激以触发裂解剂，从而从固体支持物12或12'释放测序就绪核酸片段14、14'、14”。在其他示例中，测序就绪核酸片段14、14'、14”的释放可涉及将流通池24加热至高于与片段14、14'、14”杂交的引物的熔化温度。
在释放时，测序就绪核酸片段14、14'、14”的输送和接种可受到外部固定剂的限制。因此，任何特定复合物10A、10B的片段14、14'、14”可被限制在测序表面30、30'或32、32'的在特定复合物10A、10B附近的区域，片段14、14'或14”从该区域释放。
流通池24的相应测序表面30、30'或32、32'的引物42、42'可接种释放的测序就绪核酸片段14、14'或14”。通过片段14、14'或14”的第一序列或第二序列与相应测序表面30、30'或32、32'的引物42、42'中的互补引物之间的杂交来完成接种。接种可在片段14、14'或14”和引物42、42'的合适杂交温度下进行。在一个示例中，接种在约80℃下进行，然后将温度降低至室温(例如，25℃)。
测序就绪核酸片段14、14'或14”在流通池24内接种的位置部分地取决于引物42、42'的附接方式。在具有非图案化测序表面30、30'的流通池24的示例中，释放的测序就绪核酸片段14、14'或14”将在凹面区域38、38'中的聚合物水凝胶40、40'上接种。在具有图案化测序表面32、32'的流通池24的示例中，释放的测序就绪核酸片段14、14'或14”将在凹入部48、48'中的每个凹入部内的聚合物水凝胶40、40'上接种。
在沿流通池24的图案化测序表面32、32'的不同凹入部48、48'中接种的测序就绪核酸片段14、14'或14”的示例在图9A中示出。
然后可将固体支持物12、12'从流通池24移除。固体支持物12、12'的移除可涉及任何合适的技术，这取决于将固体支持物12、12'附接到捕获位点44、44'的机制。例如，可使用变性、键断裂等。移除固体支持物12、12'还可移除未接种的测序就绪核酸片段14、14'或14”。固体支持物12、12'的移除也可移除液体或粘性形式的外部固定剂。
然后可使用簇生成扩增已接种的测序文库片段14、14'或14”。
在簇生成的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶通过3'延伸从杂交引物42、42'复制测序就绪核酸片段14、14'或14”。高保真DNA聚合酶可以是引入流通池24的扩增混合物的一部分。扩增混合物还可包含其他合适的聚合酶链反应试剂。使原始的测序就绪核酸片段14、14'或14”变性，留下固定到测序表面30、30'或32、32'的拷贝。等温桥扩增或一些其他形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，复制的模板环回以与相邻的互补引物42、42'杂交，并且聚合酶复制所复制的模板以形成双链桥，使这些双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并与相邻的互补引物42、42'杂交，并且再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在一个示例中，通过特异性碱基裂解移除反义链，留下正向模板多核苷酸链。成簇使得沿测序表面30、30'或32、32'形成若干模板多核苷酸链。成簇的该示例是桥扩增，并且是可执行的扩增的一个示例。应当理解，可使用其他扩增技术，诸如排除扩增(ExAmp)工作流程(Illumina Inc.)。
扩增以及因此簇生成的另一个示例涉及温度响应材料的使用。该示例在图9A至图9C中示意性地示出。该示例性方法涉及：将含有液体形式63的温度响应材料的扩增混合物引入流通池24中；使液体形式63的温度响应材料胶凝(其生成凝胶形式63'的温度响应材料)；引发已接种的测序就绪核酸片段14、14'或14”的扩增以生成模板链64，由此凝胶形式63'的温度响应材料减少模板链64的扩散；使凝胶形式63'的温度响应材料液化(其生成液体形式63的温度响应材料)；以及从流通池24中移除液体形式63的温度响应材料。
如图9A所示，将含有液体形式63的温度响应材料的扩增混合物已例如经由入口引入流动通道28中。除液体形式63的温度响应材料之外，扩增混合物的该示例还包括高保真DNA聚合酶和任何其他合适的聚合酶链反应试剂。
通过改变材料所暴露的温度条件，温度响应材料能够从液体形式63转变为凝胶形式63'。在液体形式63中，温度响应材料的分子断开连接，因此能够流动。在凝胶形式63'中，温度响应材料的分子交联，因此不能流动。凝胶形式63'包括孔、通道或其他开口，这些孔、通道或其他开口可i)促进小分子、蛋白质和试剂的扩散交换，以接近已接种的测序就绪核酸片段14、14'或14”来进行扩增，以及ii)阻止或防止已接种的测序就绪核酸片段14、14'或14”或模板链64由于扩散或对流而移动。因此，任何温度敏感材料i)促进凝胶内扩增，ii)限制已接种的测序就绪核酸片段14、14'或14”和模板链64的扩散、对流或其他运动，iii)可在交联之前作为液体泵送或以其他方式流动，iv)可以可控地交联和胶凝，以及v)可以可控地断开连接和液化。
