WO2013151465A1 - Комплекс логического элемента на основе биомолекул (варианты) - Google Patents

Комплекс логического элемента на основе биомолекул (варианты) Download PDF

Info

Publication number
WO2013151465A1
WO2013151465A1 PCT/RU2013/000269 RU2013000269W WO2013151465A1 WO 2013151465 A1 WO2013151465 A1 WO 2013151465A1 RU 2013000269 W RU2013000269 W RU 2013000269W WO 2013151465 A1 WO2013151465 A1 WO 2013151465A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
agent
label
binding
element complex
logic element
Prior art date
Application number
PCT/RU2013/000269
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2013151465A9 (ru
Inventor
Максим Петрович НИКИТИН
Original Assignee
Nikitin Maxim Petrovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nikitin Maxim Petrovich filed Critical Nikitin Maxim Petrovich
Priority to US14/389,993 priority Critical patent/US20160144051A1/en
Priority to EP13772828.3A priority patent/EP2851850A4/en
Publication of WO2013151465A1 publication Critical patent/WO2013151465A1/ru
Publication of WO2013151465A9 publication Critical patent/WO2013151465A9/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06N—COMPUTING ARRANGEMENTS BASED ON SPECIFIC COMPUTATIONAL MODELS
    • G06N3/00—Computing arrangements based on biological models
    • G06N3/002—Biomolecular computers, i.e. using biomolecules, proteins, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y10/00—Nanotechnology for information processing, storage or transmission, e.g. quantum computing or single electron logic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the invention relates to the field of logical elements, namely, logical elements based on biomolecules.
  • the invention allows the conversion of input signals to output action according to a given logical function. So, depending on the output effect, the proposed logical element complex can be used both for computational purposes and for various biomedical applications, for example, for the diagnosis or therapy of diseases, targeted delivery of substances to target cells, etc.
  • Biological computing systems are of great interest, both for computer technology, and for various fields of medicine and biology. From the point of view of computer technology, the efficiency of biological computer systems can be higher compared to traditional computer systems due to the possibility of implementing not only binary, but also multi-valued logic (for example, if a variable is an oligonucleotide consisting of 20 bases, then its polysemy may reach 4 20 , which corresponds to about 10 12 digits).
  • a computing system capable of handling these oligonucleotides in the same solution is essentially a quantum computer. At the moment, computing systems based on oligonucleotides are just beginning to develop. In other areas, such as medicine, computing systems of a different kind are required.
  • Biological computing systems exist that are capable of performing the aforementioned functions under the sole condition of a single “input signal,” for example, “kill a cell if it carries a certain marker on its surface” (for example, such a system could be an antibody with a radioactive isotope).
  • a single “input signal” for example, “kill a cell if it carries a certain marker on its surface”
  • there are systems that perceive two effects as input parameters for example, “kill a cell if the medium has a low pH and the cell carries a certain marker on its surface”.
  • such multi-input systems cannot be easily rearranged to perform any given function of the values of variables.
  • the logical element is a set of oligonucleotides in which logical operations are performed on input oligonucleotides due to branch migration of DNA as part of a logical element.
  • the logical element is a set of oligonucleotides in which logical operations are performed on input oligonucleotides due to branch migration of DNA as part of a logical element.
  • oligonucleotides or their variants can be used as input elements. This approach is not applicable to molecules of a different nature, for example, carbohydrates, proteins, low molecular weight organic compounds, etc.
  • the output signal can only be the release of the oligonucleotide from the complex of the logical element.
  • Enzymes are used as the basis of the logical element, the set of which is very limited.
  • the required technical result consists in creating a logic element for which the set of input signals and output actions could be practically unlimited and such signals and effects could be diverse in nature, and in addition, it would be possible to implement a wide range of logical functions over the same input signals.
  • a logic element complex is proposed that converts input signals to output action according to a given logical function, consisting of at least
  • a logic element complex in which said output action is produced by said blockable label of said agent depending on direct or indirect interaction of said blockable label with an object, said output effect being different from binding agents to each other.
  • the complex logic element in which the lockable label is an enzyme.
  • the logical element complex in which, after binding the said molecule or particle to the said blocking label of the said agent, the main part of the unbound said molecules or particles is removed (separated), and the said output action is mainly due to the said molecules or particles bound to the said agent .
  • a complex of a logical element in which the process of producing said output action involves specific binding to said blocking label directly or indirectly of at least one molecule or particle immobilized on an additional solid phase (immunochromatographic test strip, plastic plate, etc.), for which a liquid medium containing said logic element complex is passed through said solid phase or incubated in contact with it, and said output in action defined by the number associated with said additional solid phase agents.
  • additional solid phase immunochromatographic test strip, plastic plate, etc.
  • a logical element complex in which said output action allows the diagnosis of a disease or condition of a subject in vivo.
  • the blocked label is a receptor (an antibody to a marker on a cell membrane, a nuclear localization signal peptide, etc.) for targeted delivery of a substance to a necessary area of an organism, a cell, etc.
  • the complex of a logical element in which, in which the output effect is to create molecules to improve the health of the subject or to diagnose his condition is a receptor (an antibody to a marker on a cell membrane, a nuclear localization signal peptide, etc.) for targeted delivery of a substance to a necessary area of an organism, a cell, etc.
  • the complex of a logical element in which, in which the output effect is to create molecules to improve the health of the subject or to diagnose his condition.
  • a logical element complex designed to be administered to a subject (intravenously, subcutaneously, etc.) for treating a disease or diagnosing a condition.
  • the complex of the logical element in which the output is to deliver the substance to the target cells.
  • a logical element complex in which said output action is performed by said blockable label of said agent depending on direct or indirect interaction of said blockable label with an object, which does not lead to specific binding of two agents.
  • a complex of a logical element in which said output action is performed by said blockable label of said agent depending on direct or indirect interaction of said blockable label with an object, said object being selected different from the agent and not similar to the agent, and the creation of said output effect is essential the number of interactions "blockable label-mentioned object" affects, and does not significantly affect whether several objects interact with each mentioned object only agents or only one.
  • the agent may be any molecule, nano- or micro-particle, or surface of a solid phase with which other molecules can be combined in any way. So, for example, it can be a protein molecule, a glycoprotein, a nano- or micro-particle - magnetic, gold, polymer, crystalline, protein, etc.
  • a surface of the solid phase any standard surface used in laboratory practice can be used, for example, plastic plates for enzyme immunoassay or immunochromatographic test strips, or plastic tubes.
  • the input signal affecting the binding of the blocking substance and the binding receptor 1 of the agent may be different in nature effects. In addition, in one embodiment of the invention, the same effects can affect similar bonds of the blocked label and the binding receptor 2 of the agent.
  • the input signal is a pH or temperature value
  • various labile bonds can be broken at different pH or temperatures, while again it makes more sense to talk about the value of the variable related to the connection, and not the effect.
  • pH and temperature have only one dimension of the parameter, in contrast to electromagnetic radiation, which, as indicated above, has two parameters - intensity and frequency. Based on this, variables corresponding to relationships will not be linearly independent. Moreover, in certain cases it is more convenient to consider the pH and temperature not as a binary variable, but as a multi-valued one.
  • the ligand or receptor within the framework of this description, can be considered both the first part and the second, that is, for example, the ligand can be an antibody, and the receptor is an antigen to the aforementioned antibody, the ligand can be a lectin, and the receptor to it - appropriate carbohydrate, etc.
  • ligand is meant a ligand itself as a for convenience of description, and its analogs, t. e., any molecule or molecular complexes, and particles of which are homologous ligand, including molecular complexes.
  • the term “ligand receptor” includes the concept of a ligand analog receptor.
  • the ligand of the binding receptor 1 can act as an input signal, competing with the blocking substance for binding to the binding receptor 1 (in the format of either displacing the blocking substance from the binding to the binding receptor 1, or inhibiting the binding receptor 1 or blocking substance, so that the blocking substance could not contact the binding receptor 1) or by binding the blocking substance to the binding receptor 1.
  • the input signal may not coincide with the ligand (or its analogue) or binding receptor 1, for example, if the binding receptor 1 is nickel-nitrilotriacetic acid (or nickel pro-ion coordinatively bound to the agent), and the blocking substance binds with it due to the polyhistidine tag, the input signal may be, for example, nickel ion or ethylenediaminetetraacetic acid, which displaces the blocking substance from the bond with the binding receptor 1.
  • said input signal can destroy, inhibit, or mediate not only the binding of the binding receptor 1 of the agent to the blocking substance, but also the binding of the binding of the binding receptor 2 of the agent to the blocking label, as described above. It should be noted that in the description below, sometimes for convenience of presentation, only binding of the binding receptor 1 to a blocking substance will be mentioned, however, where appropriate, the above may also apply to binding of the binding receptor 2 to a blocked label.
  • a blockable label can be any atom, molecule or particle whose spatial or spatial-electrostatic blocking modifies the output.
  • An example of a blocked tag is any detectable tag: fluorescent (including atomic or ionic), radioactive, magnetic, with surface plasmon resonance, etc.
  • fluorescent tag its spatial blockage may consist in the inability of the fluorescence quencher to come close enough to a fluorophore to extinguish it, or, conversely, a blocked tag can be a fluorescence quencher, and its blocking may be the inability of the fluorophore to approach the quencher.
  • the blocked label can be one fluorophore (or a receptor labeled with such a fluorophore) from a pair of fluorophores between which Förster resonance energy transfer is possible.
  • the blocking will consist in the impossibility of the components of this pair to approach each other.
  • it may be an enzyme whose action can be detected.
  • it can be an enzyme, as a result of which the unpainted substrate turns into a colored product or the non-fluorescent substrate into a fluorescent product.
  • it can also be an enzyme that triggers a cascade reaction, for example, its substrate is the zymogenic form of another enzyme, which, when activated, already produces a detectable signal as a result of its work, etc.
  • the blocked label can be any receptor capable of binding to another molecule, such that the fact of binding to this molecule can be recorded.
  • said molecule may be one of the aforementioned detectable labels.
  • this molecule may be immobilized on any surface or particle (for example, on a plastic tablet or immunochromatographic test strip), while the detection of the binding of the said molecule and the blocked label occurs due to the marker associated with the blocked label.
  • a marker may be, for example, a colored polymer particle, a magnetic or gold particle.
  • a convenient marker can also be, for example, an enzyme or fluorescent label.
  • the role of such a marker can be performed by, but not limited to, the agent or the molecules on the agent, or molecules in the agent).
  • the lockable label may be several labels of a different nature, for example, from those mentioned above.
  • the combined signal from different labels can change the parameters of the output action, for example, increasing the sensitivity or expanding the dynamic working range of the input signal.
  • the above examples are given only to illustrate the possible nature of the lockable label, and not to limit the options for the lockable label.
  • the output can be any detectable signal generated by an unblocked lockable label, and not generated (or created to a lesser extent) by a blocked lockable label, it can be detected qualitatively (yes / no) or quantified, and then correlated with the value of the logical function . Detection can be carried out by any known method: optical measuring instruments, magnetic, electrochemical, etc.
  • the output can be determined by the interaction of the blocked label with a ligand immobilized on a solid phase, for example, on an immunochromatographic strip or enzyme-linked immunosorbent assay plate.
  • a test strip as in the standard immunochromatography method
  • incubated in a tablet after adding input signals to the logic element complex and waiting for the necessary time for the logic element to operate, the mixture containing the logic element complex is passed through a test strip (as in the standard immunochromatography method) or incubated in a tablet.
  • a signal proportional to the number of agents retained on the solid phase i.e., agents that interacted with the immobilized ligand
  • any known method either by the optical signal of a complex of a logical element, or by a magnetic signal, or is biochemically manifested (for example, by means of an enzymatic reaction ) due to other receptors carried by the agent.
  • the blocked label binds to the agent via the binding receptor 2 of the agent depending on the input signal, and also when it is associated with an agent without binding receptor 2, the output interaction may lead to aggregation of the agents.
  • aggregation of agents can be detected by any standard methods.
  • Another option is implemented in the following way: at least two agents are used, the lockable label of one agent being complementary to the lockable label of the second agent.
  • particle aggregation can be measured by any known method: for example, turbodimetrically, by changing the characteristics of plasmon resonance in the case of using gold nanoparticles as the basis for one or both particles, by changing the NMR signal in the case of using magnetic particles as the basis for one or for both particles and in other ways.
  • the output effect will be determined by the ability of said fluorescein-labeled protein to contact the agent and produce a fluorescent signal, for example, after washing molecules of the protein that are not bound to the agent, and not due to aggregation of agents, although in this case it is possible insignificant aggregation of agents leading to insignificant quenching of fluorescence.
  • said exit effect is produced by said blockable label of said agent depending on direct or indirect interaction of said blockable label with an object, said exit effect being different from binding the agents to each other.
  • said exit effect is produced by said blockable label of said agent depending on direct or indirect interaction of said blockable label either with the surface of the solid phase (including the surface of the cell) or with an object producing said exit effect or changing the output effect produced by a lockable label, said object different from the agent or an agent similar to the agent.
  • nonspecific aggregation of agents can and does occur almost in any case - in the presence of input signals or their absence, therefore there are no processes that are absolutely not affected by the aggregation of certain substances involved in the process.
  • the specific aggregation of agents due to the addition of several agents to one BSA molecule can change the fluorescence signal due to, for example, quenching of fluorescence.
  • fluorescence quenching will only slightly affect the signal.
  • the said object producing the output action can be a detectable label (fluorescent, magnetic, having surface plasmon resonance) directly producing the output effect in the form of a detectable signal, in addition, it can be, for example, an enzyme tag producing fluorescent molecules from non-fluorescent ones etc.
  • the output should be produced by the said object, and not be due to interaction with the agent.
  • said object in cases where the said object changes the output effect produced by the blocked label, said object can be, for example, a fluorescence quencher of the blocked label or an inhibitor of the enzyme blocked label.
  • the output effect should be determined precisely by the blocked label, and not by the agent (unlike the case of media aggregation determination), and the requirement for the said object to be different from the agent or an analogue similar to the agent means that the change in the output effect can be achieved only through interaction mentioned object with a lockable label regardless of the interaction of agents with each other.
  • an analogue similar to an agent means an analogue arranged like an agent, but having other binding receptors, other blocked labels, or other corresponding blocking substances.
  • the agents themselves when the blocked label is bound to the surface of the solid phase, the agents themselves can produce an output effect, for example, due to the fact that they can be registered (if, for example, they are colored latex particles or gold, magnetic particles, or other labels are associated with them, for example, enzymatic) or can be, for example, cytotoxic upon delivery to the cell, while the specific binding of agents to the solid phase (including the cell surface) is not as such is their aggregation. Although a large number of particles combines with a single solid phase, this interaction should be attributed to a specific
  • said exit effect is produced by said blockable label of said agent depending on direct or indirect interaction of said blockable label with other molecules or particles or solid phase surfaces that do not include those on other agents that are identical or similar to said agent, that is, having other blocked labels and / or binding receptors and / or their corresponding blocking substances.
  • the output action may consist in the production, modification, and removal from the medium (in the sense of transformation into other molecules or sorption) of any molecules.
  • the blocked label is an enzyme, then, interacting with its substrate, it can either modify it or split it, etc.
  • the blocked label can be a substrate, interacting with which, the enzyme will produce or excrete other molecules from the environment.
  • a blocked label may be a single-stranded oligonucleotide.
  • access to a DNA polymerase for example, immobilized on a nanoparticle
  • PCR polymerase chain reaction
  • a blocking substance and an agent for spatial or spatially electrostatic blocking that exceed the sizes of the receptors used in the system, as well as due to the spatial diversity of the binding receptor and the blockable label on the agent, it is possible to use them as blockable labels, including including enzymes capable of degrading receptors by which a blocking substance binds to an agent.
  • an agent that carries, for example, a protein receptor and a blocked label, which is a protease the protease has practically no opportunity to degrade the receptor on other agents due to the limited diffusion, as well as degrees of freedom, i.e. the possibility of the correct spatial orientation of the receptor relative to the protease for its degradation.
  • the first is an antitumor antibody that has specificity for tumor markers on the cell membrane, for example, the commercial antibody trastuzumab
  • the second binding receptor is a receptor for a non-toxic low molecular weight compound (input signal) - for example
  • concanavalin A is a receptor for glucose.
  • a blocking substance a nanoparticle representing a cross-linked protein recognized by concanavalin A can be used. It can be a protein of non-animal origin, for example, horseradish peroxidase, but it is preferable to use a protein from the type for which a therapeutic or diagnostic agent is being created.
  • a significant advantage will be the use as a basis of the blocking component of the protein isolated from the blood directly of the organism for which the agent is created. This eliminates the immunogenicity of the administered agent and minimizes opsonization. In addition, in the case of using a strongly sialylated blocking substance, it becomes possible to reliably mask the agent from the organs of the reticuloendothelial system, which remove foreign particles from the bloodstream.
  • an assembled agent or a logical element complex By mixing MF conjugated with the aforementioned receptors with a blocking substance, an assembled agent or a logical element complex will be obtained, which can be separated from the blocking substance that has not bound to MH conjugates. However, without removing the unbound component, the efficiency of agent delivery to the tumor can be improved.
  • a free blocking substance is introduced into the bloodstream (it is possible to introduce a blocking substance even some time before the logical element complex itself), the filtering systems of the body (for example, Kupffer cells) will be overloaded with filtering of the free blocking substance and, when the logical element complex is introduced, it will be more slowly removed from the bloodstream , which will increase the time for recognition by a blocked tag of its target.
  • the blocked label When a logical element complex is introduced into the human body, the blocked label will not be immediately exposed on the surface of the agent. This avoids the possibility of opsonization of a foreign blocked label on the agent and allows masking the surface of the particle with the protein of the organism itself, which also leads to a decrease in opsonization.
  • the level of the input signal in this example glucose. This can be done by direct injection of glucose into the bloodstream or orally, i.e. allowing the patient to eat glucose if the pharmacokinetic parameters of the logical element complex allow it, i.e. if it circulates long enough to absorb glucose in the stomach.
  • the higher the glucose level the faster the dissociation of the blocking substance from the MF and the exposure of the blocked label, in this case, the antibody capable of recognizing the tumor marker on the cancer cell, and thus deliver the MF to the target cell.
  • this type of particle delivery it becomes possible to distribute the particles evenly through the bloodstream, while they are protected by the body protein from opsonization and immune response, and then “turn on” their recognizing component.
  • the input signal can be selected in such a way that it will not need to be introduced additionally into the bloodstream, and its concentration in the area where the agent must be delivered will be increased.
  • concentration of chemoattractants is increased to attract neutrophils and monocytes or the pH is lower in the tumor area, etc.
  • this complex logic element can be composed in multilayer. So, for example, as a first “layer” on the MF, a blockable label and a 1 A binding receptor associated with a blocking substance A that blocks the blockable label A can be immobilized. Such a nanoparticle can be the basis of the second “layer”. For example, on said blockable substance a, a blockable label B and a binding receptor 1 B bound to a blocking substance B are immobilized, which blocks a blockable label B, etc.
