JP6578605B2 - 核酸の検出方法、捕捉プローブ、検出プローブセット、マイクロアレイ、核酸検出キット、核酸固定化固相、及び流体デバイス - Google Patents
核酸の検出方法、捕捉プローブ、検出プローブセット、マイクロアレイ、核酸検出キット、核酸固定化固相、及び流体デバイス Download PDFInfo
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Description
本発明は、核酸の検出方法、捕捉プローブ、検出プローブセット、マイクロアレイ、核酸検出キット、核酸固定化固相、及び流体デバイスに関する。
本願は、２０１４年７月１８日に、日本に出願された特願２０１４−１４７７２６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１４年７月１８日に、日本に出願された特願２０１４−１４７７２６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
従来、細胞内の遺伝子発現量を測定する手段としてｍＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイが広く用いられている。２１世紀に入って、短鎖の非コードＲＮＡであるｍｉＲＮＡが、生体内の遺伝子発現の制御をしていることが報告され、ｍｉＲＮＡの異常発現とがんを初めとした様々な疾患との関係が明らかになりつつある。このような知見に基づき、ｍｉＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイの開発競争が繰り広げられている。
更に、ｍｉＲＮＡが血液中を循環していることが発見されたことにより、血液検査するだけでがんの診断ができる可能性が示され、ｍｉＲＮＡをターゲットとしたＤＮＡマイクロアレイ市場が近い将来急拡大するものと見込まれている。
一方、ｃＤＮＡへの逆転写反応を利用した定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）法もｍｉＲＮＡを定量する技術として広く実用化されている。定量ＰＣＲ法は、逆転写酵素を用いてｍｉＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、該ｃＤＮＡを増幅することにより、鋳型となったｍｉＲＮＡ量を見積もる方法である。定量ＰＣＲ法は、ＰＣＲ反応を用いて一定量まで増幅したｃＤＮＡ量を測定する方法であるため、ＤＮＡマイクロアレイに比べて定量性が高い一方で、複数のサンプルや多種のｍｉＲＮＡに対する並列処理が難しいという問題点がある。
ｍｉＲＮＡをターゲットとした既存のＤＮＡマイクロアレイ（以下、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイという。）は、目的となるｍｉＲＮＡに相補的にハイブリダイズする遺伝子配列を持つ核酸プローブを基板上に並べたものである。
ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイを用いたｍｉＲＮＡの定量方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。先ず、生体サンプルからｍｉＲＮＡを抽出し、該ｍｉＲＮＡを蛍光標識した後に、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに添加し、基板上の核酸プローブにハイブリダイズさせる。次いで、基板に非特異的に吸着したｍｉＲＮＡを洗浄した後、蛍光強度を指標にｍｉＲＮＡ量を見積もる。
生体サンプルからｍｉＲＮＡを調製する際には、生体サンプルから全ＲＮＡを抽出・精製し、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを蛍光標識した後に、蛍光標識ｍｉＲＮＡを含む蛍光標識全ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに接触させる。
ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイを用いたｍｉＲＮＡの定量方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。先ず、生体サンプルからｍｉＲＮＡを抽出し、該ｍｉＲＮＡを蛍光標識した後に、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに添加し、基板上の核酸プローブにハイブリダイズさせる。次いで、基板に非特異的に吸着したｍｉＲＮＡを洗浄した後、蛍光強度を指標にｍｉＲＮＡ量を見積もる。
生体サンプルからｍｉＲＮＡを調製する際には、生体サンプルから全ＲＮＡを抽出・精製し、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを蛍光標識した後に、蛍光標識ｍｉＲＮＡを含む蛍光標識全ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ標的ＤＮＡマイクロアレイに接触させる。
しかし、生体内、特に血液中のｍｉＲＮＡ量は、全ＲＮＡ中、０．０１質量％と極めて少ないため、このような前処理の過程が複雑な場合、ｍｉＲＮＡは、ピペット操作の途中で吸着や分解の影響を受けやすい。さらに、測定ごとの蛍光標識率の変動が測定結果の再現性を低くしてしまうという問題点も持ち合わせている。
また、このような手作業による前処理は、研究者や臨床検査技師の技術差によって影響を受けるため、将来的にはμ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用いて、全ての前処理工程をチップ上で行えるように全自動化されることが望まれている。ここで、μ−ＴＡＳとは、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を用いて、チップ上に微小な流路や反応室、混合室を設け、一つのチップ上で核酸を分析するマイクロ流体デバイスを意味する。
しかしながら、以下のように蛍光標識法がボトルネックとなり、前処理工程の全自動化への組み込みが進んでいない。
しかしながら、以下のように蛍光標識法がボトルネックとなり、前処理工程の全自動化への組み込みが進んでいない。
ｍｉＲＮＡの主な蛍光標識法として、ｍｉＲＮＡの塩基部分に直接蛍光標識する方法や、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどの酵素を用いてｍｉＲＮＡの３’末端に蛍光標識したヌクレオチドを付加する方法が挙げられる。
しかし、これらの方法では全ての核酸が非特異的に蛍光標識されるため、基板上の核酸プローブにハイブリダイゼーションさせる前に、予め蛍光標識された標的ｍｉＲＮＡから未反応の蛍光試薬等を取り除く必要がある。これらの分離にはゲルろ過クロマトグラフィーを用いるのが一般的であり、約２２塩基と短いｍｉＲＮＡを、未反応の蛍光試薬から精度良く分離する必要がある。例えば、μ−ＴＡＳを用いて分離する場合には、生体サンプルを、樹脂の詰まった領域を長距離移動させる工程が必要であり、スペースの限られたチップ内でかかる工程を行うのは極めて難しい。また、例え可能であっても、連続して実験を繰り返すためには、未反応の蛍光試薬を洗い流すために長時間の洗浄が必要となる場合がある。
しかし、これらの方法では全ての核酸が非特異的に蛍光標識されるため、基板上の核酸プローブにハイブリダイゼーションさせる前に、予め蛍光標識された標的ｍｉＲＮＡから未反応の蛍光試薬等を取り除く必要がある。これらの分離にはゲルろ過クロマトグラフィーを用いるのが一般的であり、約２２塩基と短いｍｉＲＮＡを、未反応の蛍光試薬から精度良く分離する必要がある。例えば、μ−ＴＡＳを用いて分離する場合には、生体サンプルを、樹脂の詰まった領域を長距離移動させる工程が必要であり、スペースの限られたチップ内でかかる工程を行うのは極めて難しい。また、例え可能であっても、連続して実験を繰り返すためには、未反応の蛍光試薬を洗い流すために長時間の洗浄が必要となる場合がある。
上記の問題点に対し、未反応の蛍光色素の分離過程を省いてｍｉＲＮＡを検出できるサンドイッチ型マイクロアレイ法が考案されている（特許文献１参照。）。
しかしながら、例えば、特許文献１に記載の方法では、ｍｉＲＮＡと４種類のプローブが全て衝突して５種類の分子が複合体を形成した場合のみシグナルが検出されるため、定量性が悪くなるという問題を抱えており、操作も煩雑で時間を要する。
本発明の一実施態様は、下記（１）〜（４）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸の検出方法は、
（ａ）標識物質により標識されている検出プローブと、核酸と、を含む溶液を、
前記核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有する捕捉プローブが固定された固相に接触させる工程、
（ｂ）前記第１の部分に前記核酸をハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記固相上に核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記核酸がハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記核酸と前記検出プローブとをライゲーションさせる工程、
（ｄ）前記核酸とライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程、及び
（ｆ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該核酸を鋳型にした核酸合成を行う工程
を含む核酸の検出方法であって、
前記核酸合成の産物の検出は、前記工程（ｆ）の後、又は前記工程（ｆ）と同時に行い、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されていることを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における核酸の検出方法は、
（ａ’）核酸を含む溶液を、
前記核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記第２の部分に標識物質により標識されている前記検出プローブが予めハイブリダイズされた捕捉プローブが固定された固相に、接触させる工程、
（ｂ’）前記第１の部分に前記核酸をハイブリダイズさせ、前記固相上に核酸―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記核酸がハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記核酸と前記検出プローブとをライゲーションさせる工程、
（ｄ）前記核酸とライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程、及び
（ｆ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該核酸を鋳型にした核酸合成を行う工程
を含む核酸の検出方法であって、
前記核酸合成の産物の検出を、前記工程（ｆ）の後、又は前記工程（ｆ）と同時に行い、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されていることを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様における核酸検出キットは、
捕捉プローブ及び検出プローブを備え、
前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、
前記検出プローブは、標識物質により標識され、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されていることを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における流体デバイスは、
捕捉プローブが固定化されてなる固相を有する核酸検出部を備え、
前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されていることを特徴とする。
（１）本発明の一実施態様における核酸の検出方法は、
（ａ）標識物質により標識されている検出プローブと、核酸と、を含む溶液を、
前記核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有する捕捉プローブが固定された固相に接触させる工程、
（ｂ）前記第１の部分に前記核酸をハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記固相上に核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記核酸がハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記核酸と前記検出プローブとをライゲーションさせる工程、
（ｄ）前記核酸とライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程、及び
（ｆ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該核酸を鋳型にした核酸合成を行う工程
を含む核酸の検出方法であって、
前記核酸合成の産物の検出は、前記工程（ｆ）の後、又は前記工程（ｆ）と同時に行い、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されていることを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における核酸の検出方法は、
（ａ’）核酸を含む溶液を、
前記核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記第２の部分に標識物質により標識されている前記検出プローブが予めハイブリダイズされた捕捉プローブが固定された固相に、接触させる工程、
（ｂ’）前記第１の部分に前記核酸をハイブリダイズさせ、前記固相上に核酸―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記核酸がハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記核酸と前記検出プローブとをライゲーションさせる工程、
（ｄ）前記核酸とライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程、及び
（ｆ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該核酸を鋳型にした核酸合成を行う工程
を含む核酸の検出方法であって、
前記核酸合成の産物の検出を、前記工程（ｆ）の後、又は前記工程（ｆ）と同時に行い、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されていることを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様における核酸検出キットは、
捕捉プローブ及び検出プローブを備え、
前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、
前記検出プローブは、標識物質により標識され、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されていることを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における流体デバイスは、
捕捉プローブが固定化されてなる固相を有する核酸検出部を備え、
前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されていることを特徴とする。
≪核酸の検出方法≫
検出対象の核酸としては、特に限定されないが、一例としてｍｉＲＮＡや転写が途中で止まった短鎖ｍＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡ、核酸アプタマーなどである。例えば、検出対象の核酸は、生体内に多種類存在し、遺伝子発現の制御に関与しているｍｉＲＮＡである。
検出対象の核酸としては、特に限定されないが、一例としてｍｉＲＮＡや転写が途中で止まった短鎖ｍＲＮＡ等の短鎖ＲＮＡ、核酸アプタマーなどである。例えば、検出対象の核酸は、生体内に多種類存在し、遺伝子発現の制御に関与しているｍｉＲＮＡである。
例えば、捕捉プローブが固定された固相としては、基板や担体を好ましいものとして例示できる。固相担体としては、例えば、磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等が挙げられる。固相基板としては、たとえば、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。
［第一実施形態］
本実施形態の核酸の検出方法は、以下の工程を有する。
