WO2013151364A1 - 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 및 이를 이용한 프로바이오틱스 - Google Patents

신규 분리한 바실러스 리체니포미스 및 이를 이용한 프로바이오틱스 Download PDF

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WO2013151364A1
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WO
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cjmpb283
bacillus licheniformis
ammonia
strains
culture
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백승희
양시용
우서형
서효실
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씨제이제일제당(주)
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis

Definitions

  • the present invention relates to novel probiotics and their use.
  • antibiotics In general, antibiotics, antibacterial agents, and chemicals are used to improve disease and water quality in farmed fish, but their use is limited due to the increase of resistant bacteria, residual body, and water pollution. I'm doing it.
  • development of alternatives such as organic acids, probiotics, non-specific immunopotentiators, and natural substances is urgently progressed to fundamentally block the use of antibiotics (diagnosis of fish diseases). And treatment measures, Ministry of Oceans and Fisheries, 2001).
  • Probiotics has an etymological meaning that is opposed to antibiotics (antibiotics), which means antibiotics, defined as a microbial agent or microbial component that helps balance microorganisms in the intestine, and is called a lactic acid bacterium, such as Lactobacillus and Bifidus.
  • antibiotics defined as a microbial agent or microbial component that helps balance microorganisms in the intestine, and is called a lactic acid bacterium, such as Lactobacillus and Bifidus.
  • the fungus species is representative.
  • Bacillus which is used as a probiotic, is a gram-positive bacillus that forms endogenous spores and has a unique form among bacteria used as probiotics. Bacillus is characterized by excellent heat resistance than lactobacillus that does not form endospores. It also survives the low pH of the stomach wall, so most of the bacteria administered can reach the small intestine. (Barbosa, TM et al . Appl. Environ . Microbiol . 71 (2005) 968-978; Spinosa, MR et al . Res. Microbiol . 151 (2000) 361-368).
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2007-0036016 discloses a method for preventing or mitigating the accumulation of nitrite in the aquatic environment using nitrite-oxidizing bacteria.
  • the nitrite-oxidizing bacteria are Nitrococcus and Nitrospira .
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2010-0040960 discloses a method for removing carbon and nitrogen contaminants from wastewater using heterotrophic ammonia oxidizing bacteria, and the heterotrophic ammonia oxidizing bacteria disclosed in the literature are Bacillus pseudopymus NH-. 2 ( Bacillus pseudofimus NH-2), Arthrobacter globiformis WR-2.
  • Nitrococcus and nitrospy disclosed in the above documents cannot be used as probiotics because they are not GRAS strains, and because they belong to archaea, they are very difficult to produce and thus cannot be used industrially.
  • Bacillus Pseudomusus WR-2 also known as GRAS strain, is a strain that has not been registered as a probiotic.
  • the present inventors completed the present invention by separating the strains having digestive enzyme activity in Korean doenjang, which is a traditional fermented food in Korea, and oxidizing ammonia and nitrite, and confirming the morphological, biochemical and genetic properties of the strain.
  • Another object of the present invention is to provide a culture selected from the group consisting of the culture solution of Bacillus licheniformis CJMPB283, the concentrate thereof and the dried product thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a feed additive comprising the probiotic formulation.
  • Another object of the present invention is to provide aquatic aquaculture improving agent comprising Bacillus licheniformis CJMPB283, its culture, its concentrate or its dried product.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for improving the quality of the farm by spraying the water improver before or at the farming stage.
  • a novel Bacillus licheniformis CJMPB283 which produces a digestive enzyme and has an ammonia and nitrite oxidizing ability.
  • Bacillus licheniformis CJMPB283 of the present invention is obtained by separating from the traditional Korean food meju.
  • the morphological feature of the strain of the present invention is Gram-positive bacilli (FIG. 6) and has the 16s rDNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Analysis of the base sequence showed 97% homology with Bacillus licheniformis . Accordingly, the present inventors deposited the newly isolated Bacillus Richenformis CJMPB283 to Korean Culture Center of Microorganisms (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul) on March 22, 2012 with the accession number KCCM11270P.
  • the isolate was excellent in useful digestive enzyme activities such as amylase, cellulose, and protease, and has the characteristic of oxidizing ammonia and nitrite.
  • growth is possible under anaerobic and anaerobic conditions, and because it is flame resistant to 10% sodium chloride, it is possible to grow in various water environments.
  • the control of ammonia in the flounder tank was excellent and the mortality was low.
  • a culture selected from the group consisting of a culture of a novel isolated strain of the present invention, a concentrate thereof and a dried product thereof.
  • the novel isolated strain of the present invention can be cultured through a conventional method for culturing Bacillus strains.
  • the medium may be natural or synthetic medium.
  • the carbon source of the medium for example, glucose, sucrose, dextrin, glycerol, starch and the like can be used, and as the nitrogen source, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, soybean, ammonium salt, nitrate and other organic or inorganic Nitrogen containing compounds may be used, but are not limited to these components.
  • the inorganic salt included in the medium magnesium, manganese, calcium, iron, phosphorus, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • culture temperature conditions of the novel isolated strain of the present application can be cultured in 12 hours to 4 days in the temperature range of 20 ⁇ 40 °C.
  • the culture solution of the newly isolated strain may be a culture stock solution including the cells, and may also be a culture cell from which the culture supernatant is removed or concentrated.
  • the composition of the culture solution may further include not only components necessary for normal Bacillus culture, but also components that synergistically act on the growth of Bacillus, and thus the composition may be easily selected by those skilled in the art. Can be.
  • the state of the strain may be a liquid state or dry state
  • the drying method is possible, but not limited to ventilation drying, natural drying, spray drying and freeze drying.
  • a probiotic formulation comprising a novel isolated strain of the invention or a culture thereof.
  • Probiotics settle on the gut wall of the intestine, preventing harmful bacteria from settling and inhibiting the growth of pathogens.
  • beneficial digestive enzymes produced by probiotics facilitate the absorption and utilization of nutrients, improving feed demand.
  • the probiotic formulation of the present invention comprises Bacillus licheniforms CJMPB283 of 5 x 10 4 to 5 x 10 10 CFU / ml, preferably Bacillus licheniforms CJMPB283 of 1 x 10 6 to 1 x 10 9 CFU / ml It includes.
  • the probiotic formulation of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated with the carrier to provide food and feed additives.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not irritate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • Acceptable pharmaceutical carriers for probiotics formulated as liquid solutions include sterile and physiologically compatible saline, sterile water, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solutions, maltodextrin solutions, glycerol and one of these components. More than one component can be mixed and used, and other conventional additives, such as antioxidant, buffer, and bacteriostatic agent, can be added as needed.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • binders, emulsifiers, preservatives, and the like added to prevent deterioration of the quality of the probiotic formulations in the present invention, and amino acids, vitamins, enzymes, flavors, nonprotein nitrogen compounds, and silicates added to the feed to increase the efficacy.