  • the blocking label mentioned can be not only a receptor for targeted delivery, but also, for example, an enzyme whose interaction with its substrate is blocked by a blocking substance, or a fluorescent label that is blocked from interacting with a fluorescence quencher with a blocking substance, or, conversely, a blocking label can be a quencher fluorescence, the interaction of which with a fluorophore sterically interferes with a blocking substance.
  • the blocked label is an enzyme, for example, ricin (or the ricin chain a)
  • its cytotoxicity determined by the cleavage of glycosidic bonds in the ribosome, which blocks protein synthesis, can be spatially blocked by a blocking substance, which sterically prevents the large ribosome from approaching ricin on the agent. If the blocking substance dissociates from the agent, then ricin “turns on” and kills the target cell.
  • chain B when using ricin, which consists of the enzyme part (chain A) and the lectin part (chain B), which is responsible for the penetration of ricin into the cytosol of the cell and binds to galactose and N-acetylgalactosamine residues, chain B can be used directly as a binding receptor ricin itself, and as a blocking component - a particle that carries the remains of galactose and ⁇ -acetylgalactosamine.
  • a blocking substance can be any other molecule or particle capable of binding to the binding receptor 1 of the agent using the input signal or by itself (in this case, the dependence of the connection of the blocking substance and the agent on the input signal will be determined by the fact that the input the signal can destroy this connection).
  • a blocking substance can be created by cross-linking the receptor to the input signal or cross-linking the molecules of the input signal or its analogue, as well as by cross-linking the carrier molecule, which carries molecule of the input signal (in the case of a low molecular weight input signal).
  • the carrier molecule can naturally carry this input signal, for example, in the case of horseradish peroxidase glycoprotein.
  • the input signal can be immobilized on a carrier molecule artificially, for example, by chemical conjugation, for example, as is customary for immobilizing haptens on a carrier protein to immunize animals and generate antibodies against this hapten.
  • the input signal or its receptor can be conjugated to a particle formed by cross-linking another molecule. Cross-linking can be done by various known methods, for example, homobifunctional cross-linkers (glutaraldehyde, etc.), or heterobifunctional.
  • the attachment of the blocking substance to the agent is single-point or multi-point.
  • the case of multipoint binding compares favorably with the fact that it is possible to use low affinity receptors for the input signal or receptors with a high dissociation rate of the complex with the input signal.
  • the sensitivity of the logic element and its speed will be higher than in the case of high affinity receptors in the case of adding an input signal to the already assembled particle-blocking substance complex.
  • Due to the high rate of pair dissociation a receptor-epitope of a blocking substance it is more likely that the blocking substance will be displaced from the interaction by adding lower concentrations of a free detectable input signal.
  • the bond between the particle and the blocking substance will be strong in the absence of a free input signal. This case is convenient when the operating time of a logical element is critical.
  • the blocking substance can interact with the agent not only through interaction through the binding receptor 1.
  • the blocking substance can interact with the agent not only through interaction through the binding receptor 1.
  • the blocking substance for example, when displaced by a free molecular input signal, is disconnected from the binding receptor 1 on the agent, and moves to a distance determined by the length of the said linker, thereby unlocking the blocked label for creating an output effect.
  • the molecules of the input signal dissociate from the binding receptor 1 on the agent, to which the blocking substance can now again connect and block the blocked label, and therefore stop the output action.
  • Various molecules can be such a linker, however, it is preferable to use hydrophilic polymers (polyethylene glycol, dextran, etc.) that do not interfere, but rather stimulate, the removal of the blocking substance from the agent until they are connected through the binding receptor 1 on the agent.
  • a blocking substance can not bind to the binding receptor 1 on the agent directly, but through a set of molecules interacting with each other, for example, if mouse antibodies against the molecular input signal are used as binding receptor 1, biotinylated may be added first an input signal (or a biotinylated analogue of an input signal to which the aforementioned antibody has a lower affinity so that when added, the input signal easily displaces the aforementioned biotinylated ALOGIA) and then blocking substance bearing a (strept) avidin. This, for example, may allow the use of only one type of blocking substance for many input signals.
  • a multilayer blocking can be used, for example, in the above case with a streptavidin blocking substance, a second blocking substance carrying rat anti-streptavidin antibodies and a third blocking substance carrying rabbit anti-rats can be used antibodies, etc. It is clear that through the use of such multi-layer blocking, the degree of blocking can be multiplied.
  • nonspecific binding of the blocking substance to the agent leads to a decrease in the signal, and not to its increase, which does not lead to a deterioration in sensitivity to the input signal.
  • nonspecific binding of the agents to the solid phase, mediated by a blocking substance nonspecifically associated with the agent will generally not occur, because basically, a free blocking substance, usually present in the mixture in a substantially larger amount than the amount of agents, will bind non-specifically to the solid phase.
  • the sensitivity of the method to the input signal can be shifted to the desired range, for example, concentration (in the case of a molecular input signal) by adjusting the density of, as a rule, binding receptors (1 or 2) on the agent, although the option of regulating the density of the blocked label on the agent is also feasible.
  • concentration in the case of a molecular input signal
  • binding receptors 1 or 2
  • the option of regulating the density of the blocked label on the agent is also feasible.
  • the following option is possible.
  • the corresponding blocking substance when adding a small number of molecules of the input signal and inhibiting at least one binding receptor 1 on the agent, the corresponding blocking substance will not be able to attach to the agent in this place, due to which the blocked labels that could, for example, remain unblocked in this place of the agent contact a complementary ligand immobilized on an immunochromatographic test strip.
  • the ability to prevent the binding of the blocking substance with the agent in a specific location of the agent will require more molecules of the input signal, firstly, due to the higher concentration of binding receptors, and secondly, because of the possibility multipoint binding of a blocking substance and an agent.
  • the density of the blocking labels on the agent or the number of binding receptors 2 that are able to bind the blocking labels determines the complexity of completely blocking the blocking labels connected to the agent, which also affects the sensitivity of the logic element complex with respect to the input signal.
  • binding receptor 1 and binding receptor 2 or blockable label on the agent are separated in space, the more complicated the spatial or spatial electrostatic lock the lockable label.
  • the molecular input signal itself is chosen as the blocking substance, the method is limited by the possibility of using extremely large input signals.
  • the blockable labels can be blocked substantially removed from the binding receptors, and the removal may be on the order of the size of the blocking substance.
  • the blocking substance can be significantly larger than any molecular receptors - up to several tens of microns or more, this invention is in no way limited by the size of the molecules of the input signals or the spatial diversity of the binding receptor 1 and binding receptor 2 (or blocked label) .
  • the change in output effect depends on the binding or non-binding of the blocking substance to the agent.
  • the input signal can affect the formation or destruction of the connection of the blocking substance and the agent in various ways. So, for example, the binding of a blocking substance to a binding receptor on an agent can occur, including the following two methods.
  • the aforementioned connection can be achieved by recognition by the receptor 1 of the molecules of the input signal on the blocking substance or by recognition of the molecules of the input signal on another molecule with which the blocking substance is directly or indirectly bound.
  • the input signal competes for binding with the aforementioned binding receptor 1, due to which the amount of the blocking substance bound to the agent depends on the amount of the input signal.
  • the second option is implemented differently.
  • Spatial or electrostatic-spatial blocking of a blocked label the difficulty of a blocked label to interact directly or indirectly with certain other molecules due to steric and / or electrostatic factors.
  • the aforementioned certain molecules cannot approach the blocked label, due to which “blocking” occurs.
  • the impossibility of approaching may be due to both the volume of the blocking substance and its strong charge.
  • the said molecules will repel from the blocking substance and will not come close to the blocking label.
  • the mentioned molecules can be attracted to the blocked substance, due to which their interaction with the blocked label will compete with the attraction to the blocked substance, and, therefore, an effective "blocking" will be observed.
  • an improvement in blocking can be achieved in the following way, if the blocking substance has, among other things, a weak affinity for the blockable label, then compared to the case when there is no such affinity, a significantly stronger blocking can be achieved in the absence of an input signal and a slightly changed residual blocking in the presence of an input signal and said molecules interacting with a blockable label. Because all reversible biochemical reaction reactions imply the presence of both bound and free molecules, and then all the concepts used above such as “blocking,” “impossibility of approaching,” etc. meaning in their statistical sense, i.e. for example, one can talk about blocking even if not all blocked tags are “blocked”, it is only important that in the case of locking “blocked tags” more than “not blocked”.
  • the examples cited in this description assume that the lockable label should be the same for the agents mentioned. However, this is not necessary - the lockable labels can be different, however, it should be understood that the concept of the value of a logical function should then be taken in a different sense, for example, that it is equal to unity (true) if at least one locked label produces the corresponding output impact. So, for example, it is convenient to use different oligonucleotides as such a set of different blockable labels due to the large variety of specifically interacting pairs. At the same time, it is possible not only to obtain integral information about the value of the function of the complex of the logical element, but also detailed information about the status of each agent as part of the complex of the logical element.
  • the location of the binding receptor 1 on such an agent is advantageous from the point of view that in order to prevent blocking of blocked labels by the blocking substance, a small amount of the input signal is necessary, in contrast to the case when the agent contains, for example, the input signal molecules and the receptors They are located on a blocking substance, because in the latter case, the blocking substance itself and the receptors to the input signal on them should be substantially larger than the molecules of the input signal on the agent.
  • the blocking substance can bind to the binding receptor 1 in various indirect ways, for example, it can interact with a chain of molecules or particles, one of which carries or consists of molecules of the input signal, or the blocking substance can carry or consist of receptor to the molecules of the input signal, then the molecules of the input signal bind to the binding receptor 1 (also a receptor to the molecules of the input signal) on the agent, and then to the associated molecules of the input signal said blocking substance is referred to.
  • various other molecules for example, biotin-streptavidin, etc., can participate in the chain of bonds between the agent and the blocking substance.
  • an agent that carries a binding receptor 1 and a blockable label.
  • binding receptor 1 and blocked labels are not directly connected, they do not block and do not interfere with each other's activity. That is, for example, when a large number of fluorophores are conjugated with an antibody (i.e., if a blocked label, a fluorophore is directly conjugated to binding receptor 1, an antibody), the antibody is insolubilized due to the fact that most of the fluorophores used are poorly soluble in water .
  • the aforementioned spatial separation of the binding receptor 1 and the blocked label, as well as the use of the blocking substance (and not the input signal molecules themselves) for the spatial blocking of the blocked tags makes it possible to use molecules of almost any size as a binding receptor 1 and a blocked label - up to several micrometers or more.
  • the effectiveness of blocking will depend only on the number of binding receptors 1 on the agent. So, in the case of the presence of a minimum sufficient number of binding receptors 1 for the formation of a "complete blocking layer" all blocked labels on the carrier will be blocked. In the case of a direct connection (for example, conjugation) of binding receptors 1 and a blocked label, the effectiveness of blocking significantly depends on the quantitative ratio of these substances. Moreover, with a larger number of binding receptors 1, the blocking efficiency is higher, but the output from the blocked labels is weaker, which imposes significant restrictions on the applicability of the invention.
  • the said agent allows itself to be used as a solid phase, i.e., it provides easy separation (for example, if the agent is a magnetic nano- or microparticle) and other advantages of using nano- and microparticles as a solid phase.
  • any input signal affecting the binding of the blocking substance and the agent does not affect the connection of the blocked label and the agent, and vice versa, any input signal affecting the connection of the blocked label and the agent does not affect the connection of the blocking substance and the agent.
  • the output effect of the CLE can be expressed, for example, by the product including molecules identical or similar to the input signal of the given CLE, due to which the CLE corresponding to the nonlinear CLE, the input signal amplifier will be realized.
  • the output effect of the CLE can be expressed, for example, by the product of including molecules that inhibit, neutralize, or transform the input signal of this CLE, due to which the CLE corresponding to the nonlinear CLE, the quencher of the input signal will be realized.
  • each CLE can have many different outputs in the sense that the “on” state can be expressed by the output action, which consists in the product of several different molecules or other effects. Moreover, each produced molecule or effect can be an input signal for another or the same CLE.
  • one and the same CLE can “include” the product of various molecules (or other output actions) with a quantitatively different unlocked TM of a blocked tag. So, for example, if the product of the mentioned molecules occurs due to blocked enzyme labels, and the process of the product of the said molecules consists in the degradation of their substrates by these enzymes. Moreover, for different enzymes (for example, glucosidase and DNase), the sizes of substrates can be significantly different.
  • Figure 1 The complex of the logical element for the implementation of the logical function VALUE OF VARIABLE.
  • Fig.Z The complex of the Logical Element for the implementation of the logical function (A & B & C & (NOT i) & (HE ii) & (HE iii)) from the variables A, B, C, I, and, iii.
  • VALUE OF THE VARIABLE The implementation of the function “VALUE OF THE VARIABLE” is carried out by the CLE (Fig. 1), in which a blocking substance is connected to the binding receptor 1 of the agent, which carries the binding receptor 1 and the blocking label, and the connection between the blocking substance and the agent depends on the input signal. If the input signal is capable of breaking the mentioned connection, then with the help of this CLE the logical function “VALUE OF VARIABLE” is realized. Indeed, if the input signal breaks the mentioned connection, then the blocked label on the agent is unlocked and the output action is performed.
  • the function conjunction of the values of the variables (A and B) is implemented by the CLE, in which the agent carries at the same time a set of binding receptors for all input signals, while the blocking substance is bound or able to bind to all of the mentioned binders receptors.
  • the input signals destroy the corresponding bonds of the binding receptor and the blocking substance, then in the absence of at least one input signal, the binding of the agent and the blocking substance will not be disturbed, while the blocked label will be blocked.
  • the disjunction function of the values of the variables (A OR B) is realized by the LE, which includes different agents for each input signal, and all agents carry the same blocked label and each of them carries a binding receptor 1 corresponding to only one input signal, when at least one blocking substance or a set of blocking substances is associated with each binding receptor 1 of the agent, such that at least one blocking substance can bind to each binding receptor. Moreover, if the input signals destroy the corresponding bonds of the binding receptor 1 and the blocking substance, then only in the absence of all input signals the binding of the agents and the corresponding blocking substance will not be broken, and the blocked label on all agents will be blocked. Moreover, in the presence of at least one input signal, the blocked label on the corresponding agent will be unlocked and the output will be produced.
  • the disjunction function of negating the values of variables (“NOT A” or “NOT B”) is implemented by a CLE, in which the blocked labels are connected with the binding receptors of 2 agents by means of a set of parallel bonds that are destroyed by the input signals, and when the corresponding signal is broken by the input signal, the corresponding blocked the label dissociates from the agent.
  • a set of parallel connections is implemented as follows.
  • the binding receptor 2 of the agent is connected to a molecule 1 carrying a blocked label, so that their connection is broken by the input signal 1
  • the binding receptor 2 of an agent is connected to a molecule 2, bearing a blocked label, so their connection is broken by an input signal 2 , etc.
  • NOT A OR “NOT B”
  • CLE a CLE
  • identical blocked labels are connected with binding receptors 2 sets of different agents that uniquely correspond to input signals, through bonds destroyed by input signals, and upon destruction the input signal of the corresponding connection, the blocked label dissociates from the corresponding agent.
  • binding receptor 2 of agent 1 is associated with a molecule 1 that carries a blocked label, so that their connection is destroyed by the input signal 1; the binding receptor 2 of agent 2 is coupled to a molecule 2 carrying a blockable label, so that their bond is destroyed by the input signal 2, and the like.
  • Example 2 use input signals that mediate any connection.
  • VALUE OF VARIABLE is implemented by the CLE, in which the blocked label is connected to an agent that carries a binding receptor 2, but not an active blocked label, by an input signal connecting to the connecting receptor 2.
  • the agent begins to bear on itself an active lockable label capable of producing an output effect.
  • the “NOT” function is implemented by CLE, in which a blocking substance, spatially or spatially electrostatically blocking the blocking label, is attached to an agent that carries a binding receptor 1 and an active blocking label, so that it cannot produce an output effect.
  • NOT A disjunctioning the negation of variables
  • NOT B The function of disjunctioning the negation of variables
  • CLE which includes a set of agents that carry identical active blocking labels, and each of which carries a binding receptor 1 that uniquely corresponds to the input signal.
  • the CLE includes a set of blocking substances, such that for each input signal there is a blocking substance capable of contacting the binding receptor 1 of the corresponding agent via this input signal and blocking the blocked label on this agent.
  • all input signals must be present.
  • the function of disjunctioning the values of variables (A OR B) is realized by the CLE, in which the blocked labels are connected to the binding receptors of the agent 2 by a set of parallel bonds mediated by the input signals, and in the absence of any of the input signals, the corresponding blocked label cannot join the agent.
  • a set of parallel connections is implemented as follows.
  • the binding receptor 2 of the agent is associated with a molecule 1 carrying a blockable label, so that their binding is mediated by input signal 1
  • the binding the receptor 2 of the agent is associated with a molecule 2 carrying a blockable label, so that their connection is mediated by input signal 2, etc.
  • Example 4 Using the CLE of the implementation of a combination of logical functions in Example 3, the value of a variable, NOT and AND (i.e., the conjunction of variables and their negatives) for input signals that destroy the mentioned connections, almost any logical function is implemented. Indeed, any logical function can be represented as a perfect disjunctive normal form, i.e. disjunctions of conjunctions of variables and their negations. Moreover, to implement the logical function presented in this way, they use the CLE, which includes agents for all “conjunctions,” with identical lockable labels. At the same time, this CLE implements the disjunction of functions realized by these agents, i.e. if at least one of the CLE agents has an unblocked lockable label, then the output action is performed.
  • Example 5 Implementation of a CLE performing a logical function, which is a combination of logical functions VALUE OF A VARIABLE, NOT, AND (ie conjunction of variables and their negations), for input signals mediating communication is as follows.
  • a CLE consists, among other things, of an agent with which a blockable label is connected by means of connections that are mediated by those input signals that enter the aforementioned complex logical function as the value of a variable (and not its negation).
  • Example 6 Using the CLE of the implementation of a combination of logical functions in Example 6, the value of a variable, NOT and AND (i.e., the conjunction of variables and their negatives) for input signals mediating the mentioned connections, almost any logical function is implemented. Indeed, any logical function can be represented as a perfect disjunctive normal form, i.e. disjunctions of conjunctions of variables and their negations. Moreover, to implement the logical function presented in this way, they use the CLE, which includes agents for all “conjunctions,” with identical lockable labels. At the same time, this CLE implements the disjunction of functions realized by these agents, i.e. if at least one of the CLE agents has an unblocked lockable label, then the output action is performed.
  • input signals can be added both before and after mixing the mentioned agents.
  • the mentioned agents may not be mixed with each other, and the output action is considered to be produced if it was produced by at least one of the mentioned agents after adding the input signals.
  • the case of input signals mediating said connections is, as a rule, more demanding on the procedure for calculating the value of a logical function than the case of input signals destroying said connections. So, for example, for the implementation of CLE, it is preferable to add all the input signals to each agent separately, then add the blocked tags and blocking substances related to this agent, and then mix all the agents to obtain the final output effect.
  • the addition of blocked labels and blocking substances to the agent can be both before and after the addition of input signals.