（ａ）標識物質により標識されている検出プローブと、ｍｉＲＮＡと、を含む溶液を、
前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、ループ構造を有し二本鎖を形成するステム部と、を有する捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程、
（ｂ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせ、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとをライゲーションさせる工程、（ｄ）前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程
本実施形態の核酸の検出方法は、以下の工程を有する。
（ａ）標識物質により標識されている検出プローブと、ｍｉＲＮＡと、を含む溶液を、
前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、ループ構造を有し二本鎖を形成するステム部と、を有する捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程、
（ｂ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせ、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとをライゲーションさせる工程、（ｄ）前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程
以下、図１を参照しながら、本実施形態における各工程について説明する。
工程（ａ）は、標識物質により標識されている検出プローブと、ｍｉＲＮＡと、を含む溶液を、前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、ループ構造を有し二本鎖を形成するステム部（以下ステムループ構造ともいう。）と、を有する捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程である。
図１は、本実施形態における核酸の検出方法の一態様の模式図である。図１に示すように、捕捉プローブ４は、第１の部分１、第２の部分２、ループ構造３ｂを有し二本鎖を形成するステム部３ａ，３ａ’及びスペーサー４ａから構成される。第１の部分は、ｍｉＲＮＡ６とハイブリダイズし得る配列からなる。第２の部分は、検出プローブ５とハイブリダイズし得る配列からなる。
図１は、本実施形態における核酸の検出方法の一態様の模式図である。図１に示すように、捕捉プローブ４は、第１の部分１、第２の部分２、ループ構造３ｂを有し二本鎖を形成するステム部３ａ，３ａ’及びスペーサー４ａから構成される。第１の部分は、ｍｉＲＮＡ６とハイブリダイズし得る配列からなる。第２の部分は、検出プローブ５とハイブリダイズし得る配列からなる。
ｍｉＲＮＡ６を高精度に検出する観点から、捕捉プローブ４の第２の部分は、ｍｉＲＮＡ６とハイブリダイズしないよう、ｍｉＲＮＡ６の配列と相補的な配列を含まないことが好ましい。同様に、捕捉プローブ４の第２の部分は、捕捉プローブ４自身の第１の部分１とハイブリダイズしないよう、第１の部分１の配列と相補的な配列を含まないことが好ましい。
第１の部分１の長さ（例、塩基数）は、ｍｉＲＮＡ６が捕捉プローブ４の第１の部分１にハイブリダイズし得ることを考慮し、ｍｉＲＮＡ６の長さと同じ長さ（例、同じ塩基数）を設定すればよい。
第２の部分２の長さ（例、塩基数）は、特に限定されず、（１）Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの至適温度（３７℃）付近で検出プローブ５が第２の部分２ハイブリダイズ可能であること、（２）配列特異性を有すること、が好ましいとの観点から１０〜３０塩基程度とすればよい。上記２点は、第２の部分２のＧＣ含有量などによって影響される。第２の部分２の長さを５〜１０塩基程度とした場合には、スタッキング効果による核酸の２本鎖構造の安定化作用がより顕著に発揮されるため、該作用を主に利用して、検出プローブ５を第２の部分２へとハイブリダイズさせることとなると考えられる。しかし、配列特異性を高め、より短時間でより精度よく検出プローブ５をハイブリダイズさせるとの観点からは、第２の部分２の長さは、１０〜３０塩基が好ましく、１８〜２５塩基がより好ましい。また、例えば、第２の部分２の塩基数は、スタッキング効果が主となる塩基数よりも多い塩基数でもよい。
ステム部３ａ，３ａ’の長さ（例、塩基数）は特に限定されないが、２本鎖を安定的に形成可能な長さを考慮し、目安として、８〜１５塩基程度とすればよい。ステム部３ａ，３ａ’は、ステム部全体が２本鎖の塩基対を形成している必要はないが、本実施形態の場合を例にとると、図１に示すように、ステム部３ａ，３ａ’は第１の部分１と隣接しており、第１の部分１にはｍｉＲＮＡ６をハイブリダイズし得るので、ステム部３ａ，３ａ’のうち少なくとも第１の部分１と隣接する塩基は、塩基対を形成していることが好ましい。
検出プローブ５は、標識物質５ａにより標識されている。検出プローブ５における標識物質５ａの配置は特に制限されないが、後述するｍｉＲＮＡ６―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体を形成する際の立体障害の観点、及び、後述するｍｉＲＮＡ６―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体へとリガーゼが接近することを妨げないとの観点から、標識物質５ａは、ｍｉＲＮＡと隣接する端には結合していないことが好ましく、ｍｉＲＮＡと隣接する端の側とは反対の側に結合していることが好ましく、ｍｉＲＮＡと隣接する端の側とは反対側の末端に結合していることが好ましい。本実施形態では、検出プローブ５において、ｍｉＲＮＡと隣接する端とは反対の端は検出プローブ５の５’末端であり、図１に示すように、標識物質５ａは検出プローブ５の５’末端側に結合している。
標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
全ＲＮＡに含まれる、ｍｉＲＮＡはごく微量しか存在しないため、ｍｉＲＮＡを高効率に標識することは困難である。一方、本実施形態においては、予め標識した検出プローブを用いるため、高感度に、ｍｉＲＮＡを定量することができる。
蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
全ＲＮＡに含まれる、ｍｉＲＮＡはごく微量しか存在しないため、ｍｉＲＮＡを高効率に標識することは困難である。一方、本実施形態においては、予め標識した検出プローブを用いるため、高感度に、ｍｉＲＮＡを定量することができる。
捕捉プローブ４が標識物質により標識されている場合、捕捉プローブ４を標識する標識物質と検出プローブ５を標識する標識物質との組合せは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ） Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）が起こり得ない組合せであっても、ＦＲＥＴが起こり得る組合せでもあってもよい。
標的ｍｉＲＮＡの有する配列や長さによって、ＦＲＥＴ効率が異なるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得ない組合せが好ましい。ＦＲＥＴが起こり得る標識物質の組合せを用いる場合であっても、例えば、検出プローブの基板に近い末端をＦＡＭで標識し、捕捉プローブの基板から最も遠いループ部分をＡｌｅｘａ６４７で標識する等、両者間でＦＲＥＴが起きないように設計することもできる。
一方、検出プローブが捕捉プローブに連結された場合と基板に吸着した場合とを区別することができるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得る組合せが好ましい。
ＦＲＥＴが起こりうる標識物質の組合せとしては、励起波長が４９０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ（登録商標）ｆｌｕｏｒ ４８８、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ等）と励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３）、または、励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素と励起波長が６３０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、Ｃｙ５等）の組み合わせが好ましい。
標的ｍｉＲＮＡの有する配列や長さによって、ＦＲＥＴ効率が異なるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得ない組合せが好ましい。ＦＲＥＴが起こり得る標識物質の組合せを用いる場合であっても、例えば、検出プローブの基板に近い末端をＦＡＭで標識し、捕捉プローブの基板から最も遠いループ部分をＡｌｅｘａ６４７で標識する等、両者間でＦＲＥＴが起きないように設計することもできる。
一方、検出プローブが捕捉プローブに連結された場合と基板に吸着した場合とを区別することができるという観点からは、ＦＲＥＴが起こり得る組合せが好ましい。
ＦＲＥＴが起こりうる標識物質の組合せとしては、励起波長が４９０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ（登録商標）ｆｌｕｏｒ ４８８、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ等）と励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３）、または、励起波長が５４０ｎｍ付近の蛍光色素と励起波長が６３０ｎｍ付近の蛍光色素（例えば、Ｃｙ５等）の組み合わせが好ましい。
基板７に固定された捕捉プローブ４が、ｍｉＲＮＡ６とハイブリダイゼーションするためには、分子的な自由度が必要であることから、捕捉プローブ４は、基板７と結合する３’末端にスペーサー４ａを有していることが好ましい。また、後述するｍｉＲＮＡ６―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体へとリガーゼが接近することが容易となることからも、捕捉プローブ４は、基板７と結合する３’末端にスペーサー４ａを有していることが好ましい。
スペーサー４ａの長さ（例、塩基数）としては、特に限定されないが、３〜５０塩基が好ましく、５〜２５塩基がより好ましい。ただし、スペーサーに用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったＰＥＧ等のリンカーで代替可能である。係る場合には、スペーサー４ａに用いられる塩基数は０塩基でもよい。
前記ｍｉＲＮＡ（核酸）を含有する試料は、特に限定されないが、例えば、本実施形態の核酸の検出方法をがんの診断に用いる場合には、がんの発症が確認されている者、若しくはがんの発症が疑われている者、又はがん治療を受けている患者等の被験者の血液、リンパ液、髄液、***、唾液、尿等のサンプルから核酸を抽出することにより得られるものであることが好ましい。これらのサンプルからの核酸抽出は、トリゾルを用いる等、定法により行うことができるが、短鎖ＲＮＡを抽出する方法を利用することが好ましい。
上述したように、血液中のｍｉＲＮＡ量は、全ＲＮＡ中、０．０１質量％と極めて少ないため、サンプルから抽出された全ＲＮＡから分画により濃縮したｍｉＲＮＡを核酸試料として用いてもよいが、本実施形態においては、検出対象のｍｉＲＮＡ自体を標識物質で標識する必要が無いため、分画操作をしていないものを核酸試料として用いてもよい。
捕捉プローブ４を固定するために用いられる基板７としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。捕捉プローブ４を基板７上に固定する方法としては、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定する方法やガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定する方法が挙げられる。
光リソグラフ技術を利用する場合には、基板７上で捕捉プローブ４を合成してもよい。
スポッティングにより捕捉プローブ４を固定する場合には、捕捉プローブ４に固相結合部位を設け、基板７に固相結合部位認識部位を設けておくことが好ましい。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、捕捉プローブ４をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、スクシミジルエステル基等の官能基で修飾して設けられた固相結合部位と、基板７をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基等を有するシランカップリング剤で表面処理して設けられた固相結合部位認識部位との組み合わせや、金-チオール結合を利用した組合せが挙げられる。
また、スポッティングにより捕捉プローブを固定する他の方法として、シラノール基を有する捕捉プローブを、ガラス基板に吐出し、配列させ、シランカップリング反応により共有結合させる方法も挙げられる。
光リソグラフ技術を利用する場合には、基板７上で捕捉プローブ４を合成してもよい。
スポッティングにより捕捉プローブ４を固定する場合には、捕捉プローブ４に固相結合部位を設け、基板７に固相結合部位認識部位を設けておくことが好ましい。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、捕捉プローブ４をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、スクシミジルエステル基等の官能基で修飾して設けられた固相結合部位と、基板７をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基、マレイミド基等を有するシランカップリング剤で表面処理して設けられた固相結合部位認識部位との組み合わせや、金-チオール結合を利用した組合せが挙げられる。
また、スポッティングにより捕捉プローブを固定する他の方法として、シラノール基を有する捕捉プローブを、ガラス基板に吐出し、配列させ、シランカップリング反応により共有結合させる方法も挙げられる。
検出プローブ５は、核酸とライゲーションされるものであればよい。ライゲーションにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いる場合、検出プローブ５は、ＲＮＡが好ましく、核酸と同様の機能を有するものであれば、２’ ―Ｏ―ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡ、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡとの親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、検出プローブ５は、２’ ―Ｏ―ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡやＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。但し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの性質から、検出プローブ５の３’末端（核酸と隣接する側の末端）はＲＮＡであることが好ましい。
捕捉プローブ４及び検出プローブ５の少なくともいずれか一方が、２’ ―Ｏ―ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡ、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましく、捕捉プローブ４及び検出プローブ５の両方が、２’ ―Ｏ―ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡ、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことがより好ましい。
捕捉プローブ４及び検出プローブ５の少なくともいずれか一方が、２’ ―Ｏ―ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡ、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましく、捕捉プローブ４及び検出プローブ５の両方が、２’ ―Ｏ―ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡ、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことがより好ましい。