  • the feed mixture may further include, but is not limited thereto.
  • Formulations for oral administration containing the probiotics of the present invention as an active ingredient can be formulated into tablets, troches, lozenges, water-soluble or oily suspensions, prepared powders or granules, emulsions, soft capsules.
  • lactose For formulation into tablets and capsules, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, binders such as cellulose or gelatin, excipients such as dicalcium phosphate, disintegrants such as corn starch or sweet potato starch, magnesium stearate And lubricating agents such as calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax, and the capsule formulation may further contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the aforementioned substances.
  • a liquid carrier such as fatty oil in addition to the aforementioned substances.
  • the present invention relates to aquaculture feed additive comprising the probiotic formulation as an active ingredient.
  • Bacillus forms endogenous spores and has a very stable characteristic of heat. Therefore, the newly isolated Bacillus licheniformis CJMPB283 may be prepared separately in the form of feed additives and mixed in the feed, or directly added during the preparation of the feed.
  • Bacillus licheniformis CJMPB283 in the feed of the present invention may be a liquid or dry state, preferably in the form of a dry powder. Drying methods may be, but not limited to, ventilation drying, natural drying, spray drying and freeze drying.
  • Bacillus licheniformis CJMPB283 of the present invention may be mixed in the form of a powder of 0.05 to 10% by weight, preferably 0.1% to 1% by weight of the feed weight.
  • the aquaculture feed additives may further include conventional additives to increase the shelf life of the feed in addition to Bacillus Richenomyces CJMPB283 of the present invention.
  • the plants include grains, fruits, food processing by-products, algae, fibres, oils, starches, gourds, grain by-products, and the like, proteins, minerals, oils, Minerals, fats and oils, unicellular proteins, zooplankton, fishmeal, and the like, but are not limited thereto.
  • the aquaculture feed additive of the present invention can be used by adding to the aquaculture feed by dipping, spraying or mixing.
  • Fish species to which the feed additive of the present invention may be added may be used for fish or crustaceans, and more specifically, but not limited thereto, such as farmed fish such as flounder, dom, shrimp, tilapia, salmon, eel, trout, etc. Do not.
  • the feed additive is mixed with the animal feed in an amount of 0.05 to 0.5% by weight on a dry weight basis.
  • the aquaculture modifier for aquaculture including Bacillus Richenomyces CJMPB283 as an active ingredient; And it relates to a method for improving the water quality of the farm by spraying the water improver before or in the farming step in the farm.
  • the novel isolated Bacillus licheniformis CJMPB283 of the present invention can be used to reduce the ammonia and nitrite content present in the aquaculture environment.
  • Fish species of aquaculture farms in which the water quality improving agent of the present invention can be used may be used for fish or crustaceans, and more specifically include, but are not limited to, farmed fish such as flounder, dome, shrimp, tilapia, salmon, eel, trout, and the like.
  • the water quality improver of the present invention may be prepared separately from the newly isolated Bacillus Richenomyces CJMPB283 in the form of a water quality improver, or may be directly sprayed with the strain and / or probiotic agent.
  • Bacillus licheniformis CJMPB283 in the water improver of the present invention may be a liquid or dry state, preferably in the form of a dried powder. Drying methods may be, but not limited to, ventilation drying, natural drying, spray drying and freeze drying.
  • Bacillus licheniformis CJMPB283 of the present invention may be mixed in the form of a powder of 0.05 to 10% by weight, preferably 0.1% to 1% by weight of the feed weight.
  • Acceptable carriers for water quality improvers are sterile and biocompatible materials, and may be used by mixing saline, sterile water, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol and one or more of these components. If necessary, other conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatics, etc. may be added. Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • the newly isolated Bacillus licheniformis CJMPB283 has an excellent digestive enzyme activity such as amylase, cellulose, and protease, and has excellent oxidation ability against ammonia and nitrous acid, thereby improving water quality at the stage of farming fish and shrimp. It has the effect to do it.
  • the newly isolated Bacillus licheniformis CJMPB283 can be used not only as a probiotic, but also as a water quality improver.
  • 1 is a figure quantitatively evaluating the consumption of ammonia in the ammonia-containing medium of the first selected strains of the present invention.
  • Figure 3 is a picture evaluating the growth of anaerobic and anaerobic conditions of the secondary screening strains of the present invention.
  • Figure 4 is a figure evaluating the flame resistance of the secondary screened strains of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram evaluating the ammonia reduction effect according to the water quality improvement evaluation in the flounder fry tank of the secondary selection strain of the present invention.
  • Figure 6 is a photograph taken with an electron microscope of the Bacillus Richenomyces CJMPB283 strain of the final selection strain of the present invention.
  • Oxidation evaluation of ammonia and nitrous acid was carried out to select the microorganisms that oxidize ammonia and nitrite, which are the main causes of water pollution.
  • Ion medium with ammonia (NH 4 ) 2 SO 4 4.95g / L, K 2 HPO 4 8.82g / L, MgSO 4 (1M solution) 1.1ml / L, CaCl 2 (1M solution) 0.3 ml / L, FeSO 4 (30 mM solution) 0.5 ml / L, CuSO 4 (50 mM solution) 0.04 ml / L, NaH 2 PO 4 0.7 g / L, 5% (W / V) Na 2 CO 3 anhydrous 12 ml / L) with nitrous acid added (CaCl 2 0.01g / L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.1g / L, EDTA 1.4mg / L, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 5mg / L, H 2 SO 4 0.5 ⁇ l / L, Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.05 mg / L, MnCl 2 4H 2 O 0.1 mg / L, CoCl 2 6H
  • the first strain was inoculated in 5 ml of the prepared two media 0.01% incubation at 30 °C for 14 days.
  • the culture solution was centrifuged to collect 1 ml each of the culture supernatant, and then 100 ⁇ l of an indicator (sulanilic acid, N, N-Dimethyl-1-naphylamine) that exhibits color reaction in the presence of nitrous acid was added.
  • the culture supernatant to which the indicator was added was reacted at 25 ° C. for 10 minutes and then observed for color change. When nitrous acid was present or produced, the color of the medium changed to dark purple, and when nitrous acid was not present or consumed, no color change of the medium was observed.
  • Ammonia consumption was quantified in the medium to which ammonia was added to 10 strains of the selected strains in order to evaluate the reduction effect of ammonia oxidation of the first selected strains.
  • the first 10 strains were inoculated in 0.1% BHI liquid medium, and then cultured at 37 ° C. at 200 rpm for 15 hours to activate the strains.
  • Ammonia-containing medium ((NH 4 ) 2 SO 4 0.5g / L, NaH 2 PO 4 13.5g / L, K 2 HPO 4 0.7g / L, MgSO 4 7H 2 O 0.1g / L, CaCl 2 2H 2 O 0.18g / L, NaHCO 3 0.5g / L, FeCl 3 ⁇ 6H 2 O 0.014g / L, glucose 0.5g / L) 1% inoculated and incubated at 200rpm at 37 °C. During 6 hours, 12 hours, 24 hours, 36 hours of culture was collected and centrifuged to recover only the culture supernatant. The residual amount of ammonia in the recovered culture supernatant was quantified.