Abstract

Изобретение относится к области логических элементов, а именно логических элементов на основе биомолекул. Сущность изобретения заключается в комплексе логического элемента, выполняющем преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции. В зависимости от выходного воздействия, предложенный комплекс логического элемента может быть использован как для вычислительных целей, так и для различных биомедицинских применений, например для диагностики или терапии заболеваний, направленной доставки вещества к клеткам-мишеням и т.п. Технический результат при использовании изобретения состоит в комплексе логического элемента, для которого множество входных сигналов и выходных воздействий может быть практически неограниченным и такие сигналы и воздействия могут быть разнообразными по своей природе, и кроме того, реализуется возможность осуществления большого диапазона логических функций над одними и теми же входными сигналами.

Description

Описание изобретения
Изобретение относится к области логических элементов, а именно логических элементов на основе биомолекул. Изобретение позволяет выполнять преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции. Так, в зависимости от выходного воздействия, предложенный комплекс логического элемента может быть использован как для вычислительных целей, так и для различных биомедицинских применений, например для диагностики или терапии заболеваний, направленной доставки вещества к клеткам-мишеням и т. п.
Биологические вычислительные системы представляют большой интерес, как для вычислительной техники, так и для различных областей медицины и биологии. С точки зрения вычислительной техники, эффективность биологических вычислительных систем может быть выше по сравнению с традиционными вычислительными системами за счет возможности реализации не только бинарной, но и многозначной логики (так, например, если переменной является олигонуклеотид, состоящий из 20 оснований, то его многозначность может достигать 420, что соответствует около 1012 разрядам). Кроме того, вычислительная система, способная оперировать с этими олигонуклеотидами, находящимися в одном растворе, по сути, является квантовым компьютером. На данный момент вычислительные системы на основе олигонуклеотидов только начинают развиваться. В других областях, таких как медицина, требуются вычислительные системы иного рода. Например, были бы чрезвычайно полезны системы, состоящие из вычислительного модуля, который бы регистрировал присутствие или отсутствие различных сигналов от окружающей среды, а также из действующего модуля, который, в зависимости от результата работы вычислительного модуля мог бы совершать то или иное биологически- осмысленное воздействие, например, убивать раковую клетку в организме. Такие системы требуют передачи информации между вычислительным и действующим модулями. Понятно, что чем больше спектр возможных сигналов вычислительной системы и больше спектр воздействий действующего модуля, тем лучше. Такие воздействия необязательно должны быть обусловлены присутствием каких- либо молекул - это может быть электромагнитное излучение (в т. ч. свет и низкочастотное поле), изменение рН, температура и т. д.
Существуют и широко распространены биологические вычислительные системы, способные выполнять вышеупомянутые функции при единственном условии относительно одного «входного сигнала», например «убить клетку, если она несет на своей поверхности определенный маркер» (например, такой системой может быть антитело с радиоактивным изотопом). Кроме того, существуют системы, которые воспринимают два воздействия в качестве входных параметров, например, «убить клетку, если в среде пониженный рН и клетка несет на своей поверхности определенный маркер». Однако такие многовходные системы не могут быть легко перестроены для выполнения любой заданной функции от значений переменных. Так, упомянутые системы не могут быть легко перестроены на выполнение отрицания входного сигнала или своего выходного воздействия: «убить клетку, если она НЕ несет на своей поверхности определенный маркер» или «НЕ убивать клетку, если она несет на своей поверхности определенный маркер» (хотя с точки зрения математической логики эти выражения тождественны, с биологической они могут отличаться,, т.к. убийство клетки носит статистически- количественный характер, а не бинарно-качественный - убить/не убить, и вышеупомянутые функции могут существенно различаться нелинейностью воздействия в зависимости от наличия маркера).
Известен способ (Патент США 7,745,594 В2, выдан 29 июня 2010 г.), в котором логический элемент представляет собой набор олигонуклеотидов, в котором логические операции совершаются над входными олигонуклеотидами за счет миграции ветви (branch migration) ДНК в составе логического элемента. С помощью различных комбинаций олигонуклеотидов различного строения реализуются различные логические функции.
Недостатки этого известного способа состоят в том, что:
1) В качестве входных элементов могут быть использованы только олигонуклеотиды или их варианты. Данный подход не применим к молекулам другой природы, например углеводам, белкам, низкомолекулярным органическим соединениям и т. п.
2) Время передачи сигнала чрезвычайно велико за счет низкой скорости вытеснения одним олигонуклеотидом другого.
3) Выходным сигналом может быть только высвобождение из комплекса логического элемента олигонуклеотида.
Известен способ (заявка на патент WO2011116151 (А2) от 22 сентября 2011 г.), в котором используют набор ферментов для проведения биокатализируемой реакции, представляющей собой логическую булеву функцию от полученных «входных» сигналов биомаркеров. При этом генерируется бинарный выходной сигнал, причем сигнал, равный единице означает наличие заболевания или травмы.
Недостатки этого известного способа состоят в том, что:
1) В качестве входных сигналов могут быть использованы только субстраты, кофакторы или продукты действия используемых ферментов. При этом количество комбинаций при использовании ферментов сильно ограничено.
2) В качестве основы логического элемента используют ферменты, множество которых весьма ограниченно.
Известен наиболее близкий к заявляемому способ (Nanoparticle Self-Assembly Gated by Logical Proteolytic Triggers, G. von Maltzahn, et al., J Am Chem Soc, 2009), в котором две частицы собираются друг с другом при разрывании ферментом связи между частицей и полиэтиленгликолем, маскирующим нейтравидин на одной частице и биотин на другой.
Недостатки этого известного способа состоят в том, что:
1) В качестве входных сигналов используются ферменты.
2) Связь между частицами и маскирующим полиэтиленгликолем ковалентная.
3) Возможна реализация только логических функций И, ИЛИ.
4) Выходной сигнал логического элемента ограничен состояниями агрегации частиц (значение логической функции - ИСТИНА) и их коллоидно-стабильным состоянием (значение функции - ЛОЖЬ).
Таким образом, требуемый технический результат состоит в создании логического элемента, для которого множество входных сигналов и выходных воздействий могло бы быть практически неограниченным и такие сигналы и воздействия могли бы быть разнообразными по своей природе, и кроме того, было бы возможна реализация большого диапазона логических функций над одними и теми же входными сигналами. Для достижения указанного технического результата предложен комплекс логического элемента, выполняющий преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции, состоящий, по крайней мере, из
A) агента (молекулы, частицы, поверхности твердой фазы), имеющего, по крайней мере, связующий рецептор 1 и связующий рецептор 2,
Б) блокируемой метки, участвующей прямо или косвенно в создании, по крайней мере, одного выходного воздействия и способной связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 2 упомянутого агента, причем так, что связь упомянутой блокируемой метки с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента определяется, по крайней мере, одним из входных сигналов,
B) блокирующего вещества, способного связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента в зависимости от, по крайней мере, одного из входных сигналов, причем так, что при упомянутом связывании упомянутого блокирующего вещества с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутая блокируемая метка, при соответствующих входных сигналах связанная с упомянутым агентом, что приводит к изменению упомянутого выходного воздействия.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, причем упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом.
Кроме того, комплекс логического элемента, выполняющий преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции, состоящий, по крайней мере, из
А) агента (молекулы, частицы, поверхности твердой фазы), имеющего, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемой метки, участвующей прямо или косвенно в создании, по крайней мере, одного выходного воздействия,
Б) блокирующего вещества, способного связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента в зависимости от, по крайней мере, одного из входных сигналов, причем так, что при упомянутом связывании упомянутого блокирующего вещества с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутая блокируемая метка упомянутого агента, что приводит к изменению упомянутого выходного воздействия,
причем, упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом и упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки либо с поверхностью твердой фазы (в том числе с поверхностью клетки), либо с объектом, производящим упомянутое выходное воздействие или изменяющим выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, причем объект отличен от агента или схожего с агентом аналога.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором, по крайней мере, один из упомянутых агента или блокирующего вещества представляет собой магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе з представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором блокируемая метка - фермент.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое блокирование упомянутой блокируемой метки приводит к подавлению (ослаблению), по крайней мере, частичному, упомянутого выходного воздействия.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором, по крайней мере, одна из упомянутых зависимостей связывания блокирующего вещества или блокируемой метки и агента от входного сигнала, характеризующегося молекулярной природой, обуславливается тем, что в цепочке связей между упомянутым агентом и упомянутой блокируемой меткой (блокирующим веществом) присутствует связь «рецептор к упомянутому входному сигналу - упомянутый входной сигнал или его аналог».
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутое выходное воздействие производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, иммобилизованной на дополнительной твердой фазе (иммунохроматографической тест-полоске, пластиковом планшете, и т.п.), для чего жидкая среда, содержащая упомянутый комплекс логического элемента, пропускается по упомянутой твердой фазе или инкубируется в контакте с ней, и упомянутое выходное воздействие определяется количеством связанных с упомянутой дополнительной твердой фазой агентов.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие заключается, по крайней мере, в произведении детектируемого сигнала.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vitro.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vivo.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором выходное воздействие позволяет терапевтически влиять на здоровье или состояние субъекта.
Кроме того, комплекс логического элемента, на основе которого построен фармацевтический препарат.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором, по крайней мере, часть упомянутых входных сигналов, определяется состоянием субъекта.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором, в котором блокируемая метка - рецептор (антитело к маркеру на мембране клетки, сигнальный пептид ядерной локализации и т.п.) для направленной доставки вещества в необходимую область организма, клетки и т.п. Кроме того, комплекс логического элемента, в котором, в котором выходное воздействие заключается в создании молекул для улучшения здоровья субъекта или диагностики его состояния.
Кроме того, комплекс логического элемента, выполненный предназначенным для введения субъекту (внутривенно, подкожно, и т.п.) для терапии заболевания или диагностики состояния.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором выходное воздействие заключается в доставке вещества к клеткам-мишеням.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, которое не приводит к специфическому связыванию двух агентов.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с другими молекулами или частицами или поверхностями твердой фазы (в том числе с поверхностью клеток), не включающими те, которые находятся на других агентах, идентичных или подобных упомянутому (имеющие другие блокируемые метки и/или связующие рецепторы).
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, причем упомянутый объект выбирают отличный от агента и не аналогичный агенту, и на создание упомянутого выходного воздействия существенно влияет количество взаимодействий «блокируемая метка-упомянутый объект», и не существенно влияет то, взаимодействует ли с каждым упомянутым объектом несколько агентов или только один.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором упомянутое выходное воздействие не зависит существенным образом от агрегации агентов друг с другом.
Кроме того, комплекс логического элемента, в котором участие упомянутой блокируемой метки в произведении упомянутого выходного воздействия заключается во взаимодействии с объектом, причем упомянутый объект выбирается отличным от агента и не аналогичным агенту, и на создание упомянутого выходного воздействия существенно влияет количество взаимодействий «блокируемая метка - упомянутый объект», но несущественно влияет то, взаимодействует ли с каждым упомянутым объектом несколько агентов или только один (когда в качестве упомянутого объекта выбрана молекула или частица, а не поверхность твердой фазы и не поверхность клетки).
Все варианты реализации изобретения, приводимые ниже, описаны лишь для иллюстрации многообразия возможных вариантов изобретения, а не для ограничения.
Упомянутым агентом может быть любая молекула, нано- или микро-частица, или поверхность твердой фазы, с которой любым способом можно соединить другие молекулы. Так, например, это может быть молекула белка, гликопротеина, нано- или микро-частица - магнитная, золотая, полимерная, кристаллическая, белковая и т. п. В качестве поверхности твердой фазы может быть использована любая стандартная поверхность, используемая в лабораторной практике, например пластиковые планшеты для проведения иммуноферментного иммуноанализа или иммунохроматографические тест-полоски, или пластиковые пробирки. Входным сигналом, влияющим на связь блокирующего вещества и связующего рецептора 1 агента, могут быть различные по своей природе воздействия. Кроме того, в одном воплощении изобретения, те же воздействия могут влиять на подобные связи блокируемой метки и связующего рецептора 2 агента.
Так, например, входной сигнал может быть электромагнитным излучением (например, свет), и связь между блокирующим веществом и связующим рецептором 1 может разрушаться (или, наоборот, образовываться) под воздействием этого излучения. При этом интенсивность, при которой большая часть упомянутых связей разрушается, может быть принята за значение переменной, равное 1, а меньшая интенсивность - равное 0. Кроме того, в случае если данная связь разрушается под действием излучения определенной частоты, то тогда лучше говорить о самой связи как о бинарной переменной (связь есть или ее нет - 1 или 0) или считать, что излучение может принимать не только бинарное значение, но и многозначное, например как функцию интенсивности от частоты). Кроме того, можно говорить и о более сложных ситуациях, когда используются сложные оптические эффекты, например, двухфотонное поглощение и подобные, когда появляется дополнительный параметр. Понятно, что такие случаи лишь расширяют возможности системы.
Если входной сигнал - значение рН или температуры, то различные лабильные связи могут быть разорваны при различных рН или температурах, при этом опять же имеет больший смысл говорить о значение переменной относящийся к связи, а не воздействию. С другой стороны, рН и температура имеют лишь одно измерение параметра в отличие от электромагнитного излучения, которое, как указано выше, имеет два параметра - интенсивность и частоту. Исходя из этого, переменные, соответствующие связям, не будут линейно независимы. При этом в определенных случаях удобнее считать рН и температуру не бинарной переменной, а многозначной.
Кроме того, входным сигналом может быть частица, молекула, ион или атом, которые либо способствуют образованию какой-либо связи (в т. ч. опосредуют ее), либо разрушают какую-либо связь, например, связь упомянутого связующего рецептора 1 и упомянутого блокирующего вещества или связь упомянутого связующего рецептора 2 и упомянутой блокируемой метки.