温度响应材料的示例包括二硫键交联的聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐，以及聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)和聚乙二醇(PEG)的共聚物。对于这些材料中的每种材料，扩增可在不会熔化凝胶形式63'的温度下进行。
PNIPAAm和PEG的共聚物在较低温度下为液体并且在较高温度下为凝胶。PNIPAAm和PEG的共聚物的一个示例是在低于29℃的温度下为液体并且在高于32℃的温度下为凝胶。PNIPAAm和PEG的共聚物的胶凝温度可通过改变共聚物中聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚乙二醇的比率进行调节。
在不发生扩增反应的条件下将扩增混合物装载到流通池24中。例如，扩增不在4℃下发生，因此扩增混合物(含有温度响应材料的液体形式63)可在该温度下引入。
使液体形式63的温度响应材料胶凝从而生成凝胶形式63'，可通过将流通池24的温度和其中包含的温度响应材料调节至温度响应材料的胶凝温度来进行。凝胶形式63'在图9B中示出。流通池24被调节至的温度将取决于所用的温度响应材料。
如图9B所示，引发已接种的测序就绪核酸片段14、14'或14”的扩增生成模板链64。可通过将流通池24和其中包含的扩增混合物的温度调节至PCR试剂有活性的温度来引发扩增。在扩增期间，凝胶形式63'的温度响应材料减少了已接种的测序就绪核酸片段14、14'或14”和模板链64的移动。
使凝胶形式63'的温度响应材料液化从而生成液体形式63，可通过再次将流通池24的温度和其中包含的温度响应材料调节至温度响应材料的液化温度来进行。同样，流通池24被调节至的温度将取决于所用的温度响应材料。
然后，液体形式63可被泵出流通池24，从而使流通池24为后续测序做好准备。移除液体形式63的温度响应材料后的流通池24示于图9C中。
在一个具体示例中，PNIPAAm和PEG的共聚物用于扩增混合物并与重组酶介导的聚合酶链反应(PCR)结合使用。温度程序可用于控制扩增，因为典型的重组酶介导的等温PCR在4℃下无活性，在37℃或其他高温下有活性，并且PNIPAAm和PEG的共聚物在低于29℃的温度下为液体并且在高于32℃的温度下为凝胶。在该示例中，扩增混合物可在约4℃下作为液体混合物引入流通池24中。然后可将温度升高至约37℃以使共聚物胶凝并开始PCR扩增。在完成时，共聚物的凝胶形式63'可通过将温度降至低于29℃，例如降至约8℃(其为合适的测序温度)来液化。然后，液体形式63可被泵出流通池24，从而使流通池24为后续测序做好准备。
温度响应材料63、63'的使用可使已接种的测序就绪核酸片段14、14'或14”和扩增的模板链64移动(例如，由于扩散或自由对流)至图案化测序表面32、32'的附近凹入部48、48'或远离非图案化测序表面30、30'上的初始接种位置移动的扩散最小化。通过限制或防止这种移动，簇保持在流通池24的相对隔离的区域中，这使得能够单独读取每个簇而没有冗余。移动还可生成原始测序文库片段14、14'或14”中不存在的杂合分子，这导致不准确的测序数据。通过限制或防止这种移动，不生成这些杂合分子，从而提高所得测序数据的准确度。
虽然图9A至图9C描绘了具有图案化测序表面32、32'的流通池24，但应当理解，该方法也可使用非图案化测序表面30、30'执行。
此外，图9A至图9C中所示的方法可用任何测序就绪核酸片段14、14'、14”(包括不栓系到固体支持物12、12'的那些)执行。在该示例中，可使用任何合适的文库制备技术，该技术将所需的接头添加到片段化的DNA样品。可将测序就绪核酸片段14、14'、14”引入并接种到流通池测序表面30、30'或32、32'上。一旦接种了文库片段，就可执行图9A至图9C中所述的方法。
还应当理解，图9A至图9C中所示的方法可不用成簇固体支持物13执行，因为这些靶材料11不暴露于流通池24上的扩增。
然后可引入与模板多核苷酸链上的互补序列杂交的测序引物。该测序引物使得模板多核苷酸链64准备好用于测序。模板64和任何流通池结合的引物42、42'(未附接到拷贝)的3'端可被封闭，以防止干扰测序反应，并且具体地，防止不期望的引发。
为了引发测序，可将掺入混合物添加到流通池24中。在一个示例中，掺入混合物包含液体载体、聚合酶和荧光标记的核苷酸。荧光标记的核苷酸可包含3'OH封端基团。当将掺入混合物引入流通池24中时，流体进入流动通道28，并且在一些示例中，进入凹入部48、48'(其中存在模板多核苷酸链)。
以模板依赖性方式将荧光标记的核苷酸添加到测序引物(从而使测序物延伸)，使得对添加到测序引物中的核苷酸的顺序和类型的检测可用于确定模板的序列。更具体地，通过相应的聚合酶将核苷酸之一掺入延伸测序引物并与模板多核苷酸链互补的新生链中。换句话讲，在流通池24上的至少一些模板多核苷酸链中，相应的聚合酶通过掺入混合物中的核苷酸之一延伸杂交的测序引物。