工程（ｂ）は、前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程である。
工程（ｂ）において、ｍｉＲＮＡは立体構造を形成しやすいため、９５℃で５分間程度インキュベーションして、ｍｉＲＮＡを熱変性させ、プローブとハイブリダイズしやすい状態にしておくことが好ましい。
ハイブリダイゼーションは、特に限定されるものではなく、各プローブのＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で行うことができるが、高精度にｍｉＲＮＡを定量する観点から、ストリンジェントな条件で行うことが好ましい。
工程（ｂ）において、ｍｉＲＮＡは立体構造を形成しやすいため、９５℃で５分間程度インキュベーションして、ｍｉＲＮＡを熱変性させ、プローブとハイブリダイズしやすい状態にしておくことが好ましい。
ハイブリダイゼーションは、特に限定されるものではなく、各プローブのＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で行うことができるが、高精度にｍｉＲＮＡを定量する観点から、ストリンジェントな条件で行うことが好ましい。
尚、本発明及び本願明細書において「ハイブリダイズし得る」とは、本発明に用いられる標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）あるいは検出プローブの少なくとも一部が捕捉プローブにハイブリダイズし、相補的に複合体を形成することを含む。「ストリンジェントな条件」とは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件が挙げられ、例えば、３０℃程度の温度条件（プローブの配列のＴｍより５℃〜１０℃程高い温度条件）、１Ｍ未満の塩濃度条件が挙げられる。
図１に示すように、捕捉プローブ４は３’側で基板７に固定されており、捕捉プローブ４は、基板７の側から、スペーサー４ａ、第２の部分２、第１の部分１、ステム部３ａ，３ａ’、ループ構造３ｂの順に配置されている。
溶液中に存在する検出プローブ５の数が、ｍｉＲＮＡ６の数よりも多くなるように設定されることは、ハイブリダイゼーションの効率を向上させるために通常行われることであり、この場合、ｍｉＲＮＡ６が捕捉プローブ４の第１の部分１にハイブリダイズするより前に、既に検出プローブ５が捕捉プローブ４の第２の部分２にハイブリダイズしている状態である確率が高まっている。
ここで、本実施形態においては、第１の部分１が、第２の部分２とステム部３ａ，３ａ’との間に位置しているので、検出プローブのｍｉＲＮＡ６はステム部３ａ，３ａ’の二重鎖及び、第２の部分２と検出プローブ５が形成した二重鎖の間に、第１の部分１が露出することとなる。
このように、第１の部分１の両端が二重鎖に接し、第１の部分１が二重鎖によって囲まれることで、二重鎖によって囲まれた第１の部分１の長さよりも長いｍｉＲＮＡが、第１の部分１へ結合するのを防ぐことができる。例えば、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの前駆体）が第１の部分１に結合することを防ぐことができ、成熟ｍｉＲＮＡのみをより正確に検出することができる。また、スタッキング効果により、一層効率的にｍｉＲＮＡ６を第１の部分１にハイブリダイゼーションさせることができる。
ここで、本実施形態においては、第１の部分１が、第２の部分２とステム部３ａ，３ａ’との間に位置しているので、検出プローブのｍｉＲＮＡ６はステム部３ａ，３ａ’の二重鎖及び、第２の部分２と検出プローブ５が形成した二重鎖の間に、第１の部分１が露出することとなる。
このように、第１の部分１の両端が二重鎖に接し、第１の部分１が二重鎖によって囲まれることで、二重鎖によって囲まれた第１の部分１の長さよりも長いｍｉＲＮＡが、第１の部分１へ結合するのを防ぐことができる。例えば、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの前駆体）が第１の部分１に結合することを防ぐことができ、成熟ｍｉＲＮＡのみをより正確に検出することができる。また、スタッキング効果により、一層効率的にｍｉＲＮＡ６を第１の部分１にハイブリダイゼーションさせることができる。
工程（ｃ）は、前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせ、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとをライゲーションさせる工程である。
図１に示すように、捕捉プローブ４の５’末端と、ｍｉＲＮＡ６の３’末端と、をライゲーションさせる。捕捉プローブ４とｍｉＲＮＡ６をライゲーションさせることで、捕捉プローブ４にハイブリダイズしたｍｉＲＮＡ６が捕捉プローブ４から解離することを防ぎ、工程（ｅ）において、ｍｉＲＮＡ６が複数に亘って検出されることを防ぐことができる。
また、図１に示すように、ｍｉＲＮＡ６の５’末端と、検出プローブ５の３’末端と、をライゲーションさせる。検出プローブ５とｍｉＲＮＡ６をライゲーションさせることで、ｍｉＲＮＡ６を介して、検出プローブ５と捕捉プローブ４が結合する。したがって、ｍｉＲＮＡ６が第１の部分１にハイブリダイズしているときのみ、検出プローブ５と捕捉プローブ４を結合させることができる。本実施形態によれば、ｍｉＲＮＡ６が第１の部分１にハイブリダイズしているときに、検出プローブ５と捕捉プローブ４を結合させることができるので、高精度にｍｉＲＮＡを検出できる。
図１に示すように、捕捉プローブ４の５’末端と、ｍｉＲＮＡ６の３’末端と、をライゲーションさせる。捕捉プローブ４とｍｉＲＮＡ６をライゲーションさせることで、捕捉プローブ４にハイブリダイズしたｍｉＲＮＡ６が捕捉プローブ４から解離することを防ぎ、工程（ｅ）において、ｍｉＲＮＡ６が複数に亘って検出されることを防ぐことができる。
また、図１に示すように、ｍｉＲＮＡ６の５’末端と、検出プローブ５の３’末端と、をライゲーションさせる。検出プローブ５とｍｉＲＮＡ６をライゲーションさせることで、ｍｉＲＮＡ６を介して、検出プローブ５と捕捉プローブ４が結合する。したがって、ｍｉＲＮＡ６が第１の部分１にハイブリダイズしているときのみ、検出プローブ５と捕捉プローブ４を結合させることができる。本実施形態によれば、ｍｉＲＮＡ６が第１の部分１にハイブリダイズしているときに、検出プローブ５と捕捉プローブ４を結合させることができるので、高精度にｍｉＲＮＡを検出できる。
ライゲーションに用いる酵素としては、リガーゼが挙げられ、リガーゼとしては、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１等が挙げられる。
工程（ｃ）に際しては、意図しない反応である捕捉プローブ４の５’末端と検出プローブ５の３’末端とのライゲーション反応が生じてしまう可能性がある。このような意図しない捕捉プローブ４と検出プローブ５とのライゲーション反応は、一本鎖の核酸同士のライゲーション活性によるものと考えられる。したがって、当該ライゲーション反応よりも、捕捉プローブ上のｍｉＲＮＡと検出プローブとのライゲーション反応が優先的に行われることが好ましい。この点、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは２本鎖依存的に活性を発揮するので、捕捉プローブ４の５’末端と検出プローブの３’末端とのライゲーションの問題が生じ難い。したがって、ライゲーションに用いる酵素としてはＴ４ ＤＮＡリガーゼが好ましい。図１中では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ８によって、捕捉プローブ４とｍｉＲＮＡ６、及びｍｉＲＮＡ６と検出プローブ５がライゲーションされる様子を示している。
工程（ｃ）に際しては、意図しない反応である捕捉プローブ４の５’末端と検出プローブ５の３’末端とのライゲーション反応が生じてしまう可能性がある。このような意図しない捕捉プローブ４と検出プローブ５とのライゲーション反応は、一本鎖の核酸同士のライゲーション活性によるものと考えられる。したがって、当該ライゲーション反応よりも、捕捉プローブ上のｍｉＲＮＡと検出プローブとのライゲーション反応が優先的に行われることが好ましい。この点、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは２本鎖依存的に活性を発揮するので、捕捉プローブ４の５’末端と検出プローブの３’末端とのライゲーションの問題が生じ難い。したがって、ライゲーションに用いる酵素としてはＴ４ ＤＮＡリガーゼが好ましい。図１中では、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ８によって、捕捉プローブ４とｍｉＲＮＡ６、及びｍｉＲＮＡ６と検出プローブ５がライゲーションされる様子を示している。
工程（ｂ）及び工程（ｃ）は、同時に行われてもよい。即ち、ハイブリダイゼーション及びライゲーションが、同時に行われてもよい。
本実施形態においては、工程（ｃ）におけるライゲーションに際し、予め捕捉プローブ４の５’末端を、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化しておくことが好ましい。生体由来のｍｉＲＮＡは５’末端にリン酸基を有している。
工程（ｄ）は、前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程である。
例えば、本実施形態において工程（ｄ）は、前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされておらず、且つｍｉＲＮＡを介して捕捉プローブと連結していない検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程である。また、例えば、図１に示すように、工程（ｄ）は、基板７に固定された複数の検出プローブ５のうちｍｉＲＮＡ６とライゲーションされていない検出プローブ５と、上記の捕捉プローブ４との間の結合を解消させる工程である。また、例えば、基板７に固定された複数の検出プローブ５におけるｍｉＲＮＡ６にライゲーションした検出プローブ５とｍｉＲＮＡ６にライゲーションされていない検出プローブ５とのうち、ｍｉＲＮＡ６にライゲーションされていない検出プローブ５は、工程（ｄ）において、捕捉プローブ４との間の結合が解消される。
例えば、本実施形態において工程（ｄ）は、前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされておらず、且つｍｉＲＮＡを介して捕捉プローブと連結していない検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程である。また、例えば、図１に示すように、工程（ｄ）は、基板７に固定された複数の検出プローブ５のうちｍｉＲＮＡ６とライゲーションされていない検出プローブ５と、上記の捕捉プローブ４との間の結合を解消させる工程である。また、例えば、基板７に固定された複数の検出プローブ５におけるｍｉＲＮＡ６にライゲーションした検出プローブ５とｍｉＲＮＡ６にライゲーションされていない検出プローブ５とのうち、ｍｉＲＮＡ６にライゲーションされていない検出プローブ５は、工程（ｄ）において、捕捉プローブ４との間の結合が解消される。
検出プローブ５はｍｉＲＮＡ６が第１の部分１にハイブリダイズしていない場合であっても、捕捉プローブ４の第２の部分２にハイブリダイズすること自体は可能である。したがって、本実施形態の核酸の検出方法が、ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと、捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程（ｄ）を有することは、ｍｉＲＮＡ６の存在を高精度に検出することを可能とする。
本実施形態では、ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと、捕捉プローブとの間の結合を解消させる方法として、ｍｉＲＮＡと捕捉プローブ及び検出プローブと捕捉プローブとの間のハイブリダイゼーションを解消可能な条件下に捕捉プローブをおくことを例示する。また、ｍｉＲＮＡと捕捉プローブ及び検出プローブと捕捉プローブとの間の二重鎖を形成させている水素結合を切断可能な条件下に捕捉プローブをおくことを例示する。このとき、前記条件は、核酸の二重鎖を形成させている水素結合を切断可能であり、且つヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合（共有結合）は解消させない条件であることが好ましい。係る条件下としては、核酸を変性する場合に通常適用される条件を広く採用することができる。例えば、検出プローブの配列のＴｍ値より高い温度の液中（検出プローブが再び結合しないように、核酸の変性に続いて基板を洗浄することが好ましい）や、二本鎖の核酸を一本鎖へと変性させることのできる各種試薬溶液中を例示することができる。前記試薬としては、核酸の変性剤として通常用いられるものを広く用いることができ、例えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤、尿素、ホルムアミド、ホルムアルデヒド等を挙げることができる。これらの条件および試薬類は単独で用いてもよいし、複数のものを組み合わせて用いても良い。なかでもＲＮＡを分解させずに変性可能であることから、最終濃度２０〜８０％（ｖ/ｖ）のホルムアミド及び最終濃度０．０５〜１０％（ｗ/ｖ）のＳＤＳの溶液を基板に接触させることを例示できる。
本実施形態では、ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと、捕捉プローブとの間の結合を解消させる方法として、ｍｉＲＮＡと捕捉プローブ及び検出プローブと捕捉プローブとの間のハイブリダイゼーションを解消可能な条件下に捕捉プローブをおくことを例示する。また、ｍｉＲＮＡと捕捉プローブ及び検出プローブと捕捉プローブとの間の二重鎖を形成させている水素結合を切断可能な条件下に捕捉プローブをおくことを例示する。このとき、前記条件は、核酸の二重鎖を形成させている水素結合を切断可能であり、且つヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合（共有結合）は解消させない条件であることが好ましい。係る条件下としては、核酸を変性する場合に通常適用される条件を広く採用することができる。例えば、検出プローブの配列のＴｍ値より高い温度の液中（検出プローブが再び結合しないように、核酸の変性に続いて基板を洗浄することが好ましい）や、二本鎖の核酸を一本鎖へと変性させることのできる各種試薬溶液中を例示することができる。前記試薬としては、核酸の変性剤として通常用いられるものを広く用いることができ、例えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤、尿素、ホルムアミド、ホルムアルデヒド等を挙げることができる。これらの条件および試薬類は単独で用いてもよいし、複数のものを組み合わせて用いても良い。なかでもＲＮＡを分解させずに変性可能であることから、最終濃度２０〜８０％（ｖ/ｖ）のホルムアミド及び最終濃度０．０５〜１０％（ｗ/ｖ）のＳＤＳの溶液を基板に接触させることを例示できる。
図１に示されるように、ｍｉＲＮＡ６とライゲーションされていない検出プローブ５は、捕捉プローブとの間の二重鎖を形成させている水素結合を切断されると、捕捉プローブ４から解離する。対して、ｍｉＲＮＡ６とライゲーションされた検出プローブ５は、捕捉プローブとの間の二重鎖を形成させている水素結合を切断されても、ｍｉＲＮＡ６を介して捕捉プローブ４と連結し、ｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体の状態が維持される。
このように、ｍｉＲＮＡと捕捉プローブ及び検出プローブと捕捉プローブの間のハイブリダイゼーションを解消可能な条件下に、前記捕捉プローブをおくことで、非特異的な結合の除去効率を飛躍的に高めることができる。
第１の部分と完全に相補的でない類似ｍｉＲＮＡが第１の部分に結合した場合、類似ｍｉＲＮＡを検出することを排除するために、例えば工程（ｃ）と工程（ｄ）の間に、類似ｍｉＲＮＡと捕捉プローブとのミスマッチ領域のホスホジエステル結合を分解する工程を行ってもよい。
ｍｉＲＮＡと捕捉プローブとのミスマッチ領域のホスホジエステル結合を分解する方法としては、米国特許第５８９１６２９号明細書「Compositions For Improving Rnase Cleavage Of Base Pair Mismatches In Double-stranded Nucleic Acids」に記載の方法が挙げられ、本明細書の一部としてこれを援用する。例えば、ミスマッチ領域認識能及びミスマッチ領域分解能を有する酵素を用いればよく、酵素としては、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ Ｔ１等の各種ＲＮａｓｅが挙げられる。