Связующим рецептором может быть, например, любой атом или молекула, имеющая комплементарную ей молекулу (лиганд). При этом парой «связующий рецептор - лиганд» может быть любая пара специфически взаимодействующих молекул. В качестве примера, но не органичения, можно привести следующие пары: антиген-антитело, олигонуклеотид-олигонуклеотид, лектин-углевод, лектин-гликопротеин, стрептавидин-биотин, протеин А-иммуноглобулин, фермент-субстрат, фермент- активатор - зимоген и пр. В приведенных парах лигандом или рецептором, в рамках данного описания, можно считать как первую часть, так и вторую, т. е. например, лиганд может быть антителом, а рецептор - антигеном к упомянутому антителу, лиганд может быть лектином, а рецептор к нему - соответствующим углеводом и т. п. В понятии лиганда для удобства описания подразумевается как сам лиганд, так и его аналоги, т. е. любые молекулы или молекулярные комплексы, и частицы, часть которых гомологична лиганду, в том числе комплексы молекул. Например, понятие "рецептор к лиганду" включает в себя понятие рецептор к аналогу лиганда. В одном из воплощений изобретения лиганд связующего рецептора 1 при этом может выполнять роль входного сигнала, конкурируя с блокирующим веществом за связывание со связующим рецептором 1 (в формате либо вытеснения блокирующего вещества из связи со связующим рецептором 1, либо ингибирования связующего рецептора 1 или блокирующего вещества, чтобы блокирующее вещество не могло связаться со связующим рецептором 1) или осуществляя связь блокирующего вещества со связующим рецептором 1. Однако для определенной связи входной сигнал может не совпадать с лигандом (или его аналогом) или связующим рецептором 1, например в случае, если связующий рецептор 1 - никель-нитрилотриускусная кислота (или проао ион никеля, координационно связанный с агентом), а блокирующее вещество связывается с ним за счет полигистидиновой метки, то входным сигналом может быть, например, ион никеля или этилендиаминтетрауксусная кислота, вытесняющее блокирующее вещество из связи со связующий рецептором 1.
Кроме того, например, если связующий рецептор 1 - металлозависимый рецептор (например, конканавалин А, которому для связывания глюкозы требуются двухвалентные ионы), а блокирующее вещество несет на себе остатки глюкозы, то входным сигналом может быть этилендиаминтетрауксусная кислота, которая лишит конканавалин ионов металлов, за счет чего связь будет разорвана.
Как отмечалось выше, связь между связующим рецептором 1 и блокирующим веществом может быть и не основана на специфическом молекулярном взаимодействии. Это может быть любая связь, которая может быть либо образована, либо разрушена с помощью внешнего воздействия, примером которого являются электромагнитное излучение (например, фотоактивируемые кросс-сшивающие реакции), рН, температура, ферментативная реакция (сшивание различными ферментами, например, лигазами) и т. п. При этом само воздействие будет являться входным сигналом.
Кроме того, в одном воплощении изобретения упомянутый входной сигнал может разрушать, запрещать или опосредовать не только связь связующего рецептора 1 агента с блокирующим веществом, но и связь связующего рецептора 2 агента с блокируемой меткой так же, как описано выше. Необходимо заметить, что в приводимом ниже описании, иногда для удобства изложения будет упоминаться только связывание связующего рецептора 1 с блокирующим веществом, однако, где уместно, сказанное может также касаться связывания связующего рецептора 2 с блокируемой меткой.
Блокируемой меткой может быть любой атом, молекула или частица, пространственное или пространственно-электростатическое блокирование которой изменяет выходное воздействие. Примером блокируемой метки может служить любая детектируемая метка: флуоресцентная (в т.ч. атомарная или ионная), радиоактивная, магнитная, обладающая поверхностным плазмонным резонансом и т. п. В случае флуоресцентной метки ее пространственная заблокированность может заключаться в невозможности тушителя флуоресценции подойти достаточно близко к флуорофору для его тушения или же, наоборот, Блокируемая метка может быть тушителем флуоресценции, а его блокировка может заключаться в невозможности флуорофора подойти к тушителю. Кроме того, блокируемая метка может быть одним флуорофором (или рецептором, меченным таким флуорофором) из пары флуорофоров, между которыми возможен Фёрстеровский резонансный перенос энергии. При этом блокировка будет заключаться в невозможности компонентов этой пары сблизиться друг с другом. Кроме того, это может быть фермент, действие которого может быть детектировано. Например, это может быть фермент, в результате работы которого неокрашенный субстрат превращается в окрашенный продукт или нефлуоресцентный субстрат - во флуоресцирующий продукт. Кроме того, это также может быть фермент, запускающий каскадную реакцию, например, его субстратом является зимогенная форма другого фермента, который, будучи активированным, уже производит детектируемый сигнал в результате своей работы и т. п. Кроме того, блокируемая метка может быть любым рецептором, способным связать другую молекулу, причем такую, что факт связывания с этой молекулой может быть зарегистрирован. Например, упомянутая молекула может быть одной из вышеупомянутых детектируемых меток. Кроме того, например, эта молекула может быть иммобилизована на какой-либо поверхности или частице (например, на пластиковом планшете или иммунохроматографической тест-полоске), при этом детекция связывания упомянутой молекулы и блокируемой метки происходит за счет маркера, связанного с блокируемой меткой. В случае иммунохроматографической тест-полоски таким маркером это может быть, например, окрашенная полимерная частица, магнитная или золотая частица. В случае планшета удобным маркером также может быть, например, ферментная или флуоресцентная метка. Кроме того роль такого маркера может выполнять, в том числе, упомянутый агент или упомянутые молекулы на агенте, или молекулы в составе агента).
Кроме того, блокируемая метка может представлять собой несколько разных по своей природе меток, например, из тех, что упомянуты выше. При этом комбинированный сигнал от разных меток может изменять параметры выходного воздействия, например, повышая чувствительность или расширяя динамический рабочий диапазон действия входного сигнала. Приведенные примеры даны лишь для иллюстрации возможной природы блокируемой метки, а не для ограничения вариантов блокируемой метки.
Кроме того, блокируемая метка может создавать выходное воздействие не только заключающееся в создании детектируемого сигнала.
Выходным воздействием может быть любое изменение состояние системы или ее части, в том смысле, что можно отличить состояние системы без воздействия и при воздействии. Примером выходного воздействия может служить, изменение флуоресценции системы, радиоактивности, магнитных свойств системы и т. п. Причем появление радиоактивности может быть осуществлено, например, следующим образом. Пусть блокируемой меткой служит антитело. При разблокировании такой блокируемой метки она может связать радиоактивно-меченный антиген. При отмытии несвязавшегося антигена в системе остается радиоактивность. В случае если антитело не может связать антиген (воздействие заблокировано), после отмытия несвязавшегося антигена радиоактивности в образце будет существенно меньше (за счет недоотмытого антигена).
В одном воплощении метода выходным воздействием может быть любой детектируемый сигнал, создаваемый незаблокированной блокируемой меткой, и не создаваемый (или создаваемый в меньшей степени) заблокированной блокируемой меткой сигнал может детектироваться качественно (есть/нет) или измерен количественно, а затем соотнесен со значением логической функции. Детекция может быть осуществлена любым известным способом: оптическими средствами измерения, магнитными, электрохимическими и т. д.
В одном из воплощений метода выходное воздействие может определяться взаимодействием блокируемой метки с лигандом, иммобилизованным на твердой фазе, например, на иммунохроматографической полоске или планшете иммуноферментного анализа. При этом после добавления к комплексу логического элемента входных сигналов и ожидания нужного времени для срабатывания логического элемента, смесь, содержащая упомянутый комплекс логического элемента, пропускается по тест-полоске (как в стандартном методе иммунохроматографии) или инкубируется в планшете. Далее сигнал, пропорциональный количеству задержавшихся на твердой фазе агентов, т. е. агентов, провзаимодействовавших с иммобилизованным лигандом, считывается любым известным способом: либо по оптическому сигналу комплекса логического элемента, либо по магнитному сигналу или же биохимически проявляется (например, с помощью ферментативной реакции) за счет иных рецепторов, которые на себе несет агент. Кроме того, в случае, когда блокируемая метка связывается с агентом посредством связующего рецептора 2 агента в зависимости от входного сигнала, а также, когда она ассоциирована с агентом без связующего рецептора 2, выходное взаимодействие может приводить к агрегации агентов. Например, в случае, когда к комплексу логического элемента добавляют вещество, взаимодействующее с незаблокированными, но присоединенными к агенту блокируемыми метками, таким образом, что с одной молекулой упомянутого вещества может связаться одновременно, по крайней мере, две блокируемые метки, принадлежащие различным агентам, то происходит агрегация агентов, которую можно детектировать любыми стандартными способами. Другой вариант реализуется следующим способом: используют, по крайней мере, два агента, причем блокируемая метка одного агента комплементарна блокируемой метке второго агента. При этом агрегацию частиц можно измерять любым известным способом: например турбодиметрически, по изменению характеристик плазмонного резонанса в случае использования золотых наночастиц в качестве основы для одной или для обеих частиц, по изменению ЯМР-сигнала в случае использования магнитных частиц в качестве основы для одной или для обеих частиц и другими способами.
Однако агрегация агентов не всегда может быть полезным и достаточно чувствительным выходным воздействием. Когда необходимо произведения выходного воздействия, которое может быть зарегистрировано с высокой чувствительностью, выходное воздействие должно быть принципиально иным, нежели агрегация агентов. Так, в одном воплощении изобретения упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, который не приводит к связыванию двух агентов, т. е. не приводит к их агрегации. В другом воплощении метода, упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента за счет прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с упомянутым объектом, который не находится на другом агенте, причем побочное взаимодействие двух агентов с одним упомянутым объектом не вносит существенного вклада в выходное воздействие. Это значит, что в случае, например, связывания с блокируемой меткой (например анти-флуоресцеиновыми антителами) белка, меченного флуоресцеином, выходное воздействие будет обуславливаться флуоресценцией флуоресцеина на агенте. При добавлении не слишком больших избытков упомянутого белка, меченного флуоресцеином, может происходить незначительная агрегация агентов друг с другом, связанная с тем, что упомянутый белок, меченный флуоресцеином, может связаться более, чем с одним агентом. При этом в данном воплощении изобретения, выходное воздействие будет определяться возможностью упомянутого белка, меченного флуоресцеином, связаться с агентом и произвести флуоресцентный сигнал, например, после отмывания несвязавшихся с агентом молекул упомянутого белка, а не за счет агрегации агентов, хотя в данном случае возможна и несущественная агрегация агентов, приводящая к несущественному тушению флуоресценции. Так, например, в другом воплощении изобретения упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, причем упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом. В другом воплощении изобретения упомянутое выходное воздействие - производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки либо с поверхностью твердой фазы (в том числе с поверхностью клетки), либо с объектом, производящим упомянутое выходное воздействие или изменяющим выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, причем упомянутый объект отличен от агента или схожего с агентом аналога. Это значит, что указанное взаимодействие не подразумевает, что выходное воздействие определяется лишь агрегацией агентов друг с другом. Даже если агрегация и возникает, то выходное воздействие производится за счет другого феномена. Так, например, если блокируемая метка на агенте - поликлональное антитело против бычьего сывороточного альбумина (БСА), а упомянутый объект - бычий сывороточный альбумин, меченный флуоресцеином, то при разблокировании блокируемой метки на агенте, она будет связывать меченный флуоресцеином БСА из раствора. При этом т.к. блокируемая метка представляет из себя поликлональные антитела, то при малой концентрации меченного БСА, несколько агентов может связаться с одной молекулой меченного БСА, при этом может произойти частичная агрегация агентов. Однако в этом случае намного чувствительнее и легче, например, детектировать (если выходное воздействие должно произвести детектируемый сигнал) связавшийся с агентами флуоресцеин по его флуоресценции, нежели определять степень агрегации агентов. Кроме того, при добавлении существенного избытка меченного флуоресцеином БСА, специфическое связывание агентов посредством БСА не будет происходить, и следовательно, уменьшится степень агрегации агентов. В то же время флуоресцентный сигнал, будет все также пропорционален количеству разблокированных блокируемых меток, а не степени агрегации агентов. Необходимо заметить, что неспецифическая агрегация агентов может происходить и происходит практически в любом случае - при наличии входных сигналов или их отсутствии, поэтому не существует процессов, на которые абсолютно не влияет агрегация тех или иных веществ, участвующих в процессе. Кроме того, в вышеприведенном случае специфическая агрегация агентов за счет присоединения нескольких агентов к одной молекуле БСА может изменять флуоресцентный сигнал за счет, например, тушения флуоресценции. Однако если агрегация незначительна и БСА был добавлен в достаточном количестве, тушение флуоресценции будет лишь незначительно влиять на сигнал. В упомянутых случаях упомянутый объект, производящий выходное воздействие, может быть детектируемой меткой (флуоресцентной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом), прямо производящей выходное воздействие в виде детектируемого сигнала, кроме того он может быть, например, ферментной меткой производящей флуоресцирующие молекулы из не флуоресцирующих и т.п. При этом выходное воздействие должно производиться именно упомянутым объектом, а не быть обусловленным взаимодействием с агентом. Кроме того, в тех случаях, когда упомянутый объект изменяет выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, упомянутый объект может быть, например, тушителем флуоресценции блокируемой метки или ингибитором ферментной блокируемой метки. При этом выходное воздействие должно определяться именно блокируемой меткой, а не агентом (в отличие от случая определения агрегации носителей), а требование к упомянутому объекту быть отличным от агента или схожего с агентом аналога означает, что изменение выходного воздействия может быть достигнуто лишь за счет взаимодействия упомянутого объекта с блокируемой меткой безотносительно взаимодействия агентов друг с другом. Кроме того, схожий с агентом аналог подразумевает аналог устроенный подобно агенту, но имеющий другие связующие рецепторы, другие блокируемые метки или другие соответствующие им блокирующие вещества. Кроме того, в другом воплощении метода, когда блокируемая метка связывается с поверхностью твердой фазы агенты могут сами производить выходное воздействие, например, за счет того, что они могут быть зарегистрированы (в случае если они, например, являются окрашенными латексными частицами или золотыми, магнитными частицами, или с ними ассоциированы иные метки, например, ферментные) или могут быть, например, цитотоксичными при доставке в клетку, при этом специфическое связывание агентов с твердой фазой (в том числе с поверхностью клетки) не является как таковой их агрегацией. Хотя с единой твердой фазой и соединяется большое количество частиц, такое взаимодействие следует отнести к специфическому
ю связыванию агентов с не аналогичными им объектами, нежели к агрегации агентов друг с другом в смысле агрегации аналогичных друг другу веществ. В другом воплощении метода, упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с другими молекулами или частицами или поверхностями твердой фазы, не включающими те, которые находятся на других агентах, идентичных или подобных упомянутому агенту, т. е. имеющие другие блокируемые метки и/или связующие рецепторы и/или соответствующие им блокирующие вещества.
Кроме того, выходное воздействие может заключаться в произведении, модификации, выводе из среды (в смысле трансформации в другие молекулы или сорбции) каких-либо молекул. Так, например, если блокируемая метка суть фермент, то, взаимодействуя со своим субстратом, она может либо модифицировать его, либо расщеплять и т. п. Кроме того, например, блокируемая метка может быть субстратом, взаимодействуя с которым, фермент будет производить или выводить из среды другие молекулы. Так, например, блокируемая метка может быть одноцепочечным олигонуклеотидом. При этом в состоянии блокировки доступ ДНК-полимеразы (например, иммобилизованной на наночастице) к такой блокируемой метке будет затруднен или невозможен. В случае же разблокирования можно провести полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) и произвести большое количество данного олигонуклеотида. В другом варианте, в заблокированном состоянии к олигонуклеотидной блокируемой метке не может подойти ДНКаза и не может отщепить часть этого олигонуклеотида, которая затем может быть амплифицирована за счет ПЦР.