核苷酸的掺入可以通过成像事件来检测。在成像事件期间，照明***(未示出)可向相应测序表面30、30'或32、32'提供激发光。
在一些示例中，核苷酸可以进一步包括可逆终止属性(例如，3'OH封端基团)，一旦将核苷酸添加到测序引物中，该属性就会终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到测序引物，使得随后的延伸直到递送解封闭剂以除去该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的示例，可以在检测发生之后将解封闭剂递送到流通池24。
洗涤可在各种流体递送步骤之间发生。然后可以重复SBS循环n次以将测序引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。
在一些示例中，可以对正向链进行测序和移除，然后如本文所述对反向链进行构建和测序。
虽然已经详细描述了SBS，但应当理解，本文所述的流通池24可与其他测序方案一起用于基因分型，或用于其他化学和/或生物应用中。在一些情况下，流通池24的引物42、42'可被选择成允许同时进行双端测序，其中正向链和反向链均存在于聚合物水凝胶40、40'上，从而允许同时进行每个读段的碱基检出。顺序和同时双端测序有助于检测基因组重排和重复序列元件，以及基因融合和新转录本。
成簇固体支持物和测序
如上所述，当靶材料11固定在流通池24的两个相对表面30和30'或32和32'或31和31'上时，流通池24准备好用于下游分析。当成簇固体支持物13固定在流通池24的两个相对表面31和31'上时，流通池24准备好用于测序。在这些示例中，流通池24准备好用于测序，因为扩增和簇生成已在流通池24之外的固体支持物12或12'上发生。
测序可如本文所述通过引入测序引物和掺入混合物并进行顺序测序循环来进行。
为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供这些实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。
非限制性工作示例
实施例1
制备平均直径为3μm的类似于图1A所示那些复合物的复合物。复合物的固体支持物为来自ThermoFisher Scientific的DYNABEADSTMM-280链霉抗生物素蛋白小珠。固体支持物各自的密度为约1.18g/cm3。特定小珠上的片段来自相同的长DNA分子(来自PhiX基因组)。将文库片段通过脱硫生物素寡核苷酸附接到固体支持物，该脱硫生物素寡核苷酸具有比生物素对小珠表面上的链霉抗生物素蛋白更弱的亲和力。文库片段包括P5'序列和P7序列，以及索引序列和读段1序列和读段2序列。
使用类似于图3A和图3B中所述的方法的示例，将复合物装载到包括相对的图案化测序表面(包括P5引物和P7引物)的流通池中。
更具体地，首先将复合物分成两种流体，第一流体的密度为约2g/cm3，并且第二流体的密度为约1g/cm3。第一流体为1g/ml多钨酸钠溶液(500mg多钨酸钠/500μL含十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液)，并且包含浓度为600,000个复合物/1μL的复合物。第二流体为含十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液，并且包含浓度为600,000个复合物/1μL的复合物。
将第一流体引入流通池中，并且允许复合物固定到流通池的顶部表面。然后用洗涤溶液洗涤流通池。将第二流体引入流通池中，并且允许复合物固定到流通池的底部表面。用锚定物完成复合物与相应表面的附接(例如，将具有生物素的互补引物与附接到凝胶材料的P5引物杂交，或者使用点击化学将炔烃-PEG-生物素接头共价附接到凝胶材料上的游离叠氮化物)。
图10A示出了复合物固定后的顶部表面的明视场图像，并且图10B示出了复合物固定后的底部表面的明视场图像。每个图像的较暗区域描绘了固定的复合物。
引入含十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液中的游离生物素，并且将流通池加热至约80℃以从相应复合物中释放文库。使用等温扩增进行成簇。簇用Sytox green染色，得到的图像(本文未重现)证实在流通池的每个测序表面上形成了模板链的簇。
然后对流通池进行测序。针对流通池的顶部表面和底部表面收集的一些测序数据在图11A和图11B中示出。
图11A描绘了流通池的一个泳道在顶部表面和底部表面上的分子覆盖率直方图。该数据示出了该泳道测序覆盖度的范围和均匀度。
图11B描绘了在流通池的一个泳道中的顶表面和底表面上，对于各种测序循环，大于Q30的质量评分的百分比。30的质量评分(Q30)相当于1000次中出现错误碱基检出1次的概率。这意味着碱基检出准确度(即，正确碱基检出的概率)为99.9％。99％的较低碱基检出准确度(Q20)将具有100次中出现错误碱基检出1次的概率，这意味着每100个碱基对测序读段将可能包含一个错误。当测序质量达到Q30时，几乎所有的读取都将是完美的，没有错误和歧义。如图11B所描绘的，对于所有测序循环，高于Q30的质量评分的百分比通常在60％至99％的范围内。