ｍｉＲＮＡと捕捉プローブとのミスマッチ領域のホスホジエステル結合を分解する方法としては、米国特許第５８９１６２９号明細書「Compositions For Improving Rnase Cleavage Of Base Pair Mismatches In Double-stranded Nucleic Acids」に記載の方法が挙げられ、本明細書の一部としてこれを援用する。例えば、ミスマッチ領域認識能及びミスマッチ領域分解能を有する酵素を用いればよく、酵素としては、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｉ、ＲＮａｓｅ Ｔ１等の各種ＲＮａｓｅが挙げられる。
工程（ｄ）において捕捉プローブ４との間の結合が解消された検出プローブ５、及び基板等に非特異的にハイブリダイズした検出プローブ５を除去するために、工程（ｄ）の後又は工程（ｄ）と同時に、基板７を洗浄する工程を設けることが好ましい。洗浄としては、例えば、基板７を上記変性剤中で振とうさせて数回洗浄する方法が挙げられる。
工程（ｅ）は、前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程である。ここで、「検出する」とは、定量的に検出すること、定量すること、分析すること等も含まれる。
上記のように、検出プローブ５は標識物質５ａで標識されているため、ｍｉＲＮＡ６―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体中の標識物質５ａを検出することが可能である。
その際、段階希釈した既知量のｍｉＲＮＡを用いて、標準曲線を作製し、該標準曲線を利用することが好ましい。かかる検出結果を用いて核酸試料中のｍｉＲＮＡ６を定量することができる。
工程（ｅ）における、標識物質の検出方法は、特に限定されるものではなく、例えば、核酸マイクロアレイ自動検出装置を用いて複合体の蛍光強度を測定する、電気化学検出器を用いて複合体を検出する等、核酸を検出する場合に通常行われる方法を用いて行うことができる。
上記のように、検出プローブ５は標識物質５ａで標識されているため、ｍｉＲＮＡ６―検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体中の標識物質５ａを検出することが可能である。
その際、段階希釈した既知量のｍｉＲＮＡを用いて、標準曲線を作製し、該標準曲線を利用することが好ましい。かかる検出結果を用いて核酸試料中のｍｉＲＮＡ６を定量することができる。
工程（ｅ）における、標識物質の検出方法は、特に限定されるものではなく、例えば、核酸マイクロアレイ自動検出装置を用いて複合体の蛍光強度を測定する、電気化学検出器を用いて複合体を検出する等、核酸を検出する場合に通常行われる方法を用いて行うことができる。
本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法によれば、高精度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
また、本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法によれば、ステムループ構造を形成する捕捉プローブを用いるため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを認識するおそれがより一層低減されており、高精度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
また、本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法によれば、ステムループ構造を形成する捕捉プローブを用いるため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを認識するおそれがより一層低減されており、高精度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法の更なる利点として、検出対象のｍｉＲＮＡの配列が異なる場合であっても、共通の検出プローブを用いてｍｉＲＮＡが可能であることを強調する。これは、本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法では、検出プローブとｍｉＲＮＡとを直接ハイブリダイズさせないので、ｍｉＲＮＡの配列に左右されずに、自由に検出プローブの配列を設計することができるためである。共通の検出プローブを用いることにより、ｍｉＲＮＡの配列に合わせた検出プローブを用いる場合と比較して、より低価格でｍｉＲＮＡ検出の検出方法を提供できる。
［第二実施形態］
先に記載の［第一実施形態］の核酸の検出方法においては、検出プローブとｍｉＲＮＡとを含む溶液を、捕捉プローブが固定された基板に接触させる。対して、本第二実施形態の核酸の検出方法では、ｍｉＲＮＡを含む溶液を、前記検出プローブが予めハイブリダイズされた捕捉プローブが固定された基板に接触させるものである。また、本実施形態において、ステム部はループ構造を有している。
例えば、本実施形態の核酸の検出方法は、以下の工程を有する。
（ａ’）ｍｉＲＮＡを含む溶液を、
前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、ループ構造を有し二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記第２の部分に標識物質により標識されている前記検出プローブが予めハイブリダイズされた捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程、
（ｂ’）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせ、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとをライゲーションさせる工程、（ｄ）前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程
先に記載の［第一実施形態］の核酸の検出方法においては、検出プローブとｍｉＲＮＡとを含む溶液を、捕捉プローブが固定された基板に接触させる。対して、本第二実施形態の核酸の検出方法では、ｍｉＲＮＡを含む溶液を、前記検出プローブが予めハイブリダイズされた捕捉プローブが固定された基板に接触させるものである。また、本実施形態において、ステム部はループ構造を有している。
例えば、本実施形態の核酸の検出方法は、以下の工程を有する。
（ａ’）ｍｉＲＮＡを含む溶液を、
前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、ループ構造を有し二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記第２の部分に標識物質により標識されている前記検出プローブが予めハイブリダイズされた捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程、
（ｂ’）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせ、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとをライゲーションさせる工程、（ｄ）前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程
以下、図２を参照しながら、本実施形態について説明する。なお、先に記載の［第一実施形態］と共通する点については、説明を省略する。
工程（ａ’）は、ｍｉＲＮＡを含む溶液を、前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、ループ構造を有し二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記第２の部分に標識物質により標識されている前記検出プローブが予めハイブリダイズされた捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程である。
図２は、本実施形態における核酸の検出方法の一態様の模式図である。図２に示すように、捕捉プローブ４は、第１の部分１、第２の部分２、ループ構造３ｂを有し二本鎖を形成するステム部３ａ，３ａ’、スペーサー４ａ及び、前記第２の部分２にハイブリダイズした検出プローブ５から構成される。第１の部分は、ｍｉＲＮＡ６とハイブリダイズし得る配列からなる。
図２は、本実施形態における核酸の検出方法の一態様の模式図である。図２に示すように、捕捉プローブ４は、第１の部分１、第２の部分２、ループ構造３ｂを有し二本鎖を形成するステム部３ａ，３ａ’、スペーサー４ａ及び、前記第２の部分２にハイブリダイズした検出プローブ５から構成される。第１の部分は、ｍｉＲＮＡ６とハイブリダイズし得る配列からなる。
工程（ｂ’）は、前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程である。
図２に示すように、捕捉プローブ４は３’側で基板７に固定されており、捕捉プローブ４は、基板７の側から、スペーサー４ａ、第２の部分２及び検出プローブ５、第１の部分１、ステム部３ａ，３ａ’、ループ構造３ｂの順に配置されている。捕捉プローブ４の第２の部分２には、標識物質５ａにより標識されている検出プローブ５が予めハイブリダイズされているので、検出プローブのｍｉＲＮＡ６はステム部３ａ，３ａ’の二重鎖及び、第２の部分２と検出プローブ５が形成した二重鎖の間に、第１の部分１が露出することとなる。
図２に示すように、捕捉プローブ４は３’側で基板７に固定されており、捕捉プローブ４は、基板７の側から、スペーサー４ａ、第２の部分２及び検出プローブ５、第１の部分１、ステム部３ａ，３ａ’、ループ構造３ｂの順に配置されている。捕捉プローブ４の第２の部分２には、標識物質５ａにより標識されている検出プローブ５が予めハイブリダイズされているので、検出プローブのｍｉＲＮＡ６はステム部３ａ，３ａ’の二重鎖及び、第２の部分２と検出プローブ５が形成した二重鎖の間に、第１の部分１が露出することとなる。
本実施形態のｍｉＲＮＡの検出方法によれば、第１の部分１の両端が二重鎖に接し、第１の部分１が二重鎖によって囲まれることで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡの前駆体）が第１の部分１に結合することを防ぐことができ、ｍｉＲＮＡのみをより正確に検出することができる。また、スタッキング効果により、一層効率的にｍｉＲＮＡ６を第１の部分１にハイブリダイゼーションさせることができる。
また、予め検出プローブがハイブリダイズした捕捉プローブを用いるので、捕捉プローブを基板に接触させるために、捕捉プローブを含む溶液を用意せずともよい。したがって、作業者は、検出対象の核酸のみを用意すればよく、実施者の負担を軽減させることができる。また方法としての利便性を向上させることができる。
ステムループ構造を形成する捕捉プローブを用いるため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを認識するおそれがより一層低減されており、高精度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
また、予め検出プローブがハイブリダイズした捕捉プローブを用いるので、捕捉プローブを基板に接触させるために、捕捉プローブを含む溶液を用意せずともよい。したがって、作業者は、検出対象の核酸のみを用意すればよく、実施者の負担を軽減させることができる。また方法としての利便性を向上させることができる。
ステムループ構造を形成する捕捉プローブを用いるため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを認識するおそれがより一層低減されており、高精度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
［第三実施形態］
先に記載の［第一実施形態］の核酸の検出方法の工程（ｃ）においては、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとのライゲーション及び前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとのライゲーションの２か所のライゲーションを行う。対して、本第三実施形態では、ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとのライゲーションのみを行い、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとの連結は行わない。また、ステム部はループ構造を有していない。
例えば、本実施形態の核酸の検出方法は、以下の工程を有する。
（ａ）標識物質により標識されている検出プローブと、ｍｉＲＮＡと、を含む溶液を、
前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有する捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程、
（ｂ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせる工程、
（ｄ）前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程
先に記載の［第一実施形態］の核酸の検出方法の工程（ｃ）においては、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとのライゲーション及び前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとのライゲーションの２か所のライゲーションを行う。対して、本第三実施形態では、ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとのライゲーションのみを行い、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとの連結は行わない。また、ステム部はループ構造を有していない。
例えば、本実施形態の核酸の検出方法は、以下の工程を有する。
（ａ）標識物質により標識されている検出プローブと、ｍｉＲＮＡと、を含む溶液を、
前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有する捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程、
（ｂ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせる工程、
（ｄ）前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程
以下、図３を参照しながら、本実施形態について説明する。なお、先に記載の［第一実施形態］と共通する点については、説明を省略する。
本実施形態の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）は、図１に示す［第一実施形態］の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）と同様に行えばよい。
工程（ｃ）は、前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせる工程である。
図３は、本実施形態における核酸の検出方法の一態様の模式図である。図３に示すように、ｍｉＲＮＡ６の５’末端と、検出プローブ５の３’末端と、をライゲーションさせる。このとき、捕捉プローブ４の５’末端と、ｍｉＲＮＡ６の３’末端とはライゲーションさせない。
図３は、本実施形態における核酸の検出方法の一態様の模式図である。図３に示すように、ｍｉＲＮＡ６の５’末端と、検出プローブ５の３’末端と、をライゲーションさせる。このとき、捕捉プローブ４の５’末端と、ｍｉＲＮＡ６の３’末端とはライゲーションさせない。
工程（ｄ）は、前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程である。
本実施形態では、係る方法として、検出プローブと捕捉プローブとの間のハイブリダイゼーションは解消するが、検出プローブ−ｍｉＲＮＡ複合体と捕捉プローブとの間のハイブリダイゼーションは解消しない条件下に捕捉プローブをおくことを例示する。
例えば、ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと、捕捉プローブとの間の水素結合は解消させるが、ｍｉＲＮＡとライゲーションされた検出プローブと、捕捉プローブとの間の水素結合は解消させない条件下に捕捉プローブをおくことを例示できる。ｍｉＲＮＡとライゲーションされている検出プローブは、ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと比較して、ｍｉＲＮＡの長さの分ポリヌクレオチドの長さが長い。この配列長の違いにより、検出プローブと捕捉プローブとの間に生じる結合エネルギーよりも、検出プローブ−ｍｉＲＮＡ複合体と捕捉プローブとの間に生じる結合エネルギーの方が高められている。ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと、ｍｉＲＮＡとライゲーションされた検出プローブとを、結合エネルギーの差により区別する方法としては、徐々に溶液の温度を上昇させる等の従来公知の方法を採用すればよい。