  • nitrite consumption was quantified by quantifying in the medium to which nitrite was added to the 10 selected strains.
  • the first 10 strains were inoculated in 0.1% BHI liquid medium, and then cultured at 37 ° C. at 200 rpm for 15 hours to activate the strains.
  • Nitrous acid-containing medium NaNO 2 0.5g / L, NaH 2 PO 4 13.5g / L, K 2 HPO 4 0.7g / L, MgSO 4 7H 2 O 0.1g / L, CaCl 2 2H 2 O 0.18g / L , NaHCO 3 0.5g / L, FeCl 3 ⁇ 6H 2 O 0.014g / L, glucose 0.5g / L
  • Nitrous acid-containing medium NaNO 2 0.5g / L, NaH 2 PO 4 13.5g / L, K 2 HPO 4 0.7g / L, MgSO 4 7H 2 O 0.1g / L, CaCl 2 2H 2 O 0.18g / L , NaHCO 3 0.5g / L, FeCl 3 ⁇ 6H 2 O 0.014g / L, glucose
  • nitrite in the culture supernatant was reduced in all 10 selected strains in the nitrite-containing medium, in particular, strains 102, 109, 251, 253 and 268 were 6 hours of initial culture. From the second it was confirmed that the content of nitrite is sharply reduced.
  • the color reaction was observed by adding an indicator indicating the color reaction in the presence of nitrous acid. As a result, dark purple color was observed in the initial medium containing nitrous acid. Did not change. That is, it was found that nitrite was not oxidized because the first selection strain oxidized nitrite.
  • the aquatic environment coexists with aerobic, flue-gas, and anaerobic conditions, and especially anaerobic (a process in which ammonia is oxidized to nitric acid under anaerobic conditions) under anaerobic conditions. Therefore, it is one of the important factors to grow the selection strain under various conditions. Therefore, growth of anaerobic and anaerobic conditions of 10 primary strains was evaluated.
  • strains of the first selected strains were inoculated in BHI liquid medium by 0.1%, followed by incubation for 24 hours under anaerobic and anaerobic conditions at 37 ° C. Most of the selected strains were grown under both anaerobic and anaerobic conditions. Especially, strains 253 and 368 showed excellent growth under anaerobic conditions, and strain 283 showed growth under anaerobic conditions. Was the best (FIG. 3). Accordingly, strains 253, 268, and 283 which were excellent in growth anaerobic and anaerobic conditions were selected.
  • Three candidate strains selected from BHI broth added with 0%, 3%, 5%, and 10% sodium chloride were inoculated by 0.1% and incubated at 37 ° C at 200 rpm. During the cultivation progress, samples were taken at 8, 10 and 22 hours to measure absorbance.
  • Example 3 in vivo Evaluation and final strain selection
  • Bacillus Richenformis CJMPB283 Bacillus Richenformis CJMPB283
  • the novel microorganism of the present invention identified by the above method was deposited as " Bacillus licheniformis CJMPB283" on March 22, 2012 to the Korea Microorganism Conservation Center ( Accession number KCCM11270P).
  • Example 5 Characterization of probiotics of strain B. licheniformis CJMPB283
  • the selected strains were cultured in BHI liquid medium for 24 hours, and then the culture medium was used as a coenzyme solution for enzyme activity analysis.
  • the degree of substrate degradation was determined using a medium containing respective substrates for each enzyme as follows.
  • YM (Difco, USA) medium containing 2% skim milk (skim milk, Sigma, USA) was prepared. 2 ⁇ l of the crude enzyme solution collected above was dispensed into a substrate medium, and then reacted at 37 ° C. for 15 hours, and enzyme activity was measured according to the degree of clear zone formation.
  • YM medium with 1% CMC (carboxyl methyl cellulose) substrate was added. 2 ⁇ l of the coenzyme solution collected above was dispensed into the substrate medium, reacted at 37 ° C. for 15 hours, and then stained with 0.2% congo red aqueous solution for 30 minutes and decolorized with 1M NaCl aqueous solution. The activity of the enzyme was measured according to the degree of formation of a clear zone resulting from decomposition of the substrate around the crude enzyme solution.
  • YM medium was prepared to which 1% soluble starch substrate was added. 3 ⁇ l of the coenzyme solution collected above was dispensed into the substrate medium, and then reacted at 37 ° C. for 15 hours. After dyeing with an aqueous solution containing 0.1% and 2% of I 2 and KI, respectively, the activity of the enzyme was measured according to the degree of formation of a clear zone resulting from decomposition of the substrate around the crude enzyme solution.
  • the final selected strain Bacillus licheniformis CJMPB283 had a digestive enzyme activity against protease, amylase, cellulose as shown in Table 3. In particular, the activity against protease was excellent.
  • Bacillus forms endogenous spores to survive when stressed, such as depletion of one or more of the essential nutrients. Endogenous spores are resistant to extreme environments such as ultraviolet rays, high temperature, low temperature drying and high pressure, so the formation of endospores is important in maintaining the viability of Bacillus. Therefore, Bacillus licheniformis CJMPB283 was incubated for a long time to confirm the endogenous spore forming ability.
  • the BHI liquid medium was inoculated with 0.1% of the bacteria, and cultured at 37 ° C. and 200 rpm for 24 hours and 48 hours.
  • the total bacterial count was measured by smearing the culture medium for each time period in the BHI solid medium, and the endogenous spores were measured by smearing the culture solution heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes in the BHI solid medium.
  • Bacillus licheniformis CJMPB283 As shown in Table 4, when Bacillus licheniformis CJMPB283 was incubated for 24 hours, about 24.5% formed endospores, and when incubated for 48 hours, 100% endospores were formed. Bacillus licheniformis CJMPB283 of the present invention has a high endogenous spore forming ability when cultured for more than 48 hours can be a characteristic that can maintain a high survival rate when used as probiotics.
  • Bacillus licheniformis CJMPB283 of the present invention is excellent in the production of digestive enzymes such as amylase, cellulose, and protease, and has an excellent oxidation effect against ammonia and nitrous acid, probiotics and water quality in the stage of farming fish and shrimp It has the efficacy to improve. Therefore, the newly isolated Bacillus licheniformis CJMPB283 can be used not only as a probiotic, but also as a water quality improver.

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Abstract

본 발명은 소화효소를 생산하며, 암모니아 및 아질산 산화능력을 가지는 신규 바실러스 리체니포미스 CJMPB283(Bacillus licheniformis CJMPB283; 기탁번호 KCCM11270P) 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 분리한 바실러스 리체니포미스 및 이를 이용한 프로바이오틱스
본 발명은 신규 프로바이오틱스 및 이의 용도에 관한 것이다.