所有收集到的数据都证实，密度更大的流体(在该示例中为第一流体)与流通池的测序表面相容。
实施例2
制备平均直径为3μm的类似于图1A所示那些复合物的复合物。复合物的固体支持物为来自ThermoFisher Scientific的DYNABEADSTMM-280链霉抗生物素蛋白小珠。固体支持物各自的密度为约1.18g/cm3。特定小珠上的片段来自相同的长DNA分子(来自PhiX基因组)。
在该示例中，用不同浓度的捕获位点(即，炔烃-PEG-生物素接头)制备流通池泳道(具有涂覆有凝胶材料的相对表面)。使用点击化学将这些接头共价附接到流通池泳道中的凝胶材料上的游离叠氮化物。洗涤流通池泳道并将其分别暴露于浓度为约0.5μM、约5μM或约25μM的炔烃-PEG-生物素溶液。使溶液在约60℃下温育约30分钟。然后再次洗涤流通池泳道。
首先将复合物分成两种流体，第一流体的密度为约1g/cm3，并且第二流体的密度为约2g/cm3。第一流体为含氯化钠的柠檬酸钠盐水缓冲液，并且包含浓度为25,000/μL的复合物。第二流体为2g/ml的多钨酸钠溶液，并且包含浓度为25,000/μL的复合物。
将第一流体引入相应流通池泳道中，并且允许复合物固定到流通池泳道的底部表面。抽吸速率为100μL/min，并且第一流体在流通池中停留180秒。然后用洗涤溶液洗涤流通池。将第二流体引入相应流通池泳道中，并且允许复合物固定到流通池泳道的顶部表面。抽吸速率为100μL/ms，并且第二流体在流通池泳道中停留450秒。然后用洗涤溶液洗涤流通池泳道。
对每个流通池泳道的底部表面和顶部表面进行成像，并使用显微镜图像对每个表面上的固定的复合物(小珠)进行计数。
底部表面的小珠数/mm2示于图12A中，并且顶部表面的小珠数/mm2示于图12B中。图12A和图12B中每个柱的浓度表示用于在复合物固定之前制备流通池的炔烃-PEG-生物素浓度(约0.5μM、约5μM或约25μM)。如所描绘的，炔烃-PEG-生物素浓度不影响在底部表面上的固定，因为这些底部表面中的每个底部表面都具有约2,100个小珠/mm2至约2,300个小珠/mm2。固定在顶部表面上的复合物的数量不如在底部表面上的高，因为它们在约550个小珠/mm2至约1,150个小珠/mm2的范围内。对于顶部表面，用较高浓度的炔烃-PEG-生物素接头处理过的泳道具有固定在其上的较高数量的复合物/小珠。
这些结果表明，较重的流体确实有助于将复合物固定在顶部表面上，并且增加顶部表面上的捕获尺寸浓度也可有助于固定。
实施例3
制备平均直径为3μm的类似于图1A所示那些复合物的复合物。复合物的固体支持物为来自ThermoFisher Scientific的DYNABEADSTMM-280链霉抗生物素蛋白小珠。固体支持物各自的密度为约1.18g/cm3。特定小珠上的片段来自相同的长DNA分子(来自PhiX基因组)。
在该示例中，用捕获位点(即，炔烃-PEG-生物素接头)制备八个流通池泳道(具有涂覆有凝胶材料的相对表面)。使用点击化学将这些接头共价附接到流通池泳道中的凝胶材料上的游离叠氮化物。洗涤流通池泳道并将其分别暴露于浓度为约5μM的炔烃-PEG-生物素溶液。使溶液在约60℃下温育约30分钟。然后再次洗涤流通池泳道。
首先将复合物分成两种流体，第一流体的密度为约1g/cm3，并且第二流体的密度为约2g/cm3。第一流体为柠檬酸钠缓冲液，并且包含浓度为40,000/μL的复合物。第二流体为2g/ml的多钨酸钠溶液，并且包含浓度为40,000/μL的复合物。
将第一流体引入七个流通池泳道中，并且允许复合物固定到底部表面。抽吸速率为100μL/min，并且第一流体在每个泳道中停留240秒。然后用洗涤溶液洗涤流通池泳道。将第二流体引入所述七个流通池泳道中的每个流通池泳道中，并且允许复合物固定到顶部表面。抽吸速率在80μL/ms至100μL/ms的范围内，并且第二流体在流通池中停留300秒。然后用洗涤溶液洗涤流通池泳道。
在第八泳道中，将流体稀释至各100μL，并进行两次相应流体的引入。因此，泳道8具有双重装载。
对每个流通池泳道的底部表面和顶部表面进行成像，并对每个表面上的固定的复合物(小珠)进行计数。表1提供了每个流通池泳道的平均小珠数/mm2。
表1
| 泳道ID | 顶部表面(复合物数/mm<sup>2</sup>) | 底部表面(复合物数/mm<sup>2</sup>) |
| 1 | 3393±343 | 3335±151 |
| 2 | 2291±583 | 3044±556 |
| 3 | 3576±290 | 3395±281 |
| 4 | 3657±606 | 3148±95 |
| 5 | 3577±467 | 3243±229 |
| 6 | 3877±770 | 3194±245 |
| 7 | 3672±594 | 3629±94 |
| 8 | 6272±2000 | 4389±950 |
每个表面的目标复合物(小珠)数量为4,000个小珠/mm2。虽然泳道1-7略低于目标，但这些泳道的顶部表面和底部表面上的复合物数量相对一致。泳道8(暴露于双重装载)超过了两个表面上的目标复合物数量。