В одном из воплощений метода за счет использования для пространственной или пространственно- электростатической блокировки блокирующего вещества и агента, превышающих размеры рецепторов, используемых в системе, а также за счет пространственного разнесения связующего рецептора и блокируемой метки на агенте возможно использовать в качестве блокируемых меток, в том числе, ферменты, способные деградировать рецепторы, посредством которых блокирующее вещество связывается с агентом. За счет использования агента, несущего на себе, например, белковый рецептор и блокируемую метку, представляющую собой протеазу, у протеазы практически нет возможности деградировать рецептор на других агентах из-за ограниченности диффузии, а также степеней свободы, т.е. возможности правильной пространственной ориентации рецептора относительно протеазы для его деградации. При этом протеаза может быть функциональной по отношению к малому молекулярному субстрату, обладающему быстрой диффузией и неограниченностью по всем степеням свободы. То же применимо и к другим ферментам - нуклеазам, гликозидазам и т. п. Например, в одном из воплощений метода на агенте иммобилизованы конканавалин А, связывающий терминальные остатки маннозы и глюкозы, и энтеропептидаза. При этом блокирующим веществом может быть кросс-сшитая пероксидаза хрена, хорошо связываемая конканавалином А и вытесняемая из данной связи глюкозой. В качестве субстрата может быть использован трипсиноген (в том числе иммобилизованный на наночастицах). При этом в случае блокировки взаимодействия энтеропептидазы и трипсиногена за счет связывания агента с блокирующим веществом (при низкой концентрации глюкозы) не происходит активация трипсиногена до трипсина. При повышении концентрации глюкозы происходит разблокировка энтеропептидазы, которая превращает трипсиноген в трипсин. Если в смеси присутствует прокарбоксипептидаза Б, происходит ее превращение трипсином в активный фермент карбоксипептидазу Б, которая совместно с трипсином способна энзиматически превращать проинсулин в активный инсулин (W. Kemmler, J.D. Peterson, D.F. Steiner, Studies on the conversion ofproinsulin to insulin. I. Conversion in vitro with trypsin and carboxypeptidase B, J. Biol. Chem. 246 (1971) 6786-6791). Таким образом можно добиться выработки инсулина из проинсулина при повышении концентрации глюкозы в среде, что может быть чрезвычайно эффективным лечением диабета.
Необходимо отметить, что, как правило, Блокируемая Метка в случае разблокированности и присутствии на Агенте должна произвести Выходное Воздействие, однако необходимо заметить, что за единицу (ИСТИНУ) значения упомянутых функции Комплекса Логического Элемента может приниматься и обратное - не произведение какого-либо Воздействия Блокируемой Меткой в случае разблокированности и нахождении на Агенте и произведении какого-либо Воздействия заблокированной Блокируемой Меткой или Меткой не связанной с Агентом.
Данное изобретение может также быть использовано для диагностических и/или терапевтических целей. В том числе для целей направленной доставки различных агентов к клеткам. При этом это могут быть клетки, выращиваемые in vitro в культуре, или клетки живого организма. Применение данного метода может быть, например, следующим. Пусть для иллюстративных целей требуется доставить магнитные наночастицы (МЧ) к опухолевым клеткам. Данные МЧ могут быть основой агента. Пусть они конъюгированы с двумя рецепторами: первый - блокируемая метка - представляет собой противоопухолевое антитело, имеющее специфичность к онкомаркерам на мембране клеток, например коммерческое антитело трастузумаб, второй связующий рецептор - рецептор к нетоксичному низкомолекулярному соединению (входной сигнал) - например конканавалин А - рецептор к глюкозе. В качестве блокирующего вещества может быть использована наночастица, представляющая кроссшитый белок, распознаваемый конканавалином А. Это может быть белок неживотного происхождения, например, пероксидаза хрена, но предпочтительнее использовать белок из того вида, для которого создается терапевтический или диагностический агент. Существенным преимуществом будет использование в качестве основы блокирующей компоненты белка, выделенного из крови непосредственно того организма, для которого создается агент. Это исключит иммуногенность введенного агента и минимизирует опсонизацию. Кроме того, в случае использования сильно сиалированного блокирующего вещества появляется возможность надежной маскировки агента от органов ретикуло-эндотелиальной системы, удаляющих чужеродные частицы из кровотока.
При смешивании МЧ, конъюгированных с упомянутыми рецепторами, с блокирующим веществом, будет получен собранный агент или комплекс логического элемента, который можно отделить от блокирующего вещества, не связавшегося с конъюгатами МЧ. Однако, не удаляя несвязавшуюся компоненту, можно повысить эффективность доставки агента к опухоли. При введении свободного блокирующего вещества в кровоток (возможно введение блокирующего вещества даже за некоторое время до самого комплекса логического элемента), фильтрующие системы организма (например, купферовские клетки) будут перегружены фильтрацией свободного блокирующего вещества и при введении комплекса логического элемента будут медленнее выводить его из кровотока, что увеличит время для распознавания блокируемой меткой своей мишени.
При введении комплекса логического элемента в организм человека блокируемая метка не будет сразу экспонирована на поверхности агента. Это позволяет избежать возможности опсонизации чужеродной блокируемой метки на агенте и позволит замаскировать поверхность самой частицы белком самого организма, что также ведет к снижению опсонизации. После того, как комплекс логического элемента равномерно распределился по кровотоку и по всему организму, необходимо поднять уровень входного сигнала, в данном примере - глюкозы. Это можно сделать прямой инъекцией глюкозы в кровоток либо перорально, т.е. дав пациенту съесть глюкозу, если это допускают фармакокинетические параметры комплекса логического элемента, т. е. если он циркулирует достаточно долго для усвоения глюкозы в желудке. При этом чем выше уровень глюкозы, тем быарее произойдет диссоциация блокирующего вещества от МЧ и обнажение блокируемой метки, в данном случае, антитела, способного распознать онкомаркер на раковой клетке, и таким образом доставить МЧ к клетке-мишени. При таком варианте доставки частицы появляется возможность распределить частицы равномерно по кровотоку, пока они защищены белком организма от опсонизации и иммунного ответа, а затем уже «включить» их распознающую компоненту.
Кроме того, возможен случай, что входной сигнал может быть выбран таким образом, что его не надо будет вводить дополнительно в кровоток, а его концентрация в области, куда необходимо доставить агент будет повышена. Например, в очагах воспаления повышена концентрация хемоаттрактантов для привлечения нейтрофилов и моноцитов или рН ниже в области опухоли и т.п.
Кроме того, данный комплекс логического элемента может быть составлен многослойно. Так, например, в качестве первого «слоя» на МЧ могут быть иммобилизованы блокируемая метка и связующий рецептор 1 А, связанный с блокирующим веществом А, которая блокирует блокируемую метку А. Такая наночастица может быть основой второго «слоя». Например, на упомянутом блокируемом веществе а иммобилизуют блокируемую метку Б и связующий рецептор 1 Б, связанный с блокирующим веществом Б, которая блокирует блокируемую метку Б и т. п. (то же возможно при использовании связующего рецептора 2 для связывания блокируемой метки с агентом, МЧ). Такой вариант может быть использован, например, для последовательной доставки частицы по разным «вложенным» адресам - например, сначала к мембране специфической клетки, затем обеспечивая выход из лизосомы, затем в ядро. При этом «включение» соответствующих блокируемых меток может быть обеспечено различным биохимическим окружением в соответствующих областях (кровоток, лизосома, цитоплазма и т.п.).
За счет того, что комплекс логического элемента может воспринимать не только один входной сигнал, а, например, также «включать/выключать» блокируемые метки в случае присутствия определенных входных сигналов и в случае отсутствия других определенных входных сигналов, можно создать вещество, «включающее» свое действие только при определенном биохимическом «профиле» среды (т. е. определенном количественном соотношении различных молекул в среде). Это может быть полезно для диагностики и лечения сложных заболеваний, таких как рак, для которых на данный момент неизвестны единичные маркеры, высокоспецифичные для данного заболевания, но, в то же время, известны группы маркеров, по отсутствию части которых и присутствию другой части которых можно более точно поставить тот или иной диагноз. В таком случае вещество, способное одновременно почувствовать присутствие одних молекул и отсутствие других, обладает несомненным преимуществом перед современными методами направленной доставки, которые, как правило, оперируют лишь понятием наличия маркера заболевания.
Упомянутой блокируемой меткой может быть не только рецептор для направленной доставки, но и например, фермент, взаимодействие которого со своим субстратом заблокировано блокирующим веществом, или флуоресцентной меткой, которая заблокирована от взаимодействия с тушителем флуоресценции блокирующим веществом, или, наоборот, блокируемая метка может быть тушителем флуоресценции, взаимодействию которого с флуорофором стерически мешает блокирующее вещество.
Так, например, если блокируемая метка - фермент, например рицин (или цепь а рицина), то его цитотоксичность, определяемая расщеплением гликозидных связей в рибосоме, что блокирует синтез белка, может быть пространственно заблокирована блокирующим веществом, которая стерически не допустит подхода крупной рибосомы к рицину на агенте. Если же блокирующее вещество диссоциирует от агента, то рицин «включается» и убивает клетку-мишень. Кроме того, при использовании рицина, состоящего из ферментной части (цепь А) и лектиновой части (цепь Б), которая отвечает за проникновение рицина в цитозоль клетки и связывается с остатками галактозы и N- ацетилгалактозамина, можно в качестве связующего рецептора использовать непосредственно цепь Б самого рицина, а в качестве блокирующей компоненты - частицу, несущую на себе остатки галактозы и Ν-ацетилгалактозамина.
В качестве упомянутого блокирующего вещества может выступать один из входных сигналов (например, антитело против связующего рецептора 1), или же молекула, частица или поверхность, несущая на себе определенные рецепторы, которые прямо или косвенно связываются со связующим рецептором 1, причем один или несколько входных сигналов влияют на эту связь.
Кроме того, в роли блокирующего вещества может быть и любая другая молекула или частица, способная связываться со связующим рецептором 1 агента с помощью входного сигнала или сама по себе (в этом случае зависимость связи блокирующего вещества и агента от входного сигнала будет определяться тем, что входной сигнал может разрушать эту связь). Так, например, в случае использования молекулярного входного сигнала, блокирующее вещество может быть создано путем кросс-сшивания рецептора к входному сигналу или кросс-сшивания молекул самого входного сигнала или его аналога, а также за счет кросс-сшивания молекулы-носителя, несущего на себе молекулу входного сигнала (в случае низкомолекулярного входного сигнала). Причем, например, в случае, когда входной сигнал - углевод, например глюкоза или манноза, молекула-носитель может естественным образом нести на себе этот входной сигнал, например в случае гликопротеина пероксидазы хрена. Кроме того, входной сигнал может быть иммобилизован на молекуле-носителе искусственным образом, например, с помощью химической конъюгации, например, так же, как принято для иммобилизации гаптенов на белке-носителе для иммунизации животных и наработке антител против данного гаптена. Кроме того, входной сигнал или рецептор к нему могут быть конъюгированы с частицей, образованной кросс-сшиванием иной молекулы. Кросс-сшивание может быть произведено различными известными способами, например, гомобифункциональными кросс-линкерами (глютеральдегидом и т.п.), или гетеробифункциональными. Кроме того, на такой искусственной белковой частице могут быть образованы функциональные группы для удобной и быстрой конъюгации гаптенов, лигандов или рецепторов. Удобство использования такой частицы состоит в том, что, подбирая концентрации кросссшиваемой молекулы и кросссшивающего агента, можно получать частицы разного размера для оптимизации свойств их стерической блокировки поверхности агента. Дисперсию по размерам получаемых блокирующих частиц можно уменьшать, выделяя нужные по размеру фракции, используя гель-фильтрационное хроматографическое разделение кросс-сшитых молекул. При этом можно подбирать размер блокирующих частиц для оптимальной блокировки блокируемых меток. Кроме того, используя разные фракции частиц после гель-фильтрации кросссшитых молекул, можно стерически более полно блокировать блокируемые метки: сначала добавлять к агенту фракции с большими частицами, а затем с меньшими.
Кроме того, за счет использования агентов со многими связующими рецепторами 1 можно добиться, чтобы присоединение блокирующего вещества к агенту было одноточечным или многоточечным. Случай многоточечного связывания выгодно отличается тем, что возможно использовать низкоафинные рецепторы к входному сигналу или рецепторы, отличающиеся большой скоростью диссоциации комплекса с входным сигналом. При этом чувствительность логического элемента и скорость его работы будут выше, чем в случае высокоафинных рецепторов в случае добавлении входного сигнала к уже собранному комплексу частица-блокирующее вещество. За счет высокой скорости диссоциации пар рецептор-эпитоп блокирующего вещества, более вероятно вытеснение блокирующего вещества из взаимодействия при добавлении более низких концентраций свободного детектируемого входного сигнала. Тем не менее, за счет многоточечного связывания связь частицы и блокирующего вещества будет прочной в отсутствие свободного входного сигнала. Данный случай удобен, когда время работы логического элемента критично.
Надо заметить, что блокирующее вещество может взаимодействовать с агентом не только посредством взаимодействия через связующий рецептор 1. Так, например, за счет использования второй связи между агентом и блокирующим веществом можно реализовать многократно обратимую блокировку блокируемой метки на агенте. Если упомянутая вторая связь (ковалентная или нековалентная) происходит с использованием длинного линкера, то блокирующее вещество, например, при вытеснении свободным молекулярным входным сигналом отсоединяется от связующего рецептора 1 на агенте, и отходит на определенное длиной упомянутого линкера расстояние, тем самым разблокирует блокируемую метку для создания выходного воздействия. Когда концентрация входного сигнала в образце снижается, молекулы входного сигнала диссоциируют от связующего рецептора 1 на агенте, с которым теперь может опять соединиться блокирующее вещество и заблокировать блокируемую метку, а следовательно прекратить произведение выходного воздействия. Таким линкером могут быть различные молекулы, тем не менее, предпочтительнее использовать гидрофильные полимеры (полиэтиленгликоль, декстран и т.п.), не препятствующие, а наоборот стимулирующие, удаление блокирующего вещества от агента пока они не связаны через связующий рецептор 1 на агенте.
Способность блокирующего вещества связываться с агентом прямо или косвенно через связующий рецептор 1 на агенте подразумевает широкое разнообразие вариантов блокировки блокирующим веществом блокируемой метки на агенте. Так, например, блокирующее вещество может связываться со связующим рецептором 1 на агенте не напрямую, а через набор взаимодействующих друг с другом молекул, так, например, в случае использования в качестве связующего рецептора 1 мышиных антител против молекулярного входного сигнала, сначала может быть добавлен биотинилированный входной сигнал (или биотинилированный аналог входного сигнала, к которому упомянутое антитело имеет меньшее сродство так чтобы при добавлении входной сигнал с легкостью вытеснял упомянутый биотинилированный аналог), а затем блокирующее вещество, несущее на себе (стрепт)авидин. Это, например, может позволить использовать только один тип блокирующих веществ для многих входных сигналов.
Кроме того, может быть использована и многослойная блокировка, например, в том числе в вышеприведенном случае со стрептавидиновым блокирующим веществом могут быть использованы второе блокирующее вещество, несущее на себе крысиные анти-стрептавидиновые антитела, и третье блокирующее вещество, несущее на себе кроличьи анти-крысиные антитела и т. д. Понятно, что за счет использования такой многослойной блокировки степень блокирования может быть многократно усилена.