양식업은 많은 나라에서 주요한 경제적 수단이 되고 있으며, 양식어류의 질병발생은 경제적 발전에 커다란 영향을 미치고 있는 실정이다(Jose Luis Balcazar et al. Veter.Microbio. 114(2006):173-186).
일반적으로 양식어류에 발병하는 질병 및 수질 개선을 위해 항생제, 항균제 및 화공약품을 사용하지만, 이들의 과도한 사용으로 인하여 내성균의 증가와 체내 잔류를 비롯하여 주변의 수질오염 등의 문제가 발생하면서 사용을 제한하고 있는 실정이다. 또한 수산식품의 항생제 사용여부에 대한 소비자들의 관심이 높아짐에 따라 항생제 사용을 근원적으로 차단하기 위해서 유기산, 생균제, 비특이 면역증강제, 천연물질 등의 대체물질의 개발이 시급히 진행되고 있다(어류질병 진단 및 치료대책. 해양수산부. 2001).
양식에서의 프로바이오틱스는 사료에 첨가하거나 부수적으로 물에 투여하고 있다. 최근 양어 및 새우에 프로바이오틱스를 급여에 따른 병원성에 대한 면역력 증강 및 수질 개선으로 인한 질병 개선효과에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Jiqiu Li et al. Aquaculture 291(2009) 35-40).
프로바이오틱스(probiotics)란 항생물질을 의미하는 항생제(antibiotics)와는 대립되는 어원적 의미를 가지는 것으로 장내의 미생물 균형에 도움을 주는 미생물 제제 또는 미생물 성분으로 정의되며, 락토바실러스균과 비피더스균 등 유산균이라고 총칭하는 균종이 대표적이다.
프로바이오틱스로 사용되고 있는 바실러스는 그람양성의 간균으로 내생포자를 형성하며 프로바이오틱스로 사용되는 균 중 독특한 형태를 가지고 있다. 바실러스는 내생포자를 형성하지 않는 락토바실러스보다 내열성이 우수한 특징을 가지고 있다. 또한 위벽의 낮은 pH에도 생존하기 때문에 투여한 대부분의 균이 소장까지 도달할 수 있다. (Barbosa,T.M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 71(2005)968-978; Spinosa, M. R. et al. Res. Microbiol. 151(2000) 361-368).
수질개선 목적으로 사용되고 있는 물질 및 미생물에 대한 선행기술을 살펴보면 대한민국 공개특허 제2007-0036016호에는 아질산염-산화 박테리아를 이용하여 수생환경에서 아질산염의 축적을 예방하거나 완화하는 방법이 개시되어 있다. 상기 아질산염-산화 박테리아는 니트로코커스(Nitrococcus)와 니트로스피라(Nitrospira)이다. 또한 대한민국 공개특허 제2010-0040960호에는 종속영양 암모니아 산화 박테리아를 이용하여 폐수로부터 탄소 및 질소 오염물질을 제거하는 방법을 개시하고 있으며, 상기 문헌에서 개시된 종속영양 암모니아 산화 박테리아는 바실러스 슈도피무스 NH-2(Bacillus pseudofimus NH-2), 아트로박터 글로비포미스 WR-2(Arthrobacter globiformis WR-2)를 의미한다. 상기 문헌에서 개시된 니트로코커스와 니트로스피라는 GRAS 균주가 아니기 때문에 프로바이오틱스로 사용될 수 없으며, 고세균에 속하기 때문에 생산이 매우 어려워서 산업상 이용이 불가능하다. 또한 GRAS 균주로 알려져 있는 바실러스 슈도필무스 WR-2는 프로바이오틱스로 등록되지 않은 균주이다.
본 발명자들은 한국의 전통적인 발효식품인 된장에서 소화효소 활성을 가지며, 암모니아 및 아질산을 산화하는 균주를 분리하고, 당해 균주의 형태학적, 생화학적 및 유전학적 특성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 소화효소를 생산하며, 암모니아 및 아질산 산화능력을 가지는 신규 바실러스 리체니포미스 CJMPB283을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 바실러스 리체니포미스 CJMPB283의 배양액, 그의 농축액 및 그의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 바실러스 리체니포미스 CJMPB283 또는 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 바실러스 리체니포미스 CJMPB283, 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하는 수산 양식용 수질 개선제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 양식장에서 양식 전 또는 양식단계에 있어서 상기 수질개선제를 살포하여 상기 양식장 수질을 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태로서, 소화효소를 생산하며, 암모니아 및 아질산 산화능력을 가지는 신규한 바실러스 리체니포미스 CJMPB283을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 한국의 전통식품인 메주에서 분리하여 얻은 것이다. 본 발명 균주의 형태학적 특징은 그람 양성 간균이며(도 6) 서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 가진다. 상기 염기 서열을 분석한 결과 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)와 97% 상동성을 가진다. 이에 본 발명자들은 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB283을 2012년 3월 22일 한국 미생물 보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제 1동 361-221)에 기탁번호 KCCM11270P로 기탁하였다.
구체적으로 한국의 전통식품인 염지 40일차 메주에서 채취하여 BHI(Brain heart infusion) 고체 배지에서 분리하였다. 분리균주는 아밀레이즈, 셀룰레이즈, 프로테이즈와 같은 유용 소화효소 활성이 우수하며, 암모니아 및 아질산을 산화하는 특징을 가지고 있다. 또한 통성혐기 및 혐기적인 조건에서 성장이 가능하며, 10% 염화나트륨에 대한 내염성이 있기 때문에 다양한 수질환경에서 성장이 가능하다. 또한 넙치 치어를 대상으로 수질정화 능력을 평가한 결과, 넙치 사육 수조 내 암모니아 제어 효능이 우수하였으며, 낮은 폐사율을 보였다.
다른 양태로서 본 발명의 신규 분리한 균주의 배양액, 그의 농축액 및 그의 건조물로 이루어진 군으로부터 선택되는 배양물을 제공한다.
본 발명의 신규 분리한 균주는 통상적인 바실러스 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 칼슘, 철, 인 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다. 본원의 신규한 분리 균주의 배양온도 조건은 20~40℃의 온도 범위에서 12시간에서 4일간 배양할 수 있다.
구체적으로 신규 분리한 균주의 배양액은 균체를 포함한 배양 원액일 수 있으며, 또한 배양 상등액을 제거하거나 농축한 균체일 수 있다. 상기 배양액의 조성은 통상의 바실러스 배양에 필요한 성분뿐 아니라, 바실러스의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
또한 균주의 상태는 액상상태 또는 건조상태일 수 있으며, 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양태로서 본 발명의 신규 분리한 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
프로바이오틱스는 장내의 소화관 벽에 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하며, 병원균의 증식을 억제한다. 또한 프로바이오틱스가 생산하는 유익한 소화효소는 영양소의 흡수와 이용을 용이하게 하여 사료의 요구율을 개선시킨다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 5 x 104 내지 5 x 1010 CFU/ml의 바실러스 리체니포미스 CJMPB283을 포함하며, 바람직하게는 1 x 106내지 1 x 109 CFU/ml의 바실러스 리체니포미스 CJMPB283을 포함한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화되어 식품 및 사료첨가제로 제공될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약제학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 프로바이오틱스에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 본 발명에서의 프로바이오틱스 제제의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 향미제, 비단백질태 질소화합물, 규산염제, 완충제, 추출제, 올리고당 등이 있다. 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 프로바이오틱스를 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 소프트 캡슐로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐등의 제형으로 제제화 하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활류를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프로바이오틱스 제제를 유효성분으로 포함하는 수산 양식용 사료 첨가제에 관한 것이다.