本実施形態では、係る方法として、検出プローブと捕捉プローブとの間のハイブリダイゼーションは解消するが、検出プローブ−ｍｉＲＮＡ複合体と捕捉プローブとの間のハイブリダイゼーションは解消しない条件下に捕捉プローブをおくことを例示する。
例えば、ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと、捕捉プローブとの間の水素結合は解消させるが、ｍｉＲＮＡとライゲーションされた検出プローブと、捕捉プローブとの間の水素結合は解消させない条件下に捕捉プローブをおくことを例示できる。ｍｉＲＮＡとライゲーションされている検出プローブは、ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと比較して、ｍｉＲＮＡの長さの分ポリヌクレオチドの長さが長い。この配列長の違いにより、検出プローブと捕捉プローブとの間に生じる結合エネルギーよりも、検出プローブ−ｍｉＲＮＡ複合体と捕捉プローブとの間に生じる結合エネルギーの方が高められている。ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと、ｍｉＲＮＡとライゲーションされた検出プローブとを、結合エネルギーの差により区別する方法としては、徐々に溶液の温度を上昇させる等の従来公知の方法を採用すればよい。
尚、ステム部３ａ，３ａ’の二本鎖状態を解消させないために、ステム部３ａ，３ａ’の二本鎖間を連結させておくことが好ましい。例えば、ステム部３ａ，３ａ’の配列中に、後述する光反応性塩基誘導体を配置し、ステム部３ａ，３ａ’の二本鎖間を架橋しておくことで（不図示）、ステム部３ａ，３ａ’の二本鎖間の解離を防ぐことができる。
このように、捕捉プローブとｍｉＲＮＡ６とをライゲーションさせない場合であっても、ｍｉＲＮＡの存在を検出することが可能である。
［第四実施形態］
先に記載の［第一実施形態］の核酸の検出方法の工程（ｃ）においては、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとのライゲーション及び前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとのライゲーションの２か所のライゲーションを行う。対して、本第四実施形態では、ｍｉＲＮＡと前記検出プローブ間の連結はライゲーションによるものであるが、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとの連結は、光反応性塩基誘導体による核酸同士の架橋により行う。
例えば、本実施形態の核酸の検出方法は、以下の工程を有する。
（ａ）標識物質により標識されている検出プローブと、ｍｉＲＮＡと、を含む溶液を、
前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記第１の部分の配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程、
（ｂ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせ、第１の波長帯域の光によって、前記第一の光反応性塩基誘導体と前記ｍｉＲＮＡとを架橋させる工程、
（ｄ）前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程
先に記載の［第一実施形態］の核酸の検出方法の工程（ｃ）においては、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとのライゲーション及び前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとのライゲーションの２か所のライゲーションを行う。対して、本第四実施形態では、ｍｉＲＮＡと前記検出プローブ間の連結はライゲーションによるものであるが、前記ｍｉＲＮＡと前記捕捉プローブとの連結は、光反応性塩基誘導体による核酸同士の架橋により行う。
例えば、本実施形態の核酸の検出方法は、以下の工程を有する。
（ａ）標識物質により標識されている検出プローブと、ｍｉＲＮＡと、を含む溶液を、
前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記第１の部分の配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程、
（ｂ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記基板上にｍｉＲＮＡ―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせ、第１の波長帯域の光によって、前記第一の光反応性塩基誘導体と前記ｍｉＲＮＡとを架橋させる工程、
（ｄ）前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程
以下、図４を参照しながら、本実施形態について説明する。なお、先に記載の［第一実施形態］と共通する点については、説明を省略する。
工程（ａ）は、標識物質により標識されている検出プローブと、ｍｉＲＮＡと、を含む溶液を、前記ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記第１の部分の配列中に第１の光反応性塩基誘導体を含む捕捉プローブが固定された基板に、接触させる工程である。
図４は、本実施形態における核酸の検出方法の一態様の模式図である。図４に示すように、捕捉プローブ４は、第１の部分１、第２の部分２、二本鎖を形成するステム部３ａ，３ａ’及びスペーサー４ａから構成される。第１の部分は、ｍｉＲＮＡ６とハイブリダイズし得る配列からなる。第２の部分は、検出プローブ５とハイブリダイズし得る配列からなる。第１の部分の配列中には、第１の光反応性塩基誘導体１ａを含む。
図４は、本実施形態における核酸の検出方法の一態様の模式図である。図４に示すように、捕捉プローブ４は、第１の部分１、第２の部分２、二本鎖を形成するステム部３ａ，３ａ’及びスペーサー４ａから構成される。第１の部分は、ｍｉＲＮＡ６とハイブリダイズし得る配列からなる。第２の部分は、検出プローブ５とハイブリダイズし得る配列からなる。第１の部分の配列中には、第１の光反応性塩基誘導体１ａを含む。
光反応性塩基誘導体とは、所定の波長の光が照射されることにより、反応性が活性化され、任意の標的核酸と検出プローブ、及び任意の標的核酸と捕捉プローブとを架橋可能な塩基誘導体を意味する。光反応性塩基誘導体の一例として、ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）を付加した塩基、３−Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ（以下、ＣＮＶＫともいう。）、4-チオチミジン、アデニン反応性基のケージド物 （Kobori ら、Bioorg. Med. Chem., 20：5071-5076 (2012)）、３−ｃａｒｂｏｎｙｌｖｉｎｙｌ ｐｈｅｎｏｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ （ＣＶＰ） (Yoshimuraら、 Nucleic Acids Symp. Ser., 48:81-82 (2004))、ｐ‐ｃａｒｂａｍｏｙｌｖｉｎｙｌ ｐｈｅｎｏｌｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ （ｐ−ＣＶＰ） （Amiら、Org. Biomol. Chem., 5: 2583-2586（2007）））、５‐ｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＣＶＵ） (Ogasawaraら、ChemBioChem, 6：1756-1760 (2005))、ｃａｒｂａｚｏｌｅ‐ｔｅｔｈｅｒｅｄ ５‐ｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌ‐２'‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＹＣＶＵ）(Fujimotoら、Org. Lett., 10: 397-400 (2008))、５-ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌ‐１’‐α‐２’-ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （α‐ＣＵ）, β‐ＣＵ（Oginoら、Angew. Chem. Int. Ed.45：7223-7226（2006））、５‐ｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＶＵ）, ５‐ｈｅｐｔｅｎｙｌ‐２’―ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＨＵ）, ５‐ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＨＶＵ）, ５‐ｔ‐ｂｕｔｙｌｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＢｕＶＵ）（Oginoら、Org. Biomol. Chem., 7：3163-3167 (2009)）、 ＢＴＶＵ， ＰＴＶＵ， ＭＰＴＶＵ， ＮＴＶＵ （Amiら、ChemBioChem 9, 2071-2074 (2008)）、Ｎ３‐ｍｅｔｈｙｌ−５−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌ‐２’‐ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ （ＭＣＶＵ）（Fujimotoら、Chem. Commun., 3177-3179 （2005））、７‐ｄｅａｚａ‐２’‐ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ （ＶＺＡ） (Saitoら、Tetrahedron Lett., 46：97-99 (2005))などが挙げられる。
第１の波長帯域光は、任意のｍiＲＮＡと捕捉プローブとを架橋可能な波長帯域光であれば特に制限されない。
本実施形態の工程（ｂ）は、［第一実施形態］の工程（ｂ）と同様に行えばよい。
工程（ｃ）は、前記第１の部分に前記ｍｉＲＮＡがハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとをライゲーションさせ、第１の波長帯域の光によって、前記第一の光反応性塩基誘導体と前記ｍｉＲＮＡとを架橋させる工程である。
図４に示すように、捕捉プローブ４の５’末端と、ｍｉＲＮＡ６の３’末端と、をライゲーションさせる。また、第１の波長帯域光を基板７に照射し、第１の光反応性塩基誘導体１ａとｍｉＲＮＡ６を架橋させる。図４中１ａはｍｉＲＮＡ６と架橋されていない状態の光反応性塩基誘導体を表し、１ａ’はｍｉＲＮＡ６と架橋された状態の光反応性塩基誘導体を表す。
図４に示すように、捕捉プローブ４の５’末端と、ｍｉＲＮＡ６の３’末端と、をライゲーションさせる。また、第１の波長帯域光を基板７に照射し、第１の光反応性塩基誘導体１ａとｍｉＲＮＡ６を架橋させる。図４中１ａはｍｉＲＮＡ６と架橋されていない状態の光反応性塩基誘導体を表し、１ａ’はｍｉＲＮＡ６と架橋された状態の光反応性塩基誘導体を表す。
工程（ｄ）は、前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程である。
例えば、本実施形態において工程（ｄ）は、前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされておらず、且つｍｉＲＮＡを介して捕捉プローブと連結していない検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程である。
本実施形態では、ｍｉＲＮＡと捕捉プローブ及び検出プローブと捕捉プローブとの間の二重鎖を形成させている水素結合を切断可能な条件下に捕捉プローブをおくことを例示する。
例えば、本実施形態において工程（ｄ）は、前記ｍｉＲＮＡとライゲーションされておらず、且つｍｉＲＮＡを介して捕捉プローブと連結していない検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程である。
本実施形態では、ｍｉＲＮＡと捕捉プローブ及び検出プローブと捕捉プローブとの間の二重鎖を形成させている水素結合を切断可能な条件下に捕捉プローブをおくことを例示する。
図４に示されるように、ｍｉＲＮＡ６とライゲーションされていない検出プローブ５は、捕捉プローブ４との間の二重鎖を形成させている水素結合を切断されると、捕捉プローブ４から解離する。対して、ｍｉＲＮＡ６とライゲーションされた検出プローブ５は、ｍｉＲＮＡ６が光反応性塩基誘導体１ａ’との架橋により捕捉プローブ４と連結されているので、捕捉プローブとの間の二重鎖を形成させている水素結合が切断されても、ｍｉＲＮＡ６を介して捕捉プローブ４と連結し、ｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体の状態が維持される。
本実施形態の工程（ｅ）は、［第一実施形態］の工程（ｅ）と同様に行えばよい。
このように、捕捉プローブとｍｉＲＮＡ６と光反応性塩基誘導体により架橋をさせることによっても、ｍｉＲＮＡの存在を検出することが可能である。
また、先に記載の［第一実施形態］においては、工程（ｃ）において、捕捉プローブ４の５’末端とｍｉＲＮＡ６の３’末端とをライゲーションさせるために、予め捕捉プローブ４の５’末端を、リン酸化しておくことが推奨された。一方、本実施形態においては、捕捉プローブ４とｍｉＲＮＡ６とは光反応性塩基誘導体により架橋されるので、予め捕捉プローブ４の５’末端を、リン酸化しておく必要がない。生体由来のｍｉＲＮＡは５’末端にリン酸基を有している。したがって本実施形態は、全工程にわたって、リン酸化の処理を行う必要が無いという点においても優れている。
また、先に記載の［第一実施形態］においては、工程（ｃ）において、捕捉プローブ４の５’末端とｍｉＲＮＡ６の３’末端とをライゲーションさせるために、予め捕捉プローブ４の５’末端を、リン酸化しておくことが推奨された。一方、本実施形態においては、捕捉プローブ４とｍｉＲＮＡ６とは光反応性塩基誘導体により架橋されるので、予め捕捉プローブ４の５’末端を、リン酸化しておく必要がない。生体由来のｍｉＲＮＡは５’末端にリン酸基を有している。したがって本実施形態は、全工程にわたって、リン酸化の処理を行う必要が無いという点においても優れている。
先に記載の［第四実施形態］では、光反応性塩基誘導体は、捕捉プローブの第１の部分に配置されていたが、光反応性塩基誘導体は、核酸―検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の他の部分に配置されていてもよく、複数含まれるように配置されていても良い。例えば、光反応性塩基誘導体をステム部に配置させることで、ステム部の二本鎖を安定的に形成させることができる。同様に、光反応性塩基誘導体を捕捉プローブの第２の部分又は検出プローブに配置させることで、捕捉プローブと検出プローブとの二本鎖を安定的に形成させることができる。
しかし、捕捉プローブと検出プローブとが、光反応性塩基誘導体により架橋されたまま工程（ｅ）を行うと、ｍｉＲＮＡの存在と非存在とを区別することが困難である。このような場合、光反応性塩基誘導体は、可逆的光連結性塩基であることが好ましい。捕捉プローブの第２の部分又は検出プローブに配置させる光反応性塩基誘導体を、可逆的光連結性塩基とすることで、上記問題が解決される。
可逆的光連結性塩基は、核酸との光連結及び光解離とを可逆的に生じさせることが可能な光連結性塩基であり、可逆的光連結性塩基は、例えば、光連結に用いた波長帯域光とは異なる波長帯域光が照射されることによって、可逆的に光連結及び光開裂する塩基を含む。
可逆的な架橋反応を用いた核酸の検出方法を、先に記載の［第二実施形態］の場合を例に挙げて説明すると、まず、捕捉プローブの第２の部分に可逆的光連結性塩基を配置しておき、第２の部分に捕捉プローブがハイブリダイズされたところで、光連結する第一の波長帯域の光を照射して、捕捉プローブと検出プローブとを架橋させておく。その後工程（ｄ）の前に、第二の波長帯域の光を照射し、捕捉プローブと検出プローブとの架橋を解消させる。第二の波長帯域光は、捕捉プローブと検出プローブとの架橋を開裂させることが可能な波長帯域光である。
可逆的光連結性塩基は、核酸との光連結及び光解離とを可逆的に生じさせることが可能な光連結性塩基であり、可逆的光連結性塩基は、例えば、光連結に用いた波長帯域光とは異なる波長帯域光が照射されることによって、可逆的に光連結及び光開裂する塩基を含む。