В одном из воплощений изобретения, неспецифическое связывание блокирующего вещества с агентом не ухудшает чувствительность комплекса логического элемента к входному сигналу. В известных методах детекции различных молекул, например, в иммуноферментном твердофазном анализе, неспецифическое связывание ферментной метки, взаимодействующей с иммуносендвичем, с твердой фазой планшета, приводит к повышению всех сигналов (для всех образцов), что ухудшает предел детекции метода. В предлагаемом изобретении, например, в воплощении, в котором блокируемая метка для произведения выходного воздействия связывается с молекулой, иммобилизованной на твердой фазе (например, на иммунохроматографической тест-полоске), неспецифическое связывание блокирующего вещества с агентом, наоборот, приводит к уменьшению сигнала, а не к его увеличению, что не приводит к ухудшению чувствительности ко входному сигналу. В одном из воплощений изобретения, неспецифическое связывание агентов с твердой фазой, опосредованное неспецифически связанным с агентом блокирующим веществом, как правило, не будет происходить, т.к. в основном с твердой фазой неспецифически будет связываться свободное блокирующее вещество, как правило, находящееся в смеси в существенно большем количестве, чем количество агентов. Кроме того, подобрав блокирующее вещество, обладающее минимальным неспецифическим связыванием с твердой фазой (но не обязательно с агентом), возможно свести вредные эффекты неспецифического связывания в системе практически к абсолютному минимуму. Для этого в одном из воплощений метода, выгодно использовать блокирующее вещество, созданное на основе сильно-гидрофильных незаряженных соединений, которые, как правило, обладают минимальным неспецифическим связыванием. Это, например, могут быть частицы, покрытые молекулами полиэтиленгликоля, или созданные с содержанием большого количества углеводов - например, на основе декстрана или гликопротеинов. Кроме того, в приведенных примерах, неспецифическое связывание за счет рецепторов на блокирующем веществе, прямо или косвенно распознающих связующий рецептор 1 на агенте, может не ухудшать предел детекции. Т.е. как было отмечено, такое неспецифическое связывание с агентом не повышает сигнал, и неспецифическое связывание свободного блокирующего вещества с твердой фазой также не повышает сигнал. Таким образом, в одном из воплощений метода, можно практически полностью не зависеть от неспецифического связывания блокирующего вещества с агентом, специфическая связь которых зависит от входного сигнала.
Чувствительность метода к входному сигналу (т.е. пороговая сила сигнала, когда его значение меняется с нуля до единицы) может быть сдвинута в нужный диапазон, например, концентрационный (в случае молекулярного входного сигнала) с помощью регулирования плотности, как правило, связующих рецепторов (1 или 2) на агенте, хотя вариант регулирования плотности блокируемой метки на агенте также реализуем. Например, возможен следующий вариант. В случае повышенных требований к чувствительности комплекса логического элемента (т.е. требования разрушения или образования связи между блокирующим веществом и агентом), преимущественнее использовать редкое расположение связующих рецепторов 1 на агенте, но так чтобы блокирующее вещество могло заблокировать блокируемые метки, связанные с агентом. При этом при добавлении малого количества молекул входного сигнала и ингибировании хотя бы одного связующего рецептора 1 на агенте, соответствующее блокирующее вещество не сможет присоединиться в этом месте к агенту, за счет чего останутся незаблокированными в этом месте агента блокируемые метки, которые могли бы, например, связаться с комплементарным лигандом, иммобилизованным на иммунохроматографической тест-полоске. В случае плотной посадки связующих рецепторов 1 на агенте, возможность не допустить связывания блокирующего вещества с агентом в определенном месте агента потребует большего количества молекул входного сигнала, во-первых, из-за большей концентрации связующих рецепторов, а во- вторых, из-за возможности многоточечного связывания блокирующего вещества и агента.
Кроме того, плотность блокирующих меток на агенте или количество связующих рецепторов 2, которые способны связать блокируемые метки определяет сложность полной блокировки блокируемых меток, соединенных с агентом, что также влияет на чувствительность комплекса логического элемента по отношению ко входному сигналу.
Чем дальше в пространстве разнесены связующий рецептор 1 и связующий рецептор 2 (или блокируемая метка) на агенте, тем сложнее пространственно или пространственно-электростатически заблокировать блокируемую метку. При этом, например, в случае если в качестве блокирующего вещества выбран сам молекулярный входной сигнал, метод ограничен возможностью использования крайне больших по размерам входных сигналов. Тем не менее, при использовании дополнительного блокирующего вещества для блокировки блокируемой метки можно заблокировать блокируемые метки существенно удаленные от связующих рецепторов, причем удаление может быть порядка размеров блокирующего вещества. При этом учитывая, что блокирующее вещество может быть существенно больше, чем любые молекулярные рецепторы - вплоть до нескольких десятков микрон и более, данное изобретение никоим образом не ограничено размерами молекул входных сигналов или пространственным разнесением связующего рецептора 1 и связующего рецептора 2 (или блокируемой метки).
Изменение выходного воздействия зависит от связывания или не связывания блокирующего вещества с агентом. При этом входной сигнал может влиять на образование или разрушение связи блокирующего вещества и агента разными способами. Так, например, связывание блокирующего вещества со связующим рецептором на агенте может происходить, в том числе следующими двумя способами. В первом - упомянутая связь может осуществляться за счет распознавания связующим рецептором 1 молекул входного сигнала на блокирующем веществе или за счет распознавания молекул входного сигнала на другой молекуле, с которой прямо или косвенно связывается блокирующее вещество. При этом в данном случае входной сигнал конкурирует за связывание с упомянутым связующим рецептором 1, за счет чего количество связанного с агентом блокирующего вещества зависит от количества входного сигнала. Второй вариант реализуется иначе. Связывание блокирующего вещества со связующим рецептором 1 происходит за счет распознавания рецептором на блокирующем веществе связующего рецептора 1 на агенте или за счет связывания блокирующего вещества прямо или косвенно с рецептором, связавшимся со связующим рецептором. При этом связывание упомянутого рецептора на блокирующем веществе со связующим рецептором 1 становится затрудненным или невозможным в случае прямого или косвенного связывания связующего рецептора 1 с молекулами входного сигнала.
Пространственная или электростатически-пространственная блокировка блокируемой метки - затрудненность блокируемой метки взаимодействовать прямо или косвенно с определенными другими молекулами из-за стерических и/или электростатических факторов. Т.е. при таком блокировании за счет нахождения вблизи блокируемой метки блокирующего вещества, упомянутые определенные молекулы не могут приблизиться к блокируемой метке, за счет чего и происходит «блокировка». При этом невозможность приблизиться может быть обусловлена как объемом блокирующего вещества, так и ее сильным зарядом. Например, в случае одинакового знака заряда блокирующего вещества и упомянутых молекул, упомянутые молекулы будут отталкиваться от блокирующего вещества и не приблизятся к блокируемой метке. В случае же разных знаков зарядов упомянутые молекулы могут притягиваться к блокируемому веществу за счет чего их взаимодействие с блокируемой меткой будет конкурировать с притяжением к блокирующему веществу, и, следовательно, будет наблюдаться эффективная «блокировка».
Кроме того, улучшение блокировки может быть достигнуто следующим способом, если блокирующее вещество имеет в том числе слабое сродство к блокируемой метке, то по сравнению со случаем когда такого сродства нет, может быть достигнута существенно более сильная блокировка при отсутствии входного сигнала и несущественно измененная остаточная блокировка в присутствии входного сигнала и упомянутых молекул, взаимодействующих с блокируемой меткой. Т.к. все обратимые биохимические реакции взаимодействия подразумевают наличие, как связанных молекул, так и свободных, то и все использованные выше понятия такие как «блокировка», «невозможность приближения» и т.п. имеются в виду в их статистическом смысле, т.е. например, о блокировке можно говорить и в том случае, если не все блокируемые метки «заблокированы», важно лишь то, что в случае блокировки «заблокированных меток» больше, чем «не заблокированных».
Кроме того, для простоты объяснения в примерах приводимых в данном описании полагается, что блокируемая метка должна быть одинакова для упомянутых агентов. Однако это необязательно - блокируемые метки могут быть и различными, при этом надо понимать, что понятие значения логической функции тогда стоит воспринимать в ином смысле, например, что оно равно единице (истине), в случае если хотя бы одна блокируемая метка произвела соответствующее ей выходное воздействие. Так, например, удобно использовать в качестве такого набора разных блокируемых меток различные олигонуклеотиды за счет большого многообразия специфически взиамодействующих пар. При этом можно не только получать интегральную информацию о значении функции комплекса логического элемента, но и подробную информацию о состоянии каждого агента в составе комплекса логического элемента.
В одном из воплощений изобретения выбирают агент, представляющий собой нано- или микрочастицу или поверхность твердой фазы и несущий на себе, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемую метку, участвующий прямо или косвенно в произведении выходного воздействия, а также используется блокирующее вещество, способное связываться прямо или косвенно со связующим рецептором 1 на агенте. При этом, например, блокирующее вещество может связываться со связующим рецептором 1 из-за того, что она состоит из молекул входного сигнала или его аналога или несет на себе такие молекулы или аналогичные им. При этом расположение связующего рецептора 1 на таком агенте выгодно с той точки зрения, что при этом для недопущения блокировки блокируемых меток блокирующим веществом надо малое количество входного сигнала, в отличие от случая, когда на агенте находятся, напрмер, молекулы входного сигнала, а рецепторы к ним расположены на блокирующем веществе, т.к. в последнем случае самого блокирующего вещества и рецепторов к входному сигналу на них должно быть существенно больше, чем молекул входного сигнала на агенте.
Кроме того, блокирующее вещество может связываться со связующим рецептором 1 различными косвенными путями, например, оно может взаимодействовать с цепочкой молекул или частиц, одна из которых несет на себе или состоит из молекул входного сигнала, или же блокирующее вещество может нести на себе или состоять из рецептора к молекулам входного сигнала, тогда молекулы входного сигнала связываются со связующим рецептором 1 (тоже являющимся рецептором к молекулам входного сигнала) на агенте, а затем со связанными молекулами входного сигнала связывается упомянутое блокирующее вещество. Кроме того, в цепочке связей между агентом и блокирующим веществом могут участвовать различные другие молекулы, например, биотин-стрептавидин и т. п.
Кроме того, в одном из воплощений изобретения, используется агент, несущий на себе связующий рецептор 1 и блокируемую метку. Преимущества такого подхода заключаются, во-первых, в том, что такой агент-носитель одновременно несет большое количество связующих рецепторов 1, а также блокируемых меток, производящих выходное воздействие.
Во-вторых, использование такого агента, а не прямое соединение связующего рецептора 1 с блокируемой меткой позволяет пространственно разнести связующий рецептор 1 и блокируемую метку и, хотя это существенно усложняет блокировку, тем не менее, может помочь иммобилизовать большее количество блокируемых меток в активном состоянии. А именно, за счет того, что упомянутые связующие рецепторы 1 и блокируемые метки связаны не напрямую, они не блокируют и не нарушают активности друг друга. Т.е., например, при конъюгации большого количества флуорофоров с антителом (т. е. если блокируемая метка, флуорофор, напрямую конъюгирована со связующим рецептором 1, антителом) может происходить инсолюбилизация антитела за счет того, что большинство используемых флуорофоров плохо растворимы в воде. Кроме того, флуорофор обычно присоединяется химически, а потому хаотично, за счет чего часть флуорофора может присоединиться к распознающему участку антитела, что не позволит ему распознать лиганд, являющийся входным сигналом, и кроме того, при большом количестве флуорофора на антителе возникает перекрестное тушение флуорофора.
В-третьих, упомянутое пространственное разнесение связующего рецептора 1 и блокируемой метки, а также использование блокирующего вещества (а не самих молекул входных сигналов) для пространственной блокировки блокируемых меток, позволяет использовать в качестве связующего рецептора 1 и блокируемой метки молекулы или вещества практически любого размера - вплоть до нескольких микрометров и более. Кроме того, за счет использования больших агентов, существенно превышающих размер упомянутых молекул, появляется возможность принципиально иной (по сравнению со случаем, если связующий рецептор 1 напрямую связан с блокируемой меткой) пространственной или пространственно-блокировки блокируемых меток, а именно блокировки слоистого типа, в том числе многослойной с использованием нескольких типов блокирующих веществ). При этом можно сделать практически независимой эффективность блокировки блокируемых меток от их количества на агенте, т. е. эффективность будет блокировки зависеть лишь от количества связующих рецепторов 1 на агенте. Так, в случае наличия минимально достаточного количества связующих рецепторов 1 для образования «полного блокирующего слоя» все блокируемые метки на носителе будут заблокированы. В случае же прямого соединения (например, конъюгации) связующих рецепторов 1 и блокируемой метки эффективность блокировки существенно зависит от количественного соотношения этих веществ. Причем при большем количестве связующих рецепторов 1 эффективность блокировки выше, но при этом выходное воздействие от блокируемых меток слабее, что накладывает существенные ограничения на применимость изобретения.
В-четвертых, упомянутый агент позволяет использовать себя как твердую фазу, т. е. обеспечивает легкую сепарацию (например, если агент - магнитная нано- или микрочастица) и другие преимущества использования нано- и микрочастиц в качестве твердой фазы.
Кроме того, в одном из воплощений при использовании агента, несущего на себе, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемую метку, участвующую прямо или косвенно в произведении выходного воздействия, пространственная или пространственно-электростатическая блокировка упомянутой блокируемой метки, приводящая к изменению упомянутого выходного воздействия может происходить за счет молекул входного сигнала, связывающихся со связующим рецептором 1. В таком случае блокирующей частицей является сам входной сигнал. В этом случае, также возможно вышеупомянутая «слоистая» блокировка со всеми вышеперечисленными преимуществами.
Кроме того, в одном из воплощений изобретения используют агент, имеющий, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемую метку, участвующую прямо или косвенно в произведении выходного воздействия. Причем агент создается таким что упомянутое выходное воздействие производится в большей степени в случае не связывания блокирующего вещества и агента и производится в меньшей степени в случае связывания блокирующего вещества и агента. Обратный вариант также возможен.
Кроме того, в другом воплощении изобретения, любой входной сигнал влияющий на связь блокирующего вещества и агента не влияет на связь блокируемой метки и агента, и наоборот, любой входной сигнал влияющий на связь блокируемой метки и агента не влияет на связь блокирующего вещества и агента.
Наряду с простыми комлексами логических элементов в рамках данного изобретение возможно создание существенно более сложных комплексов логических элементов, а также соединение нескольких таких комплексов логических элементов в логические схемы.
Выходное воздействие одного комплекса логического элемента (КЛЭ) может являться входным сигналом для другого комплекса логического элемента, т.е. сигнал от одного агента может быть передан другому. Так, например, если выходное воздействие первого КЛЭ выражается произведением какой-либо молекулы - то, как уже было описано ранее, повышенная концентрация этой молекулы может, например, разрывать связь агента и блокирующего вещества второго КЛЭ. Таким образом, может осуществляться создание логической схемы, состоящей из нескольких КЛЭ, причем выходы одного КЛЭ могут быть входами других.
Кроме того, выходное воздействие КЛЭ может выражаться, например, произведением в том числе, молекул идентичных или аналогичных входному сигналу данного КЛЭ, за счет чего будет реализован КЛЭ соответствующий нелинейному КЛЭ, усилителю входного сигнала.
Кроме того, выходное воздействие КЛЭ может выражаться, например, произведением в том числе молекул ингибирующих, нейтрализующих или преобразующих входной сигнал данного КЛЭ, за счет чего будет реализован КЛЭ соответствующий нелинейному КЛЭ, тушителю входного сигнала.
Кроме того, упомянутая схема, да и единичные КЛЭ, могут быть существенно усложнены за счет нескольких факторов:
1) у каждого КЛЭ может быть много различных выходов в том смысле, что «включенное» состояние может выражаться выходным воздействием, заключающемся в произведении нескольких разных молекул или иных воздействий. При этом каждая произведенная молекула или воздействие может быть входным сигналом для другого или этого же КЛЭ.