통상적으로 바실러스는 내생포자를 형성하여 열에 매우 안정적인 특징을 가지고 있다. 따라서 상기 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 액상 또는 건조상태 일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1% 내지 1 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다. 또한 상기 수산 양식용 사료첨가제는 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB283외에 사료의 보존성을 높일 수 있는 통상의 첨가제들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서의 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질, 동물성플랑크톤류, 어분 등이 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 수산 양식용 사료첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 수산 양식용 사료에 첨가하여 이용될 수 있다. 본 발명의 사료첨가제가 첨가한 사료가 사용될 수 있는 어종은 어류 또는 갑각류에 사용될 수 있고, 더욱 구체적으로는 넙치, 돔, 새우, 틸라피아, 연어, 장어, 송어 등과 같은 양식어류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 사료첨가제를 포함한 수산 양식용 사료의 배합 방법은, 상기 사료첨가제를 동물사료에 건조 중량기준으로 0.05 내지 0.5 중량%의 양으로 혼합한다.
또 다른 양태로서, 상기 바실러스 리체니포미스 CJMPB283을 유효성분으로 포함하는 수산 양식용 수질개선제; 및 양식장에서 양식 전 또는 양식단계에 상기 수질개선제를 살포하여 상기 양식장의 수질을 개선하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 수산양식 환경 내에 존재하는 암모니아 및 아질산 함량을 감소시키는데 사용 할 수 있다.
본 발명의 수질개선제가 사용될 수 있는 양식장의 어종은 어류 또는 갑각류에 사용될 수 있고, 더욱 구체적으로는 넙치, 돔, 새우, 틸라피아, 연어, 장어, 송어 등과 같은 양식어류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 수질개선제는 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB283을 수질개선제 형태로 따로 제조하거나, 상기 균주 및/또는 프로바이오틱스 제제를 직접 살포할 수 있다. 본 발명의 수질개선제 내 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 액상 또는 건조상태 일 수 있으며, 바람직하게는 건조된 분말형태이다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1% 내지 1 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다.
수질개선제에 있어서 허용되는 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명은 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 아밀레이즈, 셀룰레이즈, 프로테이즈와 같은 소화효소 활성이 우수하며, 암모니아 및 아질산에 대한 산화능이 우수하여, 양어 및 새우의 양식하는 단계에서 수질을 개선할 수 있는 효능을 가진다.
따라서 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 프로바이오틱스로 이용 가능할 뿐 아니라, 수질개선제로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 1차 선발된 균주들의 암모니아 함유배지에서 암모니아 소모량을 정량 평가한 그림이다.
도 2는 본 발명의 1차 선발된 균주들의 아질산 함유배지에서 아질산 소모량을 정량 평가한 그림이다.
도 3은 본 발명의 2차 선발된 균주들의 통성혐기 및 혐기적 조건에서 성장성을 평가한 그림이다.
도 4는 본 발명의 2차 선발된 균주들의 내염성을 평가한 그림이다.
도 5는 본 발명의 2차 선발된 균주들의 넙치 치어 수조에서 수질개선 평가에 따른 암모니아 저감효능을 평가한 그림이다.
도 6은 본 발명의 최종 선발 균주인 바실러스 리체니포미스 CJMPB283 균주를 전자현미경으로 촬영한 사진이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 암모니아 및 아질산 산화 균주 분리
(1) 시료 확보 및 균주 분리
한국의 전통식품인 된장, 메주, 간장 등에서 명품장류유래균주를 확보하였다. 확보된 시료를 3% 염화나트륨이 첨가된 BHI 고체배지(Difco, USA)에 도말 후 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 각 시료에서 분리된 균주들은 콜로니 관찰에 따라 그룹화하여 균주들을 분리하였다. 선별된 콜로니는 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리 하였으며, 순수 배양된 균을 20% 글리세롤이 첨가된 배지에 담아 영하 70℃ 이하에서 보존하였다.
(2) 암모니아 및 아질산 산화 평가
수질오염의 주요원인인 암모니아와 아질산을 산화하는 미생물을 1차 선발하기 위해 암모니아 및 아질산에 대한 산화평가를 실시하였다.
암모니아 산화 평가를 위해 암모니아가 첨가된 이온배지((NH4)2SO4 4.95g/L, K2HPO4 8.82g/L, MgSO4(1M용액) 1.1ml/L, CaCl2(1M용액) 0.3ml/L, FeSO4(30mM용액) 0.5ml/L, CuSO4(50mM용액) 0.04ml/L, NaH2PO4 0.7g/L, 5%(W/V) Na2CO3 anhydrous 12ml/L)와 아질산이 첨가된 이온배지(CaCl2 0.01g/L, MgSO4ㆍ7H2O 0.1g/L, EDTA 1.4mg/L, FeSO4ㆍ7H2O 5mg/L, H2SO4 0.5 ㎕/L, Na2MoO4ㆍ2H2O 0.05mg/L, MnCl2ㆍ4H2O 0.1mg/L, CoCl2ㆍ6H2O 0.001mg/L, ZnSO4ㆍ7H2O 0.05mg/L, CuSO4ㆍ5H2O 0.01mg/L, NaNO2 0.21g/L, K2HPO4 0.3mg/L)를 제조하였다. 상기 제조된 2종의 배지 5 ml에 선발균주를 0.01% 접종 후 30℃에서 14일간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 1 ml씩 각각 채취한 후, 아질산 존재 시 색반응을 나타내는 지시약(sulanilic acid, N,N-Dimethyl-1-naphylamine)을 100 ㎕씩 첨가하였다. 지시약이 첨가된 배양 상등액을 25℃에서 10분간 반응시킨 후 색 변화 여부를 관찰하였다. 아질산이 존재하거나 생성되었을 경우, 배양액의 색은 짙은 자주색으로 변하였으며, 아질산이 존재하지 않거나 소모되었을 경우, 배양액의 색 변화는 관찰되지 않았다.
약 1000 여종의 분리균주를 평가한 결과 표 1과 같이 암모니아와 아질산을 모두 산화하는 균주 7종, 암모니아 분해 우수균주 2종, 아질산 분해균주 1종을 1차 선발하였다.