可逆的な架橋反応を用いた核酸の検出方法を、先に記載の［第二実施形態］の場合を例に挙げて説明すると、まず、捕捉プローブの第２の部分に可逆的光連結性塩基を配置しておき、第２の部分に捕捉プローブがハイブリダイズされたところで、光連結する第一の波長帯域の光を照射して、捕捉プローブと検出プローブとを架橋させておく。その後工程（ｄ）の前に、第二の波長帯域の光を照射し、捕捉プローブと検出プローブとの架橋を解消させる。第二の波長帯域光は、捕捉プローブと検出プローブとの架橋を開裂させることが可能な波長帯域光である。
可逆的光連結性塩基誘導体は、一例として、ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）を付加した塩基、ＣＮＶＫ、ＣＶＵ、ＹＣＶＵ、α‐ＣＵ、β‐ＣＵ、ＶＵ、ＨＵ、ＨＶＵ、ＢｕＶＵ、ＶＺＡ等が挙げられる。
なお、可逆的光連結性塩基の一例として、ＣＮＶＫを用いる場合、短時間で効率よく架橋できる。光反応性塩基誘導体としてＣＮＶＫを用いる場合を例に挙げて説明すると、ＣＮＶＫを用いる場合、第一の波長帯域は３４０ｎｍ以上の光である。一例として、３４０〜３８０ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、ＣＮＶＫの５’側 に隣接するプリン塩基と塩基対を形成しているｍｉＲＮＡ６中のピリミジン塩基を構成する原子とＣＮＶＫを構成する原子とが架橋構造を形成する。第二の波長帯域は３５０ｎｍ未満の光である。一例として、２８０〜３４５ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、架橋は解除される。第一の波長帯域と第二の波長帯域は、波長帯域の一部が互いに重複していてもよいとする。
ＣＮＶＫを用いることで、所定の波長帯域の光を短時間（例えば３０秒）照射することで高い架橋効率が得られ、照射対象の核酸を損傷するおそれがない。また、ＣＮＶＫは、効率のよい可逆的な架橋反応が可能であるという点において優れている。
なお、可逆的光連結性塩基の一例として、ＣＮＶＫを用いる場合、短時間で効率よく架橋できる。光反応性塩基誘導体としてＣＮＶＫを用いる場合を例に挙げて説明すると、ＣＮＶＫを用いる場合、第一の波長帯域は３４０ｎｍ以上の光である。一例として、３４０〜３８０ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、ＣＮＶＫの５’側 に隣接するプリン塩基と塩基対を形成しているｍｉＲＮＡ６中のピリミジン塩基を構成する原子とＣＮＶＫを構成する原子とが架橋構造を形成する。第二の波長帯域は３５０ｎｍ未満の光である。一例として、２８０〜３４５ｎｍの波長帯域の光を照射することにより、架橋は解除される。第一の波長帯域と第二の波長帯域は、波長帯域の一部が互いに重複していてもよいとする。
ＣＮＶＫを用いることで、所定の波長帯域の光を短時間（例えば３０秒）照射することで高い架橋効率が得られ、照射対象の核酸を損傷するおそれがない。また、ＣＮＶＫは、効率のよい可逆的な架橋反応が可能であるという点において優れている。
［第五実施形態］
本第五実施形態の核酸の検出方法は、前記工程（ａ）〜工程（ｅ）に加えて、更に、（ｆ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該ｍｉＲＮＡを鋳型にした核酸合成を行う工程、を有する。前記工程（ａ）〜工程（ｅ）としては、前記［第一実施形態］における工程（ａ）〜工程（ｅ）、又は前記［第二実施形態］における工程（ａ’）〜工程（ｅ）を、好ましいものとして例示できる。
本第五実施形態の核酸の検出方法は、前記工程（ａ）〜工程（ｅ）に加えて、更に、（ｆ）前記基板上に形成され、前記ｍｉＲＮＡと前記検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該ｍｉＲＮＡを鋳型にした核酸合成を行う工程、を有する。前記工程（ａ）〜工程（ｅ）としては、前記［第一実施形態］における工程（ａ）〜工程（ｅ）、又は前記［第二実施形態］における工程（ａ’）〜工程（ｅ）を、好ましいものとして例示できる。
以下、図５〜７を参照しながら、本実施形態について説明する。
図５は、本実施形態における核酸の検出方法の工程（ｆ）の一態様の模式図である。まず、前記工程（ａ）〜工程（ｅ）を行い、ｍｉＲＮＡ６−検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体を形成させる（図５（Ａ１））。次いで、ステム部３ａ’にハイブリダイズし得る塩基配列を有するＲＴプライマー１１を用いて、ｍｉＲＮＡ６及び検出プローブ５を含む配列を逆転写酵素１２により逆転写し、ｃＤＮＡ１３を得る（図５（Ａ２）〜（Ａ３））。ｍｉＲＮＡとライゲーションしなかった捕捉プローブからはｃＤＮＡが得られないため、ｍｉＲＮＡの存在量に対応する量のｃＤＮＡが合成される。その後、加熱処理を行い、逆転写酵素を熱変性させるとともに、ｍｉＲＮＡ６−検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体からｃＤＮＡ１３を解離させる（図５（Ａ４））。
次いで、上記ｃＤＮＡを鋳型にした核酸合成を行う。一例として、第２の部分にハイブリダイズし得る塩基配列を有する第１のＰＣＲプライマー１４と、ステム部３ａ’にハイブリダイズし得る塩基配列を有する第２のＰＣＲプライマー１４’と、からなるプライマーセットを用いて、ＤＮＡポリメラーゼ１７により核酸増幅を行うことを例示できる。第１のＰＣＲプライマー及び第２のＰＣＲプライマーの長さは、通常のプライマーと同様、それぞれ、１０〜４０塩基が好ましく、２０〜３０塩基がより好ましい。
図５は、本実施形態における核酸の検出方法の工程（ｆ）の一態様の模式図である。まず、前記工程（ａ）〜工程（ｅ）を行い、ｍｉＲＮＡ６−検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体を形成させる（図５（Ａ１））。次いで、ステム部３ａ’にハイブリダイズし得る塩基配列を有するＲＴプライマー１１を用いて、ｍｉＲＮＡ６及び検出プローブ５を含む配列を逆転写酵素１２により逆転写し、ｃＤＮＡ１３を得る（図５（Ａ２）〜（Ａ３））。ｍｉＲＮＡとライゲーションしなかった捕捉プローブからはｃＤＮＡが得られないため、ｍｉＲＮＡの存在量に対応する量のｃＤＮＡが合成される。その後、加熱処理を行い、逆転写酵素を熱変性させるとともに、ｍｉＲＮＡ６−検出プローブ５−捕捉プローブ４複合体からｃＤＮＡ１３を解離させる（図５（Ａ４））。
次いで、上記ｃＤＮＡを鋳型にした核酸合成を行う。一例として、第２の部分にハイブリダイズし得る塩基配列を有する第１のＰＣＲプライマー１４と、ステム部３ａ’にハイブリダイズし得る塩基配列を有する第２のＰＣＲプライマー１４’と、からなるプライマーセットを用いて、ＤＮＡポリメラーゼ１７により核酸増幅を行うことを例示できる。第１のＰＣＲプライマー及び第２のＰＣＲプライマーの長さは、通常のプライマーと同様、それぞれ、１０〜４０塩基が好ましく、２０〜３０塩基がより好ましい。
増幅方法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）の他に、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等、従来公知の方法が挙げられる。
本実施形態の核酸の検出方法は、
（ｇ）前記工程（ｆ）で得られた増幅産物を検出する工程を含む。
工程（ｇ）は工程（ｆ）の後に行ってもよく、工程（ｆ）と同時に（リアルタイムに）行ってもよい。
増幅産物の検出は増幅産物自体を標識することにより行うことが挙げられる。増幅産物の標識に用いられる標識物質としては、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
これらの中でも、標識物質としては、蛍光色素が好ましく、インターカレーターがより好ましい。インターカレーターとしては、蛍光やＵＶで検出可能な、二本鎖ＤＮＡにインターカレートして蛍光を発する物質であれば特に限定されることなく、例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＥＲ Ｇｏｌｄ等が挙げられる。ｃＤＮＡを鋳型にした核酸合成を行う際に、これらインターカレーター１６を核酸合成の反応溶液中に添加する（図５（Ａ５）〜（Ａ８））、又は泳動用緩衝液に蛍光試薬を微量添加するだけで、増幅産物と蛍光試薬とがインターカーレーションし、蛍光検出が可能となる。
（ｇ）前記工程（ｆ）で得られた増幅産物を検出する工程を含む。
工程（ｇ）は工程（ｆ）の後に行ってもよく、工程（ｆ）と同時に（リアルタイムに）行ってもよい。
増幅産物の検出は増幅産物自体を標識することにより行うことが挙げられる。増幅産物の標識に用いられる標識物質としては、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
これらの中でも、標識物質としては、蛍光色素が好ましく、インターカレーターがより好ましい。インターカレーターとしては、蛍光やＵＶで検出可能な、二本鎖ＤＮＡにインターカレートして蛍光を発する物質であれば特に限定されることなく、例えば、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＥＲ Ｇｏｌｄ等が挙げられる。ｃＤＮＡを鋳型にした核酸合成を行う際に、これらインターカレーター１６を核酸合成の反応溶液中に添加する（図５（Ａ５）〜（Ａ８））、又は泳動用緩衝液に蛍光試薬を微量添加するだけで、増幅産物と蛍光試薬とがインターカーレーションし、蛍光検出が可能となる。
工程（ｆ）を行うことで、ｍｉＲＮＡの配列が増幅されるので、前記工程（ａ）〜工程（ｅ）を行うことでは検出されなかったｍｉＲＮＡを検出することが可能となる。特に、工程（ｇ）工程（ｆ）と同時に（リアルタイムに）行うことにより、工程（ｅ）でのみ標識物質を検出してシグナル強度を比較する方法に比べて、ダイナミックレンジが大幅に向上し、核酸の検出下限濃度も改善する。
また、工程（ｆ）を行うことで、ｍｉＲＮＡの定量も行うことが可能である。
例えば、同一の共通プライマーセットを用いて核酸合成を行った場合、核酸の配列が異なっていても、核酸の合成効率は同程度となることが推定される。したがって、ｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該ｍｉＲＮＡを鋳型にした核酸合成を行うことで、そのため、検出プローブ−ｍｉＲＮＡ−捕捉プローブ複合体量に応じた量の増幅産物を得ることができる。
例えば、同一の共通プライマーセットを用いて核酸合成を行った場合、核酸の配列が異なっていても、核酸の合成効率は同程度となることが推定される。したがって、ｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該ｍｉＲＮＡを鋳型にした核酸合成を行うことで、そのため、検出プローブ−ｍｉＲＮＡ−捕捉プローブ複合体量に応じた量の増幅産物を得ることができる。
本実施形態の核酸の検出方法に用いられるマイクロアレイとして、捕捉プローブが複数集合してなるスポットが、基板と基板上に設けられたスペーサーとにより形成されたウェル内に配置され、前記捕捉プローブが前記ウェル内の基板上又はスペーサー上に固定化されたものを例示できる。前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有する。
図６は、本実施形態の核酸の検出方法に用いられるマイクロアレイを有する検出装置の一態様の模式図である。
図６（ａ）は、当該検出装置２０の一態様を表す平面図である。基板７上には、捕捉プローブ４が複数集合してなるスポットが複数形成されている。基板７は、筐体２３に収められており、筐体２３の壁面には試薬流入口２４ａ及び試薬排出口２４ｂが設けられている。各々のウェル２１間の距離はスポットから発せられるシグナルが互いに干渉しない距離とすることが好ましい。
図６（ｂ）は、当該検出装置２０の一態様を表す斜視図である。ウェル２１の形状は特に制限されず、円柱状、円錐状、多角柱状等の形状を例示でき、本実施形態では、図６（ｂ）に示されるように円柱状である。ウェルの直径は、一例として、０．１μｍ〜１ｍｍ程度とすることができる。基板上にスペーサーが設けられていることにより、スポットごとに核酸合成の反応液を隔離し、スポットごとに独立の反応空間を形成させることができる。そのため、各スポットに由来する増幅産物を溶液中に混在させることなく、スポットごとに核酸の検出を行うことができる。また、スペーサーが遮光性の材料によって構成されている場合には、スペーサーによってスポットから発せられるシグナル同士の干渉を低減することも可能である。基板の下部には、核酸の増幅温度を制御するためのヒーターユニット３０を配置してもよい。
図６（ｃ）は、当該検出装置２０の一態様を表す断面図である。捕捉プローブ４はウェル２１内の基板上に固定化されている。図６（ｃ）に示すように、スペーサー２５の上面と筐体２３の壁面の間には間隙が設けられている。間隙は、各ウェルに試薬を送液するための空間として用いることができる。
図６は、本実施形態の核酸の検出方法に用いられるマイクロアレイを有する検出装置の一態様の模式図である。
図６（ａ）は、当該検出装置２０の一態様を表す平面図である。基板７上には、捕捉プローブ４が複数集合してなるスポットが複数形成されている。基板７は、筐体２３に収められており、筐体２３の壁面には試薬流入口２４ａ及び試薬排出口２４ｂが設けられている。各々のウェル２１間の距離はスポットから発せられるシグナルが互いに干渉しない距離とすることが好ましい。
図６（ｂ）は、当該検出装置２０の一態様を表す斜視図である。ウェル２１の形状は特に制限されず、円柱状、円錐状、多角柱状等の形状を例示でき、本実施形態では、図６（ｂ）に示されるように円柱状である。ウェルの直径は、一例として、０．１μｍ〜１ｍｍ程度とすることができる。基板上にスペーサーが設けられていることにより、スポットごとに核酸合成の反応液を隔離し、スポットごとに独立の反応空間を形成させることができる。そのため、各スポットに由来する増幅産物を溶液中に混在させることなく、スポットごとに核酸の検出を行うことができる。また、スペーサーが遮光性の材料によって構成されている場合には、スペーサーによってスポットから発せられるシグナル同士の干渉を低減することも可能である。基板の下部には、核酸の増幅温度を制御するためのヒーターユニット３０を配置してもよい。
図６（ｃ）は、当該検出装置２０の一態様を表す断面図である。捕捉プローブ４はウェル２１内の基板上に固定化されている。図６（ｃ）に示すように、スペーサー２５の上面と筐体２３の壁面の間には間隙が設けられている。間隙は、各ウェルに試薬を送液するための空間として用いることができる。
なお、本実施形態では、捕捉プローブは、基板と基板上に設けられたスペーサーとにより形成されたウェル内の該基板上に配置された態様を例示したが、基板自体に凹部（ウェル）が形成されていてもよい。
また、本実施形態では、捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有するものを例示した。しかし、捕捉プローブは、検出対象の核酸を捕捉するための、検出対象の核酸の少なくとも一部とハイブリダイズし得る配列を有するものであればよい。この場合の核酸の検出方法は、当該捕捉プローブに捕捉された検出対象の核酸を、捕捉プローブに連結させる、又は当該捕捉プローブに捕捉された検出対象の核酸を、任意の物質を介して連結させる工程を経た後、検出対象の核酸を鋳型にした核酸合成を行う工程を含む。ここで、核酸を捕捉プローブに連結させることの例として、上記各実施形態で説明したリガーゼによるライゲーションさせること、光反応性塩基誘導体に光を照射して塩基同士を架橋させることが挙げられる。任意の物質としては、任意の配列のオリゴヌクレオシドを例示できる。オリゴヌクレオシドはステムループ構造を有していることが好ましい。該ステムループ構造は捕捉プローブの一部分であってもよい。
また、本実施形態では、捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有するものを例示した。しかし、捕捉プローブは、検出対象の核酸を捕捉するための、検出対象の核酸の少なくとも一部とハイブリダイズし得る配列を有するものであればよい。この場合の核酸の検出方法は、当該捕捉プローブに捕捉された検出対象の核酸を、捕捉プローブに連結させる、又は当該捕捉プローブに捕捉された検出対象の核酸を、任意の物質を介して連結させる工程を経た後、検出対象の核酸を鋳型にした核酸合成を行う工程を含む。ここで、核酸を捕捉プローブに連結させることの例として、上記各実施形態で説明したリガーゼによるライゲーションさせること、光反応性塩基誘導体に光を照射して塩基同士を架橋させることが挙げられる。任意の物質としては、任意の配列のオリゴヌクレオシドを例示できる。オリゴヌクレオシドはステムループ構造を有していることが好ましい。該ステムループ構造は捕捉プローブの一部分であってもよい。