图13A示出了如沿着流通池泳道1的长度从入口(1)到出口(5)测量的目标小珠数量和小珠数/mm2。图13B示出了如沿着流通池泳道7的长度从入口(1)到出口(5)测量的目标小珠数量和小珠数/mm2。沿长度等距离进行测量。这些结果表明，沿着流动通道泳道的长度在顶部表面和底部表面两者上的固定是相对一致的。
实施例4
制备平均直径为3μm的类似于图1A所示那些复合物的复合物。复合物的固体支持物为来自ThermoFisher Scientific的DYNABEADSTMM-280链霉抗生物素蛋白小珠。固体支持物各自的密度为约1.18g/cm3。特定小珠上的片段来自相同的长DNA分子(来自PhiX基因组)。
在该示例中，用捕获位点(即，炔烃-PEG-生物素接头)制备十个流通池泳道(具有涂覆有凝胶材料的相对表面)。使用点击化学将这些接头共价附接到流通池泳道中的凝胶材料上的游离叠氮化物。洗涤流通池泳道并将其分别暴露于浓度为约5μM的炔烃-PEG-生物素溶液。使溶液在约60℃下温育约30分钟。然后再次洗涤流通池泳道。
首先将复合物分成两种流体，第一流体的密度为约1g/cm3，并且第二流体的密度为约2g/cm3。第一流体为柠檬酸钠缓冲液，并且包含浓度为10μg/50μL的复合物。第二流体为2g/ml的多钨酸钠溶液，并且包含浓度为12.5μg/50μL的复合物。
将第一流体引入十个流通池泳道中，并且允许复合物固定到底部表面。抽吸速率为100μL/min，并且第一流体在每个泳道中停留300秒。然后用洗涤溶液洗涤流通池泳道。将第二流体引入所述十个流通池泳道中的每个流通池泳道中，并且允许复合物固定到顶部表面。抽吸速率为80μL/ms，并且第二流体在流通池中停留360秒。然后用洗涤溶液洗涤流通池泳道。
对每个流通池泳道的底部表面和顶部表面进行成像，并对每个表面上的固定的复合物(小珠)进行计数。
图14示出了如沿着流通池的一个泳道的长度从入口(1)到出口(10)测量的目标小珠数量和小珠数/mm2。图14还示出了顶部表面和底部表面数据的线性拟合。这些结果表明，当根据本文所公开的方法的示例引入复合物时，沿流动通道的顶部表面和底部表面的长度的固定是相对一致的。
实施例5
制备平均直径为3μm的类似于图1A所示那些复合物的复合物。复合物的固体支持物为来自ThermoFisher Scientific的DYNABEADSTMM-280链霉抗生物素蛋白小珠。固体支持物各自的密度为约1.18g/cm3。特定小珠上的片段来自相同的长DNA分子(来自PhiX基因组)。将文库片段通过脱硫生物素寡核苷酸附接到固体支持物，该脱硫生物素寡核苷酸具有比生物素对小珠表面上的链霉抗生物素蛋白更弱的亲和力。
在该示例中，用捕获位点(即，炔烃-PEG-生物素接头)制备八个流通池泳道(具有涂覆有凝胶材料的相对表面)。使用点击化学将这些接头共价附接到流通池泳道中的凝胶材料上的游离叠氮化物。洗涤流通池泳道并将其分别暴露于浓度为约5μM的炔烃-PEG-生物素溶液。使溶液在约60℃下温育约30分钟。然后再次洗涤流通池泳道。
首先将复合物分成两种流体，第一流体的密度为约1g/cm3，并且第二流体的密度为约2g/cm3。第一流体为柠檬酸钠缓冲液，并且包含浓度为10μg/50μL的复合物。第二流体为2g/ml的多钨酸钠溶液，并且包含浓度为12.5μg/50μL的复合物。
将第一流体引入八个流通池泳道中，并且允许复合物固定到底部表面。抽吸速率为100μL/min，并且第一流体在每个泳道中停留240秒。然后用洗涤溶液洗涤流通池泳道。将第二流体引入所述八个流通池泳道中的每个流通池泳道中，并且允许复合物固定到顶部表面。抽吸速率在80μL/ms至100μL/ms的范围内，并且第二流体在流通池中停留300秒。然后用洗涤溶液洗涤流通池泳道。
对每个流通池泳道的底部表面和顶部表面进行成像，并对每个表面上的固定的复合物(小珠)进行计数。
引入柠檬酸钠缓冲液中的游离生物素，并且将流通池加热至约80℃以从相应复合物中释放文库。使用桥扩增进行成簇。然后对流通池进行测序。收集的测序数据包括通过过滤(％PF)(百分比)。通过过滤(PF)是用于描述通过纯度阈值并用于对测序数据进行进一步处理和分析的簇的度量。较高的通过过滤％结果表明用于测序数据的独特簇的增加的产率。
表2提供了每个流通池泳道的平均小珠数/mm2，以及每个泳道的PF数据。
表2
| 泳道ID | 总的顶部表面+底部表面(复合物数/mm<sup>2</sup>) | ％PF |
| 1 | 6728 | 58.16±6.4 |
| 2 | 5335 | 64.62±4.74 |
| 3 | 6971 | 65.97±4.18 |
| 4 | 6805 | 66.48±3.59 |
| 5 | 6820 | 65.23±5.29 |
| 6 | 7072 | 65.64±6.76 |
| 7 | 7302 | 71.25±4.33 |
| 8 | 10334 | 66.83±6.85 |