2) один и тот же КЛЭ может «включать» произведение различных молекул (или иных выходных воздействий) при количественно различной разблокированное™ блокируемой метки. Так, например, если произведение упомянутых молекул происходит за счет ферментных блокируемых меток, и процесс произведения упомянутых молекул заключается в деградации данными ферментами своих субстратов. При этом для разных ферментов (например, глюкозидаза и днказа) размеры субстратов могут быть существенно различными. За счет этого, можно реализовать вариант многозначной логики, в котором многозначность реализовывается переведением количественной степени заблокированное™ блокируемой _ метки в качественно разные выходные воздействия, например, «нет никакой модификации субстратов», «модификация только малого субстрата», «модификация малого и большого субстрата». Работа предлагаемого Комплекса Логического элемента иллюстрируется чертежами фиг. 1-3.
Список фигур чертежей.
Фиг.1. Комплекс логического элемента для реализации логической функции ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ.
Фиг.2. Комплекс логического элемента для реализации логической функции НЕ.
Фиг.З. Комплекс Логического Элемента для реализации логической функции (А&В&С&(НЕ i)&(HE ii)&(HE iii)) от переменных А,В,С, I, и, iii.
ПРИМЕРЫ
Нижеприведенные примеры даны в качестве иллюстрации данного изобретения и не ограничивают его применения.
Варианты выполнения логических функций с помощью комплекса логического элемента (КЛЭ) разнообразны. Приведем различные примеры выполнения таких функций.
Пусть часть входных сигналов определяет связывание блокируемой метки с агентом, и, по крайней мере, другая часть определяет связывание блокирующего вещества с Агентом. Тогда можно реализовать набор функций ЗНАЧЕНИЕ ФУНКЦИИ, НЕ, И, ИЛ И - базис для выражения любой логической функции следующими вариантами.
Итак, рассмотрим два краевых варианта реализации логических функций с помощью изобретения: в первом - все входные сигналы разрывают какую-то связь, во втором - все входные сигналы опосредуют образование какую-то связь.
Пример 1. В данном примере используются входные сигналы, разрушающие какую-либо связь.
Реализация функции «ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ» осуществляется КЛЭ (Фиг. 1), в котором со связующим рецептором 1 агента, несущего на себе связующий рецептор 1 и блокируемую метку, связано блокирующее вещество, причем связь блокирующего вещества и агента зависит от входного сигнала. В случае если входной сигнал способен разрывать упомянутую связь, то с помощью данного КЛЭ реализуется логическая функция «ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ». Действительно, если входной сигнал разрывает упомянутую связь, то блокируемая метка на агенте разблокируется и выходное воздействие производится.
Реализация функции «НЕ» осуществляется КЛЭ (Фиг. 2), в котором агент, несущий на себе связующий рецептор 2, связан посредством связующего рецептора 2 с блокируемой меткой, это связь агента и блокируемой метки зависит от входного сигнала. В случае если входной сигнал разрывает упомянутую связь, то данный КЛЭ реализует логическую функцию «НЕ». Так, например, если входной сигнал разорвал упомянутую связь, то блокируемая метка диссоциирует от агента и на агенте нет активной блокируемой метки, способной произвести выходное воздействие (например, связать агент с поверхностью твердой фазы).
Реализация функции конъюнкция значений переменных (А И Б) осуществляется КЛЭ, в котором агент несет на себе одновременно набор связующих рецепторов для всех входных сигналов, при этом блокирующее вещество связано или способно связываться со всеми упомянутыми связующими рецепторами. При этом в случае если входные сигналы разрушают соответствующие связи связующего рецептора и блокирующего вещества, то при отсутствии хотя бы одного входного сигнала связывание агента и блокирующего вещества не будет нарушаться, при этом блокируемая метка будет заблокирована.
Реализация функции дизъюнкции значений переменных (А ИЛИ Б) осуществляется ЛЭ, включающим различные агенты для каждого входного сигнала, причем все агенты несут на себе одну и ту же блокируемую метку и каждый из которых несет на себе связующий рецептор 1 соответствующий только одному входному сигналу, при этом с каждым связующим рецептором 1 агента связано, по крайней мере, одно блокирующее вещество или набор блокирующих веществ, таких чтобы с каждым связующим рецептором могло связаться хотя бы одно блокирующее вещество. При этом в случае если входные сигналы, разрушают соответствующие связи связующего рецептора 1 и блокирующего вещества, то только при отсутствии всех входных сигналов связывание агентов и соответствующего блокирующего вещества не будет нарушаться, и блокируемая метка на всех агентах будет заблокирована. При этом в случае присутствии хотя бы одного входного сигнала, блокируемая метка на соответствующем ему агенте будет разблокирована и будет произведено выходное воздействие.
Реализация функции конъюнкции отрицаний значений переменных («НЕ А» И «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором блокируемая метка связана со связующим рецептором 2 агента посредством набора последовательных связей, включающего связи, разрушаемые всеми входными сигналами, причем при разрушении любым из входных сигналов соответствующей ему связи, блокируемая метка диссоциирует от агента. Такой набор последовательных связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента связывается с молекулой 1, так что их связь разрушается входным сигналом 1, с упомянутой молекулой 1 связана молекула 2, несущая на себе блокируемую метку, причем связь молекулы 1 и молекулы 2 разрушается входным сигналом 2. В случае большего количества входных сигналов КЛЭ - используемый набор молекул 1,2,...,п увеличивается, включая молекулы, связи которых с предыдущими разрушаются соответствующими входными сигналами. При этом молекула п несет на себе, в том числе блокируемую метку.
Реализация функции дизъюнкции отрицаний значений переменных («НЕ А» ИЛИ «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором блокируемые метки связаны со связующими рецепторами 2 агента посредством набора параллельных связей, разрушаемыми входными сигналами, причем при разрушении входным сигналом соответствующей ему связи, соответствующая блокируемая метка диссоциирует от агента. Такой набор параллельных связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента связан с молекулой 1, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь разрушается входным сигналом 1, кроме того, связующий рецептор 2 агента связан с молекулой 2, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь разрушается входным сигналом 2, и т.п.
Иная реализация функции дизъюнкции отрицаний значений переменных («НЕ А» ИЛИ «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором идентичные блокируемые метки связаны со связующими рецепторами 2 набора различных агентов, однозначно соответствующих входным сигналам, посредством связей, разрушаемыми входными сигналами, причем при разрушении входным сигналом соответствующей ему связи, блокируемая метка диссоциирует от соответствующего агента. Такой набор связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента 1 связан с молекулой 1, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь разрушается входным сигналом 1; связующий рецептор 2 агента 2 связан с молекулой 2, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь разрушается входным сигналом 2, и т.п. Пример 2. В данном примере используют входные сигналы, опосредующие какую-либо связь.
Реализация функции «ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ» осуществляется КЛЭ, в котором к агенту, несущему на себе связующий рецептор 2, но не активную блокируемую метку, посредством входного сигнала, присоединяющегося к связующему рецептору 2, присоединяется блокируемая метка. При этом агент начинает нести на себе активную блокируемую метку, способную произвести выходное воздействие.
Реализация функции «НЕ» осуществляется КЛЭ, в котором к агенту, несущему на себе связующий рецептор 1 и активную блокируемую метку, посредством входного сигнала, присоединяющегося к связующему рецептору 1, присоединяется блокирующее вещество, пространственно или пространственно-электростатически блокирующее блокируемую метку, так что она не может произвести выходное воздействие.
Реализация функции конъюнкции отрицаний переменных («НЕ А» И «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором агент несет на себе набор связующих рецепторов 1, соответствующих входным сигналам, и активную блокируемую метку. Кроме того, КЛЭ включает в себя набор блокирующих веществ, таких что для каждого входного сигнала есть блокирующее вещество, способное связаться с соответствующим связующим рецептором 1 агента посредством данного входного сигнала и заблокировать блокируемую метку. При этом, при наличии хотя бы одного из входных сигналов к агенту присоединяется блокирующее вещество, пространственно или пространственно-электростатически блокирующее блокируемую метку, так что она не может произвести выходное воздействие.
Реализация функции дизъюнкции отрицаний переменных («НЕ А» ИЛИ «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, который включает в себя набор агентов, которые несут на себе идентичные активные блокируемые метки, а также каждый из которых несет на себе связующий рецептор 1, однозначно соответствующий входному сигналу. Причем для каждого входного сигнала в КЛЭ есть соответствующий ему агент. Кроме того, КЛЭ включает в себя набор блокирующих веществ, таких что для каждого входного сигнала есть блокирующее вещество, способное связаться со связующим рецептором 1 соответствующего агента посредством данного входного сигнала и заблокировать блокируемую метку на данном агенте. При этом для блокировки всех блокируемых меток на всех агентах обязательно наличие всех входных сигналов.
Реализация функции конъюнкции значений переменных (А И Б) осуществляется КЛЭ, в котором блокируемая метка связывается со связующим рецептором 2 агента посредством набора последовательных связей, включающего связи, опосредуемые всеми входными сигналами, причем только при наличии всех входных сигналов блокируемая метка способна присоединиться к агенту. Такой набор последовательных связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента связывается с молекулой 1, так что их связь опосредуется входным сигналом 1, с упомянутой молекулой 1 посредством входного сигнала 2 связывается молекула 2, несущая на себе блокируемую метку. В случае большего количества входных сигналов КЛЭ - используемый набор молекул 1,2,...,п увеличивается, включая молекулы, связи которых с предыдущими опосредуются соответствующими входными сигналами. При этом молекула п несет на себе, в том числе блокируемую метку.
Реализация функции дизъюнкции значений переменных (А ИЛИ Б) осуществляется КЛЭ, в котором блокируемые метки связаны со связующими рецепторами 2 агента набором параллельных связей, опосредуемых входными сигналами, причем при отсутствии какого-либо из входных сигналов соответствующая блокируемая метка не может присоединиться к агенту. Такой набор параллельных связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента связан с молекулой 1, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь опосредуется входным сигналом 1, кроме того, связующий рецептор 2 агента связан с молекулой 2, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь опосредуется входным сигналом 2, и т.п.
Иная реализация функции дизъюнкции отрицаний значений переменных («НЕ А» ИЛИ «НЕ Б») осуществляется КЛЭ, в котором идентичные блокируемые метки связаны со связующими рецепторами 2 набора различных агентов, однозначно соответствующих входным сигналам, посредством входных сигналов, причем при отсутавии какого-либо входного сигнала, соответствующая блокируемая метка не может присоединиться к соответствующему агенту. Такой набор связей реализуется следующим образом. Связующий рецептор 2 агента 1 связан с молекулой 1, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь опосредуется входным сигналом 1; связующий рецептор 2 агента 2 связан с молекулой 2, несущей на себе блокируемую метку, так что их связь опосредуется входным сигналом 2, и т.п.
Таким образом, перечисленные варианты позволяют осуществить набор функций «значение переменной, не, или, и, не или (конъюнкция отрицаний), не и (дизъюнкция отрицаний)», как в случае входных сигналов разрушающих связи (пример 1), так и в случае входных сигналов, опосредующих связи (пример 2). Данные наборы позволяют выразить любую логическую функцию через члены каждого набора.
Сложные функции на основе базиса конъюнкции и дизъюнкции от значений переменных и их отрицаний в случае входных сигналов, разрывающих соответствующие связи.
Пример 3. Реализация КЛЭ, выполняющего логическую функцию, представляющую собой комбинацию логических функций ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ, НЕ, И (т.е. конъюнкция переменных и их отрицаний), осуществляется следующим образом (Фиг.З). КЛЭ состоит в том числе из агента, с которым блокируемая метка связана посредством связей, которые разрушаются теми входными сигналами, которые входят в упомянутую сложную логическую функцию с отрицанием. Кроме того, агент несет на себе набор связующих рецепторов 1, которые связываются с блокирующим веществом КЛЭ, причем для каждого входного сигнала, входящего в упомянутую сложную логическую функцию как значение переменной (а не ее отрицание), существует, по крайней мере, один связующий рецептор, связь которого с блокирующим веществом разрушается данным входным сигналом, и кроме того, для каждого связующего рецептора существует входной сигнал, входящий в упомянутую сложную логическую функцию как значение переменной (а не ее отрицание), который разрушает связь данного связующего рецептора с блокирующим веществом.
Пример 4. С помощью КЛЭ приведенного в Примере 3 реализации комбинации логических функций значение переменной, НЕ и И (т.е. конъюнкция переменных и их отрицаний) для входных сигналов, разрушающих упомянутые связи, реализуется практически любая логическая функция. Действительно, любая логическая функция представима в качестве совершенной дизъюнктивной нормальной формы, т.е. дизъюнкции конъюнкций переменных и их отрицаний. При этом для реализации представленной таким образом логической функции, используют КЛЭ, включающий в себе агенты для всех «конъюнкций», причем с идентичными блокируемыми метками. При этом данный КЛЭ реализует дизъюнкцию функций, реализующихся данными агентами, т.е. если хотя бы на одном из агентов КЛЭ есть незаблокированная блокируемая метка, то производится выходное воздействие.
Пример 5. Реализация КЛЭ, выполняющего логическую функцию, представляющую собой комбинацию логических функций ЗНАЧЕНИЕ ПЕРЕМЕННОЙ, НЕ, И (т.е. конъюнкция переменных и их отрицаний), для входных сигналов, опосредующих связи, осуществляется следующим образом. КЛЭ состоит, в том числе, из агента, с которым блокируемая метка связывается посредством связей, которые опосредуются теми входными сигналами, которые входят в упомянутую сложную логическую функцию как значение переменной (а не ее отрицание). Кроме того, агент несет на себе набор связующих рецепторов 1, которые связываются с блокирующим веществом, причем для каждого входного сигнала, входящего в упомянутую сложную логическую функцию с отрицанием, существует, по крайней мере, один связующий рецептор 1, связь которого с блокирующим веществом опосредуется данным входным сигналом, и кроме того, для каждого связующего рецептора 1 существует входной сигнал, входящий в упомянутую сложную логическую функцию с отрицанием, который опосредует связь данного связующего рецептора 1 с блокирующим веществом.
Пример 6. С помощью КЛЭ приведенного в Примере 6 реализации комбинации логических функций значение переменной, НЕ и И (т.е. конъюнкция переменных и их отрицаний) для входных сигналов, опосредующих упомянутые связи, реализуется практически любая логическая функция. Действительно, любая логическая функция представима в качестве совершенной дизъюнктивной нормальной формы, т.е. дизъюнкции конъюнкций переменных и их отрицаний. При этом для реализации представленной таким образом логической функции, используют КЛЭ, включающий в себе агенты для всех «конъюнкций», причем с идентичными блокируемыми метками. При этом данный КЛЭ реализует дизъюнкцию функций, реализующихся данными агентами, т.е. если хотя бы на одном из агентов КЛЭ есть незаблокированная блокируемая метка, то производится выходное воздействие. При этом входные сигналы могут быть добавлены как до, так и после смешения упомянутых агентов. Кроме того, упомянутые агенты могут быть не смешаны друг с другом, а выходное воздействие считается произведенным, если его произвел хотя бы один упомянутый агент после добавления входных сигналов. Случай входных сигналов, опосредующих упомянутые связи, как правило, более требователен к порядку действий при вычислении значения логической функции, чем случай входных сигналов, разрущающих упомянутые связи. Так, например, для осуществления КЛЭ предпочтительнее добавление всех входных сигналов к каждому агенту по отдельности, затем добавление блокируемых меток и блокирующих веществ, относящихся к данному агенту, а затем смешение всех агентов для получения итогового выходного воздействия. Кроме того, добавление блокируемых меток и блокирующих веществ к агенту может быть как до, так и после добавления входных сигналов.
Описанные выше примеры КЛЭ, реализующих логические функции, не ограничены случаями, когда все входные сигналы разрушают упомянутые связи, или все опосредуют. Приведенные примеры даны лишь для простоты и наглядности описания изобретения, также возможна реализация различных логических функций при различных комбинациях входных сигналов, часть которых разрушает, а часть опосредует упомянутые связи при этом реализация базисного набора функций, хотя и может отличаться от приведенных примеров, остается в рамках изобретения.