図７は、本実施形態の核酸の検出方法における工程（ｆ）及び工程（ｇ）の手順を説明する模式図である。まず、検出装置２０内に検出対象のｍｉＲＮＡ、検出プローブ、及びリガーゼを含む溶液を導入する（図７（Ｄ１））。その後、ウェル及びスペーサーの上部の間隙にある余分な前記溶液を除去し、捕捉プローブにｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、捕捉プローブに検出プローブをハイブリダイズさせ、基板上に核酸―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させ、ｍｉＲＮＡと検出プローブとをライゲーションさせる（図７（Ｄ２）〜（Ｄ３））。続いて、検出装置２０に核酸の変性剤を導入してｍｉＲＮＡとライゲーションされていない検出プローブと、捕捉プローブとの間の結合を解消させた後、検出装置２０に洗浄液を導入し、洗浄液を除去する（図７（Ｄ４）〜（Ｄ５））。これら一連の手順により、ｍｉＲＮＡと検出プローブとがライゲーションされているｍｉＲＮＡ−検出プローブ−捕捉プローブ複合体、又はｍｉＲＮＡを捕捉しなかった捕捉プローブが、基板上に残存する。
その後、検出装置２０内へ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、インターカレーターを含む反応溶液を導入し、ウェル及びスペーサーの上部の間隙にある余分な前記溶液を除去する（図７（Ｄ６）〜（Ｄ７））。ヒーターユニットを稼働させ、逆転写反応及びＰＣＲを行う（図７（Ｄ８）〜（Ｄ１２））。図７中（Ｄ９）〜（Ｄ１２）は、ｃＤＮＡを鋳型にした核酸合成により蛍光シグナルが増大していく様子を示している。
その後、検出装置２０内へ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、インターカレーターを含む反応溶液を導入し、ウェル及びスペーサーの上部の間隙にある余分な前記溶液を除去する（図７（Ｄ６）〜（Ｄ７））。ヒーターユニットを稼働させ、逆転写反応及びＰＣＲを行う（図７（Ｄ８）〜（Ｄ１２））。図７中（Ｄ９）〜（Ｄ１２）は、ｃＤＮＡを鋳型にした核酸合成により蛍光シグナルが増大していく様子を示している。
（複数種類の捕捉プローブ・複数種類の検出プローブ）
上記の各実施形態で挙げた核酸の検出方法に共通の利点の一つは、検出プローブとｍｉＲＮＡとを直接ハイブリダイズさせないので、ｍｉＲＮＡの配列に左右されずに、自由に検出プローブの配列を設計することができ、異なる種類のｍｉＲＮＡの検出にも共通の検出プローブを用いることが可能なことである。
しかし、そのことは、前記第２の部分の配列が異なる複数種類の捕捉プローブを用いること、及びそれに対応する複数種類の検出プローブを用いることを妨げるものではない。
上記の各実施形態で挙げた核酸の検出方法に共通の利点の一つは、検出プローブとｍｉＲＮＡとを直接ハイブリダイズさせないので、ｍｉＲＮＡの配列に左右されずに、自由に検出プローブの配列を設計することができ、異なる種類のｍｉＲＮＡの検出にも共通の検出プローブを用いることが可能なことである。
しかし、そのことは、前記第２の部分の配列が異なる複数種類の捕捉プローブを用いること、及びそれに対応する複数種類の検出プローブを用いることを妨げるものではない。
図８は、本実施形態における核酸の検出方法の一態様を説明する模式図であり、第２の部分２の配列が互いに異なる第１の捕捉プローブ４及び第２の捕捉プローブ４’が基板に固定化された状態を表す。第１の捕捉プローブの第２の部分を配列Ａとする。第２の捕捉プローブの第２の部分を配列Ｂとする。配列Ａには第１の検出プローブ５が、配列Ｂには第２の検出プローブ１５がそれぞれハイブリダイズし得る。
第１の捕捉プローブ４の第１の部分にハイブリダイズし得るｍｉＲＮＡ（以下第１のｍｉＲＮＡという。）と、第２の捕捉プローブ４’の第１の部分にハイブリダイズし得るｍｉＲＮＡ（以下第２のｍｉＲＮＡという。）とは異なる種類であるとする。さらに、第１のｍｉＲＮＡの溶液中の存在量が、第２のｍｉＲＮＡの溶液中の存在量よりも非常に多いものとする。このとき、仮に配列Ａと配列Ｂが同じ配列であって、共通の検出プローブを用いる場合では、第１のｍｉＲＮＡに対しては好ましい量の検出プローブ量であっても、第２のｍｉＲＮＡに対しては過剰量の検出プローブとなる恐れがあり、第２のｍｉＲＮＡの検出にあたって、非特異的な検出プローブのハイブリダイズの可能性を高めてしまう。
そこで、第２の部分２の配列が互いに異なる第１の捕捉プローブ及び第２の捕捉プローブ、並びに、それらに対応する複数種類の検出プローブを用いることで、ｍｉＲＮＡの存在量に合わせた好ましい検出プローブの量を選択することができる。
そこで、第２の部分２の配列が互いに異なる第１の捕捉プローブ及び第２の捕捉プローブ、並びに、それらに対応する複数種類の検出プローブを用いることで、ｍｉＲＮＡの存在量に合わせた好ましい検出プローブの量を選択することができる。
また、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブは、互いに異なる種類又は異なる量の標識物質により標識されていてもよい。このとき、前記標識物質は、前記第２の部分の配列と対応づけられていることが好ましい。
図８に示すように、第１の検出プローブ５は標識物質５ａにより標識されており、第２の検出プローブ１５は標識物質５ａ’により標識されている。
第１の検出プローブ及び第２の検出プローブが、互いに異なる種類の標識物質により標識されていることで、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブの量を変えた場合でも、標識の種類ごとにシグナルを見分けることができるので、検出対象のｍｉＲＮＡ量の判断をより正確に行うことができる。
第１の検出プローブ及び第２の検出プローブが、同じ物質で互いに異なる量の標識物質により標識された場合には、標識の強度を上げることができ、より高感度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
図８に示すように、第１の検出プローブ５は標識物質５ａにより標識されており、第２の検出プローブ１５は標識物質５ａ’により標識されている。
第１の検出プローブ及び第２の検出プローブが、互いに異なる種類の標識物質により標識されていることで、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブの量を変えた場合でも、標識の種類ごとにシグナルを見分けることができるので、検出対象のｍｉＲＮＡ量の判断をより正確に行うことができる。
第１の検出プローブ及び第２の検出プローブが、同じ物質で互いに異なる量の標識物質により標識された場合には、標識の強度を上げることができ、より高感度に標的ｍｉＲＮＡを検出することができる。
また、上述の例に挙げたように、第１のｍｉＲＮＡの溶液中の存在量が、第２のｍｉＲＮＡの溶液中の存在量よりも非常に多い場合、捕捉プローブ４’にハイブリダイズする検出プローブ１５の量が、捕捉プローブ４にハイブリダイズする検出プローブ５の量に比べて少なくなる。その結果、検出プローブ１５に由来するシグナル量と、検出プローブ５に由来するシグナル量との差が大きくなり、一度の解析で両者のシグナル定量することが難しくなる恐れがある。したがって、第１の検出プローブが有する標識物質に由来する強度と、第２の検出プローブが有する標識物質に由来する強度が互いに異なっていてもよい。
例えば、第１のｍｉＲＮＡの存在量が第２のｍｉＲＮＡの存在量よりも多く、第２のｍｉＲＮＡの存在量が第１のｍｉＲＮＡの存在量よりも少ない場合には、第１の検出プローブの有する標識に由来するシグナル強度が前記第２の検出プローブの有する標識に由来するシグナル強度よりも高くなるように、それぞれ異なる標識物質で標識することが挙げられる。このとき、第１の検出プローブの有する標識に由来するシグナル強度と第２の検出プローブの有する標識に由来するシグナル強度との差は特に限定されず、検出装置のダイナミックレンジ内に入るようにシグナル強度の差を調整すればよい。このように、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブが、互いに異なる種類又は異なる量の標識物質により標識されていることにより、検出可能なｍｉＲＮＡの範囲を拡張することができる。
例えば、第１のｍｉＲＮＡの存在量が第２のｍｉＲＮＡの存在量よりも多く、第２のｍｉＲＮＡの存在量が第１のｍｉＲＮＡの存在量よりも少ない場合には、第１の検出プローブの有する標識に由来するシグナル強度が前記第２の検出プローブの有する標識に由来するシグナル強度よりも高くなるように、それぞれ異なる標識物質で標識することが挙げられる。このとき、第１の検出プローブの有する標識に由来するシグナル強度と第２の検出プローブの有する標識に由来するシグナル強度との差は特に限定されず、検出装置のダイナミックレンジ内に入るようにシグナル強度の差を調整すればよい。このように、第１の検出プローブ及び第２の検出プローブが、互いに異なる種類又は異なる量の標識物質により標識されていることにより、検出可能なｍｉＲＮＡの範囲を拡張することができる。
≪捕捉プローブ、検出プローブセット、マイクロアレイ、核酸検出キット、及び核酸固定化固相≫
本実施形態の捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有することを特徴とする捕捉プローブであり、前記第１の部分と前記第２の部分とが隣接して配置され、前記第１の部分が、前記第２の部分と前記ステム部との間に位置することが好ましい。本実施形態の捕捉プローブは、上述した捕捉プローブ４に代表されるものである。
他の実施形態として、捕捉プローブは前記第２の部分に標識物質により標識されている検出プローブがハイブリダイズされたものであることが好ましい。
本実施形態の捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有することを特徴とする捕捉プローブであり、前記第１の部分と前記第２の部分とが隣接して配置され、前記第１の部分が、前記第２の部分と前記ステム部との間に位置することが好ましい。本実施形態の捕捉プローブは、上述した捕捉プローブ４に代表されるものである。
他の実施形態として、捕捉プローブは前記第２の部分に標識物質により標識されている検出プローブがハイブリダイズされたものであることが好ましい。
本実施形態の検出プローブセットは、複数種類の検出プローブを含む検出プローブセットであって、前記検出プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有する捕捉プローブの、前記第２の部分に結合可能であり、互いに異なる種類又は異なる量の標識物質により標識されている第１の検出プローブ及び第２の検出プローブを含むものである。当該検出プローブセットは、図８に示す互いに異なる種類の標識物質により標識されている第１の検出プローブ５及び第２の検出プローブ１５、を含むプローブセットに代表されるものである。前記標識物質は、前記第２の部分の配列と対応づけられていることが好ましい。係る構成により各ｍｉＲＮＡを厳密に識別することができる。
本実施形態のマイクロアレイは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有する捕捉プローブが基板に複数固定化されてなるものである。
本実施形態に係る捕捉プローブは、基板と結合する側の末端にスペーサーを有しており、前記第１の部分、前記第２の部分、ループ構造を有する前記ステム部、及び前記スペーサーからなるものであってもよく、本実施形態のマイクロアレイとして、上記≪核酸の検出方法≫において説明したものが例示できる。
他の実施形態として、捕捉プローブの前記第２の部分には、標識物質により標識されている検出プローブが予めハイブリダイズされていてもよい。これは、上記≪核酸の検出方法≫の［第二実施形態］において説明したものが例示できる。
本実施形態に係る捕捉プローブは、基板と結合する側の末端にスペーサーを有しており、前記第１の部分、前記第２の部分、ループ構造を有する前記ステム部、及び前記スペーサーからなるものであってもよく、本実施形態のマイクロアレイとして、上記≪核酸の検出方法≫において説明したものが例示できる。
他の実施形態として、捕捉プローブの前記第２の部分には、標識物質により標識されている検出プローブが予めハイブリダイズされていてもよい。これは、上記≪核酸の検出方法≫の［第二実施形態］において説明したものが例示できる。
本実施形態の核酸検出キットは、捕捉プローブ及び検出プローブを備えた核酸検出キットであって、前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記検出プローブは、標識物質により標識されているものである。本実施形態に係る捕捉プローブは、上述した捕捉プローブ４に代表されるものである。本実施形態に係る検出プローブは、上述した検出プローブ５に代表されるものである。
本実施形態の核酸固定化固相は、検出プローブ及び捕捉プローブが検出対象の核酸を介して連結されてなる核酸―検出プローブ−捕捉プローブ複合体が固相上に固定化されてなる核酸固定化固相であって、前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記検出プローブと前記核酸及び前記核酸と前記捕捉プローブとが連結されている。本実施形態の核酸固定化固相は、上記≪核酸の検出方法≫の［第五実施形態］で説明した工程（ｆ）において好適に用いることができる。
本実施形態の核酸固定化固相としては、上記≪核酸の検出方法≫において説明した工程（ａ）〜（ｄ）を経て得られたものを例示できるが係る工程に限定されない。なかでも、［第一実施形態］の工程（ａ）〜（ｄ）を経て得られる、捕捉プローブ４の５’末端とｍｉＲＮＡ６の３’末端、及び、ｍｉＲＮＡ６の５’末端と検出プローブ５の３’末端がライゲーションされた核酸―検出プローブ−捕捉プローブ複合体が固相上に固定化されてなるものを、好ましいものとして例示できる。
本実施形態の核酸固定化固相としては、上記≪核酸の検出方法≫において説明した工程（ａ）〜（ｄ）を経て得られたものを例示できるが係る工程に限定されない。なかでも、［第一実施形態］の工程（ａ）〜（ｄ）を経て得られる、捕捉プローブ４の５’末端とｍｉＲＮＡ６の３’末端、及び、ｍｉＲＮＡ６の５’末端と検出プローブ５の３’末端がライゲーションされた核酸―検出プローブ−捕捉プローブ複合体が固相上に固定化されてなるものを、好ましいものとして例示できる。
≪流体デバイス≫
本実施形態の流体デバイス（例えばマイクロ流体デバイス（マイクロＴＡＳ）、ミリ流体デバイス（ミリＴＡＳ）など）は、捕捉プローブが固定化されてなる基板を有する核酸検出部を備えた流体デバイスであって、前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有するものである。また、本実施形態の流体デバイスは、前記第２の部分に、標識物質により標識されている検出プローブが予めハイブリダイズされていてもよい。
捕捉プローブが固定化されてなる基板としては、先に記載のマイクロアレイを例示することができる。
図９に本実施形態の流体デバイスの構成を模式的に示す。流体デバイス１０１は、捕捉プローブが固定化されてなる基板１０４ｃと、検出プローブ導入用インレット１０４ａと、を有する核酸検出部１０４を備えている。核酸検出部１０４は、核酸試料を導入するためのサンプル導入用インレット１０２ｂをさらに備えていてもよい。
本実施形態の流体デバイス（例えばマイクロ流体デバイス（マイクロＴＡＳ）、ミリ流体デバイス（ミリＴＡＳ）など）は、捕捉プローブが固定化されてなる基板を有する核酸検出部を備えた流体デバイスであって、前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有するものである。また、本実施形態の流体デバイスは、前記第２の部分に、標識物質により標識されている検出プローブが予めハイブリダイズされていてもよい。
捕捉プローブが固定化されてなる基板としては、先に記載のマイクロアレイを例示することができる。
図９に本実施形態の流体デバイスの構成を模式的に示す。流体デバイス１０１は、捕捉プローブが固定化されてなる基板１０４ｃと、検出プローブ導入用インレット１０４ａと、を有する核酸検出部１０４を備えている。核酸検出部１０４は、核酸試料を導入するためのサンプル導入用インレット１０２ｂをさらに備えていてもよい。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１６の配列を有するＲＮＡを合成した。また、Ｔ７プロモーター配列を有する検出プローブを合成した。そして、ｍｉＲ−１６の配列と相補的な配列及びＴ７プロモーター配列と相補的な配列の両方を有する捕捉プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−１６［配列：５’−ｐ−Ｘ１−３’］
Pはリン酸を表し、Ｘ１は以下の配列を表す。標的ｍｉＲＮＡの以下の配列はＲＮＡである。
ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ（配列番号１：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ−１６の配列を有するＲＮＡを合成した。また、Ｔ７プロモーター配列を有する検出プローブを合成した。そして、ｍｉＲ−１６の配列と相補的な配列及びＴ７プロモーター配列と相補的な配列の両方を有する捕捉プローブを設計・合成した。