泳道1-7的每个表面的目标复合物(小珠)数量为4,000个小珠/mm2(总共8,000个小珠/mm2)。泳道8的每个表面的目标复合物(小珠)数量为5,500个小珠/mm2(总共11,000个小珠/mm2)。虽然泳道1-8略低于目标，但这些泳道的顶部表面和底部表面上的总复合物数量相对一致。通过过滤数据表明大部分纳米孔被单克隆簇占据。
附加说明
此外，应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同它们被明确列举一样。例如，由约2mm至约300mm表示的范围应当解释为不仅包括明确列举的限值约2mm至约300mm，而且还包括单个值诸如约15mm、22.5mm、245mm等，以及子范围诸如约20mm至约225mm等。
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。
虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。
Claims (44)
1.一种方法，包括：
将靶材料固定在流通池的两个相对的测序表面中的每个测序表面处，其中所述固定涉及：
将其中包含所述靶材料的第一部分的第一流体引入所述流通池中，由此所述靶材料中的至少一些靶材料被所述两个相对的测序表面中的一个测序表面上的捕获位点固定；
从所述流通池中移除所述第一流体和任何未固定的靶材料；以及
将其中包含所述靶材料的第二部分的第二流体引入所述流通池中，由此所述靶材料中的至少一些靶材料被所述两个相对的测序表面中的另一个测序表面上的捕获位点固定；
其中二者择一：
所述第一流体的密度小于所述靶材料的密度，并且所述第二流体的密度大于所述靶材料的所述密度；或者
所述第二流体的密度小于所述靶材料的密度，并且所述第一流体的密度大于所述靶材料的所述密度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述密度小于所述靶材料的所述密度的所述第一流体或所述第二流体为含水缓冲溶液，并且其中所述密度大于所述靶材料的所述密度的所述第二流体或所述第一流体为多钨酸钠溶液或氯化钠溶液。
3.根据权利要求1或2中的一项所述的方法，其中所述第一流体或所述第二流体在捕获温度下的所述密度比所述靶材料在所述捕获温度下的所述密度低至少0.1g/cm3，并且其中所述第二流体或所述第一流体在所述捕获温度下的所述密度比所述靶材料在所述捕获温度下的所述密度高至少0.1g/cm3。
4.根据权利要求1或2中的一项所述的方法，其中在捕获温度下小于所述靶材料的所述密度的所述第一流体或所述第二流体的所述密度为约1g/cm3，并且其中在所述捕获温度下大于所述靶材料的所述密度的所述第二流体或所述第一流体的所述密度为约2g/cm3。
5.根据权利要求1至4中的一项所述的方法，所述方法还包括在从所述流通池中移除所述第一流体和任何未固定的靶材料之前允许经过预先确定的时间。
6.根据权利要求1至5中的一项所述的方法，其中当引入所述第二流体时，固定在所述两个相对的测序表面中的所述一个测序表面上的所述靶材料保持固定在所述两个相对的测序表面中的所述一个测序表面上。
7.根据权利要求1至6中的一项所述的方法，其中所述靶材料为复合物，所述复合物包括：
固体支持物；和
附接到所述固体支持物的测序就绪核酸片段。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括：
从所述流通池中移除所述第二液体和未固定的复合物；
引发所述测序就绪核酸片段从固定的复合物的所述固体支持物的释放，从而将至少一些所述测序就绪核酸片段接种到所述两个相对的测序表面的相应引物；
移除所述固体支持物和未接种的测序就绪核酸片段；
将含有液体形式的温度响应材料的扩增混合物引入所述流通池中；
使所述液体形式的所述温度响应材料胶凝；
引发所述已接种的测序就绪核酸片段的扩增以生成模板链，由此所述凝胶形式的所述温度响应材料减少所述模板链的扩散；
使所述凝胶形式的所述温度响应材料液化；以及
从所述流通池中移除所述液体形式的所述温度响应材料。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述温度响应材料为聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚乙二醇的共聚物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶材料为成簇固体支持物，所述成簇固体支持物包括：
固体支持物；和
模板链的簇，所述模板链的簇附接到所述固体支持物。
11.一种试剂盒，包括：
其中包含靶材料的制备流体；
第一引入流体，所述第一引入流体的密度小于所述靶材料的密度；和
第二引入流体，所述第二引入流体的密度大于所述靶材料的所述密度。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述第一引入流体为含水缓冲溶液，并且其中所述第二引入流体为多钨酸钠溶液或氯化钠溶液。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述第二引入流体为所述多钨酸钠溶液，并且所述多钨酸钠溶液的浓度为每1毫升水约1克多钨酸钠。