Claims

Формула изобретения
1) Комплекс логического элемента, выполняющий преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции, состоящий, по крайней мере, из
A) агента (молекулы, частицы, поверхности твердой фазы), имеющего, по крайней мере, связующий рецептор 1 и связующий рецептор 2,
Б) блокируемой метки, участвующей прямо или косвенно в создании, по крайней мере, одного выходного воздействия и способной связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 2 упомянутого агента, причем так, что связь упомянутой блокируемой метки с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента определяется, по крайней мере, одним из входных сигналов,
B) блокирующего вещества, способного связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента в зависимости от, по крайней мере, одного из входных сигналов, причем так, что при упомянутом связывании упомянутого блокирующего вещества с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутая блокируемая метка, при соответствующих входных сигналах связанная с упомянутым агентом, что приводит к изменению упомянутого выходного воздействия.
2) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом, причем упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом.
3) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки либо с поверхностью твердой фазы (в том числе с поверхностью клетки), либо с объектом, производящим упомянутое выходное воздействие или изменяющим выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, причем объект отличен от агента или схожего с агентом аналога.
4) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором, по крайней мере, один из упомянутых агента или блокирующего вещества представляет собой магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.
5) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором блокируемая метка - фермент.
6) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором упомянутое блокирование упомянутой блокируемой метки приводит к подавлению (ослаблению), по крайней мере, частичному, упомянутого выходного воздействия.
7) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором, по крайней мере, одна из упомянутых зависимостей связывания блокирующего вещества или блокируемой метки и агента от входного сигнала, характеризующегося молекулярной природой, обуславливается тем, что в цепочке связей между упомянутым агентом и упомянутой блокируемой меткой (блокирующим веществом) присутствует связь «рецептор к упомянутому входному сигналу - упомянутый входной сигнал или его аналог». 8) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.
9) Комплекс логического элемента по п. 8, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутое выходное воздействие производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.
10) Комплекс логического элемента по п. 8, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, иммобилизованной на дополнительной твердой фазе (иммунохроматографической тест-полоске, пластиковом планшете, и т.п.), для чего жидкая среда, содержащая упомянутый комплекс логического элемента, пропускается по упомянутой твердой фазе или инкубируется в контакте с ней, и упомянутое выходное воздействие определяется количеством связанных с упомянутой дополнительной твердой фазой агентов.
11) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором упомянутое выходное воздействие заключается, по крайней мере, в произведении детектируемого сигнала.
12) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vitro.
13) Комплекс логического элемента по п. 1, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vivo.
14) Комплекс логического элемента, по п. 1, в котором выходное воздействие позволяет терапевтически влиять на здоровье или состояние субъекта.
15) Комплекс логического элемента по п. 1-14, на основе которого построен фармацевтический препарат.
16) Комплекс логического элемента по одному из п. 12-14, в котором, по крайней мере, часть упомянутых входных сигналов, определяется состоянием субъекта.
17) Комплекс логического элемента по одному из п. 12-14, в котором блокируемая метка - рецептор (антитело к маркеру на мембране клетки, сигнальный пептид ядерной локализации и т.п.) для направленной доставки вещества в необходимую область организма, клетки и т.п.
18) Комплекс логического элемента по одному из п. 12-14, в котором выходное воздействие заключается в создании молекул для улучшения здоровья субъекта или диагностики его состояния.
19) Комплекс логического элемента по одному из п. 12-14, выполненный предназначенным для введения субъекту (внутривенно, подкожно, и т.п.) для терапии заболевания или диагностики состояния.
20) Комплекс логического элемента по одному из п. 12-14, в котором выходное воздействие заключается в доставке вещества к клеткам-мишеням. 21) Комплекс логического элемента, выполняющий преобразование входных сигналов в выходное воздействие согласно заданной логической функции, состоящий, по крайней мере, из
А) агента (молекулы, частицы, поверхноаи твердой фазы), имеющего, по крайней мере, связующий рецептор 1 и блокируемой метки, участвующей прямо или косвенно в создании, по крайней мере, одного выходного воздействия,
Б) блокирующего вещества, способного связываться прямо или косвенно с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента в зависимости от, по крайней мере, одного из входных сигналов, причем так, что при упомянутом связывании упомянутого блокирующего вещества с упомянутым связующим рецептором 1 упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутая блокируемая метка упомянутого агента, что приводит к изменению упомянутого выходного воздействия, причем, упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки с объектом и упомянутое выходное воздействие отлично от связывания агентов друг с другом.
22) Комплекс логического элемента по п. 21, в котором упомянутое выходное воздействие производится упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутой блокируемой метки либо с поверхностью твердой фазы (в том числе с поверхностью клетки), либо с объектом, производящим упомянутое выходное воздействие или изменяющим выходное воздействие, производимое блокируемой меткой, причем объект отличен от агента или схожего с агентом аналога.
23) Комплекс логического элемента по п. 20, в котором, по крайней мере, один из упомянутых агента или блокирующего вещества представляет собой магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.
24) Комплекс логического элемента по п. 21, в котором блокируемая метка - фермент.
25) Комплекс логического элемента по п. 21, в котором упомянутое блокирование упомянутой блокируемой метки приводит к подавлению (ослаблению), по крайней мере, частичному, упомянутого выходного воздействия.
26) Комплекс логического элемента по п. 21, в котором, по крайней мере, одна из упомянутых зависимостей связывания блокирующего вещества или блокируемой метки и агента от входного сигнала, характеризующегося молекулярной природой, обуславливается тем, что в цепочке связей между упомянутым агентом и упомянутой блокируемой меткой (блокирующим веществом) присутствует связь «рецептор к упомянутому входному сигналу - упомянутый входной сигнал или его аналог».
27) Комплекс логического элемента по п. 21, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.
28) Комплекс логического элемента по п. 27, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутой блокируемой меткой упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутое выходное воздействие производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.
29) Комплекс логического элемента по п. 28, в котором процесс произведения упомянутого выходного воздействия включает в себя специфическое связывание с упомянутой блокируемой меткой прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, иммобилизованной на дополнительной твердой фазе (иммунохроматографической тест-полоске, пластиковом планшете, и т.п.), для чего жидкая среда, содержащая упомянутый комплекс логического элемента, пропускается по упомянутой твердой фазе или инкубируется в контакте с ней, и упомянутое выходное воздействие определяется количеством связанных с упомянутой дополнительной твердой фазой агентов.
30) Комплекс логического элемента по п. 21, в котором упомянутое выходное воздействие заключается, по крайней мере, в произведении детектируемого сигнала.
31) Комплекс логического элемента по п. 21, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vitro.
32) Комплекс логического элемента по п. 21, в котором упомянутое выходное воздействие позволяет проводить диагностику заболевания или состояния субъекта in vivo.
33) Комплекс логического элемента, по п. 21, в котором выходное воздействие позволяет терапевтически влиять на здоровье или состояние субъекта.
34) Комплекс логического элемента по п. 21-33, на основе которого построен фармацевтический препарат.
35) Комплекс логического элемента по одному из п. 31-33, в котором, по крайней мере, часть упомянутых входных сигналов, определяется состоянием субъекта.
36) Комплекс логического элемента по одному из п. 31-33, в котором блокируемая метка - рецептор (антитело к маркеру на мембране клетки, сигнальный пептид ядерной локализации и т.п.) для направленной доставки вещества в необходимую область организма, клетки и т.п.
37) Комплекс логического элемента по одному из п. 31-33, в котором выходное воздействие заключается в создании молекул для улучшения здоровья субъекта или диагностики его состояния.
38) Комплекс логического элемента по одному из п. 31-33, выполненный предназначенным для введения субъекту (внутривенно, подкожно, и т.п.) для терапии заболевания или диагностики состояния.
39) Комплекс логического элемента по одному из п. 31-33, в котором выходное воздействие заключается в доставке вещества к клеткам-мишеням.
PCT/RU2013/000269 2012-04-02 2013-03-29 Комплекс логического элемента на основе биомолекул (варианты) WO2013151465A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/389,993 US20160144051A1 (en) 2012-04-02 2013-03-29 Logic element complex based on biomolecules (variants)
EP13772828.3A EP2851850A4 (en) 2012-04-02 2013-03-29 LOGIC ELEMENT COMPLEX BASED ON BIOMOLECULES (VARIANTS)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012112643 2012-04-02
RU2012112643/08A RU2491631C1 (ru) 2012-04-02 2012-04-02 Комплекс логического элемента на основе биомолекул (варианты)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2013151465A1 true WO2013151465A1 (ru) 2013-10-10
WO2013151465A9 WO2013151465A9 (ru) 2013-12-12

Family

ID=49163929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2013/000269 WO2013151465A1 (ru) 2012-04-02 2013-03-29 Комплекс логического элемента на основе биомолекул (варианты)

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20160144051A1 (ru)
EP (1) EP2851850A4 (ru)
RU (1) RU2491631C1 (ru)
WO (1) WO2013151465A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021137740A3 (en) * 2019-12-31 2021-08-12 Nikitin Maxim Petrovich Molecular computing device based on essentially single stranded nucleic acids

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2020100864A (ru) * 2020-01-14 2021-07-14 Максим Петрович Никитин Агент для аналит-зависимой доставки к клеточной мишени

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6774222B1 (en) * 1998-02-20 2004-08-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Molecular computing elements, gates and flip-flops
US7745594B2 (en) 2005-07-21 2010-06-29 California Institute Of Technology Nucleic acid-based logic circuits
US20100227382A1 (en) * 2005-05-25 2010-09-09 President And Fellows Of Harvard College Nanoscale sensors
WO2011066541A2 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Trustees Of Boston University Biological circuit chemotactic converters
WO2011116151A2 (en) 2010-03-16 2011-09-22 The Regents Of The University Of California Enzyme-logic biosensing

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0310361A3 (en) * 1987-09-30 1989-05-24 Beckman Instruments, Inc. Tridentate conjugate and method of use thereof
IL121312A (en) * 1997-07-14 2001-09-13 Technion Res & Dev Foundation Microelectronic components, their manufacture and electronic networks containing them
WO1999042929A1 (en) * 1998-02-20 1999-08-26 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Molecular computing elements: gates and flip-flops

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6774222B1 (en) * 1998-02-20 2004-08-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Molecular computing elements, gates and flip-flops
US20100227382A1 (en) * 2005-05-25 2010-09-09 President And Fellows Of Harvard College Nanoscale sensors
US7745594B2 (en) 2005-07-21 2010-06-29 California Institute Of Technology Nucleic acid-based logic circuits
WO2011066541A2 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Trustees Of Boston University Biological circuit chemotactic converters
WO2011116151A2 (en) 2010-03-16 2011-09-22 The Regents Of The University Of California Enzyme-logic biosensing

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MALTZAHN ET AL.: "Nanoparticle of Self-Assembly Gated by Logical Proteolytic Triggers", J AM CHEM SOC, 2009
See also references of EP2851850A4
W. KEMMLER; J.D. PETERSON; D.F. STEINER: "Studies on the conversion of proinsulin to insulin. I. Conversion in vitro with trypsin and carboxypeptidase B", J. BIOL. CHEM., vol. 246, 1971, pages 6786 - 6791

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021137740A3 (en) * 2019-12-31 2021-08-12 Nikitin Maxim Petrovich Molecular computing device based on essentially single stranded nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
RU2491631C1 (ru) 2013-08-27
EP2851850A1 (en) 2015-03-25
EP2851850A4 (en) 2015-12-30
US20160144051A1 (en) 2016-05-26
WO2013151465A9 (ru) 2013-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7122384B2 (en) Resonant light scattering microparticle methods
DE60110604T2 (de) Dielektrisch-hergestellte mikropartikel
EP3500857B1 (en) Methods and systems for detecting bioanalytes
Huang et al. Nanoparticle-mediated IgE− receptor aggregation and signaling in RBL mast cells
Liu et al. Multifunctional nano-sunflowers with color-magnetic-Raman properties for multimodal lateral flow immunoassay
EP1813946A1 (en) Biomaterial construct, its producing method, biomaterial support, target material purifying method, affinity chromatography container, separation chip, analyzing method and analyzing separator for target material, biomaterial complex, and its support, sensor chip, solid support with biomaterial fixe
Zhou et al. Biosensors for cell analysis
CN1993145A (zh) 用于药学活性物质细胞特异性富集的基于蛋白质的纳米颗粒形式的载体***
Gribko et al. Is small smarter? Nanomaterial-based detection and elimination of circulating tumor cells: Current knowledge and perspectives
Jeon et al. Metallic Fe–Au barcode nanowires as a simultaneous T cell capturing and cytokine sensing platform for immunoassay at the single-cell level
Wang et al. Precise molecular profiling of circulating exosomes using a metal–organic framework-based sensing interface and an enzyme-based electrochemical logic platform
DE102014215208A1 (de) Verfahren zur Bindung von biologisch aktiven Molekülen an Oberflächen
Cong et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy
RU2491631C1 (ru) Комплекс логического элемента на основе биомолекул (варианты)
Zhang et al. Design and Application of Metal Organic Framework ZIF-90-ZnO-MoS2 Nanohybrid for an Integrated Electrochemical Liquid Biopsy
Chaudhuri et al. Tetrazine–trans-cyclooctene mediated conjugation of antibodies to microtubules facilitates subpicomolar protein detection
US10900962B2 (en) Molecular nets and devices for capturing analytes including exosomes
Zhang et al. Microswimmer-Based Ultrasensitive Dual-Signal Ratiometric Electrochemical Homogeneous Aptasensor with Functionalized Co-UiO-66 for the Single-Step Detection of HER2 in Whole Blood
Mayorga et al. Development of nanostructures in the diagnosis of drug hypersensitivity reactions
EP2972343A1 (en) Molecular nets on solid phases
Kim et al. Functional fusion proteins and prevention of electrode fouling for a sensitive electrochemical immunosensor
RU2517161C2 (ru) Способ определения содержания лиганда в образце (варианты)
Wu et al. Multistage magnetic separation of microspheres enabled by temperature-responsive polymers
Li et al. Nano-Bio Interface-Guided Nanoparticle Protein Corona Antigen for Immunoassays and Immunoimaging in a Complex Matrix
Sadana et al. Fractal analysis of the binding and dissociation kinetics for different analytes on biosensor surfaces

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13772828

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013772828

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14389993

Country of ref document: US