표 1
균주번호 암모니아 산화 아질산 산화
102 + +
109 + +
251 +++ +
253 + +
268 +++ +
283 + +
296 + +
303 +++ +
396 +++ ++
462 +++ +
실시예 2: 암모니아 및 아질산 산화 in vitro 평가
(1) 1차 선발 균주의 암모니아 정량 평가
1차 선발된 균주들의 암모니아 산화에 따른 저감 효과를 평가하기 위해 상기 선발균주 10종에 대한 암모니아가 첨가된 배지에서 암모니아 소모량을 정량하였다.
1차 선발된 10종의 균주를 BHI 액체 배지에 0.1%씩 접종 후, 37℃에서 200rpm으로 15시간 배양하여 균주를 활성화시켰다. 암모니아 함유 배지((NH4)2SO4 0.5g/L, NaH2PO4 13.5g/L, K2HPO4 0.7g/L, MgSO4ㆍ7H2O 0.1g/L, CaCl2ㆍ2H2O 0.18g/L, NaHCO3 0.5g/L, FeCl3ㆍ6H2O 0.014g/L, glucose 0.5g/L)에 활성화된 균을 1% 접종하여, 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 배양 과정 중 6시간, 12시간, 24시간, 36시간의 배양액을 채취하여 원심분리 후 배양 상등액만을 회수하였다. 회수된 배양 상등액에서의 암모니아 잔여량을 정량하였다.
그 결과 도 1과 같이 암모니아 함유 배지에서 선발균주 10종 모두 배양 상등액 내 암모니아 함량이 감소됨을 확인할 수 있었으며, 특히 283번, 296번, 303번, 396번 균주는 배양 초기인 6시간째부터 암모니아의 함량이 급격히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 암모니아가 산화되어 아질산이 생성 되었는지 확인하기 위해 아질산 존재 시 색반응을 나타내는 지시약을 첨가하여 색 반응을 관찰 한 결과, 암모니아 함유 초기 배지에서는 색 변화가 관찰되지 않았으며, 배양 종료 시 채취한 각 샘플에서는 배양 상등액의 색이 모두 짙은 자주색으로 변하였다. 이에 1차 선발균주 모두 암모니아를 아질산으로 산화시킨다는 것을 알 수 있었다.
(2) 1차 선발 균주의 아질산 정량 평가
1차 선발된 균주들의 아질산 산화에 따른 저감 효과를 평가하기 위해 상기 선발균주 10종에 대한 아질산이 첨가된 배지에서 정량하여 아질산 소모량을 정량하였다.
1차 선발된 10종의 균주를 BHI 액체 배지에 0.1%씩 접종 후, 37℃에서 200rpm으로 15시간 배양하여 균주를 활성화시켰다. 아질산 함유 배지(NaNO2 0.5g/L, NaH2PO4 13.5g/L, K2HPO4 0.7g/L, MgSO4ㆍ7H2O 0.1g/L, CaCl2ㆍ2H2O 0.18g/L, NaHCO3 0.5g/L, FeCl3ㆍ6H2O 0.014g/L, glucose 0.5g/L)에 활성화 된 균을 1% 접종하여, 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 배양 과정 중 6시간, 9시간, 12시간, 24시간, 30시간의 배양액을 채취하여 원심분리 후 배양 상등액만을 회수하였다. 회수된 배양 상등액에서의 아질산의 잔여량을 정량하였다.
그 결과 도 2와 같이 아질산 함유 배지에서 선발균주 10종 모두 배양 상등액 내 아질산의 함량이 감소됨을 확인할 수 있었으며, 특히 102번, 109번, 251번, 253번, 268번 균주는 배양 초기인 6시간째부터 아질산의 함량이 급격히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 아질산이 산화여부를 판단하기 위해 아질산 존재 시 색반응을 나타내는 지시약을 첨가하여 색 반응을 관찰 한 결과, 아질산 함유 초기 배지에서는 짙은 자주색이 관찰되었으며, 배양 종료 시 채취한 각 샘플에서는 배양 상등액의 색이 변하지 않았다. 즉, 1차 선발균주가 아질산을 산화시킴으로써 아질산이 산화되어 존재하지 않는다는 것을 알 수 있었다.
(3) 성장성 평가
수질의 환경은 호기, 통성혐기, 혐기적인 조건이 공존하며, 특히 혐기적인 조건에서 암모니아가 질산으로 산화되는 아나목스(Anammox, 혐기적인 조건에서 암모니아가 질산으로 산화되는 과정)가 혐기적인 조건에서 일어나기 때문에 선발 균주가 다양한 조건에서 성장하는 것은 중요한 인자 중 하나이다. 따라서 1차 선발균주 10종에 대한 통성혐기 및 혐기조건에서의 성장성을 평가하였다.
1차 선발된 균주 10종을 BHI 액체 배지에 0.1%씩 접종 한 후, 37℃의 통성혐기, 혐기적인 조건에서 24시간 동안 배양을 진행하였다. 선발균주 대부분은 통성혐기, 혐기적인 조건에서 모두 성장하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 253번, 368번 균주의 경우 혐기적인 조건에서의 성장성이 우수하였으며, 283번 균주의 경우 통성혐기적인 조건에서의 성장성이 가장 우수하였다(도 3). 이에 통성혐기 및 혐기적인 조건에서의 성장성이 우수한 253번, 268번, 283번 균주를 2차 선발하였다.
(4) 내염성 평가
담수조건과 해수조건에서 균주의 활성을 평가하기 위해 염화나트륨이 첨가된 배지에서의 2차 선발된 균주들의 성장성 평가를 진행하였다.
염화나트륨이 0%, 3%, 5%, 10% 첨가된 BHI 액체배지에 선발된 후보균주 3종을 0.1%씩 접종하여 37℃에서 200rpm으로 배양하였다. 배양 진행 중 8시간, 10시간, 22시간째의 각 샘플을 채취하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 4와 같이 균주 3종 모두 3% 염화나트륨 첨가 배지에서 균이 증식함을 확인할 수 있었으며, 283번 균주의 경우 5%의 염화나트륨 첨가 배지에서 다른 균주들보다 성장성이 우수함을 알 수 있었다. 이에 2차 선발된 3종의 균주, 즉, 253, 268 및 283은 담수조건뿐만 아니라 해수조건에서도 적용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: in vivo 평가 및 최종 균주 선발
2차 선발 균주 3종에 대한 수질정화 능력을 넙치 치어를 대상으로 평가하였다. 넙치 치어에 상업사료를 만복으로 공급한 후 실험 수조(64L)에 무작위로 배치시켰다. 실험어 배치 후, 모든 실험 사육 수조의 사육수를 깨끗하게 환수한 다음 0시간, 24시간, 48시간, 72시간, 92시간 및 120시간째에 각각 50ml씩 사육수를 샘플링 하였다. 2차 선발균주의 투여는 24시간 간격으로 약 3ml에 1x105 CFU 균수가 되도록 희석한 후 수조에 5일간 투여하였다. 대조구의 경우 해수를 동량으로 투여하였다. 샘플 채취 후 암모니아의 농도를 분석하였고, 분석하고 남은 해수 샘플은 -20℃에 보관한 후 아질산염 및 질산염 분석에 사용하였다. 수질 분석은 암모니아, 아질산염 및 질산염 3가지 항목을 분석하였다. 이들의 분석은 수질분석기(RQflex 10, Merck, 독일)를 이용하여 키트의 시약과 각각 반응시킨 후 분석하였다.