14.根据权利要求11至13中的一项所述的试剂盒，其中所述第一引入流体在捕获温度下的所述密度比所述靶材料在所述捕获温度下的所述密度低至少0.1g/cm3，并且其中所述第二引入流体在所述捕获温度下的所述密度比所述靶材料在所述捕获温度下的所述密度高至少0.1g/cm3。
15.根据权利要求11或14中的一项所述的试剂盒，其中所述第一引入流体在捕获温度下的所述密度为约1g/cm3，并且其中所述第二引入流体在所述捕获温度下的所述密度为约2g/cm3。
16.根据权利要求11至15中的一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括具有两个相对的测序表面的流通池。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述相对的测序表面中的每个测序表面包括：
聚合物水凝胶；
附接到所述聚合物水凝胶的扩增引物；和
化学捕获位点。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中：
所述化学捕获位点是结合对的一个成员；并且
所述靶材料是涂覆有所述结合对的另一个成员的固体支持物。
19.根据权利要求11至18中的一项所述的试剂盒，其中所述靶材料为复合物，所述复合物包括：
固体支持物；和
附接到所述固体支持物的测序就绪核酸片段。
20.根据权利要求11至18中的一项所述的试剂盒，其中所述靶材料为成簇固体支持物，所述成簇固体支持物包括：
固体支持物；和
模板链的簇，所述模板链的簇附接到所述固体支持物。
21.根据权利要求11至19中的一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括含有液体形式的温度响应材料的扩增混合物。
22.一种方法，包括：
通过以下方式将靶材料固定在流通池的两个相对的测序表面中的每个测序表面处：
将包含所述靶材料的流体引入所述流通池中，其中：
所述靶材料包括：
磁性固体支持物；和
附接到所述磁性固体支持物的测序就绪核酸片段或模板链；并且
所述流体的密度至少大致等于所述磁性固体支持物的密度；
允许所述靶材料中的一些靶材料被所述两个相对的测序表面中的一个测序表面上的捕获位点固定；以及
向所述两个相对的测序表面中的另一个测序表面施加磁力，从而将所述靶材料中的另一些靶材料拉到所述两个相对的测序表面中的所述另一个测序表面，在那里它们被所述两个相对的测序表面中的所述另一个测序表面上的捕获位点固定。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述流体的所述密度在所述磁性固体支持物的所述密度的0.08g/cm3内。
24.根据权利要求22或23中的一项所述的方法，其中所述流体是含水缓冲溶液。
25.根据权利要求22至24中的一项所述的方法，其中在所述流体的所述引入和所述磁力的所述施加之间经过预先确定的时间段，并且其中所述预先确定的时间在约5秒至约2分钟的范围内。
26.根据权利要求20至23中的一项所述的方法，其中所述磁力的所述施加涉及将嵌入有磁性颗粒的弹性体条放置在所述流通池的外表面上，所述外表面与所述两个相对的测序表面中的所述另一个测序表面相邻。
27.根据权利要求20至24中的一项所述的方法，所述方法还包括：
停止所述磁力的所述施加；
从所述流通池中移除所述流体和未固定的复合物；
引发所述测序就绪核酸片段从所述固定的复合物的所述固体支持物的释放，从而将至少一些所述测序就绪核酸片段接种到所述两个相对的测序表面的相应引物；
移除所述固体支持物和未接种的测序就绪核酸片段；
将含有液体形式的温度响应材料的扩增混合物引入所述流通池中；
使所述液体形式的所述温度响应材料胶凝；
引发所述已接种的测序就绪核酸片段的扩增以生成模板链，由此所述凝胶形式的所述温度响应材料减少所述模板链的扩散；
使所述凝胶形式的所述温度响应材料液化；以及
从所述流通池中移除所述液体形式的所述温度响应材料。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述温度响应材料为聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚乙二醇的共聚物。
29.一种方法，包括：
将测序就绪核酸片段引入流通池，从而将所述测序就绪核酸片段中的至少一些测序就绪核酸片段接种到所述流通池的测序表面上的相应引物；
从所述流通池中移除未接种的测序就绪核酸片段；
将含有液体形式的温度响应材料的扩增混合物引入所述流通池中；
使所述液体形式的所述温度响应材料胶凝；
引发所述已接种的测序就绪核酸片段的扩增以生成模板链，由此所述凝胶形式的所述温度响应材料减少所述模板链的扩散；
使所述凝胶形式的所述温度响应材料液化；以及
从所述流通池中移除所述液体形式的所述温度响应材料。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述温度响应材料为聚(N-异丙基丙烯酰胺)和聚乙二醇的共聚物。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中当将所述测序就绪核酸片段引入所述流通池中时，所述测序就绪核酸片段附接到固体支持物，并且其中所述方法还包括从所述固体支持物释放所述测序就绪核酸片段。