用いた標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ−１６［配列：５’−ｐ−Ｘ１−３’］
Pはリン酸を表し、Ｘ１は以下の配列を表す。標的ｍｉＲＮＡの以下の配列はＲＮＡである。
ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵＵＧＧＣＧ（配列番号１：２２ｍｅｒ）
（２）検出プローブ１（Ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｂｅ１）［配列：５’−ｐ−Ａｌ−Ｘ２−３’］
ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ６４７−ＡｍｉｎｏＣ６−ｄＡを表し、Ｘ２は以下の配列を表す。検出プローブ１の以下の配列は、RNA及び2’-O-methyl RNAである。大文字で表した配列がRNAであり、小文字で表した配列が2’-O-methyl RNAである。
Ｘ２：ＧｃＵａＧｕＵａＵｕＧｃＵｃＡｇＣｇＧ（配列番号２：１９ｍｅｒ）
ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ６４７−ＡｍｉｎｏＣ６−ｄＡを表し、Ｘ２は以下の配列を表す。検出プローブ１の以下の配列は、RNA及び2’-O-methyl RNAである。大文字で表した配列がRNAであり、小文字で表した配列が2’-O-methyl RNAである。
Ｘ２：ＧｃＵａＧｕＵａＵｕＧｃＵｃＡｇＣｇＧ（配列番号２：１９ｍｅｒ）
（３）捕捉プローブ１（Ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ１）［配列：５’−ｐ−Ｘ３−Ｘ４−ｆN−３’］
ｐはリン酸を表し、Ｘ３は以下の配列を表し、Ｘ４は以下の配列を表し、ｆは６−ＦＡＭ（６−フルオロセイン）を表し、Ｎはアミノ基を表す。Ｘ４はスペーサーの役割を果たす配列である。捕捉プローブ１の以下の配列はＤＮＡである。
Ｘ３：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣ（配列番号３：６３ｍｅｒ）Ｘ４：ＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号４：２１ｍｅｒ）
ｐはリン酸を表し、Ｘ３は以下の配列を表し、Ｘ４は以下の配列を表し、ｆは６−ＦＡＭ（６−フルオロセイン）を表し、Ｎはアミノ基を表す。Ｘ４はスペーサーの役割を果たす配列である。捕捉プローブ１の以下の配列はＤＮＡである。
Ｘ３：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣ（配列番号３：６３ｍｅｒ）Ｘ４：ＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号４：２１ｍｅｒ）
インクジェット装置（ＭｉｃｒｏＪｅｔ社製ＬａｂｏＪｅｔ−５００Ｂｉｏ）を用いて、ガラス基板（Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ Ｓｌｉｄｅ ｅｐｏｘｙ ｃｏａｔｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に、表１に示す捕捉プローブを含む溶液を吐出した。 表１中、２０×ＳＳＣ ｂｕｆｆｅｒの組成は、３Ｍ ＮａＣｌ，０．３Ｍ クエン酸ナトリウムである。
得られた基板を２５℃、高湿条件（２０μｌ、５０℃の水を配したチャンバー内）にて一晩保温し、捕捉プローブ−１をガラス基板のエポキシ基と反応させた。その後、基板を０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、超純水、ブロッキング溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、５０ｍＭ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、０．１％ ＳＤＳ）、超純水で洗浄し、風乾させ、ガラス基板に捕捉プローブ−１が固定化されたマイクロアレイを得た。基板上の６−ＦＡＭの蛍光強度から算出した捕捉プローブの固定密度は１，５４０ｃｏｐｙ/μｍ２であった。
ｍｉＲＮＡ−１６を含まない、コントロールのハイブリダイゼーション反応溶液１を表２のように調製した。
ｍｉＲ−１６を１ｎＭの濃度で含有する以外はハイブリダイゼーション反応溶液１と同様の組成で、ハイブリダイゼーション反応溶液２を調整した。
ＮａＣｌを１５０ｎＭの濃度で含有する以外は、ハイブリダイゼーション反応溶液１と同様の組成で、ハイブリダイゼーション反応溶液３を調整した。
ｍｉＲ−１６を１ｎＭの濃度で含有する以外はハイブリダイゼーション反応溶液２と同様の組成で、ハイブリダイゼーション反応溶液４を調整した。
ＮａＣｌを７５ｎＭの濃度で含有する以外は、ハイブリダイゼーション反応溶液４と同様の組成で、ハイブリダイゼーション反応溶液５を調整した。
各ハイブリダイゼーション反応溶液を９５℃で５分間インキュベーションした後、室温に戻し、これにＴ４ ＤＮＡリガーゼを、最終濃度が５ｕｎｉｔｓ／μｌになるよう加えた。次いで、これらハイブリダイゼーション反応溶液を、マイクロアレイ基板に接触させた状態で密封し、シェーカー上で１０００ｒｐｍの速さで振とうさせながら３７℃で２時間ハイブリダイゼーションさせた。
ハイブリダイゼーション反応終了後、マイクロアレイ基板を洗浄用液（５０％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０．１％ ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中で３分間振とうさせながら洗浄し、この洗浄操作を２回繰り返した。超純水でリンスしたのち基板を乾燥させ、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光強度を測定した。
結果を図１０に示す。図１０のグラフに示されるように、ｍｉＲＮＡ依存的にＡｌｅｘａ６４７標識された検出プローブの蛍光像が観察された。また、ＮａＣｌ濃度が低いほど検出プローブの蛍光シグナルが増大していた。
結果を図１０に示す。図１０のグラフに示されるように、ｍｉＲＮＡ依存的にＡｌｅｘａ６４７標識された検出プローブの蛍光像が観察された。また、ＮａＣｌ濃度が低いほど検出プローブの蛍光シグナルが増大していた。
［実施例２］
次に、ｍｉＲ−１６の濃度を変えたときの、各スポットにおける検出プローブの蛍光強度の変化を確認した。ｍｉＲ−１６をそれぞれ最終濃度０．４８８ｆＭ、１．９５ｆＭ、７．８１ｆＭ、３１．３ｆＭ、１２５ｆＭ、５００ｆＭとなるように含有させた反応溶液６〜１１を調整した。反応溶液６〜１１の組成は、ｍｉＲ−１６の濃度を変えた以外は上記反応溶液１と同様である。
実施例１と同様にして、ハイブリダイゼーション反応行った。このとき反応溶液１１にＴ４ ＤＮＡリガーゼを加えない反応（Ｎｏ ｌｉｇａｓｅ）も、コントロールの反応として行った。
次に、ｍｉＲ−１６の濃度を変えたときの、各スポットにおける検出プローブの蛍光強度の変化を確認した。ｍｉＲ−１６をそれぞれ最終濃度０．４８８ｆＭ、１．９５ｆＭ、７．８１ｆＭ、３１．３ｆＭ、１２５ｆＭ、５００ｆＭとなるように含有させた反応溶液６〜１１を調整した。反応溶液６〜１１の組成は、ｍｉＲ−１６の濃度を変えた以外は上記反応溶液１と同様である。
実施例１と同様にして、ハイブリダイゼーション反応行った。このとき反応溶液１１にＴ４ ＤＮＡリガーゼを加えない反応（Ｎｏ ｌｉｇａｓｅ）も、コントロールの反応として行った。
実施例１と同様にして、蛍光強度の測定を行った。結果を図１１に示す。ハイブリダイゼーション反応に用いたｍｉＲ−１６の濃度が０．４８８ｆｍｏｌ〜１２５ｆｍｏｌの範囲において直線性が確認されスポット全体の蛍光強度はｍｉＲＮＡ濃度に依存してシグナルが上昇していることが確認された。反応溶液中のｍｉＲ−１６の濃度が１２５ｆＭのときと、５００ｆＭのときとでは、蛍光の強度がほぼ同じであり、捕捉プローブに対して結合した検出プローブの蛍光シグナルが飽和していることが分かる。０ｎＭのｍｉＲＮＡ−１６での蛍光強度は、コントロール（Ｎｏ ｌｉｇａｓｅ）のものとほぼ同じであった。
以上の結果から、本実施形態によれば、本実施形態に係る検出プローブおよび捕捉プローブを用いることで、高精度に核酸を検出できることが示された。
各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨から逸脱しない範囲内で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。本発明は実施形態によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。
１…第１の部分、１ａ，１ａ’…第１の光反応性塩基誘導体、２…第２の部分、３ａ，３ａ’…ステム部、３ｂ…ループ構造、４、４’…捕捉プローブ、４ａ…スペーサー、５，１５…検出プローブ、５ａ，５ａ’…標識物質、６…ｍｉＲＮＡ、７…基板、８…Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ａ，Ｂ…配列、１１…ＲＴプライマー、１２…逆転写酵素、１３…ｃＤＮＡ、１４，１４’…ＰＣＲプライマー、１６…インターカレーター、１７…ＤＮＡポリメラーゼ、２０…検出装置、２１…ウェル、２３…筐体、２４ａ…試薬流入口、２４ｂ…試薬排出口、２５…スペーサー、３０…ヒーターユニット、１０１…流体デバイス、１０４…核酸検出部、１０４ａ…検出プローブ導入用インレット、１０４ｃ…基板、１０２ｂ…サンプル導入用インレット
Claims (22)
- （ａ）標識物質により標識されている検出プローブと、核酸と、を含む溶液を、
前記核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、前記検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有する捕捉プローブが固定された固相に接触させる工程、
（ｂ）前記第１の部分に前記核酸をハイブリダイズさせ、前記第２の部分に前記検出プローブをハイブリダイズさせ、前記固相上に核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記核酸がハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記核酸と前記検出プローブとをライゲーションさせる工程、
（ｄ）前記核酸とライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程、及び
（ｆ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該核酸を鋳型にした核酸合成を行う工程
を含む核酸の検出方法であって、
前記核酸合成の産物の検出は、前記工程（ｆ）の後、又は前記工程（ｆ）と同時に行い、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されている、核酸の検出方法。 - （ａ’）核酸を含む溶液を、
前記核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、前記第２の部分に標識物質により標識されている前記検出プローブが予めハイブリダイズされた捕捉プローブが固定された固相に、接触させる工程、
（ｂ’）前記第１の部分に前記核酸をハイブリダイズさせ、前記固相上に核酸―検出プローブ−捕捉プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記第１の部分に前記核酸がハイブリダイズされ、前記第２の部分に前記検出プローブがハイブリダイズされた状態で、前記核酸と前記検出プローブとをライゲーションさせる工程、
（ｄ）前記核酸とライゲーションされていない前記検出プローブと、前記捕捉プローブとの間の結合を解消させる工程、
（ｅ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の標識物質を検出する工程、及び
（ｆ）前記固相上に形成され、前記核酸と前記検出プローブとがライゲーションされている核酸−検出プローブ−捕捉プローブ複合体中の該核酸を鋳型にした核酸合成を行う工程
を含む核酸の検出方法であって、
前記核酸合成の産物の検出を、前記工程（ｆ）の後、又は前記工程（ｆ）と同時に行い、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されている、核酸の検出方法。 - 前記ウェルは、円柱状に形成され、その直径が０．１μｍ〜１ｍｍである、請求項１又は２に記載の核酸の検出方法。
- 前記ウェルは、基板と基板上に設けられたスペーサーとにより形成され、前記スペーサーが遮光性の材料で構成されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記工程（ｄ）は、前記核酸と捕捉プローブ及び前記検出プローブと前記捕捉プローブの間のハイブリダイゼーションを解消可能な条件下に、前記捕捉プローブをおくことにより実施される請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記工程（ｃ）において、前記核酸と前記捕捉プローブとを連結させる請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記核酸と前記捕捉プローブとの連結は、前記核酸と前記ステム部の末端とのライゲーションによるものである請求項６に記載の核酸の検出方法。
- 前記ステム部がループ構造を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記第１の部分と前記第２の部分とが隣接して配置された請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記第１の部分は、前記第２の部分と前記ステム部との間に位置する請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記第２の部分の配列が互いに異なる第１の捕捉プローブ及び第２の捕捉プローブを含む複数種類の捕捉プローブを用いる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 互いに異なる種類又は異なる量の標識物質により標識されている第１の検出プローブ及び第２の検出プローブを含む複数種類の検出プローブを用いる請求項１１に記載の核酸の検出方法。
- 前記標識物質は、前記第２の部分の配列と対応づけられている請求項１１又は１２に記載の核酸の検出方法。
- 前記第１の部分及び前記第２の部分はＤＮＡから構成されており、前記検出プローブはＲＮＡから構成されており、前記核酸と前記検出プローブの末端とがＴ４ ＤＮＡリガーゼによりライゲーションされる請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記核酸は、ｍｉＲＮＡである請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 前記捕捉プローブ及び／又は前記検出プローブは、２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ ＲＮＡ、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）及びＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）からなる群から選ばれる１種以上の化合物を含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
- 捕捉プローブ及び検出プローブを備え、
前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、
前記検出プローブは、標識物質により標識され、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されている、核酸検出キット。 - 前記ウェルは、円柱状に形成され、その直径が０．１μｍ〜１ｍｍである、請求項１７に記載の核酸検出キット。
- 前記ウェルは、基板と基板上に設けられたスペーサーとにより形成され、前記スペーサーが遮光性の材料で構成されている、請求項１７又は１８に記載の核酸検出キット。
- 捕捉プローブが固定化されてなる固相を有する核酸検出部を備え、
前記捕捉プローブは、検出対象の核酸とハイブリダイズし得る配列からなる第１の部分と、標識物質により標識されている検出プローブとハイブリダイズし得る配列からなる第２の部分と、二本鎖を形成するステム部と、を有し、
前記捕捉プローブは、複数集合して検出装置のウェル内に固定されている、流体デバイス。 - 前記ウェルは、円柱状に形成され、その直径が０．１μｍ〜１ｍｍである、請求項２０に記載の流体デバイス。
- 前記ウェルは、基板と基板上に設けられたスペーサーとにより形成され、前記スペーサーが遮光性の材料で構成されている、請求項２０又は２１に記載の流体デバイス。
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