실험결과 72시간째부터 암모니아의 제거효과가 나타났으며(도 5), 120시간째에는 더욱 큰 차이를 보였다. 140시간 후에는 전체 수조에서 암모니아 독성에 의한 폐사가 일어나기 시작하였다. 2차 선발된 균주 3종 중 253번 및 283번 균주가 대조구와 비교하여 유의적으로 높은 암모니아 제거 효능을 보였으며, 폐사율 역시 대조구 보다 낮은 폐사율을 보임으로써 사육수(넙치(물고기)를 사육할 때 쓰는 물) 내의 암모니아 및 아질산 산화균주의 첨가는 넙치의 생존율을 높일 수 있다는 것을 알 수 있었다. 따라서 넙치 사육에 따른 암모니아 제거 효능이 우수하고 통성혐기 및 혐기 조건에서의 성장성이 우수한 283번 균주를 최종선발 하였다.
실시예 4: 선발 균주의 동정 및 생리, 생화학적 특성조사
(1) 형태학적, 생화학적 특성 조사
최종 선발된 균주의 종정을 위하여, 일차적으로 형태학적, 생화학적 조사를 수행하였다. 형태적인 특징으로는 그람염색결과 그람 양성이였으며, 전자현미경촬영 결과 간균임을 확인하였다(도 6). 생화학적 특성을 분석하기 위하여 API 50 CHB system(Biomerieux, 프랑스)으로 균주의 당 발효 패턴을 분석하였다(표 2).
표 2
대조구 - 에스쿨린 +
글리세롤(Glycerol) + 살리신 +
에리스리톨(Erythritol) - 셀로비오스 +
D-아라비노스 - 말토스 +
L-아라비노스 + 락토스 -
리보스 + 멜리비오스 -
D-자일로스 + 사카로스 +
L-자일로스 - 트레할로스 +
아도니톨 - 이눌린 +
β메틸-자일로시드 - 멜레지토스 -
갈락토스 + D-라피노스 +
D-글루코스 - 아미돈 +
D-프럭토스 - 글리코진 -
D-만노스 + 자일리톨 -
L-솔보스 - β겐티오비오스 +
람노스 - D-튜라노스 -
둘씨톨 - D-리쏘스 -
이노시톨 + D-타가토스 -
만니톨 + D-푸코스 -
소비톨 + L-푸코스 -
α메틸-디만노시드 - D-아라비톨 -
α메틸-글루코시드 - L-아라비톨 -
N 아세틸 글루코사민 - 글루코네이트 -
아미그달린 - 2 세토-글루코네이트 -
아뷰틴 - 5세토-글루코네이트 -
+, 양성; -, 음성
(1) 균주 동정
정확한 균주의 동정을 위하여, DNA 염기서열에 의한 분자계통 분류학적인 방법을 실시하였다. 염기서열 분석은 PCR premix(바이오니아, 대한민국)와 유니버셜 프라이머 27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3'; 서열번호 2)와 1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3'; 서열번호 3)를 사용하여 16s rDNA의 유전자 증폭을 시켰다. 유전자 증폭시 총 반응액은 20 ㎕로 맞추어 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분을 총 30회 반복하여, 증폭된 DNA 염기서열을 분석하였다. 분리 균주의 분석된 16s rDNA의 염기서열은 서열번호 1과 같다. 상기 분석결과, 바실러스 리체니포미스와 96% 상동성을 가지는 미생물로 동정되었다. 이에 상기 선발된 균주를 바실러스 리체니포미스 CJMPB283으로 명명하였으며, 상기와 같은 방법으로 동정된 본 발명의 신규한 미생물은 한국미생물 보존센터에 2012년 3월 22일자로 "Bacillus licheniformis CJMPB283"으로 기탁하였다(기탁번호 KCCM11270P).
실시예 5: 바릴러스 리체니포미스 CJMPB283균주의 프로바이오틱스 특성 분석
(1) 선발균주의 소화효소 활성
1) 조효소액 채취
상기 선발한 균주를 BHI 액체 배지에서 24시간 배양 후 배양액을 효소 활성 분석을 위한 조효소액으로 하여 아래와 같이 각 효소별 각각의 기질이 들어 있는 배지를 사용하여 기질 분해 정도를 판정하였다.
2) 프로테이즈(Protease) 활성
탈지분유(skim milk, Sigma, USA)를 2% 첨가한 YM(Difco, USA)배지 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 2 ㎕를 기질배지에 분주한 후, 37℃ 에서 15시간 반응시킨 후 투명환(clear zone) 형성 정도에 따라 효소 활성능력을 측정하였다.
3) 셀룰레이즈(Cellulase)활성
1% CMC(carboxyl methyl cellulose) 기질이 첨가된 YM 배지를 제조 하였다. 상기에서 채취한 조효소액 2 ㎕씩 기질배지에 분주한 후, 37℃ 에서 15시간 반응시킨 후, 0.2% congo red 수용액으로 30분 동안 염색하였으며, 1M NaCl 수용액으로 탈색하였다. 조효소액 주위의 기질이 분해되어 생기는 투명환(clear zone)의 형성 정도에 따라 효소의 활성능력을 측정하였다.
4) 아밀레이즈(Amylase) 활성
1% soluble starch 기질이 첨가된 YM 배지를 제조하였다. 상기에서 채취한 조효소액 3 ㎕씩 기질배지에 분주한 후, 37℃ 에서 15시간 반응시켰다. I2와 KI가 각각 0.1%, 2% 첨가된 수용액으로 염색한 후 조효소액 주위의 기질은 분해 되어 생기는 환(clear zone)의 형성 정도에 따라 효소의 활성능력을 측정하였다.
상기 최종 선발한 균주 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 표 3과 같이 프로테이즈, 아밀레이즈, 셀룰레이즈에 대한 소화효소 활성이 있었다. 특히 프로테이즈에 대한 활성이 우수하였다.
표 3
프로테이즈 아밀레이즈 셀룰레이즈
CJMPB283 +++ ++ ++
-: 활성없음, +; 활성 있음, ++: 활성우수, +++: 활성 매우 우수
(2) 내생포자 형성능
바실러스는 필수 영양원들 중에 한 개 이상의 영양원이 고갈되는 등의 스트레스를 받으면 생존하기 위해 내생포자를 형성한다. 내생포자는 자외선, 고온, 저온 건조 및 고압 등의 극한 환경에 저항성을 가지기 때문에 바실러스의 생존율을 유지하는데 있어서 내생포자의 형성은 중요하다. 따라서 바실러스 리체니포미스 CJMPB283을 장시간 배양하여 내생포자 형성능을 확인하였다.