32.一种方法，包括：
通过以下方式同时将第一靶材料固定在流通池的两个相对的测序表面中的第一测序表面处和将第二靶材料固定在所述两个相对的测序表面中的第二测序表面处：将包含所述第一靶材料和所述第二靶材料的靶流体引入所述流通池中，其中：
所述靶流体的载流体具有流体密度；
所述第一靶材料的第一密度小于所述流体密度；并且
所述第二靶材料的第二密度大于所述流体密度。
33.根据权利要求32所述的方法，其中：
所述第一靶材料中的至少一些第一靶材料被所述两个相对的测序表面中的所述第一测序表面上的相应捕获位点固定；并且
所述第二靶材料中的至少一些第二靶材料被所述两个相对的测序表面中的所述第二测序表面上的相应捕获位点固定。
34.一种靶流体，包含：
具有流体密度的载流体；
第一靶材料，所述第一靶材料的第一密度小于所述流体密度；和
第二靶材料，所述第二靶材料的第二密度大于所述流体密度。
35.根据权利要求34所述的靶流体，其中：
所述第一靶材料包括：
第一固体支持物，所述第一固体支持物的第一固体支持物密度大致等于所述第一密度；和
附接到所述第一固体支持物的测序就绪核酸片段；并且
所述第二靶材料包括：
第二固体支持物，所述第二固体支持物的第二固体支持物密度大致等于所述第二密度；和
附接到所述第二固体支持物的测序就绪核酸片段。
36.根据权利要求34所述的靶流体，其中：
所述第一靶材料包括：
第一固体支持物，所述第一固体支持物的第一固体支持物密度大致等于所述第一密度；和
模板链的第一簇，所述模板链的第一簇附接到所述第一固体支持物；并且
所述第二靶材料包括：
第二固体支持物，所述第二固体支持物的第二固体支持物密度大致等于所述第二密度；和
模板链的第二簇，所述模板链的第二簇附接到所述第二固体支持物。
37.一种方法，包括：
将第一靶材料和第二靶材料引入包括两个相对的测序表面的流通池，其中所述第一靶材料具有不同于所述第二靶材料的至少一种特性，其中所述至少一种特性选自密度、电荷、磁性以及它们的组合；以及
使所述第一靶材料和所述第二靶材料暴露于至少一种条件，从而使所述第一靶材料被所述两个相对的测序表面中的第一测序表面上的捕获位点固定，并且所述第二靶材料被所述两个相对的测序表面中的第二测序表面上的捕获位点固定。
38.根据权利要求37所述的方法，其中：
所述第一靶材料具有负电荷；
所述第二靶材料具有正电荷；并且
所述至少一个条件是施加在所述两个相对的测序表面之间的电场，以在所述两个相对的测序表面中的所述第一测序表面处生成正电荷并在所述两个相对的测序表面中的所述第二测序表面处生成负电荷。
39.根据权利要求38所述的方法，其中：
所述第一靶材料选自羧化固体支持物、涂覆有聚谷氨酸的固体支持物和硫酸盐官能化的固体支持物；并且
所述第二靶材料为胺官能化的固体支持物。
40.根据权利要求37所述的方法，其中：
将所述第一靶材料和所述第二靶材料在具有第一密度的流体中引入所述流通池中；
所述第一靶材料是磁性的；
所述第二靶材料是非磁性的并且具有大于所述第一密度的密度；并且
所述至少一个条件是被施加以将所述第一靶材料吸引到所述两个相对的测序表面中的所述第一测序表面的磁场。
41.根据权利要求37所述的方法，其中：
将所述第一靶材料和所述第二靶材料在具有第一密度的流体中引入所述流通池中；
所述第一靶材料是非磁性的并且具有小于所述第一密度的密度；
所述第二靶材料是磁性的；并且
所述至少一个条件是被施加以将所述第二靶材料吸引到所述两个相对的测序表面中的所述第二测序表面的磁场。
42.根据权利要求37所述的方法，其中：
将所述第一靶材料和所述第二靶材料在具有第一密度的流体中引入所述流通池中；
所述第一靶材料带负电；
所述第二靶材料不带电并且具有大于所述第一密度的密度；并且
所述至少一个条件是施加在所述两个相对的测序表面之间的电场，以在所述两个相对的测序表面中的所述第一测序表面处生成正电荷并在所述两个相对的测序表面中的所述第二测序表面处生成负电荷。
43.根据权利要求37所述的方法，其中：
将所述第一靶材料和所述第二靶材料在具有第一密度的流体中引入所述流通池中；
所述第一靶材料带正电；
所述第二靶材料不带电并且具有大于所述第一密度的密度；并且
所述至少一个条件是施加在所述两个相对的测序表面之间的电场，以在所述两个相对的测序表面中的所述第一测序表面处生成负电荷并在所述两个相对的测序表面中的所述第二测序表面处生成正电荷。
44.根据权利要求37所述的方法，其中：
将所述第一靶材料和所述第二靶材料在具有第一密度的流体中引入所述流通池中；
所述第一靶材料不带电并且具有小于所述第一密度的密度；
所述第二靶材料带正电；并且
所述至少一个条件是施加在所述两个相对的测序表面之间的电场，以在所述两个相对的测序表面中的所述第一测序表面处生成正电荷并在所述两个相对的测序表面中的所述第二测序表面处生成负电荷。
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