BHI 액체배지에 균을 0.1% 접종하여, 37℃, 200 rpm에서 24시간, 48시간 배양하였다. 각 시간대 별 배양액을 BHI 고체 배지에 도말하여 총 균수를 측정하고, 95℃에서 10분간 열처리한 배양액을 BHI 고체 배지에 도말하여 내생포자 수를 측정하였다.
표 4에 나타난 바와 같이 바실러스 리체니포미스 CJMPB283을 24시간 배양하였을 때 약 24.5%가 내생포자를 형성하였으며, 48시간 배양하였을 때 100% 내생포자를 형성하는 것을 알 수 있었다. 본 발명의 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 48시간 이상 배양 시 높은 내생포자 형성능을 가지고 있어 프로바이오틱스로 사용 시 생존율을 높게 유지할 수 있는 특성이 될 수 있다.
표 4
배양시간 총균수(CFU/ml) 내생포자수(CFU/ml) 포자율(%)
24h 1.1x109 2.7x108 24.5%
48h 1.5x109 1.5x109 100%
본 발명 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 아밀레이즈, 셀룰레이즈, 프로테이즈와 같은 소화효소 생산이 우수하며, 암모니아 및 아질산에 대한 산화효능이 우수하여, 양어 및 새우의 양식하는 단계에서 프로바이오틱스 및 수질을 개선할 수 있는 효능을 가진다. 따라서 신규 분리한 바실러스 리체니포미스 CJMPB283은 프로바이오틱스로 이용 가능할 뿐 아니라, 수질개선제로도 이용될 수 있다.
Figure PCTKR2013002829-appb-I000001

Claims (6)

  1. 소화효소를 생산하며, 암모니아 및 아질산 산화능력을 가지는 바실러스 리체니포미스 CJMPB283(Bacillus licheniformis CJMPB283; 기탁번호 KCCM11270P).
  2. 바실러스 리체니포미스 CJMPB283(기탁번호 KCCM11270P)의 배양액, 그의 농축액 및 그의 건조물로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 바실러스 리체니포미스 CJMPB283의 배양물.
  3. 제1항의 바실러스 리체니포미스 CJMPB283(기탁번호 KCCM11270P) 또는 제2항의 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 제제.
  4. 제3항의 프로바이오틱스 제제를 포함하는 수산 양식용 사료 첨가제.
  5. 바실러스 리체니포미스 CJMPB283(Bacillus licheniformis CJMPB283; 기탁번호 KCCM11270P), 그의 배양액, 그의 농축액 또는 그의 건조물을 포함하는 수산 양식용 수질 개선제.
  6. 양식장에서 양식 전 또는 양식 단계 중에 제5항에 따른 수질 개선제를 살포하여 상기 양식장의 수질을 개선하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110278704A (zh) * 2017-12-29 2019-09-24 Cj第一制糖株式会社 包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株的用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(ahpnd)或白斑综合征(wss)的饲料组合物

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104304142B (zh) * 2014-09-26 2017-03-29 浙江海洋学院 一种对长毛对虾育苗池的环境改良方法
WO2019132600A1 (ko) * 2017-12-29 2019-07-04 씨제이제일제당 (주) 바실러스 서브틸리스 균주, 바실러스 푸밀러스 균주 및 바실러스 리체니포미스 균주를 유효성분으로 포함하는 급성 췌장염 괴사증 또는 흰반점 증후군의 예방 또는 치료용 사료 조성물
JP2020127383A (ja) * 2019-02-08 2020-08-27 学校法人 東洋大学 培養方法、培養装置、廃水処理方法及び廃水処理装置
KR102242160B1 (ko) 2019-10-14 2021-04-20 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 신규한 바실러스 서틸리스 mkhj 1-1 균주 및 이의 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070036016A (ko) * 2003-10-09 2007-04-02 아쿠아리아, 인코퍼레이티드 아질산염-산화 박테리아 및 이를 검출하고 이용하는 방법
KR20080037457A (ko) * 2006-10-26 2008-04-30 주식회사 바이넥스 바실러스 폴리퍼멘티쿠스, 바실러스 리케니포르미스 및사카로마이세스 세르비지에를 포함하는 어류사료첨가용조성물
KR20100040960A (ko) * 2007-08-08 2010-04-21 구앙하오 펭 종속영양 암모니아―산화 박테리아를 이용하여 ｃ, ｎ 오염물질을 제거하는 방법
KR20110076337A (ko) * 2009-12-29 2011-07-06 경남과학기술대학교 산학협력단 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 리체니포르미스 ｃｓ48 및 그의 배양액
KR101062309B1 (ko) * 2008-11-03 2011-09-06 선 바이오 (주) 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 및 이의 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6080568A (en) * 1997-08-19 2000-06-27 Genencor International, Inc. Mutant α-amylase comprising modification at residues corresponding to A210, H405 and/or T412 in Bacillus licheniformis
JP4631082B2 (ja) * 2003-07-17 2011-02-16 財団法人新産業創造研究機構 微生物を利用してｎｈ４＋とｎｏ３−とを同時除去する硝化・脱窒方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070036016A (ko) * 2003-10-09 2007-04-02 아쿠아리아, 인코퍼레이티드 아질산염-산화 박테리아 및 이를 검출하고 이용하는 방법
KR20080037457A (ko) * 2006-10-26 2008-04-30 주식회사 바이넥스 바실러스 폴리퍼멘티쿠스, 바실러스 리케니포르미스 및사카로마이세스 세르비지에를 포함하는 어류사료첨가용조성물
KR20100040960A (ko) * 2007-08-08 2010-04-21 구앙하오 펭 종속영양 암모니아―산화 박테리아를 이용하여 ｃ, ｎ 오염물질을 제거하는 방법
KR101062309B1 (ko) * 2008-11-03 2011-09-06 선 바이오 (주) 셀룰라아제 및 자일라나아제를 분비하는 바실러스 리케니포르미스 및 이의 용도
KR20110076337A (ko) * 2009-12-29 2011-07-06 경남과학기술대학교 산학협력단 섬유소 분해 활성을 가지는 신균주 바실러스 리체니포르미스 ｃｓ48 및 그의 배양액

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110278704A (zh) * 2017-12-29 2019-09-24 Cj第一制糖株式会社 包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株、短小芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株的用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病(ahpnd)或白斑综合征(wss)的饲料组合物
CN110602950A (zh) * 2017-12-29 2019-12-20 Cj第一制糖株式会社 包括作为活性成分的枯草芽孢杆菌菌株的用于预防或治疗急性肝胰腺坏死病（ahpnd）或白斑综合征（wss）的饲料组合物
US11432566B2 (en) 2017-12-29 2022-09-06 Cj Cheildejang Corporation Feed composition for preventing or treating acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) or white spot syndrome (WSS), comprising a Bacillus subtilis strain, a Bacillus pumilus strain, and a Bacillus licheniformis strain as active ingredients

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